KR20080068069A

KR20080068069A - 보툴리눔 신경독소 ａ형 단백질 수용체 및 그의 이용

Info

Publication number: KR20080068069A
Application number: KR1020087011531A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 럼멜; 토마스 빈츠
Original assignee: 토소겐 게엠베하
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-30
Publication date: 2008-07-22
Also published as: CA2627457C; ZA200803403B; WO2007048638A3; US8476024B2; JP2009513118A; NZ567312A; EP1940874A2; DE102005051789B4; DE102005051789A1; WO2007048638A2; EP1940874B1; CA2627457A1; ES2379513T3; US20090252722A1; AU2006308122B2; AU2006308122A1; ATE539088T1

Abstract

본 발명은 호모 사피언스(homo sapiens)의 시냅스 소포 당단백질의 아미노산 서열과 최소한 70%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 보툴리눔 신경독소 A형의 H_C-단편과 결합하여, 결합하는 폴리펩티드는 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C가 아니도록 한다. 또한 본 발명은 BoNT/A 과 상호작용하는 SV2C 단백질의 펩티드 영역(peptide section)에 관한 것이다.

Description

보툴리눔 신경독소 Ａ형 단백질 수용체 및 그의 이용{Botulinum Neurotoxin A Protein Receptor and Uses Thereof}

본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 형성된 보툴리눔 신경독소 A형(BoNT/A)과 결합하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 호모 사피언스(homo sapiens) 의 시냅스 소포 당단백질의 아미노산 서열과 최소한 70%가 동일한 아미노산 서열로 구성된 것이어서, 상기 폴리펩티드가 BoNT/A의 H_C-단편과 결합하여, 결합하는 폴리펩티드는 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C가 아니도록 하는 것이다. 본 발명은 또한 BoNT/A와 상호작용하는 SV2C 단백질의 펩티드 영역(peptide section)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BoNT/A의 신경독성을 줄이기 위한 길항제로서, 다양한 메트릭스들(matrices)내에서 BoNT/A를 검출하는 것 및 BoNT/A가 신경세포에 결합하는 것을 감소시키는 물질을 식별하기 위한 수단(expedient)로서의 상기 폴리펩티드 및 그의 펩티드 영역의 이용에 관한 것이다.

신경세포는 엑소시토시스(exocytosis)에 의해 신경전달물질을 방출한다. 세포내 소포의 막이 원형질막과 융합하는 것을 엑소시토시스라 한다. 이 과정을 통해 동시에 소포내의 물질이 시냅스 갭으로 방출되게 된다. 소포의 막과 원형질막의 융 합은 단백질 시냅토타그민(synaptotagmin)과 반응하여 칼슘에 의해 조절된다. 다른 보조인자와 함께 시냅토타그민은 세 개의 소위 융합 단백질인 SNAP-25, 시냅토브레빈2(synaptobrevin 2) 및 신탁신 1A(syntaxin 1A)의 상태를 조절한다. 신탁신 1A 및 시냅토브레빈 2가 원형질막 및/또는 소포 막으로 융합되는(integrated) 반면, SNAP-25는 단지 원형질막에 가볍게 결합한다. 세포내 칼슘 농도가 증가하는 범위에서, 상기 세 개의 단백질은 서로 결합되어 있는데, 두 개의 막이 점점 서로에게 접근하여 함께 융합하게 된다. 콜린성 뉴런의 경우, 아세틸콜린이 분비되어 근육수축, 호흡 및 콜린성에 의해 자극받는 다른 반응들을 일으킨다.

상기에서 언급한 융합 단백질들은 클로스트리디움 보툴리눔(C. botulinum), 클로스트리디움 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리디움 바라티(C. baratii) 및 클로스트리디움 테타니(C. tetani)에 의해 형성되는 클로스트리디움 신경독소들의 가벼운 사슬(LC)의 표적분자(기질)들이다.

혐기성이자, 그람양성균인 클로스트리디움 보툴리눔은 클로스트리디움 신경독소의 7개의 다른 혈청형(serotype)을 만들어낸다. 클로스트리디움 신경독소는 보툴리눔 신경독소(BoNT/A 내지 BoNT/G)로 일컬어진다. 이들 중, 특히 BoNT/A 및 BoNT/B는 인간 및 동물에서 보툴리즘(botulism)이라는 신경마비 장애를 야기한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견될 수 있으나 미숙하게 멸균될 수 있고, 보툴리즘을 유발하는 많은 경우인 밀봉된 가정용 음식 통조림에서 발견될 수 있다.

BoNT/A는 알려진 생물 물질 중에서 가장 독성이 크다. 정화된 BoNT/A의 5∼6 pg만으로도 최소치사량(MLD, Minimal Lethal Dose)이 될 정도이다. MLD로서 정의되는 BoNT/A의 한 개의 유닛(one unit)만으로도 복강내 주사 후, 18∼20 g의 몸무게를 갖는 스위스 웹스터 암컷 쥐들 중 절반을 죽일 수 있다. 7개의 면역학적으로 다른 BoNT들은 각각 특징이 있다. 그들은 BoNT/A, B, C1, D, E, F 및 G라고 표시되고, 혈청형-특이적인 항체와의 중화반응(neutralization)에 의해 구별된다. BoNT들의 여러 혈청형들이 야기하는 마비증상(paralysis)의 심한 정도 및 기간에 관해서는 감염된 동물 종에 따라 다르다. 따라서, 마비증상에 관해, BoNT/A는 BoNT/B보다 쥐(rat)에서 500배 이상 강하다. 뿐만 아니라, BoNT/B는 체중 당 480 U/kg을 복용해도 영장류에게는 해롭지 않은 것으로 나타났다. BoNT/A의 같은 양이라면 영장류 치사량의 12배에 해당하는 양이다. 한편, BoNT/A를 쥐(mice)에 주입 후 나타나는 마비 증상의 기간은 BoNT/E를 주입한 경우보다 10배 이상 길다.

BoNT들은 병리학적으로 과잉활동적인 말초 신경에 의해 야기된 골격근에서의 과다활동(hyperactivity)으로 특징되는 신경근 장애를 치료하는데 이용된다. BoNT/A는 미국 식품의약청(FDA)으로부터 안검경련, 사시, 다한증, 주름 및 안면 경련(hemi-facial spasms) 등의 치료에 사용승인을 받았다.

