KR20210127476A - 확산 챔버 및 채널을 포함하는 생체 미세환경 모사 미세유체 장치 - Google Patents

확산 챔버 및 채널을 포함하는 생체 미세환경 모사 미세유체 장치 Download PDF

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KR20210127476A
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Abstract

본 발명은 채널 내부의 유체 흐름을 차단 또는 생성하여 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어함으로써 미세환경의 시간적 제어를 통해 생체 미세환경을 모사할 수 있는 미세유체 장치 및 이의 제조방법으로, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 단순히 채널의 유체 흐름을 기계적으로 생성 또는 차단하는 일시적 조작으로 시간에 따라 끊임없이 변화하는 생체 미세환경을 모사할 수 있으며, 간단한 방법으로 확산을 제어할 수 있어, 확산 챔버와 채널의 수, 및 이들의 배열을 다양하게 설계할 수 있어 보다 복잡한 미세환경도 재현할 수 있다.

Description

확산 챔버 및 채널을 포함하는 생체 미세환경 모사 미세유체 장치 {A microfluidic device mimicking a biological microenvironment and comprising diffusion chambers and channels}
본 명세서에는 채널 내부의 유체 흐름을 차단 또는 생성하여 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어함으로써 미세환경의 시간적 제어를 통해 생체 미세환경을 모사할 수 있는 미세유체 장치, 이의 제조방법, 이를 이용한 실시간 미세환경 제어 방법, 및 세포 반응 측정 및 관찰 방법이 개시된다.
암은 전 세계적으로 주요한 사망 원인이 되는 질병이다. 다수의 연구자들은 기존의 수술, 화학 요법 및 방사선 요법 이외에 효과적인 치료 방법을 개발하기 위해 암 시스템을 연구해왔으며, 여러 암 치료법이 연구되어 분자 표적 요법(M. Huang, A. Shen, J. Ding, and M. Geng, "Molecularly targeted cancer therapy: Some lessons from the past decade," Trends Pharmacol. Sci., vol. 35, no. 1, pp. 41-50, 2014.), 면역 요법(S. A. Rosenberg, "Decade in review―cancer immunotherapy: Entering the mainstream of cancer treatment," Nat. Rev. Clin. Oncol., 2014.) 등 많은 유망한 결과가 제시되었다. 그러나, 의료 행위 적용 시 성공적으로 사용된 사례는 거의 없었다. 연구 결과에서 약물 상용화로의 전환에 있어 주요한 장애물은 제안된 시스템을 검증하고 약물 개발하는 과정 중 막대한 비용과 시간이 소비된다는 것이다. 신약 개발을 완료하기까지, 평균 26억 달러로 12년 동안 5 단계의 임상을 거쳐야 하며 임상 시험에서 전임상 동물 시험을 통과한 후보 약물의 약 90% 이상이 실패한다(M. Wilkinson, "The Potential of Organ on Chip Technology for Replacing Animal Testing," in Animal Experimentation: Working Towards a Paradigm Change, 2019.). 이는 동물 모델이 인간 모델을 정확하게 표현할 수 없으므로, 임상 시험에서 부정확한 종양 표적화 및 부정확한 조직 침투 문제가 발생하기 때문이며, 이로 인해 비용과 시간이 추가적으로 소요된다(N. S. Forbes, "Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy,"Nat. Rev. Cancer, vol. 10, no. 11, pp. 785-794, 2010.). 임상 시험이 필수적이고 대체할 수 없는 절차라는 점을 고려할 때, 약물 개발 비용과 시간을 줄이기 위해 전임상 단계를 매우 정밀하게 단순화하는 것이 가장 바람직한 접근법이다.
새로운 암 치료법을 개발하는 데 드는 비용을 줄이기 위해, 전임상 단계에서 높은 처리량과 신속한 약물 스크리닝 능력을 포함하는 미세유체 기반의 칩(organ-on-a-chip)이 수십 년 동안 널리 연구되어 왔다(B. Zhang, A. Korolj, B. F. L. Lai, and M. Radisic, "Advances in organ-on-a-chip engineering," Nat. Rev. Mater., vol. 3, no. 8, pp. 257-278, 2018.; S. N. Bhatia and D. E. Ingber, "Microfluidic organs-on-chips," Nat. Biotechnol., vol. 32, no. 8, pp. 760-772, 2014.; A. Sontheimer-Phelps, B. A. Hassell, and D. E. Ingber, "Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips," Nat. Rev. Cancer, vol. 19, no. 2, pp. 65-81, 2019.). 체외(in vitro) 미세유체 칩을 이용하는 것의 주요 장점은 생체 내(in vivo) 장기의 미세한 생리 기능 및 병리학적 과정을 복제하는 데 있으며, 이로 인해 임상 시험 전에 의미 있는 전임상 데이터를 제공할 수 있다(S. N. Bhatia and D. E. Ingber, "Microfluidic organs-on-chips," Nat. Biotechnol., vol. 32, no. 8, pp. 760-772, 2014.; A. Sontheimer-Phelps, B. A. Hassell, and D. E. Ingber, "Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips," Nat. Rev. Cancer, vol. 19, no. 2, pp. 65-81, 2019.; S. J. Hachey and C. C. W. Hughes, "Applications of tumor chip technology," Lab Chip, vol. 18, no. 19, pp. 2893-2912, 2018.). 예를 들어, 기계적으로 진동하는 폐 칩(lung-on-a-chip)은 박테리아와 사이토카인에 대해 동일한 반응을 보였으며, 또한 물리적 진동 응력이 세포에 대한 나노입자의 흡수를 향상시킨다는 것을 보여주었다(D. Huh, B. D. Matthews, A. Mammoto, M. Montoya-Zavala, H. Yuan Hsin, and D. E. Ingber, "Reconstituting organ-level lung functions on a chip," Science (80-. )., 2010.). 또한, 체외(in vitro) 혈관신생 칩은 (angiogenesis chip) 전-혈관신생 인자 및 항-혈관신생 인자에 대한 동등한 반응을 나타냈다(A. Sobrino et al., "3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks," Sci. Rep., vol. 6, no. July, pp. 1-11, 2016.).
체외(in vitro) 종양 칩 (tumor-on-a-chip)의 중요한 측면인 효과성은 칩이 생체 내 종양 미세 환경 (tumor microenvironment, TME)의 주요 특징을 유사하게 포함하였는지 여부에 의해 결정된다. 종양이 성장하는 동안, 종양 세포는 성장 인자, 케모카인 및 사이토카인과 같은 유인하는 분자(attractive molecules)를 분비하여 기질 세포, 면역 세포 및 혈관 세포를 모으고 조직에서 미세환경을 구축한다(Y. Yuan, Y. C. Jiang, C. K. Sun, and Q. M. Chen, "Role of the tumor microenvironment in tumor progression and the clinical applications (Review)," Oncol. Rep., vol. 35, no. 5, pp. 2499-2515, 2016.). 종양 세포가 TME에서 모인 세포와의 상호작용을 시작할 때, 모인 세포는 침윤 및 전이를 촉진하고, 혈관신생을 자극하며, 증식 신호 전달(proliferate signaling)을 유지함으로써 종양 성장을 돕는다(M. Wang et al., "Role of tumor microenvironment in tumorigenesis,"J. Cancer, vol. 8, no. 5, pp. 761-773, 2017.). TME는 정상 세포 환경으로부터 분리된 몇 가지 주요 특징을 갖는다: 1) 다양한 유형의 주변 세포가 종양 세포와 상호 작용하고, 2) 종양 세포의 중심 영역이 저산소 상태를 가지며, 3) 환경은, 특이 종양 성장 과정에 필수적인 혈관 신생으로 인해, 시간에 걸쳐 변화한다(M. Wang et al., "Role of tumor microenvironment in tumorigenesis,"J. Cancer, vol. 8, no. 5, pp. 761-773, 2017.; Y. Yuan, Y. C. Jiang, C. K. Sun, and Q. M. Chen, "Role of the tumor microenvironment in tumor progression and the clinical applications (Review)," Oncol. Rep., vol. 35, no. 5, pp. 2499-2515, 2016.; F. R. Balkwill, M. Capasso, and T. Hagemann, "The tumor microenvironment at a glance," J. Cell Sci., vol. 125, no. 23, pp.5591-5596, 2012.).
