KR20080067376A - 알파 태아 단백질의 조성물 및 암 치료를 위한세포자멸사의 유도인자 - Google Patents

알파 태아 단백질의 조성물 및 암 치료를 위한세포자멸사의 유도인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-태아 단백질(AFP)을 포함하는 신규의 조성물, 및 다중약물 내성과 함께 또는 상기 내성 없이 알파-태아 단백질 수용체(AFPR)를 발현하는 악성 종양을 예방, 치료 또는 억제하기 위한 방법에 관한 것이다. 외부 AFP, 및 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합한다. 본 발명은 또한 초기 배아발생 중 추출한 혈액 및 양막 액으로부터 수득한 돼지 알파-태아 단백질의 부탄올 추출 방법을 제공한다.
알파-태아 단백질(AFP), 알파-태아 단백질 수용체(AFPR), 악성 종양, 예방, 치료

Description

알파 태아 단백질의 조성물 및 암 치료를 위한 세포자멸사의 유도인자{COMPOSITIONS OF ALPHA-FETOPROTEIN AND INDUCERS OF APOPTOSIS FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 의학, 특히 종양학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 세포자멸사 유도인자에 결합된 AFP를 포함하는, 포유동물에서 악성 세포 증식을 치료, 예방 및 억제하기 위한 신규 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 초기 배아발생 중 추출한 혈액 및 양막 액으로부터 수득한 돼지 알파 태아 단백질의 부탄올 추출 방법을 제공한다.
본 출원은 미국 출원 제 11/274,906 호로부터 우선권을 주장하며, 상기 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
알파 태아 단백질(AFP)은 셔틀로서 작용하고 3 내지 5일의 반감기를 갖는, 태아의 주요 운반 단백질이다(Mizejewski, G.J., "AFP and Congenital Disorders", pp. 5-34, Academic Press, Orlando, 1985; Abelev, GI, Alpha-fetoprotein: 25 years of study, Tumor Biology, 10:63-74; 1989). AFP의 발현은 발생 중에 엄격하게 조절되며, 따라서 AFP 발현의 검출 가능한 수준은 주로 발생 단계에 의존한다. AFP가 개체발생적 성장 및 종양 진행 모두에서 성장 조절인자로서 작용한다는 연구가 확립되었다. 발생 및 종양발생 중 AFP의 발현으로 인해, AFP를 종양태아성 항원이라 칭한다.
AFP는 알부미노이드 유전자 상과(알부민도 또한 일원이다)에 속하는 당단백질이다. AFP의 분자량은 출처, 발생 단계 및 그의 정제에 사용된 방법에 따라 64,000 내지 72,000 달톤으로 다양할 수 있다. 탄수화물의 관련 퍼센트는 상기 출처 및 발생 단계에 따라 다시 3 내지 5%로 다양하다.
AFP는 2 가지 기본적인 분자 형태로 존재하는 것으로 보인다: 1) 결합되지 않은 형태, 및 2) AFP가 다양한 리간드(예를 들어 지방산, 에스트로젠, 피토스테로이드)에 착화된 결합된 형태. 그러나, AFP의 변체들이 동정되었다. 상기 결합된 리간드(들)의 성질 및 농도에 따라, 결합된 AFP의 상이한 형태들(완전형태)이 존재한다. 인간 AFP(HAFP)의 분자 변체들이 동정되었으며, 이때 상기 변화는 탄수화물 미세불균일성뿐만 아니라(즉 상이한 탄수화물 부분들이 HAFP 상의 당화 부위에 결합한다), 등전점의 차이에 기인한다(Keel, B.A., et al., CRC Press; vol 2, 24-31, 1989; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5):377-408, 2001; Morinaga, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(15):4604-8, 1983; Parker, M.H. et al., 트랜스제닉 염소의 젖에서 발현된 인간 AFP의 재조합 변형의 정제 및 특성화, Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004). HAFP mRNA의 발생기-특이적 발현에 기인한 HAFP의 유전자 변체가 검출되었다.