BoNT/A와 비교하여, 나머지 BoNT 혈청형들은 약한 효능을 보이고, 효능을 나타내는 기간도 더 짧은 것으로 나타났다. BoNT/A를 말초-근육내에 투여한 경우 임상 효과는 보통 일주일 안에 현저하게 나타난다. BoNT/A의 한번의 근육내 주사에 의한 증상 억제 기간은 3개월에서 6개월 정도 이다.

클로스트리디움 신경독소는 융합 기관(fusion apparatus)의 다른 단백질들을 특이적으로 가수분해한다. 테타누스 신경독소(tetanus neurotoxin (TeNT)) 뿐만 아니라 BoNT/B, D, F 및 G는 소포-관련 막 단백질(VAMP) 2-또한 시냅토브레빈 2라고도 불리우는-를 공격하는 한편, BoNT/A, C1 및 E는 SNAP-25를 파괴한다. 더 나아가, BoNT/C1은 신탁신 1A(syntaxin 1A)를 파괴한다.

클로스트리디움 박테리아는 각각 1251개 내지 1315개의 아미노산을 갖는 단일-사슬 폴리펩티드인 신경독소를 분비한다. 그 후 내재성 단백질가수분해효소가 정해진 위치에서 이들 단백질 각각을 2개의 사슬로 절단하지만(닉킹('nicking')), 두 사슬은 이황화-다리(disulfide-bridge)에 의해 여전히 연결되어 있다. 이들 이중-사슬(dual-chain) 단백질은 홀로톡신(holotoxin)이라고 불리운다(Shone 외 다수(1985), Eur. J. Biochem.151,75-82). 상기 두 개의 사슬은 다른 기능을 갖는다. 가벼운 사슬(light chain = LC)인 더 작은 단편은 Zn²⁺-의존적인 내부 단백질분해효소(endoprotease)를 나타내고, 더 큰 유닛(heavy chain = HC)은 가벼운 사슬의 운반수단을 나타낸다. HC를 펩티드내부가수분해효소( endopeptidase)로 처리함으로써, 두 개의 50 kDa 단편이 만들어졌다( Gimenez 외 다수(1993), J. Protein Chem.12, 351-363 참조). 아미노-말단 절반(H_N-fragment)은 낮은 pH 값에서 막과 통합하고, LC를 신경세포의 세포기질 속으로 전좌시킨다. 카르복실-말단 절반(H_c-fragment)은 신경세포 막에만 배타적으로 존재하는 복합체 폴리시알로갱글리오시드(complex polysialogangliosides)에 결합하고, 단지 부분적으로만 만난다고 알려진 단백질 수용체에 결합한다. 후자는 클로스트리디움 신경독소의 높은 신경 선택 성을 설명하는 것이다. 결정질(crystalline) 구조는 BoNT/A가 세 개의 도메인을 처리하고, 이는 세 단계의 행동 메커니즘에 의해 조화를 이룸을 확인해준다(Lacy 외 다수 (1998), Nat. Struct. Biol. 5,898-902 참조). 게다가, 이러한 데이터는 Hc-단편 내에 두 개의 자율적인 서브유니트(서브-도메인)가 각각 25 kDa로 존재한다는 결론을 초래한다. 두 개의 기능적인 서브-도메인이 존재한다는 첫 번째 증거는 TeNT의 Hc-단편의 아미노-말단 절반(H_CN) 및 카르복실-말단 절반(H_CC)에 의한 것이고, 이들이 재조합형으로 발현되어 있다는데 있고, 이는 H_CN도메인이 아닌 H_CC-가 뉴런에 결합한다는 것을 알려주는 것이다(Herreros 외 다수 (2000), Biochem. J. 347, 199-204 참조). 다음 단계에서, BoNT/A 및 B의 H_CC-도메인 내에 있는 하나의 단일 갱글리오시드 결합 부위가 로칼라이즈되고 특징된다(Rummel 외 다수 (2004), Mol. Microbiol. 51,631-643 참조). 시냅토타그민 I 및 II에 결합하는 부위는 BoNT/B 및 G에 대한 단백질 수용체로서 확인되었고, 마찬가지로 BoNT/B 및 G의 H_CC-도메인 부분으로 제한될 수 있다(Rummel 외 다수(2004),J Biol Chem 279, 30865-70 참조). PC12 세포내 또는 실험실 내(in vitro)의 어떤 단백질 결합에 관한 연구도 현재의 시냅토타그민 단백질 그룹의 13개 멤버와의 상호작용을 보여주는 것은 없다.

따라서, BoNT/A의 신경독성에 영향을 미치는 수단 및 방법(process)을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

상기 목적은 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 최소한 70%가 동일한 아미노산 서열으로 구성된 폴리펩티드를 제공함으로써, 그리고 상기 폴리펩티드가 보툴리눔 신경독소 A형의 Hc-단편에 결합한다는 사실로부터 상기 폴리펩티드가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C가 아니라는 것을 제공함에 의해서 달성된다. 나아가, 본 발명은 BoNT/A의 신경독성을 줄이기 위한 길항제로서, BoNT/A가 신경세포에 결합하는 것을 감소시키는 물질을 밝히기 위한 수단으로서, 또한 다양한 메트릭스에 있는 BoNT/A를 검출하기 위한 수단으로서 상기 폴리펩티드 및 그의 루멘 도메인(luminal domain)을 이용하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 BoNT/A에 대한 수용체로서 시냅스 소포 단백질 2C(SV2C)를 제시하는 것이다.

본 발명자는 연구에서 시냅토피신, 시냅토포린, 시냅토지린 I & III, 시냅스 소포 당단백질 2A(SV2A) 또는 시냅스 소포 당단백질 2B(SV2B) 중 어느 것도 BoNT/A에 대한 단백질 수용체로서 작용한다는 것을 보여줄 수 없었다. 하지만, BoNT/A가 SV2C에 결합한다는 것은 보여줄 수 있었다.

리간드-수용체 연구에서, 시냅토피신, 시냅토포린, 시냅토지린 I & III, SV2A, SV2B 및 SV2C의 루멘 도메인들은 서브-클론되었고, 대장균(E. coli) 재조합형으로 발현되었으며, 글루타티온-에스-트렌스퍼라제-(GST)-융합 단백질(glutathione-S-transferase-(GST)-fusion protein)로서 분리되었다. 7개의 BoNT 및 TeNT의 Hc-단편들은 모두 ³⁵S-메티오닌으로 실험실내(in vitro)에서 번역되었을 뿐만 아니라, 대장균 재조합형에서 발현되었다. Hc-단편의 상기 열거한 GST-융합 단백질 루멘 도메인에 대한 친화력이 글루타티온-에스-트랜스퍼라제-(GST)-풀-다운 실험에서 측정되었다. GST-SV2C 유도체의 존재 하에서, 클로스트리디움 신경독소의 생리적 표적을 나타내는 쥐의 분리된 신경-근육-제조물(편측 횡경막 분석법(Hemi-Diaphragma-Assay)=HDA)에서 BoNT/A 및 BoNT/B의 신경독성의 억제가 분석되었다.