종양 혈관신생은 종양 성장 단계에서 일어나는 뚜렷한 특징이고, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 전-혈관신생 인자(pro-angiogenic factors) 및 항-혈관신생 인자의 불균형한 발현으로 인해 정상적인 생리적 혈관신생과는 크게 다르다(G. Bergers and L. E. Benjamin, "Tumorigenesis and the angiogenic switch," Nat. Rev. Cancer, vol. 3, no. 6, pp. 401-410, 2003.). 저산소 상태가 "혈관 신생 스위치"를 켜면, 종양 세포와 종양에 모인 주변 세포 (예를 들어 대식세포, 섬유아세포)로부터 전-혈관신생 인자가 과도하게 방출되어, 결국 내피세포가 종양을 향해 모여드는 새로운 혈관을 형성한다(D. Ribatti, B. Nico, E. Crivellato, A. M. Roccaro, and A. Vacca, "The history of the angiogenic switch concept," Leukemia, vol. 21, no. 1, pp. 44-52, 2007.). 이러한 과정은 종양이 남아있는 한 무기한으로 계속된다(J. Folkman, "Tumor Angiogenesis," Adv. Cancer Res., 1985.). 정상적으로 혈성된 혈관은 빠르게 성숙하고 안정되는 반면, 이 혈관은 투과적이고 비정상적인 혈관 구조를 가져, 영향을 받지 않던 새로운 조직으로의 혈관 외 유출, 순환 및 재배치, 즉 전이를 촉진한다(G. Bergers and L. E. Benjamin, "Tumorigenesis and the angiogenic switch," Nat. Rev. Cancer, vol. 3, no. 6, pp. 401-410, 2003.; B. Muz, P. de la Puente, F. Azab, and A. K. Azab, "The role of hypoxia in cancer progression, angiogenesis, metastasis, and resistance to therapy," Hypoxia, 2015.; C. L. Chaffer and R. A. Weinberg, "A perspective on cancer cell metastasis," Science. 2011.). 혈관신생이 종양 진행 및 전파에 중추적인 역할을 하는 것은 명백하다. 연구자들은 TME 내에서 혈관신생의 역할을 더 잘 이해하는 것이 새롭고도 개선된 치료 전략을 개발하는 데 가치가 있다고 판단한다.
따라서, 효과적인 종양 미세환경 칩 (TME-on-a-chip) 에는 혈관 신생을 포함한 변화하는 TME, 저산소 상태 및 내부에 존재하는 세포 간의 분자 교환이 포함되어야 한다. 그러나, 종양 세포에서 혈관신생을 모방하는 기존의 칩(organ-on-a-chip)은 정지 상태를 가지며, 이는 혈관신생 스위치의 온/오프 과정과 같이 변화하는 환경과 상호작용을 통해 발생하는 생리현상을 정확하게 재현하는 데 한계가 있다(A. Sobrino et al., "3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks," Sci. Rep., vol. 6, no. July, pp. 1-11, 2016.; D. H. T. Nguyen et al., "Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 110, no. 17, pp. 6712-6717, 2013.).
또한, 시간에 따라 변화하는 미세환경을 온/오프하는 스위치 메커니즘을 미세유체 장치에서 구현하기 위해, 의도적으로 펄스 레이저(pulsed laser)를 조사하여 버블을 형성하여 제어하고자 하는 타겟 요소의 이동 방향을 바꾸거나(WU, Ting-Hsiang, et al., Pulsed laser triggered high speed microfluidic switch., Applied Physics Letters, 2008, 93.14: 144102), 상호 연결된 튜브를 클램핑함으로써 여러 방향으로 향한 밸브 장치로 미세환경을 모사하거나(JEON, Hojeong, et al., Quantitative analysis of single bacterial chemotaxis using a linear concentration gradient microchannel., Biomedical microdevices, 2009, 11.5: 1135), 두 개의 주입구 채널에 원하는 유체를 직접적으로 전달하는 방식으로 배출구 채널로 흘러나가는 유체의 종류를 결정하여 미세환경을 모사하고자 하는 종래 기술이 존재하나(Huh, Dongeun, et al., Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007 Nov 27;104(48):18886-91), 이들은 구현 방법이 복잡하고 추가적으로 요구되는 장치들이 많아 시간 및 비용적으로 비효율적인 면이 있고, 구성의 복잡성으로 인해 다양한 요소에 의해 변화하는 미세환경을 구현하기에는 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 확산 스위치 시스템(diffusion switch system)을 사용하여 생체 내 미세환경, 예를 들어 혈관신생을 시간적으로 제어할 수 있는 간단한 가변 미세유체 장치(예를 들어 종양 미세환경 칩)를 설계하고 제조하였다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 복수의 확산 챔버; 및 이들 사이에 배치되는 하나 이상의 채널;을 포함하고, 상기 채널 내부에서의 유체의 흐름을 차단 또는 생성하여 상기 복수의 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어함으로써 생체 미환경을 모사하는, 미세유체 장치를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 장치 형성 용액을 제조하는 단계;폴리머(polymer)를 포함하는 스캐폴드 용액을 평면 상에 코팅하여 기판을 형성하고 상기 기판 내 공동을 형성하는 단계; 및 상기 장치 형성 용액을 상기 기판 내 형성된 공동에 넣고, 이를 경화시켜 미세유체 장치를 형성하는 단계;를 포함하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 실시간 미세환경 제어 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 복수의 확산 챔버 중 하나 이상의 확산 챔버에 생체 시료를 탑재하는 단계; 및 상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 미세유체 장치를 이용한 세포 반응 측정 및 관찰 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 복수의 확산 챔버; 및 상기 복수의 확산 챔버 사이에 배치되는 하나 이상의 채널;을 포함하고, 상기 확산 챔버 및 채널의 표면은 다공성이고, 상기 채널 내부에서의 유체의 흐름을 차단 또는 생성하여 상기 복수의 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 장치 형성 용액을 제조하는 단계; 폴리머(polymer)를 포함하는 스캐폴드 용액을 평면 상에 코팅하여 기판을 형성하고 상기 기판 내 공동을 형성하는 단계; 및 상기 장치 형성 용액을 상기 기판 내 형성된 공동에 넣고, 이를 경화시켜 미세유체 장치를 형성하는 단계;를 포함하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 제조방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 실시간 미세환경 제어 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 복수의 확산 챔버 중 하나 이상의 확산 챔버에 생체 시료를 탑재하는 단계; 및 상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 미세유체 장치를 이용한 세포 반응 측정 및 관찰 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치(100)는 그 표면이 다공성인 복수의 확산 챔버(210, 220, 300) 및 하나 이상의 채널(410, 420)을 포함하고 있어, 확산 챔버에 존재하는 생체시료에서 타겟 요소인 분자를 신호로 전달하는 확산 통로를 제공하며, 상기 채널은 이를 가로지르는 타겟 요소의 확산을 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 확산된 타겟 요소(예를 들어, 전-혈관신생 인자)의 양을 제어함으로써 미세유체 장치에서 생체 내 미세환경의 변화(예를 들어, 혈관 신생 스위치)의 인공 조작을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 단순히 채널의 유체 흐름을 기계적으로 생성 또는 차단하는 일시적 조작으로 시간에 따라 끊임없이 변화하는 생체 미세환경을 모사할 수 있으며, 간단한 방법으로 확산을 제어할 수 있어, 확산 챔버와 채널의 수, 및 이들의 배열을 다양하게 설계할 수 있어 보다 복잡한 미세환경도 재현할 수 있다. 이로써, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 의학 및 생물학 분야에서 다양한 생체평가를 수행하기 위한 강력한 수단으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 측면에 따라 설계된 미세유체 장치(100)의 일 예시를 간략하게 도시한 도이다.
도 2a 및 도 2b는 도 1의 중앙 확산 챔버 부근을 확대하여 도시한 도로서, 본 발명의 일 측면에 따라 설계된 미세유체 장치(100)의 일 예시를 간략하게 도시한 도이다.
