CN113620952B - 异喹啉生物碱化合物及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及异喹啉生物碱化合物及其制备和用途。具体地，本申请涉及从夏天无分离的异喹啉生物碱化合物、其旋光异构体或旋光异构体的混合物。本申请还涉及制备所述化合物的方法。本申请还涉及所述化合物、其旋光异构体或旋光异构体的混合物在制备用于在有此需要的受试者中治疗或预防心血管疾病或由冠状病毒引起的疾病或症状中的用途。

Description

异喹啉生物碱化合物及其制备和用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，尤其涉及异喹啉生物碱化合物及其制备和用途。
背景技术
夏天无为罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎。主要分布于中国东南部的福建、江西、江苏、安徽、浙江等地区和日本南部。异喹啉类生物碱在紫堇属植物中含量丰富，被认为是紫堇属药用植物的主要生物活性成分。夏天无相关中成药主要由其总生物碱以不同剂型(片剂、滴眼液、注射液等)研制而成，传统上用于治疗中风偏瘫、头痛、外伤和其它疼痛性疾病。目前，已从夏天无中分离鉴定出70多种异喹啉类生物碱，如巴马汀、小檗碱、延胡索乙素等，这些化合物已被开发成药物应用于临床。
发明内容
本申请的发明人从夏天无中分离得到了具有新颖碳骨架的两对旋光异构异喹啉生物碱，并对其进行了结构确认、手性拆分、合成及其心肌保护和抗冠状病毒例如SARS-CoV-2的生物活性研究。
在第一方面，本申请提供了式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，式(I)的化合物的化学名称为5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐，
本申请使用的术语“旋光异构体”是指构造相同仅基团空间排布不同的异构体。
本申请使用的术语“旋光异构体的混合物”可以本申请的任何旋光异构体的任何比例的混合物，例如两种旋光异构体以10:1至1:10的比例，例如8:1至1:8的比例，例如6:1至1:6的比例，例如4:1至1:4的比例，例如2:1至1:2的比例，例如1:1的比例混合的混合物。
在一些实施方式中，式(I)化合物的旋光异构体为式(I-1)所示的旋光异构体，式(I-1)所示的旋光异构体的化学名称为(8S,13R,7’S,8’R)-5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐，
在一些实施方式中，式(I)化合物的旋光异构体为式(I-2)所示的旋光异构体，式(I-2)所示的旋光异构体的化学名称为(8R,13S,7’R,8’S)-5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐，
在一些实施方式中，式(I)化合物的旋光异构体的混合物为式(I-1)所示的旋光异构体和式(I-2)所示的旋光异构体的混合物。在一些实施方式中，在所述混合物中，式(I-1)所示的旋光异构体和式(I-2)所示的旋光异构体以10:1至1:10的比例，例如8:1至1:8的比例，例如6:1至1:6的比例，例如4:1至1:4的比例，例如2:1至1:2的比例，例如1:1的比例混合的混合物。
在第二方面，本申请提供了式(II)的化合物以及其旋光异构体和旋光异构体的混合物，所述式(II)的化合物的化学名称为表-5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐，
在一些实施方式中，式(II)化合物的旋光异构体为式(II-1)所示的旋光异构体，所述式(II-1)所示的旋光异构体的化学名称为(8S,13R,7’R,8’S)-5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐，
在一些实施方式中，式(II)化合物的旋光异构体为式(II-2)所示的旋光异构体，所述式(II-2)所示的旋光异构体的化学名称为(8R,13S,7’S,8’R)-5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐，
在一些实施方式中，式(II)化合物的旋光异构体的混合物为式(II-1)所示的旋光异构体和式(II-2)所示的旋光异构体的混合物。在一些实施方式中，在所述混合物中，式(II-1)所示的旋光异构体和式(II-2)所示的旋光异构体以10:1至1:10的比例，例如8:1至1:8的比例，例如6:1至1:6的比例，例如4:1至1:4的比例，例如2:1至1:2的比例，例如1:1的比例混合的混合物。
