BRPI0619103A2 - métodos e composições para melhorar o crescimento vegetal - Google Patents

Abstract

MéTODOS E COMPOSIçõES PARA MELHORAR O CRESCIMENTO VEGETAL. A presente invenção surpreendentemente descobriu que certos microorganismos formadores de esporos, presentes no solo, plantas e outras formas de meio orgânico, sobrevivem ao calor excessivo de um fogo dentro do solo ou em madeira carbonizada. Foi determinado que tais microorganismos estimulam o crescimento vegetal, melhoram o valor nutritivo dos produtos vegetais, e incorporam diáxido de carbono. Portanto, a presente invenção fornece métodos para isolar e identificar os microorganismos estimulantes de crescimento vegetal a partir do solo e de materiais orgânicos carbonizados. A presente invenção também fornece composições e métodos úteis para melhorar o crescimento vegetal e as propriedades nutritivas e para produzir plantas com DNA melhorados que podem ser consumidas por indivíduos humanos para melhorar o DNA humano. As composições e métodos da presente invenção também são úteis para melhorar o solo. A invenção também fornece métodos para usar carvão vegetal como um veículo para promover o crescimento vegetal, e transferir e realocar os microorganismos desejáveis de um ecossistema para outro.

Description

"MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MELHORAR O CRESCIMENTO VEGETAL"

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção relaciona-se a identificação e isola- mento de microorganismos estimulantes do crescimento de planta. Em particular, a invenção relaciona-se ao isolamento de microorganismos termo resistentes de materiais que encap- sulam e protegem tais microorganismos de calor excessivo, tais como materiais vegetais carbonizado, resíduo oceânico, e solo. A presente invenção também se relaciona ao uso de tais microorganismos para aumentar o crescimento de planta e propriedades nutricionais através do reparo e correção de solo. A invenção ainda relaciona-se ao uso de carvão para promover o crescimento de microorganismos e para transferir e realocar microorganismos desejáveis de um ecossistema a outro.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Métodos de agriculturas convencionais correntes utilizados para aumentar a produção da safra em terras agrí- colas marginais geralmente exploram o uso excessivo de fer- tilizantes e pesticidas prejudiciais. Fertilizantes quími- cos, em particular, são aplicados em quantidades aumentadas para prover uma fonte de nitrogênio, fósforo e potássio, bem como outros materiais e micronutrientes, em formas que são acessíveis às plantas. Fertilizantes químicos têm acidifiça- do o solo, e depositado altos níveis de metais pesados, e sais. Uréia sintética e outros químicos causam desequilíbrio adicional por restituir nutrientes essenciais e minerais i- nacessiveis às plantas. Uso excessivo de fertilizantes e pesticidas resultam em um desequilíbrio de nutrientes essen- ciais em solos corrigidos, eventualmente restitui a terra inadequada para agricultura, e no extremo, a inabilidade de manter a vida de planta. Irrigação e água de chuva lixiviada aplicada fertilizantes e pesticida em canais, causando eu- trofização de lagos, rios e outras fontes de água, contribu- indo substancialmente a poluição de água e criando fontes de água não potáveis e tóxicas.

Métodos de agricultura orgânica têm sido introdu- zidos nas últimas décadas em um esforço de reduzir o impacto negativo de fertilizantes convencionais e pesticidas no am- biente. Práticas agrícolas orgânicas, entretanto, têm intro- duzido outros problemas. Por exemplo, fertilizantes utiliza- dos na agricultura orgânica podem conter metais pesados, po- luentes orgânicos, e patógenos microbianos. Rotenona, um pesticida feito de produtos naturais e utilizado na agricul- tura orgânica, é capaz de matar neurônios produtores de do- pamina, resultando em déficit motor. Rotenona tem sido mos- trada produzir sintomas parkinsoniano em ratos. (Renner, R. "From Flush to Farm," Scientific American, 10/2002; Karov, J., "Pesticides and Parkinson's." Scientific American, 11/6/2000; Lozano, A.M. e Kalia, S. K., "New Movement in Parkinson's: Environmental Culprits," Scientific American, p. 71. 6/27/2005.)

Há uma necessidade, então, para métodos e composi- ções que resolvem desequilíbrios correntes em nutrientes no solo e reduzir níveis de químicos tóxicos, bem como criar terras agrícolas auto-sustentáveis que impactam minimamente no ambiente ao redor.

Solos "terra preta" são solos ricos valorizados por sua fertilidade e produtividade aumentada. Encontrada em bolsos da floresta Amazônica, eles contêm altos níveis de matéria orgânica e carbono. Solos terra preta têm também si- do observados conter altos níveis de nutrientes, incluindo níveis de nitrogênio, fósforo, cálcio e potássio, e para ter melhor nutriente e capacidade de manter a umidade que solos não terra preta. Sombroek, WG et al, Ambio, 22:417-426 (1966); Smith, N.J.H., Ann. Assoc. Am. Geogr. 70:553-566 (1980); Zech, W. et al, Em: McCarthy, P. et al, eds., Ameri- can Society of Agronomy and Soil Science Society of America, Madison, Wis., pp. 187-202 (1990). Como solos terra preta, solos terra mulata mostram uma cor marrom acinzentado escuro e contêm níveis elevados de matéria orgânico do solo.

A despeito da intensa pesquisa ao redor da forma- ção dos solos de terra preta, a identidade e funções de bac- térias e fungos em solos terra preta e terra mulata permane- cem desconhecidos. Ver, por exemplo, Lehmann, J. et al, eds., "Amazonian Dark Earths", Kluwer Academic Publ. (2003). Por exemplo, embora cientistas tenham reconhecidos à preva- lência de carvão como um ingrediente chave em solos de terra preta, e têm bactérias conhecidas e outros microorganismos existindo no solo, a identidade e funções de bactéria e fun- go em solos de terra preta e terra mulata é desconhecida. Glaser, B. et al, Biol. Fértil. Soils 35:219-230 (2002); Lehmann et al. (2003). RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na surpreendente descoberta que certos microorganismos termo resistentes for- madores de esporos, ou "micróbios termo resistentes" como aqui referidos, presente em materiais orgânicos tais como solo e plantas, sobrevive em condições extremas tais como calor excessivo de um incêndio. As plantas morrem em um in- cêndio, mas esses micróbios termo resistentes formam esporos e sobrevivem dentro de um material encapsulante, tal como solo e materiais vegetais carbonizados por virtude das pro- priedades isoladas de materiais de planta e solo carboniza- dos, e solo e plantas povoados de novo uma vez que as condi- ções se tornem favoráveis.

Consequentemente, a presente invenção provê um mé- todo reprodutivel para isolar e selecionar tais micróbios termo resistentes, bem como micróbios então isolados. Tem também sido determinado que esses micróbios termo resisten- tes estimulam o crescimento vegetal, aumentam o valor nutri- cional de produtos vegetais, e incorporam dióxido de carbo- no. A presente invenção provê o reconhecimento único que ma- deira carbonizada serve como um repositório de micróbios termo resistentes estimulando o crescimento vegetal, e então podem ser empregados como um veiculo a povoar novamente os micróbios termo resistentes estimulando o crescimento vege- tal para reconstrução do ecossistema. Esta invenção também demonstra que carvão promove crescimento vegetativo de mi- cróbios termo resistentes, possivelmente por proteger os mi- cróbios termo resistentes através da adsorção de fatores químicos deletérios, que são produzidos durante o processo de esporulação. É ainda proposto em acordo com a presente invenção que a notável fertilidade dos solos de terra preta é atribuível a incêndios naturais e feitos pelo homem na floresta tropical Amazônica, que gera extensiva madeira car- bonizada e permite os micróbios termo resistentes sobreviver e crescer. Baseados no novo entendimento da relação entre carvão e micróbios termo resistentes, a presente invenção provê metodologias para emprego de um botão restauração na- tural para corrigir danos ambientais criados pela agricultu- ra e para iniciar o tipo de auto-união molecular nos siste- mas naturais seguindo um incêndio.

Em uma modalidade, a presente invenção provê um método para isolar micróbios termo resistentes de um materi- al orgânico carbonizado, particularmente um material vegetal carbonizado, por exemplo, carvão, por inocular um meio de crescimento com o material carbonizado contendo esporos dos micróbios termo resistentes, e mantendo o meio de crescimen- to em uma temperatura apropriada por um período de tempo su- ficiente para permitir o crescimento vegetativo dos micró- bios termo resistentes dentro do meio. Uma mistura de múlti- plas cepas bem como cepas únicas isoladas de micróbios termo resistentes pode ser obtida.

A presente invenção também provê um processo para produção de materiais carbonizados, particularmente materi- ais vegetais carbonizados, cujo processo mimetiza as condi- ções em um incêndio natural e permite um isolamento e sele- ções reprodutíveis de micróbios termo resistentes. Em uma modalidade específica, o processo envolve aquecimento ou queima de um material orgânico sob condições tais como pro- gresso de carbonização para a extensão somente antes da ex- tinção da bactéria estável no incêndio. Por exemplo, o aque- cimento pode ser conduzido em uma temperatura e por um perí- odo de tempo que são cerca IBTU fora da temperatura e tempo que pode ter resultado na extinção da bactéria estável ao incêndio. Em uma modalidade preferida, o processo envolve aquecimento ou queimada de um material vegetal em uma tempe- ratura de pelo menos 200°C, ou preferivelmente pelo menos 400°C, ou mais pref erivelmente a cerca de 600°C, por um pe- ríodo de tempo de cerca de 5 a cerca de 20 minutos, preferi- velmente cerca de 10 a cerca de 15 minutos, para produzir um material vegetal carbonizado.

Em outra modalidade, a presente invenção provê um método para isolamento de micróbios termo resistentes do so- lo por fervura de uma suspensão líquida de um solo contendo esporos de micróbios termo resistentes, inoculando um meio de crescimento com uma alíquota da suspensão fervida, e man- tendo o meio de crescimento a uma temperatura apropriada por um período de tempo suficiente para permitir crescimento ve- getativo de micróbios termo resistentes dentro do meio.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê um método para identificar uma cepa de micróbio termo resistentes que estimula o crescimento vegetal. Cepas indi- viduais de micróbios termo resistentes são isolados de solo ou carvão e são selecionados para a habilidade de estimular o crescimento vegetal. Em ainda outra modalidade, a presente invenção prove micróbios termo resistentes isolados que produzem es- poros que sobrevivem em uma temperatura de pelo menos 200°C ou encerrar em cerca de 600°C ou mais alta. Micróbios termo resistentes preferidos incluem isolados de Brevibacillus centrosporus, particularmente, HAB7, e isolados de Bacillus megaterium, tal como AC9.

Em uma modalidade, a presente invenção provê com- posições contendo micróbios termo resistentes que produz es- poros que sobrevivem em uma temperatura de pelo menos 200°C ou até cerca de 600°C. As composições da presente invenção são úteis para aumentar o crescimento vegetal e melhorar a qualidade do solo, e pode ser fabricada como composições fertilizantes.

Em outra modalidade, a presente invenção provê um método para aumentar o crescimento vegetal por cultivo de vegetação de uma planta em um meio de cultivo vegetal suple- mentado com pelo menos um micróbio termo resistentes da pre- sente invenção.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção provê um método para produzir produtos vegetais aumentados nutricionalmente por cultivos de vegetação de uma planta em um meio de cultivo de planta suplementado com pelo menos um micróbio termo resistentes da presente invenção.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê métodos de aumentar o crescimento e/ou valor nutricio- nal vegetal por cultivo de vegetação de uma planta em um meio de cultivo de planta suplementado com carvão. Preferi- velmente, o carvão a ser empregado em nos métodos tem sido selecionado por conter micróbios termo resistentes deseja- dos .

As plantas e produtos vegetais produzidos baseados nos métodos da presente invenção formam outra modalidade da presente invenção. Produtos vegetais produzidos de acordo com a presente invenção são benéficos aos animais que inge- rem as mesmas, porque os micróbios termo resistentes aumen- tar o conteúdo de fitoquimicos na planta (Exemplos X e XI) e são acreditados estimular o sistema imune do animal.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê um método para aumentar a propriedade estimulante de crescimento vegetal de um solo e para aumentar a biodiversi- dade em um solo por empregar os micróbios termo resistentes ou composições contendo os micróbios termo resistentes iden- tificados de acordo com a presente invenção.

