KR20080070901A - A bacterium salmonella harboring plasmid expressing tnf-alpha in eukaryotic cell and an antitumoral composition thereof - Google Patents

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Abstract

A bacterium Salmonella harboring a plasmid expressing TNF(tumor necrosis factor)-alpha in an eukaryotic cell is provided to improve antitumoral effects as compared with the prior Salmonella and inhibit toxicity by using attenuated Salmonella, and treat tumors, especially colon cancer and skin cancer to which administration of TNF alpha itself is difficult. A bacterium Salmonella typhimurium KCCM 0782P expressing TNF-alpha in an eukaryotic cell other than Salmonella is produced by transforming attenuated Salmonella typhimurium with a plasmid pcDNA3-TNF-alpha containing a gene encoding TNF-alpha having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 and a CMV(cytomegalovirus) promoter for inducing the expression of TNF-alpha in an eukaryotic cell. An antitumoral composition comprises the Salmonella typhimurium KCCM 0782P.

Description

튜머 네크로시스 팩터 알파를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 항암 치료용 조성물{A bacterium salmonella harboring plasmid expressing TNF-alpha in eukaryotic cell and an antitumoral composition thereof}A bacterium salmonella harboring plasmid expressing TNF-alpha in eukaryotic cell and an antitumoral composition

도 1은 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드 (plasmid)인 pcDNA-TNF 의 벡터의 모식도이다.1 is a schematic diagram of a vector of pcDNA-TNF, which is a plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells.

도 2는 피부암종 B16F10에 대하여 본 발명 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid) 를 처리함으로써 나타난 쥐의 피부암의 살상효과를 나타낸 도면이다.FIG. 2 is a diagram showing the killing effect of skin cancer in rats, which was obtained by treating a plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) of the present invention against skin carcinoma B16F10.

도 3은 암모델 마우스 C57/BL6에서 증식된 피부암종 B16F10에 대하여 PBS용액, BRD509 살모넬라, BRD509 살모넬라(벡터포함) 및 본 발명 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid) 함유 살모넬라 균주를 처리할때에 쥐의 체내에 TNF-alpha 의 발현양을 측정한 도면이다. Figure 3 contains a plasmid expressing PBS solution, BRD509 Salmonella, BRD509 Salmonella (including vector) and the present Tumer Necrosis Factor Alpha (TNF-α) for skin carcinoma B16F10 proliferated in cancer mouse C57 / BL6 When the Salmonella strains were treated, the expression levels of TNF-alpha in the rats were measured.

도 4는 암모델 마우스 C57/BL6에서 증식된 피부암종 B16F10에 대하여 PBS용액, BRD509 살모넬라, BRD509 살모넬라(벡터포함) 및 본 발명 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid) 함유 살모넬라 균주를 처리할때에 암을 억제하는 정도의 크기를 나타낸 도면이다.Figure 4 contains a plasmid expressing PBS solution, BRD509 Salmonella, BRD509 Salmonella (including vector) and the present invention Tumer Necrosis Factor Alpha (TNF-α) for skin carcinoma B16F10 grown in cancer model mouse C57 / BL6 Figure showing the extent of inhibiting cancer when processing Salmonella strains.

도 5는 암모델 마우스 C57/BL6에서 증식된 피부암종 B16F10에 대하여 PBS용액, BRD509 살모넬라, BRD509 살모넬라(벡터포함) 및 본 발명 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid) 함유 살모넬라 균주를 처리할때에 암에 대한 생존률의 기간을 나타낸 도면이다.FIG. 5 contains plasmids expressing PBS solution, BRD509 Salmonella, BRD509 Salmonella (including vectors) and the present Tumer Necrosis Factor Alpha (TNF-α) for skin carcinoma B16F10 grown in cancer mouse C57 / BL6 Figure shows the duration of survival for cancer when treating Salmonella strains.

본 발명은 항암효과를 유도하는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 항암 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 병원성이 없는 약독화된 살모넬라 균주내에 살모넬라 균주가 아닌 진핵세포에서 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)를 형질도입함으로써 새로운 형질융합에 의해 항암효과가 증대된 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 항암 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a Salmonella strain comprising a plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells inducing an anticancer effect, and more particularly, to a composition for treating anticancer containing the same. Salmonella strains having increased anticancer effect by new fusion by transducing plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells other than Salmonella strains in attenuated Salmonella strains without It relates to a composition for anticancer treatment.