도 3는 본 발명의 일 측면에 따라 설계된 미세유체 장치(100)를 COMSOL 시뮬레이션으로 시험한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 3의 왼쪽부터 차례로 채널(410, 420) 내부에서 유체의 흐름을 차단(no flow)하여 확산 챔버들(제 1 측면 확산 챔버(210), 중앙 확산 챔버(300) 및 제 2 측면 확산 챔버(220))간 타겟 요소의 확산이 시작하도록 확산 스위치를 켠 상태(diffusion switch on), 확산 스위치를 켬에 따라 확산 챔버들(측면 확산 챔버(210, 220) 및 중앙 확산 챔버(300))간 상호작용이 발생한 상태, 채널(410, 420) 내부에서 유체의 흐름을 생성(flow)하여 확산 챔버들(측면 확산 챔버(210, 220) 및 중앙 확산 챔버(300))간 타겟 요소의 확산이 차단되도록 확산 스위치를 끈 상태(diffusion switch off), 확산 스위치를 끔에 따라 확산 챔버들(측면 확산 챔버(210, 220) 및 중앙 확산 챔버(300))간 상호작용이 차단한 상태를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치의 구성 및 제조 과정을 간략하게 도시한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 측면에 따라 제조된 미세유체 장치의 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치를 이용하여 채널 내부에서의 유체의 흐름을 차단(no flow) 또는 생성(flow)함으로써 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어하는, 확산 스위치 (diffusion switching) 메커니즘을 간략하게 나타낸 도이다. 도 6에서 노란색(도 1 및 도 2a의 도트로 표시된 부분에 해당)은 채널 및 확산 챔버를, 검은색(도 1 및 도 2a의 검은 선 및 하얀색 면으로 표시된 부분에 해당)은 다공성 하이드로겔을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치에서의 채널 내부의 유체 흐름 차단 또는 생성에 따른 확산 챔버 간 타겟 요소 확산이 일어나는 확산 스위치 메커니즘을 확인하기 위해 수행한 확산 제어 실험의 시간에 따른 형광 이미지를 나타낸 도이다. 도 7에서 초록색은 FITC를, 붉은색은 Cy5를 나타낸다.
도 8은 도 7의 시간에 따른 지점 A (Point A) 및 지점 B (Point B) 각각의 형광 강도 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치를 이용하여 채널 내부에서의 유체의 흐름을 차단 또는 생성함으로써, 중앙 확산 챔버에 존재하는 성장 인자(VEGF)의 확산을 제어하는, 확산 스위치 (diffusion switching) 메커니즘을 간략하게 나타낸 도이다. 도 9에서 노란색(도 1 및 도 2a의 도트로 표시된 부분에 해당)은 채널 및 확산 챔버를, 검은색(도 1 및 도 2a의 검은 선 및 하얀색 면으로 표시된 부분에 해당)은 다공성 하이드로겔을 나타낸다.
도 10a 및 10b은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치에서 세포를 배양하여 생체 내 미세환경을 시간적으로 제어할 수 있는지 확인하기 위해 수행한 실험에서, 채널 내 유체 흐름이 차단(Diffusion on) 또는 생성(Diffusion off) 시 2 개의 측면 확산 챔버(210, 220) 각각에서 증식된 내피세포의 사진(도 10a) 및 내피세포의 증식율을 나타낸 그래프(도 10b)이다.
도 11a 및 11b은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치에서 세포를 배양하여 생체 내 미세환경을 시간적으로 제어할 수 있는지 확인하기 위해 수행한 세포 이동 실험에서, 채널 내 유체 흐름이 차단(Diffusion on) 또는 생성(Diffusion off) 시 2 개의 측면 확산 챔버(210, 220) 각각에서의 내피세포의 이동 사진(도 11a) 및 내피세포의 이동 정도(CMI)를 나타낸 그래프(도 11b)이다.
도 12a 및 12b는 확산 챔버의 수 또는 형태, 또는 채널의 수 또는 형태를 다양하게 하여 제조할 수 있는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치의 예시를 나타낸 도이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.
본 발명의 일 측면에서, "미세환경"은 개체 내부에 존재하는 개체의 생리학적 측면에 영향을 끼치는 미세한 환경으로서, 구체적으로 인간 내부에 존재하는 미세환경일 수 있고, 보다 구체적으로 인간 조직 내부에 존재하는 미세환경일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)일 수 있으나, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치로 모사할 수 있는 생체 미세환경이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에서, "미세유체"는 개체 내부에서 관류하는 미세한 유체로서, 구체적으로 인간의 조직에서 관류하는 유체일 수 있고, 보다 구체적으로 인간의 종양에서 관류하는 기체 또는 체액일 수 있고, 보다 더 구체적으로 인간의 종양 또는 종양 근처의 혈관에서 관류하는 물, 혈액, 림프액 등일 수 있으며, 상기 혈액 등과 같은 기체가 아닌 유체는 in vitro 상에서 배양액을 포함하는 유체 또는 물로 대체될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 복수의 확산 챔버; 및 상기 복수의 확산 챔버 사이에 배치되는 하나 이상의 채널;을 포함하고, 상기 확산 챔버 및 채널의 표면은 다공성이고, 상기 채널 내부에서의 유체의 흐름을 차단 또는 생성하여 상기 복수의 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 확산 챔버(210, 220, 300)는 확산 챔버에 탑재된 타겟(target) 요소가 다른 인접 확산 챔버로 확산되는 챔버일 수 있으며, 본 발명의 일 측면에 따른 생체 미세환경 모사 미세유체 장치는 복수의 확산 챔버를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 확산 챔버의 형태는 생체 시료를 탑재할 수 있는 구조의 3차원의 형태라면 제한되지 않으며, 구체적으로 판상형, 직육면체형, 반구형, 구형, 디스크형 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 확산 챔버의 재료는 경화(curing)가 가능한 폴리머(polymer, pre-polymer)라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 친수성 폴리머일 수 있으며, 구체적으로 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 폴리디메틸실록산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 확산 챔버의 표면은 다공성일 수 있다. 상기 확산 챔버의 기공율은 확산 챔버의 총 부피에 대하여 10 내지 95 부피%일 수 있고, 구체적으로 상기 확산 챔버의 기공율은 확산 챔버의 총 부피에 대하여 10 부피% 이상, 15 부피% 이상, 20 부피% 이상, 25 부피% 이상, 30 부피% 이상, 35 부피% 이상, 40 부피% 이상, 45 부피% 이상, 50 부피% 이상, 55 부피% 이상, 60 부피% 이상, 65 부피% 이상, 70 부피% 이상, 75 부피% 이상, 80 부피% 이상, 85 부피% 이상 또는 90 부피% 이상일 수 있고, 95 부피% 이하, 90 부피% 이하, 85 부피% 이하, 80 부피% 이하, 75 부피% 이하, 70 부피% 이하, 65 부피% 이하, 60 부피% 이하, 55 부피% 이하, 50 부피% 이하, 45 부피% 이하, 40 부피% 이하, 35 부피% 이하, 30 부피% 이하, 25 부피% 이하, 20 부피% 이하 또는 15 부피% 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 13.4 내지 27.0 부피%일 수 있으나, 기공율은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 유체의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 확산 챔버의 표면의 공극의 크기는 5 μm 내지 50 μm 일 수 있으며, 구체적으로 상기 확산 챔버의 표면의 공극의 크기는 5 μm 이상, 10 μm 이상, 15 μm 이상, 20 μm 이상, 25 μm 이상, 30 μm 이상, 35 μm 이상, 40 μm 이상 또는 45 μm 이상일 수 있고, 50 μm 이하, 45 μm 이하, 40 μm 이하, 35 μm 이하, 30 μm 이하, 25 μm 이하, 20 μm 이하, 15 μm 이하 또는 10 μm 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 9 내지 42 μm 일 수 있으나, 공극 크기는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 유체의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 복수의 확산 챔버들의 기공률 및 공극 크기는 서로 동일하거나 서로 다를 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 채널(410, 420)은 내부에 유체가 흐르도록 구성된 채널일 수 있으며, 본 발명의 일 측면에 따른 생체 미세환경 모사 미세유체 장치는 하나 이상의 채널을 포함할 수 있다. 