KR20080084809A - 병원체를 검출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
병원체, 특히 성적으로 전이되는 질병에 연관된 유기체, 특히 인체 유두종 바이러스 유전자형을 검출하기 위한 방법이 기재되어있다. 본 방법은 특별히 디자인된 프로브들을 사용한 실시간 PCR의 사용을 포함한다. 프로브들, 방법의 수행을 위한 키트, 및 본 발명의 방법의 사용에 적합한 프라이머들을 디자인하기 위한 방법이 기재되어 있다.
인체유두종 바이러스, 프로브, FRET
Description
본 발명은 특히 성적으로 전이되는 질병에 연관된 기관에 대한 진단에 관련한 것이고, 좀 더 특별하게는 인체 유두종 바이러스 유전자형, 특히 생식기 파필로마바이러스의 유전자형에 관련한 것이다.
인체 유두종 바이러스와 그것의 중요성
WHO(World Health Organization)에 따르면 자궁 경부 암은 여성에 있어 두 번째로 가장 흔한 암 사망의 원인이다. HPV의 감염의 존재는 세계적으로 자궁경부암의 99%이상 연루되어 있다. 통계에 따르면, 전 세계 500,000명의 여성이 매년 자궁경부암이 발생하며 그 경우들 중 273,000명 이상이 치명적이다. Pap 스크리닝 프로그램(Pap screening programs, 검사프로그램)을 사용하여도, 여성의 상당수가 매년 자궁경부암으로 사망한다.
HPV감염은 세계에서 가장 빈번하게 성적으로 전염되는 질병(STD, sexually transmitted disease)으로, 성적으로 왕성한(active) 여성의 60%에 이르는 수가 그들의 일생동안 생식 기간에 한번으로 HPV에 의해 감염 될 것이다. HPV의 감염과 상관없이 여성 10,000분의 1보다 더 적은 수가 침윤성(invasive) 자궁경부암이 발생한다. 대부분의 HPV 감염 여성이 세포학적인 이상이나 암이 발생하지 않는다는 사실은 HPV 감염된 여성에서 자궁경부질병으로부터 암으로의 진행을 조절하는(modulating)하는 인자들의 중요성을 강조한다. 이 인자들은 HPV 유전자형과 분자적 변형체들이며 HPV 개수(viral load), HPV 감염의 지속성, 다른 STD 에이전트(agent)들과의 상호 감염, 숙주의 면역 상태와 담배와 같은 환경요인들을 포함한다.
파필로마바이러스는 포유류의 상피세포들을 감염시키는 작은 DNA 바이러스이며, 예를 들어, 섬유유두종, 사마귀/쥐젖(fibropapillomas)과 같은 양성이 될 수 있거나 악성이 될 수도 있는 상피의 증식성 장애를 일으킨다. 모든 파필로마바이러스들은 게놈 크기, 조직화, 오픈 리딩 프레임(open reading frames), 및 공유도는 단백질 기능이 유사하다. 다수, 모두가 그런 것은 아니나, 게놈 부위는 다양한 파필로마바이러스 사이에서 보존된다.
파필로마바이러스의 라이프 사이클및 숙주 세포의 분화 상태 사이의 근접한 연관성 때문에 파필로마바이러스의 라이프사이클의 세부 사항이 완전히 밝혀지지 않았다. 파필로마바이러스가 숙주 상피 기저 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있 고, 거기에는 바이러스 게놈이 확립되었으며 숙주세포의 복제와 공동 작용으로 복제하는 저복제수 유전자 부체(low-copy number episome)로서 유지된다. 케라티노사이트로 감염된 세포가 분화됨으로서, 바이러스 DNA가 증폭되며, 더 레이크 진(the late gene)이 유도되고, 파필로마바이러스의 성장력 있는 복제가 일어난다.
파필로마바이러스는 인간을 포함해서 동물의 넓은 다양한 종을 감염시킨다.
인체 유두종 바이러스(HPV)(파필로마바이러스 군을 포함해서, 알파-, 베타-, 감마-, 델타-, 뮤파필로마바이러스(Mupapillomavirus)및 분류화되지 속은 파필로마바이러스 군(unclassified papillomaviridae genera))들은 성적으로 전이된 질병들의 공통적인 원인이다. DNA 서열 데이터에 의해 몇몇 HPV의 유형이 밝혀졌으며, 96 HPV 유전자형은 완전히 데이터로 서열화 되었다. HPV의 유전자형은 L1, E6, 및 E7 유전자의 DNA 서열에 기초한다. 이미 확립된 계통에 관련한 서열에의 10% 분화는 바이러스의 새로운 형태를 규명하는데 충분하다.
인체 유두종 바이러스 군의 이종(heterogeneity)은 보편적으로 deVilliers, 1989, J. Virology 63:4898-4903에 설명되어 있으며, 이는 여기에서의 참고문헌으로 포함된다. 상당수의 HPV 타입의 게놈들은 서열화 및/또는 특정화되었다.
HPV는 DNA 종양 바이러스인데 그것들의 게놈은 세 가지 구역으로 조직되어있다: 또는 초기 유전자(E1에서 E7), 마지막 유전자(L1과 L2)구역이고, 상위조절 구 역(URR)또는 long control 구역(LCR). URR은 많은 전사 억제자들 및 전사 활성자들에 대한 결합 부위를 소유하고, 그것은 특정한 HPV 타입들에 대한 숙주의 범위를 규명하는데 일 부분의 역할을 한다는 것을 시사한다. E1 및 E2는 반면에, 염색체 외의 DNA복제 및 바이러스 라이프사이클의 완료에 중요한 단백질들을 암호화한다. E2는 두 가지 단백질을 암호화한다: 한 가지는 초기 구역의 전사를 억제하고; 다른 하나는, 초기 구역의 전사를 증가시킨다. HPV와 연관된 자궁경부암의 특징(hallmark)은 바이러스성 E2단백질의 발현을 감소시키는 것이다. 최근에 새로운 E2 단백질의 부분을 가지고 있는 작은 E8 ORF의 생성물로 구성되는E2 단백질이 밝혀졌다. 이 단백질은 바이러스의 복제 및 전사를 억제할 수 있으며, 게다가 바이러스의 잠복에 있어 주요 역할을 하는 것으로 믿어진다.
E4 단백질은 완벽한 비리온들이 집합되었을 때 감염의 가장 마지막 단계에서 발현하며, 형성 기작은 알려지지 않았다; 그러나 바이러스의 성숙 및 복제를 위해 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어진다. E4 단백질은 또한 인간의 케라티노사이트(keratinocytes)에서 세포질 사이토케라틴(cytokertin) 붕괴 즉, 감염된 세포로부터 비리온이 방출되는 것을 도움을 줄 수도 있는 상황을 유도한다.
E5 오픈 리딩 프레임(ORF), 반면에 종종 자궁경부암 세포에서 제거되며, 숙주 세포의 악성 종양 변형(transformation)을 유지하는데 필수적은 요소는 아닌 것으로 여겨진다. 현재, E5는 상피(표피)의 성장인자 수용체,혈소판 유도 성(platelet-de rived) 성장인자 β, 및 콜로니 자극 인자 같은 다양한 바이러스 막 통과 단백질과 상호작용을 한다. HPV-16 감염된 세포를 사용한 연구는 약한 변형(형성)인자를 포함하는 E5 단백질을 발견하였다.
발암현상에서, E6 및 E7 ORF는 가장 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어진다. 이 두 가지 단위들은 바이러스의 복제, 및 HPV DNA의 숙주세포의 불멸 및 변형(transformation)을 허락하는 온코프로테인(oncoprotein)을 암호화한다.
late region units은 L1 및 L2, 비리온의 집합 마지막 단계에서 바이러스 켑시드 단백질을 암호화한다. L1에 의해 암호화되는 단백질은 고도로 다른 파필로마바이러스 종 사이에서 보존된다. 마이너 캡시드 단백질은 L2에 의해 암호화 되며, 좀더 L1 단백질의 그것보다 더욱 많은 서열의 다양성을 갖고 있다
HPV는 피부 또는 내부 조직 내용물(linings)의 기저 상피세포를 감염시킬 수 있고, 따라서 피부의 또는 점막(항문성기의, anogential) 타입으로 구별되어진다.
HPV DNA는 보통 양성 자궁 전구체 장애에서의 염색체 외상 또는 유전자 부체이다. 그러나 많은 자궁경부암 세포뿐 아니라 자궁경부암 세포 주에서 그리고 시험관에서 HPV 변화된 형성된 인간 케라티노사이트에서, HPV DNA는 숙주 게놈에 통합된다.
비록 통합(integration) HPV 16-연관된 자궁경부암에서보다 HPV 18-연관된(associated) 자궁경부암에 있어 좀 더 빈번하게 발생하는 것으로 보일지라도, 종양 조직은 유전자부체 및 통합된 HPV DNA들을 동시에 포함할 수도 있다. 몇몇 전암(premalignant)장애에서 통합된 HPV-16가 존재하나 항상 암종에서 존재하는 것은 아니다. HPV DNA 통합(integration)이 일어나는 동안, 바이러스 게놈은 보통 E1/E2 구역에서 깨진다. 그 깨짐은 보통 E1과 E2 구역의 손실을 이끌어낸다. E6 및 E7 구역의 전사를 억제하는 것을 포함하는 단백질을 암호화하는 E2의 손실은 조절되지 E6 및 E7 암유발(oncogenic) 단백질의 비조절되고 증가된 발현을 야기시키는 것으로 알려져 있다. E6 및 E7의 발현은, 그러는 와중에, 숙주 세포로의 악성종양의 변형 및 종양의 형성을 유도하기 위해 관찰되었다. 숙주세포 DNA에의 HPV 바이러스의 통합은 자궁경부상피내 종양에서(CNI, Cervical Intraepithelial Neoplasia) 다클론성(polyclonal)에서 단일클론성(monoclonal) 상태로의 진행과 관련되며, 이 같은 현상은 저 등급에서부터 고 등급의 자궁 경관의 종양형성(신조직형성) 진행에서 기본적인 역할을 한다.
DNA 복제(copy)수의 불균형(CNI, copy number imbalence)의 패턴은 자궁 편평상피 상피내 병소(squamous intraepithelial lesion, SIL)등급, 인체 유두종 바이러스(HPV) 상태 및 수술 후 재발하는 특징이 있다. 몇몇 자궁경부상피내 종양(CNIs)은 고 등급 상피내 병소(HG-SIL(high grade SIL))및 저 등급 상피내 병 소(LG-SIL(low grade SIL))의 빈도에서 유사함을 보이는 반면, 1q, 3q 및 16q상의 증가를 포함한 다른 것들은 빈번하게 고 등급 상피내 병소(HG-SILs)에서 발견되지만, 저 등급 상피내 병소(LG-SIL)는 발견되지 않는다. HPV16 E2유전자의 상실을 나타내며 고 등급 상피세포 내 병소(HG-SILs)에서의 경우 케이스 당 현저하게 더 많은 자궁경부 상피내 종양(CNIs)이 있었으며, HPV16 E2 유전자의 손실과 연이어 재발하는 HG-SILs에서 보여지고 있다. 그 데이터는 자궁 SIL진행에서 CNIs의 연속된 획득과 일치한다. E2 유전자의 손실과 연관된 CNI의 더높은 빈도는 고 위험(high-risk) HPV 통합이 게놈의 불안정성에 연관되있다는 시험관 내(in vitro) 증거를 뒷받침해준다.
이용 가능한 분자, 임상적 및 역학적 데이터에 기초하여, HPVs의 부분집합들은 명백히 자궁경부암 및 그것들의 전구체에 대하여 병인학의 제제이다. HPVs는 선암종 (adenocarcinoma)와 편평상피세포암(squamous cell carcinoma)의 약 90%정도에서 확인되었다. HPV 감염의 과반수는 자발적인 것이 분명하나, HPV DNA를 갖고 있는 잠복기간이 긴 감염은 자궁경부암을 일으키는 전이에서 발견된다. 고 위험 또는 ㅇ암유발성의 HPV유형으로 알려져 있음에도 불구하고, 현저한 자궁경부암에 대한 위험(risk) 인자가 있으며, 점진적으로 다른 암에 대하여 그것들의 기능이 인식되어진다. 사실상 모든 자궁경부암(99%)들은 고 위험(high-risk) HPVs의 유전자, 가장 흔한 유형 16, 18, 31 및 45 을 포함한다.
다른 고 위험 유형들은 유형 31, 33, 35, 39, 45, 51, 56, 58, 59, 68, 및 73을 포함하고 있다. HPV 31, 33, 35, 51, 및 52는 때때로 중간 위험(intermediate risks)으로 알려져 있는데, 왜냐하면 그것들은 종양에서보다는 효과가 느리거나 심각한 이형성(dysplastic) 장해에서 보다 좀 더 흔하기 때문이다. 고 위험 계통들 사이에서, HPV 16과 18은 가장 근접하게 자궁경부암에 관련된다. HPV 16 DNA는 편평세포암종의 50%이상에서 발견되고 있으며, 반면에 HPV18 DNA는 아데노칼시노마(adenocarcinoma)중 50%이상에서 발견되었다. 그러나, 항문생식기의(anogenital) HPVs들의 대부분은 암 발생적(oncogenic) 잠재성을 갖고 있다.
숙주세포와 HPV's와의 상호작용은 기본적인 두 가지의 중요한 생물학적 결과를 갖는다: a) 모든 항문생식기(anogenital) HPVs들은 저 등급의 편평(squamous) 장해들을 유도하는데, 그것은 생산성 있는 감염 및 불멸화, 정상적 E6, E7 발현에 의해 일어난 불멸화 표현형의 형태학적 연관성이다. 불명화는 DNA 에 대한 재원을 모빌라이즈(mobilise)하고 새로운 자손을 생산하기 위한 파필로마바이러스의 선천적인 전략이다. b) 드물게, HPV들은 고 등급 장애(high grade lesion), 즉 증식성 상피 표현형을 유도하고, 그 결과 침윤성 자궁경부암의 가장 근접한 세포조직학적 전구체로 인식되는 조절되지 않는 E6, E7발현에 관여한다.
임상 질병을 데이터화 하는 것은, HPV 감염과 HPV 검출의 응용에 있어 잠재적인 분야에 관련된 것이며, 타이핑 방법(typing method)에는 첨형 콘딜 롬(condyloma acumination), 경화성 태선(lichen sclerosus), 편평 세포 과형성(squamosus cell hyperplasia), 음문상피내암(vulvar intraepithelial neoplasia), 편평 세포 암(squamosus cell carcinoma), 자궁경부상피내종양(cervical intraepithelial neoplasia), 자궁경부암(cervical carcinoma), 목 생암종( adenocarcinoma of the cervix), 항문 상피 내암(anal intraepithelial neoplasia), 음경 상피 내암(penile intraepithelial neoplasia), 후두 생암종(adenocarcinoma of the larynx), 재발한 호흡기 파필로마토시스와 우체상표피 형성증(epidermodysplasias verruciformis)등을 포함한다. 최근의 증가는 HPV가 남성의 전립선 암의 발생에도 역할을 한다는 것을 제안한다.
자궁경부암 전구체 장애(intraepithelial lesions)또는 세포학적 비정상(abnormalities)들은 발명자인 Gergr Papanicolaou이후에 자궁경부세포진 검사(Pap Smear)로 알려진 파파니코올우 염색(Papanicolaou Stain)을 사용함으로써 테스트된다. 그 기술은 유리 슬라이드(slide) 위에 자궁 경관의 표본을 도말하고, 헤마톡실린, 즉 핵염색(hematoxylin)을 처리한 항문성기의 관(anogenital tract)으로부터 얻어진 세포를 염색하는 것을 포함한다. 자궁경부 세포진 검사(Pap smear)는 그러나, 반복성이 부족하고, HPV 유도된 신생물(neoplasia) 유도하는 예상성이 충분하지는 아니하다. 진전된 인 시투(in situ) 종양을 갖는 환자의 25%가 진단 전 몇 년 정상 세포진 검사가 나타나거나, 마지막 음성 세포학이 한결같이 재 실험에서 자궁경부암 경우에서 양성이었다. 점진적으로 유행하는(prevalent) 문제점은 침 윤성 암이 음성 세포진 검사(negative Pap smear) 3년 내에 발생한다는 것이다.
가 음성(fake negative) 현재 허용 가능한 비율(즉, 병리학자의 전문가들이표본(smear) 샘플보다 조직 생검(biopsies)을 봄에 따라서 디스플라지아(dysplasia)를 가지나, 보통의 표본(smear) 스크리닝(screening) 동안에는 그와 같이 진단되지 않은 여성)은 개략적으로 5-10%이지만, 최근 연구에서는 실제 비율이 보다 높게 나타난다는 것을 보여준다. 사례들의 대략 7-8%에서는 세포진 검사(Pap smear)는 정해지지 않는 중요성을 갖는 비전형성 편평 상피 세포들을 의미한다(ASCUS). 게다가 사례 중 추가적인 20-30%에서는 세포진 검사(Pap smear)는 염증성 세포의 존재 때문에 해석하는데 불충분하다. 자궁 경부의 경우에 있어서는, 편평사마귀(flat warts, 질 확대경 검사(colposcopy)는 전암성(premalignant)의 장애가 의심된다. 편평사마귀로부터 인 시투(in situ)에서의 종양 및 자궁경부암으로의 조직병리학적 진전이 잘 나타나 있다.
상피내(intraepithelial) 장애는 갑작스러운 HPV감염을 가진 여성 사이에서의 공통적인 초기 현상이고, 그리고 갑작스런 HPV-16 또는 HPV-18 감염의 간격 및 생검-확인된 CIN 단계 2-3은 비교적 짧은 것을 나타낸다. 그러나 연구들은 고 위험을 가진 HPV 유형들을 가진 감염은 보통 일시적임(transient)을 확인하였다.
HPV 감염의 지속성은 상위 단계의 상피내(intraepithelial) 장애 및 침윤성 질병으로의 진전의 위험을 실질적으로 증가시킨다.
이 질병의 과정은 다양하며, HPV의 손실이나 존재(영속성)에 연관이 있다. 대부분 석회화(dysplastic) 장애의 수가 자발적으로 후퇴하게 되며, 다른 것들은 진행에 실패하고, 몇 가지 경우만 빠르게 진행한다.
자궁 경부암에서 고 위험 유전자형의 바람직한 기능의 결과로, 그리고 다른 병리학적 상태를 위한 결과적이고, 그리고 특이적인 유형 패턴 때문에 확인 및 타이핑(typing)이 매우 중요하다. 예를 들어, HPV 16 역시 편평 종양의 경우들(squmosus carcinoma cases)에서 좀 더 효과가 있으며, HPV 18은 좀 더 아데노칼시노마(adenocarcinlma) 경우에 효과가 있다.
HPV
진단(
HPV
diagnostics
)
1980년대 이래로, 몇몇 바이러스 게놈들은 클론화 되었으며 타입 특이적인 프로브(probes)들은 HPVs진단에 사용되었다. 필터 하이브리다이제이션(Filter hybridization) 기술은 보통 세포학에서 샘플을 가지고 있는 대비(parallel)에서 수집된 자궁경관의 토막들에서 HPV DNA를 잡아내기 위한 것으로 사용되었다. HPV DNA 프로브들은 임상적으로 유래한 조직 샘플에서 HPV DNA를 검출하기 위한 서던(Southern)과 하이브리드 Dot/서던 어세이와 같은 다른 하이브리다이제이션(융 합)에 기초한 실험에 사용되었다. 게다가 정제된 생검(biopsy) DNA 와 보존돼있는 조직 표본에서 인 시투(in situ) 하이브리다이제이션은 즉, 핵산 프로브들로 상보적인 염기 서열들과 세포와의 상호작용에서 나타난다.
역방향의 블롯팅 과정을 이용하는 HPV DNA 타입들을 검출하기 위한 방법이 보고되었다. 그 과정은 4개의 다른 HPV 타입들로부터 게놈 DNA가 묶인 맴브레인(membrane) 형성과 연관되어 있으며, 그 맴브레인(membrane)에 부착한 생물학적 샘플로부터 레이블된 DNA에 하이브리다이징한다.