살모넬라는 병원성 미생물로 대개의 경우 식중독을 일으키는 병원균이다. 하지만 최근 미국 예일대학 연구팀은 유러피언 암 잡지(European Journal of Cancer)에 발표한 논문에서 유전자를 조작한 살모넬라균과 방사선 요법을 병행하여 사용함으로써 흑색종을 치료하는데 매우 성공적인 결과를 거두었다고 보고하였다(Antitumour effects of genetically engineered Salmonella in combination with radiation. European Journal of Cancer, Volume 36, Issue 18, Pages 2397- 2402 J. Platt.). 이들 연구팀은 이전에도 살모넬라균이 생쥐의 종양을 공격하는 특성을 지닌 것을 발견한 바 있는데, 살모넬라를 유전자 조작하면 종양을 공격하는 특성은 유지하면서 독성만 제거할 수 있으며, 상기 유전자 조작된 살모넬라의 주입을 통해 종양을 억제할 수 있다고 발표하였다. 현재 암세포를 공격하는 상기 박테리아는 미국과 유럽의 세 곳에서 사람을 대상으로 하는 제1기 임상실험에 들어가 있다.Salmonella is a pathogenic microorganism, usually a pathogen that causes food poisoning. However, a recent study by Yale University researchers in the European Journal of Cancer reported very successful results in the treatment of melanoma by using a combination of genetically engineered Salmonella and radiation therapy (Antitumour). effects of genetically engineered Salmonella in combination with radiation.European Journal of Cancer, Volume 36, Issue 18, Pages 2397-2402 J. Platt.). The researchers have previously found that Salmonella has the characteristic of attacking mouse tumors. Genetic engineering of Salmonella can only remove the toxicity while maintaining the tumor attack characteristics. It is reported that the tumor can be suppressed through. The bacteria that attack cancer cells are currently in a first phase clinical trial in humans in three parts of the United States and Europe.

한편, 상기 논문내용에 따르면, 방사선 요법이나 살모넬라 요법을 단독으로 시행하는 경우에는 생쥐에서 종양 억제효과가 2-3주밖에 지속되지 않으나, 두 가지 방법을 병행하여 사용할 경우에는 그 효과가 2배로 증폭된다고 한다. 하지만 이 방법의 경우에도 종양이 완전히 사라지지는 않았으며 단지 생쥐의 생명을 더욱 오래 연장시켜준 것에 불과한 한계가 있었다.On the other hand, according to the above paper, the tumor suppression effect lasts only 2-3 weeks in the case of radiation therapy or Salmonella therapy alone, but the effect is doubled when the two methods are used in combination It is said to be. However, even with this method, the tumor did not disappear completely, but was limited only by extending the life of the mice longer.

한편, 튜머 네크로시스 팩터(TNF)란 세균벽에서 나오는 내독소인 지다당체에 의해 T세포에서 분비되는 종양을 괴사시키는 물질을 말한다. 종양세포상의 TNF 수용체에 결합하면, 표적세포의 대사에 변화를 끼쳐서 상해한다. TNF는 대식세포에 작용하여 그 종양상해 활성을 증가하는 작용도 하며 혈관 내피세포에 작용하여 혈전을 형성시키게 한다. 현재까지 밝혀진 TNF는 α, β의 두 종류가 있으며, 이들은 세포내의 특이적 수용체(receptor)들을 통해 신호를 전달하는 것으로 밝혀졌다. 두 종류 중 항암효과가 뚜렷한 것은 α type으로, 여러 자료를 통해 그 효과가 입증되었다.Meanwhile, the tumer necrosis factor (TNF) refers to a substance that necroses tumors secreted from T cells by the endotoxin, which is an endotoxin from the bacterial wall. Binding to TNF receptors on tumor cells damages the metabolism of target cells. TNF acts on macrophages to increase its oncolytic activity and on vascular endothelial cells to form blood clots. There are two types of TNFs identified so far, which are known to transmit signals through specific receptors in cells. Of the two types, the anti-cancer effect is apparent in the α type, which has been proved through various data.

본 출원인은 상기 튜머 네크로시스를 자체내에서 발현하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 항암 치료용 조성물을 개발하여 특허출원하였다(특허출원 제2006-0014769호, 미공개). 상기 특허출원은 살모넬라 자체의 항암효과와 더불어 살모넬라에서 분비되는 튜머 네크로시스 팩터 알파단백질에 의한 항암효과가 더해져 기존의 각각의 항암효과보다 훨씬 더 우수한 항암효과를 보여주었으나, 이 경우 살모넬라에서 분비되는 튜머 네크로시스 팩터에 의하여 혈중의 튜머네크로시스 양이 급격히 증가되어 독성문제가 제기될 수 있다.Applicant has developed and patented a Salmonella strain expressing the tumer necrosis in itself and an anticancer treatment composition containing the same (Patent Application 2006-0014769, unpublished). The patent application shows the anticancer effect of the Salmonella itself and the anti-tumor effect by the Tumer Necrosis Factor alpha protein secreted by Salmonella showed much better anticancer effect than the existing anticancer effects, but in this case it is secreted from Salmonella The tumer necrosis factor causes a rapid increase in the amount of tumer necrosis in the blood, which may pose a toxicity issue.

