KR20090014577A - 클로트리마졸을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료및 예방용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로트리마졸을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 클로트리마졸은 부작용이 적으면서도 염증성 장질환 모델에서 효과적인 치료효과를 나타낼 뿐 아니라, IL-8에 의해 유도된 혈관신생을 유의적으로 억제함으로써 신뢰할 수 있는 염증성 장질환의 치료제로 사용가능하다.

클로트리마졸, 염증성 장질환, 혈관신생

Description

클로트리마졸을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating and preventing inflammatory bowel disease comprising clotrimazole}

본 발명은 클로트리마졸을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 임상적으로 유사하면서도 조직학적 소견과 내시경 및 면역학적 측면에서 서로 다른 염증성 대장염 및 크론병의 두 가지 질환으로 분류된다.

크론병 환자의 약 70%는 수술적 치료를 받고 그 중 40-50%는 재수술을 받고 있는 반면, 염증성 대장염 환자의 경우는 20-25% 정도의 환자가 수술요법을 받는 것으로　알려져 있다. 그러나, 이 두 가지 질환 모두 그 병인에 대해서는 아직도 잘 알려져 있지 않기 때문에 약물요법은 매우 제한적이며, 염증의 일반 과정에 대한 억제 정도로 이루어지고 있다.

최근 들어 만성 장염에서 면역세포와 사이토카인 및 키모카인들의 역할에 대한 연구가 활성화되고 있어, 이들 인자의 제어를 통한 치료에 초점이 맞추어 지고 있다. 최근 염증 매개인자에 대한 항체를 이용한 치료가 시도되고 있으나, 아직 효과적인 치료제는 개발되지 못한 실정이다.

염증 매개인자들은 장관 조직의 파괴를 촉진하는데, 특히, 화학주성인자(chemoattractant) 역할을 하는 키모카인들은 호중성 백혈구(neutrophil) 등의 다핵성 백혈구를 활성화시키고 염증 병소로 백혈구 이주에 필요한 유착분자(adhesion molecule)의 발현을 증가시킨다.

IBD에 관련된 키모카인으로는 단핵구 화학주성 단백질-1(monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1), 대식세포 염증성 단백질-1α(macrophage inflammatory protein-1α; MIP-1α), 인터페론-유도성 단백질 10(interferon-inducible protein 10; IP 10), 에오탁신(eotaxin) 및 인터루킨-8(interleukin-8; IL-8) 등이 있다.

특히, IL-8은 염증성 대장염 및 크론병 환자 모두 염증 병소의 유무와 관계없이 장 점막에 그 발현이 매우 증가되어 있으며, IL-8을 생성하는 세포의 수가 많을수록 IBD에서 염증의 정도가 심하게 나타나는 것으로 보고되었다.

혈관신생은 상처가 치유되는 과정에서 수반되고 그 과정이 잘 조절되고 있는 생리적 경우 외에 암을 비롯한 만성 염증성 질환의 원인이 되는 병태생리학적인 경우로 구분되는데 염증성 장질환에서 혈관신생은 매우 중요한 병인으로 알려지고 있다.

즉, 새로 형성된 혈관의 구조적 결함 때문에 염증반응을 가중시키고 호중성 단핵구 등의 염증성 세포를 더 더욱 끌어들이는 두 가지 병적 역할을 수행한다.

혈관신생은 여러 단계를 거쳐 일어나는 복합 과정이며 그 조절 또한 다양한 종류의 사이토카인, 세포외 기질, 내피세포의 표현형과 그에 따른 기능 등의 다양한 인자에 의해 조절된다. 특히 염증 병소에서 생성되는 IL-8은 혈관신생 촉진 인자로 잘 알려져 있다.

한편, 현재 염증성 장질환 치료제로는 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid; 5-ASA) 계통 약물 예를들어, 설파살라진 등을 이용하거나 스테로이드류의 면역억제제를 사용하고 있다.

설파살라진은 복부허실(fullness), 두통, 발진, 간질환, 백혈구 감소증, 무과립구증, 남성 불임 등과 같은 부작용 또는 역효과를 일으키기 쉽다. 또한, 설파살라진이 장의 환부를 절개한 환자 또는 차도가 있는 환자에게 충분한 재발 억제 효과가 있는지는 불분명하다.

