KR20090003363A - 기저막의 단백질 합성 자극용 화장료 조성물 - Google Patents

기저막의 단백질 합성 자극용 화장료 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20090003363A
KR20090003363A KR1020087028769A KR20087028769A KR20090003363A KR 20090003363 A KR20090003363 A KR 20090003363A KR 1020087028769 A KR1020087028769 A KR 1020087028769A KR 20087028769 A KR20087028769 A KR 20087028769A KR 20090003363 A KR20090003363 A KR 20090003363A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
formula
synthesis
skin
compounds
Prior art date
Application number
KR1020087028769A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101332578B1 (ko
Inventor
마르크 하이들
마틴 스토클리
도미니크 임펠트
휴고 지글러
Original Assignee
디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. filed Critical 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Publication of KR20090003363A publication Critical patent/KR20090003363A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101332578B1 publication Critical patent/KR101332578B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/37—Esters of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은, R1이 H, C1-C20-알킬, 사이클로알킬 또는 아릴-C1-C4-알킬이고, n이 1-4이고, X가 -O-, -NH- 또는 -NR2-이고, R2가 H 또는 C1-C20-알킬인 식 (I)의 1종 이상의 화합물과, 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 1종 이상의 화합물을 포함하는 국소 적용가능한 조성물; 기저막의 단백질 합성 자극을 위한 이들 화합물 및 조성물의 용도; 및 X가-NR2-이고 R1 및 R2가 H 이외의 분자인 식 (I)의 화합물과 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 화합물에 관한 것이다.