상당수의 방법들은 인체 유두종 바이러스 타입들을 측정하기 타입-특이적인 반응, 시간대에서 HPV 타입의 한 가지를 검출하는 것 등을 측정하기 위해 발전되었다. PCR은 증폭에 사용되었으며, 특히 구강에서 그리고 자궁경부 생검(cervical biopsies)에서 HPV 16을 잡아내기 위해 HPV 16과 HPV 18의 존재를 확인하였다. 타입 1a, 5, 6a, 8, 11, 16, 18, 그리고 33타입 U.S.Pat.Nos. 4,683,195와 4,683,202에서의 HPV 서열을 특이적인 PCR 증폭을 위해 프라이머들의 혼합이 기재되었으며, PCR과 샘플에서 핵산 서열의 존재나 비존재 여부를 측정하기 위한 PCR 사용이 개시되었다.
U.S.Pat.No.5,447,839는 레퍼런스에 의해 통합되었으며, HPV의 검출과 타이핑을 위한 방법을 개시하였다(밝혀졌다). 이 방법에서, 샘플안에서 HPV DNA 서열은 암 유발 유전자와 비암 유발 유전자 HPV타입 모두 증폭하는 연속적인 프라이머들을 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다. 그래서, 샘플 안에 있는 HPV의 존재는 증폭된 생산물의 형성의 의해 알 수 있다. HPV는 그리고 나서 증폭된 DNA구역들과 하이브리다이제이션 한 타입 특이적인 DNA 프로브들을 사용함으로써 유형화 될 수 있다. 환자들 내에서 드러난 타입 특이적인 하이브리다이제이션 프로브들은 HPV 타입, 다시 말해 HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18 및 HPV-33타입의 다섯 개의 암 유발 유전자로 알려진 타입들 사이에서 구별되고 확인되었다.
HPV의 고 위험 타입을 검출하기 위한 다양한 방법들은 고안되었다. 이것들 중 많은 것들은 HPV 게놈에 있어 유일한 서열의 측정에 의존한다. 예를 들어, DNA 나 RNA 프로브들은 특히 부분적인 고 위험 HPV 스트레인(strain)의 유전자 비율에 상보적이라고 그 분야에서 보고되었다.
환자 샘플에서 고 위험 HPV의 부분적인 스트레인 존재를 검진하는데 있어 유용하며(U. S. Pat. No. 4,849,332, 레퍼런스에 의해 통합되었다) 레퍼런스에 따라 여기서 통합될 수 있으며, 증폭을 위해 PCR의 사용을 보고하였고, 퇴화(degenerate)나 혼합된 일치된 프라이머들을 사용해 HPV DNA를 검출하였고, 유전자 특이적인 DNA 프로브들의 혼합물을 사용하는 타이핑이 뒤따라온다. 일치된 프라이머들을 사용한 다른 예들에는 U.S.PAt.No.5364758과 Kleter, B.et al., Am. J. 병리학, vol. 153, No. 6, 1731-39(1998).에서 발견되었다.
이들 참고문헌들은 또한 여기에 포함된다.
상업적으로 이용가능한 방법이 있는데, 이것은 이종결합과 신호적 증폭에 기초하였다.(Hybrid Capture Ⅱ, Digene Corp.) 그러나, 이 방법은 보고되기에 HPV 게놈들 중 몇 부분의 높은 서열 상동성(high sequence homology) 때문에 몇 가지 특이한 문제점들이 있다.
이 방법에 기초한 증폭(amplification)은 민감성의 원인이 되는 부분으로 구성되며, 이것은 특정화 이종결합에 의한 측정의 원인이 되는 부분들로부터 분리되어있다. 이 기술들은 프라이머의 수와 측정 기술 사이에서 증폭된 게놈들의 section과는 다르다. 가장 자주 사용되는 증폭방법은 GP5+-GP6+(일반적인 프라이머(general primer) - GP), MY9-MY11, PGMY, SPF, L1C와 타입 특이적인 PCR 반응이다. 가장 자주 사용되는 측정 기술로는 서열 특이적인 이종 결합, 제한 단편 length polymorphism(RFLP)와 line probe assay(LiPA)가 있다. 때로는, 드물기는 하지만, 서열화나 다른 방법들이 적용된다. 그 분석적인 증폭의 특징들은 매우 넓은 범위에 걸쳐 있으며 유전자형 수에 의해 특징화 되어지고, 증폭되어 질 수 있고, 분석적 민감성, 유전자형의 증폭/측정의 특정화와 유전자형 사이에서 민감성의 차이에 의한 것들이 있다.
HPV
실시간(
real
-
time
)
PCR
인체 유두종 바이러스-16(HPV-16) 바이러스 수는 상위 등급의 자궁 경부의 장애의 존재를 생물학적 표지로 예상 할 수 있다. 몇 가지 실시간(real-time) PCR 분석법은 정확히 HPV-16 바이러스 수(HPV-16, L1, HPV-16 E6, HPV-16 E6 PG)를 측정하기 위해 발전해왔다. 그 방법들은 실시간(real-time)에서 HPV를 검출을 수행하기 위해 우리에게 지침을 주고 있으나, 당시에 한 가지 유전자형만을 측정할 수 있다.
주브나일 온셋(juvenile-onset) 재발생 하는 호흡기 파필로마토시스를 갖고 있는 환자들에게 있는 HPV DNA 확인은 SYBR R Green 실시간(real-time) PCR을 사용해서 수행한다. 그 방법은 실시간(real-time) PCR반응에서 다중/복잡한 인체 유두종 바이러스 유전자형을 측정하기 위해 사용되었다. 그러나 증폭 방법은 본 발명에서 설명한 바와 다르다. 진행되는 앰플리콘은 더 길어지고(approx. 450 bp), 그리고 나서 이 분야에서 실시간(real-time) 증폭 방법에 기초한 프로브들에 적용될 수 있다. 바람직한 길이는 150bp 또는 그 이하이다. 이 측정 방법은 비 특이적이며 유전자형들이 신뢰성 있게 분화하는 것이 불가능하다. 그것은, 후임(subsequence) 바이러스 타이핑을 필요로 하는데 HPV 타입 6, 11, 16, 18, 31, 그리고 33에 대한 타입 특이적인 프라이머들을 가지고 있는 실시간(real-time) PCR을 사용한다. 이것은 다시 격리 집단에서 인체 유두종 바이러스의 타입들을 검출하는 것이나 유일하게 동시에 하나의 유전자형을 측정할 수 있다.
일반적인 방법으로 인체 유두종 바이러스 유전자형을 측정하기 위해 사용된 단일 튜브 네스티드(single-tube nested) 반응은 다른 것들과 유사하게 한 방법이(통상적인 방법에서) 사용되었다. 그러나, 군들의 특이적인 검출은 설명되어 지지 않았다.
다른 방법으로는 성 파트너에서 인체 유두종 바이러스 DNA를 측정하기 위해 사용되었으며, 유전자형과 바이러스 수 데이터(data) 모두 측정하기 위해 두 가지 단계를 접근을 사용되었다. 그 방법은 GP5+/6+ PCR을 사용하였는데, 역 -line blot 분석법에 의하여 실시하였다.
자궁 경부 그리고 음경(penile)스크랩(scrape) 샘플에서 45 HPV 타입의 측정을 위하여 사용되었다. 바이러스 수는 Light Cycler based 실시간(real-time) PCR assay에 의한 HPV 타입인 16,18,31,33에 대하여 양성반응을 보이는 scrape 샘플 연이어서 측정하였다.
GP5+/GP6+ PCR은 150bp길이의 앰플리콘을 발생시키는데, 방법에 기초한 실시간(real-time) 프로브에 대한 기초한 방법의 적용을 가능하게 한다. 그러나 그 방법은 한 가지 반응에서 다중성의 유전자형이나 그룹들을 측정할 수 있는 것은 아니다.
호모제너러스 실시간(real-time) 검출과 핵산 증폭을 위한 방법은 제한효소 절단을 사용하여 고안되었다. 이 호모제너러스 시스템 측정은 리포터(reporter)와 제한 효소 인식 서열을 암호화하는 짧은 DNA 절편에 의해 분리되는 5‘ 말단(terminus)에서 퀀처(quencher) 부분에 의해 매개된다. 하나의 단일 가닥에서 형광 reporter로부터의 신호는 형광 공명(resonance) 에너지 이동 (tranfer(FRET) 때문에 억누르게/제한하게 된다. 그러나, 프라이머로 인하여 이중 가닥 앰플리콘(이중가닥 앰플리콘)으로 통합되고, 반응에서 제한효소 존재는 리포터(reporter)나 퀀처(quencher)에 DNA 연결(linking) 되면 쪼개짐이(cleaves)되고, 리포터의 비제한적인 형광물질은 통과되게 된다.
이 시스템은 인체 유두종 바이러스(HPV)16의 E6 유전자에 대하여 특이적인 프라이머들을 사용함으로써 테스트하였고, 이는 쪼갤 수 있는(cleavable) 에너지 이동 레이블이 붙어있으며, HPV 16 양성 DNA를 증폭하는데 사용되었다. 그 방법은 다중성 유전자형이나 그룹을 측정하는데 사용될 수 없다.
자궁 경부암의 고 위험에 융합된 인체 유두종 바이러스타입을 동시에 정량하기 위한 시스템에 기초한 실시간(real-time) PCR이 나타나 있다. HPV 16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -58과 67의 측정과 정량을 위해 실시간(real-time) PCR 분석법을 실시하였다. 이 분석법은 각각의 환자 샘플로부터 평행한 실시간(real-time) PCRs에 기초하였다:
(ⅰ) 반응1 HPV 16, -31, -18과 -45(HPV 18과 -45는 검출되었고, 하나의 프로브를 사용하여 함께 정량하였다) 세 가지 다른 형광프로브를 가지고 측정하고 정량한다; (ⅱ) 반응2는 세 개의 다른 형광 프로브들로 인한 HPV -33, -35, -39, -52, -58, -67을(HPV 33, -52, -58 및 -67은 함께 측정하고 정량되었다) 측정하고 정량하는데 유일하게 세 가지 다른 프로브들은 사용되었다;
그리고 (ⅲ) 반응 3은 인간의 하나의 복제 유전자(copy gene)의 양을 측정하고 정량한다(HMBS, Homo sapience hydroxymethylbilane 합성; Genbank accession no. M95623.1). 반응1은 7개의 PCR 프라이머들과 3개의 프로브들 전체를 포함하고, 반응2는 7개의 PCR 프라이머들과 3개의 프로브들을 포함하고 있으며, 그리고 반응3은 2개의 PCR 프라이들과 한 개의 프로브를 포함한다. 그 방법은 TaqMan 하이드로저블(hydrolysable) 실시간(real-time) PCR 프로브들에 적용한다. 같은 반응에서 6 유전자형(genotype)들의 최고치(maximum)를 측정하는 하나의 반응에서 오로지 세 개의 프로브들의 사용이 설명되었다. 그 방법은 다중의 HPV 유전자형들을 측정하는 반응들을 디자인하기 위해 일반적인 지침으로 사용될 수는 없는데, 왜냐하면 유전자형들 사이에 서열 확인이 한계가 있기 때문이다. 그 반응의 확장은 유전자형 사이에서 사용된 서열 동일성들을 사용함으로써 제한된다.
발암성의(oncogenic) 인체 유두종 바이러스의 측정과 정량을 위한 방법은 이미 형광 5′엑소뉴클리아제 분석법을 사용함으로써 발전되었다. 그 방법은 HPV 타입 16,18,31,33과 35를 위한 타입 특이적인 프로브들을 가지는 단일(single) PCR에서 E1 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 부분인 3’으로부터 180-bp 단편을 증폭하는데 기초한다. 그 프로브들은 분리적으로 사용되거나 또는 실험마다 3개의 프 로브까지 조합하여 사용할 수 있다.
SybrGreen와 분자적인 표지 폴리머레이즈 체인 반응(beacon polymerase chain reaction)을 가지고 인체 유두종 바이러스를 측정하고 유전자화하는 단계는 나타나있다. 그 실험법은, HPV 앰플리콘을 표적(reporting) 하는 SyrGreen 에 의해 일반적인 HPV 측정을 수행한다. 그리고, 7개의 우세한(prevalent) HPV 타입인(HPV-6,-11,-16,-18,-31,-33,-45)들을 실시간 표지 PCR (실시간(real-time) beacon PCR)을 통해서 유전자화 하였다. 그 두 단계의 방법은 세 개의 달리 레이블된 분자들을 사용하였는데 이는 한 개의 PCR에서 반응이기 때문이다.
다른 방법은 또한 설명되어진다: 스콜피온(Scorpion)으로 알려진 HPV 자가 프로빙 형광 프라이머들의 저해와 프라이머의 일반적인 꼬리에 접합되는 데 사용된 스콜피온(Scorpion) 혼합물이 사용되었다. 꼬리가 달린 프라이머를 사용함으로써, 많은 다른 HPV 앰플리콘들을 인식하기 위한 단일 스콜피온(single Scorpion)이 가능한 일치 부위를 유도할 가능성이 있다. 이것은 두 단계의 과정들이 있는데 그것은 이론적으로 40이상의 다른 HPV 타입들을 측정할 수 있다. 10 스콜피온(Scorpion) 타이핑 프라이머들은 이번 연구에서(HPV 6, 11,16,18,31,33,39,45,51,56)에서 사용되었다. 각각의 스콜피온(Scorpion)의 프라이머 서열은 타입이 특이적이고 Jacobs et al의 GP6+ 프라이머의 같은 서열 위치에 위치하게 되었다. 그 방법은 양성 샘플 타입에 사용되는 타입 특이적인 측정 방법 이고 HPV 존재시 측정하기 위한 보편적인 방법을 알려준다. 프로브의 상호작용을 이끄는 것인 다중 복합적인 프로브들을 가진 검진의 문제점을 해결할 수 없다. 사실 그 방법은 하나의 반응에서 다중 기능을 하는 프로브들의 사용을 피하는 것이다.
실시간(real-time) LIGHTCYCLER™ 와 TaqMan assays들을 사용한 HPV 측정 방법에 기초한 실시간(real-time) PCR은 자궁 경관의 scrape 표본에 인체 유두종 바이러스 수를 측정하기 위해 전통적인 GP5+/6+ PCR/enzyme immunoassay(EIA)를 비교하였다. 두 실시간(real-time) PCR 시험법들은 자궁 경부의 스크렙 견본(scrape specimens)에서 HPV 16 수가 측정되었으나, 이들 시험법과 GP5+/6+ PCR/EIA 사이 낮은 어그리먼트(agreement)가 있으며, 이는 후의 방법이 정량적인 HPV DNA를 위해 적합하지 않다는 것을 알려준다. 한 HPV6/11과 HPV16/18 DNA loads는 동시에 두 개의 HPV 유전자를 측정하는 실시간(real-time) 형광 정량 PCR에 의해 측정된다.
일치되는
프라이머
디자인 방법(
Consensus
primer
design
methods
)
프라이머들과 프로브들은 오로지 인체 유두종 바이러스 핵산 분자를 측정하기 위해 사용되고, L1의 비율을 암호화하는 핵산 분자 용도를 디자인할 수 있다. 예를 들어, OLIGO(Molecular Biology Insights Inc., Cascade Colo.)와 같은 컴퓨터 프로그램이나 프라이머3이 있다. 이 올리고뉴클레오타이드의 정확한 특징은 이 분야에서의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
수 많은 소프트 웨어 어플리케이션(application), 가장 주목할 만하게는 프라이머3(primer3) 및 다양한 확장과 같은 것을 야기하여야 하는 PCR 프라이머 디자인의 일반적인 원리들에 관한 광범위한 문헌이 있다. 널리 쌍을 이루는 친화성을 위한 프라이머들을 시험하기 위한 다이나믹한 빠른 프로그래밍은 발전해 왔다. 이 다중 복잡한 PCR에 대한 어플리케이션(application)은 안정적으로 과거 10년에 걸쳐 증가되 왔고, 좀 더 정교화된 프라이머 선별 방법을 요구하게 된다. 다른 알고리즘들은 특히 부분적인 목적을 위해 선호하고, 또는 부분적인 특별한 테크놀로지 플랫폼을 위해 디자인되어진다. 일반적으로 하나의 시험법의 다양한 수준을 최고화하기 위한 프라이머 쌍을 확인하는데 생기는 문제점은 NP-컴플리트(complete)로 보여진다. 정확한 알고리즘 그것은 3‘ 염기 상보성을 배출하는데, 산물의 크기 제한을 서열화하는 동안 존재한다.
그 발명의 방법은 다양한 PCR 분석법들의 문제점과 관련된 것이다. 특히 동일한 프라이머들의 디자인에 관한 것이다. 이 문제의 보편적인 접근에는 표적들의 숫자보다 프리이머들의 숫자들이 더 적은 상당 수의 표적을 증폭하기 위한 동일한 프라이머들을 디자인하는 것이다. 게다가 그 디자인은 다양한 PCR 시험법의 디자인 규칙을 설명(account)할 수 있을 뿐만 아니라, 동일한 헤르페스바이러스(herpesvirus)에 의해 예시화할 수 있다.
동일한 디제너레이트(degenerate) 하이브리드 올리고뉴클레오티드 프라이머들(CODEHOPs)에 기초한 멀리 떨어진 유전자 서열에 관련하여 확인하기 위한 특별한 접근은 발전되었다. 상위 수준의 보존부위를 갖고 있는 단백질의 짧은 구역은 다시 재보고 되고 있다. CODEHOPs는 보존된 서열 블록(blocks)으로부터 유래되었으며, 그들 사이에 그 지역을 증폭하기 위해 PCR이 사용되었다. CODEHOP PCR 프라이머는 3‘-디제너레이트 코아(degenerate core) 구역에 있는 각각의 다른 서열을 포함하고 있는 프라이머들의 풀로 구성되어 있으며 3‘-디제너레이트 코아(degenerate core) 구역에서 각각 프라이머는 서열 블록 내에 표적이 된 3-4 보존 구역인 아미노산 주된 요소(motif)를 암호화하는 콤비네이션을 가능 암호(codon)중에 하나를 공급한다. 게다가, 그 풀안에 각각의 프라이머들은 표적이 된 요소의 측면에 위치하는 보존된 각각의 아미노산을 암호화하는 위치에서 대부분의 충분히 가능한 핵산에서 유래한 동일한 5′콘센서스 클램프(consensus clamp) 구역을 가진다.
증폭은 표적이 된 주형(template)에 3‘디제너레이트 코아(degenerate core)에서 가장 유사성이 있는 풀에서 프라이머의 어닐링(annyling)과 연장에 의해 시작된다. 어닐링(annyling)은 표적 주형(template)에 부분적으로 매치하는 5’ 동일한 클램프(clamp)에 의해 안정화된다. 한때 프라이머들이 통합되면, 이는 연속적인 증폭 사이클을 위한 주형이 된다. 왜냐하면 모든 프라이머들은 5‘ 동일한 클램프 영역(clamp region) 안에서 동일하고, 그들은 모두 증폭의 연속적인 단계(rounds)동안에 고도의 방법(stringency)에서 어닐링(annealing) 한다. 이 방법은 바이러스분 야에서도 사용되는 방법이다. 이 접근은 발명의 방법과는 다르며, 발명에서 특정 서열 블록들이 효율적으로 관련된 서열을 증폭하는데 사용된다. 그 Codehop 프로그램은 알려지지 않은 표적들의 증폭을 위한 프라이머들을 발견하였으나 DNA 서열 대신 일렬로 되있는 단백질 서열을 가지고 시험한다.
공통된(concensus)/ 축퇴성(degenerate) 프라이머들은 디자인하는 것을 다루는 수 많은 방법이 있지만, 그것들은 기본적으로 같은 문제를 해결하기 위한 다른 알고리즘을 보편적으로 사용한다: 표적 서열과 관련하여 효율적인 증폭을 위한 가장 정확한 프라이머 세트를 확인하기 위한 것, 프라이머들 사이에 협력(coorporation)은 아직 설명(account) 하지 않았다:
다른 접근으로 PriFi 프로그램을(http://cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main) 들 수 있다. 이 프라이머들의 디자인 쌍은 서열 정보 이전에 유용하지 않은 종에 있는 게놈 DNA의 PCR 증폭에 유용하다. 이 프로그램은 계통 발생학적으로 관련된 종으로부터 DNA 서열 정렬을 사용하여 작동하고, 수많은 기준(cieria) 수행하는 가능한한 축퇴성의 프라이머 쌍의 리스트를 출력하여, 그 결과 프라이머가 다른 계통발생학적으로 관련된 종 내의 비슷한 서열(orthologous sequence)을 증폭시키는 높은 개연성을 갖게 된다.