스테로이드류의 면역억제제는 부신피질 스테로이드로서, 단기적인 효과는 인정받고 있지만, 장기적인 예후를 향상시킬 수는 없으며, 유도된 감염성 질환, 2차 부신피질 부전증, 소화성 궤양, 당뇨병, 정신장애, 스테로이드성 신장병 등과 같은 부작용의 측면에서 단지 급성인 경우에만 사용되어야 하는 한계가 있다.

따라서, 염증성 장질환에 대해 아직까지 신뢰할 만한 치료요법은 없으며 이러한 질환에 대해 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 부작용이 적으면서도 신뢰할 수 있는 염증성 장질환 치료제를 개발하고자 하는 데에 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 클로트리마졸을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 클로트리마졸은 하기 화학식 1로 표시되는 1-[(2-클로로페닐)디페닐메틸]-1H-이미다졸(1-[(2-chlorophenyl)diphenylmethyl]-1H-imidazole)의 화합물로, 피부 및 질 감염, 피부 사상균 감염증 등의 항진균제로 널리 사용되고 있다.

본 발명은 클로트리마졸이 염증성 장질환의 인비보 모델인 초산으로 유도한 장염에서 장 점막의 손상을 억제하고 장 점막의 염증 부위에 호중구 침윤의 측정 지표인 골수세포형 과산화수소(myeloperoxide; MPO) 활성을 억제하며, 또한 염증성 장질환의 인비트로 모델인 TNF-α로 유도한 단핵구와 장 상피유래세포 HT-29의 부착을 현저히 억제할 뿐 아니라, 장 상피유래세포 HT-29에서 TNF-α에 의한 IL-8의 분비를 현저히 감소시키며, IL-8으로 유도한 인비트로 및 인비보 혈관신생을 현저히 억제함으로써 염증성 장질환의 치료 및 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다는 새로운 용도를 발견하여 이루어졌다.

상기 클로트리마졸을 함유하는 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

본 발명의 클로트리마졸은 전체 약학조성물 100 중량부에 대하여 20-70 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 만약, 클로트리마졸이 상기 범위를 벗어나 소량으로 포함되면 염증성 장질환의 치료 및 예방 효과가 떨어지며, 상기 범위를 벗어나 과량으로 포함되면 용량에 비해 염증성 장질환의 치료 및 예방 효과가 둔화될 것이며, 클로트리마졸의 부작용도 야기될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정 제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 클로트리마졸의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 5 내지 50 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 클로트리마졸의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 클로트리마졸은 이미 공지된 바와 같이 50% 치사량(LC50)이 750 mg/kg 이하로 안정성이 확보된 화합물로서, 본 발명의 약학조성물에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 클로트리마졸을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 건강식품은 클로트리마졸 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 클로트리마졸의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 부작용이 적으면서도 염증성 장질환 모델에서 효과적인 치료효과를 나타낼 뿐 아니라, IL-8에 의해 유도된 혈관신생을 유의적으로 억제할 수 있는 클로트리마졸을 유효성분으로 함유함으로써 신뢰할 수 있는 염증성 장질환의 치료제로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 대장염에 대한 억제효과 검토

1) 대장염 유도

수컷 스프라그-돌리 랫트(Male Sprague-Dawley rat; 200-220g)를 실험동물로 사용하고 12시간 간격의 명암 주기로 공기조절실에서 사육하였다. 이때, 공기조절실은 사육 온도 21±1℃, 상대습도 60-70%로 일정하게 유지하였다. 랫트는 먹이와 물을 자유롭게 섭취하였다.

동물 실험은 한국국립보건원에서 발표한 기관 가이드라인에서 정한 윤리표준에 따라 실험동물을 관리하여 사용하였다. 대장염의 유도전에 랫트를 12시간 동안 물만 급여하고 절식시켰다.

랫트는 임의로 5군(각 군마다 n=6) 즉, 제1군은 음성 대조군(대장염 비유도군), 제2군은 양성 대조군(약물처리되지 않은 대장염 유도군), 제3군은 5-ASA(100mg/kg) 처리군, 제4군은 클로트리마졸(50mg/kg) 처리군, 제5군은 클로트리마졸(100mg/kg) 처리군으로 분류하였다.