특히, SV2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)은 BoNT/A와의 상호작용을 하는 단편을 나타낸다. 루멘 도메인의 분리된 125머 펩티드는 갱글리오시드 없이 BoNT/A의 Hc-단편과 상호작용할 수 있다. SV2C 펩티드와 BoNT/A간의 상호작용의 결과로서 그의 수용체 결합 부위는 채워지고, 막 속에 위치한 SV2C와의 상호작용이 차단되는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 SV2C의 루멘 도메인을 구성하는 125머 펩티드를 포함하고, 또는 SV2C의 루멘 도메인과 최소 80%가 동일한 또는 후-번역시에 변형된 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 포함한다. 이러한 제제(agent)는 BoNT/A의 Hc-단편에 특이적 결합을 하기 위해 사용될 수 있다. 그 결과, BoNT/A의 수용체 결합 부위가 채워지게 되어 원형질막에 존재하는 SV2C와의 생리적 상호작용이 억제될 수 있다. 따라서, BoNT/A에 급성 중독되는 것을 방지할 수 있다. 게다가, 이들 제제들은 마찬가지로 BoNT/A의 Hc-단편에 있는 수용체 결합 부위 속에 자리를 잡아서, 길항제로서 작용할 수 있는 다른 분자들을 서치(search)하는데 있어서, 경쟁적인 결합 연구에 이용될 수 있다. 형광단 등으로 제제를 표시하거나 특이적 확인 서열에 의한다거나 또는 제제를 BoNT/A에 결합시킨 후에 고상에서 고정화(immobilization)에 의해서, 직접 또는 특이적으로 검출될 수 있다. 따라서, 다양한 환경 및 메트릭스에서 특이적 방법을 이용하여 BoNT/A를 검출할 수 있다.

SV2C는 신경세포 및 신경내분비 세포에 있는 당단백질이다(synoptic article by: Janz, R. and Sudhof T.C., Neuroscience 94 (1999), 1279-1290 참조). 이는 86 kDa의 분자량을 갖는 727개의 아미노산으로 구성되어 있고, 시냅스 소포의 막에 있는 12개의 막횡단 도메인(trans-membrane domains)에 자리하고 있다. 약 160개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노 말단과 11개의 아미노산의 길이를 갖는 카르복실 말단은 세포기질에 위치하고, 90개의 아미노산의 길이를 갖는 막횡단 도메인 6 및 7 사이의 구역(section)도 세포기질에 위치한다. 소포내의 경우, 막횡단 도메인 7 및 8 사이에 125개의 아미노산(아미노산 454-579)의 길이를 가지는 구역만이 위치하고 있는데, 3개의 추정 N-글리코실화 부위 및 2개의 추정 이황화 다리를 포함하는 소포내(intravesicular) 또는 루멘 도메인(LD)이다. 시냅스 소포에서 이온 또는 당 운반체로서 SV2C의 역할은 확인된 바는 없지만, 3개의 SV2 동종체(isoform)의 시냅토타그민의 동종체들과의 상호작용-아미노 말단의 인산화 기능으로서-은 SV2를 통해 Ca²⁺와 결합하는 유리 시냅토타그민의 양 및 이어지는 엑소시토시스의 시작이 영향을 받는다는 것을 알려주는 하나의 지표(indicator)이다.

시냅스 소포의 막이 프리-시냅스 원형질막(pre-synaptic plasma membrane)과 엑소시토시스에 의해 융합되며, 이는 시냅스 소포 단백질이 잠시 동안 프리-시냅스 막에 존재하도록 한다. 그 결과, 시냅스 소포 단백질의 소포내 도메인이 세포외 방식(extracellular manner)으로 드러나게 된다. BoNT/A의 Hc-단편이 신경세포의 표면에 무수히 존재하는 복합 폴리시알로갱글리오시드와 결합하는 것은 신경독소를 수용하기에 그자체로 충분하지 않다. 하지만, 신경세포의 표면에 BoNT/A 분자를 축적함에 의해, 이들 분자는 막의 측면으로 확산될 수 있어서, 좀처럼 드러나지 않는 단백질 수용체와의 생산적인 접촉(encounter) 가능성을 높일 수 있다. SV2C의 경우, 125개의 아미노산을 갖는 루멘 도메인이 소포 융합 후에 세포외로 드러나게 되어서, BoNT/A에 대한 단백질 수용체로서 쓰이게 되는 것이다. 갱글리오시드 결합 때문에, 신경독소가 막 위에 아주 근접하여 존재하기 때문에, BoNT/B/G-시냅토타그민 상호작용과 유사하게, 루멘 도메인의 약 30개의 첫 번째 및 마지막 아미노산들이 바람직하게 수용체로서 제공된다. 엔도솜에서 수용체 신경독소 복합체를 수용한 후에, 복합체는 산성화되고, 전위 도메인(translocation domain)이 엔도솜 막으로 삽입되어, 부분적으로 풀어진 LC를 세포기질 안으로 전위시키고, 거기서 마지막 단계로 그의 특이적인 기질을 쪼갠다. 융합 단백질의 복합체 형성 및 해리 사이클은 방해되고, 그에 의해 아세틸콜린의 방출을 방해하게 된다. 그 결과, 가로무늬근이 마비되고 땀샘은 분비를 멈춘다. 각각의 BoNT 혈청형들의 활성기간은 세포기질에 있는 손상되지 않은 LC의 존재 여부에 따라 다양하다.

콜린성 전달이 막히는 것은 말초의 HC가 상기 뉴런에 침투한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 중심 시냅스는 단백질이 침투할 수 없는 혈-뇌-관문(blood-brain-barrier)에 의해 보호된다.

하기에서, 본 발명의 적용의 측면에서 이해되어야 할 용어들이 정의된다.

