KR20080083649A

KR20080083649A - 식물 성장을 개선하기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20080083649A
Application number: KR1020087016091A
Authority: KR
Inventors: 존 찰스 마렐리; 돈 에이. 필립스
Original assignee: 테라 프레타, 엘엘씨
Priority date: 2005-12-02
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2008-09-18
Also published as: US20070148754A1; CA2631649A1; BRPI0619103A2; AU2006320315A1; MX2008007078A; JP2009518012A; EP1963485A2; WO2007064985A2; WO2007064985A3; EP1963485A4

Abstract

본 발명은 놀랍게도 토양, 식물 및 다른 형태의 유기물에 존재하는 특정한 포자-형성 미생물이 토양 또는 탄화된 목재 내에서 화재의 과다한 열에서 생존한다는 것을 알아내었다. 이러한 미생물은 식물 성장을 자극하고 식물 생성물의 영양 가치를 높히고 이산화탄소를 혼입하는 것으로 결정된다. 따라서, 본 발명은 식물 성장-자극 미생물을 토양 및 탄화된 유기 재료로부터 단리 및 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 식물 성장 및 영양 가치를 높히고, 인간 DNA를 증진시키기 위해 인간 개체에 의해 소모될 수도 있는 DNA-향상 식물을 생성하기 위해 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 토양을 개선하기 위해 유용하다. 본 발명은 또한 식물 성장을 촉진하고 하나의 생태계로부터 다른 생태계로 원하는 미생물을 옮기고 재배치하기 위하여 담체로서 목탄을 사용하는 방법을 제공한다.

화재-극상 미생물, 포자 형성, 식물 성장 개선.

Description

식물 성장을 개선하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING PLANT GROWTH}

본 발명은 식물 성장-자극 미생물의 동정 및 단리에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 과다한 열로부터 이러한 미생물을 보호하고 방어하는 재료, 예컨대 탄화된 식물 재료, 해양성 폐기물 및 토양으로부터 화재-극상(fire-climax) 미생물을 단리하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 토양의 개선 및 개량을 통해 식물 성장 및 영양 성질을 향상시키기 위한 미생물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미생물의 생육을 촉진하고 하나의 생태계로부터 다른 생태계로 바람직한 미생물을 옮기고 재배치하기 위한 목탄의 용도에 관한 것이다.

주변 농장에서 곡물 수확률을 개선하기 위해 현재 사용되는 관습적인 농업 방법은 일반적으로 유해한 비료 및 살충제의 과다한 사용을 이용하고 있다. 특히, 식물에게 이용될 수 있는 형태로 질소, 인 및 칼륨뿐만 아니라 다른 미네랄 및 마이크로영양소의 공급원을 제공하기 위하여 화학 비료가 증가된 양으로 적용된다. 화학 비료는 토양을 산성화하고 높은 수준의 중금속 및 염류를 침착시킨다. 합성 우레아 및 다른 화학물질은 필수 영양소와 미네랄을 식물에게 접근하기 어렵게 만듬으로써 더욱 불균형을 일으킨다. 비료 및 살충제의 과다 사용은 개량된 토양에 서 필수 영양소의 불균형을 가져오고, 이는 결국 토지를 농업을 위해 부적합하게 만들고 최후에는 식물 생존을 불가능하게 만든다. 관개 및 빗물은 적용된 비료 및 살충제를 수로에 녹여서, 호수 강 및 기타 지역 수원의 부영양화를 일으키고, 실질적으로 물 오염의 원인이 되고 마실 수 없거나 독성인 수원을 만들게 된다.

환경에 미치는 통상적인 비료 및 살충제의 부정적인 영향을 감소시키기 위한 노력으로 지난 수십 년에 걸쳐 유기 농업 방법이 도입되었다. 그러나, 유기 농업 실행은 다른 문제점을 가져왔다. 예를 들어, 유기 농업에서 사용되는 비료는 중금속, 유기 오염물 및 미생물 병원체를 함유할 수 있다. 천연 생성물로부터 만들어지고 유기 농업에서 사용되는 로테논은 도파민-생성 뉴론을 죽일 수 있고 그 결과 운동신경의 결손을 가져온다. 로테논은 쥐에서 파킨슨씨 증후군을 일으키는 것으로 밝혀졌다 [Renner, R. "From Flush to Farm", Scientific American, 10/2002; Karow,J., "Pesticides and Parkinson's", Scientific American, 11/6/2000; Lozano, A.M. 및 Kalia,S.K., "New Movement in Parkinson's: Environmental Culprits", Scientific American, p. 71, 6/27/2005].

따라서, 토양 영양소의 불균형을 해결하고 독성 화학물질의 수준을 감소시킬 뿐만 아니라 주변 환경에 최소로 영향을 미치는 자립 농장을 만들 수 있는 방법 및 조성물이 요구되고 있다.

"테라 프레타(Terra preta)" 토양은 향상된 비옥함 및 생산성으로 평가되는 풍부한 토양이다. 아마존 우림의 골짜기에서 발견되기 때문에, 이 토양은 높은 수준의 유기물 및 탄소를 함유한다. 테라 프레타 토양은 또한 질소, 인, 칼슘 및 칼륨의 수준을 포함하여 높은 수준의 영양소를 함유하고 비-테라 프레타 토양에 비해 다량의 영양소 및 수분-보유 능력을 갖는 것으로 관찰되었다. 문헌 [Sombro다 WG 등, Ambio, 22: 417-426 (1966)]; [Smith, N.J.H., Ann.Assoc.Am.Geogr. 70:553-566 (1980)]; [Zech, W., 등. In:McCarthy, P. 등, eds., American Society of Agronomy and Soil Science Society of America, Madison, Wis., pp. 187-202 (1990)]. 테라 프레타 토양과 유사하게, 테라 물라타 토양은 어두운 회색을 띤 갈색을 나타내고 높은 수준의 토양 유기물을 함유한다.

테라 프레타 토양의 형성을 둘러싼 집중적인 연구에도 불구하고, 테라 프레타 및 테라 물라타 토양에서 세균 및 진균의 정체 및 기능은 여전히 알려져 있지 않다. 예를 들어 문헌[Lehmann,J. 등, eds. "Amazonian Dark Earths", Kluwer Academic Publ. (2003)] 참조. 예를 들어, 과학자들은 테라 프레타 토양의 주요 성분으로서 목탄의 우세를 인정하고 세균 및 기타 미생물이 토양에 존재하는 것을 알아내긴 하였으나, 테라 프레타 및 테라 물라타 토양 중의 세균 및 진균의 정체 및 기능은 알려져 있지 않다. 문헌 [Glaser, B. 등, Biol.Fertil.Soils. 35: 219-230 (2002); Lehmann 등 (2003)].

발명의 요약

본 발명은, 토양 및 식물과 같은 유기 재료에 존재하는 특정한 포자-형성 화재-극상 미생물 또는 여기에서 언급된 "화재-극상 미생물"이 화재의 과다한 열과 같은 극한 조건에서 생존한다는 놀라운 연구결과를 근거로 한다. 식물은 화재 시에 죽지만, 이러한 화재-극상 미생물은 포자를 형성하고, 탄화된 식물 재료 및 토 양의 격리 성질의 덕택으로 토양 및 탄화된 식물 재료와 같은 보호 재료 내에서 생존하며, 일단 조건이 유리하게 되면 토양 및 식물을 다시 거주시킨다.

따라서, 본 발명은 화재-극상 미생물을 단리하고 선택하기 위한 재생산 방법뿐만 아니라 단리된 미생물을 제공한다. 또한, 이러한 화재-극상 미생물은 식물 성장을 자극하고 식물 생성물의 영양 가치를 높히며 이산화탄소를 혼입하는 것으로 결정되었다. 본 발명은 탄화된 목재가 식물-성장 자극 화재-극상 미생물의 저장소로서 작용하고 따라서 생태계 재구성을 위한 식물-성장 자극 화재-극상 미생물을 재배치하기 위한 담체로서 사용될 수 있다는 유례없는 인식을 제공한다. 또한 본 발명은 가능하다면 포자형성 과정 동안에 생성되는 해로운 화학 인자의 흡착을 통해 화재-극상 미생물을 보호함으로써, 목탄이 화재-극상 미생물의 영양생식 성장을 촉진한다는 것을 증명한다. 또한, 본 발명에 따르면, 테라 프레타 토양의 비옥함이 아마존 우림에서의 천연 및 인공 화재에 기인하고, 이것이 광범위한 탄화된 목재를 발생시키고 화재-극상 미생물이 생존하고 번성하도록 한다는 것이 제시된다. 목탄과 화재-극상 미생물 간의 관계에 관한 새로운 이해를 기초로 하여, 본 발명은 농업에 의해 발생되는 환경 손상을 바로잡고 화재 후에 자연계에서 발생하는 분자의 자기-조립 유형을 개시하기 위해 자연적인 재설정 버튼을 사용하기 위한 방법을 제공한다.

하나의 구현양태에서, 본 발명은 성장 배지에 화재-극상 미생물의 포자를 함유하는 탄화된 재료를 접종하고; 성장 배지를 적절한 온도에서 배지 내에서 화재-극상 미생물의 영양생식 생육을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지함으로써 탄화된 유기 재료, 특히 탄화된 식물 재료, 예를 들어 목탄으로부터 화재-극상 미생물을 단리하기 위한 방법을 제공한다. 화재-극상 미생물의 다수의 균주의 혼합물뿐만 아니라 단일의 단리된 균주가 수득될 수 있다.

본 발명은, 자연 화재 상태를 모방하고 화재-극상 미생물의 재생가능한 단리 및 선택을 가능하게 하는, 탄화된 재료, 특히 탄화된 식물 재료를 제조하는 방법을 또한 제공한다. 특정한 구현양태에서, 방법은 화재 안정성 세균의 소멸 직전의 정도까지 탄화를 진행시키는 조건 하에서 유기 재료를 가열 또는 연소하는 것을 포함한다. 예를 들어, 화재 안정성 세균의 소멸을 일으키는 온도 및 시간으로부터 약 1 BTU 떨어진 온도 및 시간 동안 가열을 수행할 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 공정은 적어도 200 ℃, 바람직하게는 적어도 400 ℃, 또는 더욱 바람직하게는 약 600 ℃에서 약 5 내지 약 20분, 바람직하게는 약 10 내지 약 15분 동안 식물 재료를 가열하거나 연소시켜 탄화된 식물 재료를 생성하는 것을 포함한다.

다른 구현양태에서, 본 발명은 화재-극상 미생물의 포자를 함유하는 토양의 액체 현탁액을 끓이고, 성장 배지에 끓인 현탁액의 분취량을 접종하고, 배지 내에서 화재-극상 미생물의 영양생식 성장을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 적절한 온도에서 성장 배지를 유지시킴으로써 토양으로부터 화재-극상 미생물을 단리하기 위한 방법을 제공한다.

추가의 구현양태에서, 본 발명은 식물 성장을 자극하는 화재-극상 미생물 균주를 동정하는 방법을 제공한다. 화재-극상 미생물의 각각의 균주를 토양 또는 목탄으로부터 단리하고, 식물 성장을 자극하는 능력에 대해 선별한다.

또 다른 구현양태에서, 본 발명은 적어도 200 ℃ 또는 심지어 약 600 ℃ 또는 그 이상의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 단리된 화재-극상 미생물을 제공한다. 바람직한 화재-극상 미생물은 브레비바실러스 센트로스포루스 (Brevibacillus centrosporus), 특히 HAB7의 단리물, 및 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 예컨대 AC9의 단리물을 포함한다.

하나의 구현양태에서, 본 발명은 적어도 200 ℃ 또는 심지어 약 600 ℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 화재-극상 미생물을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 식물 성장을 증진시키고 토양 품질을 개선하기 위해 유용하고, 비료 조성물로서 제조될 수 있다.

다른 구현양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 경작 배지 중에서 식물의 재배품종을 성장시킴으로써 식물 성장을 증진시키기 위한 방법을 제공한다.

또 다른 구현양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 경작 배지에서 식물의 재배품종을 성장시킴으로써 영양적으로 향상된 식물 생성물을 생성하는 방법을 제공한다.

추가의 구현양태에서, 본 발명은 목탄으로 보충된 식물 경작 배지에서 식물의 재배품종을 성장시킴으로써 식물의 성장 및/또는 영양 가치를 향상시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 원하는 화재-극상 미생물을 함유하기 위해 방법에서 사용되는 목탄이 선택되었다.

본 발명의 방법을 기초로 하여 생성된 식물 및 식물 생성물은 본 발명의 다 른 구현양태를 형성한다. 화재-극상 미생물이 식물에서 식물성화학물질의 함량을 증가시키고 (실시예 X 및 XI) 동물의 면역 체계를 자극하는 것으로 생각되기 때문에, 본 발명에 따라 생성된 식물 생성물은 이들을 섭취하는 동물에게 유익하다.

추가의 구현양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 화재-극상 미생물을 함유하는 화재-극상 미생물 또는 조성물을 사용함으로써 토양의 식물 성장-자극 성질을 개선하고 토양에서 생물다양성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 식물에 의한 태양 에너지 전환을 향상시키는 방법, 및 식물에 의해 미네랄 영양소 이용 효율을 향상시킴으로써 오염을 감소시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 화재-극상 미생물 및/또는 화재-극상 미생물을 함유하는 목탄은 미관을 위한 야생지, 도시 그린벨트 및 골프 코스를 포함하는 비-농경지에 도입될 수 있다.

도 1. 공지된 세균 서열에 대하여, 목탄으로부터 단리된 미생물로부터의 부분 16S rDNA 서열의 비교. 이 도면은 가장 근접한 세균 서열 조화 및 상응하는 퍼센트 서열 차이를 나타낸다. 4개의 단리물, CP1-2, CP1-6, CP1-13 및 CP1-14는 동정될 수 없다. "가장 근접한 조화(match)"는 5% 초과만큼 서열에서 차이가 나는 각각의 단리물을 가리키고, 따라서 동일한 것일 가능성은 없다고 결론내려졌다 (실시예 I 참조).