Além disso, a presente invenção provê métodos para aumentar a conversão por energia solar por plantas, e méto- dos para reduzir a poluição por aumentar a eficiência da u- tilização de nutriente mineral pela planta.

Os micróbios termo resistentes da presente inven- ção e/ou carvão contendo micróbios termo resistentes podem também ser introduzidos a uma terra não agrícola, incluindo terras esteticamente não exploradas, zonas verdes urbanas e cursos de golfos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Comparação de Seqüências Parciais 16S DNAr de Micróbios Isolados de Carvão de Seqüências Bactéria- nas Conhecidas. Esta figura mostra a comparação mais próxima da seqüência bacteriana e as correspondentes diferenças de porcentagem da seqüência. Quatro isolados CP1-2, CPI-6, CPI- 13, e CPI-14 não foram identificáveis. A "comparação mais próxima" designa que cada um desses isolados diferem da se- qüência por >5%, então foram concluídos improváveis de serem os mesmos (ver Exemplo I).

Figura 2. Comparação de Seqüências Parciais 16S DNAr de Micróbios Isolados de Carvão de Seqüências GenBank. Esta figura mostra a comparação da seqüência GenBank mais próxima encontrada para os quatro isolados não comparáveis (ver Exemplo I).

Figura 3A-3B. Análise de Seqüências 16S DNAr de Micróbios Isolados de Carvão de Amendoeira. Um dos 29 iso- lados analisados (ver 3B) foi identificado como Brevibacil- Ius centrosporus (ver Exemplo II).

Figura 4. Análise de Seqüências Parciais 16S DNAr de Micróbios Isolados do Solo. Esta figura mostra, para ca- da uma das amostras DAP-I a DAp-6, a seqüência bacteriana mais próxima da seqüência comparada e a porcentagem corres- pondente de diferença na seqüência entre a cepa amostra e a comparação mais próxima baseada em 500 pares de base as se- qüência 16S DNA r. DAP-2 foi determinado ser Brevibacillus centrosporus (ver Exemplo III).

Figura 5. Seqüência 16S-DNAr completa obtida para HAB7 (ver Exemplo III).

Figura 6. Efeito do Carvão no Crescimento Bacteri- ano.O gráfico mostra que o carvão teve crescimento bacteri- ano aumentado aproximadamente 20 vezes no Dia 3 e 8 vezes no Dia 5 como comparado com culturas controles não tratadas. O Dia 5 efetivamente, determinado por medir células viáveis em cada uma das três replicatas para cada tratamento, foi alta- mente significante (ρ^Ο,ΟΙ). O Dia 3 efetivamente foi medido com uma replicata única em cada tratamento (ver Exemplo V).

Figura 7. Fixação de Carbono por HAB7. Células ΗΔΒ7 incorporaram CO2 em um nivel de aproximadamente 0,25% de carbono total (círculos pretos). Aumentos no conteúdo de 13C entre 12 e 18 horas e entre 12 e 36 horas foram altamen- te significantes (ρ<0,001). Concentração aumentada de CO2 (triângulos pretos) promoveu crescimento celular (massa) por 50% em T12 (12 horas) (p<0,01) e por 12% a T36 (36 horas) (p^0,01) relativa à atmosférica ambiente de CO2 (triângulos abertos) (ver Exemplo VI).

Figura 8. Efeito da Uréia no Crescimento de HAB7. O crescimento de HAB7 cultivada em presença ou ausência de uréia por trinta horas foi avaliado. A figura mostra que a uréia significantemente inibiu o crescimento de HAB7 (ver Exemplo X).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para clareza da revelação, e não por meio de limi- tação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas se- guintes subseções que descrevem e ilustram certas caracte- rísticas, modalidades ou pedidos da invenção.

Características dos Micróbios Termo resistentes da Presente Invenção

O termo "micróbios termo resistentes", como aqui utilizado, refere-se à bactéria formadora de esporo altamen- te envolvida que se associa beneficialmente com plantas e têm uma relação especial com o fogo. Micróbios termo resis- tentes têm a habilidade de se adaptar a mudanças ambientais, e produzir esporos que resistem a temperaturas mais altas que as normalmente associadas com condições de sustentação da vida. Todos os micróbios termo resistentes, por exemplo, sobrevivem no solo a 200°C, 400°C, ou mesmo 600°C como passa- gens pelo fogo sobre eles, e muitos micróbios termo resis- tentes podem ser encontrados em substratos de carbono pirro- lizados, tal como carvão ou outras formas de materiais de planta carbonizados, bem como outras formas de materiais or- gânicos carbonizados, produzidos por aquecimento em tempera- turas muito mais altas (por exemplo, 500°C ou até 600°C).

De acordo com a presente invenção, micróbios termo resistentes derivam quatro benefícios do fogo. Primeiro o fogo enfraquece as paredes do esporo, que então pode adqui- rir água necessária para ativar a germinação do esporo. Se- gundo, fogo produz carvão, que mantém micróbios termo resis- tentes em um estado de crescimento vegetativo persistente por adsorção de fatores químicos favorecendo a esporulação (Gonzalez-Pastor et al, Science 301: 510-513, 2003) e então promovendo o crescimento bacteriano imediato. Terceiro, o fogo mata muitos microorganismos que competem com micróbios termo resistentes. Finalmente, fogo cria uma plataforma fér- til para micróbios termo resistentes por liberação de nutri- entes minerais de materiais de plantas. A comunidade micro- biana termo resistentes cresce após um incêndio por coloni- zar novas raízes de plantas. Eventualmente, como os produtos do incêndio - carvão, altos níveis de nutrientes, e competi- ção reduzida - desaparece, micróbios termo resistentes for- mam esporos e descansam até o próximo ciclo de incêndio e crescimento renovado ocorrer. Neste senso, micróbios termo resistentes representam uma versão microbiana das espécies de planta comumente reconhecidas como termo resistentes, o que também desperta e cresce profusamente após um incêndio.

De acordo com a presente invenção, micróbios termo resistentes existem dentro de plantas e beneficiam as plan- tas hospedeiras por estimular a produção de fitoquímicos im- portantes para o crescimento e proteção da planta. Adicio- nalmente, micróbios termo resistentes estimulam vias metabó- licas chaves em plantas, incluindo exudação e respiração da raiz, que ajuda o fluxo de carbono direto dos órgãos da planta acima da terra para as raízes. Esta estimulação do crescimento da raiz por sua vez aumenta a disponibilidade de nutrientes minerais e água. Adicionalmente, vários micróbios termo resistentes estimulam o crescimento da planta por re- dução de N2 à amônia, inibindo o crescimento de patógenos de plantas, solubilizante de fosfato, e incorporando dióxido de carbono. Sem tencionar estar ligado a qualquer teoria parti- cular, é acreditado que os efeitos estimulatórios dos micró- bios termo resistentes em plantas são alcançados epigeneti- camente. Micróbios termo resistentes podem super-regular a expressão de genes selecionados em plantas hospedeiras, re- sultando em plantas de "gene-aumentado" ou "DNA-aumentado", caracterizado por, por exemplo, crescimento aumentado e pro- dução de fitoquímicos. Ver revisões de epigenéticos por Grant-Downton e Dickinson, Annals Botany 96:1143-1164 (2005), Parte 1; e Annals Botany (Outubro, 2005), Parte 2.

Ainda de acordo com a presente invenção, micróbios termo resistentes também existem no solo virgem. Sobrevivên- cia de micróbios termo resistentes como esporos durante um incêndio e seu subseqüente crescimento em presença de luga- res úmidos dos micróbios termo resistentes no top da linha para colonizar novas raízes de planta.

Isolamento e Identificação dos Micróbios Termo re- sistentes

Em uma modalidade, a presente invenção provê méto- dos para isolar os micróbios termo resistentes de matérias orgânicas carbonizadas.

Outras matérias orgânicas são materiais de origem biológica que contêm (1) micróbios termo resistentes, (2) seu DNA, e (3) substratos inertes consistindo de carbono e outros elementos associados com organismos vivos, tais como oxigênio, hidrogênio e nitrogênio. Exemplos de materiais or- gânicos adequados para isolamento de micróbios termo resis- tentes incluem materiais de plantas, materiais oceânicos desperdiçados tais como alimentos de peixe e algas e maté- rias orgânicas derivadas do solo.

Carbonização refere-se à conversão de uma substân- cia orgânica em um resíduo contendo primariamente carbono. Geralmente tais resíduos são compostos de misturas de molé- culas de carbono policíclicas aromáticas.

Em uma modalidade específica, o material carboni- zado é carvão, que pode ser obtido da natureza ou pode ser artificialmente produzido por um número de métodos conheci- dos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, carvão po- de ser produzido de madeira seca em um forno de baixa emis- são de madeira moderno que tem um sistema apagador efetivo. Um forno adequado para este propósito tem uma dimensão inte- rior de 20''x 20''x 15'' (L x P x A). O operador constrói um incêndio utilizando gravetos, tais como sequóia canadense rachada, e várias lenhas rachadas de pinheiro ou carvalho. As lenhas de pinheiro ou carvalhos devem ser colocadas nova- mente várias vezes e queimadas com o apagador completamente aberto para aquecer o fogão adequadamente e para gerar uma cama adequada de brasa. Após um período de aproximadamente 3 a 4 horas, uma cada de brasa incandescente de aproximadamen- te 5'' de profundidade deve estar presente no fundo do for- no.

Lenhas de madeira para produção de carvão podem ser ou intacta ou rachada, mas a experiência ensina que le- nhas intactas dão uma produção mais alta de carvão. Três ou quatro lenhas escolhidas para a produção de carvão devem ser colocadas na brasa viva (laranja brilhante) com o apagador completamente aberto. As novas lenhas tipicamente irão cre- pitar em chama dentro de 10 minutos, dependendo do conteúdo de umidade da madeira, e um fogo intenso deve resultar den- tro de cerca de 20 minutos. Vários minutos após todas as le- nhas serem envelopadas em chamas, o apagador pode ser fecha- do completamente para reduzir a disponibilidade do oxigênio. O fogo irá rapidamente abaixar, e as lenhas irão carbonizar e queimar simultaneamente. Um fogão contendo lenhas sob as condições descritas aqui podem ser permitidas permanecer por uma noite sem supervisão adicional. Na manhã, o fogão será arrefecido, e remanescentes queimados das lenhas estarão presentes. Uma lenha queimada pode ser quebrada em pedaços de carvões menores imediatamente.

Produções de carvão em uma base de peso são alta- mente variáveis. Um carvoeiro experiente obtém uma produção de 25%, mas uma produção mais típica sob as condições des- critas aqui é de cerca de 15-20%.

Para liberar micróbios termo resistentes dentro do carvão, carvão mais fino, partículas tipo pó de aproximada- mente 2 mm - 15 mm em diâmetro, são separadas os pedaços maiores do carvão. As partículas finas de carvão são então utilizadas para inocular um meio de crescimento selecionado de qualquer meio adequado para culturas de bactérias. Inocu- lação pode ser alcançada por adição de partículas de carvão diretamente em um meio de crescimento líquido. Alternativa- mente, meio de crescimento sólido pode ser utilizado; em tal caso, partículas de carvão podem ser adicionadas ao meio de crescimento durante a preparação do meio e antes de sua so- lidificação (por exemplo, imediatamente após o meio ser au- toclavado). 0 meio de crescimento inoculado com partículas de carvão é então mantido em uma temperatura apropriada na variação de 5 °C-55 °C por um período de tempo suficiente para permitir crescimento vegetativo de micróbios termo re- sistentes dentro do meio. Micróbios termo resistentes então produzidos podem ser facilmente separados do meio de cresci- mento para uso adicional.

Cepas individuais de micróbios termo resistentes podem também ser isoladas, se desejado. Por exemplo, partí- culas de carvão podem ser adicionadas a uma suspensão liqui- da de um meio de crescimento antes do meio solidificado. Pa- ra obter colônias únicas na placa, carvão é adicionado a suspensão líquida em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 10%, preferivelmente cerca de 1% a cerca de 5%, e mais preferivelmente cerca de 3% (p/v). O meio de suspensão é então vertido em placas de Petri para solidificar. Colô- nias únicas representando cepas de micróbios termo resisten- tes individuais desenvolverão nas placas e podem ser coleta- das para uso ou análise individual. 16S rDNA das colônias pode ser seqüenciado para identificar os micróbios termo re- sistentes no nível das espécies.