천연 보툴리눔 신경독소 A형과 동일한 아미노산 서열을 가지는 대장균인, 인터 알리아(inter alia)로부터 재조합 형태로 제조된 보툴리눔 신경독소 A 형(BoNT/A)은 천연 보툴리눔 신경독소 A형과 약리적으로 동일한 방식으로 작용하고, 재조합 보툴리눔 신경독소 와일드 타입으로 불리운다. 재조합형으로 제조된 BoNT/A의 Hc-단편은 천연 Hc-단편과 대응되는 동일한 아미노산 서열을 갖고, 천연 BoNT/A와 동일한 결합 특성을 갖는다. 상기에서 언급된 신경세포는 콜린성 운동 뉴런이다. 바람직하게, 수송 단백질은 원형질 막, 막횡단 단백질, 시냅스 소포 단백질, SV2 그룹 단백질, 바람직하게 SV2C이고 더욱 바람직하게는 SV2C의 루멘 도메인과 연관된 분자에 특이적으로 결합한다. 결합은 바람직하게 실험실 내(in vitro)에서 측정된다. 더욱 바람직하게는 측정은 GST-풀-다운(GST-pull-down) 실험을 이용하여 행해지고 이는 하기 실시예에서 상세하게 설명된다.

SV2C 서열은 데이터베이스로부터 어느 종이든 제공될 수 있다. 호모 사피언스로부터 얻은 SV2C에 대한 서열 ID는 인터 알리아 유전자 등록번호 (inter alia GenBank) NP055794이다. 래투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus)로부터 얻은 SV2C는 인터 알리아 유전자 등록번호 NP113781이고, 무스 무스쿨루스(Mus musculus)로부터 얻은 SV2C는 인터 알리아 유전자 등록번호 XP127490이다.

본 발명에서, "폴리펩티드(polypeptide)"라는 용어는 최소한 두 개의 모노머 유닛으로 구성된 아미노산 폴리머를 나타낸다. 이러한 맥락에서 모노머는 자연적으로 존재하는 아미노산일 수도 있고 아닐 수도 있다. 바람직하게, 폴리펩티드는 최소한 10개의 아미노산 모노머를 갖는다. 개별 아미노산들은 변형될 수 있다. 변형은 자연적으로 일어나는 것(예를 들면, 후-번역( post-translational))일 수 있고, 또한 글리코실화, 디- 및 올리고머화(di- and oligomerization), 및 시스-잔기의 변형 등에 의해 합성된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 "% 아이덴터디(% identity)"는 단백질 레벨에서의 % 아이덴터티를 의미하는데, 특히 공지의 과정(procedures), 예를 들면, 컴퓨터를 이용한 서열 비교 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(BLAST) 같은 것에 의해 확립된 것을 말한다(S.F. Altschul 외 다수, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410). 바람직하게 초기에 아이덴터티를 측정하는 방법은 연구된 서열과 가능한 가장 큰 일치성을 보인다. 서열 페어(pairs)가 상호 비교될 경우엔, 프로그램 GAP (Devereux, J. 외 다수, Nucleic Acids Res. 12812)=: 387 (1987) 및 BestFit을 이용하는 것이 또한 가능하다. 일반적인 스탠더드 파라미터가 이용될 수 있지만, 특히 바람직한 것은 아래와 같다:

알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 4:443-453(1970)

비교 메트릭스: BLOSUM 62 from Henikoff and Henikoff, PNAS USA 89(1992), 10915-10919

갭 패널티(Gap Penalty): 12

갭 길이 패널티(Gap Length Penalty): 4

"항체(antibody)"라는 용어는 고전적인 항체뿐만 아니라, 단일사슬 항체 및 항체 단편을 포함한다. 본 발명에서 바람직한 단편은 F(ab)2 및 F(ab)이다.

"조성물(composition)"이란 용어는 융합 단백질을 포함한다. 조성물에 포함 된 폴리펩티드는 컨쥬게이트 형태로 존재할 수 있다. 이러한 맥락에서, 색소(dye), 철 분자, 플레그(Flag) 또는 HA-Tag와 같은 항원결정기, 가교제(cross-linker), 친화력 펩티드 또는 방사성 동위원소 등을 포함한 컨쥬게이트들이 바람직하다.

바람직한 구체예에 따르면, 폴리펩티드의 아미노산 서열의 최소한 80%가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 동일하다. 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 최소한 90% 동일한 아미노산 서열이 특히 바람직하다. 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 최소한 95%가 동일한 아미노산 서열이 특히 바람직하다.

더욱 바람직한 구체예에 따르면, 추가, 치환, 결실, 삽입 및/또는 역위 등에 의해 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 달라진 폴리펩티드의 아미노산 서열이 최소 1개의 아미노산이거나, 바람직하게, 5개 이하의 아미노산이거나, 특히 1개 이하의 아미노산인 것이 바람직하다. 본 발명에서 추가, 치환, 결실, 삽입 또는 역위는 공지된 방법으로 수행되는 것을 말한다.

더욱 바람직한 구체예에 따르면, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 최소한 70%가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일하다. 바람직하게, 아미노산 서열의 최소한 80%가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열이다. 더욱 바람직하게는, 아미노산 서열의 최소한 90%가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열이다. 아미노산 서열의 최소한 95%가 호 모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열이 더욱 바람직하다. 특히, 상기 폴리펩티드는 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 분리된 폴리펩티드이고, 보툴리눔 신경독소 A형의 Hc-단편과 결합하는 분리된 폴리펩티드이다.

본 발명은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 적절한 숙주세포 안에서 적당한 프로모터의 조절 하에 복제 및 선택적 발현을 위한 핵산을 포함하는 것이 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면으로서, 적절한 숙주세포 안에서 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합 발현 및 공지된 방법으로 상기 제조된 폴리펩티드를 분리하는 것으로 이루어지는 폴리펩티드의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에서 코딩하는 핵산은 RNA, DNA 또는 그의 혼합물이 될 수 있다. 핵산은 그의 핵산가수분해효소(nuclease) 저항성이란 관점에서, 좀 더 변형될 수 있는데, 예를 들면, 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate-bond)의 삽입과 같은 것이다. 핵산은 모핵산(parent nucleic acid)으로부터 준비되고 그러한 모핵산은 게놈 또는 cDNA-데이터베이스로부터 클로닝하여 얻을 수 있다. 나아가, 상기 핵산은 고상 합성(solid phase synthesis)에 의해 직접 제조될 수도 있다. 적절한 방법은 해당기술의 당업자에게 알려져 있다. 모핵산으로부터 제공되어도, 선택적 변형, 예를 들면, 로컬리티-특이적인(locality-specific) 돌연변이유발이 야기되어 아미노산 레벨에서 최소한 하나의 추가, 삽입, 결실, 및/또는 치환이 일어날 수 있다. 그런 다음 핵산이 적절한 프로모터에 연결된다. 공지의 발현시스템에 있어서 발현에 적절한 프로모터는 해당기술의 당업자에 알려져 있다. 이 경우 프로모터의 선택은 발현에 이용되는 발현시스템에 따라 다르다. 일반적으로, 구성성 프로모터(constitutive promoters)들이 선호되지만, 유도성 프로모터도 또한 이용될 수 있다. 이러한 방법으로 제조된 구조물(construct)은 특정 조절요소(regulatory element) 안에 벡터의 적어도 하나의 부분을 포함하며, 상기 벡터는 γ-유도체(γ-derivate), 아데노바이러스, 바큐로바이러스, 우두바이러스, SV40-바이러스(SV40-viruse) 및 레트로바이러스 등으로부터 선택된다. 바람직하게 상기 벡터는 주어진 숙주세포 안에서 핵산을 발현할 수 있다.

