KR20080111785A - 수인성 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 특히 실시간 PCR(real-time PCR) 또는 실시간 역전사-PCR(real-time reverse transcription-PCR; 실시간 RT-PCR)을 이용하여 수인성 바이러스(water-borne viruses)를 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머 및 프로브, 및 상기 프라이머 및/또는 프로브를 이용한 수인성 바이러스의 검출키트 및 방법에 관한 것으로서, 수인성 바이러스를 매우 낮은 농도까지 신속하게 검출·정량할 수 있을 뿐 아니라 종류까지 확정할 수 있어 수인성 질병의 전파경로를 차단하는 효과가 기대된다.
수인성 바이러스, 프라이머, 프로브, PCR, RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR
Description
도 1은 주형 DNA 및 RNA의 클로닝 과정을 보여주는 모식도이고;
도 2a 내지 2h는 클로닝된 주형 DNA 또는 RNA의 염기서열 및 주형 DNA 또는 RNA를 제조하기 위한 프라이머 위치를 보여주는 도면이며;
도 3a 내지 3h는 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR에 사용되는 프라이머와 프로브 위치를 보여주는 도면이고;
도 4a 내지 4h는 상기 프라이머 및 프로브로 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR을 수행한 결과를 보여주는 도면이다(도 2 내지 4에서, a: 아데노바이러스10, b: 아데노바이러스41, c: 폴리오바이러스1, d: 에코바이러스6, e: 콕사키바이러스A9, f: 콕사키바이러스B5, g: A형 간염 바이러스, h: E형 간염 바이러스이다).
본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의한 수인 성 바이러스(water-borne viruses)의 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PCR, 특히 실시간 PCR(real-time PCR) 또는 실시간 역전사-PCR(real-time reverse transcription-PCR; 실시간 RT-PCR)에 의해 수인성 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머(primers) 및 프로브(probes), 및 상기 프라이머 및/또는 프로브를 이용한 상기 바이러스의 검출키트 및 방법에 관한 것이다.
수인성 바이러스는 오염된 물을 통하여 전파되거나 분변-구강의 경로로 전파되고 세균에 비해 환경에서 오래 생존하며 매우 작은 양으로도 사람에게 감염되어 질병을 유발하기 때문에 건강에 유해한 요인이다. 사람에게 감염성이 있는 수인성 바이러스로는 아데노바이러스(Adenovirus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 에코바이러스(Echovirus), A형 및 E형 간염 바이러스(Hepatitis A and E viruses)를 들 수 있다. 아데노바이러스는 이중가닥 DNA의 게놈을 갖고 있는 외피(envelope)가 없는 다면체형 바이러스로, 주로 호흡기, 눈, 위장관의 감염증을 발생시킨다. 폴리오바이러스는 RNA형의 전형적인 장관계 바이러스로 마비, 어린이 소아마비 등을 유발한다. 콕사키바이러스는 RNA형 바이러스로서, 감염 시 미열, 식욕부진, 콧물, 인후통과 같은 증상이 나타나며, 수포성 발진이 동반된다. 또한 수막염의 원인균이기도 하다. 에코바이러스는 장내 RNA 바이러스의 일종으로 수막염을 유발하며, 근위축성 측삭경화증의 원인균으로도 예상되고 있다. A형과 E형 간염 바이러스는 단일가닥 RNA의 게놈을 갖는 수인성 경로를 통하여 전파되는 병원균으로서, 감염되면 발열, 복통, 황달 등의 증상을 나타내 며 B형 간염을 동반할 때에는 간경화 등 만성질환으로 전환될 가능성이 크다.