미제예프스키 등(Mizejewski G.J. et al., Tumour Biol. 7(1):19-36, 1986)은 "발생 시계"로서 AFP의 주기 생리학을 개시한다. 저자들은 AFP의 구조 및 기능 이 발생 과정 전체를 통해 변하며, 이때 상기 단백질은 태아 발생 중에 변동하는 수준으로 발현되고 발현 수준이 출생 후 무시할 정도의 수준으로 감소하며, 50 ng/㎖ 미만의 보통의 성인 혈청 농도를 갖는다(Ruoslahti and Seppala, Int. J. Cancer 8:374-378, 1971). 그러나, AFP 혈장 수준은 다양한 암들을 가진 개인들에서 1000 배 이상일 수 있다(Ruoslahti and Seppala, Adv. Cancer Res. 29:275-310, 1979). 또한, 다수의 암들이 그들의 세포 표면상에서 높은 수준의 AFP 수용체를 발현한다(Uriel, J. et al., "Biological Activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol.2, pp. 104-117; Moro, R., "Biological Activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol.2, pp. 120-127). 따라서, 인간에서, AFP는 태아발생 중에 태아 검출 마커인 것 이외에 종양 마커로서 작용한다.
종래 기술에 공지된 다양한 화학 제제, 예를 들어 알킬화제, 대사길항물질, 알칼로이드, 항생제, 호르몬 및 면역조절제가 암 치료에 사용된다. 그러나, 이들 제제는 종양 세포를 특이적으로 표적화하지 않으며, 그 결과 정상의 비 종양 세포도 또한 항암제의 영향을 받을 수 있는 "방관자 효과"라 칭하는 결과가 발생한다. 정상 세포 상의 수용체의 무시할 정도의 발현에 비해 악성 세포 표면상의 HAFP 수용체(HAFPR)의 과발현은 암 세포를 특이적으로 표적화하기 위한 항암 약물의 담체/운반체로서 HAFP의 용도에 관한 연구를 촉진시켰다(Severin, S.E. et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 37(2):385-92, 1995; Severin, S.E. et al., Dokl, Akad, Nauk 366(4):561-4, 1999). HAFP가 종양 세포에 항암 약물 접합체를 표적화 할 수 있음이 입증되었다(Moskaleva et al., Cell Biol Int. 21(12):793-799, 1997; Sotnichenko et al., FEBS Letters 450:49-51, 1999; 미국 특허 제 6,630,445 호, Murgita). AFP의 수용체를 갖는 암 세포에 대한 HAFP의 높은 특이성은 종양 세포에 대한 특이적 표적화로 인해 향상된 약물 효능을 제공한다. 또한, 상기와 같은 활성제 전달 방식은 정상의 주변 세포에 영향을 끼치지 않으므로 환자에게 보다 안전하다.
다수의 항암 약물, 예를 들어 독소루비신, 다우노마이신, 칼리케미신, 카복시포스파미드, 블레오마이세틴, 클로르부틴, 시스-플라티늄, 메토트렉세이트 및 카미노마이신과 결합된 HAFP가 보고되었다(Moskaleva et al., Cell Biol. Int. 21(12):793-799, 1997; Lutsenko et al., Tumor Biology 21(6):367-374, 2000). 이러한 경우에, 상기 활성제들은 화학적 접합 방법을 사용하여 HAFP에 결합되었으며, 그 결과 HAFP가 상기 항암제에 공유 결합되었다. 생물 활성의 손실 없이 성분들의 결합을 가능하게 하고 약물의 표적화된 전달을 가능하게 하는 AFP-약물 접합체에 대한 AFP:약물의 최적 몰 비는 1:2인 것으로 밝혀졌다(Feldman, N.B. et al., Biochemistry 65:1140-1145, 2000). 동일한 몰 비 1:2가 AFP와 다이옥신의 비 공유 결합에서 성취될 수 있다(Sotnichenko et al., FEBS Letters 450:49-51, 1999).
