KR20090021611A - 동물의 면역능을 증강시키는 노란 민들레 열탕 추출물, 그제법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물의 주요 면역세포인 호중구 및 림프구(마우스 비장세포)의 각종 활성을 증강시키고 병원성세균의 공격접종에 대한 비특이적인 방어능을 증진시키는 노란 민들레(Taraxacum platycarpum H. Dahlstedt) 열탕추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강제, 백신보좌제 첨가물 및 보조치료제에 관한 것이다.
노란 민들레, 열탕추출물, 호중구, 유주능, 과산화물(superoxide), 포도상구균

Description

동물의 면역능을 증강시키는 노란 민들레 열탕 추출물, 그 제법 및 용도{Extract of Taraxacum platycarpum H. Dahlstedt for improving immunity of animals and the agent for improving immunity containing the same}
본 발명은 동물의 주요 면역세포인 호중구 및 림프구(마우스 비장세포)의 각종 활성을 증강시키고 병원성세균의 공격접종에 대한 비특이적인 방어능을 증진시키는 노란 민들레(Taraxacum platycarpum H. Dahlstedt) 열탕추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강제, 백신보좌제 첨가물 및 보조치료제에 관한 것이다.
동물에서 각종 병원미생물 침입에 1차적으로 저항할 수 있는 면역을 담당하는 것은 체내에 있는 주요 탐식세포인 호중구(neutrophil) 및 대식구(macrophages)이고, 2차적으로 특이면역을 이끄는 면역세포는 림프구(lymphocytes, T/B cell) 등이며 이들의 활성이 비정상적일 때 병원미생물이 감염, 증식하여 발병하게 된다. 면역증강물질은 이러한 질병 방어에 주요 역할을 담당하고 있는 각종 면역세포의 기능을 증강시켜 질병감염에 대한 특이 및 비특이 저항성을 높여 준다. 이러한 면 역증강물질은 동물, 식물 및 미생물 등 다양한 생물체에 존재하는 것으로 알려져 있으며 인삼, 버섯 등 다양한 식물로부터 추출한 많은 물질이 사람 및 동물의 면역증강제로서 개발되어 사용되고 있다.
민들레는 들판에서 볕이 잘 드는 곳에서 자라며 줄기가 없고, 잎이 뿌리에서 뭉쳐나며 옆으로 퍼진다. 잎은 거꾸로 세운 바소꼴이고 길이가 6∼15cm, 폭이 1.2∼5cm이며 깃꼴로 깊이 패어 들어간 모양이고 가장자리에 톱니가 있고 털이 약간 있다. 꽃은 4∼5월에 노란색으로 피고 잎과 길이가 비슷한 꽃대 끝에 두상화(頭狀花:꽃대 끝에 꽃자루가 없는 작은 꽃이 많이 모여 피어 머리 모양을 이룬 꽃)가 1개 달린다. 꽃대에는 흰색 털이 있으나 점차 없어지고 두상화 밑에만 털이 남는다. 총포는 꽃이 필 때 길이가 17∼20mm이고, 바깥쪽 총포 조각은 좁은 달걀 모양 또는 넓은 바소 모양이며 곧게 서고 끝에 뿔 모양의 돌기가 있다. 열매는 수과이고 길이 3∼3.5mm의 긴 타원 모양이며 갈색이고 윗부분에 가시 같은 돌기가 있으며 부리는 길이가 7∼8.5mm이고 관모는 길이가 6mm이며 연한 흰빛이 돈다. 봄에 어린 잎을 나물로 먹는다. 한방에서는 꽃피기 전의 식물체를 포공영(蒲公英)이라는 약재로 쓰는데, 열로 인한 종창·유방염·인후염·맹장염·복막염·급성간염·황달에 효과가 있어 동서양에서 식용과 약용 특히 각종 염증치료의 민간요법으로 널리 사용되고 있으며, 열로 인해 소변을 못 보는 증세에도 사용한다. 민간에서는 젖을 빨리 분비하게 하는 약제로도 사용한다.
이에 본 발명자들은 민들레로부터 동물의 면역능을 향상시킬 수 있는 신규한 물질을 물리적인 방법으로 추출하고, 이를 이용하여 각종 면역세포 활성 증강효능을 가지는 백신, 면역증강제 생산 및 보조 치료제를 개발하여 실용화 및 산업화하고자 하였다.
본 발명자들은 천연물질을 이용한 면역증강물질 개발연구의 일환으로 동물의 면역능을 증강시키는 노란 민들레 열탕추출물에 대한 병원성미생물 감염시 1차 방어의 중추적 역할을 하는 혈중 호중구의 각종 활성에 미치는 효과와 림프구(마우스 비장세포) 증생 활성 및 병원성미생물 공격접종에 대한 비특이적인 방어능을 시험하여 면역증강 활성이 우수한 신규한 물질을 개발하였다.