그러나 그 프로그램은 프라이머들 사이에서 협력의 의미를 사용하지는 않는다.
DNA 서열들의 정렬된 그룹에서 PCR 프라이머들을 디자인하기 위한 앰플리콘 프로그램은 유사한 방법이다. 앰플리콘의 가장 중요한 적용은 주어진 그룹으로부터 DNA 영역은 증폭하지만 다른 탁소노믹(taxonomic) 그룹으로부터 orthologous regions는 증폭하지 않는 그룹 특이적인 PCR 프라이머 셋트를 디자인하는 것이다. 다시, 프라이머들간의 협력(coorporation)은 설명(account) 하지 않는다.
표적화되는 상당수에 의한 측정을 위해 증폭 반응 프라이머들을 디자인하는 것은 문헌상 관련된 증폭 표적들이 간단한(straighforward) 규칙들을 갖고 있지 않는다. 그러나 보편적으로 예측할수 없는 반응이 프라이머들과 반응의 민감성의 증폭 자원에 대한 경쟁을 낮추며 그리고 더 많은 프라이머들 사이에서 더 많은 자원들 간의 경쟁하는 미스프라이밍(mispriming)하는 생산되는 비특이적인(aspecific) 산물들의 더 큰 가능성을 의미한다.
자궁 경부암 검진에서 HPV 테스팅의 잠재적인 기능은 존재하는 하부조직에 전적으로 의존한다. 임상적인 세팅 때문에 그곳에서 효과적이고, 잘 조직화된 세포학은 그러한 장소에 기반이 되 있는 프로그램이 있고, 주제는 HPV 테스팅이 존재하는 프로그램과 비용의 효율성에 대한 의문, 그리고 앞선 통상의 실험에 대한 추가된 가치가 온다.(come) 반대로, 검진이 존재하지 않는 셋팅 때문에 비효율적이다. 왜냐하면, 낙후된 질의 세포학이나 타고난 (본래부터 가지고 있는) 한계 때문에 감염된 표본에 대한 비율을 야기시키고, 민감성에 대한 더 기본적인 의문이, 특이성, 그리고 테스팅 과정의 간단성이 주요해진다.
실시간(real-time) PCR 기술은 상기 설명된 개요에서 요구들이 증가되고 이행하는 요건을 갖추는 특징을 제안한다. 최근 연구에서 자궁 경부 악성 종양(cervical malignancies,CIS)에 대한 진행 과정을 결정하는데 가장 빈번한 몇몇 고 위험 HPV 타입들로 인하여 HPV DNA의 양이 결정되었다. 세포 당 카피 수의 범위가 HPV 타입들 사이에서 차이가 없으나 가장 높은 바이러스 개수를 가지고 있는 백분위수에 대한 CIS의 비율의 증가는 HPV 31보다 HPV 16에 대해 점진적으로 더 높다. 그러므로, HPV 바이러스 수는 편평 이상 때문에 표본이 음성적이 된 단계에서 자궁 경부 CIS의 앞으로 다가올 위험이 예측 가능할 지도 모른다. 실 시간(실시간(real-time)) 기술들은 현존하는 HPV 검출 방법보다 더 정확히 바이러스 수를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 실시간(real-time) 기술은 현존하는 방법들 이상의 몇 가지 이점들을 제공한다. 그러나 실시간(real-time) 증폭이 없이 그리고 한 가지 반응에서 세 개의 인체 유두종 바이러스 타입들보다 더 검출할 수 있는 검출 방법들이 개발되었다. 방법이 없이 임상적으로 중요한 바이러스 그룹들을 하나의 반응에서 있는 그룹에서 저 위험도나 고 위험도의 인간 파필로마 바이러스 잡아내기 위해 개발되었다.
정확한 자가 샘플화된 HPV 실험은 광대한 함축(내포/관련)을 가지고 있다. 실험과 같이 골반 실험에 대해 어쩔 수 없이 기탁(맡기다)하게 되거나 기탁 불가능 한 검출 가능한 여성의 가능성이 열려 있다. 후진국에서 이는 통상의 실시를 넘어서 하나의 이점을 제공한다. 적제적소에 진검이 조직화된 지역에서는, 자가 샘플링은 HPV 양성반응 치료 후에 세포학상 음성적인 여성들에 있어 짧은 기간 동안 추적 조사가 필요한데, 전통적인 검진을 거부하는 여성과 감독이나 감시에 도달하기 위한 추가적인 접근을 제공한다. 환자 근처에 자가 샘플링 접근 가능성은 검진 프로그램의 질과 평가를 증가시킬 수 있다.
HPV 테스트, 그것은 틀에 박힌 그리고 초기 검진 시장을 표적으로 하며, 이들 필요 조건 모두를 충족한다. 실시간(real-time) PCR 기술은 특히 이들 기술적으로 요구 사항들을 열거하는데 적합하다. 본래 그 기술의 단순성은 하부 구조 벽들을 감소하는데 도움을 주고 그리고 또한 다른 기슬들을 넘어서 비용면에서도 효율적이다. 실시간(real-time) PCR 기술들의 다른 면은 분석적 민감성과 더 중요하게는 HPV 측정의 특이성을 증대할 수 있으며, 이들 매개 변수의 임상적인 대응물(counterpart)의 증대에 좀 더 견고한 기반을 제공한다. 내부적인 제어는 그 시스템에 대하여 질적 조절 가능성을 추가한다.
HPV 측정의 근접 환자의 어플리케이션(application)에서 실시간(real-time) 기술들은 가장 실행 가능한 선택사항들이다. 근접 환자의 테스팅은 초기 스크리닝에 있어 다음 개척지로 향할 수 있고 실시간(real-time) 기술들은 이미 다른 병리적 경우에 있어 이 분야에서 눈에 띄는 관심을 이끌어 내며, 그리고 실행하는데 있 어 증가된 가치들을 제공할 수 있다.
샘플 내용물을 포함하는 실시간(real-time) PCR에 의해 제공되는 특징의 개선 및 증폭된 산물의 실시간(real-time) 검출 뿐만 아니라 다른 방법들에 비교되는 실시간(real-time) PCR의 증가된 민감도는 임상 실험에서 인간 유두종 바이러스 감염의 통상의 진단을 위한 이러한 기술의 이행의 실행 가능성을 나타낸다.
첫 번째 일 태양으로서, 본 발명은 4개 이상의 프로브들을 포함하는 세트를 가진 샘플로부터 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 프로브들 각각은 상보적인 염기들의 4 또는 5쌍들에 의해 플랭킹된 병원체로부터의 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 염기들은 병원체로부터의 핵산으로으 하이브리드와의 결실 내에서 줄기 구조(stem structure)를 형성하며, 상기 프로브는 첫번째 상호작용하는 레이블 및 두번째 상호작용하는 레이블로 레이블링되며 그 결과 상기 프로브의 하이브리드가 검출된 시그날 내에서의 변화를 야기하는 것인, 하나 이상의 병원체의 존재를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
여기서 사용되는‘핵산'은 mRNA 및 hnRNA와 같은 다양한 형태의 ,DNA 및RNA를 의미한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 될 수 있다.
여기서 사용되는‘병원체’는 동물의 정상적인 생리를 파괴하여 질환 및 질병을 야기하거나 이에 관련되는 생물학적 작용물을 의미한다. 그러한 병원체라 함은 원인성 작용물이며, 즉 병원체를 갖는 환자의 감염이 홀로 혹은 하나 이상의 다른 협동 인자들의 존재 하에 질병을 일으키는 것이다.
바람직하게 병원체는 성적으로 전이되는 질병에 관련한 유기체이다. 여기서 사용되는 용어, ‘성적으로 전이된 질병에 관련한 유기체’는 성적으로 전이되는 질병으로부터 고통받는 환자에 존재하는 유기체를 의미한다. 성적으로 전이되는 질병들과 관련된 유기체의 예로서 클라미디아(chlamydia)에 관련된 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis)에 관련된 질병, 임질에 관련된 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 생식기 포진에 관련된 헤르페스 심플렉스(Herpes simplex) 바이러스(HSV), 생식기 혹(warts)과 관련된 인체 유두종 바이러스와 매독(Syphilis)과 관련된 틀레포네아 팔리움(Treponema pallidum)을 포함한다. 상기 유기체는 바람직하게는 바이러스, 좀 더 바람직하게는 인체 유두종 바이러스이다. 그 방법은 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 HPV 유전자형의 존재를 검출하는데 사용된다.
비록 본 발명이 병원체의 검출에 관련이 있지만, 이 방법은 어떠한 유기체,특히 이 하나 이상의 아족(sub-species), 또는 그와 관련된 유기체들을 포함하는 유기체의 존재 또는 비존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 여기서 사용되는 관련된 유기체는 같은 군이나 속(genus)이나 종을 의미하며, 고도의 유전자 유사성, 바람직하게는 80%이상, 좀 더 바람직하게는 90%이상의 고도의 유사성을 가진다. 관련된 유기체는 바람직하게는 바이러스, 좀 더 바람직하게는 인체 유두종 바이러스이다.
각각의 프로브들은 바람직하게는 일반적인 구조를 가진다.
3´-스템(stem)-F-HPV 상보적 서열(complementary sequence)-F´-스템(stem)-5´을 가진다.
F 및 F´은 상보적인 서열들을 플랭킹되는 염기서열인 줄기(stem) 및 줄기 (stem´)로 연결하는 선택적 연결 서열이다. 스템 및 스템´은 용액안에서 이중 나선 스템(stem) 구조를 형성하는 상보적인 염기 쌍들에 의해 형성되는 서열이다. 이들 서열들은 바람직하게는 회문형(palindromic)이다. 바람직하게는 프로브의 각 말단에는 4개의 염기들이 있다. 스템을 구성하는 염기들은 바람직하게는 C-G 쌍, 바람직하게는 1,2,3,4 또는 5 C-G 쌍을 포함한다. 바람직하게 스템은 CGCG서열을 가진다.
우리의 실험에서 스템(stem) 구조의 on-off 비율에 의존하는 것으로 보이는 검출 가능한 표적 DNA가 없으면 시간을 초과하여 예측 불가능한 가짜 증폭 시그널을 야기하는 각기 다른 것들과 4쌍의 염기 쌍-스템(stem) 분자 표지가 상호작용 하지 않는다는 것을 확인하였다. 때로는 5개의 염기쌍 스템(stem) 분자 표지들이 반응을 최적화하기 위해 사용될 필요가 있다. 싱글플랙스(singleplex) 및 멀티플랙스(multiplex)검출 양쪽에서 모두 더욱 긴 스템을 갖는 표지들은 조절 불가능한 가짜 증폭 신호를 야기한다. 더 짧은 스템화된(stemmed) 실시간(real-time) 증폭반응에서 유용하기에는 너무 낮은 융점을 갖는다.
상호작용하는 '레이블'이란, 레이블 쌍의 다른 것과 협력하는 레이블의 한 쌍을 의미한다. 이 협력 작용은 레이블이 근접하였을 때, 예를들어 프로브들이 스템루프(stem loop) 구조를 가질때 발생한다.
프로브가 상보적인 핵산에 하이브리드 될, 레이블간의 협동 작용은 그들의 거리가 증가됨에 따라 감소되거나 완벽히 제거된다. 레이블들은 각각의 프로브의 말단에 부착되며, 바람직하게는 스템 루프 구조로부터 상보적인 염기들의 위 또는 근접해 부착하게 된다. 만약 프로브가 하나의 형태(conformation)에서 다른 형태로 변화시킬 때, 즉 스템 루프가 열릴 때 시그널에서의 변화가 검출될 수 있다면, 상기 레이블이 부착되는 위치는 중요하지 않다. 프로브가 열린 위치(position)에 있을때, 즉 그것이 상보적인 핵산 염기서열들에 하이브리드되었을 때, 예를 들어 하나의 상호작용 하는 레이블이 두 번째 상호작용 하는 레이블로부터의 시그널을 소멸시킬 때 신호에서의 변화는 시그널의 증가가 될 수 있다. 대신에, 프로브가 열린 위치에 있을때 그것이 상보적인 핵산 서열에 하이브리드화 될때, 예를 들어 첫번째 상호작용하는 레이블이 두번째 상호 작용하는 레이블로부터 방사되는 시그널을 야기하는데, 시그널의 변화는 시그널의 감소가 될 수 있다.
바람직한 실시예에서 상호작용 하는 레이블들은 FRET 공여체와 상응하는 FRET 수용체들이다.
FRET 기술은(예를 들면, U.S. Pat.Nos. 4,996,143, 5,565,322, 5,489,489, 및 6,162,603참조) 공여체 및 상응하는 수용체 형광 부분들이 서로의 특정 거리내에 위치하게 되는데, 에너지 이동은 시각화되거나 아니면 검출되거나 및/또는 정량화 될 수 있는 두 개의 형광 부분들 사이에서 일어나게 된다. 여기에서 사용되는, FRET 기술 포맷은 인체 유두종 바이러스의 존재 여부의 확인을 위해 분자적인 표지 기술을 이용하였다. 분자 표지 기술은 공여체 형광 부분 및 수용체 형광 부분으로 레이블링 된 하이브리드 프로브를 사용한다. 형광 레이블들은 전형적으로 프로브의 각 말단에 자리 잡고 있다. 분자적 표지 기술은 2차 구조 형성을 허용하는 서열들을 가지는 프로브 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 예를 들어 헤어핀(hairpin).
프로브내에서의 2차 구조 형성의 결과로서, 형광 부분 양쪽 모두 프로브가 용액 속에 있을 때 공간적인 근접성이 있다. 표적 핵산들(즉, HPV 유전자형 핵산)로 하이브리드화 한 후에 프로브의 2차 구조는 파괴되고 그리고 형광 부분들은 서로 분리되어 그 결과 적합한 파장의 빛의 여기 후에, 첫번째 형광 부분의 q아사가 HPV 유전자형으로부터의 핵산의 비존재에서 검출되는 것과 달라진다.
공여체 및 형광 부분들의 수용체에 관하여 여기에서 사용되는 상응하는 공여체 형광적인 부분의 여기(excitation) 스펙트럼에 오버랩되는 방사(emission) 스펙트럼을 가지고 있는 수용체 형광 부분를 의미한다. 바람직하게는 수용체인 형광적인 부분의 파장 최대치는 공여체 형광 부분의 여기(excitation)의 파장 최대치보다 100nm이상 커야한다. 따라서, 효율적인 비-방사성(non-radioative) 에너지 이동은 거기 사이에서 생산될 수 있다.
형광적 공여체 및 수용체의 부분은 일반적으로 (a)고 효율성의 포스터(Forster)에너지; (b)큰 최종 스톡스(a large final Stokes shift<100nm));(c)가시 스펙트럼의 붉은 부분 내로의 가능한한 먼 방사의 이동(<600nm); 및 (d) 공여체 여기 파장에서 여기에 의해서 생산된 Raman water 형광 방출보다 더 높은 파장으로의 방사의 이동을 위해 일반적으로 선택된다. 예를 들어, 레이저 선(laser line) 근처에의 여기의 최대치, 레이저선(예를 들어 헬륨 카드뮴 442nm 혹은 아르곤 448nm), 높은 멸종 계수, 고도의 양자 효율, 및 상응하는 수용체 형광 부분에 여기 스펙트럼을 갖는 형광 방사의 좋은 오버랩이다. 상응하는 수용체 형광 부분은 높은 소멸 계수, 고도의 양자 효율 및 공여체인 형광 부분의 방사를 갖는 여기 좋은 오버랩을 갖는 것이 선택될 수 있다. 그리고 가시광선의 빨간 부분에 방출(600nm).
대표적인 공여체 형광 부분은 플루오르세신(fluorescein)을 포함하고 있는 FRET 기술에 있어 다양한 수용체 형광 부분로 사용될 수 있는데, 플루오르세신(fluorescein), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 비-피코에리트린(B-phycoerythrin), 9-아크리딘이소티오시아네이트(9-acridineisothiocyanate), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) VS, 4-아세타미도-4´-이소티오-시아나토스틸벤(4-acetamido-4´-isothio-cyanatostilbene-2), 2-디설폰산(2-disulfonic acid), 7-디에틸아미노-3-(4´-이소시아네이토페닐)-4-메틸코마린(7-diethylamino-3-(4´-isothiocyanatophenyl)-4-methylcoumarin), 석시니미딜 1-파이렌부티레이트(succinimdy1-pyrenebutyrate), 4-아세타미노-4'-이소티오시아네이토신벤-2
(4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2), 2-디설폰산 유래물(2´-disulfonic acid derivative), 선택적으로 기질화된(optionally substituted) 파이렌(pyrene), 안트라센(anthracene), 나프탈렌(naphthalene), 아크리딘(acridine), 스틸벤(stilbene), 인돌(indole), 벤진돌(benzindole), 옥사졸(oxazole), 벤조엑사졸(benzoxazole), 티아졸(thiazole), 벤조티아졸(benzothiazole), 4-아미노-7-나이트로벤-2-옥사-1,3-디아졸(4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole), 시아닌(cyanine), 카보시아닌(carbocyanine), 카보스티릴즈(carbostyryl), 포르피린(porphyrin), 살리실산염(salicylate), 안트라밀산(anthranilate), 아쥴렌(azulene), 페릴렌(perylene), 피리딘(pyridine), 퀴놀린(quinoline), 코마린(coumarin), 폴리아자인덴스(polyazaindacene), 잔틴(xanthene), 옥사진(oxazine), 벤족사진(benzoxazine), 칼바진(carbazine), 페날레논(phenalenone), 벤조페날레논(benzphenalenone), 칼바진(carbazine),옥사진(oxazine), 4-보라 3에이,4에이-디아자-에스-인다센스(4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene), 플루오르세신(fluorophorescein), 로다민(rhodamine), 로돌(rhodol), 5-카르복시플르오르오레신(5-carboxyfluorophoresceins, FAM), 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(5-(2'-aminoethyl) aminonapthalene-1-sulfonic acid, EDANS), 안타라닐라마이드(anthranilamide), 테르븀 킬레이트(terbium chelate), 활성 레드 4(Reactive Red 4), 텍사스 레드(Texas red), ATTO 시료(dyes), EVO 시료(Dyes), DYO 시료(Dyes), 알렉사 염색시료(Alexa dyes) 및 BODIPY 염색시료를 포함한다.
대표적인 수용체 형광 부분들은 공여체 형광 부분에 의존적인데, 여기에 LC.TM.-RED 640(LightCycler.TM.-Red 640-엔-하이드록시석시나마이드 에스테르(640-N-하이드록시석시나마이드 에스테르(hydroxysuccinimide ester)), LC.TM.-RED 705(LightCycler.TM.-Red 705-포스포라마다이트(Phosphoramidite)), CY5와 CY5.5와 같은 시아닌 시료(cyanine dye), 리사민 로돕신 비 설포닐 클로라이드(Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride), 테트라메틸 로다민이소티오시아네이트(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), 로다민 엑스 이소티오시아네이트(rhodamine x isothiocyanate), 에리트로신 이소티오시아네이트(erythrosine isothiocyanate), 플루오르세센(fluorescein), 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트(diethylenetriamine pentaacetate) 또는 다른 란탄 이온 킬레이트(chelates of Lanthanide ions)(예를 들어, 튜로피엄(Europium), 또는 테리븀(Terbium))등을 포함한다.
공여체와 수용체 형광 부분들은 획득될 수 있는데, 예를 들자면, 분자 프로브(Molecular Prbes(Junction City, Oreg.)) 또는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo.).
바람직하게는 수용체 형광 부분은 퀀처(quencher) 이다. 여기서 사용되는 것으로서, 퀀처(quencher)는 형광 레이블에 의해 배출되는 형광을 감소시키는 물질이다. 이것은 형광 물질의 배출의 완벽하고 부분적인 억제를 포함한다. 억제의 단계는 형광 부분에 있어 한번 퀀처(quencher)가 제거될 수 있는지 검출할 수 있는 변화가 얼마만큼 길어지는지는 중요하지 않다.
