KR20080106522A - 개선된 세팔로스포린 제조 - Google Patents

개선된 세팔로스포린 제조 Download PDF

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KR20080106522A
KR20080106522A KR1020087020431A KR20087020431A KR20080106522A KR 20080106522 A KR20080106522 A KR 20080106522A KR 1020087020431 A KR1020087020431 A KR 1020087020431A KR 20087020431 A KR20087020431 A KR 20087020431A KR 20080106522 A KR20080106522 A KR 20080106522A
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환되었고, 상기 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환되지 않은 미생물의 세팔로스포린 생산 능력에 대한 상기 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환된 미생물의 세팔로스포린 생산 능력의 비가 1.2 이상임을 특징으로 하는 세팔로스포린 생산 미생물에 관한 것이다. 더욱 또한, 본 발명은 상기 세팔로스포린 생산 미생물의 생산 방법뿐만 아니라 상기 세팔로스포린 생산 미생물을 사용하는 세팔로스포린의 발효에 의한 제조 방법을 제공한다.

Description

개선된 세팔로스포린 제조{IMPROVED CEPHALOSPORIN PRODUCTION}
본 발명은 미생물에서 발효에 의해 세팔로스포린을 제조하는 방법에 관한 것이다.
섬유상 진균인 페니실리움 크리소제늄(Penicillium chrysogenum)은 페니실린-G와 같은 β-락탐 항생제의 천연 생산자이다. 최근 수십 년간, 페니실린-G 생산 능력은 전통적인 균주 개발에 의해 매우 개선되었으며, 그 결과 강력한 산업적인 생산 균주가 생성되었다. 최근에, 대사 경로 공학에 의해, 세팔로스포린 생산을 위한 여러 경로들이 페니실린 생산 균주, 특히 페니실리움 크리소제늄에 성공적으로 접목되었다. EP-A-0532341에서, 페니실리움 크리소제늄을, 전구체 아디프산의 존재 하에서 배양 시 형질전환된 균주가 아디필-7-ADCA(아디필-7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실산)를 생산할 수 있게 하는 엑스판다제를 암호화하는 스트렙토마이세 스 클라뷸리제루스( Streptomyces clavuligerus) cefE 유전자로 형질전환시켰다. EP-A-0540210에서는 페니실리움 크리소제늄을, 상기 스트렙토마이세스 클라뷸리제루스 cefE 유전자 이외에, 아디필-7-ADCA의 3-메틸 측쇄를 3-하이드록시메틸로 전 환시켜 아디필-7-아미노데아세틸세팔로스포란산(아디필-7-ADAC)을 제공하는 발현 산물을 갖는 하이드록실라제 유전자로 형질전환시켰다; EP-A-0540210의 또 다른 예로, 엑스판다제 및 하이드록실라제를 암호화하는 유전자로 이미 형질전환시킨 페니 실리움 크리소제늄을, 상기 3-하이드록시메틸 측쇄를 3-아세틸옥시메틸 측쇄로 전환시켜 아디필-7-ACA를 제공하는 발현 산물을 갖는 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 추가로 형질전환시킨다. WO2004/106347에서, 페니실리움 크리소제늄의 균주를 엑스판다제, 하이드록실라제 및 O-카바모일 트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환시켜 아디필-7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산을 생성시켰다.
페니실리움 크리소제늄의 산업적인 균주들은 다량의 다양한 베타-락탐 화합물, 특히 페니실린 G 및 페니실린 V를 생산하여 배양 배지내로 분비하는 그들의 능력 때문에 선택되었다. 다양한 방면의 증거는 베타-락탐 분비가, 가능하게는 운반 단백질을 통한 능동 과정임을 가리킨다. 상기와 같은 발효 과정의 후반 단계 동안 대단히 높은 베타-락탐 역가가 발효물에서 산업적인 규모로 발견된다. WO01/32904는 페니실린 G의 분비와 연관된 여러 ABC-운반자 폴리펩타이드를 개시한다. ABC 운반자 활성의 강화는 상기 베타-락탐 화합물의 분비를 증대시켰다.