즉, 민들레 열탕추출물이 각종 면역세포 활성 증강효능을 시험하여 동물의 주요 면역세포인 호중구 무작위유주능, 지향성유주능 및 항미생물성 과산화물 산생, 및 병원균에 대한 비특이적인 방어능 향상 효과를 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서는 민들레 열탕추출물을 함유하는 면역증강제, 백신보좌제 첨가물 및 보조 치료제를 제공한다.
본 발명에 의한 민들레 열탕추출물은 호중구의 유주능을 향상시키고, 호중구의 과산화물 산생을 증강시키며, 병원성 포도상구균에 대하여 비특이적인 방어능을 가졌다.
본 발명에서 사용하는 민들레 열탕추출물은 산야에서 자생하고 있는 민들레를 열탕추출하여 제조한 것으로서, 보다 상세하게는 민들레 전초를 건조하여 꽃을 제거한 다음 분말화하고 이 민들레 분말을 90~100℃에서 증류수로 열탕추출하여 얻을 수 있다.
본 발명에 의한 민들레 열탕추출물은 호중구의 유주능을 향상시키고, 호중구의 과산화물 산생을 활성화시키며, 병원성 포도상구균에 대하여 비특이적인 방어능을 가진다.
따라서, 본 발명에 의한 민들레 열탕추출물은 단독으로 또는 통상적으로 사용되는 첨가물들과 함께 혼합되어 면역증강제, 백신 보좌제 첨가물 또는 보조 치료제로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이며, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
[실시예 1] 노란 민들레로부터 유효물질 추출
경가도 안양지역에서 자생하는 노란 민들레 전초를 채집하여 그늘에서 7-10일간 건조시킨 후 꽃을 제거한 전초를 믹서기로 갈아 거칠은 분말을 만들었다. 민들레 분말 50g을 증류수 500ml에 넣어 초자 약탕기에서 열탕하면서 액체의 양이 100ml가 되도록 농축하였다. 이 추출액을 여과지로 1차 여과한 다음 0.45㎛ 세균여과지로 여과멸균한 후 공병에 분주하여 냉동보관하면서 시험에 사용하였다.
[시험예 1] 노란 민들레 열탕추출물의 당성분 분석
식물 추출물에서 얻어지는 면역증강물질이 다당체로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 의한 실시예 1의 민들레 열탕추출물에 존재하는 면역증강물질인 다당체의 함량을 알아보기 위하여 당성분 분석을 실시하였다.
실시예 1에서 제조한 민들레 추출물의 주요 다당체(polysaccharides) 함량을 단당류인 글루코오스(Glucose)를 기준당으로 하여 이온크로마토그라피법(Dionex US/IC25A, ion chromatography))을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
번호 잔류시간 (min) 높이 (nC) 면적 (nC*min) 관련 영역 (Rel. Area) 유형
1 1.467 159.454 18.765 0.85 BMB
2 1.600 76.363 6.434 0.29 Ru
3 2.100 443.346 84.668 3.84 BMB*
4 11.467 1597.931 1928.997 87.43 BMb
5 17.350 67.402 55.971 2.54 bMB*
6 22.817 35.978 3.746 0.17 Ru
7 22.984 752.229 107.836 4.89 BMB*
합계 3132.702 2206.417 100.00
상기 표 1의 당분석 결과, 본 발명에 의한 민들레 열탕추출물이 글루코오스 0.024mg/ml 및 프럭토오스 0.54mg/ml를 함유하고 있음을 알 수 있었다.
[시험예 2] 노란 민들레 열탕추출물의 산양혈중 호중구(neutrophil)의 무작위유주능(Random migration) 증강효과
1) 산양혈중 호중구 분리 및 분비 추출물로 혼합처리
산양의 경정맥으로부터 혈액을 채혈하여 항응고제인 에이시디액(ACD, sodium citrate, citric acid, dextrose)과 혼합하고 2,500xg, 20분 원심분리하여 연막(buffy coat)을 제거한 후 적혈구를 용혈시켜 1500xg, 5분 원심분리하여 호중구를 수집한 다음 알피엠아이(RPMI1640)배지에 호중구수가 1x107/ml가 되도록 부유하여 시험에 사용하였다. 노란 민들레열탕 추출물로 호중구를 혼합처리하기 위하여 냉동보관중인 실시예 1의 민들레 열탕추출물 원액을 알피엠아이배지로 10배, 100배 및 1000배로 희석하고 같은 양(30㎕)의 호중구부유액(1x107/ml)과 혼합하여 탄산가스배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 1시간 혼합처리하였다.
2) 무작위유주능(Directional migration) 증강효과
