KR20080093225A

KR20080093225A - 섬모충류를 이용한 화학 물질의 환경 센서 플랫폼 및 이에대한 마이크로 유체칩

Info

Publication number: KR20080093225A
Application number: KR1020070036862A
Authority: KR
Inventors: 박성수; 남성원; 윤주영
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2007-04-16
Filing date: 2007-04-16
Publication date: 2008-10-21

Abstract

본 발명은 아미노산이나 다른 화학 물질에 민감하게 반응하는 섬모충류 등의 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체의 성질을 이용하여 수 피코 몰 농도 내지 수백 마이크로 몰 농도 단위의 화학 물질을 용액 내에서 감지할 수 있는 환경 센서 플랫폼에 대한 것으로 이에 이용된 마이크로 유체 칩은 두 개의 챔버 (chamber)와 이를 연결하는 채널 구조로 도안 되어있다.

섬모충류, 주화성, 환경 센서, 마이크로 유체칩

Description

섬모충류를 이용한 화학 물질의 환경 센서 플랫폼 및 이에 대한 마이크로 유체칩{Environmental Sensor Platform of Chemicals using Ciliates and its Microfluidic Chip}

도 1은 두 PDMS층으로 구성된 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 이용하는 환경센서의 도안을 나타낸다.

도 2는 유체 칩 내에서의 확산 현상을 분석하기 위한 형광 물질(E. J. Jun, J. A. Kim, K. M. K. Swamy, S. S. Park, J. Y. Yoon, Tetrahedron Letter, 2006, 47, 1051-1054)의 유동을 관찰한 결과이다.

도 3은 여러 다른 농도의 아미노산에 대한 섬모충류의 주화성을 실험한 결과이다.

도 4는 Gly-Pro 농도에 대한 주화성 반응에 있어서 섬모충류의 움직임을 개체 별로 분석한 그래프이다.

본 발명은 하천에서 서식하는 섬모충류 등 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 가지는 생명체를 환경 센서로 활용함에 있어서 여러 화학 물질의 종류별 또는 농도별 선택성을 테스트할 수 있는 마이크로 플랫폼 및 이에 이용되는 마이크로 유체 칩을 개발하고 이의 활용성과 민감도를 확인하는 방법에 관한 것이다.

섬모충류는 높은 운동성과 주위 환경에 대한 민감성으로 인하여 이 생명체를 환경 센서로 이용하려는 시도는 오래전부터 있어 왔다 (M. P. Sauvant, D. Pepin, E. Piccini, Chemosphere, 1999, 38, 1631-1669). 그러나 기존의 분석 방법으로는 정확한 분석물의 농도 구배 조절이 불가능하여 섬모충류의 화학 물질에 대한 민감성도 테스트하기 어려웠다 (L. Kohidai, P. Soos, G. Csaba, Cell Biol. Int., 1997, 21, 341-345).

본 발명의 목적은 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 이용하여 용액 내 화학물질을 감지하는 새로운 환경 센서의 개발 및 그 응용으로서, 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 환경 센서로 활용하는 효율적 바이오 분석 플랫폼을 제작하는 것이다.

본 발명자들은 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 환경 센서로 활용함에 있어서 여러 화학 물질의 종류별 또는 농도별 선택성을 테스트할 수 있는 마이크로 플랫폼 및 이에 이용되는 마이크로 유체 칩을 개발하고 이의 활용성과 민감도를 확인하는 방법을 개발하였다.

본 발명에서 센서로 사용되는 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체로는 섬모충류 (Ciliate), 짚신벌레 (Paramecium)나 스텐터 (Stentor)속의 생 명체는 물론이고, 트리파노소마(Trypanosoma)속 등의 편모충류, 세균 및 사람의 정자등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 운동성 및 화학물질 민감성을 갖는 작은 생명체는 모두 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "마이크로 유체칩(microfluidic chip)"은 미세 유체 공학 기술을 이용하여 제조한 마이크로 사이즈의 채널을 포함하고 있는 칩이다. 미세 채널을 통해 소량의 유체가 흘러가면서 각종 반응과 작용이 일어나도록 함으로서 기존에 실험실에서 여러 복잡한 과정을 거쳐야 했던 일들이 칩 상에서 이루어진다 하여 랩온어칩(lab-on-a-chip)이라고도 불리기도 한다. 그동안 마이크로 채널을 제조하는 재료로서는 유리, 실리카, 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리(메틸메타크릴레이트)(Poly(methylmethacrylate)), 폴리(디메틸실록산)(Poly(dimethylsiloxane), PDMS)과 같은 다양한 물질이 연구되고 이용되었다.