도 2. 진뱅크(GenBank) 서열에 대하여, 목탄으로부터 단리된 미생물로부터 의 부분 16S rDNA 서열의 비교. 이 도면은 4개의 부조화 단리물에 대해 발견된 가장 근접한 진뱅크 서열 조화를 나타낸다 (실시예 I 참조).

도 3A-3B. 아몬드 목탄으로부터 단리된 미생물로부터의 16S rDNA 서열의 분석. 분석된 29개 단리물 중의 하나 (3B 참조)는 브레비바실러스 센트로스포루스로서 동정되었다 (실시예 II 참조).

도 4. 토양으로부터 단리된 미생물로부터 부분 16S rDNA 서열의 분석. 이 도면은 샘플 DAP-1 내지 DAP-6의 각각에 대하여 샘플 균주 간의 가장 근접한 세균 서열 조화 및 상응하는 퍼센트 서열 차이 및 500개 염기 쌍 16S rDNA 서열화를 기초로 한 가장 근접한 조화를 나타낸다. DAP-2는 브레비바실러스 센트로스포루스인 것으로 결정되었다 (실시예 III 참조).

도 5. HAB7에 대해 수득된 완전한 16S-rDNA 서열 (실시예 III 참조).

도 6. 세균 생육에 미치는 목탄의 효과. 그래프는 비처리 대조 배양물에 비하여 3일째에 대략 20배 및 5일째에 대략 8배로 세균 생육을 향상시킴을 나타낸다. 각각의 처리에 대해 3개의 복제 배양물의 각각에서 생존 세포를 측정함으로써 결정되는 5일째 효과는 매우 현저하였다 (P ≤ 0.01). 각각의 처리에서 단일 복제물을 가지고 3일째 효과를 측정하였다 (실시예 V 참조).

도 7. HAB7에 의한 탄소 고정. HAB7 세포는 CO₂를 총 탄소의 대략 0.25%의 수준까지 혼입하였다 (검은색 원). 12 내지 18시간 및 12 내지 36시간에서 ¹³C 함량의 증가는 매우 현저하였다 (P ≤ 0.001). 증가된 CO₂ 농도 (검은색 삼각형)은 주변 대기 CO₂ (흰색 삼각형)에 비하여 세포 생육 (질량)을 T₁₂ (12 시간)에서 50% 만큼 (P ≤ 0.01), T₃₆ (36 시간)에서 12% 만큼(P ≤ 0.01) 촉진하였다.

도 8. HAB7의 생육에 미치는 우레아의 효과. 30시간 동안 우레아의 존재 또는 부재 하에서 배양된 HAB7의 성장을 평가하였다. 도면은 우레아가 HAB7 성장을 현저히 억제함을 나타낸다 (실시예 X 참조).

개시내용의 명백성을 위하여, 그리고 제한하지 않을 목적으로, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특징한 특징, 구현양태 또는 적용을 설명하고 예증하는 소항목으로 세분된다.

본 발명의 화재-극상 미생물의 특징

여기에서 사용된 용어 "화재-극상 미생물"은 식물과 유익하게 결합하고 화재와 특별한 관계를 갖는 고 진화된 포자-형성 세균을 가리킨다. 화재-극상 미생물은 환경 변화에 적응할 능력을 갖고 있으며, 생명-지탱 조건과 보통 연관되는 것에 비하여 더욱 높은 온도를 견디는 포자를 생성한다. 모든 화재-극상 미생물은 예를 들어 화재가 그것을 통과할 때 200 ℃, 400 ℃ 또는 심지어 600 ℃에서 토양에 생존하고, 많은 화재-극상 미생물은 열분해된 탄소 기질, 예컨대 목탄 또는 탄화된 식물 재료의 다른 형태뿐만 아니라 훨씬 높은 온도 (예를 들어, 500 ℃ 또는 심지어 600 ℃)에서 가열함으로써 생성되는 탄화된 유기 재료의 다른 형태에서 발견될 수 있다.

본 발명에 따르면, 화재-극상 미생물은 화재로부터 4가지 장점을 이끌어낸다. 첫 번째로, 화재는 포자 벽을 약하게 하고 이것은 포자 발아를 유발하기 위해 필요한 물을 흡수할 수 있다. 두 번째로, 화재는 목탄을 생성하고 이것은 포자형성에 유리한 화학 인자를 흡착하고 [Gonzalez-Pastor 등, Science 301: 510-513, 2003] 따라서 즉각적인 세균 생육을 촉진함으로써 화재-극상 미생물을 지속적인 영양생식 생장의 상태로 유지한다. 세 번째로, 화재는 화재-극상 미생물과 경쟁하는 많은 미생물을 죽인다. 마지막으로, 화재는 식물 재료로부터 미네랄 영양소를 방출함으로써 화재-극상 미생물을 위해 비옥한 기반을 생성한다. 화재-극상 미생물 군집은 새로운 식물 뿌리를 입식함으로써 화재 후에 번성한다. 결국, 화재의 소산물 -즉, 목탄, 고 영양 수준, 및 경쟁 감소가 사라질 때, 화재-극상 미생물이 포자를 형성하고 이후의 화재 및 재생육 주기가 발생할 때까지 지속된다. 이러한 의미에서, 화재-극상 미생물은 일반적으로 인지된 화재-극상 식물 종의 미생물 판을 나타내고, 이것은 화재 후에 깨어나서 풍부하게 자란다.

본 발명에 따르면, 화재-극상 미생물이 식물 내에서 존재하고 식물 성장 및 보호를 위해 중요한 식물성화학물질의 생성을 자극함으로써 숙주 식물에게 이롭게 된다. 추가로, 화재-극상 미생물은 식물에서 뿌리 삼출 및 호흡을 포함한 주요 대사 경로를 자극하고, 이것은 지상의 식물 기관으로부터 뿌리 쪽으로 탄소가 직접적으로 흐르는데 도움이 된다. 뿌리 성장의 자극은 미네랄 영양소 및 물의 이용가능성을 증가시킨다. 또한, 다양한 화재-극상 미생물은 N₂를 암모니아로 환원시키고, 식물 병원체의 성장을 억제하고, 인산염을 용해시키고 이산화탄소를 혼입시킴으로써 식물 성장을 자극한다. 어떤 특정한 이론에 의해 구속되기를 원하지 않지만, 식물에 대한 화재-극상 미생물의 자극 효과가 후성적으로 달성되는 것으로 생각된다. 화재-극상 미생물은 숙주 식물에서 선택된 유전자의 발현을 상향-조절할 수 있고, 그 결과 예를 들어 식물성화학물질의 향상된 성장 및 생성을 특징으로 하는 "유전자-향상" 또는 "DNA-향상" 식물이 얻어진다. [reviews of epigenetics by Grant-Downton and Dickinson, Annals Botany 96:1143-1164 (2005), Part 1] 및 [Annals Botany (2005년 10월), Part 2] 참조.

본 발명에 따르면, 화재-극상 미생물이 처녀 토양에 또한 존재한다. 화재 동안에 포자로서 화재-극상 미생물의 생존과 그 이후에 수분의 존재 하에서의 성장은, 화재-극상 미생물이 새로운 식물 뿌리를 입식하는데 선두에 서도록 한다.

화재-극상 미생물의 단리 및 동정

하나의 구현양태에 따르면, 본 발명은 탄화된 유기 재료로부터 화재-극상 미생물을 단리하기 위한 방법을 제공한다.

유기물은 (1) 화재-극상 미생물, (2) 그들의 DNA, 및 (3) 탄소 및 생체 유기체와 관련된 기타 원소, 예컨대 산소, 수소 및 질소로 구성된 불활성 기질을 함유하는 생물학적 기원의 물질이다. 화재-극상 미생물을 단리하기 위해 적절한 유기물의 예는 식물 재료, 해양성 폐기물, 예컨대 어분 및 조류 및 토양으로부터 유래된 유기물을 포함한다.

탄화란 유기 재료가 주로 탄소를 함유하는 잔류물로 전환되는 것을 가리킨다. 일반적으로, 이러한 잔류물은 다중고리, 방향족 탄소 분자의 혼합물로 구성된다.

특정한 구현양태에서, 탄화된 물질은 목탄이고, 자연으로부터 수득될 수 있거나 당업자에게 공지된 방법에 의하여 인공적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 효과적인 댐퍼 시스템을 가진 현대의 저-방사 목재 스토브에서 건조 목재로부터 목탄이 제조될 수 있다. 이러한 목적을 위해 적절한 한 가지 스토브는 20"×20"×15" (W×D×H)의 내부 치수를 갖는다. 작업자는 쪼개진 미국삼나무 및 소나무 또는 오크의 몇몇 쪼개진 통나무와 같은 불쏘시개를 사용하여 불을 땐다. 소나무 또는 오크 통나무는 몇 차례 새로 보충되어야 하고 적절히 스토브를 가열하고 적절한 석탄 층이 만들어지도록 완전히 열린 댐퍼로 연소되어야 한다. 약 3 내지 4시간의 기간 후에, 대략 5" 깊이의 타오르는 석탄의 층이 스토브의 바닥에 존재해야 한다.

목탄을 생성하기 위한 통나무는 원상태이거나 쪼개질 수 있지만, 원상태의 통나무가 높은 수율의 목탄을 제공한다는 것을 경험상 알 수 있다. 목탄 제조를 위해 선택된 3 또는 4개 통나무는 댐퍼가 완전히 열린 채로 살아있는 (오렌지색으로 타오르는) 석탄 위에 놓여야 한다. 새로운 통나무가 목재의 수분 함량에 의존하여 전형적으로 약 10 분 이내에 활활 타오르고, 약 20 분 이내에 강력한 화염이 일어나야 한다. 모든 통나무가 화염에 둘러싸인 후 수 분 후에, 산소 이용가능성을 감소시키기 위해 댐퍼를 완전히 밀폐시켜야 한다. 화염이 재빨리 가라앉고 동시에 통나무가 숯이 되고 동시에 연소된다. 여기에 기재된 조건 하에서 통나무를 함유한 스토브를 추가의 관리 없이 밤새 유지시킬 수 있다. 아침에, 스토브가 식을 것이고 통나무의 숯이 된 잔여물이 존재할 것이다. 숯이 된 통나무를 더 작은 목탄 조각으로 즉시 자를 수 있다.

중량 기준으로 목탄의 수율은 매우 가변적이다. 경험이 많은 탄갱부라면 25% 수율을 얻을 수 있으나, 여기에 기재된 조건 하에서 더욱 전형적인 수율은 약 15 내지 20%이다.

목탄 내에서 화재-극상 미생물을 방출하기 위하여, 대략 2mm 내지 15mm 직경의 먼지와 같은 입자인 목탄 미립자를 더욱 큰 목탄 조각으로부터 분리한다. 이어서, 세균 배양물을 위해 적절한 배지로부터 선택된 성장 배지에 접종하기 위하여 미세한 목탄 입자를 사용한다. 액체 성장 배지에 직접 목탄 입자를 첨가함으로써 접종을 달성할 수 있다. 대안적으로, 고체 성장 배지가 사용될 수 있고, 이러한 경우에 배지의 제조 동안 및 그의 고형화에 앞서서 (예를 들어, 배지를 오토클레이브처리한 후 곧) 목탄 입자를 성장 배지에 첨가할 수 있다. 목탄 입자로 접종된 성장 배지를 5 ℃ 내지 55 ℃의 적절한 온도에서 배지 내에서 화재-극상 미생물의 영양 생식 성장을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지한다. 이렇게 제조된 화재-극상 미생물을 추가의 사용을 위해 성장 배지로부터 쉽게 분리할 수 있다.

원한다면, 화재-극상 미생물의 개별 균주를 단리할 수 있다. 예를 들어, 목탄 입자를 배지가 고형화되기 전에 성장 배지의 액체 현탁액에 첨가할 수 있다. 플레이트 위에서 단일 콜로니를 수득하기 위하여, 목탄을 약 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 5%, 더욱 바람직하게는 약 3% (w/v)의 농도로 액체 현탁액에 첨가한다. 이어서, 배지 현탁액을 페트리 플레이트에 쏟아서 고형화시킨다. 개별 화재-극상 미생물 균주를 나타내는 단일 콜로니가 플레이트 상에서 발생되고 추가의 사용 또는 분석을 위해 수집될 수 있다. 종 수준에서 화재-극상 미생물을 동정하기 위하여 콜로니의 16S rDNA를 서열화할 수 있다.

다른 구현양태에서, 화재 안정성 세균의 소멸 직전의 정도까지 탄화가 진행되는 조건 하에서, 화재-극상 미생물 또는 포자를 함유하는 유기 재료, 예컨대 조각난 나무껍질 조직 및 식물의 목재 또는 해양성 유기 폐기물을 가열함으로써 화재-극상 미생물을 단리하기 위한 탄화된 재료가 제조된다. 예를 들어, 화재 안정성 세균이 소멸되는 조건으로부터 약 1BTU 떨어진 조건 하에서 가열을 수행할 수 있다.

특정한 구현양태에서, 유기 재료, 예를 들어 조각난 나무껍질 조직 및 식물의 목재 또는 해양성 유기 폐기물과 같은 유기 재료를 매우 높은 온도, 예를 들어 약 600 ℃에서 바람직하게는 10 내지 15분, 가장 바람직하게는 600 ℃에서 10분 동안 가열한다 (즉, 열 처리). 일정하고 완벽한 탄화를 달성하기 위하여, 하기 실시예 III에 예시된 바와 같이 작은 챔버를 가진 노를 사용하여 가열 공정을 수행할 수 있다. 실시예 III에서의 목재를 연소시켜 없앨 수 있지만, 세균 포자가 소멸되기 직전에, 즉 수집된 그 다음의 샘플 (600 ℃에서 15분 동안 가열)에 눈에 보이는 포자가 남지 않게 되기 직전에 세균 포자를 회복하기 위하여 약 10분에 탄화 공정을 멈추었다.