실시예 1에서 제조한 민들레 열탕추출액과 혼합처리한 호중구 10㎕씩을 아가로오스 플레이트(agarose plate)에 직경 3mm되게 만든 홀(hole)에 넣고 탄산가스배양기에서 37℃, 18시간 적용 후 8% 구루타알데하이드액으로 고정하고 겔을 제거한 다음 세척, 건조하였다. 건조시킨 플레이트를 스타트염색액(Stat stain, Volu-Sol, Inc.)으로 염색하여 호중구가 유주한 거리를 현미경(MC-50T, MEIJI/Japan)으로 측정하고 호중구의 유주면적을 하기 수학식 1로 계산하였다.
유주면적 = πr2-π(홀 반지름)2
또한 민들레 열탕추출물로 희석 배수별로 처리한 산양 혈중 호중구의 무작위유주능에 미치는 영향을 하기 표 2에 나타내었다.
노란 민들레 열탕추출물로 처리한 산양혈중 호중구의 무작위유주능에 미치는 영향
시험물질 희석 배수별 유주면적(㎟)
실시예 1 10배 42.09±14.13
100배 50.98±11.39*
1000배 52.07±1.02**
대조군 - 40.70±13.77
상기 표 2의 결과에서, 실시예 1의 민들레 추출물을 10배, 100배, 1000배로 처리한 호중구의 유주면적이 각각 42.09, 50.98 및 52.07㎟으로 대조군의 40.70㎟에 비하여 100배 및 1000배로 처리한 호중구의 무작위유주능이 현저한(p<0.01~0.05) 차이를 나타내었다.
[시험예 3] 지향성유주능(Directional migration) 증강효과 조사
무작위유주능에서와 같은 방법으로 실시예 1의 민들레 열탕추출물과 희석배수별로 혼합처리한 호중구 10㎕를 아가로즈 플레이트(agarose plate)에 직경 3mm가 되도록 일렬로 만든 3개의 홀(hole)중 가운데 홀에 넣고 나머지 두 홀에는 10㎕의 인산완충식염수액(PBS, pH 7.2)과 자이모산(Zymosan A, Sigma Z-4250)으로 옵소닌(opsonization) 처리한 염소보체를 각기 넣고 탄산가스배양기에서 37℃, 3-5시간 적용후 8% 구루타알데하이드액으로 고정하고 겔을 제거한 다음 세척, 건조하였다. 건조시킨 플레이트를 스타트염색액(Stat stain, Volu-Sol, Inc.)으로 염색하여 인산완충식염수액과 옵소닌 처리 염소보체쪽으로 호중구가 유주한 거리를 각각 현미경(MC-50T, MEIJI/Japan)으로 측정하였고 호중구의 유주거리 차이를 하기 수학식 2로 계산하였다.
유주거리 = 옵소닌 처리한 염소보체로 유주한 거리 - 인산완충식염수액으로 유주한 거리
또한 희석 배수별 민들레추출물로 처리한 산양 혈중 호중구의 지향성 유주능에 미치는 영향을 표 3에 나타내었다.
노란 민들레 열탕추출물로 처리한 산양혈중 호중구의 지향성 유주능에 미치는 영향
시험물질 희석 배수별 유주거리(mm)
실시예 1 10배 1.81±0.01**
100배 1.56±0.14
1000배 1.59±0.05*
대조군 - 1.35±0.57
상기 표 3의 결과에서, 추출 원액을 10배, 100배 및 1000배로 희석한 실시예 1의 민들레 열탕추출물로 처리한 호중구의 지향성 유주거리가 각 1.81, 1.56 및 1.59mm로서 대조군의 유주거리 1.35mm에 비하여 현저한(p<0.01~0.05) 차이를 보였다.
[시험예 4] 노란 민들레 열탕추출물의 산양혈중 호중구(neutrophil) 항미생물성 과산화물(superoxide, O2-) 산생능 조사
침입 병원체를 탐식한 호중구가 이들을 살균하기 위하여 폭발적 산소호흡(respiratory burst)에 이은 살미생물성 산소대사산물인 과산화물(superoxide, O2-) 산생능을 엔비티(NBT)법으로 시험하였다.
1) 산양혈중 호중구의 민들레 추출물로 혼합처리
추출물로 호중구를 혼합처리하기 위하여 냉동보관중인 추출물 원액을 알피엠아이배지로 10배, 100배 및 1000배가 되도록 희석하고 같은 양(30㎕)의 호중구부유액(1x107/ml)과 혼합하여 탄산가스 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 1시간 혼합처리하였다.
2) 과산화물 산생능 조사
희석배수별 민들레 추출물과 혼합처리한 호중구(2x106/ml) 50㎕와 얼스액(Earls balanced salt solution, EBSS)과 염소보체로 옵소닌 처리한 자이모산 부유액 각 25㎕를 조배양용 마이크로플레이트(Costar, 96 well)의 홀에 3회 반복하여 넣고 탄산가스배양기에서 37℃, 1시간 작용시킨 후 각 홀에 엔비티시액(NBT, nitroblue tetrazolium)을 100㎕(4mg/ml)씩 가하고 탄산가스배양기에서 3시간 반응시킨 다음 과산화물(superoxide) 생성양에 비례하여 형성된 자주색의 포르마잔(formazan) 입자를 디엠에스오(DMSO) 100㎕를 가하여 녹인 후 흡수파장 560nm에서 흡광도를 ELISA 판독기(Titertec multiscan)로 판독하여 과산화물 생성양을 측정하였다. 실시예 1의 민들레 열탕추출물의 희석 배수별로 처리한 산양 혈중 호중구의 과산화물 산생능에 미치는 영향을 표 4에 나타내었다.