Description

기저막의 단백질 합성 자극용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR STIMULATING THE SYNTHESIS OF PROTEINS OF THE BASEMENT MEMBRANE}
본 발명은 기저막의 분자, 특히 단백질의 합성을 자극하기 위한, 2종 이상의 특정 펩타이드 유도체를 포함하는, 화장료 조성물, 특히 국소 적용할 수 있는 화장료 조성물, 및 기저막의 분자, 특히 단백질 합성을 자극하기 위한 이들 특정 펩타이드 유도체의 단백질의 용도에 관한 것이다.
진피와 표피의 접합에 있어 기저막(basement membrane: BM)은 여러가지 기능을 가지며, 가장 명백한 기능은 표피와 진피를 근접 연결시키는 것이며, 이러한 방식으로 2층의 조직들의 기계적으로 안정적인 점착(cohesion)을 확보한다. 또한 기저막은 표피의 "극성"과 구성에도 영향을 주는 동시에 표피와 진피 사이에 명확한 경계가 된다. 기저막은 각질형성 세포의 표피 분화를 개시하고, 기저 세포층의 증식적인 상태를 유지시키는 것으로 추정된다. 정상 조건하에서는, 기저막은 또한 표피 세포와 진피의 직접 접촉을 방지한다. 그러나, 기저막에 손상이 가해지는 상처가 발생되면, 진피와의 직접 접촉이 이루어지게 되고, 그런 후 세포는 행태를 변화시켜 상처 치유 과정을 개시하게 된다.
기저막의 다른 중요한 기능은 표피와 진피 세포 간에 정확한 교류이다. 표 피 및 진피는 서로 독립적으로 기능하지 않기 때문에, 정상 피부의 항상성 유지를 위해서는 2가지 세포 타입들 간에 정기적인 생화학적 신호의 양방향 전달이 필요하다. 일반적으로, 이것은 하나의 구획에서 만들어지는 소형 분자로서, 다른 쪽에 그 "메세지"를 전달하기 위해서는 기저막을 통해 선택적으로 전달되어야 한다. 이러한 측면에서, 기저막은 활성 필터로서 작용하며 신호 분자의 통과시키거나 필요에 따라 이를 차단하는 중요한 기능을 가진다. 기저막을 통해 정확하게 기능하는 표피-진피의 교류는 피부에 필연적이다.
기저막은 형태학적으로 차례대로 3개의 층, 라미나 루시다(lamina lucida), 라미나 덴사(lamina densa) 및 라미나 피브로레티큘라리스(lamina fibroreticularis)로 나눌 수 있다. 라미나 루시다는 표피 세포와 라미나 덴사 사이의 영역으로, 기저막에서 전자-밀집 플라크로 보이는 헤미데스모좀을 포함하고 있다. 헤미데스모좀은 증식할 수 있는 기저 각질형성세포를 기저막과 연결시키며, 특히 콜라겐 XVII (또는 bp180) 및 인테그린 α6/β4로 이루어져 있다. 콜라겐 XVII의 결손은 잦은 물집 형성을 동반한 연약한 피부(단순 표피 수포증: epidermolysis bullosa simplex)로 이어질 수 있다. 라미나 덴사는 주로 콜라겐 IV로 구성된 편평 구조(시트)이다.
기저막의 성분은 근본적으로 단백질, 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸이다. 고정 복합체(anchoring complex)에서 중요한 성분들 중 하나는 라미닌 V이다. 라미닌 V의 돌연변이 역시 피부의 심각한 물집 형성(헤르리츠의 접합성 수포 표피 박리증(junctional epidermolysis bullosa))으로 이어지므로, 특히 표피의 진 피 조직 부착에 필수적이다. 라미닌 V는 한쪽은 헤미데스모좀의 트랜스멤브레인 인테그린 alpha6/beta4에 결합하고, 다른 쪽은 콜라겐 VII에 연결되어 있어, 고정 피브릴(anchoring fibril)로 진피를 형성한다. 콜라겐 VII는 라미나 피브로레티큘라리스의 주요 성분이다. 구조 단백질은 콜라겐 IV, VII, XVII 및 라미닌 V이며, 인테그린 α6, β4는 다른 단백질과 함께 기저막과 헤미데스모좀의 형성에 기본적인 주 성분이므로, 따라서 피부에서 기저막의 정확하고 다양한 기능에 있어 중요하다.
내인성(나이-관련) 또는 외인성(광-관련) 노화는 조직, 특히 피부의 비가역적인 변성으로 나타나며, 주름, 늘어짐, 거친 표면, 불규칙적인 색소 침착 등의 형태로 점점 육안으로 보이기 시작하는 것으로 알려져 있다. 이러한 변화들은 동화 반응(합성) 감소와 콜라겐, 또한 기저막의 단백질 성분의 이화 반응(분해) 증가로 인해 발생된다. 조직학적으로 가시적인 변화들은 짧아진 비구조화된 엘라스틴 섬유(shortened unstructured elastin fibre)(엘라스토시스)의 농축, 콜라겐 섬유의 감소, 염증 매개체의 침윤 및 비전형적인 비극성 각질형성세포가 있는 표피의 위축이다. 예컨대, 기저막에서 진피까지 고정 피브릴의 수와 피프릴을 구성하는 콜라겐 VII의 양은 광에 의해 노화된 피부에서 빠르게 감소하며, 그로 인해 기저막과 진피의 결합 안정성은 손상된다. 또한, 기저막의 다른 단백질은 일부 노화 진행중인 피부에서 감소되고 기저막의 구조 조직성은 노화됨에 따라 변성된다.
언급한 기저막의 구조 단백질은 각질형성세포에서 주로 발현되며, 일부는 섬유모세포에서도 발현된다. 피부 매트릭스에서의 합성 반응은 폴리펩타이드, 이른 바 성장 인자 및 사이토카인에 의해 주로 조절된다. 이러한 펩타이드들 중에서, TGF-β1은 피부 매트릭스의 합성 반응에 참여하는 가장 중요한 조절자이다. 이는 각질형성세포 및 섬유모세포에서도 분비된다. 기저막 단백질의 합성을 자극하는, 외부에서 공급되는 활성 화합물은 한편으로는 기저막의 노화성 변성을 보상하며, 또한 노화와 관련있는 기저막 단백질 함량의 감소를 지연시킴으로써 노화에 대한 예방적 특성도 이미 가지고 있다.
놀랍게도, 피부 외양의 분명한 개선 및 기저막 단백질의 노화성 분해의 지연이, 국소 적용가능한 화장료 조성물에 존재하는, 1종 이상의 특정한 화장학적으로 활성인 트리펩타이드 유도체 및 1종 이상의 특정한 화장학적으로 활성인 테트라펩타이드 유도체(이하 "본 발명의 화합물"이라 함)의 조합에 의해 성공적으로 달성된다는 것이 현재 확인되었다. 이는 본 발명의 화합물이 신속하게 충분한 농도로 각질층(stratum corneum)과 표피를 통해 표피와 진피 사이의 경계부에 있는 작용부위로 확산되어, 기저막의 단백질 합성에 신속하고 강력한 자극을 가져다줌으로써 달성되는 것이다. 따라서, 콜라겐 IV, VII, XVII, 라미닌 V와 인테그린 β4의 농도는 1종 이상의 특정한 트리펩타이드 유도체 및 1종 이상의 특정한 테트라펩타이드 유도체의 조합으로 현저하게 증가되는 것을 나타내 보일 수 있다.
본 발명은 청구범위에 의해 정해진다. 특히, 본 발명은 식 (I)로 표시되는 1종 이상의 화합물:
Figure 112008081109641-PCT00001
식 (I)에서
R1은 H, C1-C20-알킬, 사이클로알킬 또는 아릴-C1-C4-알킬이고,
n은 1-4이고,
X는 -O-, -NH- 또는 -NR2-이고,
R2는 H 또는 C1-C20-알킬임, 및
식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인, 1종 이상의 화합물을 포함하는, 화장료 조성물, 특히 국소 적용가능한 화장료 조성물에 관한 것이다
또한, 본 발명은 상기 기재된 화합물의 제조에 있어서의 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 화합물의 용도, 및 기저막 분자, 특히 이의 단백질 합성을 자극하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 기저막 분자, 특히 이의 단백질 합성을 자극하기 위한, 상기 식 (I)의 화합물과 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 화합물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 X가 -NR2 -이고 R1 및 R2 둘다 H 이외의 분자인 상기 식 (I)의 화합물, 및 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 화합물에 관한 것이다.
식 (I)의 화합물 및 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 화합물에서, 아미노산은 라세미체(racemate)로서, 또는 거울상 이성질체로서 순수한 L 및 D 형태로 존재할 수 있다.
상기에서 사용되는 일반적인 표현은 다음과 같이 정의된다.
"알킬"은 선형 또는 분지형의 포화 탄화수소 라디칼의 의미로서 이해된다. 예로, 비분지형으로서 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, x-운데카닐, n-도데카닐, n-트리데카닐, n-헥사데카닐, n-헵타데카닐, n-옥타데카닐 또는 n-노나데카닐과 분지형의 라디칼로서 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, sec-부틸 또는 이소아밀이다.
"사이클로알킬"은 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸 등의 최대 8개의 탄소 원자를 가지는 사이클형의 포화된 탄화수소 라디컬을 의미하는 것으로 이해된다.
"아릴"은 예컨대 알킬, 알콕시, 할로겐 및/또는 트리플루오로메틸에 의해 모노- 또는 폴리치환될 수 있는, 예컨대 페닐, p-톨릴, o-톨릴, m-톨린, 3,4-디메톡시페닐, 2-나프틸 또는 3-나프틸과 같은, 최대 10개의 탄화 수소를 가지는, 방향족의 모노핵 또는 폴리핵(polynuclear) 탄화수소 라디칼을 의미하는 것으로 이해된다. "아릴"은 또한 예컨대 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-퀴놀리닐 또는 3-이소퀴놀리닐과 같이, 헤테로아릴 기의 라디칼, 즉 선택적으로 대응되게 치환된 모노- 또는 폴리핵 방향족 헤테로사이클 라디칼을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 산, 예컨대 염화 수소, 브롬화 수소, 황산 또는 인산과 같은 무기산; 또는 적합한 카르복시산, 예컨대 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 숙신산, 푸마르산, 말론산, 말레산, 옥살산, 프탈산, 시트르산, 락트산 또는 타르타르산과 같은 지방족 모노- 또는 디-카르복시산; 또는 벤조산 또는 살리실산과 같은 방향족 카르복시산; 또는 만델산 또는 신남산과 같은 방향족-지방족 카르복시산; 또는 니코틴산과 같은 헤테로방향족 카르복시산; 또는 메탄설폰산 또는 톨루엔 설폰산과 같은 지방족 또는 방향족 설폰산과의 단가 또는 다가의 동일한 또는 혼성 염을 형성할 수 있다. 피부에 허용가능한 염이 바람직하다.
일반식(I)은 모든 이성체 형태와 이의 혼합물, 예컨대 라세미 혼합물 및 로타머 혼합물을 포함한다.