퀀칭되는 부분은 바람직하게는 선택적으로 기질로 되어있는 페닐(phenyls), 나프틸, 안트라세닐(anthracenyl), 벤조티아졸(benzothiazole), 벤족사졸(benzoxazole) 또는 벤지미다졸(benzimidazole), 파이렌(pyrene), 안트라센(anthracene), 나프탈렌(naphthalene), 아크리딘(acridine), 스틸벤(stilbene), 인돌(indole), 벤진돌(benzindole), 옥사졸(oxazole), 벤족사졸(benzoxazole), 티아졸(thiazole), 벤조티아졸(benzothiazole), 4-아미노-7-나이트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole), 시아닌(cyanine), 카르보시아닌(carbocyanine), 카르보스티릴(carbostyryl), 포르피린(porphyrins), 살리실산염(salicylate), 안트닐레이트(anthranilate), 아쥴렌(azulene), 페릴렌(perylene), 피리딘(pyridine), 퀴놀린(quinoline), 쿠마린(coumarin), 폴리아자인덴(polyazaindacene), 잔텐(xanthene), 옥사진(oxazine), 벤족사진(benzoxazine), 칼바진(carbazine), 페날레논(phenalenone), 벤즈페날레논(benzphenalenone), 칼바진(carbazine), 옥사진(oxazine), 4-보라-3에이,4에이-디아자-에스-인덴(4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene), 플루오레세인(fluorophorescein), 로다민(rhodamine), 로돌(rhodol), 5-카르복시플루오로포레세인(5-carboxyfluorophoresceins,FAM), 5-(2'-아미노에틸) 아미노나프탈렌-1-설폰산(5-(2'-aminoethyl) aminonapthalene-1-sulfonic acids (EDANS)), 안트라닐아마이드(anthranilamide), 테르븀 킬레이트(terbium chelate), 반응 레드 4(Reactive Red 4), 다비실(dabcyl), 나이트로타이로신(nitrotyrosine), 말라키트 그린(malachite green), 텍사레드(Texas red), 디나이트로벤젠(dinitrobenzene), ATTO 염료, EVO 염료, DYO 염료, Alexa 염료 및 BODIPY 염료를 포함하는 그룹으로부터 선택되어진다.
FRET 공여체 및 수용체 또는 퀀처(quencher)의 적합한 쌍의 선택은 당업자에게 달려 있다.
일반적으로, FRET는 양으로 검출되었을 때, 인체 유두종 바이러스의 핵산 분자가 부족한 샘플에서 FRET의 양이 통계적으로 다른 것은 개별적으로 인체 유두종 바이러스의 존재가 확인되는 것이다.
핵산에 프로브의 결합은 공여체와 수용체의 물질 사이에서 거리가 증가한다. 그리고 그 FRET 상호 작용이 감소된다. 검출된 방출 파장에서 변화는 퀀처(quencher)가 사용 되었을 때와 같이 다른 파장에 방출에 있어 증가할 수 있다. 선택적으로 논 퀀칭(non-quenching) 공여체가 사용되었을 때 다른 파장에서 방출에 있어 그 정도가 감소할 수 있다.
형광 분석법은 예를 들어 에피플루오레센트(epifluorescent) 현미경 시스템으로 광자(photon)를 카운팅하는 것이고, 포토멀티플라이어 시스템으로 광자(photon)를 세고, 초기 에너지 이동이 아르곤 이온 레이저, 고도의 농도(intensity) 수은(Hg) 아크 램프(arc lamp), 섬유 광학 광원(fiber optic light source), 또는 원하는 범위 내의 여기를 위해 적절히 필터링된 다른 고강도(high intensity) 광원을 사용하여 수행될 수 있다. 공여체 및 수용체의 형광 부분들은 바람직하게는 부착된 서열들 위에 프로브가 부착되는 것이다. 공여체와 형광 수용체 물질들은 바람직하게는 결합하는 서열에 있는 프로브에 부착되어진다. 공여체와 수용체 형광 부분들은 링커 암(linker arm)에 비해 적합한 올리고뉴클레오티드에 부착되어 질 수 있다. 각각의 링커의 길이 역시 중요한데, 이는 공여체 형광 부분과 수용체 형광 부분 사이에 있는 거리에 연결 팔이 영향을 줄 것이다. 현재 본 발명의 목적을 위한 링커 암의 길이는 형광 부분에 있는 뉴클레오티드 염기로부터 Angstroms(ANG)에 있는 거리가 있다. 일반적으로, 링커 암은 약 10 내지 25 ANG 이다. 링커 암은 WO 84/03285에서 기재된 종류일 수도 있다. WO 84/03285 역시 특정한 뉴클레오티드 염기들에 부착되는 링커 암을 부착시키기 위한 그리고, 또한 링커 암으로 형광 부분을 부착시키기 위한 방법들을 기재한다.
프로브는 적당한 상태에서 성적으로 전이되는 질병에 연관된 하나 또는 그 이상의 병원체나 유기체로부터의 핵산을 가지고 하이브리드 하기 위해 병원체 또는 성적으로 전이되는 질병에 관련된 뉴클레오티드를 사용하여 확인에 충분한 수준을 가져야만 한다. 만약 그것들 사이에서 이중 구조가 형성된다면 하나의 단일가닥 핵산이 다른 하나에 하이브리드 되는 것을 의미한다. 이것은 핵산이 다른 하나의 역(reverse) 또는 보완물(complement)인 서열을 포함하고 있을 때 일어난다(이 같은 배열은 게놈 안에 있는 DNA의 센스(sense) 및 안티센스(antisense)사이에서 자연적인 상호작용이 일어나고 이중 나선의 결합의 기초가 된다.) 결합하는 구역 사이에서 완전한 상보성은 이중 구조를 위해 필요하지는 않는다; 이는 유일하게 오로지 결합 조건이 사용된 상태에서 중복(이중)부위 위치를 위해 쌍을 이루는 염기쌍의 수가 충분히 필요하다. 이는 종종 프로브의 서열과 병원체의 게놈의 그것(서열)사이에서 하나 또는 그 이상의 부적당하게 짝을 이루는 것들을 가지는 것이 종종 바람직하게 일어난다.-바람직한 것이다. 이것은 프로브내에 원하지 않는 이차 구조들의 형성을 막기 위해 필요하다. 그러므로 바람직한 하나의 실시예에서 프로브 안에 있는 병원체의 유일한 서열은 병원체의 유전자 서열을 가지고 있는 이상 하나의 미스매치(mismatch)를 포함한다. 적절한 적합한 결합 상태는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 42℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS가 있다.(적당히 설득력 있는 조건을 위해) ; 그리고 68℃에서 0.1×SSC가 있다.(고도의 설득력 있는 조건을 위해). 세척은 주어진 조건 중 오직 한 가지만 사용하거나, 사용되었던 조건 중 각각을 사용하여 수행한다(예를 들어, 상기 열거된 지시에서 10-15분동안 세척한다). 세척하는데 어떤 것 혹은 전부를 반복 하게 할 수 있다. 최적의 상황들은 매우 다양할 것이고 당업자에게 실험적으로(경험적으로) 결정되어 질 수 있다.
프로브와 병원체의 핵산 사이에서 동일성의 정도는 프로브의 기능에 매우 의존할 것이다. 예를 들어 프로브는 모든 병원체의 하위 종들의 존재로가 확인될 수 있으며, 예를 들어 모든 HPV 유전자형에서 그 프로브는 HPV 유전자형들과 같은 모든 하위 종들 사이에서 고도로 보존되는 핵산의 구역에서 하나의 서열에 결합할 하나의 서열을 보유할 것이다
프로브는 HPV 유전자형들과 같은 병원체의 존재, 높은 혹은 저 위험인 유전자형들이나 다른 것들의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 그 프로브의 서열은 결국 디자인될 수 있을 것이다. 예를 들어, 프로브는 타입 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 및 73에 부착할 수 있는 고 위험 유전자형들을 검출을 위해 디자인될 수 있으나, 다른 유전자형으로부터의 핵산은 아니다. 이것들은 위험 그룹 프로브들이라 불린다.
선택적으로, 각각의 프로브는 하나의 특이적인 유전자형의 다양한 구역에 유사성의 높은 수치를 가지는 하나의 서열을 가질 수 있다. 그것은 오로지 유전자형으로부터 핵산에 결합하기 위함이다. 그러한 프로브들은 ‘유전자형 특이성’이라 불리 운다. 인체 유두종 바이러스 타입 특이적 프로브들은 결정된 유전자 특이적 범위 내에서 하이브리다이제이션할 수 있으며 바람직하게는 그것들은 증폭된 DNA상에서 서열번호: 53 내지 103을 포함하고 있다. HPV 유전자형 특이적 프로브들은 바람직하게는 서열 번호 33 내지 52 부터 서열 번호: 105 내지 117까지 선택되어진 서열을 포함한다. 이 서열들은 병원체에 유일한 서열의 전부 또는 부분을 형성한다.
프로브들의 세트는 이상 4개의 프로브들을 포함하는데, 바람직하게는 5,10,15또는 20 다른 프로브들이 있다. 프로브들은 조심스럽게 그 서열이 검출될 핵산에서 필요한 서열과 하이브리다이제이션할 뿐 아니라 그것들이 다른 프로브의 루프(loops)에서 서열을 가지고 있는 이차 구조들을 형성하므로, 스템 루프(stem loop) 구조의 “루프"(“loop")를 포함하기 위해 디자인되었다. 따라서 프로브들의 루프(loop) 부분을 위한 그 서열들은 검출된 유전자에 있는 서열에 대해 100% 상보성이 있는 서열을 꼭 존재하지는 않는다. 바람직하게는, 인체 유두종 바이러스 특이적 프로브들은 타입 특이적 영역으로 규정된 것 안에서 하이브리다이제이션을 할 수 있으며, 바람직하게는 그것들은 서열 번호: 53 내지 103 또는 서열번호: 105 내지 117을 포함하고 있다. 하나의 바람직한 실시예로 각각의 프로브들은 서열번호: 33 내지 52 또는 서열 번호: 105 내지 117에서 선택되어진 하나의 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시예로 프로브의 세트는 다음을 포함한다.
5'TET-CGGCGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAGCCG-Dabcyl-3'
5'TET-CGGCGGGACATCCATATTACTCTATCAAAGCCG-Dabcyl-3'
5'TET-CGCGGGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAACGCG-Dabcyl-3'
5'TET-CCGGCACCCATATTTCCCCCTTAAACCGG-Dabcyl-3'
5'TET-CCGGACGACCAGCAAACAAGACACCCGG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCCAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-CCGGTATCCTGCTTATTGCCACCCCGG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCCATACCTAAATCTGACAATCCGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-GCCGTTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTTCGGC-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCAAAACAAGATTCTAATAAAATAGCAGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCTTAAAGTGGGTATGAATGGTTGGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-CCGGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCCGG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCAGCACGCGTTGAGGTTTTAGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-CCGGAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCCCGG-Dabcyl-3'
5'FAM-CCCGCTGTGACTAAGGACAATACCAAACGGG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCTTCCATCAAAAGTCCCAATAACGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCAAAGGTGGTAATGGTAGACAGGGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCAATCTGGTACCAAAACAAACATCGCCG-Dabcyl-3'
5'FAM-CGGCTTAAGGTTCCTATGTCTGGGGGCCG-Dabcyl-3' 및
5'(Texas Red)-TTTTTT-플루오레세인(fluorescein))-CGGCTGACATAGATCCCCATAGACAGTTGCCG-Dabcyl-3'
특별히 위험 그룹으로부터 병원체의 존재는 두 가지 방법으로 검출 될 수 있다. 우선 “위험 그룹"(“risk-group")이 사용될 수 있다. 바람직하게는 프로브들의 세트는 하나의 타입 또는 위험 그룹 프로브들보다 더 많이 포함하며, 각 타입은 다르게 레이블되었다. 예를 들어 고 위험 그룹은 저 위험 프로브와는 구별된다. 그러므로 HPV와 같은 병원체의 존재는 위험 그룹으로부터 검출될 수 있다. 선택적으로 프로브들의 세트는 유전자 특이적인 프로브들을 포함하고 있으며, 거기에 어떤 하나의 위험 그룹에서 유전자형에 대한 모든 프로브들은 동일한 상호 작용하는 레이블들을 가지고 있는 고 위험 유전자형들이 모두 레이블화되있다.
그러므로 특이적 유전자형들의 본질은 결정 되어질 수 없으나, 어떤 그룹으로부터 유전자형의 존재는 확립될 수 있다.
바람직한 실시예에서 그 방법은 프로브라 불리는 것들 중 하나에 의해 형성된 이중 가닥 핵산 분자와 샘플에서 획득된 상보적 핵산의 녹는 점(융점)의 결정을 포함한다. 그 프로브들의 각각은 어떤 핵산 서열을 포함하고 있으며 프로브들에 의한 이중 가닥 핵산 분자의 녹는 점과 샘플에서 얻은 상보적 핵산은 각 프로브에서 유일하다. 그러므로 특이적 병원체나 유전자형은 현재 검출될 수 있다. 예를 들어 어떤 위험 그룹에 대한 유전자 특이적 프로브 세트는 만약 어떤 그 그룹으로 얻은 유전자형이 존재한다면 사용될 수 있다. 녹는 점은 특이한 유전자형들이 존재하는 확인함으로써 결정되어 질 수 있다.
HPV 타입들을 검출하는 방법은 개별적으로 그 방법이 인체 유두종 바이러스 군, 속(genera)또는 그룹(groups)나 인체 유두종 바이러스를 검출하기 위한 방법과 동일한 것으로 검출하는데 수행될 수 있다.
만약 하나의 프로브가 사용되는 것보다, 그들이 바람직하게는 하나의 다른 것과는 구별 될 수 있으며, 각 프로브는 어떤 파장에서 방출되었을 때 검출되게 다른 신호를 방출한다. 그러므로 두 개의 프로브들은 사용되는데, 하나는 수용액 안에서 두 개의 프로브들로부터 구별될 수 있는 병원체로부터 핵산을 결합할 수 있을 때(HPV 유전자형과 같은 병원체로부터 핵산으로 하이브리다이제이션되어 지지 않는다.) 그리고 다른 하나의 프로브는 병원체로부터 핵산에 결합되었을 때 프로브가 파장을 방출할 것이다. 이는 동시에 가시화되는 핵산에 결합되어진 두 프로브들의 존재를 허용한다. 대신에, 이 두 프로브들은 예를 들어 FRET 공여체와 같은 다른 상호작용을 하는 레이블들을 가지고 레이블되었으며, 이것이 다른 파장들로 여기되었다.
이것은 FRET 공여체와 수용체와 같은 상호작용하는 레이블들의 사용할 다른 조합들에 의해서 취득될 수 있다. 상호작용하는 레이블들의 적합한 조합들의 선택은 당업자에게 용이하다.
그 방법은 바람직하게는 이용 가능한 4개 또는 그 이상의 프로브들을 이용하여, 4개 또는 그 이상의 병원체들이나 유전자형의 존재를 검출한다. 바람직하게는 그 프로브들은 다른 프로브 위치들로부터 결정될 만한 프로브의 각 타입이 공간적으로 결정되는 위치를 위해 고체 상태(phase)에 붙는다. 각 프로브에 의해 생산되는 시그널을 구분하기 위한 방법을 여전히 제공하는 반면, 이는 같은 또는 유사한 파장이 사용되는 시그널을 생산하는 같거나 또는 유사한 상호작용하는 레이블로 레이블링 된 프로브를 허용한다. 선택적으로 그 프로브들은 각 프로브 유형에 의해 다른 신호들이 생산되기 위해 레이블화 될 수 있다. 기술인(당업자)은 가능한 고체 지지체 범위가 정렬된 어떤 영역에서 통상적인 용도이고 이 “기질”중 어떤 것들은 본 발명의 프로브의 산물들을 정렬한 상태에서 이용될 수 있다고 이해할 것이다.
바람직한 하나의 실시예로서 하나의 반응에서 이상 4개의 실시간(real-time) 분자 표지 프로브들을 사용하는 수 많은, 관련 있는 검출 표적을 목적으로 하는 검출을 위해 반응을 구축하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 그 방법은 프로브들에서 통상 적용되는 조건을 만족시키는 서열을 정하는데 프로브 부착 위치(결합부위)의 선택을 포함한다(프라이머3과 같은 모든 상보성에서 컴퓨터 프로그램에 대한 프로브들을 체킹하는 것) 그리고 염기들을 추가하고, 바람직하게는 4-5개의염기들, 프로브의 서열에, 말단, 상보적이기 위한 것들을 인도함(rendering)과 동일한 올리고뉴클레오티드들의 2개의 말단을 정확히 포함하는 기본적인 세포들을 형성할 가능성을 결정하는 프로브 부착 위치를 선택하는 것을 포함한다. 이 구조들은 일반적으로 4개의 스템 분자 표지이다. 게다가 프로브 서열의 녹는점은 근처 열과 냉각 비율이 평형 근처에서 측정되었을 때, 스템 구조의 녹는점보다 높아야 한다.
4개의 염-스템 분자 표지들은 통상적으로 더 긴 스템(stem)보다 짧은 on-off 수치를 가지는, 그리고 짧은 분자 표지보다 더 높은 융점을 가지고 있는 다른 템 길이 이상의 이점이 있다.
일반적으로, 프로브 혼합물의 일원들로, 어떤 결정된 타입 특이적인 영역 안에서 증폭 산물에 결합한다. 그 프로브들은 전형적으로 하나의 말단과 그리고 다른 말단에 있는 공여체 형광 부분이 레이블되었으며, 그것들은 전형적으로 수용체나 퀀처(quencher) 형광 부분에 상응하는 레이블이 되있다. 몇 가지 실시예에서, 공여체 형광 부분은 형광염료들의 특이적인 복합체를 포함하는데, 여기에는 배양 염료들이라 불리는 것들을 포함하고 있으며, 검출을 위해 유일한 형광 신호들 제공하는 프로브들의 방출 파장을 바꾸기 위함이다. 더 나아가 그 방법은 공여체 형광 부분과 수용체나 퀀처(quencher) 형광 부분 사이에서 형광 공명(reasonane) 에너지 이동(FRET)에 대한 존재, 부재나 변화를 검출하는 것을 포함한다. FRET에서 존재나 변화는 생물학적 샘플에서 인체 유두종 바이러스가 존재함을 확인하고, 반면에 FRET의 부재는 생물학적 샘플에서 인체 유두종 바이러스의 부재를 확인하는 것이다.
일반적으로, 핵산은 공여체 형광 부분에 의해 흡수된 파장에서 자극되고, 그 프로브를 가지고 하이브리다이제이션을 한다. 결합된 프로브의 존재 여부는 수용체나 퀀처(quencher) 형광 부분에 의해 방출된 파장을 가시화하고(거나) 측정함으로써 검출되었다. 선택적으로 이것은 FRET 정량에 의해 검출 할 수 있다.
바람직한 하나의 실시예로, 샘플로부터 획득한 핵산은 프로브 세트에 접촉됨으로써 증폭된 이전 프라이어이다. 바람직하게 그 증폭은 PCR을 사용하여 수행되었다. 그 증폭 반응은 PCR이며(예를 보면, U.S.Patent Nos. 4683195 와 4683202와 Innis et al, editors, PCR Protocols(Academic Press, New YOrk, 1989; Sambrook et al, Molecular Cloning, Scond Edition,(Cold Spring Harbour Laboratory, New York 1989)). PCR은 또한 RNA를 분리하고 보존하였을때 사용될 수 있는데, 바람직하게는 cDNA인 역전사인자에 의한다. 바람직하게는 PCR 은 Taq DNA polymerase, e.g. Amplitaq (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn)을 사용하여 수행한다. Taq poltmerase는 역시 Perkin Elmer, ehringer Mannheim 과 Beckman Instruments로부터 획득될 수 있다. 당량은 바람직하게는 온도안정성이 있으며 DNA polymerase 역시 Tfi(Thermus Flavus) polymerase(Gut et al, Virol. Methods 77(1):37-46(1999)). 현재 본 발명의 시험방법에 사용되었다.