허브 등(Herve et al. "Biological activities of alpha-fetoprotein", Florida Congresses, ed. Mizejewski, G.J., CRC Press, Inc., Boca Raton, Vol. 1, 1987)은 알부민 상에서 발견된 것들과 유사한, 래트 AFP 상의 와파린 및 페닐부타존 결합 부위들을 입증하였다. 또한, 이들은 상기 작용제들이 에스트로젠, 지방 산, 피라졸 화합물 및 프로프리온 약물과 동일하게 큰 소수성 포켓에서 AFP와 결합함을 입증하였다. 문헌[Mizejewski, G.J., "AFP and congenital disorders", ed. G.J. Mizejewski, Academic Press, Inc., 1985]에 고찰된 바와 같이, 지방산은 인간 AFP 및 설치류 AFP에 결합할 수 있는 반면, 피토에스트로젠은 설치류 AFP에만 결합할 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 AFP 결합 능력에 있어서 종간 차이를 암시한다.
AFP/약물 표적화된 전달 실험에 사용된 AFP의 우세한 공급원은 여성의 후태반 혈청(Moskaleva et al., Cell Biol Int. 21(12):793-799, 1997) 또는 인간 태아 물질(www.alfetin.)로부터 추출한 인간 AFP이었다. 인간 태아 물질은 제한된 공급원(12 주 이하 잉태 기간의 유산 물질로부터 추출됨)으로 인해 수득이 어렵고 또한 값이 비싸다. 러시아에서, 인간 태아 AFP는 "알페티늄"이란 이름 하에 면역 조절 주사 약물로서 등록되어 있다(1 앰플은 0.075 ㎎의 95% 순수한 AFP를 함유한다). 따라서, 암 세포에의 세포독성제의 전달에 유용한 AFP의 대체 공급원이 이로울 것이다.
상이한 작용 방식을 갖는 항암제들이 화학감수성 세포에서 세포자멸사를 촉발하는 것으로 보고되었다(Fisher, Cell 78:539-542, 1994). 미토콘드리아 기능의 변화, 예를 들어 미토콘드리아 막 투과성 및/또는 투과성 변이 기공 복합체 변경은 항암제에 의해 유발된 세포사를 포함하여 세포자멸성 세포사에서 중요한 역할을 한다(Kroemer et al., Immunol Today 18:44-51, 1997; Susin et al., J Exp. Med. 186:5-37, 1997; Marchetti et al., J. Exp Med. 184:1155-1160, 1996; Zamzani et al., J. Exp. Med. 183:1533-1544, 1996; Decaudin et al., Can Res 57:62-67, 1997). 많은 통상적인 화학요법제들은 내생적인 효과기, 예를 들어 p53(세포자멸사의 생리학적 조절에 관련된다)의 도입에 의해 간접적인 방식으로 미토콘드리아 침투를 유도한다. 그러나, 많은 상이한 인간 암에서 p53의 빈번한 돌연변이는 상기 암을 통상적인 화학요법제에 무반응성으로 만든다. 상기 미토콘드리아에 직접 작용하는 세포독성제, 예를 들어 로니다민, 아르세나이트, 베튤린산 및 CD437의 발견은, 통상적인 약물들이 내생적인 세포자멸사 유도 경로, 예를 들어 p53을 수반하는 경로의 와해로 인해 실패하는 경우에 대체 치료 전략을 제공하였다(Costantini et al., J. Natl. Cancer Institute 92:1042-1053, 2000 참조). 미토콘드리아를 표적화하고 세포자멸사를 유도하는 세포독성제, 예를 들어 베튤린산이 개시되었다(Fulda, S. et al., J. Biol. Chem. 18; 273(51):33942-8, 1998; Pezzuto et al. 미국 특허 출원 공보 제 20030186945 호). 코스탄티니(Costantini) 등은 미토콘드리아 막 투과성의 변경 및/또는 투과성 변이 기공 복합체(PTPC)의 변화에 의한 미토콘드리아 파괴를 통해 세포자멸사를 유도하는 기전을 고찰하고 세포자멸사를 유도하는 미토콘드리아를 표적화하는 세포독성제를 나열한다(J. Natl. Cancer Inst. 92(13):1042-53, 2000).