"약 600 ℃"는 585 ℃ 내지 615 ℃의 온도, 바람직하게는 590 ℃ 내지 610 ℃, 더욱 바람직하게는 595 ℃ 내지 615 ℃ 범위의 온도를 의미한다. 원하는 탄화 정도를 달성하기 위해 필요한 정확한 온도 (즉, 화재 안정성 미생물의 소멸 직전)은 화재 안정성 미생물을 보호하는 유기 재료의 특정한 밀도, 수분 함량, 수 또는 양, 균일성, 형태, 크기, 경도, 화학 조성, 산소 수준, 압력, 화학 처리(존재한다면)에 의존될 수도 있다.

온도 및 기간을 포함한 열 처리 조건은 출발 물질의 약 10 내지 20%에 달하는 수율을 달성하는 정도이어야 한다. 본 발명과 관련하여, 열처리 조건은 유기물로부터 화재-극상 미생물을 방출하거나, 회수하거나, 단리하거나 또는 수득하기 위해 필요한 온도에 의해 적절히 한정될 수도 있다. 시간에 온도를 곱한 식은 유기물로부터 화재-극상 미생물을 방출하거나, 회수하거나 단리하거나 수득하기 위해 필요한 에너지에 비례한다. 600 ℃에서 10 분 동안 유기물의 열 처리가 화재-극상 미생물을 방출하거나, 회수하거나, 단리하거나 수득하기 위해 필요한 에너지의 100%를 공급하는 경우에, 동일한 온도에서 약 5분 또는 15분 동안 유기물의 열 처리는 각각 에너지 값의 50% 및 150%를 제공할 것이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 유기물로부터 화재-극상 미생물을 방출하거나, 회수하거나, 단리하거나 또는 수득하기에 적절한 열 조건은 예를 들어 에너지의 51% 내지 149%를 공급하는 조건이다.

이어서, 목탄과 관련하여 상기 언급된 바와 같이 세균 배양을 위해 적절한 성장 배지를 접종하기 위해 탄화 재료가 사용된다.

다른 구현양태에서, 본 발명은 토양으로부터 화재-극상 미생물을 단리하기 위한 방법을 제공한다. 본 구현양태에 따르면, 토양을 물에 예를 들어 1:1 (v/v)의 비율로 현탁시킬 수 있다. 현탁액을 끓는 수욕에 약 2-4분, 바람직하게는 약 3분 동안 위치시킨다. 현탁액으로부터 분취량을 취하고 세균 생육을 위해 적절한 고체 성장 배지에 평판배양한다. 이러한 성장 배지의 예는 TY 배지 (박토 트립톤 (5g/l), 박토 효모 추출물 (3 g/l) 및 CaCl₂ (1.3 g/l), 박토 한천 (15 g/l))이다. 개별 세균 콜로니가 고체 성장 배지에서 발생하고, 필요하다면 단일 세균 균주를 수득하기 위해 2차 배양할 수도 있다.

식물 성장 및 생산성을 향상시키는 능력에 대하여 상기 기재된 바와 같이 단리된 세균을 더욱 선별할 수 있다. 새싹 건조 중량, 종자 수율, 뿌리 성장 및/또는 열매 수율 또는 크기를 기초로 하여 식물 성장 및 생산성을 결정할 수 있다. 시험 배지로서 사용될 수 있는 식물은 토양에서 성장되는 어떠한 식물이라도 실제로 포함한다. 일례의 식물은 일용 곡물 (예, 옥수수, 밀 및 대두) 및 수수속 식물을 포함한다. 다른 예는 과실 및 견과류 나무 (예, 아몬드), 대두, 땅콩, 포도, 사과, 베리류 (스트로베리, 블랙베리, 라즈베리), 괴경류 (예, 감자, 고구마), 옥수수, 알곡 (예, 밀, 쌀, 호밀), 토마토, 양파, 박과 (예, 수박, 오이 및 멜론), 잎줄기 채소 (예, 양상추, 시금치, 꽃상추), 목화 및 기타 일용 작물을 포함하는 미가공 일용 농작물을 포함한다.

화재-극상 미생물의 단리된 균주

다른 구현양태에서, 본 발명은 상기 기재된 본 발명의 방법을 기초로 하여 단리된 화재-극상 미생물을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 단리된 화재-극상 미생물은 적어도 200 ℃ 또는 심지어 600 ℃의 고온을 견디는 포자를 생성하는 세균이다. 이러한 화재-극상 미생물은 바실러스 센수 라토(Bacillus sensu lato), 예를 들어 바실러스 푸시포르미스(Bacillus fusiformis), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 브레비바실러스 센트로스포루스(Brevibacillus centrosporus), 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 심플렉스(Bacillus simplex), 바실러스 니아시니(Bacillus niacini), 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 아밀로리케파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 인솔리투스(Bacillus insolitus), 바실러스 사이크로두란스(Bacillus psychrodurans), 바실러스 스포로서모두란스(Bacillus sporothermodurans), 브레비박테리움 프리고리토레란스(Brevibacterium frigoritolerans), 파에니바실러스 아조토픽산스(Paenibacillus azotofixans), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 라우투스 (Paenibacillus lautus), 브레비박테리움 종, 브레비바실러스 종, 파에니바실러스 종, 게오바실러스 종, 알리시클로바실러스 종, 술포바실러스 종, 암모니필루스(Ammoniphilus) 종 및 아네우리니바실러스(Aneurinibacillus) 종인 것으로 생각된다.

단리된 화재-극상 미생물의 예는 메스퀴트 목탄으로부터 단리된 것 (도 1), 특히 CP1-2, CP1-6, CP1-13 및 CP1-14로서 명명된 4개의 단리물을 포함한다. 이러한 4개의 단리물의 16S rDNA 서열은 진뱅크에서의 서열에 97% 초과만큼 조화되지 않는 것으로 밝혀졌다.

단리된 화재-극상 미생물의 추가의 예는 아몬드 목탄 (도 3A - 3B)으로부터 단리된 것, 특히 "C17304 AC23 con"으로 명명되는 단리물이다. C17304 AC23 con (도 3B)는 브레비바실러스 센트로스포루스인 것으로 결정되고 스펙티노마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 내성이다.

단리된 화재-극상 미생물의 다른 예는 토양으로부터 단리된 HAB7이다. C17304 AC23 con과 유사하게, HAB7은 또한 브레비바실러스 센트로스포루스의 균주이고 스텍티노마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 내성이다. HAB7 및 C17304 AC23 con은 하나의 동일한 단리물을 나타낼 수도 있다고 생각된다. C17304 AC23 con을 함유하는 목탄은, HAB7이 단리되는 동일한 토양에서 자라는 아몬드 나무로부터 유래되었다. 또한, HAB7 및 C17304 AC23 con은 분석된 그들의 16S rDNA 서열에서 동일하다 (500 bp). 또한, HAB7 및 C17304 AC23 con은 동일한 항생물질 내성을 공유하고, 다시 말해서 스펙티노마이신 (25 ㎍/mL), 테트라사이클린 (1 ㎍/ml) 및 클로람페니콜 (2.5 ㎍/ml)의 조합에 대해 자연적으로 내성이다.

본 발명의 바람직한 화재-극상 미생물은 식물 성장을 증진시키고 탄소 고정화 가능한 미생물, 예를 들어 HAB7 및 C17304 AC23 con이다.

세균 균주 HAB7 및 AC9를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아 20108 마나사스)에 2006년 11월 17일에 기탁하였다.

화재-극상 미생물을 함유하는 조성물

식물 성장을 증진시키고 토양을 개선하기 위해 유용한 조성물을 제조하기 위하여 상기 기재된 바와 같이 목탄 및 토양으로부터 제조된 화재-극상 미생물을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 단리된 적어도 하나의 화재-극상 미생물을 함유하는 식물 비료 조성물 및 토양 개선 조성물을 제공한다.

"적어도 하나의 화재-극상 미생물"이란 단일 화재-극상 미생물 균주 또는 화재-극상 미생물의 여러 (즉 적어도 2개) 균주의 조합을 의미한다. 예를 들어, 조성물은 화재-극상 미생물의 포자를 함유하는 목탄을 성장 배지에 접종하고, 화재-극상 미생물의 영양생식 성장을 개시하기에 충분한 시간 동안 성장 배지를 배양함으로써 생성되는 화재-극상 미생물의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 제조함에 있어서 사용하기 위해 화재-극상 미생물의 개별 균주를 단리하는 것이 절대적으로 필요하지 않다. 그러나, 바람직한 구현양태에서, 식물 성장을 향상시키거나 토양을 개선하기 위한 조성물을 제조하기 위하여 하나 이상의 단리된 화재-극상 미생물 균주를 사용한다. 본 발명의 조성물에서 사용하기 위해 특히 바람직한 화재-극상 미생물은 식물 성장을 향상시키는 것으로 결정된 미생물, 예를 들어 HAB7 및 AC9이다. 특정한 구현양태에서, 조성물은 HAB7 및 AC9를 모두 포함한다.

미생물에 추가로, 본 발명의 조성물은 목탄을 포함할 수 있다. 본 발명에 의하여 목탄이 화재-극상 미생물의 영양생식 성장을 독립적으로 촉진하고, 이것은 다시 식물 성장을 자극한다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 조성물은 비료 조성물에서 사용하기 위해 적절한 다른 성분 또는 요소를 포함할 수 있다.

식물 성장을 향상시키고 토양을 개선하기 위한 방법:

하나의 구현양태에서, 본 발명은 본 발명의 화재-극상 미생물을 사용함으로써 식물 성장을 향상시키기 위한 방법을 제공한다. 향상된 성장을 달성하기 위해 본 발명의 적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시킨다.

본 발명에 따르면, 화재-극상 미생물을 식물 성장 및 생산성을 향상시키기에 효과적인 양으로 토양 또는 합성 재배 배지와 같은 식물 재배 배지에 첨가한다. 예를 들어, 화재-극상 미생물을 식물을 심기 전, 동안 또는 후에 2×10⁷ 내지 2×10¹¹ CFU/ft², 또는 바람직하게는 2×10⁸ 내지 2×10¹⁰ CFU/ft², 또는 더욱 바람직하게는 약 2×10⁹ CFU/ft²의 양으로 토양에 첨가한다. 화재-극상 미생물을 포자 또는 세포의 형태로 화재-극상 미생물을 함유한 분말 또는 액체 현탁액을 살포하는 것을 포함하여 적절한 방식으로 재배 배지에 접종할 수 있다. 당업자라면 화재-극상 미생물의 정확한 양 및 식물 성장을 촉진하기에 효과적인 접종 시기 및 빈도를 쉽게 결정할 수 있다. 화재-극상 미생물을 첨가하지 않은 것 이외에 다른 것은 동일한 배지에서 성장한 식물과 비교하여 증가된 새싹 건조 중량, 종자 수율, 뿌리 성장 및/또는 열매 수율/크기를 기초로 하여 향상된 식물 성장을 결정할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 방법을 실행함으로써 이에 한정되지 않지만 곡물 (예, 옥수수, 밀 및 대두), 수수속 식물, 과실 및 견과류 나무 (예, 아몬드), 대두, 땅콩, 포도, 사과, 베리류 (스트로베리, 블랙베리, 라즈베리), 괴경류 (예, 감자, 고구마), 옥수수, 알곡 (예, 밀, 쌀, 호밀), 토마토, 양파, 박과 (예, 수박, 오이 및 멜론), 잎줄기 채소 (예, 양상추, 시금치, 꽃상추), 목화 및 기타 일용 작물을 포함하여 다양한 식물의 성장이 향상될 수 있다.

다른 구현양태에서, 영양-증진 식물 생성물을 생산하기 위하여 본 발명의 적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시킨다.

"영양-증진 식물 생성물"이란, 본 발명의 적어도 하나의 화재-극상 미생물의 존재하에서 성장된 식물의 생성물이 화재-극상 미생물 또는 미생물들의 부재 하에서 성장된 식물 생성물에 비하여 증가된 양의 식물성화학물질 또는 영양소를 갖는 것을 의미한다. 식물 생성물은 소모되어지는 식물의 어떠한 부위, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 즙, 열매, 오일 또는 꽃을 포함한다.

용어 "식물성화학물질"은 비-영양소 식물 물질을 위한 일반적인 용어이다. 많은 식물성화학물질 및 소비 후 그들의 전환을 위한 생성물은 질병을 막는 것으로 밝혀졌다. 식물성화학물질은 예를 들어 카로테노이드, 항산화물 (예, 플라보노이드) 및 토코페롤 (예, α 및 γ-토코페롤)을 포함한다.

특정한 구현양태에서, 증가된 영양소 또는 식물성화학물질은 플라보노이드 또는 이소플라보노이드이다. 다른 구현양태에서, 영양소 또는 식물성화학물질은 비타민, 예를 들어 비타민 E (α-토코페롤 또는 γ-토코페롤)이다. 본 발명의 방법은 α-토코페롤의 양을 적어도 1.3배, 또는 약 1.3배 내지 2배 만큼의 증가, 및 γ-토코페롤의 양을 적어도 1.3배, 또는 약 1.3배 내지 3배 만큼의 증가를 달성할 수 있다.

열매 (예, 포도, 사과, 베리, 예컨대 스트로베리, 블랙베리 및 라즈베리), 괴경류 (예, 감자, 고구마), 견과류 (예, 아몬드, 땅콩), 대두, 옥수수, 알곡 (예, 밀, 쌀, 호밀), 토마토, 양파, 박과 (예, 수박, 오이 및 멜론), 잎줄기 채소 (예, 양상추, 시금치, 꽃상추)를 포함하여 다양한 식물 생성물에서 영양소 또는 식물성화학물질의 함량을 증가시키기 위하여 본 발명의 방법을 적용할 수 있다. 특정한 구현양태에서, 식물 생성물은 아몬드이고, 영양-증진 생성물이 수확되는 식물은 아몬드 식물이다.