본 발명자는 상기 독성 문제를 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 원핵세포인 살모넬라 균주에서는 발현하지 않고 살모넬라 균주가 파괴된 후 주위의 진핵세포에서 TNF를 발현하는 플라스미드를 사용했을 때 상기 문제를 해결할수 있는 점을 발견하였다. 종래 특허출원한 균주의 경우 미생물자체의 메커니즘을 이용하여 튜머네크로시스 팩터 알파 단백질을 발현하게 된다. 미생물 자체로도 사이토 카인이 발현이 된다. 하지만 본 발명의 균주에서는 진핵세포에서만 발현이 가능한 플라스미드를 살모넬라에 실어서 인체에 유전자를 도입하는 형태의 균주이다. 본 발명의 균주 자체로는 사이토카인을 만들지 못합니다. 이 균주가 인체에 들어가서 살모넬라가 터져 죽은후에 그 안에서 진핵세포에서 발현하는 플라스미드가 빠져나와서 이들 플라스미드에 의한 사이토카인발현이 있어야 튜머네크로시스펙터 알파가 발현된다.The present inventors have made diligent efforts to solve the toxicity problem, and when using the plasmid expressing TNF in the eukaryotic cells after the Salmonella strain is destroyed without the Salmonella strain, which is a prokaryotic cell, the problem can be solved. Found. In the case of the conventionally patented strain to express the tume necrosis factor alpha protein using the mechanism of the microorganism itself. The microorganisms themselves express cytokines. However, in the strain of the present invention, a plasmid that can only be expressed in eukaryotic cells is loaded into Salmonella to introduce a gene into the human body. The strain of the present invention alone does not produce cytokines. After the strain enters the human body and Salmonella bursts and dies, the plasmids expressed in eukaryotic cells must escape and cytokine expression by these plasmids is required for the expression of tumer necrosfector alpha.

이런 두 균주의 외적인 차이는 체내에 튜머네크로시스팩터의 분비량의 차이를 가져오게 되어 도 3에서 보여지듯이 살모넬라를 치료제로 투여할때에 종래 균주보다 혈중의 튜머네크로시스양을 감소시키게 된다. 이는 튜머네크로시스팩터 알파를 임상적으로 적용하는데 가장 큰 문제점인 사이토카인의 과다분비에 의한 쇼크등 의 부작용을 막아 줄 수 있을 것이다.The external differences between these two strains result in a difference in the secretion amount of the tume necrosis factor in the body, and as shown in FIG. 3, the amount of tume necrosis in the blood is reduced when compared with the conventional strain when Salmonella is administered as a therapeutic agent. This may prevent side effects such as shock caused by excessive secretion of cytokines, which is the biggest problem in clinical application of the TME necrosis factor alpha.

따라서, 본 발명의 목적은 항암효과를 유도하는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid) 포함하는 살모넬라 균주를 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a Salmonella strain comprising a plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells inducing anticancer effects.

본 발명의 다른 목적은 상기 살모넬라 균주를 함유하는 항암 치료용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide an anticancer composition containing the Salmonella strain.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 살모넬라 균주외의 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)로 형질도입됨을 특징으로 하는 살모넬라 균주(Salmonella typhimurium)를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides Salmonella typhimurium, characterized in that the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) is transduced with a plasmid that is expressed in eukaryotic cells other than Salmonella strains. .

본 발명에 있어서, 살모넬라(Salmonella typhimurium) 균주는 장티푸스를 유발하는 group D Salmonella에 속하는 병원균으로서, 본 발명에서는 상기 살모넬라 균주의 병원성을 없애기 위하여 약독화된(attenuated) 살모넬라 균주를 사용하였다.In the present invention, the Salmonella typhimurium strain is a pathogen belonging to group D Salmonella that induces typhoid fever. In the present invention, an attenuated Salmonella strain is used to eliminate the pathogenicity of the Salmonella strain.

본 발명에 있어서, 상기 약독화된 살모넬라 균주는 장티프스 예방용 약독화 백신인 것을 특징으로 한다. 여기서, 약독화(attenuation)란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고, 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다.In the present invention, the attenuated Salmonella strain is characterized in that the attenuated vaccine for preventing typhoid. Here, attenuation means artificially weakening the virulence of living pathogens, and means that the genes involved in the essential metabolism of the pathogens are not mutated to cause disease in the body, and only the immune system is stimulated to induce immunity.