상기 수인성 바이러스의 검출방법은 크게 세포배양법과 분자생물학적 방법의 두 가지로 나뉜다. 바이러스를 세포에 접종하여 감염성이 있는 바이러스가 세포에 감염되어 일정한 시간이 지나면 세포병변(Cytopathic Effect; CPE)을 일으키는데, 세포배양법은 이러한 CPE를 관찰함으로써 감염성 바이러스의 유무를 판단하는 방법이다. CPE가 생성되는 시간은 바이러스의 종류에 따라 다르지만 일반적으로 약 5~14 일이 소요되므로, 이러한 방법에 의한 바이러스의 유무 판단은 질병전파경로 차단에 큰 도움이 되지 않는다. 또한, 모든 종류의 바이러스가 세포에 감염될 수 있는 것이 아니고 바이러스에 따라 감염될 수 있는 세포 종류도 다를 뿐만 아니라 한 종류의 세포에 여러 종류의 바이러스가 감염될 수도 있어, 세포배양법만으로는 바이러스의 종류를 판단할 수 없다. 이러한 세포배양법의 단점을 극복하기 위한 것이 분자생물학적 방법, 즉 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)법이다. PCR법은 크게 일반 PCR법과 정량(quantitative) PCR법으로 나뉜다. 일반 PCR법을 이용하면 바이러스를 신속하게 종류별로 판단할 수 있지만, 정량을 위해서는 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 수행하여야 한다. 또한 너무 낮은 농도의 바이러스는 검출해내지 못하는 한계가 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2002-0000280호(2002. 1. 5. 공개)는 다수 네스티드 PCR(multiplex nested PCR)법을 이용하여 환경수에 존재하는 아데노바이러스와 엔테로바이러스(Enterovirus)를 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 프라이머를 개시하였다. 그러나 이 방법은 정량 PCR법을 사용하는 것이 아니어서, 정량을 위해서 는 여전히 아가로스 젤 전기영동을 수행하여야 하고 너무 낮은 농도의 바이러스는 검출해내지 못하는 방법에 불과하였다.
한편, 정량 PCR법은 일반 PCR법이 정량성을 갖도록 개발한 것으로, 경합(competitive) PCR법과 실시간 PCR법이 있다. 실시간 PCR법은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술로, DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하며, 전기영동이 필요없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적은 이점을 갖고 있다. 현재는 유전자 발현해석과 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 타이핑 등에 있어서 필수적인 기술이 되고 있다. 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭곡선이 얻어지는데, 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭곡선이 교차하는 지점, Ct값(Threshold Cycle)이 산출되며 Ct값과 초기 주형량 간에는 직선적인 관계가 있어 검량선을 만들 수 있으므로, 미지의 시료에 대해서도 표준시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하여 이 검량선과 대조하면 초기 주형량을 구할 수 있다. 이 방법에서는 PCR 증폭산물을 형광을 통해 검출하는데, 검출방법은 크게 인터칼레이팅(intercalating)법과 형광표지 프로브를 이용하는 2가지 방법이 있다. 형광표지 프로브를 이용하는 방법 중, 택맨(TaqMan) 프로브법은 5' 말단은 형광물질(FAM(fluorescein) 등)로, 3' 말단은 퀀처(quencher)(TAMRA(tetramethylrhodamine) 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqMan™ probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, 택맨 프로브는 어닐링(annealing) 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상의 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장반응 시 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 택맨 프로브가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 프라이머(및 프로브) 설계는 성공적인 실시간 PCR을 위한 가장 중요한 요소로, 표적 DNA 서열에 안정되게 어닐링할 수 있으며(적절한 범위의 Tm값), PCR 반응효율이 좋고(프라이머 내부 혹은 프라이머 간에 상보적인 서열이 없다), 특이성이 높은(주형 DNA 상에 미스-프라이밍(mis-priming)하는 부위가 없다) 프라이머(및 프로브)를 설계하여야 한다. 한편, 역전사 PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR)은 mRNA로부터 역전사 과정을 통해 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하는 방법으로서, RNA 분리, cDNA 합성 및 PCR 증폭의 세 과정으로 이루어진다.