R1이 H 또는 C1-C20-알킬이고, n이 2 또는 4이고, X가 산소인, 일반식 (I)의 화합물과, 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 천연 라디컬이고 n이 2인 화합물과의 조합이 바람직하다.
하기 표 1의 화합물들의 조합이 특히 바람직하다:
1.1 Palm-Lys-Val-Lys-OH
1.2 Palm-Lys-Val-Orn-OH
1.3 Palm-Lys-Val-Dab-OH
1.4 Palm-Lys-Val-Dab-OMe
1.5 Palm-Lys-Val-Dab-O옥틸
1.6 Palm-Lys-Val-Dab-O세틸
1.7 Palm-Lys-Val-Dab-NH2
1.8 Palm-Lys-Val-Dab-NH부틸
1.9 Palm-Lys-Val-Dab-N(부틸)2
1.10 Palm-Lys-Val-Dab-NH옥틸
1.11 Palm-Lys-Val-Dab-N(옥틸)2
1.12 Palm-Lys-Val-Dab-NH세틸
1.13 Palm-Lys-Val-Dab-N(세틸)2 또는
1.14 Palm-Lys-Val-Dap-OH와,
2.1 Palm-Lys-Val-Lys-Ala-OH
2.2 Palm-Lys-Val-Lys-Arg-OH
2.3 Palm-Lys-Val-Lys-Gln-OH
2.4 Palm-Lys-Val-Lys-Ser-OH
2.5 Palm-Lys-Val-Dab-Glu-OH
2.6 Palm-Lys-Val-Dab-Asp-OH
2.7 Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH
2.8 Palm-Lys-Val-Dab-Lys-OH
2.9 Palm-Lys-Val-Dab-Met-OH
2.10 Palm-Lys-Val-Dab-Asn-OH
2.11 Palm-Lys-Val-Dab-His-OH
2.12 Palm-Lys-Val-Dab-Nle-OH 또는
2.13 Palm-Lys-Val-Dab-Phe-OH.
매우 특히 바람직한 조합 파트너는 Palm-Lys-Val-Dab-OH(1.3)와 Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH(2.7)이다.
본 발명에 따른 화합물은 화장료 최종 제품에 0.5 내지 5,000 ppm (w/w), 바람직하기로는 1 내지 1,000 ppm (w/w)의 농도로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 분산액, 에멀젼으로서 용액에 포함하거나, 또는 마크로캡슐, 마이크로캡슐 또는 나노캡슐과 같은 담체나 리포좀 또는 킬로미크론(chylomicron)에 캡슐화된 형태로, 또는 마크로입자, 마이크로입자, 나노입자 또는 마이크로스폰지에 봉입된 형태로, 또는 분말의 유기 폴리머들, 탈크, 벤토나이트 및 그외 미네랄 담체에 흡착된 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 임의의 본초 약물 형태(galenical form): 유/수 에멀젼 및 수/유 에멀젼, 밀크, 로션, 연고, 젤성 및 점성의 계면활성 및 유화 폴리머, 포마드, 삼퓨, 비누, 젤, 분말, 스틱 및 펜슬, 스프레이, 바디오일, 페이스 마스크, 패치로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 함께 사용될 수 있다. 그러한 조성물은 추출된 지질 및/또는 합성 지질, 젤성 및 점성의 계면활성 및 유화 폴리머, 수용성 활성제(water-soluble active principle), 지용성 활성제(fat-soluble active principle), 식물 추출물, 조직 추출물, 해양 추출물, 선스크린제, 항산화제, 보습제, 경계제(barrier agent), 피부 활력 활성 화합물, 추가적인 피부 케어 활성 화합물(skin revitalizing active compound) 또는 피부 보호제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 통상적으로 사용되는 임의의 그외 화장학적 피부 케어 활성 화합물과 함께 사용될 수 있다. 추가적인 피부 케어 활성 화합물의 예로 항주름 활성 화합물/항-퇴화 활성 화합물을 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 1종 이상의 항주름 활성 화합물 또는 항-퇴화 활성 화합물을 안전적이고 활성인 함량으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물에 사용하기에 적합한 항주름/항-퇴화 활성 화합물의 예로는, 황-함유성 D- 및 L-아미노산과 이의 유도체 및 염, 특히 N-아세틸 유도체를 포함하며, 바람직한 예로 N-아세틸-L-시스테인; 티올; 하이드록시 산(예, 락트산 및 글리콜산과 같은 α-하이드록시산, 및 살리실산, 살리실산 유도체, 예컨대 옥타노일 유도체와 같은 β-하이드록시산), 피트산, 리폰산; 리소포스파티딕산, 피부 박피제(예, 페놀 등), 비타민 B3 화합물 및 레티노이드가 있으며, 이들은 피부를 매끄럽게 하는데 있어 본 발명의 이점을 향상시킬 수 있다.
a) 비타민 B3 화합물
본 발명에 따른 조성물은 비타민 B3 화합물을 안전적으로 활성을 나타내는 양으로 포함할 수 있다. 비타민 B3 화합물은 1997년 4월 11일자로 출원된 출원번호 08/634,010과 함께 계류중인 미국 특허(1997년 10월 30일자로 공개된 특허 공개 WO 97/39733 A1)에 개시된 바와 같이, 특히 피부의 상태를 조절하는데 사용가능하다. 전술한 비타민 B3 화합물의 유도체의 예로는, 니코틴산의 비-혈관 확장성 에스테르(예, 토코페릴 니코티네이트), 니코티닐 아미노산, 카르복시산의 니코티닐 알코올 에스테르, 니코틴산 N-옥사이드 및 니아신아미드 N-옥사이드 등의 니코틴산 에스테르를 포함한다.
b) 레티노이드
본 발명에 따른 조성물은 또한 레티노이드를 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "레티노이드"는 피부에서 비타민 A의 생물학적 활성을 가지는, 모든 천연 및/또는 합성의 비타민 A 유사체 또는 레티놀계 화합물과, 이들 화합물의 기하학적 이성체 및 입체 이성체를 포함한다. 레티노이드는 바람직하기로는 레티놀, 레티놀 에스테르(예, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트 등의, 레티놀의 C2- C22-알킬 에스테르), 레티날 및/또는 레트산(모든 트랜스 레트산 및/또는 13-시스 레트산), 특히 레트산 이외의 레티노이드 화합물이다. 그외 적절한 레티노이드는 토코페닐 레티노에이트[레트산(트랜스 또는 시스)의 토코페롤 에스테르], 아답탈렌{6-[3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐]-2-나프토산} 및 타자로텐(에틸 6-[2-(4,4-디메틸티오크로만-6-일)-에티닐]니코티네이트)이다. 바람직한 레티노이드는 레티놀, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트, 레티날 및 이들의 조합이다. 본 발명에 따른 조성물은 안전적이고 활성인 함량의 레티노이드를 포함할 수 있어, 제조되는 조성물은 각질 조직의 상태를 조절하는데, 바람직하기로는 피부의 가시적이고 및/또는 명백한 갈라짐을 조절하는데, 특히 피부의 노화 사인을 조절하는데, 더 바람직하기로는 피부의 노화 관련 피부 표면의 성질의 가시적이고 및/또는 명백한 갈라짐을 조절하는데 있어, 안전적이고 활성적이다.
c) 하이드록시산
본 발명에 따른 조성물은 하이드록시산을 안전적이고 활성을 나타내는 양으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물에 사용하기에 바람직한 산은 살리실산 및 살리실산 유도체를 포함한다.
d) 펩타이드
본 발명에 따른 조성물은 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사펩타이드 등의 1종 이상의 추가적인 펩타이드를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 펩타이드 및/또는 그 유도체는 본 발명에 따른 조성물에 안전적이고 활성을 나타내는 양으로 첨가될 수 있다. 여기에서 "펩타이드"는 천연적으로 형성되는 펩타이드와 합성 펩타이드 모두를 의미하며, 또한 펩타이드 모방체 및 "펩타이드"의 금속 복합체를 포함할 수도 있다. 펩타이드를 포함하는 천연적으로 형성되는 조성물과 상업적으로 입수가능한 조성물을 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 사용하기에 적합한 디펩타이드는 카르노신(β-Ala-His)를 포함한다. 이에 적합한 트리펩타이드로는 Gly-His-Lys, Arg-Lys-Arg 및 His-Gly-Gly를 포함한다. 바람직한 트리펩타이드 및 그 유도체로는 Biopeptide CLTM (100 ppm 팔미토일-Gly-His-Lys, 프랑스 세데르마로부터 상업적으로 입수가능함)로 획득할 수 있는 팔미토일-Gly-His-Lys, 펩타이드 CK (Arg-Lys-Arg), 펩타이드 CK+ (ac-Arg-Lys-Arg-NH2) 및 스위스의 Pentapharm사에서 상품명 SYN®-AKE으로 시판되는 β-Ala-Pro-Dab-NH-벤질이 있다. 본 발명에 따른 조성물에 사용하기 적합한 테트라펩타이드로는, 펩타이드 E가 있다. 적합한 펜타펩타이드의 예로는 프랑스 세데라마에서 입수할 수 있는 Matrixyol(팔미토일-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)과 WO　03/037933 (Pentapharm, Switzerland)에 개시된 화합물이 있다. 사용하기 적합한 헥사펩타이드로는 스페인 Lipotec사에서 제조한 Argireline (Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2)가 있다.
본 발명에 따른 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 피부 케어 제품에, 특히 피부의 외양을 개선시키고 기저막의 단백질의 파괴에 의해 초래되는 피부 노화의 부작용을 개선하는데 사용된다.
하기 실시예들은 본 발명을 설명하고자 하는 것이나, 한정하는 것은 아니다. 본 명세서 및 실시예 1-9에 사용되는 약어의 의미는 다음과 같다:
AcOH: 아세트산
ACN: 아세토니트릴
AB: 항체
Ala: 알라닌
Arg: 아르기닌
Asn: 아스파라긴
Asp: 아스파르트산
Boc: tert-부톡시카르보닐
BSA: 소 혈청 알부민
CTR: 클로로트리틸 수지
Dab: 2,4-디아미노부티르산
Dap: 2,3-디아미노프로피온산
DBU: 1,8-디아자비사이클로[5,4,0]운덱-7-엔(1,5-5)
DCC: N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드