장티프스 예방용 백신으로는 이미 당업계에 주사제와 경구용 약독화 백신이 많이 개발되어 있다. 경구용 생백신 제조에 가장 많이 사용되는 약독화 살모넬라 균주는 galE gene에 변이가 있어 uridine diphosphate(UDP) galactose-4- epimerase를 지니지 못하는 변이주 Ty21a이다 (Levine MM, et al., Progress in vaccines against typhoid fever. Rev Infect Dis 11: 552-567, 1989).As a vaccine for preventing typhoid, many injections and oral attenuated vaccines have already been developed in the art. The most attenuated Salmonella strain used for the production of live oral vaccines is the mutant Ty21a which does not have uridine diphosphate (UDP) galactose-4- epimerase due to mutations in the galE gene (Levine MM, et al., Progress in vaccines against typhoid fever). Rev Infect Dis 11: 552-567, 1989).

본 발명의 구체적인 실시예에 사용된 살모넬라 균주(숙주)는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) BRD 509 균주로, 병원성이 없는 약독화된 균주이다(J Infect Dis. 1994 Dec;170(6):1508-17, Medeva사, London으로 구입가능). 상기 균주의 약독화 방법은 aro A, aro B 의 유전자를 변형시켜서 균주의 대사에 비정상이 일어나게 만들었으며, 이로 인한 약독화 결과를 이용해서 본 발명에서 백신으로 사용하였다.Salmonella strains (hosts) used in specific examples of the present invention are Salmonella typhimurium BRD 509 strains, which are attenuated strains without pathogenicity (J Infect Dis. 1994 Dec; 170 (6): 1508). -17, available from Medeva, London). The attenuating method of the strain was to alter the genes of aro A, aro B to cause abnormalities in the metabolism of the strain, it was used as a vaccine in the present invention using the attenuation results.

본 발명에 있어서, 상기 튜머네크로시스팩터 알파를 코딩하는 유전자는 상용화된 어떤 튜머네크로시스팩터 알파 발현 플라스미드부터도 입수할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the gene encoding the tumenecrosis factor alpha can be obtained from any commercialized tumenecrosis factor alpha expression plasmid, but is preferably characterized by encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명에 있어서, 상기 플라스미드는 상기 튜머네크로시스팩터 알파를 진핵세포내에서 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티클로닝사이트를 가지고 있는 어떤 플라스미드도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 도 1에 도시된 pcDNA3-TNF-α 인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the plasmid may be any plasmid having a promoter capable of expressing the tume necrosis factor alpha in eukaryotic cells and a multicloning site for cloning, but preferably pcDNA3 shown in FIG. 1. -TNF-α.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 한국미생물보존센터에 2006. 9. 26자로 기탁된 수탁번호 KCCM10782P 인 것을 특징으로 하는 살모넬라 균주를 제공한다.In the present invention, Accession No. KCCM10782P deposited with the Korea Microorganism Conservation Center on September 26, 2006. It provides a Salmonella strain characterized in that.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 살모넬라 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for anticancer treatment comprising the Salmonella strain according to the present invention.

본 발명에 있어서, 상기 암의 종류는 튜머네크로시스팩터가 항암작용을 할 수 있는 어떤 암도 될 수 있으나, 바람직하게는 피부암인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the type of cancer may be any cancer capable of antitumor effect of the tume necrosis factor, but is preferably skin cancer.

본 발명의 상기 목적은 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid) 포함하는 유전자 발현벡터를 약독화된 살모넬라에 형질도입함으로써 본 발명의 살모넬라를 제작하고, 피부암 세포인 B16F10 암세포주를 이식한 C57/BL6 마우스 모델에 상기 형질도입 살모넬라를 투여하여, 그에 의한 항암효과를 TNF-α를 포함하지 않는 다른 살모넬라 대조군에 의한 효과와 비교 분석하여 확인함으로써 달성하였다.The above object of the present invention is to produce a Salmonella of the present invention by transducing attenuated Salmonella gene expression vector containing a plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells, skin cancer cells The transgenic Salmonella was administered to a C57 / BL6 mouse model transplanted with a phosphorous B16F10 cancer cell line, and its anticancer effect was confirmed by comparing with the effect by other Salmonella controls not containing TNF-α.

본 발명을 위해 사용된 살모넬라 균주는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) BRD 509 균주로, 병원성이 없는 약독화된 균주이며, 상기 균주내에 형질도입된 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 발현벡터는 pcDNA3-TNF-α 벡터이다. 상기 pcDNA3-TNF-α 벡터는 진핵세포에서 발현을 유도할 수 있는 CMV promoter를 가지고 있으며, TNF-α 유전자가 상기 CMV promoter하의 멀티클로닝사이티, 즉 EcoRI (939) 부위와 XbaI (1653) 부이 사이에 클로닝되어 있다.The Salmonella strain used for the present invention is a Salmonella typhimurium BRD 509 strain, which is an attenuated strain without pathogenicity, and e.g., a tumer necrosis factor alpha (TNF-α) transduced in the strain. The expression vector containing the plasmid (plasmid) expressed in the is a pcDNA3-TNF-α vector. The pcDNA3-TNF-α vector has a CMV promoter capable of inducing expression in eukaryotic cells, and the TNF-α gene is a multicloning site under the CMV promoter, that is, between the EcoRI (939) site and the XbaI (1653) buoy. Cloned to