대장염은 Sharon et al.(Gastroenterology, 88: 55-63, 1985)에 의해 기술된 이전의 방법으로 유도하였다. 대장염은 마취하에서 항문으로부터 5cm 떨어진 위치에 폴리에틸렌 배관의 팁을 통해 생리식염수로 희석된 4% 초산(pH 2.6) 2ml를 대장내로 투입함으로써 유도되었다.

초산은 서서히 대장 내강(lumen)으로 투입되었다. 초산 노출 30초 후 과도한 유량이 제거된 후 1.5ml의 인산완충식염수(pH 7.4)으로 대장을 씻어내렸다. 대장염 비유도군인 제1군은 초산 대신 등장성 식염수를 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실험하였다. 동물은 대장염 유도 5일째 되는 날 과량의 에틸에테르를 이용하여 희생되었다.

2) 약물 처리

대장 내강내 투입을 위하여 5-ASA를 준비하였다. 에탄올 완충액(2.5%, pH 7.4)은 다른 동물들을 위해 사용되었다. 대장염 유도 48시간 후, 제1군 및 제2군의 동물은 상기 에탄올 완충액을 3일 동안 내강으로 투입하고, 제3군의 동물은 5-ASA를 투입하며, 제4군 및 제5군은 각각 클로트리마졸 50mg/kg 및 100mg/kg을 투여하였다.

희생된 랫트의 항문 근처 10cm에서 채취한 대장 단편은 길이로 절단되고, 식염수 완충액으로 세정되고, 아이스콜드 플레이트로 옮겨진 후, 지방 및 장간막을 제거하고 필터페이퍼로 오염물을 제거하였다.

3) 병소의 현미경적 분석

상기와 같은 처리를 모르는 두명의 다른 사람이 현미경적 손상을 판정하였다. 원위결장(distal colon)은 장축으로 1cm의 단편 두께로 분할되었다. 각 동물에서 하나의 가장 말단 원위단편이 선택되어 10% 포르말린 용액에 고정되고 파라핀에 담두며 4-㎛ 구획이 준비되었다.

이에 가까운 단편은 -70℃에서 보관되고 골수세포형 과산화효 소(myeloperoxidase; MPO) 활성을 검토하였다. 구획들은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되고 맹검법으로 전문 병리학자에 의해 광학현미경으로 검토하였다.

육안관찰은 다음의 점수표를 이용하여 수행하였고, 그 결과는 표 1과 같다. 0 - 정상 점막, 점막 표면에 손상 없음; 1 - 가벼운 충혈 및 부종, 점막 표면에 미란 또는 궤양 없음; 2 - 중등의 충혈 및 부종, 점막 표면에 미란 관찰; 3 - 심한 충혈 및 부종, 점막 표면에 괴사 및 궤양 관찰.

4) 조직 MPO 활성 검토

조직 MPO 활성은 염증 조직에서 조직 호중성 백혈구(neutrophil) 축적을 측정하기 위해 자주 이용되며 대장 조직에서 조직화학적으로 정해진 호중성 백혈구의 수와 의미있는 상관관계를 보여왔다.

MPO 활성은 Krawisz et al.(Gastroenterology, 87: 1344-1350, 1984)에 의해 기술된 방법에 따라 측정되었다. 즉, 대장표본을 1ml의 얼음상 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide; HTAB) 완충액을 함유한 비이커에서 잘게 썰어 시험관으로 옮겨 균질화하였다.

그후 균질기에서 1ml HTAB로 2회 세정하였다. 합쳐진 균질물과 세정물을 10초 동안 초음파 처리하고 3회 동결-해동하며 MPO 활성을 측정하였다. 그 결과는 건조 조직 중량(w/w)의 그램당 MPO 단위로서 표현하였고, 1U MPO 활성은 25℃에서 과산화수소 1 mmol^-1 분해되는 것으로 정의하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

실험군	조직병리학적 점수	조직 MPO 활성
제1군(대장염 비유도군)	0±0.2	60.7±8.9
제2군(약물미처리 대장염 유도군)	18±3.2	180.9±10.9
제3군(5-ASA 처리군)	8.5±2.2	111.7±17.2
제4군(50mg/kg 클로트리마졸 처리군)	9.2±1.9	166.3±29.0
제5군(100mg/kg 클로트리마졸 처리군)	7.1±1.6	82.5±30.5

< 실시예 2> 세포 배양

이후 실험에서 사용될 세포들의 배양을 하기와 같이 수행하였다.