상기한 바와 같이, 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR법이 여러 이점을 가짐에도 불구하고, 지금까지 이를 수인성 바이러스의 검출에 적용하려는 시도는 이루어진 바 없었으며, 수인성 바이러스를 검출하기 위한 PCR 및 RT-PCR을 위한 프라이머 및 프로브 설계에 대한 연구도 미흡한 실정이었다.
이에, 본 발명자들은 상술한 종래의 세포배양법의 문제점을 해결하기 위하여, 수인성 바이러스를 종류별로 특이적으로 검출할 수 있는 각 바이러스의 특이적 프라이머 및 프로브를 설계하고 이를 이용하여 PCR, 특히 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR로 수인성 바이러스를 신속하고 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 제1목적은 PCR을 이용하여 수인성 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제2목적은 PCR을 이용하여 수인성 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는 프로브를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제3목적은 상기 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는 수인성 바이러스의 검출키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제4목적은 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR을 수행하여 수인성 바이러스를 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
첫째, 본 발명은 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
둘째, 본 발명은 서열번호 33 내지 40 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
셋째, 본 발명은 하기 ⅰ) 및 ⅱ) 중 하나 이상을 포함하는, PCR을 이용하여 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스를 포함하는 수인성 바이러스를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다:
ⅰ) PCR을 수행하기 위한 프라이머로서, 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드; 및
ⅱ) 상기 바이러스의 DNA 또는 RNA를 정량하기 위한 프로브로서, 서열번호 33 내지 40 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드. 본 발명에 따른 키트에서는, PCR, RT-PCR, 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR을 이용하여 수인성 바이러스를 검출할 수 있다.
넷째, 본 발명은 시료에 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스를 포함하는 수인성 바이러스의 DNA 또는 RNA에 특이적인 프라이머와 프로브를 가하여 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR을 수행함으로써 상기 바이러스를 종류별로 검출 및 정량하는 단계를 포함하는, 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스를 포함하는 수인성 바이러스의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 프로브는 서열번호 33 내지 40 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 용어 '중합효소연쇄반응' 또는 'PCR'은 일반(비정량) PCR과 정량 PCR을 포괄하는 것으로서, 예를 들어, 일반 PCR, 일반 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR을 모두 포함하는 개념이나, 문맥에 따라 '일반 PCR 또는 일반 RT-PCR'을 가리키거나 '일반 PCR'을 가리키는 개념으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 수인성 바이러스를 검출하기 위해서는, 먼저 각 바이러스의 DNA 및 RNA를 추출한다. 아데노바이러스는 DNA 게놈을 가지므로 DNA를 추출하고 그 외의 바이러스는 RNA 게놈을 가지므로 RNA를 추출한다. 다음으로 상기 주형으로 하는 DNA 및 RNA 부분을 증폭하기 위한 프라이머를 설계한다. 이때 설계된 프라이머는 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.
상기 프라이머를 이용하여 PCR 및 RT-PCR을 수행한다. 이때 PCR의 반응조건은 아래와 같다: ① 94 ℃에서 5 분간 전변성, ② 94 ℃ 20 초, 57 ℃ 20 초, 72 ℃ 20 초를 30회 반복, ③ 72 ℃에서 5 분 연장. 또한 RT-PCR반응조건은 아래와 같다:① 45 ℃에서 60 분 인큐베이션, ② 94 ℃에서 5 분간 전변성, ③ 94 ℃ 20 초, 57 ℃ 20 초, 72 ℃ 20 초를 30회 반복, ④ 72 ℃에서 5 분 연장
증폭된 DNA 및 cDNA 단편을 T-이지 벡터(T-easy vector)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하여, T-이지 벡터에 클로닝한 후의 염기서열이 증폭 전 DNA의 염기서열과 동일한지 조사한다. 그런 다음 T-이지 벡터에 클로닝한 cDNA는 제한효소로 절단하여 선형 상태로 만든 후, 시험관 내 전사 키트(in vitro transcription kit)(MAXIscript®; 앰비온사(Ambion, Inc.), USA)를 사용하여 cDNA를 RNA로 전사시켜 표준 RNA로 한다.