본 발명은 나아가 벡터 및 벡터의 발현에 적절한 숙주세포를 제공한다. 수많은 원핵 및 진핵 발현시스템이 당업계에 알려져 있고, 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 B. subtilis와 같은 원핵세포로부터 선택되거나, S. cerevisiae나 P. pastoris와 같은 진핵세포로부터 선택되며, 심지어 고도의 진핵세포인 곤충 세포나 포유류 세포로부터 선택되기도 한다.

펩티드나 폴리펩티드는 또한 합성이나 단편 농축에 의해 직접 얻을 수 있다. 적절한 방법은 해당 기술의 당업자에 알려져 있다.

그 다음 펩티드나 폴리펩티드는 정화되며 그 방법은 크로마토그래피 방법이나 전기영동과 같이 해당 기술의 당업자에게 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 최소한 하나의 폴리펩티드를 갖는 조성물이 제공된다. 조성물은 또한 컨쥬게이트(conjugate)나 혼합물로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 염료분자나 부형제와 함께 컨쥬게이트될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 아미노산 서열의 최소한 70%가 호모 사피언스의 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열에 결합하는 항체나 그의 항체단편이 제공된다. 상기 항체는 단일클론이거나 다클론일 수 있다. 단일클론 항체는 쥐와 같은 실험동물을 면역시킨 후 하이브리도마를 분리 및 스크리닝하는 것과 같이 해당 기술의 당업자에 알려진 방법을 통해 제조될 수 있다.

바람직하게, 상기 항체는 시냅스 소포 당단백질 2C가 보툴리눔 신경독소에 결합하는 것을 방해할 수 있다. 이는 방사면역분석법(radio-immuno-assays) 또는 ELISAs와 같이 알려진 경쟁적인 분석법에 의해 검출될 수 있다.

본 발명은 나아가, 본 발명에 따른 최소 한 개의 폴리펩티드 및/또는 본 발명에 따른 최소 한 개의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 피하내, 근육내,국소내 투여에 적합하다.

약학적 조성물은 BoNT/A를 치료 목적의 처방이나 미용 목적의 사용 시 과다투여에 의하거나 중독에 의한 보툴리즘을 치료하거나 예방적 목적을 위한 것이다.

본 발명은 더 나아가, 포유류에서 BoNT/A의 신경독성을 감소시키는 방법(process)이 제공되는데, 제제(agent)를 포유류에 투여하고, 상기 제제가 BoNT/A가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)과 최소한 70% 동일한 아미노산 서열에 결합하는 것을 최소한 10%까지, 바람직하게는 최소한 50%까지, 특히 최소한 80%까지 감소시키는 것을 포함하는 방법이다.

본 발명에서 상기 제제는 하기에 기술된 스크리닝 방법에 의해 측정될 수 있다.

바람직하게, 아미노산 서열의 최소한 70%가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C(SV2C)의 루멘 도메인(아미노산 454-579)과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 포유류에 투여되는데, 이것이 BoNT/A가 SV2C에 결합하는 것을 감소시켜준다.

더 나아가, 바람직하게 아미노산 서열의 최소한 70%가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C(SV2C)의 루멘 도메인(아미노산 454-579)과 동일한 아미노산 서열에 BoNT/A가 결합하는 것을 감소시키는 항체를 포유류에 투여한다.

더 나아가, 바람직하게 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C(SV2C)의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 발현을 감소시키는 제제를 포유류에 투여한다. 상기 제제는 본 발명에서 안티센스 분자(antisense-molecule)일 수 있다. 안티센스 분자의 제조는 해당 기술의 당업자에게 잘 알려져 있다.

상기 방법은 치료 목적의 처방 또는 미용 목적의 사용 시 과다투여에 의하거나 중독에 의한 보툴리즘에서 또는 예방적 목적에서 BoNT/A의 신경독성을 줄이기 위해 이용될 수 있다.

바람직하게, 상기 포유류는 호모 사피언스이다.

본 발명에 따르면, 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메 인(아미노산 454-579)에 BoNT/A가 결합하는 것을 감소시키는 제제임을 식별하는 방법(process)이 제공되는데 하기의 단계를 포함한다:

(a) BoNT/A 및 GST-SV2C (454-579)가 포함된 용액에 제제를 접촉시키고;

(b) GST-SV2C(454-579)와 결합된 양을 측정하고; 그리고

(c) GST-SV2C(454-579)에 결합된 BoNT/A의 양을 감소시키는 제제를 추출하기.

본 발명에서 스크리닝은 화학적 라이브러리에 의해 수행될 수 있다. 게다가, DNA 및/또는 RNA 분자로 이루어진 데이터베이스도 또한 고려될 수 있다.

바람직하게, 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)은 세포의 원형질막 내에 위치하고 있다. 본 발명에서 적절한 세포는 PC12와 같은 신경내분비 세포, 2A와 같은 신경아세포종 세포 및 NT2와 같은 배아 뇌조직으로부터 얻은 하이브리도마 세포 등이다.

나아가, 상기 제제의 존재 하에서 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C와 BoNT/A의 줄어든 결합은 쥐 편측 횡경막 테스트(Mouse Hemidiaphragm Test)에서 BoNT/A의 신경독성이 감소된 것에 의해 바람직하게 검출된다.

본 발명에 따르면, 상기에서 기술된 방법에 의해 제조될 수 있는 제제가 제공된다.