선택적으로, 증폭 반응은 RT-PCR,(Yajima et al, Clin. Chem, 44(12): 2441-2445(1998); Martell et al, J. Clin. Microbiol., 37(2):327-332(1999); Gut et al, Virol.Methods 77(1):37-46(1999); Predhomme et al, Leukemia, 13(6):957-964(1999)), 그 안에 RNA는 PCR 증폭을 목적으로 한 cDNA로 역 전사된다.
잘 알려져 있다시피, PCR은 DNA(RNA)샘플의 (바람직하게는 열에 의해) 추출과 변성을 포함한다. 1몰의 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 폴리머레이즈(중합효소)를 따라 첨가되고, 열 안정성이 있는, 증폭된 서열을 형성위해 dNTPs가 첨가된다.
올리고뉴클레오티드 프라이머들은 증폭을 위해 필요한 서열 말단 반대쪽에 교차를 위해 디자인되었다. 증폭을 위한 첫 단계는 폴리머레이즈가 각각의 프라이머들을 가지고 시작하는 두 개의 “긴 산물"(“long products")을 생산하기 위한 DNA를 증폭한다. DNA 전체 질량, 그것은 두 개의 본래의 가닥들과 두 개의 긴 산물들을 포함하며, 변성이 일어나며 폴리머리제이션(polymerisation)의 두 번째 단계가 이루어진다.(예를 들어, 온도를 낮춤으로서). 두 번째 단계의 결과는 두 개의 본래 가닥들, 첫 번째 단계에서의 두 개의 긴 산물들이며, 두 개의 새로운 긴 산물들(원래 가닥들에서 생성된다), 그리고 두 개의 "짧은 산물"(“short products")
긴 산물들로부터 생성된다. 이들 짧은 산물들은 각 말단에 있는 프라이머를 가지고 있는 (sense 나 antisense)표적 서열들을 가진다. 각각 추가적인 개별적 증폭 단계 회전을 위해, 짧은 산물들의 수는 기하급수적으로 증가되며, 두 개의 추가적인 긴 산물 및 수많은 짧은 산물들을 생산하는 각각의 회전(round)은 이전 단계에 마지막에 남아있는 긴 산물 및 짧은 산물과 맞먹는다.
올리고 뉴클레오티드 프리이머들은 e.g. Ozaki et al, Nuc. Acids Res. 20: 5205-5214(1992); Agrawal et al, Nuc. Acids Res. 18:5419-5423(1990)또는 그 와 같은 접근들의 수에 의해 합성될 수 있다. 편리하게는 올리고뉴클레오티드 프로브들은 자동적인 DNA 합성자, e.g. Applied Biosystems, Inc, Foster City, California model 392 또는 394 DNA/RNA합성자-phosphoramidite chemistry와 같은 기본적인 화학들을 사용함(Beaucage 와 Iyer, Tetrahedron 48:2223-2311(1992), US Patent Nos．４９８０４６０、７２５６７７、４１５７３２、４５８０６６과 4973679)합성된다.
선택적인 화학 반응들은, 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 및 포스포라미데이트와 같은 비자연적인(인위적인) 백본(backbone) 그룹들을 포함하며, 결론인 올리고뉴클레오티드의 효율은 역으로 영향받지 아니한다. 정확한 길이와 DNA 프라이머 서열은 증폭되기 위해 표적 폴리뉴클레오티드에 의존할 것이다. 바람직하게는 그 DNA 프라이머들의 길이가 뉴클레오티드 범위가 10 내지 60이고 좀더 바람직하게는 15 내지 30 혹은 25 뉴클레오티드 범위 내에 있다.
바람직하게는, 증폭된 뉴클레오티드의 산물은 계속적으로 관찰된다. 본 발명에서 인용하는 “지속적으로 모니터되는”이라는 뜻은 증폭된 산물의 양은 보편적 기본(basis)에서 측정된다. 예를 들어 리딩(reading)은 첫 번째 증폭 사이클 후에 그리고 계속적으로 매 사이클마다 하나, 둘, 다섯 사이클이 행하여진다. 선택적으로 현재 증폭된 산물의 측량은 어떤 시간적 기간 후에 행해 질수 있고, 매 하나, 둘, 다섯 혹은 십초마다 행해진다.
이것은 “실시간(real-time)"에서 모니터되는 과정에서 허용되는 과정이다. 당업자는 어닐링, 증폭, 변성의 다양한 단계를 통한 사이클들이 통해서 부착한 프로브들에 의해 생산된 신호체계는 변동할 것이고 이를 이해할 수 있다.
FRET 기술을 가지고 있는 편리한 PCR 방법은 발명의 방법을 실행하는데 사용될 수 있다. 실시예에서, LIGHTCYCLER™ 기구와 같은 빠른 thermocycler가 사용된다. LIGHTCYCLER™ 시스템과 실시간(real-time)과 PCR의 모니터링의 발명의 상세한 설명에는 Roche's 웹사이트에서 찾아낼 수 있다. 하기 특허 출원은 LIGHTCYCLER™ . 기술에서 사용됨으로써 실시간(real-time) PCR이 기재된다: WO 97/46707, WO 97/46714 와 WO 97/46712. LIGHTCYCLER™ 기구는 마이크로볼륨 플루오르미터(microvolume fluorimeter)를 이용하는 고 질의 광학성을 가지고 있다. 이 빠른 온도 사이클 기술은 반응 용기(vessel)로서 얇은 유리 큐벳(cuvettes)을 사용한다. 반응 챔버(chamber)의 열 냉각은 변하는 열기와 주변 공기에 의해 조절된다. 큐벳의 부피 주변의 공기의 낮은 양과 고 수치 때문에 매우 빠른 온도 변화 수치가 열적(thermal) 챔버(chamber)안에서 얻을 수 있다. 그 기구는 실시간과 온라인상에서 모니터가 가능하다. 게다가, 그 큐벳은 큐벳의 팁(tip)에 있는 신호와 관련하여 신호 집합을 위한 가시적인 광학적인 요소(유리 관 광학과 유사한)로서 소용된다. 그 효과는 효율적인 마이크로볼륨 샘플의 효율적인 조명과 형광 모니터링이 있다. 큐벳을 수용하는 카루셀(carousel)은 그 기구로부터 제거된다(예를 들어, PCR Clean Room). 게다가 이 특징은 쉽게 씻겨지며 살균되면서 샘플 카루셀(carousel)을 위해 허용된다. 방출된 빛은 큐벳의 맨 위에 있는 표면 조명 렌즈에 의해 여과되고 초점이 맞추어진다. 샘플로부터 방출된 형광 빛은 그리고 나서 샘플 렌즈에 의해 초점이 맞추어 지고, 디크로닉 거울(dichronic mirror)을 통해 통과되고, 정확히 여과되며, 그리고 수집한 데이터 포토하이브리드(photohybrids)에 초점을 맞춘다. 그 기구 안에 있는 광학 단위는 바람직하게는 세 개의 밴드-패스 필터(band-pass filters, 530nm, 640nm, 710nm)를 포함하고, 6 색의 검출과 몇 가지 형광 수득 옵션을 제공한다. 현재 본 발명은, 그러나, 상업적으로 이용가능성이 있는 기구의 구성에 의해 한정 되지 않는다. 데이터 수집 선택사항들은 한번 사이클링 단계를 모니터링 할 때 마다 전적으로 녹는 곡선 분석을 위한 지속적인 단일 샘플 수득, 지속적인 샘플링(빈번한 샘플링은 샘플 수에 의존한다)과/또는 결정적인 온도 간격 후에 모든 샘플의 계단식 측정을 포함한다. 더모사이클러(thermocycler)는 바람직하게는 PC 워크스테이션을 사용해서 작동시키고, 그리고 윈도우 NT작동 시스템을 사용할 수 있다. 그 샘플로부터 신호들은 기계 위치들이 지속적/순차적으로 광학적인 단위를 넘어 얻을 수 있다. 소프트웨어는 각 측정 후에 즉시(바로) 실시간으로 형광 신호들을 진열할 수 있다. 형광 포착 시간은 10-100msec이다. 각 사이클 단계 후에, 사이클 수에 비하여 형광의 양적 진열은 모든 샘플에 대하여 지속적으로 업데이트될 수 있다.
그 데이터는 더 낳은 분석을 위해 저장될 수 있다.
바람직한 실시예에서 핵산은 서열번호 1 내지 32에서 이상 하나의 프라이머를 이용하며, 더욱 바람직하게는 사용할 서열번호 1 내지 32를 포함하고 있는 프라이머 혼합물을 사용함으로써 증폭된다.
또 하나의 바람직한 실시예로서 그 방법은 인위적이거나 자연적인 내부 대조군 DNA를 사용하는데, 바람직하게는 검출할 신호나 FRET 방출에 의해서, 검출에 사용된 파장과 상관없거나 방출의 구별 가능한 파장이, 고체 단계에 붙은 프로브들의 공간적으로 구별 가능한 위치에 대한 방출이 변화한다.
상기 기재된 상세한 방법은 좀 더 기존의 증폭 반응으로부터 감염된 핵산의 증폭을 막는 것을 포함할 수 있다. 그러한 원하지 않는 증폭의 억제는 우라실의 존재 하에 증폭하는 단계를 수행하는 것과 첫 번째 증폭 단계 전에 우라실-DNA 글리코실라제(glycosylase)를 가지고 있는 생물학적 샘플을 치료하는 것을 포함한다. 게다가, 사이클링 단계는 발췌한 대조군 샘플에서 수행 될 수 있고, 적당한 증폭 상태를 확립하기 위해 수행될 수 있다.
대조군 샘플은 인체 유두종 바이러스 분자의 부분(portion)을 포함할 수 있다. 선택적으로, 그러한 대조군 샘플은 대조군 프라이머 쌍을 사용하여 증폭할 수 있고, 그리고 대조군 프로브 쌍을 사용하여 결합할 수 있다. 대조군 증폭 산물은 만약 대조군 주형이 샘플 내에 존재한다면 그리고 그 대조 프로브들이 대조군 증폭 산물에 결합한다.
본 발명의 방법은 생물학적 샘플로부터 얻어진 핵산위에서 수행될 수 있다. 각각 생물학적 샘플들은 자궁 스크래핑(찰과, scraping), 생검(biopsies), 표본이나 파라핀 조직 절편들, 인체 유두종 바이러스 감염이 발생하는 해부학적(anatomical) 위치들의 다른 스크래핑(scraping) 및 서변(urine) 등을 포함한다. 바람직하게는 그 샘플은 기관지 흡인액(bronchial aspirates), 유린(urine), 프로스타타 마세에이트(prostata massate), 정액(ejaculatum), 혈액과 자궁 경부(cervical), 외음부(vulvar), 항문(anal), 생식기(genital), 피부(skin)나 후두부(laryngeal) 세포생물학적 샘플들, 스크래핑(scraping) 또는 생검(biopsies)에서 선택된다.
두 번째 다른 양태로서 본 발명은 이상 4개의 프로브를 포함하는 프로브 세트를 제공하는데, 상기 프로브 각각은 상보적인 염기 4쌍에 의해 병원체에서 유래한 서열에 대한 서열 상동성을 포함하고, 상기 염기들은 병원체로부터 유래한 핵산에 대한 하이브리다이제이션 없이 스템(stem) 구조를 형성하며, 상기 프로브는 첫번째 상호작용 레이블 및 두번째 상호 작용 레이블로 표지되어 상기 프로브와 상기 병원체 핵산의 하이브리다이제이션은 검출되는 신호의 변화를 일으킨다.
첫 번째 양태로서의 바람직한 실시예는 두 번째 양태에 대한 프로브에 관련한 것이다.
상기 기재에 따르면, 프로브의 “루프"(“loop") 부분 구조는 표적 유기체에서 필요한 서열을 가지고 하이브리다이제이션할 뿐 아니라 그것들이 다른 프로브들의 루프(loop) 영역을 가진 두 번째 구조들을 형태로 만들지 않기 위해서 선택되어진 서열들이다. 그러므로 본 발명의 세 번째 양태로서, 서열 번호 33 내지 52 또는 서열 번호 105 내지 117중 어느 하나를 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 이 핵산 서열들은 하나 혹은 그 이상의 HPV 유전자형의 존재를 검출하기 위한 다른 방법들에서 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 이상 하나의 HPV 유전자형의 존재 부존재를 검출하기 위해 발명의 핵산의 이용을 제공한다. 바람직하게는 핵산은 샘플로부터 얻어지는 핵산의 증폭을 지속적으로 모니터하는 방법에 사용된다.
그러한 방법들은 TAQMAN™ 기술을, 분자 스콜피온(scorpion)의 부분으로서 서열을 사용, 그리고 다른 기본적인 PCR 방법을 포함한다.
TAQMAN™ 기술은 증폭 산물의 존재나 부존재, 그리고 향후에 인체 유두종 바이러스의 존재나 부존재를 검출한다. TAQMAN™ 기술은 두 개의 형광 부분을 가진 레이블된 하나의 단일 가닥인 하이브리다이제이션 프로브를 이용한다. 첫 번째 형광 부분은 적합한 파장의 빛으로 활성화되고, 그 흡수된 에너지는 FRET의 원리에 따라 두 번째 형광 부분로 이동되어진다. 두 번째 형광 부분은 보편적으로 퀀처(quencher) 분자이다. PCR 반응의 어닐링(annealing) 단계 동안, 레이블이 부착된 결합 프로브는 표적 DNA에 부착하고 그리고 이어서 일어나는 연장 단계 동안 텍 폴리머레이즈(Taq polymerase)의 5‘에서 3‘ 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의해 감소된다. 결과적으로, 활성화 된 형광 부분과 두 번째 형광 부분은 공간적으로 다른 하나로부터 분리된다. 결과로서, 두 번째 형광 부재 속에서 첫 번째 형광 부분의 흥분된 상태에서, 첫 번째 형광 부분로부터 형광 방출은 탐지 가능하게 변화된다. 예를 들어 만일 두 번째 형광 부분이 퀀처(quencher)라면, 첫 번째 형광 부분로부터 그 형광 방출은 증가하고 그 후에 검출될 수 있다. 예의 방법에 의해, ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System (Biosystems, Foster City, Calif.에서 적용받다)는 TAQMAN™ 기술을 사용하고, 인체 유두종 바이러스 검출하기 위한 방법을 수행하기 위해 적합하다. PCR 증폭에 대한 정보와 ABI PRISM™ 7700 시스템(system)을 사용한 검출은 Applied Biosystems의 웹사이트에서 발견하였다.
본 발명의 여섯 번째 양태는 하기의 단계를 포함하는 관련된 둘 혹은 그 이상 유기체로부터 핵산을 증폭하는 프라이머 최소한의 세트를 확인하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 유기체 사이에서 30% 이상의 동일성을 가지는 프라이머 결합 위치를 확인하는 단계;
(b) (a)에서 확인된 프라이머 위치에서 증폭을 개시할 수 있는 프라이머 세트를 디자인하되, 이때 상기 프라이머 각각은 상기 유기체 하나 이상 내의 프라이머 부착 위치에서 3이하의 미스매치(mismatch)를 가지며, 상기 프라이머 각각은 상기 프라이머 각각과 4또는 그 이하의 핵산까지 다른 것인 단계, 및;
(c) 상기 유기체의 가장 큰 가능한 수를 검출하기 위해 필요한 가작 작은 수의 프라이머를 결정하는 단계.
동일 군, 속(genus) 또는 종에서 유기체로 언급된 “연관된 유기체"(“related organism")은, 그리고 유전적 유사성이 높은 것을 갖으며, 바람직하게는 이상 80% 의 동일성, 더욱 바람직하게는 이상 90%의 동일성을 갖는 것을 말한다. 관련된 유기체는 바람직하게는 바이러스들, 좀 더 바람직하게는 인체 유두종 바이러스이다. 프라이머들은 바람직하게는 인체 유두종 바이러스의 L1영역을 증폭한다.
두 핵산 서열의 퍼센트 상동성은 최상의 비교 목적을(예컨대, 서열의 최적 정렬을 위해 첫번째 서열에 틈을 만들 수 있다)위해, 상응하는 위치의 핵산들을 비교 함으로써 정해진다.
“최적 정렬"은 가장 높은 비율의 상동성을 갖도록 두 서열을 정렬하는 것이다. 퍼센트 상동성은 비교되는 서열에서 동일한 뉴클레오티드들의 수에 의해 결정된다(즉,% 상동성=동일한 위치 수/ 전체 위치 수 ×100)
두 서열들 사이에서 퍼센트 상동성을 결정하는 것은 당해 기술로 알려진 수학적 알고리즘을 사용으로 이행될 수 있다. 비교하는 두 개의 서열들의 수학적 알고리즘의 예는 Karlin과 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268의 알고리즘으로, Karlin과 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268로 수정된다.
NBLAST와 XBLAST 프로그램 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410은 그러한 알고리즘과 같이 합쳐진다. BLAST 뉴클레오티드 조사는 NBLAST 프로그램으로 수행될 수 있으며, 그 발명의 핵산 분자에 대한 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 score=100, worldlength=12 을 수행하였다.
비교 목적을 위한 공백이 있는 정렬(alignment)을 획득하기 위해 Gapped BLAST는 Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 선택적으로, PSI-Blast는 분자들(ID) 사이에서 거리가 있는 관계를 검출하기 위한 반복된 조사를 수행될 수 있다.
BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용했을 때, 개별적인 프로그램들의 측정 실패가 사용될 수 있다 (e.g., XBLAST와 NBLAST). 서열에 비하여 사용된 수학적 알고리즘의 다른 예는 Myers와 Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이다. CGC 서열 정렬(alignment) 소프트웨어 패키지의 부분이 있는 ALIGN 프로그램(버전 20.)은 알고리즘과 같이 통합되었다. 당해 기술 분야에서 알려진 서열 분석을 위한 다른 알고리즘은 Troellis 와 Robotti(1994) Comput. Appl. Biosci.,10 :3-5;에서 기재되 있는 ADVANCE와 ADAM과 Pearson 과 Lipman(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8에 기재 되어 있는 FASTA를 포함한다. FASTA에는, ktup는 그 민감성과 조사의 속도를 구성하는 조절 선택 사항이 있다.
프라이머의 최소 세트는 필요적으로 많은 관련 있는 유기체로부터 핵산 서열들을 증폭하는데 필요한 가장 최소한의 작은 프라이머들의 수를 포함하는 프라이머 세트이다. 프라이머들의 세트는 선택적으로 특히 부분적인 프라이머 부착 위치에서의 프라이머들 사이에서의 조절 프라이밍 차이들이 사용되는 정정 프라이머를 포함한다. 정정 프라이머들은 그들이 분야에서 디자인되는 프라이머 결합부위에 대한 3군데 미스매치(mismatche)보다 더 이상 보유하고 있지 아니한다. 정정 프라이머의 추가는 모든 인체 유두종 바이러스들을 검출되도록 의도된 유기체 모두에 대해 이상 두 개의 중요하거나 큰 orders에서 검출에 있어 민감성 수준을 생산하는 데 도와준다.
본 발명에서 용어 “미스매치"(“mismatch")는 프라이머 안에 있는 염기는 프라이머 결합부위에 있는 상응하는 염기가 있는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍 형태를 이루지 않는다.
미스매치(mismatch)는 형태를 이루는데 거기서 왓슨-크릭(Watson-Crick)염기 쌍 규칙 예를 들어, C-T, G-A에서 그 두 개의 상응하는 염기들은 확정하지 않는다. 바람직하게는 5‘말단 가장 가까이 있는 프라이머의 반에서 미스매치(mismatch)가 있으며, 더욱 바람직하게는 5‘ 프라이머 말단 전에 3 핵산을 형성하는 것이다.
프라이머 세트안에 있는 각각의 프라이머들은 오로지 4개 혹은 그보다 적은 뉴클레오티드들에 의한 세트에서 다른 프라이머들중 각각과 다르다. 그러므로 만약 프라이머들이 동일한 하나의 프라이머에 11 뉴클레오티드보다 길이면에서 모든 15뉴클레오티드라면, 각기 다른 프라이머들에 있는 11 뉴클레오티들은 동일하다. 그 동일한 뉴클레오티드들은 바람직하게는 계속되지 않는다.