Em outra modalidade, o material carbonizado para isolamento de micróbios termo resistentes é produzido por aquecer material orgânico contendo micróbios termo resisten- tes ou esporos dos mesmos, tais como tecidos de casca de ár- vore triturados e madeira de uma planta, ou resíduos orgâni- cos oceânicos, sob condições tal que a carbonízação progrida para a extensão somente antes da extinção da bactéria está- vel no fogo. Por exemplo, o aquecimento pode ser conduzido sob condições de cerca de IBTU fora das condições que podem ter resultado na extinção da bactéria estável no fogo.

Em uma modalidade específica, um material orgâni- co, tal como tecidos de casca de árvores triturados e madei- ra de uma planta, ou material residual orgânico oceânico, é aquecido em uma temperatura extremamente alta (isto é, tra- tamento com calor) , por exemplo, a cerca de 600°C, por um período de tempo, preferivelmente cerca de 10-15 minutos, e mais preferivelmente a 600°C por 10 minutos. Para alcançar carbonização consistente e completa, o processo de aqueci- mento pode ser feito utilizando um forno tendo uma câmara pequena, como exemplificado no Exemplo III abaixo. Madeira no Exemplo III pode ter queimado em outro lugar para nada, mas o processo de carbonização foi parado em cerca de 10 mi- nutos para recuperar esporos de bactérias somente antes de eles se tornarem extintos, isto é, esporos não viáveis per- manecem na próxima amostra (aquecido a 600°C por 15 minutos) coletada.

Por "cerca de 600 °C", quer se dizer uma tempera- tura na variação de 585°C a 615°C, preferivelmente 590°C a 610°C, ou mais preferivelmente 595°C a 615°C. A temperatura precisa necessária para alcançar o grau desejado de carboni- zação (isto é, justamente antes da extinção dos primeiros micróbios estáveis) podem depender da densidade específica, conteúdo de umidade, número ou quantidade, uniformidade, forma, tamanho, consistência, composição química, nível de oxigênio, pressão, tratamento químico (se qualquer), do ma- terial orgânico que encapsula os micróbios estáveis no fogo.

Em condições térmicas, incluindo a temperatura e o período de tempo, deve ser tal para produzirem resíduos pe- sando aproximadamente 10-20% do material de partida. Em co- nexão com a presente invenção, as condições térmicas podem ser apropriadamente definidas por energia requerida para li- berar, recuperar, isolar ou obter micróbios termo resisten- tes de matérias orgânicas. A fórmula, tempo multiplicada por temperatura, é proporcional a energia requerida para libe- rar, recuperar, isolar ou obter micróbios termo resistentes de matérias orgânicas. No caso onde tratamento de calor de matérias orgânicas por 10 minutos a 600°C suprir 100% da e- nergia requerida para liberar, recuperar, isolar ou obter micróbios termo resistentes, tratamento de calor de matérias orgânicas por 5 minutos ou 15 minutos, na mesma temperatura, proverá 50% e 150% do valor de energia, respectivamente. Dessa forma, de acordo com a presente invenção, as condições térmicas adequadas para liberar, recuperar, isolar ou obter micróbios termo resistentes de matérias orgânicas são aque- les que suprem, por exemplo, 51% a 149% da energia.

O material carbonizado resultante é então utiliza- do para inocular um meio de crescimento adequado para cultu- ras bacterianas, como discutidas acima em conexão com car- vão .

Em outra modalidade, a presente invenção provê mé- todos para isolar micróbios termo resistentes do solo. De acordo com esta modalidade, solo pode ser suspenso em água, por exemplo, em uma proporção de 1:1 (v/v). A suspensão é então colocada em um banho de água em ebulição por cerca de 2-4 minutos, preferivelmente a cerca de 3 minutos. Uma alí- quota é tomada da suspensão e plaqueada em um meio de cres- cimento sólido adequado para crescimento bacteriano. Um e- xemplo de tal meio de crescimento é meio TY (Bacto Tryptone (5 g/L), Bacto Yeast Extract (3 g/L) e CaCl2 (1,3 g/L), cm Bacto Agar (15 g/L)). Colônias de bactérias individuais se desenvolverão em meio de crescimento sólido, e podem ser a- inda sub-cultivadas se necessário para obter cepas bacteria- nas únicas.

Bactérias isoladas como descrito acima podem ser ainda selecionadas pela habilidade de aumentar o crescimento de planta e produtividade. Crescimento de planta e produti- vidade pode ser determinado baseado no peso seco do broto, produção de semeadura, crescimento de raiz, e/ou produção de fruto ou tamanho. Plantas que podem ser utilizadas como uns meios de teste incluem virtualmente qualquer planta crescida em solo. Plantas exemplares incluem colheita de grãos de consumo (por exemplo, milho, trigo e soja), e sorgo. Outros exemplos incluem colheita de consumos agrícolas brutos, in- cluindo árvores frutíferas e de colheita de nozes (por exem- plo, amêndoa), sojas, amendoins, uvas, maças, bagas (moran- gos, amoras silvestres, framboesa), tubérculos (por exemplo, batatas, batatas doces), milho, grãos cereais (por exemplo, trigo, arroz, centeio), tomates, cebolas, abóboras (por e- xemplo, melancia, pepino, e melão), vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre, chicória), algodão e outros con- sumos de colheita.

Cepas Isoladas de Micróbios Termo resistentes Em outra modalidade, a presente invenção provê mi- cróbios termo resistentes isolados baseados na metodologia da presente invenção descrita acima.

Micróbios termo resistentes isolados de acordo com a metodologia da presente invenção são bactérias que produ- zem esporos que resistem a altas temperaturas de pelo menos 200°C, ou mesmo 600°C. É acreditado que tal micróbio termo resistentes são espécies Bacillus sensu lato, por exemplo, Bacillus fusiformis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Brevibacillus eentrosporus, Baeillus eireulans, Baeillus simplex, Bacillus niaeini, Baeillus sphaerieus, Baeillus am- yloliquefaeiens, Baeillus insolitus, Baeillus psyehrodurans, Baeillus sporothermodurans, Brevibaeterium frigoritolerans, Paenibacillus azotofixans, Paenibaeilus amysolytieus, Paeni- baeillus lautus, Brevibaeterium spp., Brevibacillus spp. , Paenibaeillus spp., Geobacillus spp., Alicyelobaeillus spp., Sulfobacillus spp., Ammoniphilus spp., e Aneurinibacillus spp.

Exemplos de micróbios termo resistentes isolados incluem aqueles isolados de carvão de algarobo (Figura 1), particularmente os quatro isolados designados como CP1-2, CP1-6, CP1-13 e CP1-14. As seqüências 16S rDNA desses quatro isolados foram não encontrados comparando uma seqüência no Genbank por maior que 97%.

Exemplos adicionais de micróbios termo resistentes isolados são aqueles isolados de carvão de amendoeira (Figu- ras 3A-3B), particularmente o isolado designado como "C17304 AC23 com". C17304 AC23 con (Figura 3B) é determinada ser Brevibacillus eentrosporus e é resistente a espectinomicina, tetraciclina e cloramfenicol.

Outro exemplo de um micróbio termo resistentes i- solado é HAB7, isolado do solo. Similar a C17304 AC23 con, HAB7 é também uma cepa de Brevibacillus eentrosporus e é re- sistente a espectinomicina, tetraciclina e cloramfenicol. É acreditado que HAB7 e C17304 AC23 con pode representar um e o mesmo isolado. O carvão contendo C17304 AC23 con vem de uma árvore amendoeira crescendo no mesmo solo daquela HAB7 iso- lada. Em adição, HAB7 e C17304 AC23 con são idênticas em su- as seqüências 16S rDNA analisadas (500 pb). Entretanto, HAB7 e C17304 AC23 con divide a mesma resistência, isto é, natu- ralmente resistente a uma combinação de espectinomicina (25 µg/mL), tetraciclina (1 µg/mL) e cloramfenicol (2,5 µg/mL).

Micróbios termo resistentes preferidos da presente invenção são aqueles que são determinados para aumentar o crescimento vegetal e são capazes de fixação de carbono, por exemplo, HAB7 e C17304 AC23 con.

Cepas de bactérias HAB7 e AC9 foram depositadas com a Coleção de Cultura Tipo Americana, Manassas, VA 20108, em 17 de Novembro de 2006.

Composições Contendo Micróbios Termo resistentes

Micróbios termo resistentes preparados de carvão e solo como descrito acima podem ser utilizados para preparar uma composição útil para aumentar o crescimento vegetal e melhoramento do solo. Dessa forma, a presente invenção provê composições fertilizadoras de planta e composições de melho- ramento do solo que contêm pelo menos um micróbio termo re- sistentes isolados de acordo com os métodos da presente in- venção.

Por "pelo menos um micróbio termo resistentes" en- tende-se uma cepa de micróbio termo resistentes única, ou uma combinação de múltiplas cepas de micróbios termo resis- tentes (isto é, pelo menos duas). Por exemplo, uma composi- ção pode incluir uma mistura de micróbios termo resistentes produzidos por inoculação de um meio de crescimento com car- vão contendo esporos de micróbios termo resistentes e incu- bando o meio de crescimento por um período de tempo para i- niciar o crescimento vegetativo dos micróbios termo resis- tentes. Não é absolutamente necessário isolar cepas indivi- duais dos micróbios termo resistentes para uso na preparação das composições da presente invenção. Entretanto, em uma mo- dalidade preferida, uma ou mais cepas de micróbios termo re- sistentes são empregadas para preparar uma composição para aumentar o crescimento da planta ou melhoramento do solo. Particularmente micróbios termo resistentes preferidos para uso nas composições da presente invenção são aqueles que têm sido determinados para aumentar o crescimento da planta, HAB7 e AC9. Em uma modalidade específica, a composição in- clui ambos HAB7 e AC9.

Em adição a micróbios, as composições da presente invenção podem incluir carvão. Carvão tem sido mostrado pela presente invenção para independentemente promover crescimen- to vegetativo dos micróbios termo resistentes, que por sua vez estimulam crescimento da planta.

As composições da presente invenção podem também incluir outros componentes ou ingredientes adequados para uso em composições fertilizadoras.

Métodos Para Aumentar o Crescimento de Planta e Melhoramento do Solo:

Em uma modalidade, a presente invenção também pro- vê um método para aumentar o crescimento vegetal por empre- gar micróbios termo resistentes da presente invenção. Culti- vos de uma planta estão crescendo em um meio de cultivo de planta suplementado com pelo menos um micróbio termo resis- tentes da presente invenção para alcançar o crescimento au- mentado.

De acordo com a presente invenção, micróbios termo resistentes são adicionados a um meio de cultivo vegetal, tais como solo ou um meio de cultivo sintético, em uma quan- tidade efetiva para aumentar o crescimento de planta e pro- dutividade. Por exemplo, micróbios termo resistentes são a- dicionados ao solo antes, durante ou após o plantio a 6,08 χ 10^6 e 6,08 χ 10^10 UFC/m (2 χ 10^7 a 2 χ 10^11 UFC/pés2) , ou pre- ferivelmente 6,08 χ 10^7 e 6,08 χ 10^9 UFC/m (2 χ 10^8 a 2 χ 10^10 UFC/pés2), ou mais preferivelmente 6,08 χ 10^8 UFC/m (2 χ 10^9 UFC/ pés2). Micróbios termo resistentes podem ser inocu- lados para um meio de cultivo na forma de esporos ou células em qualquer maneira apropriada, incluindo pós pulverizados ou suspensões líquidas contendo os micróbios termo resisten- tes. Aqueles versados na técnica podem facilmente determinar a quantidade precisa dos micróbios termo resistentes, e o tempo e freqüência da inoculação, que são efetivas para pro- mover o crescimento da planta. Um crescimento de planta au- mentado pode ser determinado baseado em um peso seco do bro- to aumentado, produção de semente, crescimento de raiz, e/ou produção/tamanho de fruta em comparação com crescimento de plantas de outra forma meio idêntico sem a adição de micró- bios termo resistentes. De acordo com a presente invenção, o crescimento de uma variedade de plantas pode ser aumentado por praticar os métodos presentes, incluindo, mas não limitado a, colhei- ta de grãos (por exemplo, milho, trigo, e soja), sorgo, ár- vores frutíferas e colheitas de nozes (por exemplo, amên- doa) , sojas, amendoim, uvas, maças, bagas (morangos, amoras silvestres, framboesa), tubérculos (por exemplo, batatas, batatas doce), milho, grãos cereais (por exemplo, trigo, ar- roz, centeio), tomates, cebolas, abóbora (por exemplo, me- lancia, pepino, e melão), vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre, chicória), algodão e outros consumos de colheita.