노란 민들레 열탕추출물로 처리한 산양혈중 호중구의 과산화물 산생능
시험물질 희석 배수별 광학적 밀도(O.D)
실시예 1 10배 0.6187±0.207
100배 0.7173±0.036**
1000배 0.5470±0.018
대조군 - 0.4808±0.067
상기 표 4의 결과에서, 실시예 1의 민들레 열탕추출물로 10배, 100배 및 1000배 농도로 처리한 호중구의 과산화물 산생양에 따른 광학적밀도(O.D) 수치는 각 0.6187, 0.7173 및 0.5470으로 대조군의 0.4808에 비하여 100배 및 1000배로 처리한 경우 무처리 대조군보다 현저히(p<0.01-0.05) 높은 과산화물 산생능을 보였다.
[시험예 5] 노란 민들레 열탕추출물의 병원성포도상구균(pathogenic Staphylococcus aureus) 공격 접종에 대한 방어능
민들레 열탕추출물의 병원미생물에 대한 비특이적인 방어능을 시험하기 위하여 병원성 포도상구균을 공격접종하고 그에 대한 마우스의 방어능으로 시험하였다.
1) 민들레 열탕추출물의 마우스접종 및 공격접종
실시예 1의 민들레 열탕추출물 원액 및 10배 희석액을 각기 25g의 아이시알(ICR, ♂) 마우스 복강으로 0.2ml를 4수씩에 접종하고 3일후에 병원성 포도상구균(Staphylococcus aureus, strain 289)으로 최소치사량의 10배(10MLD/0.3ml)양을 복강으로 공격접종한 후 7일간의 생존율로 방어효과를 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
민들레 열탕추출물의 병원성포도상구균 공격접종에 대한 방어능
시험물질 접 종 (0.2ml, 복강) 공격접종 방어효과(%)
실시예 1 원 액 0.3ml(10MLD) 복 강 1/4*(75)
10배 희석액 “ 3/4(25)
대조군 - “ 4/4 (0)
* 폐사 마리수/공격접종 마우스 수 x 100
상기 표 5의 결과에서, 실시예 1의 민들레 열탕추출물 원액을 접종한 마우스는 병원성 포도상구균 공격접종에서 4수중 3수가 생존하여 75%의 방어율을 나타내었으며 10배액을 접종한 마우스는 4수 중 1수가 생존하여 25%의 방어율을 나타낸 반면 대조군 마우스는 모두 폐사하여 민들레 열탕추출물의 우수한 비특이적 방어능을 확인할 수 있었다.
본 발명에서는 동물의 각종 면역세포의 활성을 증진시키고 병원미생물에 대한 비특이 방어능을 향상시키는 민들레 열탕추출물을 함유하는 면역증강제, 백신보좌제 첨가물 및 보조치료제로서 활용효과가 높을 것으로 기대되며 이에 따른 양축농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 금후 다양한 동물용 의약품 제조에 활용하여 수입 동물용 의약품과의 경쟁력도 강화시킬 수 있을 것이다.
도 1은 민들레 열탕추출물 중 주요 면역증강물질인 다당체(polysaccharides) 양을 단당류인 글루코오스 및 프럭토오스 양을 표준당으로 하여 분석한 것으로 성분 함량 및 물질의 표준화에 적용한 결과를 보여준다.

Claims (2)

  1. 민들레 열탕추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 민들레 열탕추출물은 민들레를 90~100℃에서 증류수로 열탕추출하여 제조된 것임을 특징으로 하는 면역증강제.
KR1020070086251A 2007-08-27 2007-08-27 동물의 면역능을 증강시키는 노란 민들레 열탕 추출물, 그제법 및 용도 KR20090021611A (ko)

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KR101315261B1 (ko) * 2010-12-29 2013-10-10 대한민국 민들레 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 조성물

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KR101315261B1 (ko) * 2010-12-29 2013-10-10 대한민국 민들레 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 조성물

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