본 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드는 세포 살상능력이 있다고 알려져있으나 본 플라스미드 만으로 암세포에 주입할때에 그 효과가 크게 기대되지 않았다. 플라스미드는 정상 상태로는 체내에서 발현되기 힘든 특성 이 있기 때문이다. The plasmid expressing this tumer necrosis factor alpha (TNF-α) is known to have cell killing ability, but when the plasmid alone was injected into cancer cells, the effect was not expected to be great. This is because plasmids are difficult to express in the body under normal conditions.

반면 본 발명자는 상기와 같은 점을 감안하여, 현재 그 종양억제 효과가 밝혀진 살모넬라와 상기 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)를 살모넬라라는 세균에 형질도입하였다. On the other hand, in view of the above, the present inventors transduced Salmonella and plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells, the tumor suppressor effect of which is currently found, to a bacterium called Salmonella. .

그리고 이를 벡터로서 이용하여 더욱 뛰어난 항암효과를 나타내는 형질도입 살모넬라를 제작하였다. 특별히 항암효과가 기대되는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)를 살모넬라에 형질도입하고 상기 형질도입된 살모넬라를 생체내에 투여하게 되면, 살모넬라 자체의 항암효과와 더불어 살모넬라 안에서 생체내로 투여되는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)에 의한 항암효과가 더해져 기존의 각각의 항암효과보다 훨씬 더 우수한 항암효과를 보여줄 것으로 기대되었기 때문이다.And using this as a vector to produce a transgenic Salmonella showing more excellent anticancer effect. In particular, when a plasmid expressing a tumer necrosis factor alpha (TNF-α), which is expected to have an anticancer effect, is transduced into Salmonella, and the transduced Salmonella is administered in vivo, the Salmonella itself has an anticancer effect. This is because the anticancer effect by the plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) administered in vivo is expected to show a much better anticancer effect than the existing anticancer effects.

본 발명에서 항암효과를 유도하는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid) 포함하는 살모넬라 균주는 당업계에서 통상 사용되는 형질도입방법에 의해 제조 가능하며, 제조된 살모넬라는 암피실린 내성을 가진 살모넬라 균주로, 체내에 들어가서 인체의 면역체계에 의해 터져 죽은후에 그 안에서 진핵세포에서 발현하는 플라스미드가 빠져나와서 주변의 진핵세포에 형질도입된 후 발현되어 튜머네크로시스펙터 알파가 발현된다.Salmonella strain comprising a plasmid expressing a tumer necrosis factor alpha (TNF-α) inducing an anticancer effect in the present invention can be prepared by a transduction method commonly used in the art, manufactured Salmonella ampicillin Resistant Salmonella strain, which enters the body, bursts by the body's immune system, dies, and thereafter, plasmids expressed in eukaryotic cells exit and transduced into surrounding eukaryotic cells, which are expressed and expressed in the tume necrosensor alpha.

본 발명의 항암치료용 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 조성물은 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 항암 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.The anticancer composition of the present invention may be administered to the human body through any general route as long as it can reach the target tissue. Parenteral administration, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration may be, but is not limited to. The composition may also be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell. The composition may be administered with a pharmaceutical carrier generally used for anticancer treatment, and examples of such carrier include physiological saline.

본 발명의 항암치료용 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"는 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 질병의 중증도, 연령, 성별, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예컨대, 성인기준으로 1회 1mg 내지 1000mg의 본 발명의 살모넬라 균주를 투여할 수 있다.The anticancer composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount. The term “therapeutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, with the effective amount being the severity, age, sex, time of administration, administration of the disease. Route and rate of release, duration of treatment, factors including concomitant medications, and other factors well known in the medical arts. For example, 1 mg to 1000 mg of the Salmonella strain of the present invention may be administered once on an adult basis.

이하, 본 발명의 구성을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail by way of examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.