Em outra modalidade, cultivos vegetais estão cres- cendo em um meio de cultivo de planta suplementado com pelo menos um micróbio termo resistentes da presente invenção pa- ra produzir produtos de planta aumentados nutricionalmente.

Por "produto de planta aumentado nutricionalmente" entende-se que o produto de um crescimento vegetal em pre- sença de pelo menos um micróbio termo resistentes da presen- te invenção tem uma quantidade aumentada de um fitoquímico ou nutriente em comparação a produto vegetal crescendo em ausência do micróbio ou micróbios termo resistentes. Produ- tos vegetais incluem qualquer parte da planta que é entendi- da para consumo, por exemplo, raízes, tronco, folhas, seiva, fruto, óleo ou flores.

O termo "fitoquímico" é um termo geral para subs- tâncias não nutrientes de plantas. Muitos fitoquímicos e os produtos de sua conversão após consumo têm sido mostrados ser protetores contra doenças. Fitoquímicos incluem, por e- xemplo, carotenóides, antioxidantes (por exemplo, flavonói- des), e tocoferóis (por exemplo, α e γ-tocoferol).

Em uma modalidade especifica, o nutriente ou fito- químico aumentado é um flavonóide ou isoflavonóide. Em ou- tras modalidades, o nutriente ou fitoquímico é uma vitamina, por exemplo, vitamina E (α-tocoferol ou γ-tocoferol). A me- todologia da presente invenção pode alcançar um aumento na quantidade de α-tocoferol por pelo menos 1,3 vezes, ou cerca de 1,3 vezes a 2 vezes, e um aumento na quantidade de γ- tocoferol por pelo menos 1,3 vezes, ou cerca de 1,3 vezes a 3 vezes.

Os métodos da presente invenção podem ser aplica- dos para aumentar o conteúdo de um nutriente ou fitoquímico em vários produtos vegetais, incluindo frutas (por exemplo, uvas, maças, bagas tais como morangos, amoras silvestres, e framboesa), tubérculos (por exemplo, batatas, batatas do- ces), nozes (por exemplos, amêndoas, amendoins), soja, mi- lho, grãos cereais (por exemplo, trigo, arroz, centeio), to- mates, cebolas, abóboras (por exemplo, melancia, pepino e melão), vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre, chicória). Em uma modalidade específica, os produtos de planta são amêndoas, e a planta a partir da qual os produtos aumentados nutricionalmente são coletados em uma planta de amêndoa.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê métodos para aumentar os valores de crescimento e/ou nutricionais de um vegetal por crescimento de cultivos da planta em um meio de cultivo de planta suplementado com car- vão. Em uma modalidade especifica, o carvão para uso nos mé- todos da presente invenção tem sido selecionado para conter pelo menos um micróbio termo resistentes que estimula o crescimento de planta.

O crescimento de plantas em presença de micróbios e os produtos de tais plantas formam outra modalidade da presente invenção. O crescimento das plantas em presença de micróbios termo resistentes são acreditados ter genes aumen- tados e DNAs, e manifestam como tendo crescimento aumentado e produção aumentada de por exemplo, fitoquimicos. Tais plantas de DNA aumentado e produtos de plantas são benéficos aos animais que ingerem as mesmas, não somente por causa de um valor nutricional aumentado de plantas e produtos de planta, mas também porque os materiais de planta de DNA - aumentados são acreditados modular e aumentar o DNAs em ani- mais (tal como humanos), resultando em, por exemplo, um sis- tema imune inato e adaptativo aumentado no animal. Então, em uma modalidade, produtos de planta contendo micróbios termo resistentes da presente invenção são ingeridos por animais, incluindo humanos, para aumentar a flora microbiana, promo- ver e melhorar a saúde, e reduzir doença. Sem desejar estar ligado por um mecanismo particular ou teoria, os micróbios termo resistentes ingeridos são acreditados inibir ou mesmo matar bactéria causadora de doença no sistema do animal, as- sim melhorando a saúde e reduzindo doença e enfermidade.

Em uma modalidade adicional, micróbios termo re- sistentes isolados de acordo com a presente invenção são em- pregados para melhorar e reconstruir o solo, e para aumentar a biodiversidade no solo. Métodos para melhorar a qualidade do solo e os solos corrigidos resultantes são modalidades adicionais da presente invenção.

Solo a ser corrigido pode ser inoculado com micró- bios termo resistentes na forma de esporos ou células. Uma cepa única ou uma mistura de múltiplas cepas de micróbios termo resistentes podem ser utilizadas. Alternativamente, partículas de carvão contendo micróbios termo resistentes podem ser adicionadas a um solo diretamente sem isolar os micróbios termo resistentes dentro do carvão, ou com somente quantidade mínima de cultivo e processamento de micróbios no carvão. Inoculação do solo pode ser alcançada por, por exem- plo, pós pulverizados ou suspensões líquidas contendo micró- bios termo resistentes, ou por partículas pulverizadas de carvão contendo micróbios termo resistentes.

A presente invenção tem identificado que certos micróbios termo resistentes presente em um solo aumentam o crescimento e produtividade do crescimento vegetal naquele solo; e que os micróbios termo resistentes vivos dentro das plantas sobrevivem dentro do carvão produzido da carboniza- ção das plantas. Madeira carbonizada tem uma característica física e química chave que contribui para o rejuvenescimento do ecossistema. Em adição a perturbação de microorganismos, madeira carbonizada contém diversos catalisadores químicos. Os parâmetros nanométricos de madeira carbonizada criam su- perfícies infinitas para reações químicas que sustentam a vida e formam câmeras que capturam e liberam gases. 0 resul- tado é uma interface profundamente, altamente envolvida en- tre os remanescentes orgânicos da vida da planta e a ativi- dade rejuvenescedora de microorganismos.

Uma característica desejável da madeira carboniza- da é que ela contém ambientes aquosos e não aquosos conecta- dos, pulverizado com catalisadores recentemente reconhecidos que possa ambos, suprir e aceitar elétrons em muitos poten- ciais redoxes diferentes. Essa matriz complexa, pobremente entendida então nutre uma intrincada comunidade de microor- ganismos interconectados. Como um exemplo simples, bactérias anaeróbicas facultativas liberam H2 como N2 é reduzido à a- mônia em ausência de O2, enquanto bactéria aeróbica é cerca- da de micelas de madeira carbonizada e pode usar o H2 para reduzir CO2 enquanto transfere elétrons para O2 e então cri- ando um ambiente anaeróbico favorecendo fixação de N2. Espé- cies Bacillus sensu lato presente na madeira carbonizada po- de preencher todas essas funções.

Os valores do carvão têm sido unicamente reconhe- cidos pela presente invenção. De acordo com a presente in- venção, carvão pode ser empregado como um veículo dos micró- bios termo resistentes para realocar micróbios termo resis- tentes a partir de um ecossistema para outro, e para trans- ferir uma propriedade de promoção de crescimento vegetal de um solo em uma locação geográfica para outra. Por exemplo, bactéria adequada nas regiões de crescimento de vinho de qualidade pode ser transferida por meio de carvão para ou- tros locais geográficos selecionados.

Solos modificados em acordo com a presente inven- ção suportam o crescimento vegetal independente de fertili- zantes comerciais e pesticidas, e não criam poluição ambien- tal. Além disso, propriedades fixadoras de carbono de micró- bios termo resistentes permitem carbono atmosférico ser fi- xadas em compostos orgânicos no solo, removendo dióxido de carbono do ar, e melhorando estocagem de carbono no solo.

Consequentemente, em uma modalidade adicional, os micróbios termo resistentes da presente invenção podem ser utilizados para aumentar a conversão de energia solar por plantas, e para reduzir poluição ambiental por aumento da eficiência da utilização do nutriente mineral por plantas. A base desta eficiência aumentada repousa na capacidade dos micróbios termo resistentes em aumentar o crescimento da ra- iz da planta. Raizes grandes nesses fatores limitantes au- mentam a conversão fotossintética da energia solar para bio- massa da planta. Promovendo crescimento de planta por 25% em 80% do tamanho da área de acres agrícola nos EUA podem au- mentar estocagem de carbono total, e então o potencial pro- dução de biomassa, por 20%. Um benefício adicional desta tecnologia pode ser uma redução em uma lixiviação de ferti- lizantes, que sempre envenenam a água da terra e promove eu- trofização dos rios da superfície.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos se- guintes exemplos.

EXEMPLOS

Exemplo I. Identificação de Novas Cepas de Bacté- rias Termo resistentes em Carvão de Algarobo

Culturas foram crescidas de carvão de madeira de algarobo obtida por carbonização de madeira de algarobo. Os carvões finos, partículas tipo pó de aproximadamente 2 mm - 15 mm em diâmetro, foram separados de grandes pedaços de carvão. Bactérias foram isoladas de CP-1 (uma fonte de car- vão de algarobo) finos por autoclavação de 250 mL de meio agar TY em um frasco por 45 minutos a 103421.355 Pa, remo- vendo o meio da autoclave, e enquanto a temperatura do agar estéril foi aproximadamente 93,3 °C, preparando uma suspen- são de carvão 2% por adição de 5 g de CPl "finos" não esté- reis à 250 mL de solução. O frasco foi agitado para misturar a suspensão e 20 mL de meio agar contendo o carvão foi ver- tido em cada placa de Petri de 90 mm. Placas foram arrefeci- das em temperatura ambiente, e o agar permitido solidificar. Após 28 horas, colônias de bactérias e fungos desenvolvidas nas placas. Após 72 horas, 14 colônias de bactérias foram coletadas e transferidas para placas de agar TY fresco. Doze das 14 colônias cresceram no segundo conjunto de placas. Es- sas 12 colônias foram passadas novamente em um terceiro con- junto de placas agar TY. O 16S rDNA das colônias que cresce- ram da terceira passagem foi parcialmente seqüenciada (Midi Labs, Newark, DE).

Figura 1 mostra a seqüência bacteriana mais próxi- ma comparada e as porcentagens correspondentes das diferen- ças de seqüências. Quatro isolados CP1-2, CP1-6, CP1-13, e CP1-14, não foram identificáveis. A "comparação mais próxi- ma" designada para cada um desses isolados diferidos na se- qüência por >5%, então foram concluídos improváveis de serem os mesmos. Figura 2 mostra a seqüência comparada GenBank mais próxima encontrada para os quatro isolados não compara- dos. As seqüências 16S rDBA CP1-2, CP1-6, CP1-13, e CP1-14 foram não encontradas comparadas com qualquer seqüência no GenBank por maior que 97%.

Exemplo II. Identificação de Novas Cepas de Bacté- rias Termo resistentes em Carvão de Amêndoa

As seqüências 16S rDNA de vinte e nove isolados de carvão de amedoeira foram examinados. Desses isolados, um foi identificado como Brevibacillus centrosporus. Além dis- so, dezenove isolados foram diferentes, oito foram identifi- cados para o nivel das espécies 1% de diferença) , seis diferiram das espécies conhecidas por 1% ou mais que ou i- gual a 5%, e três diferiram de espécies conhecidas por maior que 5%. As tabelas de seqüência de identificação são mostra- das nas Figuras 3A-3C.

Análise da seqüência 16S rDNA parcial mostrou que o carvão de amêndoa isolado designado "C17304 AC23 con" na Figura 3B teve uma diferença de 0,29% de Brevibacillus cen- trosporus, similarmente a HAB7. HAB7 é uma cepa de bactéria isolada do solo, como ainda descrito no Exemplo III. C17304 AC23 con foi também encontrado para crescer em uma combina- ção de 25 mg/L de espectinomicina, 1 mg/L de tetraciclina, e 2,5 mg/L de cloranfenicol, como foi HAB7.

Exemplo III. Processo para Carbonizar Madeira Abe- to Douglas e Serragem de Casca de Árvore e Isolamento dos Micróbios Termo resistentes dos Materiais Carbonizados

Uma árvore abeto Douglas recentemente derrubada foi cortada em seções de 14". Tecido de casca de árvore (isto é, floema) e madeira (isto é, xilema) foi triturado separadamente com uma cadeia e 20'', visto e coletada. Os dois tecidos de planta foram misturados juntos em uma pro- porção 1:1, secos por uma noite a 70 °C, e estocado em uma jarra de vidro selada para uso tardio.