앞서 논의된 페니실리움 균주와 같은 천연 비-세팔로스포린 재조합 생산 숙주에서 세팔로스포린 분자의 생산은 여전히 여러 가지 문제점을 부과한다. 예를 들어, 목적하는 화합물의 분비 수준이 여전히 비교적 낮으며 기술적으로 및 경제적으로 보다 매력적이기 위해서는 상기 수준을 증가시켜야 한다. 피. 크리소제늄(P. chrysogenum)에서 생산되는 세팔로스포린의 생산율은 상기 페니실린 운반자, 즉 ABC 운반자 폴리펩타이드가 상기 세팔로스포린 화합물에 대해 낮은 친화성을 가질 것이라는 사실로 인해 제한될 것이다. WO01/32904에서는 상기 문제점을, 상기 WO01/32904에 개시된 ABC-운반자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 아 크레모니움 크리소제늄(Acremonium chrysogenum)과 같은 천연 세팔로스포린 생산자로부터 하나 이상의 동종 ABC 운반자 폴리펩타이드를 클로닝함으로써 극복할 수 있음을 암시하였다.
섬유상 진균인 아크레모니움 크리소제늄은 세팔로스포린 C와 같은 세팔로스포린의 천연 생산자이다. 상기 진균의 특정 균주인 아크레모니움 크리소제늄 C10에서, 추정적인 유출 펌프 단백질을 암호화하고 동시에 세팔로스포린 C 생산을 현저하게 증가시키는 CefT 유전자가 최근에 동정되었다(울란(Ullan) 등의 문헌[(2002) Mol. Genet. Genomics, 267, 673-683; Liras and Martin(2006) International Microbiology 9, 9-19]). 상기 CefT-유전자의 뉴클레오타이드 서열은 더 내쇼날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(the National Center for Biotechnology Information)의 뉴클레오타이드 데이터베이스에 수탁 번호(유전자좌) AJ487683으로 기탁되어 있다. 상기 NCBS는 인터넷 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 접근할 수 있고 상기 CefT 유전자 뉴클레오타이드 서열은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=21214008에서 접근할 수 있다. 상기 CefT에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열로부터, 저자들은 상기 단백질이 12 개의 막통과 구획(TMS)을 갖고 주요 촉진인자 상과의 약 물:H+ 안티포터 12 TMS 그룹의 특징인 A, B, C, D2 및 G 동기를 함유하기 때문에 막통과 단백질인 것으로 결론지었다. 상기 CefT 단백질은 일부 독성 유기산, 예를 들어 아이소발레르산 및 페닐아세트산이 상기 CefT를 불활성으로 만드는 아크레모니움 균주에 독성이라는 사실로부터 결론지은 바와 같이, 상기 산에 내성을 부여한다. 상기 동종 CefT 유전자의 과발현은 아크레모니움 크리소제늄에서 세팔로스포린 C 생산을 개선시켰다. 이는 상기 CefT 유전자의 말단이 절단된 형태를 사용하는 경우가 아니었다. 그러나, 상기 CefT 유전자의 표적화된 불활성화는 아크레모니움 크 리소제늄에서 세팔로스포린 C 생산에 영향을 미치지 않았으며, 이는 아크 레모니움 크리소제늄 중에 세팔로스포린 배출과 연루된 중복 시스템들이 존재함을 시사한다.
아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 CefT 단백질은 ABC-운반자의 계열에 속하지 않는다. 아크레모니움 크리소제늄 C10(울란 등(2002))으로부터의 CefT 단백질의 아미노산 서열과 WO01/32904에 개시된 ABC-운반자의 아미노산 서열 중 어느 하나와의 비교는 상기 CefT 단백질이 상기 ABC 운반자 단백질과 어떠한 상동성도 갖지 않음을 밝히고 있다(즉 <25%).