在第三方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物和/或式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，以及药学上可接受的载体。
本文使用的术语“药学上可接受的”是指相应的载体、赋形剂或辅剂适于给予哺乳动物，例如人。优选地，该术语是指由管理机构例如CFDA(中国)、EMEA(欧洲)、FDA(美国)等任意国家管理机构认证的用于哺乳动物优选人。
药学上可接受的载体可以是有机或无机惰性载体材料，例如，合适的载体包括水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇、凡士林、甘露醇、纤维素、纤维素衍生物、糖精钠、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁、盐水、甘油、乙醇等。此外，药物组合物还可含有其他药物添加剂，例如调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等。
本申请的药物组合物的剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、丸剂、栓剂、膜剂、贴片、气雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。本申请的药物组合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本申请的药物组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将本申请的药物组合物制成胶囊，可以将有效成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将活性成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备胶囊。
适于肠胃外施用的制剂包括适于注射的水性和非水性等渗无菌溶液，以及水性和非水性无菌混悬剂。本文提供的肠胃外制剂任选地包含在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿)中，并且可以储存在仅需要于即将使用前添加无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。用于重构药物组合物(例如在注射前)的合适稀释剂的实例包括抑菌性注射用水、5％葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer's)溶液、盐水、无菌水、去离子水及其组合。
本申请的化合物在其药物组合物中的含量可以根据实际需要(例如剂型、施用方式、施用对象等)进行调整，例如为0.1-95重量％，例如1-95重量％，5-90重量％，10-80重量％等。
本申请的药物组合物中可以包含0.1-10g，例如0.5g，1g，2g，3g，4g，5g，6g，7g，8g，9g的本申请的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物。
在第四方面，本申请提供了制备式(I)的化合物或式(II)的化合物的方法。
本申请化合物可按有机合成领域技术人员已知的多种方式制备。例如，在一些实施方式中，制备式(I)的化合物或式(II)的化合物的方法可以包括：使盐酸药根碱和阿魏酸在无机碱作为催化剂的条件下反应。所述制备方法以无机碱例如无水碳酸钾作为催化剂，转化率高，后处理简单。
在一些实施方式中，所述无机碱是无水碳酸钾。
在一些实施方式中，所述反应在升高的温度下进行，例如36-40℃，例如38℃。
在第五方面，本申请提供了式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物和/或式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物在制备用于在有此需要的受试者中治疗或预防心血管疾病或由冠状病毒引起的疾病或症状的药物中的用途。式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物和/或式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物可以用于在有此需要的受试者中治疗或预防心血管疾病或由冠状病毒引起的疾病或症状。