Um séries de caçarolas cerâmicas de 2'' de diâme- tro foram carregadas com 10 g dos tecidos misturados. Um al- to-forno Barnstead International de 240 V, Modelo F47920-80, com controle de temperatura programável e uma câmara 5'' (L) χ 4'' (Δ) χ 6'' (D), foi utilizado para todos os experimen- tos descritos neste Exemplo. Este forno, que pode correr a 1093°C continuamente ou 1200°C intermitentemente, foi utili- zado para mimetizar condições de incêndio na floresta. O forno foi pré-aquecido a 600°C, e caçarolas individuais fo- ram colocados no forno por vários períodos de tempo. Quando uma caçarola foi colocada na câmara do forno, a temperatura desce brevemente a cerca de 585°C antes e retornada a 600°C.

Após 4 min, a temperatura do forno aumentou para 605°C por vários minutos enquanto fumaça preta escapou de uma abertura superior. Duas caçarolas foram tratadas separadamente para cada período de tempo. Uma foi utilizada para isolar micro- organismos; a outra foi fotografada. Todos os experimentos relatados neste Exemplo envolveram colocação somente de uma caçarola no forno pelo período de tempo especificado para alcançar a carbonização consistente.

Características físicas das amostras tratadas por vários períodos foram bem diferentes. Amostras removidas a- pós 5 minutos a 600 0C foram carbonizadas aproximadamente 50% como estimado por diminuição em peso seco e muitas las- cas de madeiras não foram enegrecidas. Aquelas remanescentes no forno por 10 ou 15 minutos foram completamente enegreci- das e reduziram 80-90% na massa. Nenhuma lasca reteve uma cor de madeira natural após 10 ou 15 minutos a 600 °C.

O número de bactérias isoladas obtidas das amos- tras tratadas por vários períodos diferiu. Bactérias foram isoladas por suspensão de cada amostra carbonizada em 250 mL de meio TY estéril quente como ele saiu da autoclave a apro- ximadamente 100 °C. A suspensão foi agitada vigorosamente como doze placas de Petri de 100 mm foram vertidas de cada mistura. Após 4 dias de incubação a 20-25 oC, as placas fo- ram observadas e 14 de 41 colônias de bactérias foram cole- tadas para identificação por seqüenciamento do 16s rDNA. A maioria dos isolados caem entre a bactéria do tipo Bacillus clássica. Rhodococcus globerulus, entretanto, é um organismo actinomiceto mais proximamente relacionado a microorganismos do solo tal como Streptomyces (Tabela 1) . Contagens numéri- cas mostraram que 10 minutos a 600 0C claramente produziu ótimas condições para isolamento de microorganismos termo resistentes a partir da madeira nesses experimentos. Outras combinações de madeira e tecidos de casca de árvore podem ter diferentes características termais, que podem criar um ótimo alterado. Outras espécies de madeira podem conter es- pécies bacterianas adicionais.

Como indicado, de acordo com a presente invenção, a natureza física da amostra por si só é importante porque, entre outras coisas, número, forma, tamanho e consistência da amostra afetarão como rapidamente calor externo é trans- ferido através da amostra.

A mistura contida dentro da amostra ou o ar ao re- dor da amostra também mudará a característica de carboniza- ção porque o alto calor de vaporização de água usa energia do calor para converter água do líquido para a fase vapor (isto é, ebulição) pode mudar a taxa de carbonização.

Configurações térmicas no forno e tempo de exposi- ção também influenciarão na taxa de carbonização. Valores numéricos de uma temperatura constante são importantes. Tem- peraturas mais altas apressarão a carbonização relativa a temperaturas mais baixas. Período de tempo mais longo em temperaturas menores pode ser equivalente a períodos mais curtos em temperaturas mais altas, desde que a amostra quei- me. Mudanças programadas na temperatura também produzirão condições diferentes para estados similares de carbonização.

Tabela 1. Unidades formadoras de colônia (UFC) produzidas de 10 g de tecidos abeto Douglas

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Espécies de bactérias foram também isoladas de ou- tras formas de matéria orgânica carbonizada. Uma amostra de refeição de peixe comercialmente disponível, que é uma forma de resíduo orgânico oceânico e pode ser encontrado em muitas lojas de jardinagem orgânica, foi aquecido a 600 0C e sus- pensa em Agar TY 95 OC antes das bactérias serem isoladas e identificadas por seqüenciamento parcial do 16S rDNA (Tabela 2). Seqüências divergindo mais que 1% da base de dados Mi- croSeq também foram comparadas com a base de dado GenBank.

Isolados recuperados em diferentes tempos foram mutuamente exclusivos.

Tabela 2. Isolamento de Espécies Bacterianas de Resíduos Orgânicos Oceânicos <table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 38</column></row><table>

Exemplo IV. Cultura de Micróbios Termo resistentes do Solo

Culturas foram crescidas de amostras de solo greda arenoso (Mid-Cal Ranch, Califórnia) para identificar os mi- cróbios capazes de esporulação presentes nas amostras. Para este propósito, 2,0 mL de uma solução criada pela suspensão de volumes iguais de solo e água foram colocados em um banho de água fervente por 3 minutos antes de plaquear uma alíquo- ta (por exemplo, 0,5 mL) no meio Agar TY (Difco Bcto tripto- na (5 g/L), Extrato de Levedura Difco Bacto (3 g/L) e CaCl2 (1,3 g/L), com Agar Difco Bacto (15 g/L)).

Bactérias inicialmente isoladas por esses procedi- mentos foram identificadas, por seqüenciamento de 500 pares de bases 16S rDNA, como espécies bacterianas formadoras de endoesporos aeróbicas. Esses isolados foram identificados como Brevibacillus centrosporus, Bacillus subtilis, e Bacil- Ius megaterium (Midi Labs, Newark, DE). Figura 4 mostra para cada uma das amostras DAP-I a DAP-6, a comparação mais pró- xima da seqüência bacteriana e a diferença de porcentagem correspondente na seqüência entre a cepa amostra e a compa- ração mais próxima. DAP-2 (também referido aqui como HAB7) foi determinado ser Brevibacillus centrosporus.

HAB7 foi encontrado ter resistência a múltiplos antibióticos, e ser capaz de crescer em meio Agar rico (TY) na presença combinada de 25 mg/L de espectinomicina, 1 mg/L de tetraciclina, e 2,5 mg/L de cloranfenicol. Baseado no se- quenciamento parcial de 16S rDNA, HAB7 foi encontrado ter uma diferença de 0,29% de Brevibacillus centrosporus, indi- cando uma espécie comparada. A seqüência de 16S-rDNA comple- ta obtida para HAB7, ainda indica uma diferença de 0,10% de Brevibacillus centrosporus, é provida como Figura 5.

Exemplo IV. Efeito da Cepa Bacteriana HAB7 e AC9 no Crescimento de Planta

A habilidade de HAB7 em promover o crescimento to- tal de planta foi avaliada em dois estudos. No primeiro es- tudo, semente de trigo foi plantada em campos de gráficos utilizando tratamentos diferentes de solo, incluindo combi- nações de alto (89,25-10,04-13,38 kg/ha) e baixo (26, 77- 10, 04-13, 38 kg/ha) NPK, com e sem HAB7 a 6,58 χ IO9 UFC/m (2xl09 UFC/ pés2) . 0 solo foi tratado dois dias após o plan- tio, e coletado quatro meses após o plantio. Três gráficos adjacentes, cada 3 pés por 5 pés, foram cultivados sob cada uma das cinco condições especificadas na Tabela 3. Dessa forma, um total de quinze gráficos foi utilizado, e cada nú- mero mostrado na tabela representa a média de valores de três gráficos sujeitos ao mesmo tratamento. Uma área de 1 χ 0,9 m (3 pés2)) foi coletada no centro de cada gráfico. HAB7 foi encontrado aumentar significantemente a produção de se- mente em presença de ou alto ou baixo NPK. O crescimento de raízes não foi medido. Os tratamentos e resultados são mos- trados na Tabela 3.

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*0 efeito do HAB7 foi significante (p<0,05) rela- tivo ao tratamento do fertilizante sozinho. #Valores de LSD 0,05 medem diferenças significan- tes através de todos os tratamentos.

Como mostrado na Tabela 3, a adição de HAB7 ao baixo NPK resultou em um aumento de 8% no peso seco do broto e um aumento de 38% na produção de semente. A adição de HAB7 ao alto NPK resultou em um aumento de 16% no peso seco do broto e um aumento de 35% na produção de semente. Um grande aumento em nitrogênio foi também medida no crescimento de plantas de trigo no solo tratado com HAB7/alto NPK.

Crescimento de raiz, mais exatamente avaliado em vasos dos quais todas as raizes são recuperáveis, foi medido em um segundo estudo por crescimento anual de grama de cen- teio a partir da semente em presença ou ausência de HAB7, com ou alto ou baixo NOK. A grama foi plantada em 64 vasos de dez polegadas. Células HAB7 foram suplementadas com 6,08 χ 10"8 UFC/m (2 χ 10"9 UFC/pés2) para cada vaso de tratamento HAB7. A grama foi coletada 28 dias antes da floração, dessa forma medidas da produção de semente não foram feitas. Após secagem das plantas, toda areia, seixos e detritos foram re- movidos, e as plantas foram separadas em brotos e raizes. Os tratamentos e resultados deste experimento são mostrados na Tabela 4. A tabela mostra que o crescimento da raiz foi au- mentado 11% (p≤0,05) em presença de HAB7, e 33% (p≤0,05) quando um tratamento combinado HAB7/alto NPK foi provido.

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*"NPK" representa nitrogênio, fósforo e potássio.

Valores seguidos por diferentes letras mostraram efeitos significantes de HAB7 (p<0,05) relativos ao controle apro- priado .

AC9, bem como uma mistura de HAB7 e AC9, foram também mostrados promover crescimento de planta em um solo de plantio rico em nutriente. Dados representativos de dois testes são dados na Tabela 5. Variação em plantas controles não calculadas refletem a mudança de temperatura e luz em iferentes meses do ano. TABELA 5 Efeitos de Bactérias Inoculantes no Crescimento do Trigo Após 28 Dias <table>table see original document page 42</column></row><table>

Exemplo VI. Efeito do Carvão no Crescimento Bacte- riano Os efeitos promotores do carvão no crescimento de um representativo micróbio foram facilmente demonstrados com HAB7. HAB7 foi crescendo no meio bacteriano TY contendo ou nenhum aditivo, ou 1,5% de carvão de algarobo comprimido ("CP-1"). Todos os meios foram ajustados para pH 6.74 antes da inoculação. Células foram contadas como unidades formado- ras de colônia (UFC) em placas com agar TY com técnicas de diluição normais nos Dias 0, 3 e 5 seguindo a inoculação.

Densidade celular somente após a inoculação foi 5 χ 10^4 UFC/mL. O efeito no Dia 5, determinado utilizando três re- plicatas de cultura para cada tratamento, foi altamente sig- nificante (ρ<0,01) . O efeito no Dia 3 foi medido com uma Cí- nica replicata em cada tratamento.

Um experimento feito similarmente em cada concen- tração menor (0,375%) e maior (3%) de carvão comprimido que foram mostrados mostraram que 1,5% do carvão aumentou o crescimento bacteriano sob culturas controle não tratadas, embora a concentração menor não teve nenhum efeito signifi- cante no crescimento mas reduziu significantemente a esporu- lação. O tratamento com carvão 3% teve um melhor efeito au- mentado no crescimento bacteriano que o carvão 1,5%, e re- sultou em menos esporos. Os dados medidos 3 dias após a ino- culação são mostrados na Tabela 6. Colônias desenvolvidas a partir dos esporos, em vez de outras células vegetativas, foram identificadas por seu desenvolvimento atrasado e menor tamanho de colônia no dia 3.