MC: 메틸렌 클로라이드
DIC: N,N'-디이소프로필카르보디이미드
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
DMEM: 둘베코의 변형된 이글 배지
DMF: 디메틸포름아마이드
EM: 전자 현미경
EtOAc: 에틸 아세테이트
FCS: 소 태아 혈청(Foetal calf serum)
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐
GF/A: 유리 섬유 마이크로필터
Gln: 글루타민
Glu: 글루탐산
HaCaT: 인간 불멸화된 각질형성세포
HOBt: 1-하이드록시벤조트리아졸
ILe: 이소루신
LH20: 아머샴 크기 배제 수지
Lys: 라이신
Met: 메티오닌
MS: 질량 분광측정기
NMM: N-메틸모르폴린
NMR: 핵 자기 공명
Nle: 노르루신
Orn: 오르니틴
Palm: 팔미토일
PBS: 인산 완충화된 염수
PE: 페트롤륨 에테르
Phe: 페닐알라닌
RT: 실온
Ser: 세린
tBu: tert-부틸
TBTU: O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
TCTU: O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
TGF-β1/2: 형질전환 성장 인자 β1 또는 β2
TFA: 트리플루오로아세트산
THF: 테트라하이드로퓨란
Thr: 트레오닌
Tris: Tris-(하이드록시메틸)-아미노메탄
Tween 20: 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 용액
Val: 발린
Z: 벤질옥시카르보닐
실시예 1 (본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 처리에 의한 세포주 HaCaT의 각질형성세포 세포 배양물에서의 라미닌 V 합성의 자극 측정)
시험관내 배양한 HaCaT 각질형성세포의 세포 당 라미닌V 생산성을 ELISA(효소-연계성 면역흡착 분석) 방법으로 검출하였다. 펩타이드 활성 화합물의 존재시 세포에 의한 라미닌 V 생산 증가를 상기 방법으로 정량하였다.
인간 HaCaT 각질형성세포는 하이델베르그의 독일 암 연구 센터의 Fusenig 교수로부터 제공받았으며, 이를 표준적인 세포 배양 방법에 의해 배양 배지에서 배양하였다. 해당 펩타이드(활성 화합물)와 함께 72시간 동안 배양한 후, 라미닌 V에 특이적인 항체로 정량 결정을 수행한다. 라미닌 V 함량을 결정한 후, 세포 수를 Molecular Probes 사의 CyQUANT®에 의해 결정한다. 세포 당 라미닌 V 함량을 각 수치에 대한 단위로서 계산한다.
재료:
배양 배지: 테스트 배지:
- DMEM - DMEM
- 10 % FCS - no FCS
- 100 IU/ml 페니실린 - 100 IU/ml 페니실린
- 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 - 0.1 mg/ml 스트렙토마이신
세정 완충액 : 밀크 용액:
- 0.05 M Tris, pH 8.5 - 세정 완충액
- 0.15 M NaCl - 5 % 밀크 분말
- 0.1 % BSA
- 0.1 % Tween 20
AB 희석 용액: 기질용액 :
- 50 ml SuperBlock (37515; Pierce) - 1 ImmunoPure® OPD tablet
(34006; Pierce)
- 450 ml H2O - 9 ml H2O
- 0.05 % Tween - 1 ml 안정적인 페록사이드 기질. 완 충액, 10x (34062; Pierce)
1차 AB (P3H9-2; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)는 AB 희석 용액으로1/60,000로, 2차 AB (31430; Socochim S.A.)는 1/500으로 희석하였다.
방법:
각질형성세포를 96-웰 플레이트에 약 5,000 cells/well의 밀도로 접종하고, 3일간 컨플루언스가 될때까지 배양 배지에서 배양하였다(37 ℃/10 % CO2). 배지는 테스트 기질 3 세트로 3가지의 다른 농도의 테스트 배지로 교체하였다. 또한, 각 플레이트에서 하기 대조군도 테스트하였다.
음성 대조군: 양성 대조군:
A) A)
- 세포 첨가 - 세포 첨가
- 1차 AB 무첨가; 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
B) B)
- 세포 무첨가 - 세포 첨가
- 1차 및 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
- 10 ng/ml TGF-β2 첨가
C) 세포가 첨가되지 않은 웰을, 2가지 AB의 비특이적 결합을 배제하기 위해 각 펩타이드에 대해 테스트하였다.
플레이트는 72시간 더 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간이 종료된 후, 결합된(deposited) 라미닌 V를 검출하고, 하기 프로토콜에 따라 정량하였다:
· 배지를 버리고 PBS 200 ㎕/웰로 세정
· 100 ㎕/웰의 메탄올로 고정 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 메탄올을 버리고, 200 ㎕/웰의 밀크 용액으로 블록킹 -> 30 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 밀크 용액을 버리고, 100 ㎕/웰의 1차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 2 h / RT / 교반기 600 rpm
· 1차 AB 희석물을 버리고 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정
· 100 ㎕/웰의 2차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 3 h / RT / 교반기 600 rpm
· 2차 AB 희석물을 버리고; 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정한 후, 100 ㎕/웰의 PBS로 1회 세정
· 기질 용액 100 ㎕/웰 첨가 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 50 ㎕/웰의 H2SO4 (2 M)로 반응 중지 및 492 nm에서 측정.
· 염색 용액을 버리고, 플레이트를 bidist. H2O로 세정한 다음, 약 16시간 동안 -80 ℃에서 냉동시킨다.
· 플레이트를 해동한 다음, 세포 수를 제조사의 지침서에 따라 CyQUANT 분석으로 측정한다.
세포 당 라미닌 V 생산은 하기 식: (OD라미닌 V 수치 / RFU세포 수 수치) x 100으로 계산하였다.
계산된 수치는 상대값(arbitrary unit)이다.
표 2: ELISA에서 라미닌 V의 자극
번호 기질 농도(μmol/l) 대조군 대비 자극
TGF-β(양성 대조군) 10 ng/ml 40-90
1.3 Palm-Lys-Val-Dab-OH 25 50 100 34-71 48-75 64-83
1.10 Palm-Lys-Val-Dab-NH-옥틸 2.5 5.0 10.0 40-45 154-200 772-940
1.11 Palm-Lys-Val-Dab-N(옥틸l)2 0.25 0.5 1.0 15-31 28-31 32-75
실시예 2: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 처리에 의한 세포주 HaCaT 각질형성세포의 세포 배양물에서 콜라겐 IV 합성 자극 측정
시험관내에서 배양한 HaCaT 각질형성세포의 세포 당 콜라겐 IV의 생산은 ELISA(효소-연계성 면역흡착 분석) 방법으로 검출하였다. 펩타이드 활성 화합물의 존재시 세포에 의한 콜라겐 IV 생산 증가를 상기 방법으로 정량하였다. 인간 HaCaT 각질형성세포는 하이델베르그의 독일 암 연구 센터의 Fusenig 교수로부터 제공받았으며, 이를 표준적인 세포 배양 방법에 의해 배양 배지에서 배양하였다. 해당 펩타이드(활성 화합물)와 함께 72시간 동안 배양한 후, 콜라겐 IV에 특이적인 항체로 정량 결정을 수행한다. 콜라겐 IV 함량을 결정한 후, 세포 수를 Molecular Probes 사의 CyQUANT®에 의해 결정한다. 세포 당 콜라겐 IV 함량을 각 수치에 대한 단위로서 계산한다.
재료:
배양 배지: 테스트 배지:
- DMEM - DMEM
- 10 % FCS - no FCS
- 100 IU/ml 페니실린 - 100 IU/ml 페니실린
- 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 - 0.1 mg/ml 스트렙토마이신
세정 완충액: 밀크 용액:
- 0.05 M Tris, pH 8.5 - 세정 완충액
- 0.15 M NaCl - 5 % 밀크 분말
- 0.1 % BSA
- 0.1 % Tween 20
AB 희석 용액: 기질용액:
- 50 ml SuperBlock (37515; Pierce) - 1 ImmunoPure® OPD tablet
(34006; Pierce)
- 450 ml H2O - 9 ml H2O
- 0.05 % Tween - 1 ml 안정적인 페록사이드 기질. 완 충액, 10x (34062; Pierce)
1차 AB (H-234; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)는 AB 희석 용액으로 1/200로, 2차 AB (31460; Socochim S.A.)는 1/500로 희석하였다.
방법:
각질형성세포를 96-웰 플레이트에 약 5,000 cells/well의 밀도로 접종하고, 3일간 컨플루언스가 될때까지 배양 배지에서 배양하였다(37 ℃/10 % CO2). 배지는 테스트 기질 3 세트로 3가지의 다른 농도의 테스트 배지로 교체하였다. 또한, 각 플레이트에서 하기 대조군도 테스트하였다.
음성 대조군: 양성 대조군:
A) A)
- 세포 첨가 - 세포 첨가
- 1차 AB 무첨가; 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
B) B)
- 세포 무첨가 - 세포 첨가
- 1차 및 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
- 10 ng/ml TGF-β2 첨가
C) 세포가 첨가되지 않은 웰을, 2가지 AB의 비특이적 결합을 배제하기 위해 각 펩타이드에 대해 테스트하였다.
플레이트는 72시간 더 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간이 종료된 후, 결합된(deposited) 콜라겐 IV를 검출하고, 하기 프로코콜에 따라 정량하였다:
· 배지를 버리고 PBS 200 ㎕/웰로 세정