"CefT 유전자"란 용어는 CefT 단백질, 즉 세팔로스포린 생산 미생물의 내부로부터 상기 미생물의 외부를 향한 세팔로스포린 화합물의 운반에 연루된 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 균주 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 상기와 같은 CefT 유전자의 예를 문헌[울란 등(2002)]에서 찾을 수 있으며, 상기 문헌에는 상기 CefT-유전자에 의해 암호화된 CefT 단백질의 아미노산 서열이 또한 개시되어 있다.
"이종 CefT 유전자"란 용어는 상기 CefT 유전자가 임의의 적합한 숙주 미생물로부터 획득될 수 있으며 세팔로스포린-생산 미생물을 형질전환시키는데 사용되나, 단 상기 CefT 유전자가 유래된 적합한 숙주 미생물이 상기 CefT 유전자로 형질전환시킨 세팔로스포린 생산 미생물과 동일한 종이 아님을 의미한다.
"동종 CefT 유전자"란 용어는 CefT 유전자가 임의의 적합한 숙주 미생물로부터 획득되며 세팔로스포린-생산 미생물을 형질전환시키는데 사용되나, 단 상기 CefT 유전자가 유래된 적합한 숙주 미생물이 상기 CefT 유전자로 형질전환시킨 세팔로스포린 생산 미생물과 동일한 종임을 의미한다. 상기 아크리모니움 크리소제 늄 C10의, 동일한 균주 아크리모니움 크리소제늄 C10으로부터 기원하는 동종 CefT 유전자에 의한 형질전환은 울란 등(2002)에 의해 개시되었다.
"상동성"이란 용어는 제 1 유전자, 단백질 또는 효소의 서열과 제 2 유전자, 단백질 또는 효소의 서열과의 일치성을 지칭한다. 본 명세서 전체를 통해, 상동성의 정도는 비교 유전자, 단백질 또는 효소와의 일치 퍼센트로서 나타낸다. 이러한 상동성의 측정은 숙련가에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 다른 계열 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해서 "의문 서열"로서 비교 단백질의 단백질 서열을 사용하여 공개된 데이터베이스에 대한 조사를 수행함으로써 수행할 수 있다. 상기와 같은 조사를 각 프로그램의 디폴트 매개변수를 사용하여 BLAST 프로그램(버전 2.2)으로 수행할 수 있다. 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하시오.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환되었고 형질전환된 미생물이 상기 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환되지 않은 미생물에 비해 개선된 세팔로스포린 생산 능력을 가짐을 특징으로 하는 세팔로스포린 생산 미생물을 제공한다. 개선된 세팔로스포린 생산 능력을 본 발명에서는 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환되지 않은 미생물의 세팔로스포린 생산 능력에 비해 상기 형질전환된 미생물의 세팔로스포린 생산 능력의 비가 1.2 이상, 보다 바람직하게는 1.4 이상, 보다 바람직하게는 1.6 이상, 보다 바람직하게는 1.8 이상, 보다 바람직하게는 2.0 이상, 보다 바람직하게는 2.1 이상, 보다 바람직하게는 2.3 이상, 보다 바람직하게는 2.5 이상, 보다 바람직하게는 3.0 이상, 보다 바람직하게는 5.0 이상, 보다 바람직하게는 10 이상인 것으로서 정의한다. 상기 세팔로스포린 생산 미생물은 바람직하게는 베타-락탐 화합물, 예를 들어 페니실린 및 세팔로스포린을 본래 생산할 수 있는 미생물이며, 페니실리움 , 아스퍼질러스 ( Aspergillus ), 스트렙토마이세스 및 아크레모니움으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 상기 그룹에서, 여러 미생물들, 예를 들어 스트렙토마이세스 및 아크레메니움은 본래 세팔로스포린을, 페니실리움 및 아스퍼질러스는 본래 페니실린을 생산하는 능력을 갖는다. 다른 미생물들, 예를 들어 이전에 개시된 바와 같은 페니실리움, 예를 들어 엑스판다제를 암호화하는 유전자에 의해 형질전환된 후 7-ADCA의 N-아실화된 유도체를 생산할 수 있거나, 또는 하이드록실라제, 하이드록실라제와 아세틸트랜스퍼라제 또는 하이드록실라제와 아세틸트랜스퍼라제와 O-카바모일 트랜스퍼라제에 의해 추가로 형질전환 시 각각 N-아실화된 유도체 7-ADAC, 7-ACA 및 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산을 생산할 수 있는 페니실리움 크리소제늄은 유전자 공학에 의해 세팔로스포린을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.