인간 제대정맥 내피세포(Human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)은 2% FBS, 아스코르브산, 히드로코티손, 인간 섬유아세포 성장인자(hFGF), 혈관내피성장인자(VEGF), 인간 상피성장인자(hEGF), 성장인자-1과 같은 long-R 인슐린(R³-IGF-1), 겐타마이신 설페이트(GA-100) 및 헤파린으로 보강된 EBM-2 배지를 이용하여 0.2% 젤라틴 코팅 플라스크에서 배양하였다. HUVEC는 1 내지 6 계대로 배양된 것을 실험에 이용하였다.

U937 세포는 10% FBS, 1mM 소듐 피루베이트, 200IU/ml 페니실린 및 200㎍/ml 스트렙토마이신을 함유한 RPMI1640 배지에서 배양되었다. 배양 배지는 하루 걸러 교체되었다. 컨플루언트하게 배양된 후, 1:5 비율로 스플리팅하여 서브컬처하였다.

장 상피유래세포 HT-29는 37℃, 5% CO₂/95% 공기 중에서 10% FBS, 1mM 소듐 피루베이트, 200IU/ml 페니실린 및 200㎍/ml 스트렙토마이신을 함유한 RPMI1640 배지에서 배양되었다. 배양 배지는 하루 걸러 교체되었다. 컨플루언트하게 배양된 후, 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 트립신 처리한 후 서브컬처하였다.

< 실시예 3> 세포 생존율 검토( MTT 에세이)

MTT 염색법(Loosdrecht et al., J Immunol Methods, 174(1-2): 311-320, 1994)을 이용하여 HUVEC의 세포 생존율을 검토하였다. 4 내지 5일 배양된 세포를 96웰 플레이트에 1X10⁵ cells/cm²의 농도로 분주하였다. 각 웰의 배지 부피는 100㎕로 하였다.

대조군 실험에 사용된 세포에는 동일 배지에서 약물이 처리되지 않은 용매를 첨가하면서 배양하였다. 세포들은 18 시간동안 약물로 처리된 후, 10㎕의 MTT(5g MTT/ℓ in PBS)를 가하고 4시간 동안 배양하였다.

200㎕의 DMSO를 각 배양물에 가하고 피펫팅하여 환원 MTT 결정을 용해하였다. 상대적인 세포 생존율은 540 nm 필터를 이용하여 마이크로플레이트리더(Molecular Devices, Menlo Park, CA)로 스캔하여 결정하였다.

그 결과, 도 1과 같이 농도의존적으로 클로트리마졸에 의해 HUVEC의 생존율이 저해되었다.

< 실시예 4> 유착증 에세이

37℃에서 1시간 동안 2',7'-비스(2-카르복시에틸)-5(6)-카르복시플루오레세인 아세톡시메틸 에스테르(BCECF/AM, 10㎍/ml)로 표식된 인간 백혈병 세포 U937 세포를 이용하여 단핵백혈구(monocyte) 유착을 검토하였다.

컨플루언트하게 24웰 플레이트에서 배양된 HT-29 세포는 24시간 동안 클로트리마졸로 전처리된 후, IL-8(50ng/ml) 및 TNF-α(10ng/ml)를 각각 이용하여 3시간 더 배양하였다. 그후, HT-29 세포는 37℃에서 30분 동안 BCECF/AM-전표식된 U937 세포(1X10⁶ cells/well)로 공배양되었다. 유착되지 않은 U937 세포는 제거되고 PBS로 2회 세정되었다.

얻어진 일정 세포는 디지털 카메라(TMS; Nikon, Japan)에 연결된 역광현미경에 의해 이미지화 되었다. 다른 세포는 0.1 mol/ℓ 트리스에 용해된 0.1% 트립톤 X-100에서 용해되었다. 485 nm에서 여기 및 520 nm에서 발광을 이용하여 플루오스타 옵티마 마이크로플레이트 리더(BMG LABTECH GmbH, Germany)로 형광을 측정하였다. 도 2a 내지도 2f는 TNF-α에 의해 유도된 형광 표식된 U937 세포의 유착을 나타낸 이미지 사진이다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 3시간 동안의 TNF-α 및 IL-8의 자극에 의해 장 상피유래세포 HT-29에 대한 U937 유착이 각각 유의적으로 증가되었고, 클로트리마졸 처리에 의해 TNF-α 유도성 유착 및 IL-8 유도성 유착이 저해되었다.