본 발명에서 사용된 용어 "마이크로 플랫폼"은 마이크로 유체칩(microfluidic chip)을 이용하여 수 피코 몰 농도 내지 수백 마이크로 몰 농도 단위의 화학물질을 감지할 수 있는 센서의 기반을 뜻한다.

본 발명의 마이크로 유체 칩은 유체가 흐르는 채널 층과 가스의 압력으로 유체의 흐름을 제어할 수 있는 밸브 층 등 두 층으로 구성되어 있으며, 생명체가 화학 물질과 반응하여 나타나는 주화성이나 혐오성 반응을 쉽게 관찰할 수 있는 두 개의 챔버(chamber), 이를 연결하는 채널 구조 및 주입채널을 포함한다.

상기 마이크로 유체 칩을 이용하여 여러 화학 물질을 테스트할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 마이크로 유체칩은 하기를 포함한다.

제1챔버(1) 및 제2챔버(2);

상기 제1챔버(1) 및 제2챔버(2)를 연결하는 연결채널;

상기 연결채널 중간에 존재하는 밸브(5);

상기 제1챔버(1)에 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 유입하기 위한 제1유체 유입구; 및

상기 제2챔버(2)에 테스트 시료를 유입하기 위한 제2유체 유입구 및 배출구.

본 발명은 또한 3개의 개별적 밸브(3, 4, 5)를 포함하고 있으며, 각각의 밸브(3, 4, 5)는 유체가 통과하는 채널 및 말단에 유체의 흐름을 제어하는 구조 및 주입구로 구성된다.

상기 마이크로 유체칩은 바람직하게는 타이곤 튜브 및 솔레노이드 밸브를 추가로 포함한다.

하나의 구체예에서 상기 주입구와 연결된 타이곤 튜브 및 솔레노이드 밸브를 통해 가스를 주입할 수 있으며, 말단부의 유체의 흐름을 제어하는 구조는 바람직하게는 정사각형 구조이며, 가스압에 의해 팽창되어, 하부의 마이크로 채널을 압축하여 유체의 흐름을 제어할 수 있는 구조를 가지고 있다.

본 발명은 또한 상기 마이크로 유체칩을 이용한 피코 몰 농도 내지 수백 마이크로 몰 농도 단위의 화학물질을 용액 내에서 감지하는 환경 센서 플랫폼에 대한 것으로, 화학물질을 감지하는 방법은 하기 단계를 포함한다:

상기 마이크로 유체칩의 제1유체 유입구를 통해 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 주입하는 단계;

두 챔버의 연결 채널 위의 밸브(5)를 폐쇄하는 단계로서, 바람직하게는 두 챔버의 연결 채널 위의 밸브(5)를 닫아 일정 수의 생명체를 제1챔버(1)에 가두는 것인 단계;

밸브(5)의 반복적인 개폐를 통해 제1챔버(1)와 제2챔버(2)의 압력을 같게 유지하는 단계;

제2챔버(2) 쪽에 위치한 제2유체 유입구를 통해 테스트 하려는 물질을 제2챔버에 주입하는 단계;

제2챔버 주위의 밸브(4)를 닫아 제2챔버(2) 내의 테스트 하려는 물질을 제2챔버(2)에 가두는 것인 단계;

연결채널 위의 밸브(5)를 개방하여 확산현상에 의해 제2챔버(2) 내의 시료가 제1챔버(1)로 이동하는 단계; 및

상기 생명체의 반응을 검출하는 단계.

하나의 구현예에서, 본 발명에서의 유체의 흐름은 다중 층 소프트 리소그래피(multi-layer soft lithography) 및 컴퓨터로 제어되는 솔레노이드 밸브에 의해 조절되며, 이에 의해 마이크로 유체 칩 내의 화학 물질의 확산과 이에 따른 농도 구배(concentration gradient)가 제어된다.