바람직한 일 실시예에서 인체 유두종 바이러스 증폭을 위한 고도로 복잡한 중복성의 반응을 구축하기 위한 방법을 제공한다. 그 방법은 정확한 접근에서 보존된 프라이머 결합부위(70% 다양성보다 적은)를 선택하는 것을 포함한다. 그 프라이머 결합부위는 정확한 크기의 앰플리콘이 생산되는 것을 확신하기 위해 각기 다른 것(바인딩 위치)으로부터 (일정) 거리에 위치되어야만 한다. 바람직하게는 길이에 있어 30-160 뉴클레오티드들의 앰플리콘이, 더욱 바람직하게는 길이에 있어, 40-120, 50-100, 60-90 또는 70-80 뉴클레오티드들이 생산된다. 길이에 있어 130과 160 뉴클레오티드들 사이에 있는 앰플리콘들은 특히 바람직하다. 프라이머들은 발생된 앰플리콘의 부분을 형성한다. 그 프라이머들은 바람직하게는 길이에 있어 10-30 뉴클레오티드들이 있으며 더욱 바람직하게는 길이에 있어 12-25, 15-22 또는 18, 19, 20 또는 21 뉴클레오티드들이 있다. 프라이머들은 보통 프라이머(Primer3과 같은 전적인 상보성에 컴퓨터 프로그램에 대해 그 프라이머들을 체크하는 것)세트를 위한 만족할 만한 기준이 적용되는 완벽한 프라이머세트 서열이 결정된다. 그리고 프라이머들 중 가장 작은 가능한 수는, 증폭되도록 의도된 인간 파필로마 바이러스 유형과 같은 관련된 유기체 모두에 대해, 바람직하게는 프라이머의 말단, 더욱 바람직하게는 5' 말단 상에 오직 3개의 미스매치를 가지도록 디자인되었다.
게다가 프라이머들은 겨우 3개 미스매치(mismatch)를 가지는 거의 동일한 수에 부착한다. 더 나아가 증폭 차이들은 프라이머의 근접한 농도 변화에 의해 조절된다. 검출의 결론적인 민감성은 인체 유두종 바이러스 타입들과 같은, 즉 검출되게 의도한 것과 같은 모든 관련된 유기체들을 위해 두 자리 수 내에에 있는 것이 바람직하다.
이것은 최근 기술 분야를 넘어선 현저한 성취이다. 거기서 그 프라이머들의 연속적인 추가, 그리고 시도와 착오 방법들은 하기와 같다. 고안된 방법은 최소한의 경쟁에서 유지한다. 모든 표적들에 대해 정확한 프라이밍(priming) 효율성은 고도로 동등한 증폭 민감성을 보인다. 게다가 미스프라이밍(mispriming) 가능성은 바람직하게는 5‘ 말단에서 변화하는 프라이머들의 유지에 의해 감소된다.
프라이머들의 혼합은 증폭할 이상 하나의 인체 유두종 바이러스 타입 L1 영역의 가능성이 있으며, 바람직하게는 서열 번호 53 내지 103까지를 포함한다. 바람직하게는 그룹 서열 번호 1 내지 16으로부터 이상 하나의 포워드(forward) 프라이머들을, 그리고 그룹 서열 번호 17 내지 32으로부터 하나의 역 프라이머를 포함한다.
본 발명의 일곱 번째 양태로서, 서열 번호 1 내지 32로부터 선택되어진 이상 하나의 프라이머를 포함하는 제 여섯 번째 양태의 방법에 의해 얻어진 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는 서열 번호 1에서 16으로부터 이상 하나의 포워드 프라이머를 및 서열 번호 17 내지 32에서 이상 하나의 역 프라이머를 포함한다. 좀더 바람직하게는 서열 번호 1 내지 32를 포함한다.
더 나아가 본 발명의 양태는 두 번째 양태에서 결정된 프로브들의 세트를 포함하는 하나 또는 하나 이상의 병원체를 검출을 위한 키트를 제공한다. 그 키트는 바람직하게는 더 나아가 여섯 번째 양태의 방법에 따라 확인된 프라이머 세트를 포함한다.
게다가, 발명은 여섯 번째 양태의 방법에 따라 확인된 프라이머들의 세트를 포함하는 하나 혹은 그 이상의 병원체를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
바람직하게는 그 키트는 성적으로 전이되는 질병, 바람직하게는 HPV 유전자형에 연관된 하나 혹은 그 이상의 유기체를 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는 그 프로브들은 서열 번호 17 내지 33으로부터 선택된 서열을 포함한다. 프라이머들의 세트는 바람직하게는 서열 번호 1 내지 32로부터 선택된 이상 하나의 서열들을, 좀 더 바람직하게는 서열 번호 1 내지 16 그리고 서열 번호 17 내지 32에서 선택된 이상 하나의 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 프라이머의 혼합은 서열 번호 1 내지 32중 프라이머들을 포함한다.
바람직하게는 그 키트는 더 나아가 내부적 대조군을 포함한다.
그 키트 역시 생물학적 샘플에서 인체 유두종 바이러스의 존재 또는 비존재를 검출하기 위한 프라이머들의 혼합과 프로브들의 쌍들을 사용위한 기구들을 보유하는 패키지 레이블이나 패키지 삽입(insert)을 포함할 수 있다.
그 키트는 더 나아가 PCR을 위해 필요한 시료들과 같은, 다른 구성성분들을 포함한다. 그러한 시료에는 버퍼, 적합한 DNA 중합효소(DNA polymerase)와 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP와 같은dNTPs를 포함한다. 그 키트 구성성분들은 바이알들이나 다른 컨테이너(container)의 수에 나타난다. 시료는 사용하기 전에 후에 재구성을 위해 동결건조된다. 선택적으로 그 구성성분들은 사용을 위해 적합한 버퍼 용액이 제공될 수 있다. 그러한 용액은 적합한 보존제들을 포함한다.
한편 결정되지 않을지라도, 여기서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어(term)는 공통적으로 발명에 따르는 당업자에 의해 이해됨으로써 동일한 의미를 갖는다. 비록 여기서 기재된 것들의 유사 혹은 동등한 방법과 시료들이 본 발명의 시행 또는 실험에 있어 사용될 수 있을지라도 적합한 방법들 과 시료들은 하기 기재된 바와 같다. 게다가, 시료들, 방법들과 예들은 오직 예증이 될 뿐이고 한계가 있지는 않다. 여기서 언급된 모든 간행물들, 특허 출원서, 특허, 그리고 다른 참고문헌들은 전체 참고문헌에 의해 통합되었다.
불일치한 경우, 본 발명의 특정화, 결정들을 포함하여, 조절할 것이다.
본 발명은 다음에 따라 나오는 어떠한 한계를 가지지 않는 예시들을 보여준다. 다른 특징들, 목적, 그리고 발명의 이점들은 도면과 상세한 설명, 그리고 청구항들로부터 분명해 질 수 있다.
실시예
1 고 위험과 저 위험
HPV
DNA
의 실시간(
real
-
time
)
PCR
검출
전체 반응 볼륨은 20μl이며, 다음과 같은 성분들을 포함한다: HPV DNA에서 클론된 2μl(~0,2pg), 18μl polymerase buffer (최종 성분 : 90mM TRIS-HCl (pH=8,0), 1mM DTT, 50mM KCl, 7mM MgCl₂, 1% Tween-20-(SIGMA), 1% Ficoll, 1% PVP, 각각의dNTP(ATP,CTP,GTP,TTP) 250μM(Promega), 각 프라이머들 0,28μM: 서열 번호(SEQ. ID. NO):1-32, 0,18μM의 각 molecular beacons 서열번호(SEQ. ID. NO): 33 내지 52, 그리고 7,5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (ROCHE)). 그 반응은 LIGHTCYCLER™ 2.0 PCR thermal cycler에서 시행되었으며, 하기와 같은 기준을 가진다:
step1: 95℃에서 10분;
step2: 55℃에서 5분;
step3: 1-37 cycles: 95에서 30초, 42℃에서 60초-단일 검출 모드(single detection mode), 그리고 72℃에서 30초;
고 위험 HPV 유전자형은 molecular beacons 서열번호(SEQ. ID. NO): 38-51으로 검출되었다. 형광 데이터는 530nm에서 수집되었다. 저 위험 HPV 유전자형은 분자 표지(molecular beacons) 서열번호(SEQ. ID. NO): 33-37에 의해 검출되었다. 형광 데이터는 560nm로 수집되었다. 내부 반응 대조군은 분자 표지(molecular beacons) 서열번호(SEQ. ID. NO): 52에 의해서 검출되었다. 형광 데이터는 610nm에서 수집되었다.
하기에 유전자형들은 성공적으로 검출(확인)되었다: 저 위험(6, 11, 42, 43, 44/55), 고 위험(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68)및 내부 대조군 internal control.
실시예
2
HPV
16,
HPV
18과
HPV
6,
HPV
11
HPV
DNA
의 실시간(
real
-
time
)
PCR
검출
전체 반응 볼륨은 20μl이며, 다음과 같은 성분들을 포함한다: HPV DNA에서 클론된 2μl(~0,2pg), 18μl polymerase buffer (최종 성분 : 90mM TRIS-HCl (pH=8,0), 10mM DTT, 50mM KCl, 7mM MgCl₂, 1% Tween-20-(SIGMA), 1% Ficoll, 1% PVP, 각각의dNTP(ATP,CTP,GTP,TTP) 250μM(Promega), 각 프라이머들 0,28μM: 서열번호(SEQ. ID. NO):1-32, 0,18μM의 각 molecular beacons 서열번호(SEQ. ID. NO): 33,34,38,39,52, 그리고 7,5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (ROCHE)). 그 반응은 LIGHTCYCLER™ 2.0 PCR thermal cycler에서 시행되었으며, 하기와 같은 기준을 가진다:
step1: 95℃에서 10분;
step2: 55℃에서 5분;
step3: 1-37 cycles: 95에서 30초, 42℃에서 60초-single detection mode, 그리고 72℃에서 30초;
HPV 16과 HPV 18 유전자형은 분자 표지(molecular beacons) 서열번호(SEQ. ID. NO): 38-39로 검출되었다. 형광 데이터는 530nm에서 수집되었다.
HPV 6과 HPV 11 유전자형은 분자 표지(molecular beacons) 서열번호(SEQ. ID. NO): 33-34에 의해 검출되었다. 형광 데이터는 560nm로 수집되었다. 내부 반응 대조군(reaction internal control)은 molecular beacons 서열번호(SEQ. ID. NO): 52에 의해서 검출되었다. 형광 데이터는 610nm에서 수집되었다. 하기 유전자형은 성공적 으로 검출되었다: 저 위험(6,11), 고 위험(16,18) 및 내부 대조군.
부록 1
포워드 프라이머(Forward primers):
서열번호(SEQ. ID. NO):1 KP-F/1 CGCACCAACATATTTTATT
서열번호(SEQ. ID. NO):2 KP-F/2 CGCACAAGCATCTATTATTA
서열번호(SEQ. ID. NO):3 KP-F/3 CGCACAAGCATATTTTATC
서열번호(SEQ. ID. NO):4 KP-F/4 CGCACCAGTATATTTTATCA
서열번호(SEQ. ID. NO):5 KP-F/5 CGCACAAGCATTTACTATCA
서열번호(SEQ. ID. NO):6 KP-F/6 CGCACCAACTACTTTTACC
서열번호(SEQ. ID. NO):7 KP-F/7 CGTACCAGTATTTTCTACCAC
서열번호(SEQ. ID. NO):8 KP-F/8 CGCACAGGCATATATTACT
서열번호(SEQ. ID. NO):9 KP-F/9 CGCACCAACATATATTATCA
서열번호(SEQ. ID. NO):10 KP-F/10 CGTACCAACCTGTACTATTATG
서열번호(SEQ. ID. NO):11 KP-F/11 GCACCAACTTATTTTACCAT
서열번호(SEQ. ID. NO):12 KP-F/12 ACCAACCTCTTTTATTATGG
서열번호(SEQ. ID. NO):13 KP-F/13 AGCACAAATATATATTATTATGG
서열번호(SEQ. ID. NO):14 KP-F/14 CGCACCGGATATATTACT
서열번호(SEQ. ID. NO):15 KP-F/15 CGCACAAATATTTATTATTATGC
서열번호(SEQ. ID. NO):16 KP-F/16 CGGACGAATGTTTATTACC
리버스 프라이머(Reverse primers):
서열번호(SEQ. ID. NO):17 L1C2 TACCCTAAATACTCTGTATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):18 L1R2 TACCCTAAATACCCTATATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):19 R1 AATTCTAAAAACTCTGTACTG
서열번호(SEQ. ID. NO):20 R45 TACTCTAAATACTCTGTATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):21 R11 TACCTTAAACACTCTATATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):22 R16 TATTCTAAATACCCTGTATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):23 R42 AACTCTAAATACTCTGTACTG
서열번호(SEQ. ID. NO):24 R44 CATCTTAAAAACCCTATATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):25 R03 AACCCTAAACACCCTGTATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):26 R04 AACGCGAAAAACCCTATATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):27 R05 TACCCTAAAGACCCTATACTG
서열번호(SEQ. ID. NO):28 R06 AACTCTAAATACCCTATACTG
서열번호(SEQ. ID. NO):29 R07 AACGTGAAATACACGATATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):30 R08 CACACGGAACACCCTGTACTG
서열번호(SEQ. ID. NO):31 R54 CACCCTAAACACCCTATATTG
서열번호(SEQ. ID. NO):32 R85 AACCCGAAACACTCGATACTG
프로브 서열(Probe sequences)
서열번호(SEQ.ID.NO):33 HPV6B3: GGGTCATCCTTATTTTTCCATAA
서열번호(SEQ.ID.NO):34 HPV11B2: GGGACATCCATATTACTCTATCAAA
서열번호(SEQ.ID.NO):35 HPV42B2: GGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAA
서열번호(SEQ.ID.NO):36 HPV43B2: CACCCATATTTCCCCCTTAAA
서열번호(SEQ.ID.NO):37 HPV44/55B2: ACGACCAGCAAACAAGACAC
서열번호(SEQ.ID.NO):38 HPV16B5: CAATAACAAAATATTAGTTCCTAAA
서열번호(SEQ.ID.NO):39 HPV18B8: TATCCTGCTTATTGCCACC
서열번호(SEQ.ID.NO):40 HPV31B5: CATACCTAAATCTGACAATCC
서열번호(SEQ.ID.NO):41 HPV33B7: TTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTT
서열번호(SEQ.ID.NO):42 HPV35B2: AAAACAAGATTCTAATAAAATAGCA
서열번호(SEQ.ID.NO):43 HPV39B3: TTAAAGTGGGTATGAATGGTTG
서열번호(SEQ.ID.NO):44 HPV45B3: GCTGTTCCTAAGGTATCCG
서열번호(SEQ.ID.NO):45 HPV51B2: AGCACGCGTTGAGGTTTTA
서열번호(SEQ.ID.NO):46 HPV52B2: AGTTTTAGTTCCCAAGGTGTC
서열번호(SEQ.ID.NO):47 HPV56B2: CTGTGACTAAGGACAATACCAAA
서열번호(SEQ.ID.NO):48 HPV58B2: TTCCATCAAAAGTCCCAATAAC
서열번호(SEQ.ID.NO):49 HPV59B2: AAAGGTGGTAATGGTAGACAGG
서열번호(SEQ.ID.NO):50 HPV66B2: AATCTGGTACCAAAACAAACATC
서열번호(SEQ.ID.NO):51 HPV68B2: TTAAGGTTCCTATGTCTGGGG
서열번호(SEQ.ID.NO):52 HPV-ICB2: TGACATAGATCCCCATAGACAGTT
서열번호(SEQ.ID.NO):53
>Hpv2a
cgga ctaatgtgta ttaccatggt ggcagttcta ggcttctcac tgtgggtcat ccatattact ctataaagaa gagtaataat aaggtggctg tgcccaaggt atctgggtac caatatcgtg tatttcacgt g
서열번호(SEQ.ID.NO):54
>HPV3
cgc accaacattt attattatgc aggcagttct cgcttgctga ccgtgggtca tccttatttt gctatcccca aatcttctaa ttccaagatg gatattccta aggtgtccgc ctttcaatat agagtgttta gggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):55
>HPV6
cgcacca acatatttta tcatgccagc agttctagac ttcttgcagt gggtcatcct tatttttcca taaaacgggc taacaaaact gttgtgccaa aggtgtcagg atatcaatac agggtattta
aggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):56
>hpv11
cgcacc aacatatttt atcatgccag cagttctaga ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag ttaacaaaac agttgtacca aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggta
서열번호(SEQ.ID.NO):57
>HPV13
cgtac caacatattt tatcatgcta gcagttctag actacttgca gtgggaaatc cttattttcc tattaagaaa caaaacaaaa ctgttgtccc taaggtatct ggttatcagt ttagggtatt taaagtt
서열번호(SEQ.ID.NO):58
>HPV16
cgcacaa acatatatta tcatgcagga acatccagac tacttgcagt tggacatccc tattttccta ttaaaaaacc taacaataac aaaatattag ttcctaaagt atcaggatta caatacaggg tatttagaat a
서열번호(SEQ.ID.NO):59
>HPV18
c ccacaagcat attttatcat gctggcagct ctagattatt aactgttggt aatccatatt ttagggttcc tgcaggtggt ggcaataagc aggatattcc taaggtttct gcataccaat atagagtatt tagggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):60
>HPV26
cgcacc ggcatatatt attatgcggg cagctctcgt ttattaacat taggacatcc atatttttcc atacctaaaa ctggccaaaa ggccgaaatt cctaaggtat ctgcctatca gtacagggta tttagagtg
서열번호(SEQ.ID.NO):61
>HPV27
cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa taccgtgtat ttcacgtt
서열번호(SEQ.ID.NO):62
>HPV28
cgca ccaatattta ttattatgca ggcacttctc ggttgctgac cgtgggtcat ccttattttc ccattcctaa atcatccact aacaaagcag atgtgcccaa agtgtccgcc tttcagtata gggtattccg ggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):63
>HPV29
c gcacaaatat ttattattat gcaggcagtt ctcgcctgct cactgtgggt catccacatt attcaattcc caaatcctct ggtaataagg tagatgtgcc taaggtgtct gcatttcagt acagggtttt ccgtgtg
서열번호(SEQ.ID.NO):64
>HPV30
cg caccaatata ttttatcatg caggcagctc acgtttgctt gctgttggac atccatatta ttctatttct aaggctggta attccaaaac agatgttccc aaggtgtctg catttcagta tagggtcttt agggtc
서열번호(SEQ.ID.NO):65
>HPV31
cg aaccaacata tattatcacg caggcagtgc taggctgctt acagtaggcc atccatatta
ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta ccaaaggtgt caggattaca atatagggta tttagggtt
서열번호(SEQ.ID.NO):66
>HPV33
cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat ttttctatta aaatcctac taacgctaaa aaattattgg tacccaaagt atcaggcttg caatataggg tttttagggt c
서열번호(SEQ.ID.NO):67
>HPV34
cg cacaaatata tattattatg caggtagtac acgcttgctg gcagtaggac atccctatta tcctataaag gatactaatg ggaaacgtaa gattgctgta cctaaagttt caggtttgca atacagggta tttagaata
서열번호(SEQ.ID.NO):68
>HPV35
cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa tacagagtat ttagagt
서열번호(SEQ.ID.NO):69
>HPV39
c gcacaggcat atattattat gctggcagct ctagattatt aacagtagga catccatatt ttaaagtggg tatgaatggt ggtcgcaagc aggacattcc aaaggtgtct gcatatcaat atagggtatt tcgcgtg
서열번호(SEQ.ID.NO):70
>HPV40
cgcaccag tttatattat catgctggta gtgccaggtt actgactata ggacatccat actttgagtt aaaaaaaccc aatggtgaca tttcagtgcc taaggtttct ggacatcaat acagggtatt tagggta
서열번호(SEQ.ID.NO):71
>HPV42
cgcacca actactttta ccatgccagc agttctaggc tattggttgt tggtcaccct tattactcta ttacaaaaag gccaaataag acatctatcc ccaaagtgtc tggtttacag tacagagtat ttagagtt
서열번호(SEQ.ID.NO):72
>HPV43
cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac agagtattta gagtt
서열번호(SEQ.ID.NO):73
>HPV44
cgc accaacatat attaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtgggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaggttt cgggatttca atatagggtt tttaagatg
서열번호(SEQ.ID.NO):74
>HPV45
cgcaca agcatatttt atcatgcagg cagttcccga ttattaactg taggcaatcc atattttagg
gttgtaccta atggtgcagg taataaacag gctgttccta aggtatccgc atatcagtat agggtgttta gagta
서열번호(SEQ.ID.NO):75
>HPV51
cgc accggcatat attactatgc aggcagttcc agactaataa cattaggaca tccctatttt ccaataccta aaacctcaac gcgtgctgct attcctaaag tatctgcatt tcaatacagg gtatttaggg ta
서열번호(SEQ.ID.NO):76
>HPV52
c gcacaagcat ctattattat gcaggcagtt ctcgattact aacagtagga catccctatt tttctattaa aaacaccagt agtggtaatg gtaaaaaagt tttagttccc aaggtgtctg gcctgcaata cagggtattt agaatt
서열번호(SEQ.ID.NO):77
>HPV53
cgcaccact atattttatc atgctggaag ctctcgcttg cttaccgtgg gacatcctta ttaccccatt tctaaatctg gtaaagcaga catccctaag gtgtctgcat ttcagtatag ggtgtttaga gta
서열번호(SEQ.ID.NO):78
>HPV54
cgcaca agcatatact atcatgcaag cagctctaga ttattggctg ttggacatcc atattttaaa
gtacaaaaaa ccaataataa gcaaagtatt cctaaagtat caggatatca atatagggtg tttagggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):79
>HPV55
cgc accaacatag tttaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtaggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaagttt caggatttca atatagggtt tttaaggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):80
>HPV56
cgcacta gtatatttta tcatgcaggc agttcacgat tgcttgccgt aggacatccc tattactctg tgactaagga caataccaaa acaaacattc ccaaagttag tgcatatcaa tatagggtat ttagggta
서열번호(SEQ.ID.NO):81>HPV57
cgg acgaatgttt attatcatgg tgggagctct cggctcctca cagtaggcca tccatattat tctataaaaa aaagtggcaa taataaggtg tctgtgccca aggtatcggg ctaccagtac cgtgtgttcc atgtg
서열번호(SEQ.ID.NO):82
>HPV58
c gcacaagcat ttattattat gctggcagtt ccagactttt ggctgttggc aatccatatt tttccatcaa aagtcccaat aacaataaaa aagtattagt tcccaaggta tcaggcttac agtatagggt ctttagggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):83
>HPV59
cgtaccag tattttctac cacgcaggca gttccagact tcttacagtt ggacatccat attttaaagt
acctaaaggt ggtaatggta gacaggatgt tcctaaggtg tctgcatatc aatacagagt atttagggtt
서열번호(SEQ.ID.NO):84
>HPV61
cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc tatcaatata gggtgtttag ggta
서열번호(SEQ.ID.NO):85
>HPV62
cgcacca acctttttta ttatgggggc agctcccgcc ttcttactgt gggacatcca tattgtactt tacaggttgg ccagggtaaa cgggccacca ttcctaaggt gtctgggtat cagtacaggg tgtttcgtgt
g
서열번호(SEQ.ID.NO):86
>HPV66
cgtacca gtatatttta tcatgcaggt agctctaggt tgcttgctgt tggccatcct tattactctg tttccaaatc tggtaccaaa acaaacatcc ctaaagttag tgcatatcag tatagagtgt ttagggta
서열번호(SEQ.ID.NO):87
>HPV67
cgcacaag catttactat tacgctggta gctccagact tttagctgta ggccatcctt acttttccat tcctaatccc tccaacacta aaaaggtgtt agtgcccaag gtgtcaggtt tgcagtatag ggtatttagg gtt
서열번호(SEQ.ID.NO):88
>HPV68
cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat tttaaggttc ctatgtctgg gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa tacagagtgt ttagggtt
서열번호(SEQ.ID.NO):89
>HPV69
cgcac cggatatatt actatgcagg cagctctcga ttattaactt tgggtcatcc ctattttcca attcctaaat ctggttcaac agcagaaatt cctaaagtgt ctgcttacca atatagggtt tttcgtgtt
서열번호(SEQ.ID.NO):90
>HPV70