바람직하게는 상기 이종 CefT 유전자는 임의의 적합한 세팔로스포린 생산 미생물로부터 유래될 수 있지만, 바람직하게는 아크레모니움, 보다 바람직하게는 아 크레모니움 크리소제늄, 가장 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄 C10(울란 등(2002)에 의해 개시됨)으로부터 유래된다. 본 발명의 목적을 위해서, 또한 적합한 이종 CefT 유전자의 동족체, 예를 들어 울란 등(2002)에 의해 개시된 바와 같은 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 CefT 단백질과 비교 시 단백질 기준으로 30% 초과의 상동성, 바람직하게는 40% 초과의 상동성, 바람직하게는 50% 초과의 상동성, 바람직하게는 60% 초과의 상동성, 바람직하게는 70% 초과의 상동성, 바람직하게는 80% 초과의 상동성, 바람직하게는 90% 초과의 상동성을 갖는 CefT 단백질을 암호화하는 CefT 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 예를 들어 EP-A-0532341에 개시된 바와 같이 엑스판다제를 암호화하는 유전자에 의한 형질전환의 결과로서 유전자 공학에 의해 N-치환된 7-ADCA 유도체를 생산하는 능력을 획득한 페니실리움 균주, 바람직하게는 페니실리움 크리소제늄이며, 또한 상기 균주는 이종 CefT 유전자, 바람직하게는 아크레모니움으로부터의 CefT 유전자, 보다 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄으로부터의 CefT 유전자, 가장 바람직하게는 울란 등(2002)에 의해 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CefT 단백질을 암호화하는 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 CefT 유전자에 의해 형질전환되었다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양은 EP-A-0540210에 개시된 바와 같이 엑스판다제 및 하이드록실라제를 암호화하는 유전자에 의한 형질전환의 결과로서 유전자 공학에 의해 N-아실화된 7-ADAC 유도체를 생산하는 능력을 획득한 페니실리움 균주, 바람직하게는 페니실리움 크리소제늄이며, 또한 상기 균주는 이종 CefT 유전자, 바람직하게는 아크레모니움으로부터의 CefT 유전자, 보다 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄으로부터의 CefT 유전자, 가장 바람직하게는 울란 등(2002)에 의해 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CefT 단백질을 암호화하는 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 CefT 유전자에 의해 형질전환되었다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양은 EP-A-0540210에 개시된 바와 같이 엑스판다제 및 하이드록실라제 및 아실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자에 의한 형질전환의 결과로서 유전자 공학에 의해 N-아실화된된 7-ACA 유도체를 생산하는 능력을 획득한 페니실리움 균주, 바람직하게는 페니실리움 크리소제늄이며, 또한 상기 균주는 이종 CefT 유전자, 바람직하게는 아크레모니움으로부터의 CefT 유전자, 보다 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄으로부터의 CefT 유전자, 가장 바람직하게는 울란 등(2002)에 의해 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CefT 단백질을 암호화하는 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 CefT 유전자에 의해 형질전환되었다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양은 WO2004/106347에 개시된 바와 같이 엑스판다제, 하이드록실라제 및 O-카바모일 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자에 의한 형질전환의 결과로서 유전자 공학에 의해 N-아실화된 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산 