상기 서열번호 1 내지 16의 프라이머를 이용함으로써 수인성 바이러스의 DNA 또는 RNA를 효율적으로 증폭할 수 있는 바, 본 발명의 일 태양에서는 일반 PCR 또는 RT-PCR법, 즉 상기 증폭 후 통상적인 아가로스 젤 전기영동에 의해 정량하는 과정을 거치는 방법에 의해 수인성 바이러스를 종류별로 검출·정량할 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 태양에서는, 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR법에 의해 수인성 원생동물을 검출하게 되는 바, 상기에서 클로닝 후의 염기서열이 증폭 전의 염기서열과 동일한 DNA는 별도의 처리를 하지 않고 표준 DNA로 한다. 표준 DNA로 실시간 PCR 및 표준 RNA로 실시간 RT-PCR을 수행하여 10 카피/㎕까지 검출할 수 있도록 반응조건을 최적화한다. 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR을 수행하기 위하여 설계된 프라이머 및 프로브는 아래 표 2에 나타낸 바와 같다.
이때 PCR의 반응조건은 아래와 같다: ① 95 ℃에서 12 분, ② 94 ℃에서 15 초, ③ 57 ℃에서 30 초, ④ ②~③ 단계 40회 반복. 또한, RT-PCR의 반응조건은 아래와 같다: ① 45 ℃에서 5 분, ② 94 ℃에서 12 분, ③ 94 ℃에서 15 초, ④ 57 ℃에서 30 초, ⑤ ③~④ 단계 45회 반복.
상기 서열번호 17 내지 32의 프라이머는 일반 PCR 또는 RT-PCR의 프라이머로도 사용가능한 바, 본 발명의 또 다른 태양에서는 서열번호 17 내지 32의 프라이머를 이용하여 일반 PCR법, 즉 증폭 후 아가로스 젤 전기영동에 의해 정량하는 과정을 거치는 방법에 의해 수인성 바이러스를 종류별로 검출·정량하는 것도 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 바이러스의 배양
아데노바이러스10(Genbank Accession No. AF161563, ATCC VR-1087) 및 아데노바이러스41(Genbank Accession No. AB246878, ATCC VR-930)은 HeLa 세포에 접종하고 5 일간 배양하였다. 그런 다음, 바이러스 배양액을 사이즈가 0.24 ㎕인 필터를 통해 통과시켰다. 필터를 통과한 바이러스 배양액을 1.5 ㎖ 튜브(tube)에 넣어 -70 ℃에 냉동보관하고 실험할 때마다 꺼내 사용하였다.
폴리오바이러스1(Genbank Accession No. DQ841127, ATCC VR-1464), 에코바이러스6(Genbank Accession No. AY899157, ATCC VR-1044), 콕사키바이러스A9(Genbank Accession No. AJ295200, ATCC VR-186), 콕사키바이러스B5(Genbank Accession No. AF114383, ATCC VR-185)는 BGMK(Buffalo green monkey kidney) 세포에 접종하여 약 5~9 일간 배양하였다. 그런 다음, 아데노바이러스와 동일하게 처리하였다.
A형 간염 바이러스(Genbank Accession No. DQ646426, ATCC VR-1357)는 FRhK(fetal rhesus monkey kidney)-4 세포에 접종하여 약 9 일간 배양하였다. 그런 다음, 상기 바이러스와 동일하게 처리하였다.
실시예 2: DNA 및 RNA 추출
아데노바이러스10 및 아데노바이러스41은 아큐프렙® 게놈 DNA 추출 키트(AccuPrep® Genomic DNA Extraction kit)(바이오니아, 한국)를 사용하여 DNA를 추출하고, -20 ℃에 냉동보관하고 실험할 때마다 꺼내 사용하였다.