상기 유체는 개체 내부에서 관류하는 미세한 유체로서, 구체적으로 인간의 조직에서 관류하는 유체일 수 있고, 보다 구체적으로 인간의 종양에서 관류하는 기체 또는 체액일 수 있고, 보다 더 구체적으로 인간의 종양 또는 종양 근처의 혈관에서 관류하는 물, 혈액, 림프액 등일 수 있으며, 상기 혈액 등과 같은 기체가 아닌 유체는 in vitro 상에서 배양액을 포함하는 유체 또는 물로 대체될 수 있으나, 상기 유체의 종류는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 미세환경 모사의 목적, 비용 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 복수의 확산 챔버는 생체 시료가 탑재될 수 있고, 상기 복수의 확산 챔버 각각에 포함된 생체 시료는 상기 타겟 요소의 농도가 서로 다른 것일 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 생체 시료는 개체로부터 분리된 체액, 배양액, 성장 인자 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 배양액은 구체적으로 세포 배양액일 수 있으나, 상기 생체 시료의 종류는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 유체의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 채널은 확산 챔버들 사이에 배치될 수 있고, 예를 들어 하나의 채널은 2 개의 확산 챔버들 사이에 배치될 수 있으며, 구체적으로 챔버-채널-챔버의 순서로 배치될 수 있고, 이의 배치 위치는 상하 방향, 좌우 방향, 대각선 방향, 중앙에서 가장자리 방향, 가장자리에서 중앙 방향 등일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 채널의 형태는 내부에 유체가 흐를 수 있는 구조의 3차원의 형태라면 제한되지 않으며, 구체적으로 원통형, 다각기둥형 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 채널의 재료는 경화(curing)가 가능한 폴리머(polymer, pre-polymer)라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 친수성 폴리머일 수 있으며, 구체적으로 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 폴리디메틸실록산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 채널의 표면은 다공성일 수 있다. 상기 채널의 기공율은 채널의 총 부피에 대하여 10 내지 95 부피%일 수 있고, 구체적으로 상기 채널의 기공율은 채널의 총 부피에 대하여 10 부피% 이상, 15 부피% 이상, 20 부피% 이상, 25 부피% 이상, 30 부피% 이상, 35 부피% 이상, 40 부피% 이상, 45 부피% 이상, 50 부피% 이상, 55 부피% 이상, 60 부피% 이상, 65 부피% 이상, 70 부피% 이상, 75 부피% 이상, 80 부피% 이상, 85 부피% 이상 또는 90 부피% 이상일 수 있고, 95 부피% 이하, 90 부피% 이하, 85 부피% 이하, 80 부피% 이하, 75 부피% 이하, 70 부피% 이하, 65 부피% 이하, 60 부피% 이하, 55 부피% 이하, 50 부피% 이하, 45 부피% 이하, 40 부피% 이하, 35 부피% 이하, 30 부피% 이하, 25 부피% 이하, 20 부피% 이하 또는 15 부피% 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 13.4 내지 27.0 부피%일 수 있으나, 기공율은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 유체의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 채널의 표면의 공극의 크기는 5 μm 내지 50 μm 일 수 있으며, 구체적으로 상기 채널의 표면의 공극의 크기는 5 μm 이상, 10 μm 이상, 15 μm 이상, 20 μm 이상, 25 μm 이상, 30 μm 이상, 35 μm 이상, 40 μm 이상 또는 45 μm 이상일 수 있고, 50 μm 이하, 45 μm 이하, 40 μm 이하, 35 μm 이하, 30 μm 이하, 25 μm 이하, 20 μm 이하, 15 μm 이하 또는 10 μm 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 9 내지 42 μm 일 수 있으나, 공극 크기는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 유체의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 하나 이상의 채널들의 기공률 및 공극 크기는 서로 동일하거나 서로 다를 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 미세유체 장치는 상기 채널 내부에서의 유체의 흐름을 차단 또는 생성하여 상기 복수의 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 타겟 요소는 상기 확산 챔버 내부에 탑재된 타겟 요소 또는 상기 확산 챔버 내부에 탑재된 생체 시료에 포함된 타겟 요소일 수 있으며, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 미세환경에 존재하는 세포 또는 분자로, 생체 내 미세환경의 변화에 영향을 끼치는 세포 또는 분자일 수 있으며 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치 작동 시 제어의 목적이 되는 것일 수 있다. 상기 타겟 요소는, 구체적으로 세포 또는 분자일 수 있으며, 보다 구체적으로 세포, 성장 인자, 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine), 저산소 유도 인자(hypoxia-inducible factors) 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 세포는 암세포, 면역세포, 섬유아세포, 내피세포 및 상피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 타겟 요소의 확산 제어는, 상기 채널 내부에서 유체의 흐름이 생성되면 상기 복수의 확산 챔버 간 상기 타겟 요소의 확산이 차단되고, 상기 채널 내부에서 유체의 흐름이 차단되면 상기 복수의 확산 챔버 간 상기 타겟 요소의 확산이 일어나는 것일 수 있다. 또한, 상기 타겟 요소의 확산은 상기 확산 챔버 및 상기 채널 표면의 공극을 통해 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 채널 내부에 유체의 흐름이 생성되면 유체의 흐름이 생성된 채널에 인접한 확산 챔버들 간 확산이 일어나지 않고 차단될 수 있고, 본 발명의 일 측면에 따른 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 채널 내부에 유체의 흐름이 차단되면 유체의 흐름이 차단된 채널에 인접한 확산 챔버 중 상기 타겟 요소가 고농도로 존재하는 확산 챔버에서 상기 타겟 요소가 저농도로 존재하는 확산 챔버로 상기 타겟 요소가 확산되어 이동할 수 있다. 보다 구체적으로, 제 1 확산 챔버와 제 2 확산 챔버 사이에 배치된 제 1 채널에 유체의 흐름이 생성되면 제 1 확산 챔버와 제 2 확산 챔버 간 상호작용이 차단되고 나아가 제 1 확산 챔버 또는 제 2 확산 챔버에 존재하는 타겟 요소의 이동 없이 제 1 확산 챔버와 제 2 확산 챔버 간 확산이 차단될 수 있다. 또한, 보다 구체적으로, 제 1 확산 챔버와 제 2 확산 챔버 사이에 배치된 제 1 채널에 유체의 흐름이 차단되면 제 1 확산 챔버와 제 2 확산 챔버 간 상호작용이 일어나고 나아가, 만일 제 1 확산 챔버에 타겟 요소가 고농도로, 제 2 확산 챔버에 타겟 요소가 저농도로 존재하는 경우 상기 타겟 요소가 제 1 채널, 구체적으로 제 1 채널 표면의 공극을 통해 제 2 확산 챔버로 이동 또는 확산될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 복수의 확산 챔버(210, 220, 300) 및 상기 하나 이상의 채널(410, 420)의 표면은 다공성 벽(811, 812, 821, 822)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치는 확산 제어부를 추가로 포함할 수 있고, 상기 확산 제어부는 상기 하나 이상의 채널 각각의 내부로 유체를 유입하는 하나 이상의 유입구(510, 520); 및 상기 유입된 유체가 배출되는 하나 이상의 유출구(610, 620);를 포함할 수 있다. 상기 유입구 및 유출구는 하나의 채널의 양 말단에 각각 존재할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치는 다공성 기판을 포함할 수 있다. 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치는 다공성 기판 상에 상기 복수의 확산 챔버 및 상기 하나 이상의 채널이 존재할 수 있다. 