단일 HAFP/항암제 접합체(즉 HAFP-에스트론-독소루비신 접합체)의 사용은 많은 상이한 유형의 암이 화학요법에 무반응성이고 다중약물 내성(MDR)을 나타낸다고 하는 사실로 인해 악성 종양의 치료에 제한 인자인 것으로 간주된다(Lehnert M., Eur. J. Cancer, 32A:912-920, 1996; Germann U.A., Eur. J. Cancer, 32A:927-944, 1996). 더욱이, 다수의 항암제는 알킬화제, 및 DNA를 표적화함으로써 종양 세포사를 유도하는 항생제이며, 따라서 주로 완전한 p53 신호전달 경로에 의존한다(Bykov, V.J. et al., Nat. Med. 8(3):282-8, 2002). 작용성 p53이 결여된 다수의 종양의 경우, 상기 치료는 종종 효과가 없다.
따라서, 쉽게 유도되고, 생산비가 저렴하며, 비침습적인 수단에 의해 전달이 가능하고, 암세포의 살해에 효율적이고 특이적인, 암세포의 세포독성제의 개선된 전달 기전이 필요하다.
본 발명은 상기 이점 및 다른 이점들 중 하나 이상을 제공할 수 있으며, 이는 본 출원의 고찰 후 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이다.
발명의 요약
간단히 나타내면, 본 발명은 AFP를 포함하는 신규 조성물 및 알파-태아 단백질 수용체(AFPR)를 발현하는 악성 종양의 예방, 치료 또는 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 초기 배아발생 중 추출한 혈액 및 양막 액으로부터 수득한 돼지 알파-태아 단백질의 부탄올 추출 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 외부 알파-태아 단백질(AFP), 및 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합한다. 하나의 실시태양에서, 상기 조성물은 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합할 수 있는 2 개의 세포자멸사 유도제를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 조성물은 아트락틸로사이드, 베튤린산, 탑시가진, 로테논, 피에리시딘 A, 로니다민, CD437, 아르센 트라이옥사이드, A23187, 이오노미신, 비타민 D2 및 D3, 덱사메타손 및 액쿠탄을 포함하는 그룹 중에서 선택된 세포자멸사 유도제를 포함한다.
본 발명은 또한 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제를 포유동물의 암 세포에 전달하기 위한 외부 AFP의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 암은 하나 이상의 AFP 수용체를 갖고, 상기 외부 AFP는 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 포유동물의 암 세포에 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 표적화된 전달을 위한 약제의 제조에서, 외부 알파-태아 단백질(AFP); 및 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP는 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 포유동물의 암 세포의 증식을 억제하기 위한, 외부 알파-태아 단백질(AFP); 및 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP는 상기 세포 표면상의 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 난치의 악성 종양에서 다중약물 내성을 치료하기 위한, 외부 알파-태아 단백질(AFP); 및 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물의 용도를 제공하며, 상기 난치의 악성 종양은 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 암 세포를 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP는 상기 세포 표면상의 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 포유동물에서 암 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 암세포는 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖고, 여기에서 상기 방법은 포유동물에게 치료 유효량의 외부 알파-태아 단백질(AFP); 및 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중 에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하고, 이때 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP는 상기 세포 표면상의 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 난치의 악성 종양에서 다중약물 내성을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 난치의 악성 종양은 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 암세포를 포함하고, 여기에서 상기 방법은 포유동물에게 치료 유효량의 외부 알파-태아 단백질(AFP); 및 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하며, 이때 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제는 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP는 상기 세포 표면상의 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은
(a) 약 3 내지 약 14 주 잉태 기간의 돼지 태아로부터 혈액 및 양막 액을 수거하고;
(b) 상기 (a)에서 수거한 혈액 및 양막 액을 상등액과 침전물로 분리하고;
(c) 상기 (b)로부터 생성된 상등액을 수거하고;
(d) 상기 (c)로부터 생성된 상등액을 농축시켜 농축된 용액을 제조하고;
(e) 부탄올을 상기 (d)의 농축된 용액에, 용액 중 부탄올 약 5 내지 약 10% 의 최종 농도로 가하고;
(f) 상기 (e)로부터 생성된 부탄올 용액을 교반하고;
(g) 상기 (f)로부터 생성된 부탄올 용액을 상부 비 수성 상과 하부 수성 상으로 분리시키고;
(h) 상기 (g)로부터 생성된 비 수성 상을 수거하여 결합되지 않은 돼지 AFP를 함유하는 최종 용액을 제조하는
연속 단계들을 포함하는, 부탄올을 사용하여 원료 물질로부터 돼지 AFP를 추출하는 방법을 제공한다.