<실시예 1: 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 유전자 발현벡터를 포함하는 살모넬라균주의 제작>Example 1 Preparation of Salmonella Strains Comprising Gene Expression Vectors Containing Plasmids Expressing Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) in Eukaryotic Cells>

먼저, 약독화된 살모넬라 균주 BRD509(Salmonella typhimurium BRD509)를 루리아 벌테니(Luria Bertani) 배지에서 37℃ 배양하였다. 한국사이토카인 은행으로부터 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α) 분비 벡터 플라스미드, pcDNA3-TNF-α 벡터 (ACCESSION NUMBER 21926)를 입수하였다. 상기 벡터는 Invitrogen사의 pcDNA3 모벡터의 CMV promoter하의 EcoRI (939) 부위와 XbaI (1653) 부이 사이에 TNF-α 유전자를 클로닝하여 제조되었다. 도 1은 배양된 melanoma (B16F10)암종에 대한 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)의 개열지도이다. 배양된 상기 살모넬라 균주에 상기 pcDNA3-TNF-α 벡터를 형질도입하기 위하여, 상기 살모넬라 균주를 다시 100mL의 양으로 24시간 배양한 후 파장 600nm의 광학흡광도(O.D.600) 및 0.7을 나타내는 배양농도에서 세균을 5500rpm의 속도로 원심분리하였다. 상기 원심분리 후 바닥에 가라앉은 세균만을 수집하여 배양부피와 동일한 부피의 차가운 증류수로 희석하였다. 상기 희석시킨 세균을 다시 상기와 동일한 방법으로 원심분리하여 2mL의 차가운 20% 글리세롤 증류수에 희석한 다음, 또 다시 원심분리의 과정을 거쳐 수득한 세균을 100㎕의 20% 글리세롤에 희석하였다. 상기 과정에 의해 얻어진 혼합액 중 30㎕(2㎍)를 미니원심분리용기에 넣고 여기에 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)인 pcDNA3 벡터를 3㎕(2㎍) 가한 후, 275-325V의 전기로 형질도입을 유도하였다. First, attenuated Salmonella strain BRD509 ( Salmonella typhimurium BRD509) was incubated at 37 ° C. in Luria Bertani medium. The Tumer Necrosis Factor Alpha (TNF-α) Secretion Vector Plasmid, pcDNA3-TNF-α Vector (ACCESSION NUMBER 21926) were obtained from the Cytokine Bank of Korea. The vector was prepared by cloning the TNF-α gene between the EcoRI (939) site and the XbaI (1653) buoy under the CMV promoter of the pcDNA3 parent vector of Invitrogen. 1 is a cleavage map of a plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells for cultured melanoma (B16F10) carcinoma. In order to transduce the pcDNA3-TNF-α vector into the cultured Salmonella strains, the Salmonella strains were further incubated for 24 hours in an amount of 100 mL, and then bacteria were cultured at an optical absorbance (OD600) of 0.7 nm and a concentration of 0.7. Centrifugation was performed at a speed of 5500 rpm. After centrifugation, only the bacteria settled on the bottom were collected and diluted with cold distilled water having the same volume as the culture volume. The diluted bacteria were again centrifuged in the same manner as described above, diluted in 2 mL of cold 20% glycerol distilled water, and again, the bacteria obtained through centrifugation were diluted in 100 µl of 20% glycerol. 30 μl (2 μg) of the mixture obtained by the above procedure was placed in a minicentrifuge container, and 3 μl (2) of a pcDNA3 vector, which is a plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells. Μg), then transduction was induced with electricity of 275-325V.

그 결과 얻어진 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 살모넬라를 2006년 9월 26일 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 제KCCM-10782P호를 부여받았다.Salmonella containing the plasmid expressing the resulting tumer necrosis factor alpha (TNF-α) was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center on September 26, 2006 and received Accession No. KCCM-10782P.

<실시예 2: 본 발명 형질도입 살모넬라 균주의 항암효과 확인><Example 2: Confirmation of anticancer effect of the transgenic Salmonella strain of the present invention>

피부 암세포인 B16F10(한국세포주은행)를 PBS 용액 100㎕에 105 세포만큼 포 함되도록 희석한 후, 암발현 모델로 C57/BL6 마우스(SLC,Japan)를 선택하여 상기 희석액 100㎕를 마우스의 등 부위에 피하로 주사하여 암을 이식하였다. 주사한 지 7일 내지 10일 후 상기 암이식 부위에 암세포가 증식하는 것을 눈으로 확인할 수 있었으며, 버니어 캘리퍼스로 증식한 암의 가로, 세로 길이를 측정하여 암의 크기를 확인하였다. 상기 실시예 1에서 제작한 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid) 포함하는 살모넬라 균주(KCCM10782P)를 배양하여 106개의 콜로니를 PBS 용액 100㎕에 희석하였다. 암발생 확인 후 1주일 되는 시점에 상기 PBS 용액을 C57/BL6 마우스의 암이식부위에 피하로 주사하였다. 이후 암세포의 크기변화 및 마우스의 생존률을 측정하여 본 발명 TNF-α 발현 살모넬라 균주의 항암효과를 확인하였다. 이 때, 대조군으로 다른 쥐에는 PBS 용액만을 처리하였으며, 또 다른 쥐에는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)를 형질도입하지 않은 BRD509 살모넬라 균주를 처리하여 상기와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.After diluting B16F10 (Korea Cell Line Bank), a skin cancer cell, to contain 10 5 cells in 100 μl of PBS solution, C57 / BL6 mouse (SLC, Japan) was selected as a model of cancer expression. Cancer was implanted by subcutaneous injection into the site. 7 to 10 days after the injection, the cancer cells were proliferated in the cancer graft site, and the size of the cancer was confirmed by measuring the horizontal and vertical lengths of the cancer grown by the vernier calipers. Salmonella strains (KCCM10782P) containing a plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) prepared in Example 1 were cultured and 10 6 colonies were diluted in 100 µl of PBS solution. One week after confirmation of cancer, the PBS solution was injected subcutaneously into the cancer transplantation site of C57 / BL6 mice. Then, the anticancer effect of the present invention TNF-α-expressing Salmonella strain was confirmed by measuring the size change of cancer cells and the survival rate of mice. At this time, as a control, other mice were treated with PBS solution only, and another mouse was treated with BRD509 Salmonella strain without transfection of plasmid expressing tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in eukaryotic cells. The experiment was performed in the same manner as.