· 100 ㎕/웰의 메탄올로 고정 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 메탄올을 버리고, 200 ㎕/웰의 밀크 용액으로 블록킹 -> 30 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 밀크 용액을 버리고, 100 ㎕/웰의 1차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 2 h / RT / 교반기 600 rpm
· 1차 AB 희석물을 버리고 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정
· 100 ㎕/웰의 2차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 3 h / RT / 교반기 600 rpm
· 2차 AB 희석물을 버리고; 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정한 후, 100 ㎕/웰의 PBS로 1회 세정
· 기질 용액 100 ㎕/웰 첨가 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 50 ㎕/웰의 H2SO4 (2 M)로 반응 중지 및 492 nm에서 측정.
· 염색 용액을 버리고, 플레이트를 bidist. H2O로 세정한 다음, 약 16시간 동안 -80 ℃에서 냉동시킨다.
· 플레이트를 해동한 다음, 세포 수를 제조사의 지침서에 따라 CyQUANT 분 석으로 측정한다.
세포 당 콜라겐 IV 생산은 하기 식: (OD콜라겐 IV 수치 / RFU세포 수 수치) x 100으로 계산하였다.
계산된 수치는 상대값(arbitrary unit)이다.
표 1에서 화합물 1.1, 1.10, 1.11 및 2.5-2.7은 매우 우수한 자극 작용을 보였다.
실시예 3: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 처리에 의한 세포주 HaCaT 각질형성세포의 세포 배양물에서 콜라겐 VII 합성 자극 측정
시험관내에서 배양한 HaCaT 각질형성세포의 세포 당 콜라겐 VII의 생산은 ELISA(효소-연계성 면역흡착 분석) 방법으로 검출하였다. 펩타이드 활성 화합물의 존재시 세포에 의한 콜라겐 VII 생산 증가를 상기 방법으로 정량하였다. 인간 HaCaT 각질형성세포는 하이델베르그의 독일 암 연구 센터의 Fusenig 교수로부터 제공받았으며, 이를 표준적인 세포 배양 방법에 의해 배양 배지에서 배양하였다. 해당 펩타이드(활성 화합물)와 함께 72시간 동안 배양한 후, 콜라겐 VII에 특이적인 항체로 정량 결정을 수행한다. 콜라겐 VII 함량을 결정한 후, 세포 수를 Molecular Probes 사의 CyQUANT®에 의해 결정한다. 세포 당 콜라겐 VII 함량을 각 수치에 대한 단위로서 계산한다.
재료:
배양 배지: 테스트 배지:
- DMEM - DMEM
- 10 % FCS - no FCS
- 100 IU/ml 페니실린 - 100 IU/ml 페니실린
- 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 - 0.1 mg/ml 스트렙토마이신
세정 완충액: 밀크 용액:
- 0.05 M Tris, pH 8.5 - 세정 완충액
- 0.15 M NaCl - 5 % 밀크 분말
- 0.1 % BSA
- 0.1 % Tween 20
AB 희석 용액: 기질용액 :
- 50 ml SuperBlock (37515; Pierce) - 1 ImmunoPure® OPD tablet
(34006; Pierce)
- 450 ml H2O - 9 ml H2O
- 0.05 % Tween - 1 ml 안정적인 페록사이드 기질. 완 충액, 10x (34062; Pierce)
1차 AB (C-16; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)는 AB 희석 용액으로 1/200로, 2차 AB (31402; Socochim S.A.)는 1/500로 희석하였다.
방법:
각질형성세포를 96-웰 플레이트에 약 5,000 cells/well의 밀도로 접종하고, 3일간 컨플루언스가 될때까지 배양 배지에서 배양하였다(37 ℃/10 % CO2). 배지는 테스트 기질 3 세트로 3가지의 다른 농도의 테스트 배지로 교체하였다. 또한, 각 플레이트에서 하기 대조군도 테스트하였다.
음성 대조군: 양성 대조군:
A) A)
- 세포 첨가 - 세포 첨가
- 1차 AB 무첨가; 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
B) B)
- 세포 무첨가 - 세포 첨가
- 1차 및 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
- 10 ng/ml TGF-β2 첨가
C) 세포가 첨가되지 않은 웰을, 2가지 AB의 비특이적 결합을 배제하기 위해 각 펩타이드에 대해 테스트하였다.
플레이트는 72시간 더 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간이 종료된 후, 결합된(deposited) 콜라겐 VII를 검출하고, 하기 프로코콜에 따라 정량하였다:
· 배지를 버리고 PBS 200 ㎕/웰로 세정
· 100 ㎕/웰의 메탄올로 고정 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 메탄올을 버리고, 200 ㎕/웰의 밀크 용액으로 블록킹 -> 30 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 밀크 용액을 버리고, 100 ㎕/웰의 1차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 2 h / RT / 교반기 600 rpm
· 1차 AB 희석물을 버리고 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정
· 100 ㎕/웰의 2차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 3 h / RT / 교반기 600 rpm
· 2차 AB 희석물을 버리고; 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정한 후, 100 ㎕/웰의 PBS로 1회 세정
· 기질 용액 100 ㎕/웰 첨가 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 50 ㎕/웰의 H2SO4 (2 M)로 반응 중지 및 492 nm에서 측정.
· 염색 용액을 버리고, 플레이트를 bidist. H2O로 세정한 다음, 약 16시간 동안 -80 ℃에서 냉동시킨다.
· 플레이트를 해동한 다음, 세포 수를 제조사의 지침서에 따라 CyQUANT 분석으로 측정한다.
세포 당 콜라겐 VII 생산은 하기 식: (OD콜라겐 VII 수치 / RFU세포 수 수치) x 100으로 계산하였다.
계산된 수치는 상대값(arbitrary unit)이다.
표 1에서 화합물 1.10 및 2.5-2.7은 매우 우수한 자극 작용을 보였다.
실시예 4: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 처리에 의한 세포주 HaCaT 각질형성세포의 세포 배양물에서 인테그린 β4 합성 자극 측정
시험관내에서 배양한 HaCaT 각질형성세포의 세포 당 인테그린 β4의 생산은 ELISA(효소-연계성 면역흡착 분석) 방법으로 검출하였다. 펩타이드 활성 화합물의 존재시 세포에 의한 인테그린 β4 생산 증가를 상기 방법으로 정량하였다. 인간 HaCaT 각질형성세포는 하이델베르그의 독일 암 연구 센터의 Fusenig 교수로부터 제공받았으며, 이를 표준적인 세포 배양 방법에 의해 배양 배지에서 배양하였다. 해당 펩타이드(활성 화합물)와 함께 72시간 동안 배양한 후, 인테그린 β4에 특이적인 항체로 정량 결정을 수행한다. 인테그린 β4 함량을 결정한 후, 세포 수를 Molecular Probes 사의 CyQUANT®에 의해 결정한다. 세포 당 인테그린 β4 함량을 각 수치에 대한 단위로서 계산한다.
재료:
배양 배지: 테스트 배지:
- DMEM - DMEM
- 10 % FCS - no FCS
- 100 IU/ml 페니실린 - 100 IU/ml 페니실린
- 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 - 0.1 mg/ml 스트렙토마이신
세정 완충액 : 밀크 용액:
- 0.05 M Tris, pH 8.5 - 세정 완충액
- 0.15 M NaCl - 5 % 밀크 분말
- 0.1 % BSA
- 0.1 % Tween 20
AB 희석 용액: 기질용액:
- 50 ml SuperBlock (37515; Pierce) - 1 ImmunoPure® OPD tablet
(34006; Pierce)
- 450 ml H2O - 9 ml H2O
- 0.05 % Tween - 1 ml 안정적인 페록사이드 기질. 완 충액, 10x (34062; Pierce)
1차 AB (A9; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)는 AB 희석 용액으로 1/200로, 2차 AB (31430; Socochim S.A.)는 1/500로 희석하였다.
방법:
각질형성세포를 96-웰 플레이트에 약 5,000 cells/well의 밀도로 접종하고, 3일간 컨플루언스가 될때까지 배양 배지에서 배양하였다(37 ℃/10 % CO2). 배지는 테스트 기질 3 세트로 3가지의 다른 농도의 테스트 배지로 교체하였다. 또한, 각 플레이트에서 하기 대조군도 테스트하였다.
음성 대조군: 양성 대조군:
A) A)
- 세포 첨가 - 세포 첨가
- 1차 AB 무첨가; 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
B) B)
- 세포 무첨가 - 세포 첨가
- 1차 및 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
- 10 ng/ml TGF-β2 첨가
C) 세포가 첨가되지 않은 웰을, 2가지 AB의 비특이적 결합을 배제하기 위해 각 펩타이드에 대해 테스트하였다.
플레이트는 72시간 더 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간이 종료된 후, 결합된(deposited) 인테그린 β4를 검출하고, 하기 프로코콜에 따라 정량하였다:
· 배지를 버리고 PBS 200 ㎕/웰로 세정
· 100 ㎕/웰의 메탄올로 고정 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 메탄올을 버리고, 200 ㎕/웰의 밀크 용액으로 블록킹 -> 30 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 밀크 용액을 버리고, 100 ㎕/웰의 1차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 2 h / RT / 교반기 600 rpm