cgta caggcatata ttattatgct ggaagctctc gcttattaac agtagggcat ccttatttta aggtacctgt aaatggtggc cgcaagcagg aaatacctaa ggtgtctgca tatcagtata gggtatttag ggta
서열번호(SEQ.ID.NO):91
>HPV72
cgcacca acctctatta ttatggtggc agttctcgtc tactaactgt aggacatcct tactgtgcca tacctctcaa cggacagggc aaaaaaaaca ccattcctaa ggtttcgggg tatcaataca gggtgtttag agta
서열번호(SEQ.ID.NO):92
>HPV73
agaaca aatatatatt attatgcagg tagcacacgt ttgttggctg tgggacaccc atattttcct atcaaggatt ctcaaaaacg taaaaccata gttcctaaag tttcaggttt gcaatacagg gtgtttaggc tt
서열번호(SEQ.ID.NO):93
>HPV74
cgcacc aacatctttt atcatgctag cagttctaga ctacttgctg taggaaatcc ctatttccct ataaaacagg ttaacaaaac agttgttcct aaagtgtctg gatatcaatt tagggtgttt aaggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):94
>HPV81
cgcacc aacctttttt attatggggg cagttcccgc cttcttactg tagggcatcc atattgtaca ttaactattg gtacccaagg aaagcgttcc actattccca aggtgtctgg gtatcagtac cgggtgtttc gtgtg
서열번호(SEQ.ID.NO):95
>HPV82
cgc accggcatat attattatgc aggcagttcc agacttatta ccttaggaca tccatatttt tcaataccca aaaccaatac acgtgctgaa atacctaagg tatctgcctt tcagtatagg gtgtttaggg ta
서열번호(SEQ.ID.NO):96
>HPV83
cg caccaacctc ttttattacg gtggcagctc cagacttctt accgtaggac atccatatta tcctgtacag gttaatggtc aaggaaaaaa agccactatc cccaaggttt ctggctacca atatagggtg tttcgcatt
서열번호(SEQ.ID.NO):97
>HPV84
cgcaccaac ttattttatt atggtggtag ttctcgcctg cttactgtgg gacatccata ttattctgtt cctgtgtcta cccctgggca aaacaacaaa aaggccacta tccccaaggt ttctgggtat caatacaggg tgtttagggt c
서열번호(SEQ.ID.NO):98
>HPV85
cgta ccagtacatt ttatcatgct ggcagctcta ggcttctaac cgttggacat ccatactata aagttacctc aaatggaggc cgcaagcaag acattcctaa agtgtctgcc tatcagtatc gagtgtttcg ggtt
서열번호(SEQ.ID.NO):99
>HPV86
cgtaccaac ctattttatt atggtggtag ttcccgcttg cttactgtgg gccatccata ttatcctgtt actgtttcct ccagccctgg acaaaacaac aaaaaggcca atattcccaa ggtttcgggg tatcaataca
gggtttttag ggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):100
>HPV87
cgcaccaac ttattttatt atggtggcag ttctcgcctg cttactgtgg gtcaccctta ctatccagtt actgttacca cccctggtca gaacaagaaa tccaatattc caaaggtgtc tggctatcag tacagggtgt ttcgggtg
서열번호(SEQ.ID.NO):101
>HPV89
cgtaccaac ctgtactatt atggaggcag ctcccgcctt attacagttg gccaccctta ttatactgta caggtcaatg gtgctaacaa aaaggccaac atacctaagg tatcagggta tcaatacagg gtatttaggg ta
서열번호(SEQ.ID.NO):102
>HPV90
agaacaaacata tattattatg caggcagttc ccgactgtta actgttggcc atccttattt tgctatcaaa aagcaatcag gaaaaaaccc tatagtggtt cccaaggtgt ctggatatca atatagggtg tttagggta
서열번호(SEQ.ID.NO):103
>HPV91
cgcacc aacttatttt accatgctgg cagttcccgt ttactggctg tgggccaccc tttttttcct ataaaaaata attctggtaa agtaattgtt cctaaagttt caggtcacca atatagggtg tttagagtt
서열번호(SEQ.ID.NO):104
HPV-IC
CGGACGAATGTTTATTACCagatagatagagatagatacccatatacagataatgacatagatccccatagacagtttatacagatcagtagcagtttttatatatgagatgatgatagcaatacagagtatttagggta
서열번호(SEQ.ID.NO):105 HPV11B3/2: AAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTG
서열번호(SEQ.ID.NO):106 HPV42B1: CAAAAAGGCCAAATAAGACA
서열번호(SEQ.ID.NO):107 HPV43B6: CCCCCTTAAAAATTCCTCT
서열번호(SEQ.ID.NO):108 HPV44/55B1 ATACGACCAGCAAACAAGAC
서열번호(SEQ.ID.NO):109 HPV39B4: TATGAATGGTGGTCGCAAG
서열번호(SEQ.ID.NO):110 HPV52B7: AAAACACCAGTAGTGCTAATG
서열번호(SEQ.ID.NO):111 HPV56B3: CCAAAACAAACATTCCCAA
서열번호(SEQ.ID.NO):112 HPV59B3: ATCCATATTTTAAAGTACCTAAAG
서열번호(SEQ.ID.NO):113 HPV66B1: CAAATCTGGTACCAAAACAAA
서열번호(SEQ.ID.NO):114 HPV-ICB4: CCCATAGACAGTTTATACAGATCA
서열번호(SEQ.ID.NO):115 HPV6B6: ATAAAACGGGCTAACAAAA
서열번호(SEQ.ID.NO):116 HPV26B1: TACCTAAAACTGGCCAAAAG
서열번호(SEQ.ID.NO):117 HPV35B4 : ATTCTAATAAAATAGCAGTACCCAAG
본 발명은 특히 성적으로 전이되는 질병에 연관된 유기체를 위한 진단에 관련된 것이다. 그리고 좀 더 특별하게는 인체 유두종 바이러스 유전자형의 검출을 위한 것이며, 특히 생식기 파필로마바이러스의 유전자형을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 인체 유두종 바이러스 검출에 매우 효과적이다.
<110> Genoid Kft
Jeney, Csaba
Hart, Deborah M
Takacs, Tibor
<120> Method
<130> P38434WO
<150> US 60/737006
<151> 2005-11-15
<150> GB 0523250.9
<151> 2005-11-15
<160> 117
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 1
cgcaccaaca tattttatt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
cgcacaagca tctattatta 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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cgcacaagca tattttatc 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
cgcaccagta tattttatca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 5
cgcacaagca tttactatca 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 6
cgcaccaact acttttacc 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 7
cgtaccagta ttttctacca c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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cgcacaggca tatattact 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
cgcaccaaca tatattatca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 10
cgtaccaacc tgtactatta tg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
gcaccaactt attttaccat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
accaacctct tttattatgg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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agcacaaata tatattatta tgg 23
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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cgcaccggat atattact 18
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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cgcacaaata tttattatta tgc 23
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 16
cggacgaatg tttattacc 19
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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taccctaaat actctgtatt g 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 18
taccctaaat accctatatt g 21
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<213> Artificial Sequence
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aattctaaaa actctgtact g 21
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<213> Artificial Sequence
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tactctaaat actctgtatt g 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 21
taccttaaac actctatatt g 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 22
tattctaaat accctgtatt g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 23
aactctaaat actctgtact g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 24
catcttaaaa accctatatt g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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aaccctaaac accctgtatt g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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aacgcgaaaa accctatatt g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 27
taccctaaag accctatact g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 28
aactctaaat accctatact g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 29
aacgtgaaat acacgatatt g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 30
cacacggaac accctgtact g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 31
caccctaaac accctatatt g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 32
aacccgaaac actcgatact g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Probe
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<223> Probe
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<223> Probe
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ggtcaccctt attactctat tacaaaa 27
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<223> Probe
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cacccatatt tcccccttaa a 21
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<223> Probe
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acgaccagca aacaagacac 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Probe
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<213> Artificial Sequence
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<223> Probe
<400> 39
tatcctgctt attgccacc 19
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<212> DNA
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<223> Probe
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catacctaaa tctgacaatc c 21
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<223> Probe
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aaaacaagat tctaataaaa tagca 25
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<223> Probe
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ttaaagtggg tatgaatggt tg 22
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<223> Probe
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gctgttccta aggtatccg 19
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<223> Probe
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<223> Probe
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agttttagtt cccaaggtgt c 21
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<223> Probe
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ctgtgactaa ggacaatacc aaa 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 48
ttccatcaaa agtcccaata ac 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 49
aaaggtggta atggtagaca gg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 50
aatctggtac caaaacaaac atc 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 51
ttaaggttcc tatgtctggg g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 52
tgacatagat ccccatagac agtt 24
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<212> DNA
<213> Hpv2a
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cggactaatg tgtattacca tggtggcagt tctaggcttc tcactgtggg tcatccatat 60
tactctataa agaagagtaa taataaggtg gctgtgccca aggtatctgg gtaccaatat 120
cgtgtatttc acgtg 135
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<212> DNA
<213> HPV3.
<400> 54
cgcaccaaca tttattatta tgcaggcagt tctcgcttgc tgaccgtggg tcatccttat 60
tttgctatcc ccaaatcttc taattccaag atggatattc ctaaggtgtc cgcctttcaa 120
tatagagtgt ttagggtg 138
<210> 55
<211> 132
<212> DNA
<213> HPV6
<400> 55
cgcaccaaca tattttatca tgccagcagt tctagacttc ttgcagtggg tcatccttat 60
ttttccataa aacgggctaa caaaactgtt gtgccaaagg tgtcaggata tcaatacagg 120
gtatttaagg tg 132
<210> 56
<211> 132
<212> DNA
<213> hpv11
<400> 56
cgcaccaaca tattttatca tgccagcagt tctagactcc ttgctgtggg acatccatat 60
tactctatca aaaaagttaa caaaacagtt gtaccaaagg tgtctggata tcaatataga 120
gtgtttaagg ta 132
<210> 57
<211> 132
<212> DNA
<213> HPV13
<400> 57
cgtaccaaca tattttatca tgctagcagt tctagactac ttgcagtggg aaatccttat 60
tttcctatta agaaacaaaa caaaactgtt gtccctaagg tatctggtta tcagtttagg 120
gtatttaaag tt 132
<210> 58
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV16
<400> 58
cgcacaaaca tatattatca tgcaggaaca tccagactac ttgcagttgg acatccctat 60
tttcctatta aaaaacctaa caataacaaa atattagttc ctaaagtatc aggattacaa 120
tacagggtat ttagaata 138
<210> 59
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV18
<400> 59
cccacaagca tattttatca tgctggcagc tctagattat taactgttgg taatccatat 60
tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa 120
tatagagtat ttagggtg 138
<210> 60
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV26
<400> 60
cgcaccggca tatattatta tgcgggcagc tctcgtttat taacattagg acatccatat 60
ttttccatac ctaaaactgg ccaaaaggcc gaaattccta aggtatctgc ctatcagtac 120
agggtattta gagtg 135
<210> 61
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV27
<400> 61
cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat 60
tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa 120
taccgtgtat ttcacgtt 138
<210> 62
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV28
<400> 62
cgcaccaata tttattatta tgcaggcact tctcggttgc tgaccgtggg tcatccttat 60
tttcccattc ctaaatcatc cactaacaaa gcagatgtgc ccaaagtgtc cgcctttcag 120
tatagggtat tccgggtg 138
<210> 63
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV29
<400> 63
cgcacaaata tttattatta tgcaggcagt tctcgcctgc tcactgtggg tcatccacat 60
tattcaattc ccaaatcctc tggtaataag gtagatgtgc ctaaggtgtc tgcatttcag 120
tacagggttt tccgtgtg 138
<210> 64
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV30
<400> 64
cgcaccaata tattttatca tgcaggcagc tcacgtttgc ttgctgttgg acatccatat 60
tattctattt ctaaggctgg taattccaaa acagatgttc ccaaggtgtc tgcatttcag 120
tatagggtct ttagggtc 138
<210> 65
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV31
<400> 65
cgaaccaaca tatattatca cgcaggcagt gctaggctgc ttacagtagg ccatccatat 60
tattccatac ctaaatctga caatcctaaa aaaatagttg taccaaaggt gtcaggatta 120
caatataggg tatttagggt t 141
<210> 66
<211> 140
<212> DNA
<213> HPV33
<400> 66
cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat 60
ttttctatta aaatcctact aacgctaaaa aattattggt acccaaagta tcaggcttgc 120
aatatagggt ttttagggtc 140
<210> 67
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV34
<400> 67
cgcacaaata tatattatta tgcaggtagt acacgcttgc tggcagtagg acatccctat 60
tatcctataa aggatactaa tgggaaacgt aagattgctg tacctaaagt ttcaggtttg 120
caatacaggg tatttagaat a 141
<210> 68
<211> 137
<212> DNA
<213> HPV35
<400> 68
cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac 60
tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa 120
tacagagtat ttagagt 137
<210> 69
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV39
<400> 69
cgcacaggca tatattatta tgctggcagc tctagattat taacagtagg acatccatat 60
tttaaagtgg gtatgaatgg tggtcgcaag caggacattc caaaggtgtc tgcatatcaa 120
tatagggtat ttcgcgtg 138
<210> 70
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV40
<400> 70
cgcaccagtt tatattatca tgctggtagt gccaggttac tgactatagg acatccatac 60
tttgagttaa aaaaacccaa tggtgacatt tcagtgccta aggtttctgg acatcaatac 120
agggtattta gggta 135
<210> 71
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV42
<400> 71
cgcaccaact acttttacca tgccagcagt tctaggctat tggttgttgg tcacccttat 60
tactctatta caaaaaggcc aaataagaca tctatcccca aagtgtctgg tttacagtac 120
agagtattta gagtt 135
<210> 72
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV43
<400> 72
cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat 60
ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac 120
agagtattta gagtt 135
<210> 73
<211> 132
<212> DNA
<213> HPV44
<400> 73
cgcaccaaca tatattacca tgctagcagt tctagacttc ttgctgtggg caacccttat 60
tttgccatac gaccagcaaa caagacactt gtgcctaagg tttcgggatt tcaatatagg 120
gtttttaaga tg 132
<210> 74
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV45
<400> 74
cgcacaagca tattttatca tgcaggcagt tcccgattat taactgtagg caatccatat 60
tttagggttg tacctaatgg tgcaggtaat aaacaggctg ttcctaaggt atccgcatat 120
cagtataggg tgtttagagt a 141
<210> 75
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV51
<400> 75
cgcaccggca tatattacta tgcaggcagt tccagactaa taacattagg acatccctat 60
tttccaatac ctaaaacctc aacgcgtgct gctattccta aagtatctgc atttcaatac 120
agggtattta gggta 135
<210> 76
<211> 147
<212> DNA
<213> HPV52
<400> 76
cgcacaagca tctattatta tgcaggcagt tctcgattac taacagtagg acatccctat 60
ttttctatta aaaacaccag tagtggtaat ggtaaaaaag ttttagttcc caaggtgtct 120
ggcctgcaat acagggtatt tagaatt 147
<210> 77
<211> 132
<212> DNA
<213> HPV53
<400> 77
cgcaccacta tattttatca tgctggaagc tctcgcttgc ttaccgtggg acatccttat 60
taccccattt ctaaatctgg taaagcagac atccctaagg tgtctgcatt tcagtatagg 120
gtgtttagag ta 132
<210> 78