추가의 구현양태에서, 본 발명은 목탄으로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시킴으로써 식물의 성장 및/또는 영양 가치를 향상시키기 위한 방법을 제공한다. 특정한 구현양태에서, 식물 성장을 자극하는 적어도 하나의 화재-극상 미생물을 함유하기 위하여 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 목탄을 선택하였다.

미생물의 존재 하에서 성장된 식물 및 이러한 식물의 생성물이 본 발명의 다른 구현양태를 형성한다. 화재-극상 미생물의 존재 하에서 성장된 식물은 향상된 유전자 및 DNA를 갖는 것으로 생각되고, 향상된 성장 및 예를 들어 식물성화학물질의 증가된 생산을 갖는 것으로 명백하다. 이러한 DNA-향상 식물 및 식물 생성물은, 식물 및 식물 생성물의 향상된 영양 가치 때문뿐만 아니라 DNA-향상 식물 재료가 동물 (예컨대 인간)에서 DNA를 조절하고 향상시켜서 그 결과 동물에서의 선천적 및 적응성 면역 체계를 향상시키는 것으로 생각되기 때문에, 이들을 섭취하는 동물에게 유익하다. 따라서, 하나의 구현양태에서, 미생물 군을 향상시키고, 건강을 촉진 및 개선하고, 병을 감소시키기 위하여, 본 발명의 화재-극상 미생물을 함유하는 식물 생성물이 인간을 포함한 동물에 의해 섭취된다. 어떠한 특정한 메카니즘 또는 이론에 의해 구속되기를 원하지 않지만, 섭취된 화재-극상 미생물은 동물의 체계에서 질병을 일으키는 세균을 억제하거나 심지어 죽이고, 이에 의해 건강을 개선하고 질병 및 병을 감소시키는 것으로 생각된다.

추가의 구현양태에서, 토양을 개선하고 재구성하고 토양에서 생물다양성을 증가시키기 위하여 본 발명에 따라 단리된 화재-극상 미생물이 사용된다. 토양 품질을 개선하는 방법 및 그 결과의 개량된 토양이 본 발명의 추가의 구현양태이다.

개량되어질 토양을 포자 또는 세포 형태의 화재-극상 미생물로 접종할 수 있다. 화재-극상 미생물의 단일 균주 또는 여러 균주의 혼합물이 사용될 수 있다. 대안적으로, 목탄 내에서 화재-극상 미생물을 단리하지 않은 채로, 또는 목탄에서 단지 소량의 미생물을 배양하고 처리하면서, 화재-극상 미생물을 함유하는 목탄 입자를 토양에 직접적으로 첨가할 수 있다. 예를 들어, 화재-극상 미생물을 함유하는 분말 또는 액체 현탁액을 살포하거나, 또는 화재-극상 미생물을 함유한 목탄의 입자를 살포함으로써 토양의 접종을 달성할 수 있다.

본 발명은, 토양에 존재하는 특정한 화재-극상 미생물이 그 토양에서 자라는 식물의 성장 및 생산성을 향상시키고; 화재-극상 미생물이 식물 내에서 살고 식물의 탄화로부터 생성된 목탄 내에서 생존한다는 것을 확인하였다. 탄화된 목재는 생태계 회복에 기여하는 주요한 물리적 및 화학적 특성이다. 미생물을 저장하는 것에 추가로, 탄화된 목재는 다양한 화학적 촉매를 함유한다. 탄화된 목재의 나노미터 매개변수는 생명을 지탱하는 화학 반응을 위한 무한한 표면을 생성하고 기체를 포획하고 방출하는 무수히 많은 챔버를 형성한다. 그 결과, 식물 생존의 유기 잔존물과 미생물의 회복 활성 간에 충분히 매우 발전된 계면이 존재한다. 탄화된 목재의 바람직한 한가지 특성은, 이것이 많은 상이한 산화환원 포텐셜에서 전자를 공급하고 받아들일 수 있는 새로 확인된 촉매가 산재되어 있는 연결된 수성 및 비-수성 환경을 함유한다는 것이다. 이러한 복잡하고 아직까지 잘 이해되지 않는 기반이, 상호연결된 미생물의 복잡한 군집에 자양분을 준다. 한가지 간단한 예로서, N₂가 O₂의 부재 하에서 암모니아로 환원될 때 임의의 혐기성 세균은 H₂를 방출하는 반면, 전자를 O₂로 전달하고 따라서 N₂ 고정에 유리한 혐기성 환경을 만드는 동안에 주변 탄화된 목재 교질입자에서의 호기성 세균은 CO₂를 환원시키기 위해 H₂를 이용할 수 있다.

목탄의 가치는 본 발명에 의해 유일하게 인식되었다. 본 발명에 따르면, 화재-극상 미생물을 하나의 생태계로부터 다른 생태계로 전위시키기 위하여, 그리고 하나의 지리학적 위치에 있는 토양의 식물-성장 촉진 성질을 다른 토양으로 옮기기 위하여, 목탄이 화재-극상 미생물의 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 최고급 와인용 포도가 자라는 지역에 있는 적절한 세균을 목탄에 의하여 다른 적절한 지리학적 위치로 옮길 수 있다.

본 발명에 따라 변형된 토양은 통상적인 비료 및 살충제와 독립적으로 식물 성장을 뒷받침하고, 환경 오염을 일으키지 않는다. 또한, 화재-극상 미생물의 탄소-고정 성질은 토양 중의 유기 화합물에 대기중 탄소가 고정되도록 하고, 공기로부터 이산화탄소를 제거하고, 토양에서의 탄소 저장을 개선시킨다.

따라서, 추가의 구현양태에서, 식물에 의한 태양 에너지 전환을 증진시키고 식물에 의한 미네랄 영양소 이용 효율을 향상시킴으로써 환경 오염을 감소시키기 위하여 본 발명의 화재-극상 미생물이 사용될 수 있다. 이러한 증가된 효율의 기초는 식물 뿌리 성장을 증가시키는 화재-극상 미생물의 능력에 존재한다. 더욱 큰 뿌리는 토양 수 및 미네랄 영양소에 더욱 큰 접근을 제공한다. 이러한 제한 요소에서의 증가는 식물 생물자원으로의 태양 에너지의 광합성 전환을 향상시킨다. 미국 농업 에이커 수의 80%에서 25% 만큼 식물 성장을 촉진시키면 전체 탄소 저장을 증가시킬 수 있고, 따라서 생물자원 생성 포텐셜을 20% 만큼 증가시킬 수 있다. 이러한 기술의 추가의 장점은, 지면 수를 종종 독성화하고 표면 흐름의 부영양화를 촉진하는 비료의 용해가 감소된다는 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 예증된다.

실시예 I. 메스퀴트 목탄에서 신규의 화재-극상 세균 균주의 동정

메스퀴트 목재를 연소시킴으로써 수득된 메스퀴트 목재 목탄으로부터 배양물을 성장시켰다. 대략 2 mm 내지 15 mm 직경의 미세하고 먼지와 같은 목탄 입자를 더욱 큰 조각의 목탄으로부터 분리하였다. 15 lb/in²에서 45분 동안 플라스크에서 250 ml의 TY 한천 배지를 오토클레이브처리함으로써 CP-1 (메스퀴트 목탄의 원료) 미분으로부터 세균을 단리하고, 오토클레이브로부터 배지를 꺼내고, 무균 한천의 온도를 약 200 ℉로 유지하면서, 5 g의 비-무균 CP1 "미분"을 250 ml 용액에 첨가함으로써 2% 목탄 현탁액을 제조하였다. 플라스크를 소용돌이쳐서 현탁액을 혼합하고 목탄을 함유하는 한천 배지 20 ml를 각각의 90mm 페트리 플레이트에 쏟아 부었다. 플레이트를 실온에서 냉각하고 한천을 고화시켰다. 28시간 후에, 세균 및 진균 콜로니가 플레이트 위에서 발생하였다. 72시간 후에, 14개 세균 콜로니를 골라내서 새로운 TY 한천 플레이트로 옮겼다. 14개 콜로니 중의 12개가 두 번째 세트의 플레이트에서 성장하였다. 12개 콜로니가 세 번째 세트의 TY 한천 플레이트에 다시 통과되었다. 세 번째 통과로부터 성장한 콜로니의 16S rDNA를 부분적으로 서열화하였다 (미국 델라웨어주 뉴아크 미디 랩스(Midi Labs)).

도 1은 가장 근접한 세균 서열 조화 및 상응하는 퍼센트 서열 차이를 나타낸다. 4개의 단리물 CP1-2, CP1-6, CP1-13 및 CP1-14를 동정할 수 없었다. "가장 근접한 조화"는 각각의 단리물이 5% 초과만큼 서열에서 차이가 난다는 것을 가리키고, 따라서 동일한 것일 가능성은 없다고 결론내려졌다. 도 2는 4개의 부조화 단리물에 대해 발견된 가장 근접한 진뱅크 서열 조화를 나타낸다. CP1-2, CP1-6, CP1-13 및 CP1-14 16S rDNA 서열은 진뱅크에서의 어떠한 서열에도 97% 초과만큼 조화되지 않는 것으로 밝혀졌다.

실시예 II . 아몬드 목탄에서 신규의 화재-극상 세균 균주의 동정

아몬드 목탄으로부터의 29개 단리물의 16S rDNA 서열을 검사하였다. 이러한 단리물 중에서, 하나는 브레비바실러스 센트로스포루스로 동정되었다. 또한, 19개 단리물이 상이하고, 8개는 종 수준으로 동정되었으며 (1% 이하의 차이), 6개는 1% 내지 5% 이상만큼 공지된 종으로부터 상이하였고, 3개는 5% 초과만큼 공지된 종으로부터 상이하였다. 서열 동정 표를 도 3A 내지 3C에 나타낸다.

부분 16S rDNA 서열 분석은, 도 3B에서 "C17304 AC23 con"으로 명명된 아몬드 목탄 단리물이 HAB7에 유사하게 브레비바실러스 센트로스포루스로부터 0.29% 차이를 갖고 있음을 나타내었다. HAB7은 실시예 III에 더욱 기재된 바와 같이 토양으로부터 단리된 세균 균주이다. C17304 AC23 con은 HAB7에서와 마찬가지로 25 mg/L 스펙티노마이신, 1 mg/L 테트라사이클린 및 2.5 mg/L 클로람페니콜의 조합에서 성장하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 III . 더글라스 전나무 및 나무껍질 대패밥의 탄화 방법 및 탄화된 재료로부터 화재-극상 미생물의 단리

최근에 베어낸 더글라스 전나무를 14" 조각으로 잘랐다. 나무껍질 조직 (즉, 인피부) 및 목재 (즉, 목질부)를 20" 체인 톱으로 따로따로 조각내고 모았다. 2개의 식물 조직을 1:1 비율로 함께 혼합하고 70 ℃에서 밤새 건조시키고 이후의 사용을 위해 밀봉된 유리 단지에 보관하였다.

일련의 2" 직경 세라믹 도가니에 10 g의 혼합된 조직을 넣었다. 이 실시예에 기재된 모든 실험을 위하여, 프로그램화가능한 온도 조절 및 5"(W) × 4"(H) × 6"(D) 챔버를 가진 240 V 반스테드 인터내셔날 머플 노 (모델 F47920-80)를 사용하였다. 산림의 화재 상태를 모방하기 위하여 1093 ℃에서 연속적으로 또는 1200 ℃에서 간헐적으로 시행될 수 있는 노가 사용되었다. 노를 600 ℃로 예열하고, 각각의 도가니를 다양한 기간 동안 노에 놓아 두었다. 도가니를 노 챔버에 놓아둘 때, 온도가 약 585 ℃로 잠시 떨어진 후에 600 ℃로 회복되었다. 4 분 후에, 검은색 연기가 윗쪽 배기구로부터 방출되면서 수 분 동안 노 온도가 605 ℃로 증가되었다. 도가니를 5, 10 및 15분 후에 꺼내고, 냉각하고 알루미늄 호일로 덮었다. 각각의 기간 동안 2개의 도가니를 따로따로 처리하였다. 미생물을 단리하기 위해 하나를 사용하고 다른 것은 사진을 찍었다. 이 실시예에 기록된 모든 실험은 일관된 탄화를 달성하기 위하여 규정된 기간 동안 노 안에 단지 하나의 도가니를 놓는 것을 포함하였다.

다양한 기간 동안 처리된 샘플의 물리적 특징은 상당히 상이하였다. 600 ℃에서 5 분 후에 꺼낸 샘플은 건조 중량에서의 감소에 의해 판단되듯이 대략 50% 탄화되었으며, 많은 목재 조각은 검게 되지 않았다. 10 또는 15 분 동안 노에 남아있는 것은 완전히 검게 되었으며 질량이 80 내지 90% 감소되었다. 어떠한 조각도 600 ℃에서 10 또는 15 분 후에 천연 목재 색을 유지하지 못하였다.

다양한 기간 동안 처리된 샘플로부터 수득된 세균 단리물의 수가 상이하였다. 대략 100 ℃의 오토클레이브 밖으로 꺼낼 때 각각의 탄화된 샘플을 250 mL의 고온 살균 TY 배지에 현탁시킴으로써 세균을 단리하였다. 각각의 혼합물을 12개의 100-mm 페트리 플레이트에 쏟아 부을 때 현탁액을 격렬히 소용돌이쳤다. 20 내지 25 ℃에서 배양 4일 후에, 플레이트를 관찰하고 16s rDNA 서열화에 의한 동정을 위하여 41개 세균 콜로니의 14개를 골랐다. 대부분의 단리물이 표준적인 바실러스-유사 세균에 속하였다. 그러나, 로도코쿠스 글로베룰루스는 스트렙토마이세스와 같은 토양 미생물에 더욱 밀접하게 관련된 액티노마이세트 유기체이다. 숫자로 나 타낸 총수는, 600 ℃에서의 10분이 이 실험에서 목재로부터 화재-극상 미생물을 단리하기 위해 최적의 조건을 만든다는 것을 나타내었다. 목재 및 나무껍질 조직의 다른 조합은 상이한 열 특징을 가질 수 있고 이것은 변경된 최적 조건을 만든다. 다른 목재 종은 추가의 세균 종을 함유할 수도 있다.