몇몇 특정한 실시태양의 경우, 상술한 바와 같은 조성물은 독특한 투여량을 갖는 제 1 및 제 2 세포자멸사 유도제를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 조성물에 사용된 외부 AFP는 포유동물 공급원으로부터 유래한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 AFP는 돼지 공급원(PAFP)으로부터의 것이다. 다른 실시태양에서, 상기 AFP는 영장류, 소, 말, 개, 고양이 또는 양 공급원으로부터의 것이다. 상기 AFP는 천연으로부터 단리된 것이거나 또는 AFP의 재조합 형태일 수 있다.
도 1은 화학요법제를 가한 암 세포에서 카스파제-매개된 세포자멸사 경로의 개략도이다.
도 2는 AFP 농축물 단독(레인 "C"), 아트락틸로사이드에 결합된 AFP 농축물(레인 "A"), 및 표준 분자량 마커의 젤 전기영동이다. 레인 "B"는 또 다른 실험을 위해 버린다.
도 3은 PAFP-세포자멸사 유도제 조성물에 의한 처리에 따른, 백혈병 쥐 모델에서 측정된 시간의 함수(일수)로서 ㎤으로 측정된 종양 부피이다. P-388 백혈병 세포를 DBA2 마우스에 피하 주사하였다. 접종 후 1일째 동물을 1. 제제 A(PAFP - 아트락틸로사이드 (A)); 2. 제제 T(PAFP - 탑시가진(T)); 3. 제제 S(비장 추출물(S)); 4. 제제 A + S; 5. 제제 T + S; 6. 대조용 오일; 및 7. 대조용 물 중 하나로 매일 처리하였다.
도 4는 P-388 백혈병 세포의 피하 주사, 및 1. 제제 A(PAFP - 아트락틸로사이드 (생성물)); 2. 제제 T(PAFP - 탑시가진(생성물)); 3. 제제 S(비장 추출물); 4. 제제 A + S; 5. 제제 T + S; 6. 대조용 오일; 및 7. 대조용 물 중 하나에 의한 후속의 접종 후 1일째 매일 처리에 따른 DBA2 마우스의 생존률이다.
도 5는 P-388 백혈병 세포의 DBA2 마우스에의 피하 주사 및 1. 대조군(물); 2. 대조군(오일); 3. PAFP - 베튤린산; 4. PAFP - 베튤린산 + 추가의 결합되지 않은 베튤린산 중 하나에 의한 후속의 접종 후 1일째 매일 처리에 따른, 일수로 측정된 시간의 함수로서 ㎤로 측정된 종양 부피이다.
도 6은 간 전이의 제거를 나타내는, 결장의 전이성 선암종을 갖는 암 환자 P에서 8 주의 PAFP - 아트락틸로사이드 경구 캡슐 처리 전(좌측) 및 처리 후(우측)의 CT 스캔의 비교이다.
도 7은 간 전이의 제거를 나타내는, 결장의 전이성 선암종을 갖는 암 환자 P.N.G.에서 6 주의 PAFP - 아트락틸로사이드 경구 캡슐 처리 전(좌측) 및 처리 후(우측)의 CT 스캔의 비교이다.