本申请使用的术语“受试者”是指可潜在地从用式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物和/或式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物进行的治疗中受益的任何人类或非人类生物体。示例性受试者包括任何年龄的人类或哺乳动物。优选地，所述受试者是人。
本文使用的术语“治疗”包括在哺乳动物、尤其人类中治疗疾病或症状且包括：(a)抑制疾病或症状，即遏制或延缓疾病或症状的发展；(b)缓解疾病或症状，即引起疾病或症状的消退，和/或(c)疾病或症状的治愈。
本文使用的术语“预防”包括在哺乳动物、尤其人类中进行预防性疗法以旨在降低疾病或症状发生的可能性。可以根据与一般群体相比患有疾病或症状的风险增加为因素来选择接受预防性疗法的患者。“预防”可以包括对尚未呈现临床病况的受试者进行处置，和预防相同或类似临床病况的第二次出现。
本申请的发明人发现，本申请的化合物或旋光异构体或旋光异构体的混合物能够实现对心肌细胞的保护作用，例如在缺氧条件下维持心肌细胞的活力。因此，本申请的化合物或旋光异构体或旋光异构体的混合物可以用于预防或治疗心血管疾病。在一些实施方式中，心血管疾病选自冠心病、中风、心力衰竭、心肌病、心肌梗塞、心室功能障碍、心脏肥大、心肌重塑及心脏瓣膜病。
本申请的发明人发现，本申请的化合物或旋光异构体或旋光异构体的混合物能够抵抗冠状病毒，例如能够抑制冠状病毒进入细胞，例如受试者的细胞。因此，本申请的化合物或旋光异构体或旋光异构体的混合物可以用于预防或治疗由冠状病毒引起的疾病或症状。在一些实施方式中，所述冠状病毒选自严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。在一些实施方式中，所述冠状病毒是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。在一些实施方式中，由冠状病毒(例如SARS-CoV-2)引起的疾病或症状包括由所述病毒引起的肺炎(包括重症肺炎)、急性呼吸窘迫综合征、咳嗽、发热、乏力、头痛、呼吸困难、低氧血症、肌肉疼痛、胸闷、鼻塞、嗅觉和/或味觉异常、腹泻、细胞因子风暴等。
在第六方面，本申请提供了一种治疗或预防心血管疾病或由冠状病毒引起的疾病或症状的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物和/或式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物。
在一些实施方式中，本发明化合物或旋光异构体或旋光异构体的混合物可以通过口服、肠胃外、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、经肺、经呼吸道、经阴道、经直肠、腹膜内、病灶内、病灶周围等途径施用。
“治疗有效量”是指本申请化合物或旋光异构体或旋光异构体的混合物当单独或组合给药时有效治疗或预防心血管疾病或由冠状病毒引起的疾病或症状的量。
具体施用剂量将取决于施用途径、疾病的严重程度、患者的年龄和体重，以及主治医师在确定最适合特定患者的个体方案和剂量水平时通常考虑的其他因素。例如，本申请的化合物或旋光异构体或旋光异构体的日剂量可以为0.001-150mg/kg体重，例如0.01mg/kg体重，0.1mg/kg体重，1mg/kg体重，10mg/kg体重，50mg/kg体重，100mg/kg体重，等。
具体的施用频率可以由相关领域的技术人员确定，例如为1天1次、2天1次、3天1次、4天1次、5天1次、6天1次、1天2次、1天3次等。
本领域技术人员能够理解，在本申请的一个方面中描述的定义和优选项同样适用于其他方面。本领域技术人员能够明了本申请各个方面的实施方式可以以各种方式组合，而不偏离本申请的主题和思想，这些组合也包括在本申请的范围内。
在本申请中，式(I)的化合物也被标记或称为化合物1或化合物(±)-1；式(I-1)的化合物也被标记或称为化合物(+)-1；式(I-2)的化合物也被标记或称为化合物(-)-1；式(II)的化合物也被标记或称为化合物2或化合物(±)-2；式(II-1)的化合物也被标记或称为化合物(+)-2；式(II-2)的化合物也被标记或称为化合物(-)-2。
附图说明
图1显示了式(I)，(II)，(I-1)、(I-2)、(II-1)和(II-2)化合物的立体化学结构。
图2显示了式(I-1)、(I-2)、(II-1)和(II-2)化合物的ECD实测与理论计算曲线图。
图3显示了式(I)化合物和式(II)化合物的相对立体构型图。
图4示例性显示了式(I)、(I-1)、(I-2)、(II)、(II-1)和(II-2)化合物对心肌细胞的保护活性(1μM)。平均值±SD n＝3；***，p<0.0001,****,p<0.00001相对于缺氧复氧组(H/R)；####，p<0.00001相对于正常组(control)。