· 1차 AB 희석물을 버리고 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정
· 100 ㎕/웰의 2차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 3 h / RT / 교반기 600 rpm
· 2차 AB 희석물을 버리고; 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정한 후, 100 ㎕/웰의 PBS로 1회 세정
· 기질 용액 100 ㎕/웰 첨가 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 50 ㎕/웰의 H2SO4 (2 M)로 반응 중지 및 492 nm에서 측정.
· 염색 용액을 버리고, 플레이트를 bidist. H2O로 세정한 다음, 약 16시간 동안 -80 ℃에서 냉동시킨다.
· 플레이트를 해동한 다음, 세포 수를 제조사의 지침서에 따라 CyQUANT 분석으로 측정한다.
세포 당 인테그린 β4 생산은 하기 식: (OD인테그린 β4 수치 / RFU세포 수 수치) x 100으로 계산하였다.
계산된 수치는 상대값(arbitrary unit)이다.
표 1에서 화합물 1.1 및 2.5-2.7은 매우 우수한 자극 작용을 보였다.
실시예 5: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 처리에 의한 세포주 HaCaT 각질형성세포의 세포 배양물에서 콜라겐 XVII 합성 자극 측정
시험관내에서 배양한 HaCaT 각질형성세포의 세포 당 콜라겐 XVII의 생산은 ELISA(효소-연계성 면역흡착 분석) 방법으로 검출하였다. 펩타이드 활성 화합물의 존재시 세포에 의한 콜라겐 XVII 생산 증가를 상기 방법으로 정량하였다. 인간 HaCaT 각질형성세포는 하이델베르그의 독일 암 연구 센터의 Fusenig 교수로부터 제공받았으며, 이를 표준적인 세포 배양 방법에 의해 배양 배지에서 배양하였다. 해당 펩타이드(활성 화합물)와 함께 72시간 동안 배양한 후, 콜라겐 XVII에 특이적인 항체로 정량 결정을 수행한다. 콜라겐 XVII 함량을 결정한 후, 세포 수를 Molecular Probes 사의 CyQUANT®에 의해 결정한다. 세포 당 콜라겐 XVII 함량을 각 수치에 대한 단위로서 계산한다.
재료:
배양 배지: 테스트 배지:
- DMEM - DMEM
- 10 % FCS - no FCS
- 100 IU/ml 페니실린 - 100 IU/ml 페니실린
- 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 - 0.1 mg/ml 스트렙토마이신
세정 완충액: 밀크 용액:
- 0.05 M Tris, pH 8.5 - 세정 완충액
- 0.15 M NaCl - 5 % 밀크 분말
- 0.1 % BSA
- 0.1 % Tween 20
AB 희석 용액: 기질용액 :
- 50 ml SuperBlock (37515; Pierce) - 1 ImmunoPure® OPD tablet
(34006; Pierce)
- 450 ml H2O - 9 ml H2O
- 0.05 % Tween - 1 ml 안정적인 페록사이드 기질. 완 충액, 10x (34062; Pierce)
1차 AB (STO-115; Davids Biotechnologie)는 AB 희석 용액으로 1/200로, 2차 AB (31430; Socochim S.A.)는 1/500로 희석하였다.
각질형성세포를 96-웰 플레이트에 약 5,000 cells/well의 밀도로 접종하고, 3일간 컨플루언스가 될때까지 배양 배지에서 배양하였다(37 ℃/10 % CO2). 배지는 테스트 기질 3 세트로 3가지의 다른 농도의 테스트 배지로 교체하였다. 또한, 각 플레이트에서 하기 대조군도 테스트하였다.
음성 대조군: 양성 대조군:
A) A)
- 세포 첨가 - 세포 첨가
- 1차 AB 무첨가; 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
B) B)
- 세포 무첨가 - 세포 첨가
- 1차 및 2차 AB 첨가 - 1차 및 2차 AB 첨가
- 10 ng/ml TGF-β2 첨가
C) 세포가 첨가되지 않은 웰을, 2가지 AB의 비특이적 결합을 배제하기 위해 각 펩타이드에 대해 테스트하였다.
플레이트는 72시간 더 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간이 종료된 후, 결합된(deposited) 콜라겐 XVII를 검출하고, 하기 프로코콜에 따라 정량하였다:
· 배지를 버리고 PBS 200 ㎕/웰로 세정
· 100 ㎕/웰의 메탄올로 고정 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 메탄올을 버리고, 200 ㎕/웰의 밀크 용액으로 블록킹 -> 30 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 밀크 용액을 버리고, 100 ㎕/웰의 1차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 2 h / RT / 교반기 600 rpm
· 1차 AB 희석물을 버리고 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정
· 100 ㎕/웰의 2차 AB 희석물과 인큐베이션 -> 3 h / RT / 교반기 600 rpm
· 2차 AB 희석물을 버리고; 200 ㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세정한 후, 100 ㎕/웰의 PBS로 1회 세정
· 기질 용액 100 ㎕/웰 첨가 -> 15 분 / RT / 교반기 600 rpm
· 50 ㎕/웰의 H2SO4 (2 M)로 반응 중지 및 492 nm에서 측정.
· 염색 용액을 버리고, 플레이트를 bidist. H2O로 세정한 다음, 약 16시간 동안 -80 ℃에서 냉동시킨다.
· 플레이트를 해동한 다음, 세포 수를 제조사의 지침서에 따라 CyQUANT 분석으로 측정한다.
세포 당 콜라겐 XVII 생산은 하기 식: (OD콜라겐 XVII 수치 / RFU세포 수 수치) x 100으로 계산하였다.
계산된 수치는 상대값(arbitrary unit)이다.
표 1에서 화합물 1.1, 1.10, 1.11 및 2.5-2.7은 매우 우수한 자극 작용을 보 였다.
실시예 6: 연고 제형
절차: 성분 1-5 (A)를 70 ℃로 열처리하였다. 성분 6-7 (B)를 75 ℃로 열처리 하였다. 교반하면서 A에 B를 첨가하고, 혼합물을 50 ℃로 냉각시킨 다음, 균질화하고, 30 ℃로 냉각시켰다. 성분 8 및 9 (C)와 성분 10 및 11 (D)을 연속 첨가하고, 혼합물을 잘 교반하였다.
번호 성분 % w/w
1 (A) Tego Care 450 3.00
2 세테아릴 알코올 2.25
3 글리세릴 스테아레이트 2.25
4 Cetiol 868 10.00
5 스쿠알렌 5.00
6 (B) 탈이온수 66.995
7 소듐 히알루로네이트 5.00
8 (C) 글리세롤 5.00
9 페노닙(Phenonip) 0.5
10 (D) Palm-Lys-Val-Dab-OH (1.3) 0.0025
11 Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH (2.7) 0.0025
실시예 7: 젤 제형
절차: 성분 2-6 (A)를 탈이온수에 연속 용해하였다. 이 용액을 성분 7(B)로 pH 6.0으로 조정하였다. 그런 후, 성분 8 및 9 (C)를 첨가하였다.
번호 성분 % w/w
1 (A) 탈이온수 92.095
2 1,3-부탄디올 5.00
3 페노닙 0.50
4 Abil B 8843 1.50
5 카르복시메틸셀룰로스 0.15
6 Carbopol Ultrez 10 0.75
7 (B) NaOH
8 (C) Palm-Lys-Val-Dab-OH (1.3) 0.0025
9 Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH (2.7) 0.0025
실시예 8: X가 -NR2-이고 R1 및 R2가 H 이외의 분자인 식 (I)의 본 발명에 따른 화합물, 및 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 본 발명에 따른 화합물과, 그러한 화합물의 염의 제조
본 실시예에 따라 수득되는 용리물 및 산물의 분석은 프로톤 NMR, HPLC-전자분무식 MS 또는 원소 분석으로 수행하였다. 화합물은 하기에 개시된 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다(general instructions of M. Bodanszky "The Practice of Peptide Synthesis" Springer Verlag, 2nd edition 1994). 즉, 아미노산, 예컨대 라이신은 고상 합성에서 카르복시-말단 끝이 수지에 연결되며, 이의 아미노기는 예컨대 Fmoc 보호기에 의해 보호기에 의해 보호된다. 측쇄는 예컨대 Boc 또는 t-부틸로 보호된다. 보호기는 원하는 서열이 완전하게 조합될 때까지, 펩타이드 합성에서 통상적인 시약으로 추가적인 아미노산 유도체를 연결시키기 위해, 필요에 따라 선택적으로 분리 제거된다. 그런 후, 펩타이드는 카르복시-말단 끝은 수지에서 분리되고, 미정제 펩타이드는 적합한 용매 혼합물의 점적에 의해 침전된다. 혼합물은 HPLC를 통해 정제되며, 선택적으로 반대-이온으로 교환되고, 기질은 동결건조된다.
실시예 8.1: 고상으로의 Palm-Lys(Boc)-Val-Dab(Boc)-Thr(tBu)-CTR 제조
보호된 아미노산 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc- Lys(Boc)-OH 및 팔미트산을, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 1.75 g (하중: 0.8 mmol/g)에, 연속적인 펩타이드 연결에 의해 연결하고, 보호된 펩타이드를 이러한 방식으로 조합한다.
실시예 8.2: 고상에서의 Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH ·2TFA의 제조
30분간 95% TFA 10 ml로 처리하여 수지에서 펩타이드를 분리 제거한다. 수지를 여과 제거하고, 용액을 100　ml의 Et2O로 적점 첨가한다. 형성되는 침전물을 흡입으로 여과 제거하고, 세정 및 건조한 후, 분취용 HPLC로 정제하고, 동결건조한다. 이로 무색 분말 391 mg (34 %)이 수득된다. 이론 질량 686을 검증하였고, 측정치는 687이다.
실시예 8.3: X가 -NR2 -이고 R1 및 R2가 H 이외의 분자인 식 (I)의 본 발명에 따른 화합물의 제조
그러한 화합물은 WO 2004/099237 A1의 실시예 7에 언급된 공정과 유사하게 제조할 수 있다.