유도체를 생산하는 능력을 획득한 페니실리움 균주, 바람직하게는 페니실리움 크리소제늄이며, 또한 상기 균주는 이종 CefT 유전자, 바람직하게는 아크레모니움으로부터의 CefT 유전자, 보다 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄으로부터의 CefT 유전자, 가장 바람직하게는 울란 등(2002)에 의해 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CefT 단백질을 암호화하는 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 CefT 유전자에 의해 형질전환되었다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 상기 이종 CefT 유전자를 적합한 숙주 미생물로부터 단리하고 상기 세팔로스포린 생산 미생물을 상기 단리된 CefT 유전자에 의해 형질전환시키는 단계를 포함하나, 단 상기 숙주 미생물이 상기 세팔로스포린 생산 미생물과 동일한 종이 아닌 본 발명에 따른 세팔로스포린 생산 미생물의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 상기 이종 CefT 유전자를 아크 레모니움, 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄, 가장 바람직하게는 아크레모 니움 크리소제늄 C10(울란 등(2002)에 의해 개시됨)으로부터 단리하고, 이전에 개시한 바와 같이 엑스판다제를 암호화하는 유전자 및 임의로 하이드록실라제, 아실트랜스퍼라제 및 O-카바모일 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자들 중 하나 이상에 의해 형질전환되어 페니실리움 균주에 7-ADCA, 7-ADAC, 7-ACA 및 N-아실화된 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산을 생산하는 능력이 제공된 상기 세팔로스포린 생산 미생물, 바람직하게는 페니실리움, 보다 바람직하게는 페니실리움 크리소제늄을 상기 단리된 CefT 유전자로 형질전환시키는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세팔로스포린 생산 미생물의 생산 방법을 제공한다.
세 번째 태양에서 본 발명은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 본 발명의 상응하는 세팔로스포린 생산 미생물을 배양함을 포함하는 세팔로스포린의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 7-ADCA, 7-ACA, 7-ADCA 및 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산의 N-아실화된 유도체의 제조 방법이다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 EP-A-0532341, EP-A-0540210 및 WO2004/106347에 개시된 바와 같은 발효 방법을 사용하여 7-ADCA, 7-ACA, 7-ADCA 및 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산의 아디필 유도체를 제조하는 방법이다.
일반적인 물질 및 방법
표준 과정을 문헌[Sambrook, J. et al.(1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 개시된 바와 같이 수행하였다. DNA를 제조사의 프로토콜에 따라 교정 폴리머라제 터보-Pfu-폴리머라제 또는 헤르큘라제(Herculase)(Stratagene, The Netherlands)를 사용하여 증폭시킨 반면, 제조된 균주 및 플라스미드의 확인을 Taq 폴리머라제를 사용하여 성취하였다. 제한 효소는 인비트로젠(Invitrogen) 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터의 것이었다. 통상적인 클로닝을 위해, 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli) 균주 Top10 및 DH10B(인비트로젠)를 사용하였다. 상기 제작된 플라스미드의 확인을 제한 분석 및 후속의 서열화(Seqlab GmbH, Goettingen, Germany)에 의해 수 행하였다.
섬유상 진균 페니실리움 크리소제늄 위스콘신 54-1255(ATCC 28089)를 유전자 변형 및 생산 균주 제조를 위한 숙주로서 사용하였다.