图5示例性显示了式(I)、(I-1)、(I-2)、(II)、(II-1)和(II-2)化合物对心肌细胞的保护活性(10μM)。平均值±SD n＝3；***，p<0.0001,****,p<0.00001相对于缺氧复氧组(H/R)；####，p<0.00001相对于正常组(control)。
图6示例性显示了式(I-1)、(I-2)、(II-1)和(II-2)化合物抑制SARS-CoV-2假病毒进入宿主细胞的活性，甘草酸作为阳性对照化合物。与假病毒对照组相比，平均值±SD n＝3；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。。
图7示例性显示了式(I-1)化合物与SARS-CoV-2刺突RBD蛋白相互作用曲线。化合物的测试浓度分别为3.12，6.25，12.5，25，50和100μM。
具体实施方式
实施例1：式(I)化合物和式(II)化合物的分离、拆分和结构确认
取夏天无干燥块茎(由江西天施康中药股份有限公司提供)6kg，用一斤装高速中药粉碎机粉碎成粗粉，用80％(v/v)乙醇溶液回流提取3次，每次24L。合并提取液，减压浓缩得总提取物。将总提取物溶解于8L的1％HCl溶液中，3500rpm离心30分钟。上清液用10％氨水调节pH至10.0，依次用二氯甲烷(2L×4次)和水饱和正丁醇(2L×4次)萃取。萃取后水层(762g)用D101型大孔树脂柱(国药集团化学试剂有限公司，柱体积为2.8L,长×内径宽＝610×76mm)吸附，依次用水、10％、20％和95％的乙醇溶液洗脱，每个梯度洗脱8L，得W-a至W-d共4个部位。W-d部位(20g)经C18反相中压柱(Unisil10-120μm C18 Ultra Plus,长×内径宽＝460×36mm，苏州纳微科技股份有限公司)分离，洗脱溶剂为乙腈和10mM的醋酸铵溶液，流速为16ml/min，洗脱梯度为乙腈-10mM醋酸铵溶液(10∶90→60∶40，v/v)，梯度洗脱3小时，最后得W-d-1至W-d-9共9个流份。
W-d-4(2.3g)用C18反相制备柱(Agilent Eclipse XDB-C18 5μm,250×9.4mm)等度洗脱，水相为含0.1％甲酸和10mM醋酸铵水溶液，有机相为乙腈，乙腈比例23％，得W-d-4-1至W-d-4-4共4个流份。W-d-4-2(610mg)进一步通过制备柱(Waters Xselect CSH Phenyl-Hexyl OBD Prep Column,5μm,250×10mm)纯化，0.1％甲酸水溶液-乙腈(78∶22)等度洗脱，得到式(I)化合物(58mg，tR＝10.0min)。
同以上方法，分离纯化W-d-6(2.0g)，以0.1％甲酸水溶液-乙腈(77∶23)等度洗脱，得到式(II)化合物(180mg，tR＝13.5min)。
式(I)化合物(11.7mg)和式(II)化合物(22mg)用正相手性柱(CHIRALCEL OZ-Hchiral column 5μm,250×10mm)拆分，流动相分别为正己烷-乙醇＝65:35和正己烷-乙醇＝55:45，乙醇均添加0.1％的冰醋酸和0.1％的二乙胺，用反相制备柱(Waters XselectCSH Phenyl-Hexyl OBD Prep Column,5μm,250×10mm)除去残留的冰醋酸和二乙胺，最终得到式(I-2)化合物(tR 41.2min,5.3mg)和式(I-1)化合物(tR 51.9min,5.6mg)以及式(II-2)化合物(tR 19.3min,10.2mg)和式(II-1)化合物(tR 27.8min,10.0mg)。
将式(I)化合物命名为5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐((±)-Decumicorine A)为棕黄色晶体(MeOH/H2O，5:1，v/v)；熔点：177-178℃；[a]20 D 1.7(c 0.5,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)232.0(4.04),255.3(3.84),276.0(3.78),317.0(3.52)nm；IR(KBr)νmax 3564,3389,3019,2964,2937,2837,1614,1574,1516,1493,1402,1325,1302,1261,1215,1163,1134,1078,1003,964,874,849cm-1。1H和13C NMR数据详见表1；HRMS(ESI-TOF)m/z 532.1945[M+H]+(计算值C30H29NO8,532.1966)。