도 2는 진핵세포에서 TNF-α를 발현하는 플라스미드에 의한 암세포살상효과를 나타낸다. 도 2의 시험은 TNF-α를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(pcDN A3-TNF-α)와 TNF-α가 없는 벡터플라스미드(pcDNA3)를 암세포주인 105개의 B16F10세포에 2㎍의 플라스미드를 Magnetofection Reagent(chemicell,USA)를 제조사의 지시에 따라 형질도입(transfection)하였다. 형질도입한 각각의 세포에 대하여 프로메가(Promega,USA)사의 세포사멸시험키트(Cytotox96,Promega)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 각각 세포사멸정도를 측정하였다. Figure 2 shows the effect of cancer cell death by plasmids expressing TNF-α in eukaryotic cells. In the test of FIG. 2, a plasmid expressing TNF-α in eukaryotic cells (pcDN A3-TNF-α) and a vector plasmid without TNF-α (pcDNA3) were injected with 2 μg of plasmid in 10 5 B16F10 cells, which are cancer cell lines. (chemicell, USA) was transfected according to the manufacturer's instructions. For each cell transduced, the degree of apoptosis was measured according to the manufacturer's instructions using a cell death test kit (Cytotox96, Promega) from Promega, USA.

도 3에서는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 살모넬라 균주를 처리한 암모델 쥐에서의 혈액중에서의 사이토 카인 발현양상을 검사하였다. In FIG. 3, cytokine expression in blood was examined in cancer model rats treated with Salmonella strains containing a plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α).

각각의 실험균주를 투여하고 1주후에 각각의 마우스로부터 혈액을 수득하였다. 수득된 혈액은 3500RPM 의 속도로 통상의 원심분리하여 상층액을 수득하여 이에 대해 사이토카인 ELISA Kit(TNF-a ELISA, Bendermedsystem)을 이용하여 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)의 발현양상을 비교해보았다. 그 결과 본 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 살모넬라 균주를 처리한 암모델 쥐에서의 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)의 발현이 대조군으로 사용한 정상 살모넬라와 사이토카인을 분비하지 않는 벡터만 가진 살모넬라(S.typhimurium(pcDNA3))를 투여할때에 거의 유사한 발현정도를 보여 주었고 이는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α) 분비 로 말미암은 폐혈증과 같은 질환 발병위험을 본 발명의 살모넬라가 특별히 유도하지는 않음을 말해준다.Blood was obtained from each mouse 1 week after each experimental strain was administered. The obtained blood was subjected to normal centrifugation at a rate of 3500 RPM to obtain supernatant, and the expression patterns of tumer necrosis factor alpha (TNF-α) were compared using a cytokine ELISA Kit (TNF-a ELISA, Bendermedsystem). saw. As a result, normal Salmonella and cytokines using TNF-α as a control were expressed in Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) in cancer model mice treated with Salmonella strain containing plasmid expressing TNF-α. The administration of Salmonella (S. typhimurium (pcDNA3)) containing only non-secreting vectors showed almost similar expression levels, which resulted in the development of tumer necrosis factor alpha (TNF-α). Salmonella does not specifically induce.