TABELA 6

Tratamento Bactéria Total Colônias a partir de <table>table see original document page 44</column></row><table>

Comparação Estatística: Bactéria Total% de Colô-

nias a partir de esporos

1,5 & 3,0% vs TY p<0,001p<0, 01

0, 375% vs TYnão significantep<0, 05

1,5 vs 3,0%p<0,05p<0,01

Exemplo VII. Fixação de Carbono por HAB7 A habilidade de HAB7 de incorporar 13C de 13CO2 foi examinada. Nove frascos Erlenmeyer de 50 mL, cada um conten- do 25 mL meio líquido TY foram suplementados com um inoculo de 2% de HAB7 a partir de uma cultura de uma noite e cresci- dos por 36 horas. Culturas foram colocadas em um agitador a 145 rpm a 25 °C. Todos os frascos foram selados com divisó- ria de borracha. Três replicatas de frascos contendo CO2 at- mosférico com aproximadamente 0,042% de CO2 (1,085 % de áto- mos de 13C). Seis replicatas de frascos foram suplementadas com 5% de 13C02 gerados a partir de 13C-bicarbonato de sódio (98 átomos %13C) em uma seringa 60-cc com 2N de HCl. Cinco alíquotas de mL foram coletadas de cada frasco após 12, 18 e 36 horas e células bacterianas foram removidas por centrifu- gação em tubos Eppendorf. Frascos foram abertos ao ar e se- lados novamente em uma cobertura de transferência estéril, e aqueles designados por 5% de CO2 foram cheios novamente com 5% 13CO2 em cada tempo de amostra. Amostras nos tubos Eppen- dorf foram liofilizadas e analisadas para o conteúdo de pro- porção de isótopo 12C/13C por espectrômetro de massa. A mu- dança no 13C relativo para um átomo 1,08504 %13C de referên- cia padrão foi calculado e relatado como A13C átomo%. A pos- sibilidade de contaminação de HAB7 não foi permitida no fim do experimento por comparação das contagens da diluição de célula no meio TY normal com contagens em TY contendo uma mistura de três antibióticos seletivos para HAB7. Dados (em UFC) foram similares nos dois meios para cada frasco.

Como mostrado na Figura 7, células HAB7 incorpora- ram CO2 a um nivel de aproximadamente 0,25% de carbono total (círculos pretos). Aumentos no conteúdo de 13C entre 12 e 18 horas e entre 12 e 36 horas foram altamente significantes (p≤0,001). Concentração de CO2 aumentada (triângulos pretos) promoveu crescimento celular (massa) por 50% a T12 (12 ho- ras) (p<0,01) e por 12% a T36 (36 horas) (p<0,01) relativo ao CO2 atmosférico ambiente (triângulos abertos).

Exemplo VIII. Fixação de Carbono por Micróbios

Termo resistentes no Carvão

Testes estabeleceram que micróbios termo resisten- tes presentes no carvão de algarobo (CP-I) claramente incor- poraram CO2 (Tabela 4). Frascos Erlenmeyer (tamanho 50 mL), cada contendo 25 mL de meio líquido TY estéril, foram inocu- lados com 1) CP-I autoclavado em presença de CO2 ambiente para quantificar qualquer efeito físico do carvão na adsor- ção do 13C antecedente, ou 2) CP-I autoclavado em presença de 5% de 13CO2 para quantificar qualquer efeito fisico do carvão na adsorção de 13C a partir de 13CO2 altamente marcado (98 % de átomo de 13C), ou 3) CP-I não estéril na captação de CO2 a partir de 13CO2 altamente marcado (98 % de átomo de 13C13C) , ou 4) CP-I estéril inoculado com HAB7 em presença de 5% de 13C02 para relacionar a capacidade comprovada des- sas bactérias de captar CO2 para outros tratamentos neste teste. Então níveis de CO2 foram ambientes 0,42% (1,08515 % de átomo de 13C) ou 5% de CO2 (98 % de átomo de 13C). Frascos permanecem selados por todas às 72 horas do experimento. A- mostras de frascos nos tratamentos 1 e 2 foram plaqueadas no meio TY no fim do estudo para confirmar a esterilidade antes da análise 13C. Frascos nos tratamentos 3 e 4 foram autocla- vados no fim do período de 72 horas e então carvão foi sepa- rado por filtração a partir da suspensão de bactéria em cada um desses frascos. 0 carvão foi seco a 75 0C antes da análi- se 13C. Bactérias (e algum CP-1) nos tratamentos 3 e 4 foram coletadas por centrifugação da suspensão bacteriana e seca sob o calor de uma lâmpada antes da análise 13C. 0 conteúdo 13C de cada amostra foi medido por proporção de isótopo 12C/13C em espectrometria de massa. A mudança no 13C relativa a um padrão de referência contendo 1,08504 [átomo 13C] foi calculada e relatada como Δ 13C % de átomo de 13C.

Os dados indicam que os microorganismos CP-I in- corporaram CO2 a níveis que foram significantemente maiores que o 13C estéril controle (p<0,01) e foi similar àquelas medidas no tratamento HAB7, um organismo demonstrou incorpo- rar CO2 no Exemplo VII.

TABELA 7

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Exemplo IX. Promoção do Crescimento HAB7 por Dió- xido de Carbono

0 efeito de C02 no crescimento de HAB7 foi avalia- do. Uma cultura de uma noite de HAB7 crescendo em meio TY foi utilizada para suplementar um inoculo em frascos de 50 mL, cada contendo 25 mL de TY e 30 mL de atmosfera acima do liquido. Unidades formadoras de colônia (UFC) foram contadas por plaqueamento da diluição no meio Agar TY no To (tempo de inoculação), Ti5 (15 horas após inoculação) , T 36 (36 horas após inoculação), e T42 ( 42 horas após inoculação) . Após i- noculação e após cada amostragem, CO2 atmosférico no espaço aéreo acima do liquido foi ajustado para conter atmosfera (aproximadamente 0,042%), 5% de CO2, ou 9,8% de CO2 em um volume base. Os produtos das células foram pesados em T42 após coleta das células por centrifugação. Os dados são mos- trados na Tabela 8. Os tratamentos de 5% e 9,8% de CO2 au- mentaram a UFC/mL significantemente durante o crescimento log (T15), mas 9,8% de CO2 diminuíram a UFC/mL marcadamente nas 42 horas de tempo de amostragem.

Esses resultados podem ser interpretados como mos- trando que CO2 adicional estimulou síntese de ácidos graxos e formação de membrana durante o crescimento log, mas o tra- tamento de CO2 mais alto eventualmente aumentou a mortalida- de celular. As membranas extras foram utilizadas para aumen- tar os números celulares nos frascos suplementados com CO2 extra no começo do experimento. Porque o meio TY foi muito rico, existiu uma limitação de substrato, e então o trata- mento controle envolvido para elevar o CO2 nos frascos quan- do respiração celular produziu CO2 suficiente para ótimo su- porte da síntese de membrana. Dados de peso seco sugerem que células no tratamento controle foram produzindo mais polis- sacarídeo que culturas crescendo com CO2 mais alto.

<table>table see original document page 48</column></row><table> <table>table see original document page 49</column></row><table>

*Significantemente diferente a partir do controle em p≥O,05.

Exemplo X. Reguladores de Pedogênese Aumenta Con- teúdo de Vitamina E na Planta

Niveis de Vitamina E (α- e γ-tocoferóis) foram a- nalisados, nos produtos de planta obtidos de crescimento de planta convencional e crescimentos de planta no solo trata- dos com carvão, para avaliar o efeito as composições e méto- dos da invenção nas propriedades nutricionais da planta.

Duas amostras de noz amêndoa (três replicatas de cada) foram analisadas. Uma amostra foi a marca comercial "Diamond of Califórnia", designado "Diamond" nos dados da tabela. A segunda amostra foi obtida de amêndoas crescidas coletadas de árvores crescidas no Rancho Mid-Cal ("Mid-Cal") no solo que tenha sido tratado com carvão comercial prepara- do como descrito no Exemplo I em uma taxa de 90718 g por a- cre em cada um dos dois anos prévios. Amostras de amêndoas (172,15 g por amostra) foram pulverizadas em uns triturados de café e submetidas a um laboratório comercial (Laborató- rios Analíticos em Anaheim, Inc., Anaheim, CA) para análises de conteúdo de tocoferol. A "pasta" de amêndoa foi extraída com metanol, e tocoferóis foram separadas utilizando HPLC, e analisada utilizando métodos LC-MS (cromatografia líquida - espectrometria de massa) e comparados com padrões.

Os níveis de tocoferol observados em cada amostra são mostrados na Tabela 9. 0 conteúdo de α-tocoferol de a- mêndoas do Rancho Mid-Cal foi 39% (p≤0,05) mais alta que das amêndoas Diamond. 0 conteúdo de γ-tocoferol das amêndoas Rancho Mid-Cal foi 200% (p≤0,01) mais alto que aquele de a- mêndoas Diamond.

Outros métodos úteis para avaliar o conteúdo de tocoferol em produtos de plantas têm sido descrito, por e- xemplo, por Gutierrez et al, 1999, "Influence of ecological cultivation on virgin olive oil quality", J. Amer. Oil. Chemists Soe. 76:617-621 e Martinez, J.M. et al, 1975, "Re- port About the Use of Abencor Yields Analyser", Grasas Aceites 26:379-385.

TABELA 9

<table>table see original document page 50</column></row><table> Exemplo XI. HAB7 Aumentou o Conteúdo Fitoquimico

da Alface

Alface crocante foi plantada em uma estufa Caspar utilizando vasos de 7.57 L contendo Solo de Vaso de Plantio Ace. Quatro dos oito potes foram inoculados com HAB7. Cada pote foi diminuído para duas plantas após germinação. Plan- tas foram coletadas em cerca de dois meses, pesadas, e arre- fecidas em gelo ou sob refrigeração enquanto sendo transpor- tadas para um laboratório para análise. Cabeças de alface de tamanhos equivalentes foram selecionadas de cada tratamento para análise de vitamina. Todos os dados foram examinados com análises de "two-way" de variância utilizando valores brutos e números transformados em log.

Os resultados mostraram que biomassa total coleta- da (duas cabeças/pote) não diferiram significantemente entre o tratamento controle e o HAB7. A maior cabeça de alface em cada pote foi utilizada para medir o conteúdo de vitamina, e média dos valores (± EP) para aquelas cabeças for a 163 ± 17 e 159 ± 16 para os potes controles e tratados com HAB7, res- pectivamente.

O conteúdo de vitamina C cresceu em potes tratados com HAB7 foi aumentado mais de 50% e o conteúdo de vitamina E total (a- e γ-tocoferol) foi aumentado por mais de 80%.

<table>table see original document page 51</column></row><table> Exemplo XII. Efeito da Uréia em HAB7 O efeito da uréia no crescimento e sobrevivência de HAB7 foi testado por cultura de HAB7 em presença de uréi- a.

Baseado na prática de cultivo convencional de a- plicando 90718 g de nitrogênio por acre, 100 mM de uréia foi calculado como uma concentração provavelmente ser transiente presente no topo 2,54 centímetros de um solo normal. HAB7 foi inoculado em meio TY e cresceu por uma noite em tempera- tura ambiente a aproximadamente 1 χ IO7 CPU/mL.

A cultura de uma noite foi inoculada em frascos (200 pL de cultura de uma noite por frasco) contendo ou TY (3 frascos) ou TY + 100 mM de uréia (3 frascos) . Trinta ho- ras depois, séries de diluição de 10 vezes foram preparadas de cada um dos seis frascos, e uma alíguota de 50 pL de cada tubo de diluição foi plantado em agar TY. Unidades formado- ras de colônia (UFC) desenvolvendo a partir de gotas de 50 pL foram contadas e utilizadas para calcular o número de cé- lulas viáveis em cada frasco. Valores de média ± erros pa- drões foram comparados para os efeitos de tratamento de u- réia utilizando teste de Estudante.

Figura 8 mostra o aumento na densidade bacteriana após trinta horas em presença ou ausência de uréia. Em TY, a bactéria passou através de mais de 12 duplicatas, mas em presença de 100 mM de uréia, menor de 5 duplicatas ocorren- do. Como um resultado, os frascos contendo uréia tiveram me- nos de 1 % como muitas células HAB7 como os frascos contro- les. O efeito da uréia neste teste (t = 2,91, η = 4) foi significante (ρ<0,05).

Simultaneamente com as diluições do frasco, uma série de diluições de 10 vezes foi preparada a partir de uma cultura de uma noite por ela mesma. Três alíquotas indepen- dentes de 50 pL de várias diluições da cultura de uma noite foram plaqueadas em placas de agar separadas contendo ou TY ou TY + 100 mM de uréia.