式(I-2)化合物为浅黄色晶体(MeOH/H2O,5:1,v/v)；熔点：164-165℃；[a]20 D-110.4(c 0.5,MeOH)；ECD(MeOH)λmax(Δε)207.1(-20.2),234.5(5.5),251.5(-2.7),278.2(-3.0)nm。
式(I-1)化合物为棕黄色结晶(MeOH/H2O,5:1,v/v)；熔点：171-172℃；[a]20 D118.1(c 0.5,MeOH)；ECD(MeOH)λmax(Δε)206.5(21.1),233.0(-5.1),251.8(3.1),275.5(2.9)nm。
式(II)化合物命名为表-5,6,8,13-四氢-3-羟基-2,9,10-三甲氧基-7’-(3’-甲氧基-4’-羟基苯基)-8’-羧基-8,13-乙桥二苯并[a,g]喹啉铵内盐((±)-epi-DecumicorineA)，为浅黄色晶体(EtOH/H2O,30:1，v/v)；熔点：187-188℃；[a]20 D 2.2(c 0.5,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)252.1(4.11),276.0(3.80),313.9(3.93),375.9(4.06)nm；IR(KBr)νmax2999,2941,2835,1717,1670,1609,1556,1518,1493,1464,1431,1398,1373,1313,1273,1227,1161,1080,1001,851,804cm-1。1H和13C NMR数据详见表1；HRMS(ESI-TOF)m/z532.1979[M+H]+(计算值C30H29NO8,532.1966)。
式(II-2)化合物为浅黄色粉末；[a]20 D-139.1(c 0.5,MeOH)；ECD(MeOH)λmax(Δε)203.5(-23.8),231.1(6.0),247.8(-2.2)nm。
式(II-1)化合物为浅黄色粉末；[a]20 D 148.4(c 0.5,MeOH)；ECD(MeOH)λmax(Δε)203.5(26.7),230.5(-7.1),247.2(2.8)nm。
式(I-1)、(I-2)、(II-1)和(II-2)化合物的绝对构型(见图1)的确认采用一维和二维NMR分析，ECD计算、单晶衍射分析，最终确认式(I-2)和式(I-1)的绝对构型分别为8R,13S,7′R,8′S和8S,13R,7′S,8′R；式(II-2)和式(II-1)的绝对构型分别为8R,13S,7′S,8′R和8S,13R,7′R,8′S。ECD实测与理论计算曲线见图2，单晶衍射分析结果见图3。其中，旋光值的测定仪器为Rudolph Research Autopol I automatic polarimeter；紫外和CD光谱在JASCO J-1500型高性能圆二色光谱仪上测定；红外光谱数据在IRAffinity-1S FT-IRspectrometer(KBr,Shimadzu,Japan)上测定；熔点在本昂全自动熔点仪BA-350上测得；核磁数据采集在Bruker 600MHz超导核磁共振波谱仪上进行；高分辨质谱数据在Agilent液质联用仪1290InfinityⅡUHPLC-6230TOF-MS上采集；单晶X射线衍射仪为Rigaku OxfordDiffraction，SuperNova。
表1.式(I)化合物和式(II)化合物的1H和13C NMR光谱数据(CD3OD)
实施例2：式(I)化合物和式(II)化合物的仿生合成
按照如上合成路线合成式(I)化合物和式(II)化合物。具体地，将盐酸药根碱(3.73mg，1mmol)和阿魏酸(3.88mg，2mmol)溶解于1mL无水甲醇中，搅拌下加入无水碳酸钾(2.76mg，2mmol)，升温至38℃反应6天。LC-MS检测到盐酸药根碱完全消失后，加入甲酸(1.5μL，4mmol)中和反应混合物，然后用反相苯基制备柱(Waters Xselect CSH Phenyl-HexylOBD Prep Column,5μm,250×10mm)纯化，条件为乙腈-0.1％甲酸水溶液＝20∶80，得到式(I)化合物(1.07mg，收率20.11％)和式(II)化合物(3.10mg，收率58.27％)。核磁和质谱数据与实施例1中记载的夏天无药材分离得到的式(I)化合物和式(II)化合物一致。
实施例3：式(I)、(I-1)、(I-2)、(II)、(II-1)和(II-2)化合物对心肌细胞的保护作用