본 발명은 암세포에의 세포자멸사 유도제의 표적화된 전달에 유용한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 미토콘드리아 기능에 직접 영향을 미침으로써 세포자멸사를 유도하는 화합물과 비 공유적으로 착화된 외부 AFP를 포함하며, 이는 초기 핵 신호전달을 통한 세포자멸 반응의 유도 필요성을 피한다. AFP의 공급원은 하나의 실시태양에서 돼지이며, 또 다른 실시태양에서 3 내지 14 주 잉태 기간의 태아 및 양막 액으로부터 추출된 돼지 AFP이다. AFP와의 비 공유 회합을 위해 본 발명에 유용한 구체적인 화합물로는 아트락틸로사이드, 베튤린산, 탑시가진, CD437, 로테논, 피에르시딘 A 및 로니다민이 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 '세포자멸사 유도제'란 용어는 세포자멸성 세포사를 유도하는 능력을 갖는 화학 또는 천연 화합물을 지칭한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 세포자멸사 유도제는 미토콘드리아에 직접 작용한다. 상기와 같은 화합물은 미토콘드리아 막 투과성, 미토콘드리아 기공 개방의 유도, 미토콘드리아 막 전위뿐만 아니라 수행 능력이 있는 카스파제, 예를 들어 카스파제 3 및 9의 활성화 중 어느 하나에 영향을 미침으로써 세포자멸사를 유도할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 상기 '세포자멸사 유도제'는 상기 세포 표면상에서 AFP 수용체를 발현하는 표적화된 암세포의 세포자멸사를 유도한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 세포자멸사 유도제의 예는 비 제한적으로 미토콘드리아 막 투과성 유도제, 예를 들어 아트락틸로사이드, 베튤린산, 탑시가진, CD437, 로니다민, 아르센 트라이옥사이드 및 로테논; 카스파제 활성화제, 예를 들어 Pac-1(Putt et al., Nature Chem. Biol. 2:543-550, 2006), 이오노포어, 예를 들어 칼시마이신/A23187 및 발리노마이신; 및 레니노이드, 예를 들어 액큐탄 및 시스-레티노산; 뿐만 아니라 널리 공지된 화학요법제, 예를 들어 덱사메타손; 항생제, 예를 들어 올리고미신 B; 하이드록시클로로퀸 포스페이트; 항산화제, 예를 들어 퀘르세틴, 비타민 A, 비타민 D2 및 D3, 커큐민 및 캅사이신; 및 중금속, 예를 들어 아연, 납, 구리, 니켈 및 카드뮴(http.://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/TablePage/9560323, http://www.biomol.com/Online_Catalog/Online_Catalog/Products/36/?categoryId=234, http://www.emdbiosciences.com/html/cbc/apoptosis_inducers.html, http://www.axxora.com/apoptosis_inducers_inhibitors/opfa.1014.2.1.0.html)을 포함하거나 이들로부터 유도된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 '가역적'이란 용어는 원래('결합되지 않은') 상태로 돌아올 수 있음을 의미하며, 여기에서 상기 외부 AFP는 제 1 세포자멸사 유도제(즉, 아트락틸로사이드, 탑시가진, 베튤린산, CD437, 아르센 트라이옥사이드, 로테논 및 로니다민)를 종양 세포에 전달한 후에 상기 AFP에 대해 고유의 결합 친화성을 갖는 또 다른 화합물(즉, 아트락틸로사이드, 탑시가진, 베튤린산, CD437, 아르센 트라이옥사이드, 로테논 및 로니다민)에 결합할 수 있는 결합되지 않은 형태로 세포외 매질로 다시 재순환된다. 상기 외부 AFP는 1 회를 초과하여 상기 세포 외 매질로 재순환되는 것이 가능하다. 앞서, 다수의 시험관 내 연구들은 AFP가 다중불포화된 지방산(PUFAs)을 AFP 수용체-매개된 세포 이물흡수를 통해 세포로 전달될 수 있고 나중에 상기 세포외 매질로 재순환 퇴화됨을 입증하였다(Torres et al., Int. J. Cancer 47:110-117, 1991; Uriel et al., "Biological activities of alpha-fetoprotein", Florida Congresses, edited by Mizejewski, GJ, CRC Press Inc., Boca Raton, Vol. 2, 1987; and Laborda et al., Int. J. Cancer 40:314-318, 1987). 이들 연구는 재순환된 AFP가 상기 세포 외 공간으로 복귀 시 두 번째로 세포자멸사 유도제에 결합할 수 있음을 시사한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 '치료 유효량'이란 용어는 환자에게 투여 시 본 발명에 개시된 암(고형 또는 비 고형)의 증상을 개선 또는 경감시키는 본 발명의 조성물의 양을 의미한다. 본 발명에 따라 투여되는 조성물의 특정 용량은 물론 상기 사례를 둘러싸고 있는 특정 환경, 예를 들어 투여되는 조성물, 투여 경로, 환자의 상태, 및 치료하려는 암의 유형에 의해 결정될 것이다. 본 발명에 의해 치료하기에 적합한 암은 암성 세포가 AFPRs을 발현하는 암들이다. AFPR의 발현이 입증된 암의 예로는 비 제한적으로 방광암, 유방암, 결장 및 직장암, 자궁내막암, 신장암(신세포), 백혈병, 간암, 폐암, 흑색종, 비 호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암(비 흑색종), 고환암 및 갑상선암이 있다(Moro-Vidal, R., Curex Technologies Inc., www.biocurex.com).