상기 다공성 기판의 기공율은 기판의 총 부피에 대하여 10 내지 95 부피%일 수 있고, 구체적으로 상기 다공성 기판의 기공율은 기판의 총 부피에 대하여 10 부피% 이상, 15 부피% 이상, 20 부피% 이상, 25 부피% 이상, 30 부피% 이상, 35 부피% 이상, 40 부피% 이상, 45 부피% 이상, 50 부피% 이상, 55 부피% 이상, 60 부피% 이상, 65 부피% 이상, 70 부피% 이상, 75 부피% 이상, 80 부피% 이상, 85 부피% 이상 또는 90 부피% 이상일 수 있고, 95 부피% 이하, 90 부피% 이하, 85 부피% 이하, 80 부피% 이하, 75 부피% 이하, 70 부피% 이하, 65 부피% 이하, 60 부피% 이하, 55 부피% 이하, 50 부피% 이하, 45 부피% 이하, 40 부피% 이하, 35 부피% 이하, 30 부피% 이하, 25 부피% 이하, 20 부피% 이하 또는 15 부피% 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 13.4 내지 27.0 부피%일 수 있으나, 기공율은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 유체의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 다공성 기판의 표면의 공극의 크기는 5 μm 내지 50 μm일 수 있으며, 구체적으로 상기 다공성 기판의 표면의 공극의 크기는 5 μm 이상, 10 μm 이상, 15 μm 이상, 20 μm 이상, 25 μm 이상, 30 μm 이상, 35 μm 이상, 40 μm 이상 또는 45 μm 이상일 수 있고, 50 μm 이하, 45 μm 이하, 40 μm 이하, 35 μm 이하, 30 μm 이하, 25 μm 이하, 20 μm 이하, 15 μm 이하 또는 10 μm 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 9 내지 42 μm 일 수 있으나, 공극 크기는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 유체의 종류, 미세환경 모사의 목적 등에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 다공성 기판의 기공률 또는 공극의 크기는 상기 다공성 기판 상에 존재하는 복수의 확산 채널의 기공률 또는 공극의 크기, 또는 하나 이상의 채널의 기공률 또는 공극의 크기와 동일하거나 서로 다를 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치는 상기 복수의 확산 챔버 중 하나 이상은 내부에 지지 부재(700)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 확산 챔버는 내부에 지지 부재를 포함하는 경우, 챔버의 일부에 생성된 버블을 제거할 수 있으며, 이로써 확산 챔버에 탑재된 생체 시료에 포함된 타겟 물질들의 이동 또는 확산이 원활해질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 장치 형성 용액을 제조하는 단계; 폴리머(polymer)를 포함하는 스캐폴드 용액을 평면 상에 코팅하여 기판을 형성하고 상기 기판 내 공동을 형성하는 단계; 및 상기 장치 형성 용액을 상기 기판 내 형성된 공동에 넣고, 이를 경화시켜 미세유체 장치를 형성하는 단계;를 포함하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 제조방법을 제공한다. 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치, 채널 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치 제조방법은 프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 장치 형성 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 "프레폴리머(pre-polymer)"란 폴리머의 성형 가공을 용이하게 하기 위해 중합 또는 중축합 반응을 적당한 단계에서 정지한 예비 중합물을 의미하는 것으로, 본 발명의 일 측면에 따르면 경화되기 이전의 성형 가공이 용이한 상태의 폴리머일 수 있으며, 친수성 폴리머일 수 있다. 상기 프레폴리머 용액은 공극유도중합체(porogen)이 포함된 것일 수 있으며, 상기 제조방법은 프레폴리머 용액에 포함된 공극유도중합체의 크기를 변형시킴으로써 다공성 구조체 내에 형성되는 공극의 크기를 조절하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 공극유도중합체는 폴리에틸렌글리콜(Polyehtylene glycol; PEG) 또는 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide; PAM) 등일 수 있으며, 상기 폴리에틸렌글리콜로는 구체적으로 PEG200, PEG300, PEG400, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3000, PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000, PEG10000, PEG12000, PEG20000, PEG 35000, PEG40000 등(제조사: Sigma Aldrich)일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치 제조방법은 폴리머(polymer)를 포함하는 스캐폴드 용액을 평면 상에 코팅하여 기판을 형성하고 상기 기판 내 공동을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 스캐폴드 용액은 경화(curing)가 가능한 폴리머(polymer, pre-polymer)를 포함하는 용액이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 폴리머는 친수성 폴리머일 수 있으며, 구체적으로 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 폴리디메틸실록산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 평면은 구체적으로 유리 슬라이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 기판 형성은 상기 스캐폴드 용액과 경화제의 혼합물을 평면 상에 코팅한 후 가열하는 것일 수 있고, 스캐폴드 용액과 경화제의 혼합 비율, 코팅 방법 및 조건, 가열 온도 및 시간은 미세유체 장치가 모사하고자 하는 생체 내 미세환경의 종류, 타겟 요소의 종류, 미세환경 모사의 목적, 비용 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 기판 내 공동 형성은 상기 형성된 기판의 일부를 잘라내어 기판 내에 공동, 즉 비어있는 공간을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치 제조방법은 상기 장치 형성 용액을 상기 기판 내 형성된 공동에 넣고, 이를 경화시켜 미세유체 장치를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 미세유체 장치 형성 단계는, 구체적으로 상기 장치 형성 용액을 상기 기판 내 형성된 공동에 넣고, 이를 경화시키고 복수의 확산 챔버 및 하나 이상의 채널을 에칭하여 미세유체 장치를 형성하는 단계를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 장치 형성 용액을 상기 기판 내 형성된 공동에 넣고, 이를 경화시키고 복수의 확산 챔버 및 하나 이상의 채널을 에칭한 후 폴리머 층을 덮고 체결하여 미세유체 장치를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 에칭되는 형태는 제조하고자 하는 미세유체 장치의 확산 챔버의 수 및 형태를 고려하여 정해질 수 있으며, 그 형태는 제한되지 않는다. 또한, 상기 경화는 구체적으로 광학적, 화학적 또는 열적 경화방법 등일 수 있으나, 그 방법은 제한되지 않으며, 자외선에 의한 경화를 예로 들 수 있다. 또한, 상기 제조방법은 경화 후 세척하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 세척 단계를 통하여 반응하지 않은 공극유도중합체 등을 제거할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 실시간 미세환경 제어 방법을 제공한다. 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치, 채널, 유체의 흐름의 차단 또는 생성 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 유체 흐름 차단은 상기 채널의 내부에 존재하는 유체를 모두 배출하여 채널의 내부에 유체가 존재하지 않게 하거나 확산 챔버간 타겟 요소의 확산을 일으키게 할 정도의 미량의 유체가 존재하게 하는 것이고, 상기 유체 흐름 생성은 상기 채널의 내부에 유체를 주입하여 채널의 내부에 유체가 존재하도록 하는 것일 수 있다. 또한, 상기 유체 흐름 차단 또는 생성으로 상기 복수의 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 복수의 확산 챔버 중 하나 이상의 확산 챔버에 생체 시료를 탑재하는 단계; 및 상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 미세유체 장치를 이용한 세포 반응 측정 및 관찰 방법을 제공한다. 상기 생체 미세환경 모사 미세유체 장치, 확산 챔버, 생체 시료, 채널, 유체의 흐름 차단 또는 생성 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 세포 반응은 예를 들어 세포의 이동, 세포의 형태 변화, 세포의 이동 속도 변화, 세포의 증식량 변화, 세포의 분열 양상 변화, 세포의 다른 조직으로의 침투, 세포의 괴사 등을 포함할 수 있고, 상기 세포는 박테리아 등도 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 미세유체 장치의 설계
본 발명의 일 측면에 따른 생체 미세환경을 모사하는 미세유체 장치를 제조하기 위해 미세유체 장치를 설계하였으며, 도 1, 도 2a 및 2b는 본 발명의 일 측면에 따라 설계된 미세유체 장치의 일 예시를 간략하게 도시한 것이다.