본 발명에 따르면, 원하는 시료 내에서 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 BoNT/A를 검출하기 위한 방법이 제공되는데 하기의 단계를 포함한다:

(a) 폴리펩티드가 아미노산 서열의 최소한 70%가 호모 사피언스의 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이고 BoNT/A가 SV2C에 결합하는 것을 감소시키는, 폴리펩티드를 고상에서 고정시키는(immobilizing) 단계;

(b) BoNT/A가 폴리펩티드에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 상기 고정된 폴리펩티드를 시료에 접촉시키는 단계;

(c) 상기 BoNT/A 폴리펩티드 복합체를 용출시키는 단계; 및

(d) 상기 복합체 또는 그의 구성요소를 검출하는 단계.

예를 들면, 고정화는 세파로즈(Sepharose)와 같은 크로마토그래피에 쓰이는 것으로 알려진 물질에 폴리펩티드를 BrCn-커플링(BrCn-coupling)시킴에 의해 수행될 수 있다. BoNT/A와 폴리펩티드의 결합이 일어나는 조건은 일반적인 테스트에 의해 측정될 수 있다. 상기 조건은 결합 파트너의 어느 것도 변성시키지 않도록 선택된다. 예를 들면, 용출(eluting)이 pH- 및/또는 염 조건의 경쟁 또는 변형에 의해 일어날 수 있다. 예를 들면, 상기 복합체 및 그의 구성요소는 SDS-PAGE에 의해 분리될 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1 : BoNT/A의 H_C-단편이 SV2C와 상호작용한다. (A) 시냅스 소포 당단백질의 개략적인 설명이다. (B, C) GT-세파로즈 미세 비드(micro-bead)에 고정된 GST-융합 단백질은 갱글리오시드의 존재 하에 재조합(B) 또는 ³⁵S-표지된(C) BoNT H_C-단편과 함께 배양된다. 고상(solid phase)에서 결합된 Hc-단편은 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색법(Coomassie blue staining) 또는 자기방사선법(autoradiography)에 의해 검출된다.

도 2 : BoNT/A H_C-단편은 SV2C의 막횡단 도메인 8에 접해 있는 소포내 영역에 결합한다. GT-세파로즈 미세 비드(micro-bead)에 고정된 GST-융합 단백질은 갱글리오시드의 존재 하에 재조합 BoNT H_C-단편과 함께 배양된다. 고상(solid phase)에 결합된 Hc-단편은 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색법(Coomassie blue staining) 또는 면역-화학적 방법(immuno-chemical method)에 의해 검출된다.

물질 및 방법(Material and Methods)

플라스미드 구축(plasmid construction) 및 재조합 단백질의 제조

BoNT/A 및 B의 전체 길이형 또는 BoNT/A-G 및 TeNT 각각의 재조합 Hc-단편들의 대장균 발현을 위한 플라스미드는 친화력 정화를 위해 카르복실 말단의 StrepTag를 가지고 있고, 또는 실험실내(in vitro) 전사/번역을 위해 ³⁵S-메티오닌 으로 표지되어, 적절한 프라이머, BoNT/A-G 및 TeNT 코딩 cDNA 및 발현벡터 pQe3(시작 벡터로서 Qiagen AG 또는 pSP72(Promega))을 가지고 PCR 방법에 의해 제조되었다.

다양한 시냅스 소포 단백질의 소포내 단편을 코딩하는 cDNA 구역(section)이 적절한 올리고뉴클레오티드 및 배아 쥐 cDNA-데이터베이스(GST-Syo-157-218, GST-Syg-I-45-98) 또는 기저(basis)로서 적절한 cDNA를 가진 플라스미드를 이용하여 벡터 pGEX-4T3 안에 클론되었다: GST-Syg-I-127-169 (RZPD, Deutsches Ressourcenzentrum fur Genomforschung GmbH; www.rzpd.de; ID IRAKp961C072Q), GST-SV2A-468-618 (RZPD-ID IRAKp961O24100Q), GST-Syo-22-103 (Rat; T. C. Sudhof, Dallas), GST-Syg-III-46-88 및 GST-Syg-III-128-168 (Mouse; T. C. Sudhof, Dallas), GST-SV2B-413-560 (Rat; S. Bajjalieh, Seattle), 및 GST-SV2C-454-603 (Rat; R. Janz, Houston). 하이브리드 GST-SV2-C/A를 코딩하는 플라스미드는 SV2C의 아미노산 454-553 및 SV2A의 568-594를 가지고 있고, 마찬가지로 PCR에 의해 대응하는 올리고뉴클레오티드에 의해 생산되었다. 모든 플라스미드의 핵산 서열은 DNA-시퀀싱에 의해 확인되었다. 상기 재조합 Hc-단편은 실온에서 10시간동안 인덕션(induction)하는 동안 대장균 균주 M15[pRep4](Qiagen)안에서 제조되었고 제조자의 지시사항(instruction)에 따라 StrepTactin-matrix(IBA GmbH)에서 정화되었다. 대장균 BL21로부터 얻은 GST-융합 단백질은 세파로즈 미세 비즈에 고정된 글루타티온(glutathione)의 도움을 받아 분리되었다. 원하는 단백질을 포함한 조각(fraction)들은 조합되었고 트리스-NaCl-트리톤-버퍼(Tris-NaCl-triton-buffer) (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, pH 7, 2)및 크랩-링거 버퍼(118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃, 2.5 mM CaCl₂, 11 mM glucose) 각각에 대해 여막분석되었다(dialysed).

³⁵S-표지된 H_C-단편은 pSP72 유도체로부터 실험실 내에서 합성되었는데, 이는 망상적혈구 용해질 시스템(reticulocyte lysate system)(Promega,Mannheim) 및 1회분의 2 μl내의 L-³⁵S-메티오닌(840 kBq,>37 TBq/mmol;Amersham Biosciences)을 사용하여 신경독소의 카르복실-말단 코돈의 선형 다운스트림에 의해 만들어졌다.

GST-풀-다운 분석법(GST-Pull-down Assay)

10 μl의 GT-세파로즈 미세 비즈에 고정되어 있던 GST-융합단백질(각각 0,15 nmol)은 총 부피 100 μl의 트리스-NaCl-트리톤-버퍼(Tris-NaCl-triton-buffer) 안에서 4℃ 3시간동안 보빈 뇌-갱글리오시드-혼합물(bovine brain-ganglioside-mixture)(18% GM1, 55% GD1a, 10% GT1b, 2% 다른 갱글리오시드; Calbiochem; 각각 20 μg)이 부존재한 상태 또는 존재하는 상태에서 Hc-단편(0,1 nmol)과 함께 배양되었다.