Claims (19)

  1. 식 (I)로 표시되는 1종 이상의 화합물:
    Figure 112008081109641-PCT00002
    식 (I)에서
    R1은 H, C1-C20-알킬, 사이클로알킬 또는 아릴-C1-C4-알킬이고,
    n은 1-4이고,
    X는 -O-, -NH- 또는 -NR2-이고,
    R2는 H 또는 C1-C20-알킬임; 및
    식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인, 1종 이상의 화합물
    을 포함하는, 조성물, 특히 국소 적용가능한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 제1항에 따른 화합물이 피부에 적용가능한 염 형태로 존재 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1항에서 정의된 화합물에서 아미노산 라디칼이 라세미 화합물로서 존재하거나, 또는 입체 이성체적으로 순수한 L 및 D 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, R1이 H 또는 C1-C20-알킬이고 n이 2 또는 4이고 X가 -O-인 제1항에서 정의된 식(I)의 화합물이, 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 천연 α-아미노산의 라디컬이고 n이 2인 화합물과 조합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 조합 파트너가 Palm-Lys-Val-Dab-OH 및 Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 이들 청구항에서 언급된 화합물들을 0.5 내지 5,000 ppm (w/w), 바람직하게는 1 내지 1,000 ppm (w/w)의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 박리용 활성 화합물, 항-여드름 활성 화합물, 비타민 B3 화합물, 레티노이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드 및 이들 펩타이드의 유도체, 하이드록시산, 자유 라디칼 포획제, 항-염증제, 피부 태닝 활성 화합물, 피부 미백제, 항소포염제(anticellulitis agent), 플라보노이드, 항균 활성 화합물, 피부 치유제, 항진균 활성 화합물, 선스크린 활성 화합물, 파르네솔(farnesol), 피탄트리올(phytantriol), 알란토인, 글루코사민 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추가적인 피부 케어 활성 화합물을 안전하고 활성을 나타내는 양으로 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 피부에 적합한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 활성 화합물을 분산액, 에멀젼으로서 용액에 포함하거나, 담체, 바람직하기로는 마크로캡슐, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 리포좀 또는 킬로미크론(chylomicron)에 캡슐화된 형태, 또는 마크로입자, 마이크로입자, 나노입자, 마이크로스폰지에 봉입된 형태, 또는 분말의 유기 폴리머, 탈크, 벤토나이트 및 관련 미네랄 담체에 흡착된 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 에멀젼(유/수 및 수/유), 밀크, 로션, 연고, 젤성 및 점성의 계면활성 및 유화 폴리머, 포마드, 샴푸, 비누, 젤, 분말, 스틱 또는 펜슬, 스프레이, 바디 오일, 페이스 마스크 또는 패치의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 1종 이상의 식(I)의 화합물과, 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 1종 이상의 화합물의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 조성물 제조에 있어서의 용도.
  12. 기저막의 분자, 특히 그 단백질의 합성을 자극하는데 있어서의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 조성물의 용도.
  13. 기저막의 분자, 특히 그 단백질의 합성을 자극하는데 있어서의, 1종 이상의 식(I)의 화합물과, 식 (I)로 표시되는 화합물에서 X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 1종 이상의 화합물의, 용도.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 라미닌 V의 합성, 콜라겐 IV의 합성, 콜라겐 VII의 합성, 콜라겐 XVII의 합성 및/또는 인테그린 β4합성을 자극하기 위한 것인 용도.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 기저막의 내인성 또는 외인성 변성에 의해 초래되는 늘어지고, 거칠고, 주름진 피부를 개선시키기 위한 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 늘어지고, 거칠고, 주름진 피부 형성을 방지하기 위한 것을 특징으로 하는 용도.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, 1종 이상의 추가적인 피부 케어 활성 화합물과 병용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  18. X가-NR2-이고 R1 및 R2가 H 이외의 분자인 제1항에서 정의된 식 (I)의 화합물.
  19. 식 (I)의 화합물로서,
    X가 상기 가능한 정의 중 -NH-인, XR1이 α-아미노산의 라디컬인 화합물.
KR1020087028769A 2006-04-28 2006-04-28 기저막의 단백질 합성 자극용 화장료 조성물 KR101332578B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2006/003998 WO2007124770A1 (de) 2006-04-28 2006-04-28 Kosmetische zusammensetzung zur stimulierung der synthese der proteine der basalmembran