O experimento plaqueado mostrou que 58% das célu- las da cultura de uma noite falharam em crescer em placas de agar TY + 100 mM de uréia. Por exemplo, as placas de dilui- ção 10-4 produziram 50,0 ± 5,5 colônias em TY e 21,3 ± 3,2 colônias em TY + 100 mM de uréia. 0 efeito da uréia neste teste (t=4,51, n = 4) foi significante (p<0,05).

Então, uréia em concentrações utilizadas nas prá- ticas de cultivo comuns adversamente afetou o crescimento de bactérias HAB7.

Exemplo XIII. Efeito de Reguladores de Pedogênesis no Conteúdo Flavonóide da Planta

Os organismos microbianos e fontes de carbono re- veladas aqui podem também ser utilizados para aumentar o conteúdo fitoquímico da planta, em particular isoflavonói- des, tal como fitoestrogênios, outros flavonóides. Plantas podem crescer no solo corrigido com uma fonte de carbono, tal como carvão de algarobo. O solo pode então ser corrigido com um organismo microbiano, tais como Bacillus centrospo- rus, Bacillus subtilis ou Bacillus megaterium. Uma combina- ção de organismos microbianos possa também ser utilizada pa- ra gerar um núcleo pedogênesis no solo. Após crescimento vi- sivel, matéria de raízes de plantas e matéria de folhas são analisadas para o conteúdo fitoquímico, incluindo conteúdo isoflavonóide e flavonóide.

O conteúdo de flavonóide pode ser determinado como descrito por Ren, H. et al, 2001, "Antioxidative and an- timutagenic activities and polyphenol contento f pesticide- free and organically cultivated green vegetables using wa- ter-soluble chitosan as a soil modifier and Ieaf surface spray", J. Sei. Food Agric. 81:1426-1432. Vegetais coletados cresceram no solo ou meio de cultivo de planta preparado de acordo com os métodos da invenção são transportados em um recipiente refrigerado para o laboratório para análise e comparação com vegetais amostras de referência crescendo no solo não corrigido. Uma parte do corpo vegetal (50-60 kg ca- da) pode ser aleatoriamente cortada de 5-20 amostras (1,5- 2,0 kg no total para cada vegetal) de cada variedade para eliminar variação individual. As amostras são lavadas com água corrente de torneira e água pura, secas com toalhas de papel e tratadas com um espremedor de suco elétrico (modelo MI-C29, Matsushita Electric Co., Kobe, Japão). Sucos são centrifugados a 3800 χ g e então 13500 χ g por 10 minutos cada a 5 °C para remover partículas finas. Os sobrenadantes são filtrados através de uma membrana esterilizada por radi- ação (tamanho do poro 0,45 μπι, Toyo Advantec, Tóquio, Japão) para ensaio microbiológico. Todas as amostras são estocadas em recipientes esterilizados a 80 °C até analisado para o conteúdo de polifenol.

Polifenol total e ortodifenóis podem ser determi- nados por colorimetria utilizando o reagente Folin-Deni ou molibdato de amônio como descrito por Vazquez, A., et al, 1973, "Determinacion de Ios Polifenoles Totales dei Aceite de Oliva", Grasas Aceites 24:350-357. Níveis de flavonóides individuais podem ser medidos utilizando um instrumento QP- 8000a (Shimadzu, Kyoto, Japão) para cromatografia líquida / espectrometria de massa (CL/EM) em combinação com uma coluna semi-micro STR ODS-II (150 mm χ 2.1 mm id, Indústria Shinwa Chemical, Kyoto, Japão). Como fase móvel, 0,2% de solução de ácido acético (A) e metanol (B) pode ser passada através da coluna com uma curva gradiente de (1) 30-50% B (0-5 mm), (2) 50-90% B (5-10 mm), (3) 90% B (10-15 mm), (4) 30% B (15-25 mm).

Reagentes puros (por exemplo, ácido caféico, hes- peridina, hesperitina, miricetina, quercitrina, quercetina, apigenina e baicaleina), para uso como padrões de calibração são disponíveis comercialmente, por exemplo, da Sigma Chemi- cal (St. Louis, MO, EUA). Eles são dissolvidos individual- mente em metanol, então feitos para concentração apropriada em metanol 30%. Cromatografia pode ser realizada em uma taxa de fluxo constante de 0,2 mL min"1. 0 volume de amostra in- jetada é 5 μΐ, e a coluna é mantida a 40°C no forno. Ioniza- ção química à pressão atmosférica (APCI) é empregada para a interface, e fluxo de nitrogênio é ajustado para 2,5 litros min-1 como gás nebulizador. Após cada composto ser identifi- cado por seu tempo de retenção em comparação com o padrão e pela informação do peso molecular obtido do detector de EM, determinação quantitativa é realizada utilizando a curva de calibração de um ponto absoluto obtido pela monitoração do ion selecionado.

Amostras testes são preparadas de vegetais coleta- dos independentemente em pelo menos três meses diferentes.

Cada teste é repetido duas vezes utilizando sucos vegetais preparados em três meses de diferença, e os seis grupos de dados obtidos são utilizadas para avaliar as atividades bio- lógicas e composição química de cada amostra. Significância estatística de diferenças entre as amostras testes e amos- tras de referência podem ser determinadas utilizando um tes- te T de Estudante.

Exemplo XIV. Efeito de Nutrientes de Planta, Fito- químicos, e Antigenos Bacterianos na Atividade do Sistema Imune Inato

Os antígenos microbianos, nutrientes de planta e fitoquímicos isolados de plantas crescendo nos métodos e composições reveladas aqui podem também ser utilizados para aumentar a atividade do sistema imune em espécies mamíferas. Por exemplo, antígenos microbianos ou nutrientes e fitoquí- micos, incluindo isoflavonóides e flavonóides, podem ser i- solados de raiz de planta ou amostras de matéria de planta e alimento para ratos ou camundongos. O efeito pode ser deter- minado por monitoramento da atividade do sistema imune, in- cluindo ativação do sistema imune inato através da produção aumentada de IgA, ou a estimulação dos receptores do tipo Toll no sistema imune inato. A imunidade inata pode ser a- cessada pela medida das proteínas imunes, incluindo lisozima e lactoferrina, no sangue de um paciente (Bard, E., et al, 2003, Feb., Clin. Chem. Lab. Med. 41 (2): 127-33).

Amostras de sangue podem ser coletadas em tubos secos, imediatamente colocados nos gelos e clarificados por centrifugação a 1000 x g a 4°C por 10 minutos. Aprotinina (0,0025%) e azida sódica (0,1%) são adicionados ao sobrena- dante e alíquotas de 200 μL são estocadas a -20°C até o uso.

Amostras de saliva podem ser obtidas por colocar um "Salivette" (Sarstedt, Orsay, França) entre a gengiva e a bocheche no eixo da abertura do canal Stenon por cinco minu- tos em um lado da boa e então no outro. A saliva obtida é imediatamente colocada no gelo, e clareada por centrifugação a 1000 x g a 4°C por 10 mm, para separar salina do "Sali- vette". Aprotinina (0,0025%) e azida sódica (0,1%) são adi- cionadas ao sobrenadante e alíquotas de 200 μL são estocadas a -20°C até o uso.

Amostras de fezes podem ser coletadas em jarras de 1 litro e refrigeradas a 4°C antes de sua transferência para o laboratório dentro de 2 horas seguida à coleta. Peso fres- co de fezes é medido para determinar a produtividade de pro- teínas. Concentrações de proteína fecal foram determinadas utilizando amostras diluídas três vezes. Para extratos de proteínas fecais, 5 g de fezes homogeneizadas são fortemente agitadas com um agitador magnético, com 10 mL de NaCl (0,15 M) a 4°C por 1 h. Após centrifugação a 3000 x g por 10 mi- nutos a 4°C, azida sódica (concentração fecal 0,1% pe- so/volume) e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) (concentração final a 5 mM) são adicionados ao extrato fecal. Azida sódica é um inibidor de proliferação microbiana e PMSF é um inibi- dor de enzimas digestivas (tripsina, pepsina) e bactéria. Extrato fecal é então distribuído em tubos de 200 uL e con- gelados a -20°C.

Secreções cervico-vaginal podem ser obtidas utili- zando uma técnica de descrita por Belec, et al. Três milíme- tros de salina tamponada com fosfato estéril (PBS) são colo- cados na vagina com uma pipeta. Após os ciclos de fluxo e refluxo de duração de 60 segundos cada, 2 a 3 mL de fluído são coletados. Esta amostra é centrifugada a 1000 χ g a 4°C por 10 minutos. O sobrenadante é utilizado para medir Lz e Lf enquanto o concentrado contendo células e outros mucos são congelados para o estudo tardio. A possibilidade de con- taminação do sangue pode ser eliminada por um teste Hem Check 1. Um fato de diluição sempre pode ser utilizado para lavagem cervixovaginal.

As medidas de Lz e Lf são ensaiadas por ensaio i- munofluorimétrico de tempo resolvido (IFME-TR) no soro cole- tado, saliva, fezes e secreções cervicovaginais. Placas Im- muno Plates (Microwell Maxisorp, Life Technologie, França) são revestidas e incubadas por uma noite a 4 0C com IgG pu- rificada para Lz humana na concentração 5 mg/L (IgG policlo- nal purificada anti-Lz humana de coelho, Dako, Dakopans, Co- penhagen, Dinamarca), para Lf humana na concentração de 5 mg/L (IgG policlonal purificada anti-Lf de coelho, Dako) em tampão K2HPO4 (50 mmol/L, pH 8.5). Locais de ligação proteí- na não específicos são bloqueados por incubação de placas com solução bloqueadora (50 mmol/L Na2HPO4, 1% de albumina de soro bovino (BSA)). Diluições seriadas (proporação 2.5) de amostras testes e Lz purificada padrão (sete níveis: 1.02; 2.55; 4; 6.4; 10; 16 e 25 µg/L) ou Lf (oito níveis: 1.02; 2.55; 6.4; 10; 16; 40 e 100 µg/L) (Lz de Leite Humano, Sigma, Bourgoin Jallieu, França; Lf de Leite Humano, Sigma, Bourgoin Jallieu) são adicionados aos poços. Branco e con- troles positivos (Lz de Leite Humano, LU de Leite Humano em três concentrações diferentes (no teste de linearidade pa- drão) ) são sistematicamente adicionadas para cada placa uti- lizada. As placas são incubadas por 2 horas na temperatura do laboratório sob agitação estável. Elas são lavada seis vezes com um lavador de placa automático e então incubado por 2 horas sob agitação constante com IgG conjugada com bi- otina a 250 µg/L de concentração de biotina Lz anti-humana de coelho ou 250 µg/L de concentração de biotina Lf anti- humana de coelho. Estreptavidina conjugada com európio a concentração de 100 µg/L (Estreptavidina marcada com euró- pio, Delfia®, Wallac, Turku, Finlândia) é adicionados aos poços e incubados por 2 horas sob agitação estável em tempe- ratura ambiente. Após seis lavagens com um lavador de placa automática, a reação é começada por adição de solução aumen- tada (Delfia, Ref. 1244-104, Wallac, Turku, Finlândia) por 10 minutos sob agitação. Sinais fluorimétricos são lidos a 615 nm com um fluorímetro Victor 2 (contador Multimarcação Wallac 1420, Turku, Finlândia). Dados são analisados por programa (Multicalc 2000®, Wallac, Turku, Finlândia). Resul- tados quantitativos são determinados por referência às cur- vas padrões. Concentrações são corrigidas por fatores de di- luição tomando em consideração diluições para a técnica TR- IFMA.

O coeficiente relativo de excreção (CRE) para cada proteina pode ser determinado para comparar os parâmetros da excreção de proteina em excreções humanas, e para permitir comparação com outras espécies. O CRE expressa uma taxa de excreção de proteina relativa aquela de albumina, que é in- teiramente derivada do plasma por difusão passiva. 0 RCE re- ferindo a albumina é somente aplicável a fluidos onde albu- mina não é degradada por enzimas, isto é, saliva e secreções cervico-vaginais. Dessa forma, CRE referindo ao AAT foi uti- lizado em amostras de fezes. CRE são obtidos de acordo com a seguinte fórmula: [{albumina ou AAT no soro) (albumina ou AAT no fluido)/proteina no soro)/(proteina no fluido)]. O limite (ponto de corte) entre secreção e transudação é igual a um (CRE de albumina ou AAT). Sob este limite, transudação do compartimento sérico ocorre embora CRE maior que um demons- tra uma secreção local predominante com uma quantidade pe- quena de transudação.