미세 비드(micro-bead)는 원심분리에 의해 모아졌고, 상청액은 제거되었고, 분리된 미세 비드는 각각 160 μl의 동일한 버퍼로 3번씩 린스되었다. 린스된 펠렛 조각은 SDS-시료 버퍼에서 가열되었고, 표면에 뜬 조각들과 함께 SDS-PAGE 및 쿠마 시 블루 염색법(Coomassie blue staining) 또는 자기방사선법 또는 면역-블로팅(immuno-blotting)에 의해 조사되었다.

쥐 편측 횡경막 분석법(Mouse Hemidiaphragm Assay)

쥐 편측 횡격막 분석법(HDA)이 하버만에 기술된 것과 같이 수행되었다(Habermann E, Dreyer F, Bigalke H (1980)). 파상풍 독소(tetanus toxin)는 보툴리눔 A 독소처럼 실험실 내에서 신경근 전달을 차단했다(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 311:33-40). 너버스 프레니쿠스(nervus phrenicus)는 1 헤르츠(Hertz)로 자극되었고, 수축 진폭(contraction amplitude)은 포텐시 미터(potency meter) 및 VitroDat Online Software(FMI GmbH, Seeheim-Ober Beerbach)를 이용하여 계속하여 기록되었다. BoNT를 첨가한 후에, 수축 진폭이 출력 값의 50%로 떨어지는 시간(마비의 반감기(paralytic half-time))이 측정되었다. 전체-길이 scBoNT/A 와일드 타입(full-length scBoNT/A wild type)은 하기의 최종 농도에서 최소 3배 값으로 측정되었다: 24,3 pM, 72,8 pM, 223 pM 및 728 pM. 포텐시 기능(potency function)은 이러한 농도-효과-관계(concentration-effect-relationship)에 근접했다: y(A)=225,87x^-0,2573(R²=0,9627).

같은 방식으로, 농도-효과-관계 y(B)=423,59x^-0,297(R²=0,983)이 하기의 최종 농도를 가지는 전체-길이 scBoNT/B 와일드 타입에 대해 세워졌다: 100 pM, 300 pM, 1000 pM 및 3000 pM. 저해도 조사를 위해, scBoNT/A (223 pM) 및 scBoNT/B (1000 pM)가 GST-SV2C-454-579 또는 GST-SV2-C/A(최종 농도 4, 7 또는 11,2 μM)중 어느 것과 함께 섞여져서, 20℃에서 15분 동안 배양되었고, HDA에 첨가되었다. 포텐시 기능에 기초하여, 부분적으로 늘어난 마비의 반감기는 상응하는 더 낮은 신경독소 양으로 변환되어졌고, % 독성으로 표현되었다.

결과

단백질들인 시냅토피신, 시냅토포린, 시냅토지린 I & III, 시냅토타그민 II, SV2A, SV2 및 SV2C의 루멘 도메인 및 카르복실-말단 막횡단 도메인들은 서브-클론되었고 대장균 재조합형으로 발현되었으며, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-융합 단백질로서 분리되었다. 7개의 BoNT 및 테타누스 신경독소(TeNT)의 Hc-단편은 모두 실험실 내에서 ³⁵S-메티오닌으로 번역되었을 뿐만 아니라 대장균 재조합형으로 발현되었다. 상기 언급된 GST-융합 단백질의 루멘 도메인에 대한 Hc-단편의 친화력이 글루타티온-S-트랜스퍼라제-(GST)-풀-다운 실험에서 측정되었다. 이러한 목적을 위해, 다른 Hc-단편을 가지는 각각의 GST-융합 단백질이 배양되었고 상분리(phase separation)가 수행되었다. 결합된 BoNT H_C-단편이 고상(solid phase)에서 검출될 수 있는 반면에, 유리된 Hc-단편은 GST-융합 단백질과 함께, 분리된 상청액(supernatant)에 남아있었다. 재조합 Hc-단편을 전체-길이 BoNT/A뿐만 아니라 ³⁵S-표지된 H_C-단편에 의해 대체한 것은 Hc-단편 BoNT/A와 비교할 때 GST-풀-다운 분석법에서 동일한 결과를 보였다.

^a 저해제는 GST-융합 단백질로서 사용되었음

^b 평균값± S.D. (n = 3-9)

^c 전체-길이 scBoNT/A 와일드 타입(full-length scBoNT/A wild type)은 하기의 최종 농도에서 최소 3배 값으로 측정되었다: 24,3 pM, 72,8 pM, 223 pM 및 728 pM. 포텐시 기능은 이러한 농도-효과-관계(concentration-effect-relationship)에 근접했다:y(A)=225,87x^-0,2573(R²=0,9627). 같은 방식으로, 농도-효과-관계 y(B)=423,59x^-0,297(R²=0,983)이 하기의 최종 농도를 가지는 전체-길이 scBoNT/B 와일드 타입에 대해 세워졌다: 100 pM, 300 pM, 1000 pM 및 3000 pM.

상기의 결과에서 보면, 복합 갱글리오시드의 존재여하에 관계없이, BoNT/A, B, C1, D, E, F ,G 및 TeNT의 8개 Hc-단편 중 어느 것도 시냅토피신, 시냅토포린, 시냅토지린 I & III, SV2A 및 SV2B의 루멘 도메인과 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이미 알려져 있듯이, BoNT/B 및 G의 상기 Hc-단편은 시냅토타그민 II의 루멘 도메인에 결합하지만, BoNT/A의 Hc-단편은 그러하지 않았다. 전체-길이 BoNT/A뿐만 아니라 ³⁵S-표지된 H_C-단편 재조합만이 복합 갱글리시드의 존재여하에 관계없이 GST에 융합된 SV2C의 루멘 도메인에 특이적으로 결합한다. 모든 다른 Hc-단편은 SV2C와 어떤 상호작용도 보이지 않는다(도 1).

또한, BoNT/A의 Hc-단편이 SV2C의 루멘 도메인에의 결합은 막횡단 도메인 8(GST-SV2C 454-579)에 의해서 단축된(shortening) 후에는 더 약해진 것을 알 수 있다(도 2). 20 아미노산(GST-SV2C 454-553)에 의해 카르복실-말단 결실(deletion)과 나아가 단축(shortening)은 BoNT/A와의 상호작용이 중단되는 결과를 가져온다. 아미노-말단 결실 또한 BoNT/A가 GST-SV2C 융합 단백질에 결합하는 것을 방해한다.