상기 밸브(5)를 닫아 일정 수의 생명체를 제1챔버(1)에 가두는 단계에서, 밸브(5)를 닫는 것은 바람직하게는 가스압으로 수행되며, 이는 바람직하게는 적정 수의 생명체가 제1챔버(1)로 유입됨을 실체경(stereoscope)으로 관찰함과 동시에 수행된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 밸브 내의 가스의 유입은 마이크로 유체 칩에 연결된 타이곤 튜브와 솔레노이드 밸브에 의해 조절되며, 바람직하게는 솔레노이드 밸브는 내셔널 인스트루먼트 사(National Instruments Co., Austin, TX, USA)의 디지털 IO 카드에서의 5V TTL 시그널로 제어되는 트랜지스터 스위치와 용의하게 개별 실험에 적합한 프로그램을 구성할 수 있는 랩뷰 프로그램 (LabVIEW, National Instruments Co.)을 통해 전기적으로 개폐된다.

상기 생명체의 반응을 검출하는 단계는 바람직하게는 실체경으로 실시간(real-time) 관찰함으로써 수행된다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

본 실시예에서는 센서로 이용되는 생명체로서 섬모충류인 테트라하이메나 파이리포르미스(Tetrahymena pyriformis)를 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 마이크로 유체 칩은 도 1은 도시되었으며, 도 1은 두 폴리머 PDMS (poly-dimethylsiloxane)층으로 구성된 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 이용한 환경센서의 도안을 나타낸다. 아래쪽 파란색의 층은 생명체가 반응하는 마이크로 유체 칩의 채널 층(channel layer)이고, 윗쪽의 붉은색의 층은 기압으로 조절되는 밸브 층(valve layer) 이다.

본 실시예에서 사용된 챔버(chambers)는 원형이며 직경은 1 mm이며, 두 챔버의 연결 채널의 길이는 0.9 mm이다. 채널의 너비는 100 μm이며, 채널의 높이는 12.5 μm이다. 밸브 층의 채널은 300 μm의 정사각형 밸브에 연결되어 있으며, 유체 유입을 위한 구멍은 직경 0.6 mm이다. 이 마이크로 유체 칩의 전체 길이는 15.5 mm이며, 폭은 4.1 mm이다.

유체의 흐름은 솔레노이드 밸브에 의해 조절되며, 기압으로 작용되는 밸브는 타이곤 튜브 (Tygon tubing, Fisher Scientific International Inc., Hampton, NH, USA) 를 통해 솔레노이드 밸브와 연결 되어 있다 (solenoid valves, Lee Company, Westbrook, CT, USA). 솔레노이드 밸브는 내셔널 인스트루먼트 사(National Instruments Co., Austin, TX , USA)의 디지털 IO 카드에서의 5V TTL 시그널로 제어되는 트랜지스터 스위치 (Transistor switches, Comfile Technology, Seoul, Korea)로 제어된다. 밸브의 개폐는 랩뷰 프로그램 (LabVIEW, National Instruments Co.)으로 작동된다.

실시예 1

도 2는 마이크로 유체 칩 내에서의 확산 현상을 분석하기 위한 형광 물질(E. J. Jun, J. A. Kim, K. M. K. Swamy, S. S. Park, J. Y. Yoon, Tetrahedron Letter, 2006, 47, 1051-1054)의 유동을 관찰한 결과이다. 도 2(a)는 챔버 주위의 모든 밸브가 닫힌 상태의 형광 사진이며, 형광 물질은 주입된 오른쪽 챔버인 제2챔버(2)에만 머물러 있음을 관찰할 수 있다. 도 2(b)는 두 챔버의 연결 채널 위의 밸브를 연 후 10분 후의 형광 사진이며, 제2챔버(2)의 형광 물질이 왼쪽 챔버인 제1챔버(1)로 확산됨을 관찰 할 수 있다. 도 2(c)는 연결채널 위의 밸브(5)를 연 후 20분 후의 형광 사진이며, 형광 물질의 확산이 시간의 흐름에 따라 진행됨을 관찰할 수 있다. 도 2(d)는 연결 채널을 연 후 2분, 10분, 20분, 40분, 60분 후의 두 챔버의 연결채널의 다른 위치에서의 형광 변화를 나타낸 그래프이다. X축은 두 챔버의 연결채널 위의 제2챔버로부터의 거리가 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 및 900μm인 9개의 위치를 표시하며, Y축은 100μm 위치의 형광 강도(F₀)에 대한 각각의 위치에서의 형광 강도(F) 비율(F/F₀)을 표시한다. 두 챔버의 연결채널 내의 형광 물질은 평행 상태에 이를 때까지 선형적 농도 구배를 유지하며, 시간의 흐름에 따라 농도 구배 경사가 감소하여 종국에는 평행 상태에 도달하게 됨을 추론할 수 있게 한다. 이러한 선형적 농도 구배는 운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체의 주화성의 이론적 토대가 된다.