< 실시예 5> IL -8 분비 억제효과 검토

TNF-α에 의해 유도분비된 IL-8 단백질의 양을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 측정하였다. 장 상피유래세포 HT-29를 48웰 플레이트(1X10⁵ cell/well)에 분주하고 다음날 5-ASA 및 클로트리마졸로 처리하였다. 21시간 후, 세포는 3시간 동안 10ng/ml의 TNF-α로 처리되었다.

각 웰의 상등액을 모아 상업적으로 사용되는 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, NM)를 이용하여 IL-8을 측정하였다. 먼저, 모든 시약 및 작업 표준시약이 준비되고, 100 ㎕의 에세이 희석 RD-1가 각 웰에 첨가되고, 50 ㎕의 표준시약, 대조군, 시료를 각 웰에 첨가하였다.

플레이트는 플레이트 봉함제로 봉함되고 2시간 동안 실온에서 배양되었다. 각 웰은 흡인(aspiration)되었고, 400 ㎕의 완충액을 이용하여 4회 세정되었다. 각 단계에서 액이 완전히 제거되어야 좋은 성능을 나타낼 수 있다. 마지막 세정 후, 세정 완충액은 디캔팅(decanting)에 의해 제거되고 플레이트는 깨끗한 페이퍼타월에 전사되었다.

100 ㎕의 접합된 IL-8이 모든 웰에 가해지고 플레이트 봉함제로 안전하게 감싸고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 각 웰은 흡인되고 세정 완충액(400 ㎕)을 이용하여 4회 세정하였다. 다음으로, 200 ㎕의 기질용액을 각 웰에 가하고 빛을 차단하면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 50 ㎕의 정지용액을 각 웰에 가하였다. 각 웰의 색은 푸른색에서 노란색으로 변경되어야 한다. 각 웰의 광학밀도를 450 nm의 필터로 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 이용하여 30분 동안 측정하였다.

그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 농도의존적으로 클로트리마졸이 TNF-α 유도 IL-8의 분비를 억제하였다.

< 실시예 6> 혈관형성( tube formation ) 억제효과 검토

혈관형성 분석은 각 웰마다 100 ㎕의 마트리겔 기저막 매트릭스로 코팅되고 37℃에서 30분 동안 중합된 48웰 플레이트에서 수행되었다. HUVEC은 EBM-2 배지를 포함한 2% FBS 및 다른 부가물에서 현탁되었다. 세포들은 각 웰마다 5X10⁴ 세포의 농도로 마트리겔 상에 분주되었고, 37℃에서 14시간 동안 IL-8(50ng/ml) 및 다양한 농도의 클로트리마졸약물은 처리한 후, 각 배양으로부터 혈관형성을 CCD 카메라(TE2000-U, Nikon, Japan)로 촬영하였다.

그 결과, 도 6a 내지 도 6e에 도시된 형태적 변화와 같이 14시간 이내에 혈관 네트워크를 형성하였지만, 클로트리마졸의 처리에 의해 농도 의존적으로 혈관 구조물의 형성을 저해하였다.

< 실시예 7> 닭의 융모요막 분석 ( CAM assay )

생체내 시험상 (in vivo)에서의 혈관신생을 Mousa et al.(J. Thromb . Haemost., 1: 164-170, 2003)에 기술된 이전 방법으로 검토하였다. 즉, 10일된 유정란을 백자농장(청송, 한국)에서 구입하여 37℃에서 상대습도 55%를 유지해 주면서 배양하였다.

기낭(air sac)을 숨긴 껍질에 피하주사침(hypodermic needle, 녹십자의료공업, 한국)을 이용하여 첫 번째 작은 구멍을 뚫었다. 촛불을 비추어 관찰하면서 배체외막의 무혈관 부위를 직접 가로질러 달걀의 측면 껍질쪽으로 두 번째 구멍을 뚫었다. 네가티브 압력이 첫번째 구멍에 적용됨으로써 두번째 구멍 밑에 의사기낭이 만들어져 닭 융모요막(CAM)이 껍질에서 분리되도록 하였다.