폴리오바이러스1, 에코바이러스6, 콕사키바이러스A9, 콕사키바이러스B5 및 A형 간염 바이러스는 아큐프렙® 바이러스 RNA 추출 키트(AccuPrep® Viral RNA Extraction kit)(바이오니아, 한국)를 사용하여 RNA를 추출하였다. E형 간염 바이러스(HEV-C, Genbank Accession No. DQ450072)는 하기 실시예 3에 기재된 바와 같이, 유전자 합성(gene synthesis)으로 주형 RNA를 제조하였다.
실시예 3: E형 간염 바이러스의 유전자 합성
올리고는 http://berry.engin.umich.edu/gene2oligo 프로그램을 이용하여 설계하였다. 그런 다음, 각 올리고의 농도를 100 pmol로 하고 5 ㎕씩을 취하여 한 개의 튜브에 넣고 잘 혼합하였다. 혼합된 올리고 5 ㎕에 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 5 ㎕, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 완충액 7 ㎕를 가하고 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, LCR(ligase chain reaction)을 아래 나타낸 바와 같은 조건으로 수행하였다: ① 94 ℃에서 2 분, ② 94 ℃에서 30 초, ③ 59 ℃에서 4 분, ④ ②~③ 단계 40회 반복.
실시예 4: 주형 DNA 및 RNA 부분 클로닝
아데노바이러스에서 추출한 DNA는 주형 부분을 증폭하기 위해 각각 설계된 프라이머(서열번호 1 내지 4, 및 도 2a 및 2b 참조)를 이용하여 아큐파워® HL PCR 프리믹스(AccuPower® HL PCR premix)(바이오니아, 한국)로 PCR 반응을 수행하였다. 보다 상세하게는, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 농도를 10 pmol로 희석하여 각각 1 ㎕씩, DNA 3 ㎕로 반응액을 제조한 후 증류수로 20 ㎕를 적정하여 94 ℃에서 5 분 전변성시키고 94 ℃ 20 초, 57 ℃ 20 초, 72 ℃ 20 초를 30회 반복한 후 마지막으로 72 ℃에서 5 분 연장하여 DNA 단편을 증폭시켰다. 나머지 6종의 바이러스의 RNA는 아큐파워® RT-PCR 프리믹스(AccuPower® RT-PCR premix)(바이오니아, 한국)로 각각 RT-PCR 반응을 수행하였다. 보다 상세하게는, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머(서열번호 5 내지 16, 및 도 2c 내지 2h 참조)의 농도를 10 pmol로 희석하여 각각 1 ㎕씩, DNA 3 ㎕로 반응액을 제조한 후 증류수로 20 ㎕를 적정하여 45 ℃에서 1 시간 방치하여 cDNA가 합성되게 하였다. 그런 다음, 94 ℃에서 5 분 전변성시키고 94 ℃ 20 초, 57 ℃ 20 초, 72 ℃ 20 초를 30회 반복한 후 마지막으로 72 ℃에서 5 분 연장하여 cDNA 단편을 증폭시켰다. 증폭된 DNA 및 cDNA 부분을 절단하여 아큐프렙® 젤 정제 키트(AccuPrep® Gel Purification kit)(바이오니아, 한국)로 정제하였다. 정제된 DNA를 T-이지 벡터(프로메가(Promega), USA)에 도입하여 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터로 대장균(E. coli)을 형질전환시켰다.
형질전환된 대장균을 약 15 시간 배양하여 배양액에서 아큐프렙® 플라스미드 추출 키트(AccuPrep® Plasmid Extraction kit)(바이오니아, 한국)로 플라스미드 DNA를 추출하였다. 그런 다음 솔젠트사(한국)에 의뢰하여 DNA 및 cDNA의 염기서열을 분석하여 증폭 전의 염기서열과 동일한지 확인하고, 염기서열이 일치한 DNA를 표준 주형 DNA로 하였다. 이때 DNA의 OD값을 측정한 후 DNA의 카피수를 계산하여 105~101 카피가 되게 희석하여 1.5 ㎖ 튜브에 분주한 후 -70 ℃에 냉동 보관하여 실험할 때마다 꺼내 사용하도록 하였다.