실시예 2

도 3은 여러 다른 농도의 아미노산에 대한 섬모충류의 주화성을 실험한 결과이다. 주화성 실험을 위해서는 섬모충은 가는 튜브와 연결된 1mL 주사기로 왼쪽의 제1유체 유입구를 통해 주입되며 적정 수의 섬모충이 제1챔버(1)로 유입됨을 실체경(stereoscope)으로 관찰함과 동시에 두 챔버의 연결 채널 위의 밸브(5)를 가스압으로 닫음으로서 일정 수의 섬모충을 왼쪽의 제1챔버(1)에 가둔다. 밸브(5)를 3~4회 1~2초 간 개폐 함으로써 제1챔버(1)와 제2챔버(2)의 압력을 같게 유지시킨다. 오른쪽 유체 유입구를 통해 테스트 하려는 물질을 오른쪽의 제2챔버(2)에 주입한 후 제 2 챔버 주위의 밸브를 닫아 테스트 하려는 물질을 오른쪽의 제2챔버(2)에 가둬둔다. 그런 뒤에 두 챔버의 연결채널 위의 밸브(5)를 열면 위의 도 2에서 관찰한 바와 같이 확산 현상에 의해 오른쪽 제2챔버(2) 내의 시료는 왼쪽 제1챔버(1)로 선형적 농도 구배를 유지하며 이동하며, 확산 물질의 종류에 따라 왼쪽 제1챔버(1) 내의 섬모충은 반응을 나타낸다. 도 3(a)(b)(c)는 10 pM Glycine-Proline (Gly-Pro)에 반응하는 섬모충류의 광학 사진이다. 도 3(a)는 챔버 주위의 모든 밸브가 닫힌 상태의 광학 사진이며, 섬모충류가 왼쪽 제1챔버(1)에 가두어져 있음을 관찰 할 수 있다. 도 3(b)는 두 챔버의 연결채널 위의 밸브를 연 후 2분 후의 광학 사진이며, 왼쪽 제1챔버(1)의 섬모충류가 Gly-Pro 농도 구배를 따라 오른쪽 제2챔버(2)로 이동함을 관찰 할 수 있다. 도 3(c)는 두 챔버의 연결 채널 위의 밸브를 연 후 10분 후의 광학 사진이며, 거의 모든 섬모충류가 오른쪽 제2챔버(2)로 이동했음을 관찰 할 수 있다. 도 3(d)(e)(f)(g)는 다른 농도의 아미노산에 다르게 반응하는 섬모충류의 주화성 반응을 나타내는 그래프 들이다. X축은 두 챔버의 연결 채널 위의 밸브를 연 후 경과된 시간을 나타내며, Y축은 왼쪽 제1챔버(1) 또는 오른쪽 제2챔버(2)에 존재하는 섬모충 개체 수를 나타낸다. 도 3(d)는 여과 처리된 물의 확산에 대한 섬모충류 반응을 나타내는 그래프이며, 섬모충이 주화성 반응을 보이지 않고 왼쪽 챔버에 머물러 있음을 볼 수 있다. 3(e)(f)는 아미노산 Glycine (Gly)에 대한 반응이며, 100 μM에 대해 주화성을 나타내지 않는 반면에, 1 μM에 대해 주화성 반응을 나타낸다. 3(g)는 10 pM Gly-Pro에 대한 반응을 나타내는 그래프이며, 낮은 농도임에도 불구하고 강한 주화성 반응이 관찰된다.