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090003363A true KR20090003363A (ko) 2009-01-09
KR101332578B1 KR101332578B1 (ko) 2013-11-25

Family

ID=38349629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087028769A KR101332578B1 (ko) 2006-04-28 2006-04-28 기저막의 단백질 합성 자극용 화장료 조성물

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8293712B2 (ko)
EP (1) EP2015726B1 (ko)
JP (1) JP5028474B2 (ko)
KR (1) KR101332578B1 (ko)
AT (1) ATE493110T1 (ko)
BR (1) BRPI0621609B1 (ko)
CA (1) CA2650578C (ko)
DE (1) DE502006008630D1 (ko)
ES (1) ES2358605T3 (ko)
WO (1) WO2007124770A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230155620A (ko) * 2013-12-25 2023-11-10 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 지질펩티드형 화합물을 함유하는 스틱상 기재

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102355885A (zh) * 2009-03-16 2012-02-15 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 三肽的用途
WO2010122423A2 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Dsm Ip Assets B.V. Novel composition
CN117695372A (zh) * 2019-10-18 2024-03-15 安佳榜控股股份公司 头皮保养剂
JP6802537B1 (ja) * 2019-10-28 2020-12-16 小林　裕司 ヘミデスモゾーム活性化作用を呈するドーパキノン誘導体及びその製造方法
TW202228757A (zh) * 2020-09-24 2022-08-01 日商日本安佳榜化妝股份有限公司 育毛劑
WO2022065415A1 (ja) * 2020-09-24 2022-03-31 株式会社アジュバンホールディングス 育毛剤
WO2022181785A1 (ja) 2021-02-26 2022-09-01 株式会社アジュバンホールディングス 育毛剤
US20240139276A1 (en) 2021-02-26 2024-05-02 Adjuvant Holdings Co., Ltd. Hair growth agent

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939082A (en) 1995-11-06 1999-08-17 The Procter & Gamble Company Methods of regulating skin appearance with vitamin B3 compound
AU3115097A (en) 1996-04-23 1997-11-12 Procter & Gamble Company, The Methods of regulating skin condition with centella asiatica extract
ATE510852T1 (de) 2001-10-30 2011-06-15 Dsm Ip Assets Bv Dermopharmazeutisch und kosmetisch wirksame oligopeptide
KR101116528B1 (ko) 2003-05-08 2012-02-28 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 피부구조를 향상시키는 트리펩타이드 및 그 유도체의 미용용도
JP4256389B2 (ja) * 2003-11-17 2009-04-22 セダーマ テトラペプチドとトリペプチドの混合物を含む組成物
EP1640041A3 (de) * 2004-09-24 2006-05-24 Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien Kosmetische und dermatologische Zusammensetzungen zur Behandlung reifer oder lichtgeschädigter Haut
US20060182705A1 (en) * 2005-02-11 2006-08-17 Cruse Maria K Composition for reduction and prevention of wrinkles on the skin

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230155620A (ko) * 2013-12-25 2023-11-10 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 지질펩티드형 화합물을 함유하는 스틱상 기재

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009535310A (ja) 2009-10-01
CA2650578A1 (en) 2007-11-08
US20090155347A1 (en) 2009-06-18
KR101332578B1 (ko) 2013-11-25
EP2015726A1 (de) 2009-01-21
DE502006008630D1 (de) 2011-02-10
BRPI0621609A2 (pt) 2012-09-11
BRPI0621609B1 (pt) 2017-12-19
WO2007124770A1 (de) 2007-11-08
US8293712B2 (en) 2012-10-23
CA2650578C (en) 2014-01-21
JP5028474B2 (ja) 2012-09-19
US8722852B2 (en) 2014-05-13
ES2358605T3 (es) 2011-05-12
US20130012686A1 (en) 2013-01-10
ATE493110T1 (de) 2011-01-15
EP2015726B1 (de) 2010-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101332578B1 (ko) 기저막의 단백질 합성 자극용 화장료 조성물
JP5006789B2 (ja) 表情皺及び加齢による皺に対する新規な局所適用剤
JP5878761B2 (ja) 皮膚、粘膜、および／または頭皮の治療および／またはケアに用いられるペプチド、ならびに、美容または医薬組成物におけるその使用
AU2010310108B2 (en) Peptides used in the treatment and/or care of the skin, mucous membranes and/or hair and its use in cosmetic or pharmaceutical compositions
AU2009218680B2 (en) Cosmetic or pharmaceutical compositions comprising metalloproteinase inhibitors
US7671009B2 (en) Dermopharmaceutically and cosmetically active oligopeptides
AU1256500A (en) Transport system conjugate
AU2011264125A1 (en) Skin antiaging treatment
CN112040969B (zh) 用于化妆品和医药的肽和组合物
WO2007087738A1 (de) Biologisch aktive tripeptide, deren kupferkomplexe und salze
CN101384274B (zh) 包含具有非天然存在的氨基酸的肽的组合物及其使用方法
CN113271920A (zh) 用于化妆品的肽和组合物
WO2015111857A1 (ko) 펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 기능성 화장품 조성물
US8778891B2 (en) Dermatopontin-activating peptides and cosmetic compositions including same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161019

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171018

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181018

Year of fee payment: 6