염기서열이 일치한 cDNA 중 E형 간염바이러스, 콕사키바이러스A9 및 콕사키바이러스B5는 T7 방향으로 도입되었고, 폴리오바이러스1, 에코바이러스6 및 A형 간염 바이러스는 sp6 방향으로 도입되었다. T7 방향으로 도입된 cDNA는 SalⅠ 제한효소로, sp6 방향으로 도입된 cDNA는 ApaⅠ 제한효소를 이용하여 37 ℃에서 1 시간 반응하여 cDNA를 선형으로 만들었다. 그런 다음 확인을 위하여 젤 전기영동을 수행하고, 젤 정제하여 cDNA의 O.D값을 측정하고 다음과 같이 RNA로 전사하였다. T7 방향으로 도입된 cDNA는 시험관 내 전사 키트(MAXIscript®) T7을 사용하고, sp6 방향으로 도입된 cDNA는 시험관 내 전사 키트(MAXIscript®) sp6를 이용하여 RNA를 제조하였다. DNase가 완전히 제거되었는지를 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. DNase가 완전히 제거되면 RT-PCR을 수행하여 RNA 존재를 확인하였다. RNA를 정량한 후 카피수를 계산하여 105~101 카피가 되게 희석하여 1.5 ㎖ 튜브에 분주한 후 -70 ℃에 냉동 보관하여 실험할 때마다 꺼내 사용하도록 하였다.
실시예 4: 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR
상기 표준 DNA 및 표준 RNA로 어플라이드 바이오시스템즈 7500 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), USA)을 사용하여 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 보다 상세하게는, 2× 듀스타 프리믹스(Duestar Premix)(바이오니아, 한국) 10 ㎕, 정방향 프라이머(농도 10 pmol) 1 ㎕, 역방향 프라이머(농도 10 pmol) 1 ㎕, 택맨 프로브(농도 10 pmol) 0.5 ㎕(서열번호 17 내지 40, 및 도 3a 내지 3h 참조)로 반응액을 제조한 후 증류수로 20 ㎕를 적정하여 PCR 반응 및 RT-PCR 반응을 수행하였다. PCR의 반응조건은 아래와 같았다: ① 95 ℃에서 12 분, ② 94 ℃에서 15 초, ③ 57 ℃에서 30 초, ④ ②~③ 단계 40회 반복. 또한, RT-PCR의 반응조건은 아래와 같았다: ① 45 ℃에서 5 분, ② 94 ℃에서 12 분, ③ 94 ℃에서 15 초, ④ 57 ℃에서 30 초, ⑤ ③~④ 단계 45회 반복.
그 결과를 도 4a 내지 4h에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 10 카피/㎕ 이상의 DNA 및 RNA에 대해 농도 의존적으로 그 함량을 측정할 수 있음을 확인하였다(r2=0.99). 표준 곡선의 기울기는 약 -2.65 내지 -3.86이었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR법으로 아주 낮은 농도의 수인성 바이러스를 검출해낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 기존에 수인성 바이러스를 검출하기 위해 사용되었던 세포배양법의 장시간 배양 및 바이러스의 종류 판정 불가능의 문제점을 해결할 수 있어, 수인성 바이러스를 매우 낮은 농도까지 신속하게 검출·정량할 수 있을 뿐 아니라 종류까지 확정할 수 있어 수인성 질병의 전파경로를 차단하는 효과가 기대된다.