실시예 1
페니실리움 크리소제늄에서의 형질전환을 위한 CefT 발현 카세트의 제조
에스케리키아 콜라이 DH5a를 상이한 벡터들을 갖는 인비트로젠의 멀티사이트 게이트웨이(Multisite Gateway)(등록상표) 3-단편 벡터 구성 키트를 사용하여 빈도가 잦은 형질전환, 플라스미드 DNA 증폭(Sambrook, 1989) 및 플라스미드 제작을 위한 숙주 균주로서 사용하였다. 벡터 pDONRTM P4-P1R을 pcbC 유전자의 920 bp 상부의 프로모터 부위의 클로닝에 사용하였다. attB4F 부위를 프라이머 attB4-F-IPNS를 사용하여 중합 연쇄 반응(PCR)에 의해 가하고 attB1R 부위를 프라이머 attB1-R-IPNS에 의해 가하였다. 증폭된 PCR 산물을, pDONRTM P4-P1R-IPNS 프로모터를 생성시키는 BP 클로나제를 사용하여 pDONRTM P4-P1R 내에 클로닝하였다. 벡터 pDONRTM 201 게이트웨이 벡터를 사용하여 아크레모니움 크리소제늄의 CefT 유전자(acCefT)를 클로닝하였다. attB1F 부위를 프라이머 attB1F-AcCefT를 사용하여 PCR에 의해 가하고 attB2R 부위를 attB2R-AcCefT-마이너스-Stop를 사용하여 가하였다. 상기 증폭된 AcCefT 유전자를, pDONRTM 201-AcCefT를 생성시키는 BP 클로나제를 사용하여 pDONRTM 201 내에 클로닝하였다. 상기 AcCefT의 정지 코돈을 제거하여 상기 유전자 의 카복실 말단 부위에서 His-표지 또는 GFP-표지와 융합할 수 있게 하였다. 상기 pDONRTM P2R-P3에의 클로닝을 위해 penDE 유전자의 551bp 하부의 종결자 부위에 attB2F 부위를 가하기 위해 프라이머 attB2F-His8x-Tat를 사용하였다. 프라이머 attB3R-Tat와 함께 상기 종결자 부위를 클로닝하고 정지 코돈을 갖는 HIS-표지를 가하여 벡터 pDONRTM P2-P3R-HIS-Tat를 생성시켰다. GFP와의 카복실-말단 융합을 획득하기 위해서 프라이머 attB2R-GFP 및 attB3R-Tat를 사용하여 벡터 pDONRTM P2-P3R-GFP-Tat를 생성시켰다.
상기 멀티사이트 게이트웨이(등록상표) 3-단편 벡터 구성 키트의 LR 반응에서 pDESTTM R4-R3에서 상기 pDONRTM 벡터들을 각각 PcbC 프로모터, AcCefT 유전자, His- 또는 GFP-표지 및 PenDE 유전자의 종결자와 결합시켜 목적지 벡터를 제조하였다.
Figure 112008059531735-PCT00001
실시예 2
실시예 1에서 디자인한 CefT 발현 카세트를 사용한 페니실리움 크리소제늄 ATCC28089 CefE / CefF / CmcH(WO2004106347에 개시된 구조)의 형질전환
페니실리움 크리소제늄 ATCC 28089 CefE / CefF / CmcH의 형질전환 실험을 위해서 대략 0.3 g/L의 아디필-7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산을 생산하는 균주를 사용하였다. 원형질제를 제조 및 단리하고 형질전환(Alvarez, 1987)을, 유일한 질소원으로서 아세트아미드가 있는 플레이트 상에서 pcbC 프로모터, CefT 유전자 및 penDE 종결제가 있는 pDESTTM P4-R3 벡터와 선별 마커로서 사용된 AMDS-유전자의 동시형질전환에 의해 수행하였다. 형질전환체의 전체 RNA를 트리졸(Trizol)(등록상표)(인비트로젠)을 사용하여 단리하고 양성 형질전환체를 AcCefT 특이적 프라이머(AcCefT F1; 5'-TCGATTCGTACCAGCACCAGGC-3') 및 attB2-HIS-표지 프라이머(5'-TGGTGATGGTGATGGTGGACCACTT-3')를 사용하여 RT-PCR 비드(Amersham)로 측정하여 384bp의 PCR 단편을 획득하였다.