나타낸 바와 같이, 본 발명에 따르면, 특히 샘플의 수, 형태, 크기 및 경도가 샘플 전체에 걸쳐 외부 열이 얼마나 빨리 전달되는지에 영향을 미치기 때문에 샘플 자체의 물리적 성질이 중요하다.

물의 높은 기화 열은 물을 액체로부터 증기 상으로 전환시키기 위해 (즉, 끓이기 위해) 열 에너지를 사용하기 때문에, 샘플 내에 함유된 수분 또는 샘플을 둘러싼 공기는 탄화 특성을 변화시킬 것이다. 따라서, 상대적 퍼센트 습도 및 해수면 위로의 상승 (즉, 대기압)은 탄화 속도를 변화시킬 수 있다.

또한, 노에서의 열 경화 및 노출 시간이 탄화 속도에 영향을 미칠 것이다. 일정한 온도의 수치가 중요하다. 더욱 높은 온도는 더 낮은 온도에 비해 탄화를 빠르게 할 것이다. 샘플이 연소되는 한, 낮은 온도에서 더욱 긴 기간은 높은 온도에서의 짧은 기간에 상응할 수도 있다. 프로그램화된 온도 변화는 유사한 탄화 상태를 위해 상이한 조건을 만들 것이다.

10g의 더글라스 전나무로부터 생성된 콜로니-형성 단위(CFU)
600 ℃에서의 시간 (분)	세균 콜로니 (cfu/10 g 조직)	진균 콜로니 (cfu/10 g 조직)	16S rDNA에 의해 동정된 세균 종 (즉, 표준 균주로부터 <1.00% 차이)
0	0	0	적용되지 않음
5	0	1	적용되지 않음
10	41	0	바실러스 아밀로리케파시엔스, B.섭틸리스. B.푸밀루스, 브레비박테리움 프리고리톨레란스, 브레비바실러스 코시넨시스, 로도코쿠스 글로베룰루스
15	0	0	적용되지 않음

다른 형태의 탄화된 유기물로부터 세균 종을 단리하였다. 해양성 유기 폐기물의 형태이고 많은 유기 원예 가게에서 발견될 수 있는, 통상적으로 입수가능한 어분의 샘플을 600 ℃로 가열하고 95 ℃ TY 한천에 현탁시킨 후에 세균을 단리하고 16S rDNA의 부분 서열화에 의해 동정하였다 (표 2). 마이크로세크 데이타 베이스로부터 1% 초과로 빗나간 서열을 진뱅크 데이타 베이스와 비교하였다. 상이한 시간에 회수된 단리물은 서로 배타적이었다.

해양성 유기 폐기물로부터 세균 종의 단리
600 ℃에서의 시간 (분)	세균 (cfu/10 g)	마이크로세크 ID (가장 근접한 조화로부터의 % 차이)	진뱅크 ID (가장 근접한 조화에 대한 % 유사)
0	너무 많아서 셀 수 없음	바실러스 바디우스 (0.09) 바실러스 아밀로리케파시엔스(0.00) 바실러스 글로비스포루스(4.68) 바실러스 할로데니트리피칸스(8.91) 바실러스 스포로서모두란스 (1.07) 바실러스 종 (5.34)	적용될 수 없음 적용될 수 없음 바실러스 아쿠아마리누스 AF202056 (98) 바실러스 종 AF329473 (98) 바실러스 올레로니우스 AY988598 (98) 스포로사르시나 종 AJ971924 (97)
5	너무 많아서 셀 수 없음	서열화된 것 없음	--
10 15	6 6	바실러스 니아시니 (5.08) 바실러스 스미티이 (8.57) 바실러스 니아시니 (3.09) 바실러스 니아시니 (3.18) 바실러스 키티노리티쿠스 (8.18)	바실러스 아부티니보란스 AF519469 (98) 바실러스 엔도피티쿠스 AY211143 (99) 바실러스 종 DQ275174 (98) 바실러스 종 DQ275174 (98) 파에니바실러스 세풀로리 DQ291142 (95)

실시예 IV . 토양으로부터 화재-극상 미생물의 배양

샘플에 존재하는 포자형성가능한 미생물을 동정하기 위하여 모래섞인 옥토 토양 샘플 (캘리포니아 미드-칼 랜치)로부터 배양물을 성장시켰다. 이러한 목적을 위하여 동일한 부피의 토양과 물을 현탁시킴으로써 만들어진 용액 2.0ml를 비등 수 욕에 3분 동안 놓아둔 다음, 한천 TY 배지 (디프코 박토 트립톤 (5 g/l), 디프코 박토 효모 추출물 (3 g/l) 및 CaCl₂ (1.3 g/l), 디프코 박토 한천 (15 g/l)) 위에 분취량 (예, 0.5 ml)를 평판배양하였다.

이러한 절차에 의해 초기에 단리된 세균을 500 염기쌍 16S rDNA 서열화에 의해 호기성 내생포자-형성 세균 종으로서 동정하였다. 이러한 단리물은 브레비바실러스 센트로스포루스, 바실러스 섭틸리스 및 바실러스 메가테리움 (미국 델라웨어주 뉴아크 미디 랩스)로서 동정되었다. 도 4는, 샘플 DAP-1 내지 DAP-6의 각각에 대하여, 가장 근접한 세균 서열 조화 및 샘플 균주와 가장 근접한 조화 간의 상응하는 퍼센트 차이를 나타낸다. DAP-2 (또한 HAB7이라 일컬어짐)는 브레비바실러스 센트로스포루스인 것으로 결정되었다.

HAB7은 다수의 항체에 대한 내성을 갖고, 25 mg/L 스펙티노마이신, 1 mg/L 테트라사이클린 및 2.5 mg/L 클로람페니콜의 조합된 존재 하에서 풍부한 한천 배지 (TY)에서 성장할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 부분 16S rDNA 서열화를 기초로 하여, HAB7은 브레비바실러스 센트로스포루스로부터 0.29% 차이를 갖는 것으로 밝혀지고, 이것은 종 조화를 나타낸다. 브레비바실러스 센트로스포루스로부터 0.10% 차이를 나타내는, HAB7에 대해 수득된 완전한 16S-rDNA 서열을 도 5에 제공한다.

실시예 IV . 식물 성장에 미치는 세균 균주 HAB7 및 AC9 의 효과

전체 식물 성장을 촉진하는 HAB7의 능력을 2개의 연구에서 평가하였다. 첫 번째 연구에서, 2×10⁹ CFU/ft²에서 HAB7과 함께 그리고 HAB7 없이 고 (100-11.25-15 lb/ac) 및 저 (30-11.5-15 lb/ac) NPK의 조합을 포함하여 상이한 토양 처리를 사용하여 밀 종자를 밭 소구획에 심었다. 심은 후 2일에 토양을 처리하고, 심은 후 4개월 째에 수확하였다. 각각 3피트×5피트의 3개의 인접한 소구획을 표 3에 규정된 각각의 5개 조건 하에서 재배하였다. 따라서, 전체 15개 소구획이 사용되었으며, 표에 나타낸 각각의 숫자는 동일한 처리를 받은 3개 소구획으로부터의 평균 값을 나타낸다. 각각의 소구획의 중심에 면적 1×3 ft²를 수확하였다. HAB7은 고 또는 저 NPK의 존재 하에서 상당히 종자 수율을 증가시킨 것으로 밝혀졌다. 뿌리 성장을 측정하지 않았다. 처리 및 결과를 표 3에 나타낸다.

처리	새싹 건조 중량 (g/3ft²)	종자 수율 (g/3 ft²)	N 함량 (%)	단백질 함량(%)	수확된 총 N (mg)
비처리 대조	230	46	1.57	9.81	722
저 NPK (30-11.25-15 lb/ac)	270	63	1.39	8.69	876
고 NPK (100-11,25-15 lb/ac)	375	94	1.48	9.25	1391
저 NPK + HAB7	292 (+8%)	87 (+38%)^*	1.41	8.81	1227
고 NPK + HAB7	437 (+16%)^*	127 (+35%)^*	1.67	10.44	2121
LSD 0.05^#	53	17
* HAB7 효과는 비료 처리 단독에 비해 현저하였다 (P<0.05) # LSD 0.05 값은 모든 처리에 걸쳐 상당한 차이를 측정한다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 저 NPK에 HAB7을 첨가하면 새싹 건조 중량에서 8% 증가 및 종자 수율에서 38% 증가가 얻어졌다. 고 NPK에 HAB7을 첨가하면 새싹 건조 중량에서 16% 증가 및 종자 수율에서 35% 증가가 얻어졌다. HAB7/고NPK-처리된 토양에서 자란 밀 식물에서 질소의 큰 증가가 측정되었다.

두 번째 연구에서, HAB7의 존재 또는 부재 하에 고 또는 저 NPK와 함께 종자로부터 1년생 호밀 식물을 자라게 함으로써, 모든 뿌리를 회수할 수 있는 화분에서 가장 정확하게 평가된 뿌리 성장을 측정하였다. 식물을 64개 10-인치 화분에 심었다. HAB7 세포를 각각의 HAB7 처리 화분에 2×10⁹ CFU/ft²로 공급하였다. 뿌리가 화분에 결합되기 전에, 심은지 28일에 식물을 수확하였다. 개화 이전에 식물을 수확하고, 따라서 종자 수율 측정을 행하지 않았다. 식물을 건조시킨 후에, 모든 모래, 자갈 및 파편을 제거하고, 식물을 새싹 및 뿌리로 분리하였다. 처리 및 이 실험의 결과를 표 4에 나타낸다. 표는 뿌리 성장이 HAB7의 존재하에서 11% 만큼 증가되고 (P ≤ 0.05), 조합된 HAB7/고 NPK 처리를 제공할 때 33% 만큼 증가됨 (P < 0.05)을 나타낸다.

처리	새싹 (g)	뿌리 (g)	전체 (g)
없음	2.52 ab	2.67 b	5.19 ab
NPK (30-11.25-15 lb/ac)	2.85 ab	2.16 c (-19%)	5.00 b
HAB7 (NPK 없음)	2.40 b	2.95 a (+11%)	5.35 ab
NPK + HAB7	3.06 a	2.88 ab (+33%)	5.95 a (+19%)
* "NPK"는 질소, 인 및 칼륨을 나타낸다. 상이한 문자 다음의 값은 적절한 대조에 비하여 HAB7 (p<0.05)의 현저한 효과를 나타낸다.

AC9 뿐만 아니라 HAB7 및 AC9의 혼합물은 영양소-풍부한 화분 토양에서 식물 성장을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 2개의 시험으로부터의 대표적인 데이타를 표 5에 제공한다. 접종되지 않은 대조 식물에서의 변동은 1년 중 상이한 달에 변화하는 온도 및 빛을 반영하는 것이다.

28일 후에 밀 성장에 미치는 세균 접종물의 효과
처리	밀 새싹 건조 중량 (mg/식물)
비접종	535±30	219±11
AC9	662±45 (+24%) p ≤ 0.01
HAB7 + AC9		262±13 (+20%) p ≤ 0.01

실시예 VI . 세균 성장에 미치는 목탄의 효과

대표적인 미생물의 성장에 미치는 목탄의 촉진 효과는 HAB7에 의해 쉽게 증명되었다. 첨가제를 함유하지 않거나 1.5% 분쇄된 메스퀴트 목탄 ("CP-1")을 함유하는 TY 세균 배지에서 HAB7을 성장시켰다. 모든 배지를 접종 전에 pH 6.74로 조절하였다. 접종 후 0, 3 및 5일째에 정상적인 희석 기술에 의해 TY 한천 플레이트 위에서 세포를 콜로니-형성 단위(CFU)로서 수를 세었다. 접종 직후의 세포 밀도는 5 × 10⁴ CFU/ml였다. 결과는 목탄이 3일째에 비처리 대조 배양물에 비하여 대략 20배 및 5일째에 대략 8배의 세균 성장을 향상시킨다는 것을 나타낸다 (도 6). 각각의 처리에 대해 3개의 복제 배양물을 사용하여 결정된 5일째 효과는 매우 현저하였다 (P ≤ 0.01). 각각의 처리에서 단일 복제물을 사용하여 3일째 효과를 측정하였다.

낮은 농도 (0.375%) 및 높은 농도 (3%)의 분쇄된 목탄을 시험하는 유사하게 수행된 실험은, 1.5% 목탄이 비처리 대조 배양물에 비해 세균 성장을 향상시키는 반면, 낮은 농도는 성장에 대해 현저한 효과를 미치지 않지만 포자형성을 상당히 감소시킨다는 것을 나타내었다. 3% 목탄 처리는 1.5% 목탄에 비하여 세균 성장에 대해 상당한 증진 효과를 가지며, 그 결과 포자가 거의 없다. 접종 후 3일에 측정된 데이타를 표 6에 나타낸다. 영양생식 세포로부터 발생되는 것보다는 포자로부터 발생된 콜로니가, 3일째에 발생 지연 및 더욱 작은 콜로니 크기에 의해 동정되었다.