将大鼠心肌H9c2细胞系(购自ATCC(Manassas，Virginia，美国)在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中在含有5％CO2的潮湿环境的37℃培养箱中培养。在细胞活性分析中，将心肌细胞H9c2的指数生长细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔微板(Labware,美国)中的100μL培养基中，并在处理前使之粘附24小时。在心肌细胞缺氧复氧模型中，将H9c2细胞置于无糖DMEM培养基，在94.9％N2/5％CO2/0.1％O2的缺氧培养箱(whitley H35 hypoxystation，Don Whitley Scientific Ltd.，英格兰)培养12个小时后，式(I)、(I-1)、(I-2)、(II)、(II-1)和(II-2)化合物共6个样品(1μM和10μM)添加至细胞中，以人参皂苷Rg1(购自中国食品药品检定研究院)(100μM)为阳性对照，于含有5％CO2的潮湿环境的37℃培养箱中复氧培养6小时。缺氧复氧培养后，在细胞活力测定实验中向各孔中添加MTT溶液(每孔100μL，0.5mg/mL溶液)，并在37℃下孵育4小时。随后，添加150μL二甲基亚砜(DMSO)，使用SpectraMax190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，美国)在570nm下量热法测定所得溶液的光密度。
活性结果显示(见图4和图5)：与缺氧复养组(H/R)相比，在使用不用浓度(即1μM，10μM)的式(I)、(I-1)、(I-2)、(II)、(II-1)和(II-2)化合物处理后，H9c2细胞活力提高。
实施例4：式(I-1)、(I-2)、(II-1)和(II-2)化合物抗SARS-CoV-2的生物活性
1.假病毒实验
首先，将HEK293T/hACE2细胞(高表达人ACE2受体的HEK293T，购于北京义翘神州科技股份有限公司)以1×104细胞/孔接种在96孔板中，将细胞在5％CO2的37℃恒温箱中培养24小时。将30μL SARS-CoV-2假病毒(25μg/mL水溶液,Sino Biological,Cat 40592-V08H)与70μL培养基混合后，再与100μL含各化合物的培养基混合。立即将上述200μL假病毒和化合物的混合溶液添加到细胞中用以感染细胞。感染48小时后，吸出培养基，并将100μL细胞裂解液添加到每个孔中。10分钟后，按照Firefly荧光素酶报告基因分析试剂盒(Beyotime，RG005)的操作流程，向每个孔中添加50μL发光溶液后，立即通过酶标仪(SpectraMaxParadigm,Molecular Devices，美国)在568nm处测量荧光素酶的发光强度。将假病毒对照组的相对光单位(RLU)定义为100％，并相应地将化合物处理组的RLU值标准化。
通过SARS-CoV-2假病毒抑制试验，我们评估了式(I-1)、(I-2)、(II-1)和(II-2)化合物对假病毒进入HEK293/hACE2细胞的抑制活性。仅感染SARS-CoV-2假病毒的HEK293T/hACE2细胞被视为假病毒对照组，将假病毒对照组的荧光素酶发光值定义为100％，给药组的荧光素酶发光值以假病毒组的相对百分比来进行表述。其中阳性对照甘草酸购自中国食品药品检定研究院。
结果如图6和表2所示，式(I-1)化合物能够剂量依赖性地降低假病毒的进入率，在测试药物浓度(25μM，50μM和100μM)下，对假病毒的抑制率为17.06％-28.19％。此外，在100μM药物浓度下，式(I-2)、(II-1)和(II-2)化合物对假病毒进入宿主细胞也具有抑制作用，抑制率分别为17.23％，23.76％和17.71％。
表2.化合物对SARS-CoV-2假病毒进入宿主细胞的百分抑制率(n＝3)
2.生物膜干涉实验
采用生物膜干涉法分析了各化合物与SARS-CoV-2刺突的RBD蛋白的结合动力学。首先，将带组氨酸标签的SARS-CoV-2刺突RBD蛋白(25μg/mL水溶液，北京义翘神州科技有限公司，Cat 40592-V08H)固定在Ni-NTA生物传感器(Fortebio，Inc)上。将样品溶液(用DMSO溶解的母液浓度为50mM)用PBS缓冲液连续稀释，亲和力测试的最终DMSO浓度为0.2％，测试温度为30℃。固定蛋白的传感器和空白生物传感器均在室温下于PBS缓冲液中平衡10分钟，然后将涂有刺突RBD蛋白的生物传感器浸入含有样品溶液的测试孔中进行亲和力测试，获得样品与蛋白相互作用的信号。同时，将固定蛋白质的生物传感器浸入空白缓冲液中获得背景信号，将该背景信号从所有样品中扣除。然后通过使用Octet Data Analysis软件v11.1(ForteBio)将双扣除后的传感图拟合为1:1结合模型，以计算平衡解离常数(KD)值。
SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白对宿主细胞的ACE2受体的特异性识别在病毒感染宿主的过程中起着至关重要的作用。因此，我们采用生物膜干涉法(BLI)测定了各化合物与SARS-CoV-2刺突蛋白的活性结合域(RBD)的亲和力。因甘草酸已被报导其与SARS-CoV-2刺突蛋白具有较好的亲和能力，因此在本实验中被用作阳性对照化合物。如图7和表3所示，式(I-1)化合物与SARS-CoV-2刺突蛋白具有明显的相互作用，其KD值为22.2μM，明显强于阳性对照甘草酸与刺突蛋白的结合能力(KD值为170.0μM)。该结果表明各化合物通过与刺突蛋白结合而对SARS-CoV-2假病毒进入宿主细胞显示出抑制作用。
表3.化合物与SARS-CoV-2刺突RBD蛋白的平衡解离常数(KD)值(n＝3)
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Claims (16)

1.一种式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物：
2.权利要求1所述的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，其中式(I)化合物的旋光异构体为式(I-1)所示的旋光异构体：
3.权利要求1所述的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，其中式(I)化合物的旋光异构体为式(I-2)所示的旋光异构体：
4.权利要求1所述的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，其中式(I)化合物的旋光异构体的混合物为式(I-1)所示的旋光异构体和式(I-2)所示的旋光异构体的混合物。
5.一种式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物：
6.权利要求5所述的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，其中式(II)化合物的旋光异构体为式(II-1)所示的旋光异构体：
7.权利要求5所述的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，其中式(II)化合物的旋光异构体为式(II-2)所示的旋光异构体：
8.权利要求5所述的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，其中式(II)化合物的旋光异构体的混合物为式(II-1)所示的旋光异构体和式(II-2)所示的旋光异构体的混合物。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项所述的式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物和/或权利要求5至8中任一项所述的式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物，以及药学上可接受的载体。
10.一种制备权利要求1所述的式(I)的化合物或权利要求5所述的式(II)的化合物的方法，其包括使盐酸药根碱和阿魏酸在无机碱作为催化剂的条件下反应。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述无机碱是无水碳酸钾。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述反应在36-40℃下进行。
13.权利要求1至4中任一项所述的式(I)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物和/或权利要求5至8中任一项所述的式(II)的化合物或其旋光异构体或旋光异构体的混合物在制备用于在有此需要的受试者中治疗或预防心血管疾病或由冠状病毒引起的疾病或症状的药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，所述心血管疾病选自冠心病、中风、心力衰竭、心肌病、心肌梗塞、心室功能障碍、心脏肥大、心肌重塑和心脏瓣膜病。
15.根据权利要求13所述的用途，其中所述冠状病毒是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
16.根据权利要求13或15所述的用途，其中所述由冠状病毒引起的疾病或症状选自以下中的一种或更多种：由所述病毒引起的肺炎、急性呼吸窘迫综合征、咳嗽、发热、乏力、头痛、呼吸困难、低氧血症、肌肉疼痛、胸闷、鼻塞、嗅觉和/或味觉异常、腹泻、细胞因子风暴。
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