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV54
<400> 78
cgcacaagca tatactatca tgcaagcagc tctagattat tggctgttgg acatccatat 60
tttaaagtac aaaaaaccaa taataagcaa agtattccta aagtatcagg atatcaatat 120
agggtgttta gggtg 135
<210> 79
<211> 132
<212> DNA
<213> HPV55
<400> 79
cgcaccaaca tagtttacca tgctagcagt tctagacttc ttgctgtagg caacccttat 60
tttgccatac gaccagcaaa caagacactt gtgcctaaag tttcaggatt tcaatatagg 120
gtttttaagg tg 132
<210> 80
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV56
<400> 80
cgcactagta tattttatca tgcaggcagt tcacgattgc ttgccgtagg acatccctat 60
tactctgtga ctaaggacaa taccaaaaca aacattccca aagttagtgc atatcaatat 120
agggtattta gggta 135
<210> 81
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV57
<400> 81
cggacgaatg tttattatca tggtgggagc tctcggctcc tcacagtagg ccatccatat 60
tattctataa aaaaaagtgg caataataag gtgtctgtgc ccaaggtatc gggctaccag 120
taccgtgtgt tccatgtg 138
<210> 82
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV58
<400> 82
cgcacaagca tttattatta tgctggcagt tccagacttt tggctgttgg caatccatat 60
ttttccatca aaagtcccaa taacaataaa aaagtattag ttcccaaggt atcaggctta 120
cagtataggg tctttagggt g 141
<210> 83
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV59
<400> 83
cgtaccagta ttttctacca cgcaggcagt tccagacttc ttacagttgg acatccatat 60
tttaaagtac ctaaaggtgg taatggtaga caggatgttc ctaaggtgtc tgcatatcaa 120
tacagagtat ttagggtt 138
<210> 84
<211> 144
<212> DNA
<213> HPV61
<400> 84
cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat 60
tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc 120
tatcaatata gggtgtttag ggta 144
<210> 85
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV62
<400> 85
cgcaccaacc ttttttatta tgggggcagc tcccgccttc ttactgtggg acatccatat 60
tgtactttac aggttggcca gggtaaacgg gccaccattc ctaaggtgtc tgggtatcag 120
tacagggtgt ttcgtgtg 138
<210> 86
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV66
<400> 86
cgtaccagta tattttatca tgcaggtagc tctaggttgc ttgctgttgg ccatccttat 60
tactctgttt ccaaatctgg taccaaaaca aacatcccta aagttagtgc atatcagtat 120
agagtgttta gggta 135
<210> 87
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV67
<400> 87
cgcacaagca tttactatta cgctggtagc tccagacttt tagctgtagg ccatccttac 60
ttttccattc ctaatccctc caacactaaa aaggtgttag tgcccaaggt gtcaggtttg 120
cagtataggg tatttagggt t 141
<210> 88
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV68
<400> 88
cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat 60
tttaaggttc ctatgtctgg gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa 120
tacagagtgt ttagggtt 138
<210> 89
<211> 134
<212> DNA
<213> HPV69
<400> 89
cgcaccggat atattactat gcaggcagct ctcgattatt aactttgggt catccctatt 60
ttccaattcc taaatctggt tcaacagcag aaattcctaa agtgtctgct taccaatata 120
gggtttttcg tgtt 134
<210> 90
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV70
<400> 90
cgtacaggca tatattatta tgctggaagc tctcgcttat taacagtagg gcatccttat 60
tttaaggtac ctgtaaatgg tggccgcaag caggaaatac ctaaggtgtc tgcatatcag 120
tatagggtat ttagggta 138
<210> 91
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV72
<400> 91
cgcaccaacc tctattatta tggtggcagt tctcgtctac taactgtagg acatccttac 60
tgtgccatac ctctcaacgg acagggcaaa aaaaacacca ttcctaaggt ttcggggtat 120
caatacaggg tgtttagagt a 141
<210> 92
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV73
<400> 92
agaacaaata tatattatta tgcaggtagc acacgtttgt tggctgtggg acacccatat 60
tttcctatca aggattctca aaaacgtaaa accatagttc ctaaagtttc aggtttgcaa 120
tacagggtgt ttaggctt 138
<210> 93
<211> 132
<212> DNA
<213> HPV74
<400> 93
cgcaccaaca tcttttatca tgctagcagt tctagactac ttgctgtagg aaatccctat 60
ttccctataa aacaggttaa caaaacagtt gttcctaaag tgtctggata tcaatttagg 120
gtgtttaagg tg 132
<210> 94
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV81
<400> 94
cgcaccaacc ttttttatta tgggggcagt tcccgccttc ttactgtagg gcatccatat 60
tgtacattaa ctattggtac ccaaggaaag cgttccacta ttcccaaggt gtctgggtat 120
cagtaccggg tgtttcgtgt g 141
<210> 95
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV82
<400> 95
cgcaccggca tatattatta tgcaggcagt tccagactta ttaccttagg acatccatat 60
ttttcaatac ccaaaaccaa tacacgtgct gaaataccta aggtatctgc ctttcagtat 120
agggtgttta gggta 135
<210> 96
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV83
<400> 96
cgcaccaacc tcttttatta cggtggcagc tccagacttc ttaccgtagg acatccatat 60
tatcctgtac aggttaatgg tcaaggaaaa aaagccacta tccccaaggt ttctggctac 120
caatataggg tgtttcgcat t 141
<210> 97
<211> 150
<212> DNA
<213> HPV84
<400> 97
cgcaccaact tattttatta tggtggtagt tctcgcctgc ttactgtggg acatccatat 60
tattctgttc ctgtgtctac ccctgggcaa aacaacaaaa aggccactat ccccaaggtt 120
tctgggtatc aatacagggt gtttagggtc 150
<210> 98
<211> 138
<212> DNA
<213> HPV85
<400> 98
cgtaccagta cattttatca tgctggcagc tctaggcttc taaccgttgg acatccatac 60
tataaagtta cctcaaatgg aggccgcaag caagacattc ctaaagtgtc tgcctatcag 120
tatcgagtgt ttcgggtt 138
<210> 99
<211> 153
<212> DNA
<213> HPV86
<400> 99
cgtaccaacc tattttatta tggtggtagt tcccgcttgc ttactgtggg ccatccatat 60
tatcctgtta ctgtttcctc cagccctgga caaaacaaca aaaaggccaa tattcccaag 120
gtttcggggt atcaatacag ggtttttagg gtg 153
<210> 100
<211> 147
<212> DNA
<213> HPV87
<400> 100
cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tctcgcctgc ttactgtggg tcacccttac 60
tatccagtta ctgttaccac ccctggtcag aacaagaaat ccaatattcc aaaggtgtct 120
ggctatcagt acagggtgtt tcgggtg 147
<210> 101
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV89
<400> 101
cgtaccaacc tgtactatta tggaggcagc tcccgcctta ttacagttgg ccacccttat 60
tatactgtac aggtcaatgg tgctaacaaa aaggccaaca tacctaaggt atcagggtat 120
caatacaggg tatttagggt a 141
<210> 102
<211> 141
<212> DNA
<213> HPV90
<400> 102
agaacaaaca tatattatta tgcaggcagt tcccgactgt taactgttgg ccatccttat 60
tttgctatca aaaagcaatc aggaaaaaac cctatagtgg ttcccaaggt gtctggatat 120
caatataggg tgtttagggt a 141
<210> 103
<211> 135
<212> DNA
<213> HPV91
<400> 103
cgcaccaact tattttacca tgctggcagt tcccgtttac tggctgtggg ccaccctttt 60
tttcctataa aaaataattc tggtaaagta attgttccta aagtttcagg tcaccaatat 120
agggtgttta gagtt 135
<210> 104
<211> 140
<212> DNA
<213> HPV-IC
<400> 104
cggacgaatg tttattacca gatagataga gatagatacc catatacaga taatgacata 60
gatccccata gacagtttat acagatcagt agcagttttt atatatgaga tgatgatagc 120
aatacagagt atttagggta 140
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 105
aaaacagttg taccaaaggt gtctg 25
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 106
caaaaaggcc aaataagaca 20
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 107
cccccttaaa aattcctct 19
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 108
atacgaccag caaacaagac 20
<210> 109
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 109
tatgaatggt ggtcgcaag 19
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 110
aaaacaccag tagtgctaat g 21
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 111
ccaaaacaaa cattcccaa 19
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 112
atccatattt taaagtacct aaag 24
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 113
caaatctggt accaaaacaa a 21
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 114
cccatagaca gtttatacag atca 24
<210> 115
<211> 19
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<220>
<223> Probe
<400> 115
ataaaacggg ctaacaaaa 19
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
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tacctaaaac tggccaaaag 20
<210> 117
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 117
attctaataa aatagcagta cccaag 26
Claims (68)
- 4개 이상의 프로브들을 포함하는 세트를 가진 샘플로부터 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 프로브들 각각은 상보적인 염기들의 4 또는 5쌍들에 의해 플랭킹된 병원체로부터의 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 염기들은 병원체로부터의 핵산으로으 하이브리드와의 결실 내에서 줄기 구조(stem structure)를 형성하며, 상기 프로브는 첫번째 상호작용하는 레이블 및 두번째 상호작용하는 레이블로 레이블링되며 그 결과 상기 프로브의 하이브리드가 검출된 시그날 내에서의 변화를 야기하는 것인, 하나 이상의 병원체의 존재를 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 처음 상호작용 하는 레이블 및 두 번째 상호작용 하는 레이블은 FRET 공여체 및 FRET수용체인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 FRET 수용체는 퀀처(quencher)인 방법.
- 청구항 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원체로부터의 서열에 상보적인 서열의 연결에 의해 어느 하나의 말단에 있는 상보적인 염기들의 상기 쌍에 연결되는 것인 방법.
- 청구항 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보적인 염기쌍이 C-G 쌍을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 5항에 있어서, 상기 프로브는 3´-CGCG-F병원체에 특이적인 서열-F´-CGCG-5´이되, 이때 F와 F´은 선택적인 연결 서열인 서열을 포함하는 방법.
- 청구항 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어,서 프로브 내에 있는 것인 병원체에 특이적인 서열은 병원체의 유전자 서열을 가진 하나 이상의 미스매치(mismatch)를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브들 각각은 다른 상기 프로브들 각각으로부터 구별될 수 있는 것인 방법.
- 청구항 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브들 각각은 결정된 위치에서 고체 지지체(solid support)에 부착되는 것인 방법.
- 청구항 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브 세트는 10이상, 15이상, 또는 20이상의 프로브들을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추가적으로 상기 샘플에서 획득한 상기 프로브 및 상보적 핵산에 의해 형성된 이중 가닥 핵산 분 자들의 융점을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 획득한 상기 핵산은 상기 프로브 세트에 접촉되기 전에 증폭되는 것인 방법.
- 청구항 12항에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 사용함으로써 수행되는 것인 방법.
- 청구항 12항 또는 청구항 13항에 있어서, 증폭된 핵산의 생산은 지속적으로 감독(monitering)되는 것인 방법.
- 청구항 12항 내지 청구항 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 핵산은 증폭된 한 사이클 이후에 상기 프로브 세트에 접촉되는 것인 방법.
- 청구항 12항 내지 청구항 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 핵산은 각각의 증폭 사이클 이후에 상기 프로브 세트에 접촉되는 것인 방법.
- 청구항 12항 내지 청구항 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭은 상기 프로브 세트의 존재내에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 12항 내지 청구항 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내부 대조군의 증폭을 추가적으로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 12항 내지 청구항 18항 중 어느 한 항에 있어서, 오염된 핵산의 증폭이 억제되는 것인 방법.
- 청구항 19항에 있어서, 상기 오염된 핵산의 증폭은 우라실(uracil) 존재내에서 증폭을 수행함으로써 억제되는 것인 방법.
- 청구항 20항에 있어서, 추가적으로 증폭전에 우라실-DNA-글리코실라제(uracil-DNA glycosylase)를 갖는 상기 핵산을 처리하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 1항 내지 청구항 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 기관지 흡입물(bronchil aspirates), 소변, 프로스타타 마세에이트(prostata massate),정액(ejaculatum), 혈액과 자궁경부, 외음부, 항문, 피부 또는 후두의 세포학적 샘플들, 찰과(scrapings) 또는 생검(biopsies)에서 선택되는 것인 방법.
- 청구항 1항 내지 청구항 22항 중 어느 한 항에 있어서, 성적으로 전이되는 질병과 관련된 유기체를 검출하기 위한 방법.
- 청구항 1항 내지 청구항 23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 HPV 유전자형의 존재를 검출하기 위한 방법.
- 청구항 24항에 있어서, 고 위험 또는 저 위험 HPV 유전자형을 검출하기 위한 방법.
- 청구항 24항 또는 청구항 25항에 있어서, 상기 프로브 세트는 서열번호 (SEQ ID) No.33 내지 52 또는 서열 번호 105 내지 117로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 하나 이상의 프로브를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 24항 내지 청구항 26항 중 어느 한 항에 있어, 상기 샘플에서 얻어진 핵산은 서열번호 1 내지 32에서 선택된 하나 이상의 프라이머를 사용하여 증폭되는 것인 방법.
- 청구항 27항에 있어서, 상기 샘플에서 얻어진 핵산은 서열번호 1내지 32를 포함하는 프라이머 혼합물을 사용하여 증폭되는 것인 방법.
- 4개 이상의 프로브를 포함하되, 상기 프로브 각각은 상보적인 염기 4또는 5쌍에 의해 플랭킹된 병원체로부터의 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 염기들은 병원체로부터의 핵산에의 하이브리드화의 결실에 의해서 줄기 구조(stem structure)를 형성하며, 상기 프로브는 첫번째 상호작용하는 레이블 및 두번째 상호작용하는 레이블을 사용하여 레이블링되고, 그 결과 상기 병원체로부터의 핵산에의 상기 프로브의 하이브리드가 검출된 시그널내에서 변화를 야기하는 것인 프로브 세트.
- 청구항 29항에 있어서, 상기 첫 번째 상호작용하는 레이블 및 두 번째 상호작용 하는 레이블은 FRET 공여체 및 FRET 수용체인 것인 프로브 세트.
- 청구항 30항에 있어서, 상기 FRET 수용체는 퀀처(quencher)인 프로브 세트.
- 청구항 29항 내지 청구항 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원체로부터의 서열은 상보적인 서열은 서열들을 연결하는 것에 의한 어느 한쪽 말단에 상기 상보적인 염기들의 쌍에 결합되는 것인 프로브세트.
- 청구항 29항 내지 청구항 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보적인 염기들의 쌍은 C-G쌍을 포함하는 것인 프로브 세트.
- 청구항 33항에 있어서, 상기 프로브 각각은 3´CGCG-F-병원체에 특이적인 서열-F´-CFCF-5´이되, 이때 F 및 F´은 선택적인 연결 서열을 포함하는 것인 프로브 세트.
- 청구항 29항 내지 청구항 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브 세트는 프로브 내에서 병원체에 특이적인 서열은 병원체의 유전자 서열을 가진 하나 이상의 미스매치(mismatch)를 포함하는 것인 프로브세트.
- 청구항 29항 내지 청구항 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브들 각각은 다른 상기 프로브들과 구별될 수 있는 것인 프로브 세트.
- 청구항 29항에서 청구항 36항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브 상에들 각각은 정해진 위치에서 고체 지지체(solid support)에 부착되는 것인 프로브 세트.
- 청구항 29항 내지 청구항 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원체는 성적으로 전이되는 질병과 연관있는 유기체인 프로브 세트.
- 청구항 38항에 있어서, 상기 유기체는 바이러스인 것인 프로브세트.
- 청구항 39항에 있어서, 상기 바이러스는 인간 파필로마바이러스인 것인 프로브 세트.
- 청구항 40항에 있어서, 상기 프로브 각각은 HPV 유전자형에 상보적인 서열을 포함하고 있는 것인 프로브 세트.
- 청구항 41항에 있어서, 상기 프로브 각각은 고 위험성 HPV 유전자형에 상보적인 서열을 포함하는 것인 프로브 세트.
- 청구항 41항에 있어서, 상기 프로프 각각은 저 위험성 HPV 유전자형에 상보적인 서열을 포함하는 것인 프로브 세트.
- 청구항 40항 내지 청구항 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브 세트는 서열 번호 33 내지 52 또는 서열 번호 105 내지 117로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 하나 이상의 프로브를 포함하는 것인 프로브 세트.
- 청구항 44항에 있어서, 상기 프로브 세트의 각 프로브는 서열 번호 33 내지 52 또는 서열 번호 105 내지 117로부터 선택되는 하나의 서열을 포함하는 것인 프로브 세트.
- 청구항 44항 또는 청구항 45항에 있어서, 상기 프로브 세트의 각 프로브는 서열 번호 33 내지 52로부터 선택된 하나의 서열을 포함한 것인 프로브 세트.
- 서열 번호 33에서 52중 어느 하나를 포함하는 핵산 서열.
- 서열 번호 105 내지 117중 어느 하나를 포함하는 핵산 서열.
- 하나 이상의 HPV 유전자형의 존재 또는 비존재를 검출하기 위한 청구항 47항 또는 청구항 48항의 핵산의 용도.
- 청구항 49항에 있어, PCR을 사용하되, 증폭된 핵산의 생산은 지속적으로 관찰되어지는 것.
- 다음의 단계를 포함하는, 둘 또는 그 이상의 관련된 유기체로부터의 핵산 서열을 증폭시키는 최소한의 프라이머 세트를 확인하는 방법:(a) 상기 유기체 사이에서 30% 이상의 동일성을 가지는 프라이머 결합 위치를 확인하는 단계;(b) (a)에서 확인된 프라이머 위치에서 증폭을 개시할 수 있는 프라이머 세트를 디자인하되, 이때 상기 프라이머 각각은 상기 유기체 하나 이상 내의 프라이머 부착 위치에서 3이하의 미스매치(mismatch)를 가지며, 상기 프라이머 각각은 상기 프라이머 각각과 4또는 그 이하의 핵산까지 다른 것인 단계, 및;(c) 상기 유기체의 가장 큰 가능한 수를 검출하기 위해 필요한 가작 작은 수의 프라이머를 결정하는 단계.
- 청구항 51항에 있어서, 다음의 단계를 추가적으로 포함하는 방법:(d) 상기 유기체 모두로 부터의 핵산 서열의 동량 증폭을 확인하기 위한 상기 프라이머 세트에서 필요한 각 프라이머의 상대적인 양을 결정하는 단계.
- 청구항 51항 또는 청구항 52항에 있어서, 상기 유기체들은 성적으로 전이되는 질병이 있는 것인 방법.
- 청구항 51항 내지 청구항 53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기체는 바이러스인 방법.
- 청구항 54항에 있어서, 상기 바이러스는 인간 파필로마바이러스인 것인 방법.
- 청구항 51항 내지 청구항 55항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(d)는 하나 또는 그 이상의 프라이머들을 부가하는 단계를 추가적으로 포함하되, 이때 상기 프라이머들은 동일한 증폭을 수행하기 위해 프라이밍이 수정이 필요한 상기 유기체내에서 프라이머 결합 위치에 3개 이하의 미스매치(mismatch)를 갖는 것인 방법.
- 청구항 51항 내지 청구항 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미스매치는(mismatch) 5´말단에 가장 가까운 프라이머의 절반내에 있는 것인 방법.
- 청구항 51항 내지 청구항 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 세트는 두 자리수 내에 있는 모든 유기체의 검출 민감성이 있는 것인 방법.
- 서열번호 1 내지 32로부터 선택된 하나 이상의 프라이머를 포함하는, 청구항 55항 내지 58항 중 어느 하나의 방법에 의해 얻을 수 있는 프라이머 세트.
- 청구항 59항에 있어서 서열번호 1 내지 32를 포함하는 것인 프라이머 세트.
- 청구항 29항 내지 청구항 46항 중 어느 한 항의 프로브를 포함하는, 하나 또는 그 이상의 병원체를 검출하기 위한 키트.
- 청구항 51항 내지 청구항 58항 중 어느 한 항의 방법에 따라 확인된 프라이머 세트를 포함하는, 하나 또는 그 이상의 병원체를 검출하기 위한 키트.
- 청구항 61항에 있어서, 청구항 51항 내지 청구항 58항 중 어느 한 항의 방법에 따라 확인된 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 키트.
- 청구항 61항 내지 청구항 63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원체는 성적으로 전이되는 질병에 연관된 유기체인 키트.
- 청구항 29항 내지 청구항 46항 중 어느 한 항의 프로브 세트를 포함하는 하나 또는 그 이상의 HPV 유전자형을 검출하기 위한 키트.
- 청구항 59항 또는 청구항 60항의 프라이머 세트를 포함하는 하나 또는 그 이상의 HPV 유전자형을 검출하기 위한 키트.
- 청구항 65항에 있어서, 청구항 59항 또는 청구항 60항의 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 키트.
- 청구항 61항 내지 청구항 67항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 대조군을 추가적으로 포함하는 키트.
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