도 4에서는 암발현 모습이 시간에 비례하여 성장을 보여주고 있다. 본 발명의 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid) 포함하는 살모넬라 균주를 처리한 마우스에서는 암발현정도를 버니어캘리퍼스로 암의 가로, 세로 길이를 측정하여 부피로 환산해보면 상대적으로 정상적으로 발병한 마우스와 살모넬라만 주입한 마우스와 벡터만 포함하는 살모넬라를 주입한 마우스보다 현저하게 암이 억제될수 있음을 보여주었다. 또한 도 5에서는 도 4의 실험시에 마우스 의 생존률을 표로 나타내었는데 본 발명균주가 50%정도의 생존률을 보여줌을 확인하였다. 이로 발명의 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 살모넬라 균주가 기존의 살모넬라에 비하여 훨씬 더 뛰어난 항암효과를 보임을 알 수 있었다.In FIG. 4, the dark expression shows growth in proportion to time. In mice treated with Salmonella strains containing plasmids expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) of the present invention, the degree of cancer expression was measured using a vernier caliper, It was shown that cancer can be suppressed more significantly than mice with normal onset, mice injected with Salmonella only and mice injected with Salmonella containing vectors only. In addition, in Figure 5, the survival rate of the mouse shown in the table in the experiment of Figure 4 was confirmed that the strain of the present invention showed a survival rate of about 50%. As a result, the Salmonella strain including the plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) of the invention showed a much better anticancer effect than the conventional Salmonella.

이상 상기 실시예를 통하여 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명이 제공하는 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)를 포함하는 살모넬라 균주는 병원성이 없는 약독화된 살모넬라 균주내에 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 발현하는 플라스미드(plasmid)를 형질도입함으로써 기존의 살모넬라보다 훨씬 더 우수한 항암효과를 나타내고, 특히 튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)의 독성문제로 항암제로 사용하기 어려운 암종, 특히 피부암 및 대장암에 있어서 안전하게 치료효과를 유발할수있는 가능성을 제공하므로 항암 치료 및 보조 예방제제와 관련한 의약산업에 있어서 매우 유용한 발명이다.As can be clearly seen from the above examples, Salmonella strains comprising a plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) provided in the eukaryotic cells provided by the present invention is attenuated without pathogenicity Transduction of the plasmid expressing the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) in the Salmonella strain shows a much better anticancer effect than the conventional Salmonella, in particular the toxicity of the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) It is a very useful invention in the pharmaceutical industry related to anticancer treatment and adjuvant preparations because it provides the possibility of safely inducing a therapeutic effect in carcinomas, particularly skin cancer and colon cancer, which are difficult to use as anticancer agents.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> A bacterium salmonella harboring plasmid expressing TNF-alpha in eukaryotic cell and an antitumoral composition thereof <130> PN060203 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFalpha <400> 1 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gln Lys Met Gly Gly Phe Gln Asn Ser Arg Arg Cys Leu Cys 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu Asn Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Pro Asn Gly Leu Pro Leu Ile Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Thr Leu 65 70 75 80 Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val 85 90 95 Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala 100 105 110 Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val 115 120 125 Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys 130 135 140 Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg 145 150 155 160 Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys 165 170 175 Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp 180 185 190 Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp 195 200 205 Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu 210 215 220 Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu 225 230 235 <110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> A bacterium salmonella harboring plasmid expressing TNF-alpha in          eukaryotic cell and an antitumoral composition <130> PN060203 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFalpha <400> 1 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala   1 5 10 15 Leu Pro Gln Lys Met Gly Gly Phe Gln Asn Ser Arg Arg Cys Leu Cys              20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe          35 40 45 Cys Leu Leu Asn Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Asp Glu Lys Phe      50 55 60 Pro Asn Gly Leu Pro Leu Ile Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Thr Leu  65 70 75 80 Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val                  85 90 95 Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala             100 105 110 Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val         115 120 125 Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys     130 135 140 Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg 145 150 155 160 Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys                 165 170 175 Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp             180 185 190 Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp         195 200 205 Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu     210 215 220 Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu 225 230 235  

Claims (5)

튜머 네크로시스 팩터 알파 (TNF-α)를 살모넬라 균주외의 진핵세포에서 발현하는 플라스미드(plasmid)로 형질도입됨을 특징으로 하는 살모넬라 균주(Salmonella typhimurium).Salmonella typhimurium, characterized in that the tumer necrosis factor alpha (TNF-α) is transduced with a plasmid expressing in eukaryotic cells other than Salmonella strains. 제 1항에 있어서, 상기 플라스미드는 도 1에 도시된 pcDNA3-TNF-α 인 것을 특징으로 하는 살모넬라 균주.The Salmonella strain according to claim 1, wherein the plasmid is pcDNA3-TNF-α shown in FIG. 제 1항에 있어서, 한국미생물보존센터에 기탁된 수탁번호 KCCM10782P 인 것을 특징으로 하는 살모넬라 균주.The Salmonella strain according to claim 1, which is an accession number KCCM10782P deposited at the Korea Microorganism Conservation Center. 제 1항의 살모넬라 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물.The anticancer composition comprising the Salmonella strain of claim 1. 제 4항에 있어서, 상기 암의 종류는 피부암을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. The anticancer composition according to claim 4, wherein the type of cancer is skin cancer.
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