처리	총 세균 (CFU/ml)	포자로부터의 콜로니(%)
	평균 ± 표준 오차
비처리	4.76 ± 0.7×10⁷	14.4 ± 1.2
목탄, 0.375%	3.34 ± 0.2×10⁷	9.2 ± 0.4
목탄, 1.5%	13.0 ± 0.2×10⁷	4.6 ± 0.1
목탄, 3.0%	16.1 ± 0.8×10⁷	2.0 ± 0.5
통계 비교: 총 세균 포자로부터의 % 콜로니 1.5 & 3.0% vs TY P<0.001 P<0.01 0.375% vs TY 유의하지 않음 P<0.05 1.5 vs 3.0% P<0.05 P<0.01

실시예 VII . HAB7 에 의한 탄소 고정

¹³CO₂로부터 ¹³C를 혼입하는 HAB7의 능력을 검사하였다. 각각 25ml의 무균 TY 액체 배지를 함유하는 9개의 50ml 엘렌마이어 플라스크에, 밤새 배양물로부터의 HAB7의 2% 접종액을 공급하고, 36시간 동안 성장시켰다. 배양물을 145rpm의 진탕기에 25 ℃에서 놓아두었다. 모든 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하였다. 3개의 복제 플라스크는 대략 0.042% CO₂를 가진 대기 CO₂를 함유하였다 (1.085 원자% ¹³C). 2N HCl과 함께 60cc 주사기에서 ¹³C-중탄산나트륨 (98 원자% ¹³C)로부터 발생된 5% ¹³CO₂을 6개의 복제 플라스크에 공급하였다. 12, 18 및 36 시간 후에 각각의 플라스크로부터 5 ml 분취량을 수집하고 에펜도르프 관에서 원심분리에 의해 세균 세포를 제거하였다. 플라스크를 공기로 개봉하고 무균 운반 후드에서 재밀봉하고, 각각의 샘플 채취 시점에 5% CO₂로 명시된 것을 5% ¹³CO₂로 새로 보급하였다. 에펜도르프 관에 있는 샘플을 동결 건조하고 ¹²C/¹³C 동위원소 질량 분광분석법에 의해 ¹³C 함량에 대해 분석하였다. 표준 참조 1.08504 원자 % ¹³C에 비교하여 ¹³C의 변화를 계산하고 Δ¹³C 원자 %로 기록하였다. 정상 TY 배지 위에서의 세포 희석 수를 HAB7에 대해 선택적인 3개의 항생물질의 혼합물을 함유하는 TY 위에서의 수와 비교함으로써, 실험 마지막에서 HAB7의 오염 가능성을 제외하였다. 데이타 (CFU)는 각각의 플라스크에 대해 2개의 배지 상에서 유사하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, HAB7 세포는 CO₂를 전체 탄소의 대략 0.25% 수준까지 혼입하였다 (검은색 원). 12 내지 18시간 사이 및 12 내지 36시간 사이에서 ¹³C 함량의 증가는 매우 중요하다 (p ≤ 0.001). 증가된 CO₂ 농도 (검은색 삼각형)는, 주변 대기 CO₂ (흰색 삼각형)에 비하여, T₁₂ (12 시간)에서 50% 만큼 (P ≤ 0.01), 그리고 T₃₆ (36 시간)에서 12% 만큼 (P ≤ 0.01) 세포 성장 (질량)을 촉진하였다.

실시예 VIII . 목탄에서 화재-극상 미생물에 의한 탄소 고정

시험은 메스퀴트 목탄 (CP-1)에 존재하는 화재-극상 미생물이 CO₂를 명백히 혼입한다는 것을 확고히 하였다 (표 4). 각각 25ml의 무균 TY 액체 배지를 함유하는 에렌마이어 플라스크 (50 ml 크기)에, 1) 배경 ¹³C의 흡착에 미치는 목탄의 물리적 효과를 정량화하기 위하여 주변 CO₂의 존재하에서 오토클레이브처리된 CP-1, 또는 2) 고 표지화 ¹³CO₂ (98 원자% ¹³C)로부터 ¹³C의 흡착에 미치는 목탄의 물리적 효과를 정량화하기 위하여 5% ¹³CO₂의 존재하에서 오토클레이브처리된 CP-1, 또는 3) 고 표지화 ¹³CO₂ (98 원자% ¹³C)로부터 CO₂의 흡수에 미치는 CP-1 내의 미생물의 효과를 정량화하기 위하여 5% ¹³CO₂의 존재하에서 비-무균 CP-1, 또는 4) CO₂를 흡수하는 세균의 입증된 능력을 이 시험에서의 다른 처리에 관련시키기 위하여 5% ¹³CO₂의 존재하에서 HAB7로 접종된 무균 CP-1을 접종하였다. 따라서, CO₂ 수준은 주변 0.42% CO₂ (1.08515 원자% ¹³C) 또는 5% CO₂ (98원자% ¹³C)이었다. 플라스크는 전체 72시간 실험을 위해 밀봉된 채로 유지되었다. ¹³C 분석 이전의 무균성을 입증하기 위하여 연구의 마지막에 처리 1 및 2에서 플라스크로부터의 샘플을 TY 배지에 평판배양하였다. 처리 3 및 4에서의 플라스크를 72시간 기간의 마지막에 오토클레이브처리한 다음, 각각의 플라스크에서 세균 현탁액으로부터의 여과에 의해 목탄을 분리하였다. ¹³C 분석 이전에 목탄을 75 ℃에서 건조시켰다. 처리 3 및 4에서의 세균 (및 일부 CP-1)을 세균 현탁액의 원심분리에 의해 수집하고, ¹³C 분석 전에 가열 램프 하에서 건조시켰다. 각각의 샘플의 ¹³C 함량을 ¹²C/¹³C 동위원소 비율 질량 분광분석법에 의해 측정하였다. 1.08504 원자 ¹³C를 함유하는 표준 참조에 비교한 ¹³C에서의 변화를 계산하고 Δ ¹³C 원자%로서 기록하였다.

데이타는, CP-1 미생물이 무균 ¹³C 대조 (P < 0.01)에 비해 상당히 높고 실시예 VII에서 CO₂를 혼입하는 것으로 증명된 유기체인 HAB7 처리에서 측정된 것과 유사한 수준까지 CO₂를 혼입하였음을 나타낸다.

처리	분획	¹³CO₂	Δ¹³C 원자%
1) 무균 주변 조절	무균 목탄	없음	-0.00240
2) 무균 ¹³대조	무균 목탄	5%	0.00049±0.00044
3) CP1 군	비무균 목탄	5%	0.00470±0.00233
	세균성 여액	5%	0.145±0.069
4) HAB7 접종물	무균 목탄	5%	0.00426
	세균성 여액	5%	0.186

실시예 IX . 이산화탄소에 의한 HAB7 성장의 촉진

HAB7의 성장에 미치는 CO₂의 효과를 평가하였다. 각각 25 ml의 TY 및 액체 위에 30 ml의 대기를 함유하는 50 ml 플라스크에 2% 접종물을 공급하기 위하여 TY 배지에서 성장하는 HAB7의 밤새 배양물을 사용하였다. T₀ (접종 시간), T₁₅ (접종 후 15시간), T₃₆ (접종 후 36시간) 및 T₄₂ (접종 후 42시간)에서 TY 한천 배지에 희석 평판배양함으로써 콜로니-형성 단위(CFU)를 세었다. 접종 후 및 각각의 샘플 채취 후에, 부피 기준으로 대기 (대략 0.042%), 5% CO₂ 또는 9.8% CO₂를 함유하도록 액체 위의 공기 공간에 있는 대기 CO₂를 조절하였다. 원심분리에 의해 세포를 수집한 후에 T₄₂에서의 세포 수율을 측량하였다. 데이타를 표 8에 나타낸다. 5% 및 9.8% CO₂ 처리는 CFU/ml를 로그 성장 (T₁₅) 동안에 상당히 증가시켰으나, 9.8% CO₂는 42시간 샘플 채취 시간에서 CFU/ml를 현저히 감소시켰다.

이러한 결과는 추가의 CO₂가 로그 성장 동안에 지방산 합성 및 막 형성을 자극하지만, 가장 높은 CO₂ 처리는 결국 세포 치사율을 증가시킨다는 것을 보여주는 것으로서 해석될 수 있다. 실험의 시작에서 과다한 CO₂로 공급된 플라스크에서 세포 수를 증가시키기 위해 과다한 막이 사용되었다. TY 배지가 풍부하기 때문에, 기질 제한이 존재하지 않으며, 따라서 최적의 막 합성을 뒷받침하기 위해 세포 호흡이 충분한 CO₂를 생성할 때 대조 처리는 높은 CO₂ 플라스크로 갑자기 올라갔다. 건조 중량 데이타는 대조 처리에서의 세포가 더 높은 CO₂로 성장한 배양물에 비해 더 많은 다당류를 생성할 수 있음을 제시한다.

실시예 X. 유생생식 조절인자는 식물 비타민 E 함량을 증가시킨다

식물 영양 성질에 미치는 본 발명의 조성물 및 방법의 효과를 평가하기 위하여, 통상적으로 자란 식물 및 목탄으로 처리된 토양에서 자란 식물로부터 수득된 식물 생성물에서 비타민 E의 수준 (α- 및 γ-토코페롤)을 분석하였다.

2종의 아몬드 견과 샘플 (각각 3개의 복제물)을 분석하였다. 하나의 샘플은 데이타 표에서 "다이아몬드"로 명시된 "다이아몬드 오브 캘리포니아" 상품 브랜드였다. 두 번째 샘플은, 이전의 2년 동안 매년 에이커 당 200 파운드의 비율로 실시예 I에 기재된 바와 같이 제조된 통상적인 목탄으로 처리되어진 토양에서 미드-칼 랜치("미드-칼")에서 자란 나무에서 수확한 대량 아몬드로부터 수득되었다. 아몬드 샘플 (샘플 당 6온스)를 커피 분쇄기에서 분쇄하고, 토코페롤 함량 분석을 위하여 영리 실험실 (미국 캘리포니아 아나하임 아나하임 인코포레이티드의 분석 실험실)로 보내었다. 아몬드 "페이스트"를 메탄올로 추출하고, HPLC를 사용하여 토코페롤을 분리하고, LC-MS (액체 크로마토그래피-질량 분광분석법) 방법을 사용하여 분석하고 표준과 비교하였다.

각 샘플에서 관찰된 토코페롤 수준을 표 9에 나타낸다. 미드-칼 랜치 아몬드의 α-토코페롤 함량은 다이아몬드 아몬드의 함량에 비해 39% (P≤0.05) 더 높았다. 미드-칼 랜치 아몬드의 γ-토코페롤 함량은 다이아몬드 아몬드에 비해 200% (P ≤ 0.01) 더 높았다.

식물 생성물 중의 토코페롤 함량을 평가하기 위해 유용한 다른 방법은 예를 들어 문헌 [Gutierrez 등, 1999, "Influence of ecological cultivation on virgin olive oil quality" J.Amer.Oil Chemists Soc. 76: 617-621] 및 [Martinez,J.M. 등, 1975, "Report About the Use of Absencor Yields Analyser" Grasas Aceites 26: 379-385]에 기재되어 있다.

	미드-칼 α-토코페롤 mg/kg	미드-칼 γ-토코페롤 mg/kg	다이아몬드 α-토코페롤 mg/kg	다이아몬드 γ-토코페롤 mg/kg
복제물 1	164	1.35	122	0.391
복제물 2	207	1.73	130	0.561
복제물 3	183	1.63	147	0.567
평균	184.7	1.57	133.0	0.51
표준 오차	12.4	0.11	7.4	0.06

실시예 XI . 양상추의 HAB7 증가된 식물성화학물질 함량

버터크런치 양상추를 에이스 화분 토양을 함유하는 2-gal 화분을 사용하여 카스파 온실에 심었다. 8개 화분 중 4개를 HAB7로 접종하였다. 발아 후에 각각의 화분을 2개의 식물로 성기게 만들었다. 식물을 약 2 개월 후에 수확하고, 중량을 재고, 분석을 위해 실험실로 옮기면서 얼음 위에서 또는 냉장 하에서 냉각하였다. 비타민 분석을 위한 각각의 처리를 위하여 양상추의 동등한 크기의 결구를 선택하였다. 모든 데이타를 원값 및 로그-변환 수를 사용하여 이원변량분석으로 검사하였다.

결과는 수확된 전체 생물자원 (2개의 결구/화분)이 대조 및 HAB7 처리 사이에서 상당한 차이가 없음을 나타내었다. 비타민 함량을 측정하기 위하여 각각의 화분에서 양상추의 더욱 큰 결구를 사용하였으며, 각각의 결구에 대한 평균 값 (±SE)은 대조 및 HAB7-처리 화분에서 각각 163±17 및 159±16이었다.

HAB7-처리된 화분에서 성장한 양상추의 비타민 C 함량은 50%가 넘게 증가하였으며, 총 비타민 E 함량 (α- 및 γ-토코페롤)은 80%가 넘게 증가하였다.

처리	비타민 C (mg/100g)	총 비타민 E (㎍/100g)
없음	8.5	37
HAB7	13.3 (+56%) P≤0.05	67.3 (+82%) P≤0.05

실시예 XII . HAB 에 대한 우레아의 효과

우레아의 존재하에서 HAB7를 배양함으로써 HAB7의 성장 및 생존에 미치는 우레아의 효과를 시험하였다.

에이커 당 200 파운드의 질소를 적용하는 통상적인 농업 실행을 기초로 하여, 100 mM 우레아를 정상 토양의 첫 번째 1 인치에 일시적으로 존재하는 농도로서 계산하였다. HAB7를 TY 배지에 접종하고 실온에서 대략 1×10⁷ CPU/ml까지 밤새 성장시켰다.

밤새 배양물을 TY (3개 플라스크) 또는 TY + 100mM 우레아 (3개 플라스크)를 함유하는 플라스크 (플라스크 당 200㎕ 밤새 배양물)에 접종하였다. 30 시간 후에, 6개 플라스크의 각각으로부터 10배 연속 희석을 제조하고 각각의 희석 관으로부터 하나의 50 ㎕ 분취량을 TY 한천에 평판배양하였다. 50 ㎕ 방울로부터 발생되는 콜로니 형성 단위 (CFU)를 세고 각각의 플라스크에서 눈에 보이는 세포의 수를 계산하기 위해 사용하였다. 학생의 시험을 사용하여 우레아 처리 효과에 대해서 평균 값 ± 표준 오차를 비교하였다.