구체적으로, 도 1, 도 2a 및 2b의 검은 선과 하얀색 면으로 표시된 부분은 다공성 하이드로겔을, 도트(dot)로 표시된 부분은 채널 및 확산 챔버를 나타낸다. 도 1의 미세유체 장치(100)에는 확산 챔버로 제 1 측면 확산 챔버(210) 및 제 2 측면 확산 챔버(220)와 1 개의 중앙 확산 챔버(300)가 있으며, 이는 세포 증식 또는 성장 인자 공급원으로서 역할을 한다. 이 때 채널은 하이드로겔을 통한 확산 제어를 위해 측면 챔버와 중앙 챔버 사이에 추가되며, 구체적으로 제 1 측면 확산 챔버(210)와 중앙 확산 챔버(300) 사이의 제 1 채널(410), 및 중앙 확산 챔버(300)와 제 2 측면 확산 챔버(220) 사이의 제 2 채널(420)이 추가된다. 만일 채널에 유체가 유입되면, 채널 내부에 이미 존재하던 채널 내부로 확산된 화학물질은 유체 흐름에 따라 채널 내부에서 제거되고 확산 챔버들 간의 화학물질의 확산 차단을 초래한다. 또한, 채널에서의 유체 흐름이 차단되면 확산 챔버들 간 화학물질의 확산이 일어난다. 이러한 확산 챔버들간 타겟 요소(화학물질)의 확산을 on/off하는 스위치로서 작동하는 채널(확산 스위치 채널)을 포함하는 미세유체 장치를 COMSOL 시뮬레이션으로 시험하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.
도 3에 나타난 바와 같이, 채널에 유체의 흐름을 차단하여 확산 스위치를 켜면(on) 확산 챔버들 간 타겟 요소의 확산이 일어나고, 채널에 유체의 흐름을 생성하여 확산 스위치를 끄면(off), 확산 챔버들 간의 상호작용이 차단될 뿐만 아니라 확산 챔버로부터 채널 내부로 확산된 타겟 요소가 제거되며, 다시 확산 스위치가 켜질 때까지(on) 이전 상태로 장치를 되돌린다. 이를 통해, 단순히 채널에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 간단한 방법으로 확산 챔버들 간 타겟 요소의 확산을 제어할 수 있음을 확인하였다.
다만, 중앙 확산 챔버(300)의 볼록한 형태로 인하여 경계 층 분리가 발생하여 유체 흐름에 의한 버블이 쉽게 형성될 수 있어, 버블 형성 시 유체의 흐름이 생성되면 버블이 확산 챔버 내에서 계속 움직이게 되고 이로 인해 안정된 생체 미세환경을 구현하는 데 어려움이 있다. 또한, 유체의 흐름이 생성되면 유압으로 인해 형성된 버블의 크기가 작을 수 있으니 이후 유체의 흐름을 차단하면 유압이 감소하여 버블의 크기가 증가할 수 있다. 이런 과정을 통해 확산 챔버 내부가 버블로 차게 되면 인접 확산 챔버로 타겟 요소가 고르게 확산되지 않아 생체 미세환경을 모사하기 어렵다. 따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치 제조 시, 중앙 확산 챔버(300) 내부에 지지 컬럼(support column)인 지지 부재(700)를 놓아 유체를 유입하는 동안 버블의 형성을 방지하였다.
[실시예 2] 미세유체 장치의 제조
상기 실시예 1의 미세유체 장치의 설계 및 시뮬레이션 시험 결과를 기초로 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치를 제조하였으며, 도 4 및 5는 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치의 구성 및 제조 과정을 도시한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 다공성 미세유체 장치로, 프레폴리머 용액(pre-polymer solution)으로, 광개시제 Irgacure 2959 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 0.5% (w/v) 농도로 혼합한 폴리에틸렌 글리콜-디아크릴레이트(polyethylene glycol-diacrylate) 용액 (PEG-DA, Sigma-Aldrich, MW은 700 Da, PBS에서 10% (v/v))을 이용하여 제조하였다. 유리 슬라이드 상에 PEG-DA 채널을 만들기 위해, 200 μm 높이의 폴리디메틸실록산 (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, USA) 스캐폴드를 유리 슬라이드 상에서 미리 중합시켰다. 상기 중합 과정은 구체적으로, PDMS를 10 : 1 (w/w) 비율로 경화제(SYLGARD 184 silicone elastomer curing agent, dow corning)와 혼합하고, 유리 슬라이드에서 15초 동안 500 rpm으로 스핀-코팅한 다음, 90℃ 핫 플레이트에서 30 분 동안 가열하여 200 μm 높이의 PDMS 층을 제조하였다. 그런 다음, 상기 코팅된 유리 슬라이드 가운데에 23 mm X 23 mm 크기의 정사각형 모양으로 칼집을 내어 PDMS 층을 벗겨 PDMS 스캐폴드 가운데에 정사각형 모양의 공간을 만들었다. 그 후, 상기 PDMS 층의 비어있는 가운데 공간에 상기 제조한 프레폴리머 용액을 붓고, 광마스크 ((Microtech, 40000 dpi, Korea) 및 UV 경화 시스템 (365 nm, 18 W/cm2, Omnicure S1500, Vanier, Quebec)을 사용하여 57.5초 동안 확산 챔버 및 채널 패턴을 하이드로겔(PEG-DA) 기판에 에칭하였다. 유리 슬라이드를 PDMS 층으로 덮고 아크릴판, 볼트 및 너트로 조여, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치를 제조하였다.
[실험예 1] 확산 스위치 (diffusion switching) 메커니즘의 확인
상기 실시예 2에서 제조된 미세유체 장치에서의 채널 내부의 유체 흐름 차단 또는 생성에 따른 확산 챔버 간 타겟 요소 확산이 일어나는 확산 스위치 메커니즘을 확인하기 위해, 두 종의 형광 염료를 확산 챔버 각각에 탑재하여 확산 제어 실험을 수행하였다.
구체적으로, 초록색을 발광하는 플로오레세인 5(6)-이소티오시아네이트 (FITC, Sigma-Aldrich, 0.1 mg/ml) 용액 및 붉은색을 발광하는 시아닌 5 (Cy5, Thermo Fisher Scientific, 0.01 mg/ml) 용액을 상기 미세유체 장치의 확산 챔버 중 제 1 측면 확산 챔버(210) 및 제 2 측면 확산 챔버(220) 각각에 넣었다. 그런 다음, 두 형광 염료의 확산을 6.5 시간 동안 형관 현미경 (Zeiss Axio Observer)을 사용하여 관찰하였고, 이로부터 수득한 현미경 사진 이미지를 통해 정량화하였으며, 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다. 도 7 및 8은, 확산 형광 염료(초록색의 FITC 및 붉은색의 Cy5)를 이미지화하여 시간에 걸쳐 측면 챔버에서 중앙 챔버까지의 지속 시간 및 공간 농도 변화를 분석한 결과를 나타내며, 구체적으로, 도 7은 시간에 따른 형광 이미지를, 도 8은 도 7의 지점 A (Point A) 및 지점 B (Point B) 각각의 형광 강도 그래프를 나타낸다. 이 때, 특정 농도 하에서 채널 내부에 유체 흐름을 생성 또는 차단하였다.
도 7 및 8에 나타난 바와 같이, 확산 챔버에 탑재된 형광 염료는 채널 내 유체 흐름이 차단된 상태에서는 상기 채널을 관통하여 다른 확산 챔버로 확산 또는 이동하는 반면, 채널 내 유체 흐름이 생성되면 형광 염료의 확산 또는 이동이 일어나지 않고 차단된다. 구체적으로, 0 분에 제 2 채널(Channel 2)(420)의 유체 흐름이 차단되어 Cy5(붉은색)의 확산 스위치가 켜지면(On) 지점 B의 Cy5의 형광 강도는 포화 상태에 도달할 때까지 증가하다가, 120 분에 제 2 채널(420)의 유체 흐름이 생성되어 Cy5의 확산 스위치가 꺼질 때까지 형광 강도가 유지되었다. 제 2 채널(420)에 유체 흐름이 생성되어 확산 스위치가 꺼지면, 지점 B의 초기 값으로 떨어졌다. 또한, 150 분에 제 1 채널(Channel 1)(410)의 유체 흐름이 차단되어 FITC(초록색)의 확산 스위치가 켜지면 상기 Cy5와 마찬가지의 확산 패턴을 보이나, 다만 타겟 요소인 Cy5와 FITC는 확산과 관련된 파라미터가 동일하지 않아, FITC는 Cy5보다 더 느린 속도로 확산하지만, 확산 패턴, 즉 채널의 유체 흐름 차단 또는 생성에 따른 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산 패턴은 Cy5와 동일하다. 또한, 상기 실시예 1의 COMSOL 시뮬레이션 (도 3)에서 이미 확인한 바와 같이, 채널은 채널 내 유체 흐름 생성 상태(확산 스위치 꺼짐(off))에서 중앙 확산 챔버로 확산된 타겟 요소인 분자를 흡수(중앙 확산 챔버에서 채널로 타겟 요소가 확산됨)하고 장치는 초기 상태로 되돌아갔다.