실시예 3
페니실리움 크리소제늄 ATCC28089 CefE / CefF / CmcH CefT의 배양 및 아디필-7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산 분비의 측정
5 CefT 형질전환체의 균사를 50 ㎖ 진탕 플라스크에서 (g/L): 글루코스(5); 락토오스(80); 유레아(4.5); (NH4)2SO4(1.1); Na2SO4(2.9); KH2PO4(5.2); K2HPO4(4.8)를 함유하는 무기물 배지 및 시트르산(150); FeSO4.7H2O(15); MgSO4.7H2O(150); H3BO3(0.0075); CuSO4.5H2O(0.24); CoSO4.7H2O(0.375); ZnSO4.7H2O(5); MnSO4.H2O(2.28); CaCl2.2H2O(0.99); 3 g/L의 아디프산을 함유하는 10 ㎖/L의 미량 원소 용액 A(멸균 전 pH 6.5)에 접종하였다. 25 ℃, 280 rpm에서 7일 증식 후, 세포를 펠릿화하고, 상등액을 세팔로스포린의 형성에 대해 NMR을 사용하여 분석하였다. 결과에 대해 표 2를 참조하시오. 데이터는 세팔로스포린 생산에 대한 피. 크리소제늄의 게놈에의 CefT 유전자의 통합의 긍정적인 효과를 분명히 보여준다.
페니실리움 크리소제늄 ATCC28089 CefE / CefF / CmcH의 CefT 유전자 형질전환체의 진탕 플라스크 배양물 중의 아디필-7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산의 농도
균주 아디필-7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산의 농도 비율
균주 0.30 g/L 1.0
균주 CefT1 0.55 g/L 1.8
균주 CefT2 0.49 g/L 1.6
균주 CefT3 0.63 g/L 2.1
균주 CefT4 0.71 g/L 2.4
균주 CefT5 0.53 g/L 1.8

Claims (8)

  1. 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환되었고, 상기 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환되지 않은 미생물의 세팔로스포린 생산 능력에 대한 상기 이종 CefT 유전자에 의해 형질전환된 미생물의 세팔로스포린 생산 능력의 비가 1.2 이상임을 특징으로 하는 세팔로스포린 생산 미생물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    이종 CefT 유전자가 아크레모니움 ( Acremonium ), 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄( Acremonium chrysogenum ), 가장 바람직하게는 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터 유래되거나 또는 아크레모니움 크리소제늄 C10으로부터의 CefT 단백질에 비해 단백질 기준으로 30%를 초과하는 상동성을 갖는 상기 CefT 단백질을 암호화하는 CefT 유전자의 동족체임을 특징으로 하는 세팔로스포린 생산 미생물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    본래 세팔로스포린이거나 또는 유전자 공학에 의해 상기 세팔로스포린을 생산하는 능력을 획득한 세팔로스포린 생산 미생물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    페니실리움 ( Penicillium ), 아스퍼질러스 ( Aspergillus ), 스트렙토마이세 스( Streptomyces ) 및 아크레모니움으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세팔로스포린 생산 미생물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    페니실리움 균주, 바람직하게는 페니실리움 크리소제늄( Penicillium chrysogenum) 균주가, 엑스판다제를 암호화하는 유전자에 의해 형질전환되고 임의로 하이드록실라제를 암호화하는 유전자, 하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 또는 하이드록실라제, 아세틸트랜스퍼라제 및 O-카바모일 트랜스퍼라제에 의해 추가로 형질전환된 후에 세팔로스포린을 생산하는 능력을 획득하고, 상기 페니실리움이 각각 N-아실화된 유도체 7-ADCA, 7-ADAC, 7-ACA 및 7-아미노-3-카바모일-옥시메틸-3-세펨-4-카복실산을 생산할 수 있는 세팔로스포린 생산 미생물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 미생물의 생산 방법으로서,
    a. CefT 유전자를 적합한 숙주로부터 단리하는 단계; 및
    b. 세팔로스포린 생산 미생물을 상기 단계 a에서 단리된 CefT 유전자에 의해 형질전환시키는 단계
    를 포함하나, 단 상기 숙주 및 세팔로스포린 생산 미생물이 동일한 유기체가 아닌 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 세팔로스포린 생산 미생물을 배 양함을 포함하는 세팔로스포린의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    세팔로스포린을 7-ADCA, 7-ACA, 7-ACCA 및 7-아미노-3-카바모일-옥시메틸-3-세펨-4-카복실산의 N-아실화된 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
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