도 8은 우레아의 존재 또는 부재 하에서 30 시간 후에 세균 밀도의 증가를 나타낸다. TY에서, 세균은 12 초과의 계대를 통과하지만, 100 mM 우레아의 존재하에서는 5보다 적은 계대가 발생하였다. 그 결과, 우레아-함유 플라스크는 대조 플라스크만큼 많은 HAB7 세포의 1% 미만을 가졌다. 이 시험에서 우레아의 효과 (t=2.91, n=4)는 현저하였다 (P≤0.05).

플라스크 희석과 동시에, 밤새 배양물 자체로부터 10배 연속 희석을 준비하였다. 밤새 배양물의 다양한 희석으로부터 50 ㎕의 3개의 독립적인 분취량을 TY 또는 TY+100 mM 우레아를 함유하는 별개의 한천 플레이트 위에 평판배양하였다.

평판배양 시험은, 밤새 배양물로부터의 세포의 58%가 TY 한천 + 100mM 우레아 플레이트에서 성장하지 못했음을 나타내었다. 예를 들어, 10^-4 희석 플레이트는 TY 상에서 50.5 ± 5.5 콜로니를 생성하며 TY + 100mM 우레아 상에서 21.3 ± 3.2 콜로니를 생성하였다. 이 시험 (t=4.51, n=4)에서 우레아의 효과는 현저하였다 (P ≤ 0.05).

따라서, 일반적인 농업 실행에서 사용된 농도의 우레아는 HAB7 세균의 성장에 악 영향을 미친다.

실시예 XIIII . 식물 플라보노이드 함량에 미치는 유생생식 조절인자의 효과

식물성화학물질 함량, 특히 이소플라노보이드, 예컨대 사이토에스트로겐 및 기타 플라보노이드를 증가시키기 위해 여기에 개시된 미생물 유기체 및 탄소 공급원을 사용할 수 있다. 탄소 공급원, 예컨대 메스퀴트 목탄으로 개량된 토양에서 식물이 성장될 수 있다. 이어서 토양을 미생물 유기체, 예컨대 바실러스 센트로스포루스, 바실러스 섭틸리스 또는 바실러스 메가테리움으로 개량할 수 있다. 토양에서 유생생식을 핵형성하기 위하여 미생물 유기체의 조합을 사용할 수 있다. 명백한 성장 후에, 식물 뿌리 및 식물 잎 물질을 이소플라보노이드 및 플라보노이드 함량을 포함하는 식물성화학물질 함량에 대해 분석하였다.

문헌 [Ren, H. 등, 2001, "Antioxidative and antimutagenic activities and polyphenol content of pesticide-free and organically cultivated green vegetables using water-soluble chitosan as a soil modifier and leaf surface spray", J.Sci.Food Agric. 81: 1426-1432]에 기재된 바와 같이 플라보노이드 함량을 결정할 수 있다. 분석 및 개량되지 않은 토양에서 자란 대조 샘플 채소와의 비교를 위해, 토양 또는 본 발명의 방법에 따라 제조된 식물 재배 배지에서 자란 수확된 채소를 냉장된 용기에서 연구실로 옮긴다. 채소 줄기의 일부 (각각 50 내지 60 kg)을 5 내지 20개 샘플 (각각의 채소에 대해 전체 1.5 내지 2.0 kg)으로부터 무작위로 잘라낼 수 있다. 샘플을 흐르는 수돗물 및 정제수로 세척하고, 종이 타월로 닦고 착즙기 (모델 MJ-C29, 일본 고베 마쓰시타 일렉트릭 컴퍼니)로 처리하였다. 즙을 5 ℃에서 3800 × g에 이어서 13500 × g에서 각각 10분간 원심분리하여 미립자를 제거하였다. 상층액을 미생물 분석을 위하여 방사선-살균 막 (공극 크기 0.45 ㎛, 일본 도오꾜 도요 어드밴텍)을 통해 여과하였다. 모든 샘플을 폴리페놀 함량을 위해 분석할 때까지 살균된 바이알에서 -80 ℃에서 보관하였다.

문헌 [Vazquez,A. 등, 1973, "Determination de los Polifenoles Totales del Aceite de Oliva" Grasas Aceites 24: 350-357]에 기재된 바와 같이 폴린-데니 시약 또는 몰리브덴산암모늄을 사용하여 열량측정법에 의해 전체 폴리페놀 및 오르소디페놀을 결정할 수 있다. STR ODS-II 세미-마이크로 컬럼 (150 mm × 2.1 mm 내경, 신와 케미칼 인더스트리(Shinwa Chemical Industry), 일본 교또)과 조합하여 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS)를 위한 QP-8000α (일본 교또 시마즈) 장치를 사용하여 각각의 플라보노이드 수준을 측정할 수 있다. 이동 상으로서, 0.2% 아세트산 용액(A) 및 메탄올(B)을 (1) 30 내지 50% B (0-5mm), (2) 50-90% B (5-10mm), (3) 90% B (10-15 mm), (4) 30% B (15-25mm)의 구배 곡선으로 컬럼을 통해 통과시킬 수 있다.

검정 표준으로서 사용하기 위한 순수한 시약 (예, 카페인산, 헤스페리딘, 헤스페리틴, 미리세틴, 쿠에르시트린, 퀘르세틴, 아피게닌 및 바이칼레인)은 예를 들어 시그마 케미칼 (미국 미조리주 세인트 루이스)로부터 통상적으로 입수가능하다. 이들을 개별적으로 메탄올에 용해시키고 이어서 30% 메탄올 중에 적절한 농도까지 만들었다. 0.2 ml min^-1의 일정한 유동 속도로 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 주입된 샘플 부피는 5 ㎕이고, 컬럼은 오븐에서 40 ℃로 유지시킨다. 계면을 위해 대기압 화학 이온반응(APCI)을 사용하고, 질소 흐름을 분무기 기체로서 2.5 리터 min^-1으로 조절하였다. 각각의 화합물을 표준과 비교한 그의 체류 시간 및 MS 검출기로부터 수득된 분자량 정보에 의해 동정한 후에, 선택된 이온 검사에 의해 수득되는 1-포인트 절대 검정 곡선을 사용하여 정량적 결정을 수행한다.

적어도 3개의 상이한 달에 독립적으로 수확된 채소로부터 시험 샘플을 제조한다. 3개의 상이한 달에 제조된 채소 즙을 사용하여 각각의 시험을 2회 반복하고, 각 샘플의 생물학적 활성 및 화학 조성을 평가하기 위하여 수득된 데이타의 6개 세트를 사용한다. 학생의 t-시험을 사용하여 시험 샘플과 대조 샘플 간의 차이의 통계적 의미를 결정할 수 있다.

실시예 XIV . 선천적 면역 체계 활성에 미치는 식물 영양소, 식물성화학물질 및 세균 항원의 효과

포유동물 종에서 면역 체계 활성을 증가시키기 위하여, 여기에 개시된 방법 및 조성물에서 성장한 식물로부터 단리된 미생물 항원, 식물 영양소 및 식물성화학물질을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이소플라보노이드 및 플라보노이드를 포함하여 미생물 항원 또는 영양소 및 식물성화학물질을 식물 뿌리 또는 식물 물질 샘플로부터 단리하고 쥐 또는 생쥐에게 공급할 수 있다. 대안적으로, 여기에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 성장한 식물로부터 식물 추출물을 제조할 수 있고, 쥐 또는 생쥐에게 공급할 수 있다. IgA의 증가된 생성을 통해 선천적 면역 체계의 활성화, 또는 선천적 면역 체계에서 톨(toll)-유사 수용체의 자극을 포함하여, 면역 체계 활성을 검사함으로써 효과를 결정할 수 있다. 시험자의 혈액에서 리소자임 및 락토페린을 포함한 면역 단백질의 측정에 의하여 선천 면역을 평가할 수 있다 [Bard, E. 등, 2003, Feb.Clin.Chem.Lab.Med. 41(2): 127-33].

건조한 관에 혈액 샘플을 수집하고, 즉시 얼음 위에 놓고 4 ℃에서 10분 동안 1000 × g로 원심분리에 의해 정화한다. 아프로티닌 (0.0025%) 및 소듐 아지드 (0.1%)를 상층액에 첨가하고, 200 ㎕의 분취량을 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관한다.

입의 한쪽에서 5분 동안 구멍 스테논 도관의 축에서 잇몸과 볼 사이에 "살리베트"(프랑스 오르세이 사르스테트)를 위치시킨 다음 다른 쪽에도 위치시킴으로써 타액 샘플을 수득할 수 있다. 수득된 타액을 즉시 얼음 위에 놓고, 1000 × g에서 4 ℃에서 10분 동안 원심분리함으로써 정화시키고 "살리베트"로부터 타액을 분리하였다. 아프로티닌 (0.0025%) 및 소듐 아지드 (0.1%)를 상층액에 첨가하고, 200 ㎕의 분취량을 사용시까지 -20 ℃에서 보관하였다.

1-리터 플라스틱 단지에 변 샘플을 수집하고 수집 후 2시간 이내에 실험실로 보내기 전에 4 ℃에서 냉장하였다. 대변의 새로운 중량을 측정하여 단백질의 변 배출량을 결정하였다. 3-배 희석 샘플을 사용하여 대변 단백질 농도를 결정하였다. 대변 단백질을 추출하기 위하여, 4 ℃에서 1시간 동안 10 ml의 NaCl (0.15M)과 함께 5g의 균질화 대변을 자기 교반기로 강하게 진탕하였다. 4 ℃에서 10분 동안 3000 × g에서 원심분리 후에, 소듐 아지드 (대변 농도 0.1% 중량/부피) 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF) (5 mM에서의 최종 농도)를 대변 추출물에 첨가한다. 소듐 아지드는 미생물 증식의 억제제이고, PMSF는 소화 효소 (트립신, 펩신) 및 세균의 억제제이다. 대변 추출물을 200 ㎕ 관에 분배하고 -20 ℃에서 동결시켰다.

문헌 [Belec 등]에 의해 기재된 세척 기술을 사용하여 자궁경부 분비물을 수득할 수 있다. 3 밀리리터의 무균 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 피펫으로 질에 넣는다. 각각 60초 동안 지속되는 유출 및 역류 주기 후에, 2 내지 3ml의 유체를 수집한다. 이 샘플을 1000 × g에서 4 ℃에서 10분 동안 원심분리한다. 세포를 함유한 펠릿 및 기타 점액을 이후 연구를 위해 동결하는 동안 Lz 및 Lf를 측정하기 위해 상층액을 사용한다. 헴 체크(Hem Check) 1 시험에 의하여 혈액 오염의 가능성을 제거할 수 있다. 자궁경부 세척액을 위해 희석 인자를 종종 사용할 수 있다.

수집된 혈청, 타액, 변 및 자궁경부 분비물에서 시간-분해 면역형광계측법 분석 (TR-IFMA)에 의해 Lz 및 Lf의 측정을 분석한다. 마이크로웰 면역 플레이트 (마이크로웰 맥시소르프, 프랑스 라이프 테크놀로지)를 코팅하고, K₂HPO₄ 완충액 (50 밀리몰/l, pH 8.5)에서 5 mg/l 농도 (토끼 항-인간 Lz 정제된 다클론성 JgG, 덴마크 코펜하겐 다코판스 다코)에서 인간 Lz에 대해, 그리고 5 mg/l 농도 (토끼 항-인간 Lf 정제된 다클론성 IgG, 다코)에서 인간 Lf에 대해 정제된 IgG와 함께 4 ℃에서 밤새 배양한다. 차단 용액 (50 밀리몰/l Na₂HPO₄, 1% 소 혈청 알부민 (BSA))과 함께 플레이트를 배양함으로써 비특이성 단백질-결합 부위를 차단한다. 시험 샘플 및 표준 정제 Lz (7개 수준: 1.02; 2.55; 4; 6.4; 10; 16 및 25 ㎍/l) 또는 Lf (8개 수준: 1.02; 2.55; 6.4; 10; 16; 40 및 100 ㎍/l) (프랑스 보르고잉 잘뢰 시그마 휴먼 밀크 Lz; 보르고잉 잘뢰 시그마 휴먼 밀크 Lf)의 연속 희석 (비율 2.5)을 웰에 첨가한다. 사용된 각각의 플레이트에 대해 블랭크 및 3개 상이한 농도 (표준 시험 선형)에서 포지티브 대조 (휴먼 밀크 Lz, 휴먼 밀크 LU)를 전체적으로 첨가한다. 부드럽게 교반하면서 실험실 온도에서 플레이트를 2시간 동안 배양한다. 이것을 자동 플레이트 세척기로 6회 세척한 다음, 250 ㎍/l 토끼 항-인간 lz 비오틴 농도 또는 250 ㎍/l 토끼 항-인간 Lf/비오틴 농도에서 비오틴 접합 IgG와 함께 부드럽게 교반하면서 2시간 동안 배양한다. 100 ㎍/l 농도에서 유로피움과 접합된 스트렙타비딘 (유로피움으로 표지화된 스트렙타비딘, 핀란드 투르크 월락 델피아(Delfia)^TM)을 웰에 첨가하고, 실온에서 부드럽게 교반하면서 2시간 동안 배양한다. 자동 플레이트 세척기로 6번 세척 후에, 교반 하에 10분 동안 증진 용액 (델피아 Ref. 1244-104, 핀란드 투르크 월락)을 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 빅터 2 형광계측기 (핀란드 투르크 월락 1420 멀티라벨 카운터)로 615 nm에서 형광계측 시그날을 판독한다. 소프트웨어 (멀티칼크 2000^TM, 핀란드 투르크 월락)에 의해 데이타를 분석한다. 표준 곡선을 참조하여 정량적 결과를 결정한다. TR-IFMA 기술을 위해 희석을 고려하는 희석 인자에 의해 농도를 수정한다.