이를 통하여, 채널 내부의 유체 흐름 차단 또는 생성이라는 간단한 방법으로확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 조절 내지 제어할 수 있어, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 미세환경을 시간적으로 제어 가능한바, 시간에 따라 끊임없이 변화하는 생체 미세환경을 모사할 수 있는 미세유체 장치임을 확인하였다.
[실험예 2] 확산 스위치 메커니즘을 이용한 성장 인자 확산 및 이로 인한 세포 증식의 시간적 제어 확인
상기 실시예 2에서 제조된 미세유체 장치에서 세포를 배양하여 생체 내 미세환경을 시간적으로 제어할 수 있는지 확인하였다.
생체 내 미세환경 중 하나인 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)을 구현하기 위해 혈관신생에 관여하는 세포, 성장 인자 등을 사용하였다. 종양 미세환경에서는 종양, 대식세포, 및 섬유아세포의 공존에 의해 혈관신생 반응이 제어, 즉 스위치가 on/off되며, 혈관신생은 세포 증식률이 증가하고 성장 인자가 이동하는 특징이 있다(D. Ribatti, B. Nico, E. Crivellato, A. M. Roccaro, and A. Vacca, "The history of the angiogenic switch concept," Leukemia, vol. 21, no. 1, pp. 44-52, 2007.).
이를 위해, 하기와 같은 3 종의 세포 라인을 사용하였으며, 각각은 하기와 같은 배지에서 37 ℃, 5 % CO2 조건 하에서 배양하였다:
- 인간 간세포 암종 세포 (human hepatocellular carcinoma cells) (HepG2, Korean Cell Line Bank KCLB No. 88065)를 10 % (v/v) 소태아혈청 (FBS, Gibco)을 포함하는 eagle 최소 필수 배지 (Eagle's minimum essential medium) (EMEM, Welgene)에서 배양
- 마우스 대식세포 (mouse macrophage cells) (RAW 264.7, Korean Cell Line Bank KCLB No. 40071)를 10 % (v/v) FBS 를 포함하는 Dulbecco 변형 eagle 배지 (dulbecco's modified eagle's medium) (DMEM, Gibco)에서 배양
- 인간 제대 정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cells) (HUVEC, ATCC CRL-1730)를 5 % (v/v) FBS, 1 % (v/v) 내피세포 성장 보충제 (ECGS), 및 1 % (v/v) 항생제 용액을 포함하는 내피세포 배지 (endothelial cell medium)(ECM, ScienCell)에서 배양
그런 다음, 상기 실시예 2의 미세유체 장치의 제 1 및 2 측면 확산 챔버(210, 220)를 피브로넥틴 (Corning 356008)을 5 μg/cm2 농도로 45분 동안 코딩하고, 이에 상기 배양된 내피세포(HUVEC)를 넣고 37 ℃, 5% CO2를 유지하였다. 또한, 종양 및 종양 관련 세포 환경을 모사하기 위해, 48 시간 동안 배양된 인간 간세포 암종 세포(HepG2) 및 마우스 대식세포(RAW 264.7)가 배양된 배양액을 20 ng/ml VEGF와 1 : 1로 혼합하였다. 그 후, 상기 실시예 2의 미세유체 장치의 중앙 확산 챔버(300)에 혈관신생 스위치 on 유도 배지로서 상기 혼합 배양액을 넣고 도 9에 간략하게 도시한 바와 같이 중앙 확산 챔버(300) 양 측에 배치된 채널 중 오직 하나에만(제 2 채널(420)) 유체를 유입하여 유체 흐름을 생성하고(확산 스위치 꺼짐(off) 상태), 다른 채널은(제 1 채널(410))은 유체 흐름을 차단한 후(확산 스위치 켜짐(on) 상태) 제 1 및 2 측면 확산 챔버(210, 220) 각각에 탑재된 내피세포(HUVEC)의 증식을 측정하였다. 이 때, 측면 확산 챔버에 시딩된 내피세포(HUVEC)는 ECM 배지에서 배양하였다.
내피세포의 증식을 측정하는 방법은 아래와 같다. 제 1 및 2 측면 확산 챔버(210, 220)에서 세포의 증식을 관찰하고자 하는 영역 3곳을 지정하고 각각 제 1 또는 제 2 채널에서 유체의 흐름을 생성(확산 스위치 꺼짐(off))하기 직전, 생성 후 6시간 그리고 12시간이 지났을 때를 위상차 현미경(Zeiss, Axio Observer 7)을 이용하여 촬영하여 도 10a와 같은 결과를 얻었다. 사진 속 세포의 개수를 세기 위하여 NIH에서 개발한 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ 프로그램을 사용하였다. 세포 이미지를 이진 영상(binary image)으로 전환하여 배경과 세포를 구분하였고 세포가 밀집되어 있는 영역은 워터쉐드(watershed) 기능을 이용하여 세포 경계를 따라 영역을 구분하였다. 노이즈 픽셀(Noise pixel)을 제외하기 위해 면적이 50 pixel^2 이상인 영역만 세포로 카운트하였으며 그 결과는 도 10b에 나타내었다.
도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, 유체 흐름이 생성된(확산 스위치 꺼짐, Diffusion Off) 제 2 채널(420) 쪽의 제 2 측면 확산 챔버(220)에서는 시간에 따른 내피세포 증식 정도가 크지 않은 반면, 유체 흐름이 차단된(확산 스위치 켜짐, Diffusion On) 제 1 채널(410) 쪽의 제 1 측면 확산 챔버(210)에서는 시간에 따라 내피세포가 큰 속도로 증가하였다. 이는 본 실험예에서 구현하고자 한 혈관신생 반응의 제어(스위치 작동)이 내피세포(HUVEC)의 행동, 증식 및 이동에 의해 결정될 수 있음을 반영한다(D. Ribatti, B. Nico, E. Crivellato, A. M. Roccaro, and A. Vacca, "The history of the angiogenic switch concept," Leukemia, vol. 21, no. 1, pp. 44-52, 2007.). 즉, 유체 흐름이 차단되어 확산 스위치가 켜지면 중앙 확산 챔버(300)에 존재하는 전혈관신생 인자 (proangiogenic factor)인 VEGF가 측면 확산 챔버로 확산되어 측면 확산 챔버에 존재하는 내피세포(HUVEC)의 성장을 자극한 것임을 알 수 있었다. 제 2 채널(420) 쪽의 제 2 측면 확산 챔버(220)의 내피세포의 세포의 증식율(유체 유입 전(0 h)의 세포 수에 대한 유입 후 세포 수의 비율)은 유체 유입 12 시간 후 2.07인 반면, 같은 시간에 제 1 채널(410) 쪽의 제 1 측면 확산 챔버(210)의 내피세포의 세포의 증식율은 1.39로, 1.50 배의 차이를 보였다.
이를 통해, 유체 흐름 생성 또는 차단으로 중앙 확산 챔버에서 측면 확산 챔버로의 VEGF 확산을 제어할 수 있으며, 이로써 세포 증식도 제어 가능함을 확인하였다. 더 나아가, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 채널의 유체 흐름을 단순히 기계적으로 생성 또는 차단함으로써 혈관신생 반응을 on/off할 수 있어, 종양 미세환경과 같은 생체 내 미세환경을 시간적으로 제어하여, 시간에 따라 끊임없이 변화하는 생체 미세환경을 모사할 수 있음을 확인하였다.