Resultados podem ser expressos como média ± erro padrão da média (EPM), mediana e variação de valores. Compa- ração de médias entre secreções é estabelecida pelo teste U de Mann-Whitney. Uma diferença significante pode fixar um p igual a, ou menor que 0,05. Análises estatísticas são feitas utilizando programa StatView/TM para OC (Instituto SAS Inc.).

Claims (59)

1. Método para produzir um material orgânico car- bonizado adequado para o isolamento de micróbios no auge da queima, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o aquecimento de materiais orgânicos contendo esporos dos ditos esporos no auge da queima sob condições tais que a carbonização avança até o ponto logo antes da extinção dos referidos esporos dos micróbios no auge da queima.

2.Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do aquecimento ser conduzido em con- dições de cerca de IBTU de distância das condições que teria resultado na extinção dos ditos esporos dos micróbios no au- ge da queima.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato do aquecimento é realizado a cerca de 600 ºC por cerca de 10 a cerca de 15 minutos.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico ser um material vegetal ou de um material residual oceânico.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender a recuperação dos esporos de micróbios no auge da queima a partir do mate- rial carbonizado produzido.

6. Método para produzir micróbios no auge da quei- ma a partir de material orgânico carbonizado, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. inocular um meio de crescimento com um materi- al orgânico carbonizado contendo esporos de micróbios no au- ge da queima; b. incubar o referido meio de crescimento para permitir que os esporos comecem o crescimento vegetativo, produzindo assim os micróbios no auge da queima.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser um material vegetal carbonizado.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser carvão vegetal.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato do carvão ser carvão de algarobo ou carvão de amendoeira.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser um resíduo orgânico oceânico carbonizado.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser produzido pelo aquecimento do material orgânico a cerca de 600 °C durante pelo menos 10 minutos.

12. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda: c. separar os referidos micróbios no auge da queima do meio de crescimento.

13. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda: c. isolar cepas individuais dos micróbios no auge da queima produzidos nos meios de crescimento.

14. Método de isolar micróbios no auge da queima de uma amostra de solo, CARACTERIZADO pelo fato compreender: a. misturar a amostra de solo com água para obter uma suspensão líquida; b. ferver a referida suspensão líquida; c.inocular um meio de crescimento com uma alíquota da suspensão fervida; e d. manter o meio de crescimento para permitir o crescimento vegetativo dos micróbios no auge da queima no meio.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender: e. separar os micróbios no auge da queima do meio de crescimento.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender: e. isolar cepas individuais dos micróbios no auge da queima produzidos no meio de crescimento.

17. Composição compreendendo micróbios no auge da queima, CARACTERIZADA pelo fato dos referidos micróbios no auge da queima serem bactérias aeróbicas e produzirem espo- ros que sobrevivem a uma temperatura de cerca de 600 0C.

18. Composição de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato dos ditos micróbios no auge da quei- ma serem isolados a partir de um material orgânico carboni- zado, do solo ou de uma mistura destes.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato dos ditos micróbios no auge da quei- ma serem preparados pelo método conforme definido em qual- quer uma das reivindicações 6 ou 14.

20. Composição de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato dos ditos micróbios no auge da quei- ma serem Bacillus lato sensu.

21. Composição de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato dos ditos micróbios no auge da quei- ma compreendem HAB7, AC9, ou uma combinação dos mesmos.

22. Micróbio no auge da queima isolado, CARACTERIZADO pelo fato do dito micróbio no auge da queima ser uma bactéria aeróbica e produzir esporos que sobrevivem a uma temperatura de cerca de 600 0C.

23. Micróbio no auge da queima isolado, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato do dito mi- cróbio no auge da queima ser isolado a partir de carvão ve- getal, do solo ou de uma mistura destes.

24. Micróbio no auge da queima isolado, CARACTERIZADO pelo fato de ser designado como HAB7 ou AC9.

25. Método de identificação de um micróbio no auge da queima capaz de incrementar o crescimento vegetal, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. inocular um meio de crescimento com um material orgânico carbonizado contendo esporos de micróbios no auge da queima; incubar o meio de crescimento para permitir que os esporos comecem o crescimento vegetativo, produzindo as- sim os micróbios no auge da queima; isolar cepas individuais dos micróbios no auge da queima produzidos na etapa b; d. determinar a capacidade das cepas individuais de aumentar o crescimento vegetal; e e. identificar uma cepa de micróbio no auge da queima que aumente o crescimento da planta.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser um material vegetal carbonizado.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser carvão vegetal.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato do carvão ser carvão de algarobo ou carvão de amendoeira.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser um resíduo orgânico oceânico carbonizado.

30. Método de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato do material orgânico carbonizado ser produzido pelo aquecimento do material orgânico a cerca de -600°C durante pelo menos 10 minutos.

31. Método de identificar um micróbio no auge da queima capaz de incrementar o crescimento vegetal, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. misturar a amostra de solo contendo esporos de micróbios no auge da queima com água para obter uma suspen- são líquida; b ferver a referida suspensão líquida; c. inocular um meio de crescimento com uma alíquo- ta da suspensão fervida; d. incubar o meio de crescimento para permitir que os esporos comecem o crescimento vegetativo, produzindo as- sim os micróbios no auge da queima; e. isolar cepas individuais dos micróbios no auge da queima produzidos na etapa d; f. determinar a capacidade das cepas individuais de reforçar o crescimento vegetal; e identificar uma cepa de micróbio no auge da queima que reforce o crescimento da planta.

32. Método para estimular o crescimento vegetal e a produtividade, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o crescimento de cultivares da planta em um meio de cultura de plantas suplementado com, pelo menos, um micróbio no auge da queima, onde o referido micróbio no auge da queima é uma bactéria aeróbica e produz esporos que sobrevivem a uma tem- peratura de cerca de 600 0G.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato do meio de cultura de plantas também ser suplementado com um material vegetal carbonizado.

34. Método para aumentar o teor de nutrientes ou de fitoquímicos de um produto de uma planta, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o crescimento de cultivares de planta em um meio de cultura de plantas suplementado com, pelo menos, um micróbio no auge da queima, onde o referido micróbio no auge da queima é uma bactéria aeróbica e produz esporos que sobrevivem a uma temperatura de cerca de 600 0 C.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato do meio de cultivo de plantas também ser suplementado com carvão vegetal.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato do nutriente ou fitoquimico ser um flavonóide ou isoflavonóide.

37. Método de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato do nutriente ou fitoquimico ser uma vitamina.

38. Método de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato da vitamina ser vitamina E (a- tocoferol ou γ-tocoferol).

39. Método de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato da quantidade de α-tocoferol no re- ferido produto da referida planta ser aumentada em pelo me- nos 1,3 vezes em comparação com um produto de planta culti- vada na ausência do suplemento com o referido micróbio no auge da queima.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato da quantidade de γ-tocoferol ser au- mentada em pelo menos 1,3 vezes em comparação com um produto de planta cultivada na ausência de suplemento com o referido micróbio no auge da queima.

41. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato da planta ser uma planta de oliveira ou uma planta de amendoeira.

42. Produto vegetal nutricionalmente enriquecido, CARACTERIZADO pelo fato de ser colhido a partir de uma plan- ta cultivada pelo método conforme definido na reivindicação 34.

43. Produto vegetal nutricionalmente enriquecido, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato do produto vegetal ser amêndoa.

44. Método para melhorar as propriedades de promo- ção de crescimento vegetal de um solo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a aplicação ao solo de uma composição contendo pelo menos um micróbio no auge da queima, onde o referido micróbio no auge da queima é uma bactéria aeróbica e produz esporos que sobrevivem a uma temperatura de cerca de 600°C.

45. Método de transferência de micróbios no auge da queima estimulados por crescimento vegetal presentes em um primeiro solo para um segundo solo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a obtenção de carvão vegetal a partir de plantas cultivadas no referido primeiro solo, e aplicar o referido carvão vegetal no segundo solo.

46. Método de transferência de micróbios no auge da queima estimulados por crescimento vegetal presentes em um primeiro solo para um segundo solo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender obter carvão vegetal a partir de plantas cultivadas no referido primeiro solo, onde o referido carvão vegetal contem esporos de micróbios no auge da queima, ino- cular um meio de crescimento com o carvão vegetal para ini- ciar a germinação e crescimento vegetativo de esporos para produzir micróbios no auge da queima, e aplicar os referidos micróbios no auge da queima produzidos ao segundo solo.

47. Método de transferência de micróbios no auge da queima estimulados por crescimento vegetal presentes em um primeiro solo para um segundo solo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender obter carvão vegetal a partir de plantas cultivadas no referido primeiro solo, onde o referido carvão vegetal contem esporos de micróbios no auge da queima, ino- cular um meio de crescimento com o carvão vegetal para ini- ciar a germinação e crescimento vegetativo de esporos para produzir micróbios no auge da queima, identificar a partir dos micróbios no auge da queima uma cepa que promova as ca- racterísticas do crescimento vegetal do primeiro solo, e a- plicar a cepa identificada ao segundo solo.

48. Método de transferência de micróbios no auge da queima estimulados por crescimento vegetal presentes em um primeiro solo para um segundo solo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ferver uma suspensão líquida do referido primeiro solo, inocular um meio de crescimento com uma alí- quota da suspensão líquida fervida para dar início à germi- nação e ao crescimento vegetativo de esporos de micróbios no auge da queima no mesmo para produzir micróbios no auge da queima, e aplicar os micróbios no auge da queima produzidos no segundo solo.

49. Método de transferência de micróbios no auge da queima estimulados por crescimento vegetal presentes em um primeiro solo para um segundo solo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ferver uma suspensão líquida do referido primeiro solo, inocular um meio de crescimento com uma ali- quota da suspensão liquida fervida para dar inicio à germi- nação e ao crescimento vegetativo de esporos de micróbios no auge da queima no mesmo para produzir micróbios no auge da queima, identificar a partir dos micróbios no auge da queima uma cepa que promove as características do crescimento vege- tal do primeiro solo, e aplicar a cepa identificada no se- gundo solo.

50. Método para melhorar o crescimento e os valo- res nutricionais de uma planta, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivares de crescimento da planta em um meio de cultura de plantas suplementado com um material vegetal carbonizado.

51. Método para melhorar as propriedades de promo- ção de crescimento vegetal de um solo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender aplicar material vegetal carbonizado ao solo.

52. Método, de acordo com as reivindicações 50 ou -51, CARACTERIZADO pelo fato do referido carvão vegetal ser selecionado para conter, pelo menos, um micróbio no auge da queima, onde o referido micróbio no auge da queima é uma bactéria aeróbica e produz esporos que sobrevivem a uma tem- peratura de cerca de 600 0 C.

53. Método de estimular o sistema imunológico de um animal, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o forneci- mento para consumo do produto vegetal conforme definido na reivindicação 42 ao referido anima.

54. Método para melhorar a flora microbiana e pro- mover da saúde de um animal, CARACTERIZADO pelo fato de com- preender o fornecimento do produto vegetal conforme definido na reivindicação 42 ao referido animal para consumo.

55. Método para melhorar a conversão da energia solar pelas plantas, CARACTERIZADO pelo fato de compreender os cultivares de crescimento das plantas em um meio de cul- tura de plantas suplementado com, pelo menos, um micróbio no auge da queima isolado pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6-16.

56. Método para reduzir a poluição ambiental, CARACTERIZADO pelo fato de compreender os cultivares de crescimento de plantas em um meio de cultura de plantas su- plementado com, pelo menos, um microorganismo no auge da queima isolado pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6-16.

57. Método de melhorar ou restabelecer a qualidade do solo em um terreno não-agricola, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a aplicação ao solo, de uma composição con- tendo pelo menos um micróbio no auge da queima, onde o refe- rido micróbio no auge da queima é uma bactéria aeróbica e produz esporos que sobrevivem a uma temperatura de cerca de -600°C.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato da referida composição ser carvão vegetal.

59. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato da terreno não-agricola ser um ter- reno com aparência silvestre, um cinturão verde urbano ou um campo de golfe.