실시예 3

도 4는 Gly-Pro 농도에 대한 주화성 반응에 있어서 섬모충류의 움직임을 개체 별로 분석한 그래프이다. X축은 Gly-Pro 농도를 나타내며, 왼쪽 Y축은 30초 동안의 왼쪽 챔버에서 섬모충의 움직임을 화소(pixel)로 나타내고 오른쪽 Y축은 오른쪽 챔버 즉, Gly-Pro를 찾아 이동하기까지의 시간을 표시한다. 섬모충류는 100 pM 농도의 Gly-Pro를 찾아 가기까지 가장 적은 시간이 소요되며 가장 높은 운동성을 나타냄을 미루어, 100 pM Gly-Pro에 가장 높은 주화성 반응을 보임을 추론할 수 있다.

본 발명은 하천에 서식하는 섬모충류 등 운동성 및 화학물질에 대한 민감성 을 갖는 생명체를 이용하여 용액 내 화학 물질을 감지할 수 있는 새로운 환경 센서이다. 미세한 농도에도 민감하게 반응하는 운동성을 갖는 생명체를 이용하는 방법은 기존에 시도되었으나 정확하고 세부적인 분석 방법이 요구되었다. 가스의 압력으로 유체의 흐름을 제어할 수 있는 마이크로 유체 칩을 이용한 본 발명은 극소량의 시료로 정확하고 빠른 정성적 분석뿐 아니라 세부적인 농도 변화에 따른 정량적 분석도 가능한 효과가 있다.

Claims

운동성 및 화학물질에 대한 민감성을 갖는 생명체를 용액 내 화학 물질을 분석하는 환경 센서로서 이용하는 마이크로 유체칩(micro fluidic chip)으로서:

제1챔버(1) 및 제2챔버(2);

상기 제1챔버(1) 및 제2챔버(2)를 연결하는 연결채널;

상기 연결채널 중간에 존재하는 밸브(5);

상기 제1챔버에 상기 생명체를 유입하기 위한 제1유체 유입구; 및

상기 제2챔버(2)에 테스트 시료를 유입하기 위한 제2유체 유입구 및 배출구;

를 포함하는 마이크로 유체칩.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로 유체칩은:

타이곤 튜브; 및

솔레노이드 밸브를

추가로 포함하는 마이크로 유체칩.
청구항 1에 있어서, 상기 생명체가 운동성을 갖는 섬모충류(Ciliate), 짚신벌레 (Paramecium)나 스텐터(Stentor), 편모충류, 및 세균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 마이크로 유체칩.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 마이크로 유체칩을 이용하여 수 피코 몰 농도 내지 수백 마이크로 몰 농도 단위의 화학 물질을 분석하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:

상기 마이크로 유체칩의 제1유체 유입구를 통해 상기 생명체를 주입하는 단계;

상기 밸브(5)를 폐쇄하는 단계로서, 상기 밸브(5)를 닫아 상기 주입된 일정 수의 생명체를 상기 제1챔버(1)에 가두는 단계;

상기 밸브(5)의 반복적인 개폐를 통해 제1챔버(1)와 제2챔버(2)의 압력을 같게 유지하는 단계;

제2챔버(2) 쪽에 위치한 제2유체 유입구를 통해 테스트 하려는 물질을 제2챔버에 주입하는 단계;

제2챔버 주위의 밸브(4)를 닫아 제2챔버(2) 내의 테스트 하려는 물질을 제2챔버(2)에 가두는 것인 단계;

상기 밸브(5)를 개방하여 확산현상에 의해 제2챔버(2) 내의 시료가 제1챔버(1)로 이동하는 단계; 및

상기 생명체의 반응을 검출하는 단계.
청구항 4에 있어서, 상기 밸브(5)를 폐쇄하는 단계는 가스압에 의해 수행되는 것인 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 밸브(5)를 폐쇄하는 단계는 랩뷰 프로그램 (LabVIEW, National Instruments Co.)을 통해 전기적으로 개폐되는 솔레노이드 밸브를 통해 칩 내의 가스 유입을 제어함에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 밸브를 닫아 제2챔버(2) 내의 압력을 제1챔버(1)와 같게 유지하는 단계는 밸브(5)를 반복적으로 개폐함에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 생명체의 반응을 검출하는 단계는 실체경(stereoscope)을 이용해 실시간 관측에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.