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Adenovirus type 10
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Adenovirus type 10
<400> 2
aagtgctggc catgtctagc ac 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Adenovirus type 41
<400> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Adenovirus type 41
<400> 4
ttctgagttg aagttggttg tct 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Poliovirus type 1
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<212> DNA
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<223> Reverse primer for Poliovirus type 1
<400> 6
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<213> Artificial Sequence
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<223> Forward primer for Echovirus type 6
<400> 7
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<213> Artificial Sequence
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<223> Reverse primer for Echovirus type 6
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<212> DNA
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<223> Reverse primer for Coxsaekievirus type A9
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tgagggcaga acagacataa 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Reverse primer for Coxsaekievirus type B5
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tctttgactc cttgctccat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Hepatitis A Virus
<400> 13
tggtgagggg acttgatacc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Reverse primer for Hepatitis A Virus
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gcctacccct tgtggaagat 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Forward primer for Hepatitis E Virus
<400> 15
ttcttttgct ctgtgcatgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Hepatitis E Virus
<400> 16
tagacgtaag cggggatgtt 20
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<212> DNA
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<223> Forward primer for Adenovirus type 10
<400> 17
ccgggtctgg tgcagtttg 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Reverse primer for Adenovirus type 10
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<212> DNA
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<220>
<223> Forward primer for Adenovirus type 41
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<220>
<223> Forward primer for Poliovirus type 1
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ggtatttcga acgcctattc acac 24
<210> 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Poliovirus type 1
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tttagagatg ctgcaccata gagg 24
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gacatggtgc gaagagtcta ttga 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Echovirus type 6
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cacctgctcc gcagttaaga tt 22
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<212> DNA
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<220>
<223> Forward primer for Coxsaekievirus type A9
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cagtcacatc gtgaccaagc a 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Coxsaekievirus type A9
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggtaccagtc ccatgttctc cta 23
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<213> Artificial Sequence
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agaccgatgg caccgtgtt 19
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<212> DNA
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<223> Forward primer for Hepatitis A Virus
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cacgctttct gtcttctttc ttcc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Hepatitis A Virus
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atctgtgtcc ccaatttaga ctcc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Hepatitis E Virus
<400> 31
ccggcggtgg tttctgg 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Hepatitis E Virus
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cggctgcggt tggtatgtc 19
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Adenovirus type 10
<400> 33
caccgacacg tacttcagcc tgggca 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Adenovirus type 41
<400> 34
ggcgggcctt ttactgtaag cgggg 25
<210> 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Poliovirus type 1
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tgaaggacca gtcggcagca ctaggt 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Probe for Echovirus type 6
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cctccggccc ctgaatgcg 19
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<223> Probe for Coxsaekievirus type A9
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tgtctccccg gactgagtat caataggctg 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Probe for Coxsaekievirus type B5
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tttccgagcc aggcgactgt gg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Hepatitis A Virus
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Hepatitis E Virus
<400> 40
ttgattctca gcccttcgcc ctcccc 26
Claims (6)
- 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드.
- 서열번호 33 내지 40 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드.
- 하기 ⅰ) 및 ⅱ) 중 하나 이상을 포함하는, 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스를 포함하는 수인성 바이러스를 검출하기 위한 키트:ⅰ) PCR을 수행하기 위한 프라이머로서, 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드; 및ⅱ) 상기 바이러스의 DNA 또는 RNA를 정량하기 위한 프로브로서, 서열번호 33 내지 40 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, PCR, 역전사-PCR(RT-PCR), 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR을 이용하여 수인성 바이러스를 검출하는 키트.
- 시료에 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스를 포함하는 수인성 바이러스의 DNA 또는 RNA에 특이적인 프라이머와 프로브를 가하여 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR을 수행함으로써 상기 바이러스를 종류별로 검출 및 정량하는 단계를 포함하는, 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스를 포함하는 수인성 바이러스의 검출방법.
- 제5항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 프로브가 서열번호 33 내지 40 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드인 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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2007
- 2007-06-19 KR KR1020070060158A patent/KR20080111785A/ko not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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