SV2C와 동종(homologous)인 SV2A 및 SV2B의 GST-융합 단백질은 카르복실-말단 막횡단 도메인이 있든 없든 간에 BoNT/A와의 어떤 결합도 하지 않았다. GST, SV2C의 아미노산 454-554 및 SV2A의 아미노산 568-594로 구성된 하이브리드 세대(generation)도 마찬가지로 BoNT/A Hc-단편과의 상호작용을 더 이상 보이지 않았다.

<110> toxogen GmbH et al <120> Der sotulinus Neurotoxin A Proteinrezeptor and seine Anwendungen <130> T106211WO <140> PCT/EP2006/010420 <141> 2006-10-30 <150> DE 10 2005 051 789.7 <151> 2005-10-28 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(126) <223> luminale Domane 454-579 des Sv2C <400> 1 Phe Pro Asp Val Ile Lys Pro Leu Gln Ser Asp Glu Tyr Ala Leu Leu 1 5 10 15 Thr Arg Asn Val Glu Arg Asp Lys Tyr Ala Asn Phe Thr Ile Asn Phe 　　　　　　20 25 30 Thr Met Glu Asn Gln Ile His Thr Gly Met Glu Tyr Asp Asn Gly Arg 35 40 45 Phe Ile Gly Val Lys Phe Lys Ser Val Thr Phe Lys Asp Ser Val Phe 50 55 60 Lys ser Cys Thr Phe Glu Asp Val Thr Ser Val Asn Thr Tyr Phe Lys 65 70 75 80 Asn cys Thr Phe Ile Asp Thr Val Phe Asp Asn Thr Asp Phe Glu Pro 85 90 95 Tyr Lys Phe Ile Asp Ser Glu Phe Lys Asn Cys Ser Phe Phe His Asn 100 105 110 Lys Thr Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp Asp Asp Tyr Ser Ala 115 120 125 Seite 1

Claims

호모 사피언스(homo sapiens)의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 최소한 70%가 동일한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 BoNT/A의 H_C-단편과 결합하여, 결합하는 폴리펩티드는 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C가 아니도록 하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 최소한 80 %가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 최소한 90 %가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 최소한 95 %가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 최소한 한 개의, 바람직하게 5개 이하, 특히 1개 이하의 아미노산의 추가, 치환, 결실, 삽입 및/또는 역위 등에 의하여 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 아미노산 서열과 다른 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 최소한 70 %가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 최소한 80 %가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 최소한 90 %가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 최소한 95 %가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 분리된 폴리펩티드이고, 보툴리눔 신경독소 A형의 Hc-단편과 결합하는 분리된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
제11항에 따른 핵산 및 발현 조절에 적합한 프로모터를 포함하는 벡터로서, 상기 핵산은 상기 프로모터에 의해 조절되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는 벡터.
제11항에 따른 핵산 및/또는 제12항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조방법으로서, 적절한 숙주세포 안에서 제11항에 따른 상기 폴리펩티드 및/또는 제12항에 따른 벡터를 코딩하는 핵산의 재조합 발현단계 및 상기 제조된 폴리펩티드를 공지된 방법으로 분리하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 최소한 하나의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
아미노산 서열의 최소한 70%가 호모 사피언스의 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
제16항에 있어서, 상기 항체는 시냅스 소포 당단백질 2C의 보툴리눔 신경독소에의 결합을 방해하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 최소 한 개의 폴리펩티드 및/또는 제16항 또는 제17항에 따른 최소 한 개의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
포유류에 제제를 투여하고, 상기 제제가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)과 최소한 70 % 동일한 아미노산에 BoNT/A가 결합하는 것을 최소한 10 %까지, 바람직하게 최소한 50 %까지, 특히 최소한 80 %까지 감소시키는 것을 특징으로 하는 포유류에서 BoNT/A의 신경독성을 감소시키는 방법.
제19항에 있어서, 아미노산 서열의 최소 70%가 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C(SV2C)의 루멘 도메인(아미노산 454-579)과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포유류에 투여하고, 그것이 BoNT/A가 SV2C에의 결합을 감소시키는 것을 특징으로 하는 포유류에서 BoNT/A의 신경독성을 감소시키는 방법.
제19항에 있어서, BoNT/A가 아미노산 서열에 결합하는 것을 감소시키는 항체를 포유류에 투여하는 것을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 최소한 70%가 호모 사피언스의 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 포유류에서 BoNT/A의 신경독성을 감소시키는 방법.
제19항에 있어서, 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)의 발현을 감소시키는 제제를 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 BoNT/A의 신경독성을 감소시키는 방법.
제22항에 있어서, 상기 제제는 안티센스-분자인 것을 특징으로 하는 포유류에서 BoNT/A의 신경독성을 감소시키는 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 BoNT/A의 치료 목적의 처치 또는 미용 목적의 사용 시 과다투여에 의하거나 중독에 의한 보툴리즘에서 또는 예방적 목적에서 BoNT/A의 신경독성을 감소시키는데 이용되는 것을 특징으 로 하는 방법.
제19항 내지 24항의 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 호모 사피언스인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) BoNT/A 및 GST-SV2C (454-579)가 포함된 용액에 제제를 접촉시키고;

(b) GST-SV2C(454-579)와 결합된 양을 측정하고; 그리고

(c) GST-SV2C(454-579)에 결합된 BoNT/A의 양을 감소시키는 제제를 추출하는,

단계로 이루어지고, 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)에 BoNT/A가 결합하는 것을 감소시키는 제제임을 식별하는 방법.
제26항에 있어서, 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C의 상기 루멘 도메인(아미노산 454-579)은 세포의 원형질막 속에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 제제의 존재 하에서 호모 사피언스의 시냅스 소포 당단백질 2C와 BoNT/A의 줄어든 결합은 쥐 편측 횡경막 테스트(Mouse Hemidiaphragm Test)에서 BoNT/A의 신경독성이 감소된 것에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 제조되는 제제.
(a) 폴리펩티드가 아미노산 서열의 최소한 70%가 호모 사피언스의 소포 당단백질 2C의 루멘 도메인(아미노산 454-579)과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이고 BoNT/A가 SV2C에 결합하는 것을 감소시키는, 폴리펩티드를 고상(solid phase)에서 고정시키는(immobilizing) 단계;

(b) BoNT/A가 폴리펩티드에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 상기 고정된 폴리펩티드를 시료에 접촉시키는 단계;

(c) 상기 BoNT/A 폴리펩티드 복합체를 용출시키는 단계; 및

(d) 상기 복합체 또는 그의 구성요소를 검출하는 단계;

로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 원하는 시료 내에서 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 BoNT/A를 검출하기 위한 방법.