인간 배출물에서 단백질 배출의 매개변수를 비교하고, 다른 종과의 비교를 가능하게 하기 위하여 각각의 단백질을 위한 상대 배출 계수 (RCE)를 결정할 수 있다. RCE는 알부민에 비해 단백질 분비 비율을 표현하고, 이것은 수동 확산에 의해 혈장으로부터 완전히 유래된다. 알부민을 언급하는 RCE는, 알부민이 효소에 의해 분해되지 않는 유체, 즉 타액 및 자궁경부 분비물에 단지 적용될 수 있다. 따라서, AAT를 언급하는 RCE는 변 샘플에서 사용되었다. 하기 식에 따라 RCE를 수득한다: [(혈청 중의 알부민 또는 AAT)/(유체 중의 알부민 또는 AAT)]/[(혈청 중의 단백질)/(유체 중의 단백질)]. 분비 및 형질도입 간의 한계 (컷-오프 점)는 1이다 (알부민 또는 AAT의 RCE). 이러한 한계 하에서, 혈청 구획으로부터의 형질도입이 발생하는 반면, 1 초과의 RCE는 소량의 형질전환과 함께 현저한 국소 분비를 증명한다.

결과를 평균 ± 평균의 표준오차(SEM), 중앙값 및 범위 값으로 표현할 수 있다. 맨-위트니(Mann-Whitney) U-시험에 의해 분비물 간의 평균의 비교가 달성된다. 0.05와 동일하거나 그 미만인 p에서 상당한 차이가 설정될 수 있다. PC를 위한 스타트뷰(StatView)TM 소프트웨어를 사용하여 통계적 분석을 수행한다 (SAS 인스티튜트 인코포레이티드).

서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims

화재-극상 미생물의 포자의 소멸 직전 정도까지 탄화가 진행되도록 하는 조건 하에서, 화재-극상 미생물의 포자를 함유하는 유기 재료를 가열하는 것을 포함하는, 화재-극상 미생물의 단리에 적합한 탄화된 유기 재료의 제조 방법.
제1항에 있어서, 화재-극상 미생물의 포자가 소멸되는 조건으로부터 약 1 BTU 떨어진 조건 하에서 가열을 수행하는 방법.
제2항에 있어서, 가열을 약 600 ℃에서 약 10 내지 약 15분 동안 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유기 재료가 식물 재료 또는 해양성 폐기물 재료인 방법.
제1항에 있어서, 생성된 탄화된 재료로부터 상기 화재-극상 미생물의 포자를 회수하는 것을 더욱 포함하는 방법.
a. 화재-극상 미생물의 포자를 함유한 탄화된 유기 재료를 성장 배지에 접종하고;

b. 상기 성장 배지를 배양시켜 상기 포자가 영양생식 성장을 시작하도록 하고 이에 의해 상기 화재-극상 미생물을 생성하는 것을 포함하는,

탄화된 유기 재료로부터 화재-극상 미생물을 생성하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 탄화된 유기 재료가 탄화된 식물 재료인 방법.
제7항에 있어서, 상기 탄화된 식물 재료가 목탄인 방법.
제8항에 있어서, 목탄이 메스퀴트 목탄 또는 아몬드 목탄인 방법.
제6항에 있어서, 상기 탄화된 유기 재료가 탄화된 해양성 유기 폐기물인 방법.
제6항에 있어서, 유기 재료를 약 600 ℃에서 적어도 10분 동안 가열함으로써 상기 탄화된 유기 재료가 생성되는 방법.
제6항에 있어서,

c. 상기 성장 배지로부터 화재-극상 미생물을 분리하는 것을 더욱 포함하는 방법.
제6항에 있어서,

c. 상기 성장 배지에서 생성된 화재-극상 미생물로부터 개별 균주를 단리하는 것을 더욱 포함하는 방법.
a. 상기 토양 샘플을 물과 혼합하여 액체 현탁액을 수득하고;

b. 상기 액체 현탁액을 끓이고;

c. 끓인 현탁액의 분취량을 성장 배지에 접종하고;

d. 배지 내에서 화재-극상 미생물의 영양생식 성장이 가능하도록 성장 배지를 유지시키는 것을 포함하는, 토양 샘플로부터 화재-극상 미생물을 단리하는 방법.
제14항에 있어서,

e. 상기 성장 배지로부터 화재-극상 미생물을 분리하는 것을 더욱 포함하는 방법.
제14항에 있어서,

e. 상기 성장 배지에서 생성된 화재-극상 미생물로부터 개별 균주를 단리하는 것을 더욱 포함하는 방법.
화재-극상 미생물이 호기성 세균이고 약 600 ℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 것인, 화재-극상 미생물을 포함하는 조성물.
제17항에 있어서, 상기 화재-극상 미생물이 탄화된 유기 재료, 토양 또는 이들의 혼합물로부터 단리되는 것인 조성물.
제18항에 있어서, 상기 화재-극상 미생물이 제6항 또는 제14항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 것인 조성물.
제17항에 있어서, 상기 화재-극상 미생물이 바실러스 센수 라토인 조성물.
제20항에 있어서, 상기 화재-극상 미생물이 HAB7, AC9 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
화재-극상 미생물이 호기성 세균이고 약 600 ℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 것인 단리된 화재-극상 미생물.
제22항에 있어서, 화재-극상 미생물이 목탄, 토양 또는 이들의 혼합물로부터 단리되는 것인 단리된 화재-극상 미생물.
HAB7 또는 AC9로서 명명되는 단리된 화재-극상 미생물.
a. 화재-극상 미생물의 포자를 함유한 탄화된 유기 재료를 성장 배지에 접종하고;

b. 상기 성장 배지를 배양시켜 상기 포자가 영양생식 성장을 시작하도록 하고 이에 의해 상기 화재-극상 미생물을 생성하고;

c. 단계 b에서 생성된 화재-극상 미생물로부터 개별 균주를 단리하고;

d. 식물 성장을 향상시키는 개별 균주의 능력을 결정하고;

e. 식물 성장을 향상시키는 화재-극상 미생물 균주를 동정하는 것을 포함하는, 식물 성장을 향상시킬 수 있는 화재-극상 미생물을 동정하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 탄화된 유기 재료가 탄화된 식물 재료인 방법.
제26항에 있어서, 상기 탄화된 식물 재료가 목탄인 방법.
제27항에 있어서, 상기 목탄이 메스퀴트 목탄 또는 아몬드 목탄인 방법.
제25항에 있어서, 상기 탄화된 유기 재료가 탄화된 해양성 폐기물인 방법.
제25항에 있어서, 상기 탄화된 유기 재료가 약 600 ℃에서 적어도 10분 동안 유기 재료를 가열함으로써 제조되는 것인 방법.
a. 화재-극상 미생물의 포자를 함유한 토양 샘플을 물과 혼합하여 액체 현탁액을 수득하고;

b. 상기 액체 현탁액을 끓이고;

c. 성장 배지에 끓인 현탁액의 분취량을 접종하고;

d. 상기 성장 배지를 배양하여 상기 포자가 영양생식 성장을 시작하도록 하고 이에 의해 상기 화재-극상 미생물을 생성하고;

e. 단계 d에서 생성된 화재-극상 미생물로부터 개별 균주를 단리하고;

f. 식물 성장을 향상시키는 상기 개별 균주의 능력을 결정하고; 식물 성장을 향상시키는 화재-극상 미생물 균주를 동정하는 것을 포함하는,

식물 성장을 향상시킬 수 있는 화재-극상 미생물의 동정 방법.
적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시키는 것을 포함하고, 상기 화재-극상 미생물이 호기성 세균이고 약 600 ℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 것인, 식물 성장 및 생산성을 자극하는 방법.
제32항에 있어서, 상기 식물 재배 배지가 탄화된 식물 재료로 보충되는 것인 방법.
적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시키는 것을 포함하고, 상기 화재-극상 미생물이 호기성 세균이고 약 600 ℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 것인, 식물의 생성물의 영양소 또는 식물성화학물질 함량을 증가시키는 방법.
제34항에 있어서, 상기 식물 재배 배지가 목탄으로 보충되는 것인 방법.
제34항에 있어서, 영양소 또는 식물성화학물질이 플라보노이드 또는 이소플라보노이드인 방법.
제34항에 있어서, 영양소 또는 식물성화학물질이 비타민인 방법.
제34항에 있어서, 비타민이 비타민 E (α-토코페롤 또는 γ-토코페롤)인 방법.
제38항에 있어서, 상기 식물의 생성물에서 α-토코페롤의 양이, 화재-극상 미생물로 보충되지 않은 조건에서 성장한 식물 생성물에 비하여 적어도 1.3배 만큼 증가되는 것인 방법.
제38항에 있어서, γ-토코페롤의 양이 화재-극상 미생물로 보충되지 않은 조 건에서 성장한 식물 생성물에 비하여 적어도 1.3배 만큼 증가되는 것인 방법.
제34항에 있어서, 식물이 올리브 식물 또는 아몬드 식물인 방법.
제34항의 방법에 따라 성장한 식물로부터 수확된 영양-증진 식물 생성물.
제42항에 있어서, 식물 생성물이 아몬드인 영양-증진 식물 생성물.
적어도 하나의 화재-극상 미생물을 함유한 조성물을 토양에 적용하는 것을 포함하고, 상기 화재-극상 미생물이 호기성 세균이며 약 600℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 것인, 토양의 식물 성장-촉진 성질을 개선하는 방법.
첫 번째 토양에서 성장된 식물로부터 목탄을 수득하고, 상기 목탄을 두 번째 토양에 적용하는 것을 포함하는, 첫 번째 토양에 존재하는 식물 성장-자극 화재-극상 미생물을 두 번째 토양으로 재배치하는 방법.
첫 번째 토양에서 성장한 식물로부터 화재-극상 미생물의 포자를 함유하는 목탄을 수득하고, 성장 배지에 상기 목탄을 접종하여 상기 포자의 발아 및 영양생식 성장을 개시하여 화재-극상 미생물을 생성하고, 생성된 상기 화재-극상 미생물을 두 번째 토양에 적용하는 것을 포함하는, 첫 번째 토양에 존재하는 식물 성장- 자극 화재-극상 미생물을 두 번째 토양으로 재배치하는 방법.
첫 번째 토양에서 성장한 식물로부터 화재-극상 미생물의 포자를 함유하는 목탄을 수득하고, 성장 배지에 상기 목탄을 접종하여 상기 포자의 발아 및 영양생식 성장을 개시하여 상기 화재-극상 미생물을 생성하고, 화재-극상 미생물로부터 상기 첫 번째 토양의 식물 성장 특징을 촉진하는 균주를 동정하고, 동정된 균주를 두 번째 토양에 적용하는 것을 포함하는, 첫 번째 토양에 존재하는 식물 성장-자극 화재-극상 미생물을 두 번째 토양으로 재배치하는 방법.
첫 번째 토양의 액체 현탁액을 끓이고, 성장 배지에 끓인 액체 현탁액의 분취량을 접종하여 화재-극상 미생물의 포자의 발아 및 영양생식 성장을 개시하여 상기 화재-극상 미생물을 생성하고, 생성된 화재-극상 미생물을 두 번째 토양에 적용하는 것을 포함하는, 첫 번째 토양에 존재하는 식물 성장-자극 화재-극상 미생물을 두 번째 토양으로 재배치하는 방법.
첫 번째 토양의 액체 현탁액을 끓이고, 성장 배지에 끓인 액체 현탁액의 분취량을 접종하여 화재-극상 미생물의 포자의 발아 및 영양생식 성장을 개시하여 상기 화재-극상 미생물을 생성하고, 화재-극상 미생물로부터 상기 첫 번째 토양의 식물 성장 특징을 촉진하는 균주를 동정하고, 동정된 균주를 두 번째 토양에 적용하는 것을 포함하는, 첫 번째 토양에 존재하는 식물 성장-자극 화재-극상 미생물을 두 번째 토양으로 재배치하는 방법.
탄화된 식물 재료로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시키는 것을 포함하는, 식물의 성장 및 영양 가치를 향상시키는 방법.
탄화된 식물 재료를 토양에 적용하는 것을 포함하는, 토양의 식물 성장-촉진 성질을 개선시키는 방법.
제50항 또는 제51항에 있어서, 적어도 하나의 화재-극상 미생물을 함유하도록 상기 목탄이 선택되고, 상기 화재-극성 미생물이 호기성 세균이고 약 600 ℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 것인 방법.
소비를 위해 제42항의 식물 생성물을 동물에 제공하는 것을 포함하는 동물의 면역 체계를 자극하는 방법.
소비를 위해 제42항의 식물 생성물을 상기 동물에 제공하는 것을 포함하는, 미생물 군을 증진시키고 동물의 건강을 촉진하는 방법.
제6항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단리된 적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시키는 것을 포 함하는, 식물에 의한 태양 에너지 전환을 향상시키는 방법.
제6항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단리된 적어도 하나의 화재-극상 미생물로 보충된 식물 재배 배지에서 식물의 재배품종을 성장시키는 것을 포함하는, 환경 오염을 감소시키는 방법.
적어도 하나의 화재-극상 미생물을 함유하는 조성물을 토양에 적용하고, 상기 화재-극상 미생물이 호기성 세균이며 약 600 ℃의 온도에서 생존하는 포자를 생성하는 것인 비-농경지에서 토양 품질을 개선하거나 회복하는 방법.
제57항에 있어서, 상기 조성물이 목탄인 방법.
제57항에 있어서, 상기 비-농경지가 미관을 위한 야생지, 도시 그린벨트 또는 골프 코스인 방법.