[실험예 3] 확산 스위치 메커니즘을 이용한 세포 이동의 시간적 제어 확인
상기 실시예 2에서 제조된 미세유체 장치에서 세포를 배양하여 생체 내 미세환경을 시간적으로 제어할 수 있는지를 세포 이동 정도를 비교하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 측면 확산챔버(210, 220)에 시딩된 내피세포(HUVEC)의 최대 세포 이동을 촉진하기 위해, 내피세포를 영양 결핍 환경에 처하도록 PBS에 현탁시켰으며, 세포 이동 지수(cell migration index, CMI)를 통해 세포 이동 정도를 비교하였으며, 그 결과는 도 11a 및 11b에 나타내었다. 세포 이동 지수는 한 쪽이 다른 한 쪽보다 우호적인 조건 하에서 세포 이동 방향을 나타내는 화학주성 분할 계수 (chemotaxis partition coefficient, CPC)을 하기 식 1과 같이 수정하여 계산한 값으로, 비우호적 영역(unfavorable side)과 우호적 영역(favorable side)에 각각 위치한 내피세포의 수의 비율을 의미한다.
[식 1]
Figure pat00001
본 이동 실험에서, 내피세포(HUVEC)는 중앙 확산 챔버(300)로부터 영양분을 얻기 위해 VEGF가 존재하는 영역으로 이동하는 경향이 있으며, 이런 경우 보다 큰 CMI값을 가지게 된다.
도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이, 유체 흐름이 생성된(확산 스위치 꺼짐, VEGF diffusion off) 제 2 채널(420)의 경우, VEGF가 고농도로 존재하는 중앙 확산 챔버(300)와 VEGF가 저농도로 존재하는 제 2 측면 확산 챔버(220) 사이에 상호작용이 일어나지 않아, 제 2 채널(420) 쪽의 제 2 측면 확산 챔버(220)에 탑재된 내피세포는 일정한 경향성 없이 이동하여 유의한 이동 패턴이 관찰되지 않았으며(도 11a), 그 결과 시간이 경과하여도 CMI 값은 약 0으로 유지되었다(도 11b). 반면, 유체 흐름이 차단된(확산 스위치 켜짐, VEGF diffusion off) 제 1 채널(410)의 경우, VEGF가 고농도로 존재하는 중앙 확산 챔버(300)에서 VEGF가 저농도로 존재하는 제 1 측면 확산 챔버(210) 쪽으로 VEGF의 확산이 일어나고, 그로 인해 제 1 채널(410) 쪽의 제 1 측면 확산 챔버(410) 내에서 중앙 확산 챔버(300)에 가까운 영역은 내피세포에게 우호적인 영역, 중앙 확산 챔버(300)에서 먼 영역은 비우호적인 영역이 된다. 이로 인해, 제 1 채널(410) 쪽의 제 1 측면 확산 챔버(210) 내에 탑재된 내피세포는 비우호적인 영역에서 우호적인 영역으로 이동하는 경향성을 가지게 되어(도 11a), 그 결과 CMI는 유체 흐름 생성 1 시간만에 0.010에서 0.366 로 증가하는 등 (즉, 전체 내피세포 집단의 68%가 우호적인 영역으로 이동하였다), 유체 흐름 차단이 지속되는 동안(확산 스위치 켜짐) CMI 값은 양의 값을 유지하고 점점 더 증가하는 것을 확인하였다(도 11b).
이를 통해, 유체 흐름 생성 또는 차단으로 중앙 확산 챔버(300)에서 제 1 및2 측면 확산 챔버(210, 220)로의 타겟 요소 확산 제어를 통해 세포의 이동도 제어 가능함을 확인하였으며, 이로써 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 채널의 유체 흐름을 단순히 생성 또는 차단하는 일시적 조작으로 종양 미세환경과 같은 시간에 따라 끊임없이 변화하는 생체 미세환경을 구현할 수 있음을 알 수 있었다.
종합적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 단순히 채널의 유체 흐름을 기계적으로 생성 또는 차단하는 일시적 조작으로 시간에 따라 끊임없이 변화하는 생체 미세환경을 모사할 수 있으며, 간단한 방법으로 확산을 제어할 수 있어, 확산 챔버와 채널의 수, 및 이들의 배열을 다양하게 설계할 수 있어 보다 복잡한 미세환경도 재현할 수 있다. 이로써, 본 발명의 일 측면에 따른 미세유체 장치는 의학 및 생물학 분야에서 다양한 생체평가를 수행하기 위한 강력한 수단으로 활용될 수 있다.
100: 미세유체 장치
210: 제 1 측면 확산 챔버, 220: 제 2 측면 확산 챔버
300: 중앙 확산 챔버
410: 제 1 채널, 420: 제 2 채널
510: 제 1 유입구, 520: 제 2 유입구
610: 제 1 유출구, 620: 제 2 유출구
700: 지지 부재
811: 제 1 다공성 벽, 812: 제 2 다공성 벽, 821: 제 3 다공성 벽, 822: 제 4 다공성 벽

Claims (17)

  1. 복수의 확산 챔버; 및
    상기 복수의 확산 챔버 사이에 배치되는 하나 이상의 채널;을 포함하고,
    상기 확산 챔버 및 채널의 표면은 다공성이고,
    상기 채널 내부에서의 유체의 흐름을 차단 또는 생성하여 상기 복수의 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세유체 장치는 확산 제어부를 추가로 포함하고,
    상기 확산 제어부는 상기 하나 이상의 채널 각각의 내부로 유체를 유입하는 하나 이상의 유입구; 및 상기 유입된 유체가 배출되는 하나 이상의 유출구;를 포함하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 확산 챔버는 생체 시료가 탑재되고, 상기 복수의 확산 챔버 각각에 포함된 생체 시료는 상기 타겟 요소의 농도가 서로 다른 것인, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 생체 시료는 개체로부터 분리된 체액, 배양액, 성장 인자 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 타겟 요소는 세포, 성장 인자, 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine), 저산소 유도 인자(Hypoxia-inducible factors) 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포는 암세포, 면역세포, 섬유아세포, 내피세포 및 상피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 타겟 요소의 확산 제어는, 상기 채널 내부에서 유체의 흐름이 생성되면 상기 복수의 확산 챔버 간 상기 타겟 요소의 확산이 차단되고, 상기 채널 내부에서 유체의 흐름이 차단되면 상기 복수의 확산 챔버 간 상기 타겟 요소의 확산이 일어나는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 타겟 요소의 확산은 상기 확산 챔버 및 상기 채널 표면의 공극을 통해이루어지는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 확산 챔버 표면의 공극의 크기는 5 μm 내지 50 μm 인, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 채널 표면의 공극의 크기는 5 μm 내지 50 μm 인, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 미세유체 장치는 다공성 기판을 포함하고, 상기 다공성 기판 상에 상기 복수의 확산 챔버 및 상기 하나 이상의 채널이 존재하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 확산 챔버 중 하나 이상은 내부에 지지 부재를 포함하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 제조방법으로,
    프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 장치 형성 용액을 제조하는 단계;
    폴리머(polymer)를 포함하는 스캐폴드 용액을 평면 상에 토출하여 기판을 형성하고 상기 기판 내 공동을 형성하는 단계;
    및 상기 장치 형성 용액을 상기 기판 내 형성된 공동에 넣고 이를 경화시켜 미세유체 장치를 형성하는 단계;를 포함하는, 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 제조방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 실시간 미세환경 제어 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 유체 흐름 차단은 상기 채널의 내부에 존재하는 유체를 모두 배출하여 채널의 내부에 유체가 존재하지 않게 하거나 확산 챔버간 타겟 요소의 확산을 일으키게 할 정도의 미량의 유체가 존재하게 하는 것이고,
    상기 유체 흐름 생성은 상기 채널의 내부에 유체를 주입하여 채널의 내부에 유체가 존재하도록 하는 것인, 실시간 미세환경 제어 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 유체 흐름 차단 또는 생성으로 상기 복수의 확산 챔버 간 타겟 요소의 확산을 제어하는, 실시간 미세환경 제어 방법.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 생체 미세환경 모사 미세유체 장치의 상기 복수의 확산 챔버 중 하나 이상의 확산 챔버에 생체 시료를 탑재하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 채널 중에서 하나 이상의 채널 내부에 유체의 흐름을 차단 또는 생성하는 단계;를 포함하는, 미세유체 장치를 이용한 세포 반응 측정 및 관찰 방법.
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