CAM가 유정란의 껍질로부터 분리가 되게 하여 이 부위를 작은 크래프츠 연마기(grinding wheel, Dremel, Racine WI. U.S.A.)로 절단하여 창을 만들었다. 멸균 필터디스크(Whatman #1 filter paper, U.K.)를 95% 에탄올 및 물의 용액에 3mg/ml의 코르티손 아세테이트에 담근 후, 멸균 상태에서 공기 건조하였다.

IL-8은 10일된 닭 유정란의 CAM에 대한 맥관을 성장시키는 데 이용되었다. 0.1% BSA 함유 PBS에 용해된 IL-8(10 ng/CAM)으로 흡수된 멸균 필터디스크는 CAM를 성장시키기 위해 놓였다. 30분 후, 약물 또는 대조군의 용액(0.1% BSA 함유 PBS)이 국소적으로 CAM에 직접 가해졌다.

약물 또는 대조군과 72시간 동안 전처리된 유정란에서 IL-8 포화된 필터디스크 바로 아래의 CAM 조직은 잘라내어 CAM 디스크를 얻었다.

그 결과, 도 7a 내지 도 7e와 같이 CAM 디스크를 광학현미경(Leica, Germany)으로 관찰하여 디지털 이미지(X10)를 얻었다.

또한, 필터디스크 면적당 순환 지역에 존재하는 맥관 분지점 수를 각 부위에 대하여 계산하였고, 그 결과 도 8과 같이 클로트리마졸 처리에 의해 IL-8 유도 혈관신생이 유의적으로 억제되었다.

이하, 본 발명의 클로트리마졸을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 산제의 제조

클로트리마졸 300 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

클로트리마졸 100 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 클로트리마졸 300 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 클로트리마졸 50 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 함유하여 제조하였다.

< 제제예 5> 액제의 제조

통상의 액제의 제조방법에 따라 적량의 정제수에 클로트리마졸 100 mg, 이성화당 10 g 및 만니톨 5 g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

도 1은 HUVEC의 생존에 대한 클로트리마졸의 억제 효과를 나타낸 것이고,

도 2a 내지 도 2f는 TNF-α에 의해 유도된 형광 표식된 U937 세포의 유착을 나타낸 이미지 사진이고(a: 대조군; b: TNF-α 10ng; c: 5-ASA 20mM; d: 클로트리마졸 1μM; e: 클로트리마졸 5μM; f: 클로트리마졸 10μM),

도 3은 장 상피유래세포 HT-29에서 TNF-α 유도 호중성 단핵구 유착에 관한 클로트리마졸의 억제 효과를 나타낸 것이고,

도 4는 장 상피유래세포 HT-29에서 IL-8 유도 호중성 단핵구 유착에 관한 클로트리마졸의 억제 효과를 나타낸 것이고,

도 5는 장 상피유래세포 HT-29에서 TNF-α 유도 IL-8 분비에 관한 클로트리마졸의 억제 효과를 나타낸 것이고,

도 6a 내지 도 6e는 IL-8 유도 혈관 형성에 관한 클로트리마졸의 억제 효과를 나타낸 것이고(a: 대조군(DMSO); b: IL-8 50ng/ml; c: IL-8 + 클로트리마졸 1μM; d: IL-8 + 클로트리마졸 5μM; e: IL-8 + 클로트리마졸 10μM),

도 7a 내지 도 7e는 닭 융모요막 분석에서 IL-8 유도 혈관신생에 관한 클로트리마졸의 억제 효과를 나타낸 이미지 사진이고(a: 대조군; b: IL-8 10ng/CAM; c: IL-8 10ng + 클로트리마졸 1㎍/CAM; d: IL-8 10ng + 클로트리마졸 10㎍/CAM; e: IL-8 10ng + 클로트리마졸 20㎍/CAM),

도 8은 닭 융모요막 분석에서 IL-8 유도 혈관신생에 관한 클로트리마졸의 억제 효과를 나타낸 것이다.

Claims (3)

1. 클로트리마졸을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 클로트리마졸은 전체 약학조성물 100 중량부에 대하여 20-70 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 클로트리마졸은 IL-8에 의해 유도된 혈관신생을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.

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