'환자'란 용어는 인간을 포함한 모든 포유동물을 의미한다. 환자의 예로는 인간, 다른 영장류, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 돼지, 말 및 토끼가 있다.
본 발명은 세포자멸사 유도제의 담체 또는 운반체로서 상기 암세포에 직접 작용하여, 상기 암세포의 세포자멸사를 생성시키는 외부 알파 태아 단백질(AFP)의 용도를 포함한다. 미국 특허 제 6,630,445 호 및 6,534,479 호에는 세포독성제와의 접합을 위한 재조합 인간 AFP의 용도가 개시되어 있다. 앞서, 니시이 등(Nishi et al., Ann. New York Acad. Sci. 259:109-118, 1975)은 AFP의 또 다른 포유동물 공급원의 가능성을 제기하는 면역학적 및 항원 성질에 관한 포유동물 AFPs 중 잡종 유사성을 입증하였다. 돼지와 인간 AFP간의 유사성은 인간 AFP 대신에 돼지 AFP를 사용하여 세포자멸사 유도제를 암세포에 전달할 수 있음을 암시한다(표 1).
인간 AFP(HAFP), 재조합 인간 AFP(rHAFP) 및 돼지 AFP(PAFP) 성질들의 비교
성질 HAFP rHAFP PAFP
알부민에 대한 아미노산 유사성% 40 40 38
당화% 3-4 0 3-4
당화 당 상이함 0 알려지지 않음
미세불균일성 예 아니오 아니오
공급원으로부터 병원성 오염 가능성 예 아니오 아니오
공급원에 관한 윤리문제 예 아니오 아니오
지방산 결합 능력 예 알려지지 않음 예
소수성 리간드 친화성 예 알려지지 않음 예
항암활성(암세포에 결합된 세포자멸사 유도제의 AFP-매개된 전달) 예 알려지지 않음 예
NCBI Blast 분석 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Parker, M.H. et al., Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004).
본 발명에 사용된 바와 같은 '외부'란 용어는 환자 또는 유기체의 밖에서 기원함을 의미한다.
본 발명은 시험관 내에서 외부 AFP에 가역적으로 결합되어 AFP-제 1 세포자멸사 유도제 복합체를 형성하는 외부 AFP 및 제 1 세포자멸사 유도제의 조성물에 관한 것이며, 또한 제 2 세포자멸사 유도제를 포함할 수도 있고, 이때 상기 제 1 세포자멸사 유도제와 제 2 세포자멸사 유도제는 항암 약물(즉, 아트락틸로사이드, 탑시가진, 베튤린산, CD437, 아르센 트라이옥사이드, 로테논 및 로니다민)이며 상기 제 2 세포자멸사 유도제는 생체 내에서 재순환된, 외부 AFP에 가역적으로 결합할 수 있다. 상기 제 1 세포자멸사 유도제와 상기 제 2 세포자멸사 유도제는 동일하거나(즉, 베튤린산) 또는 상이할 수 있다(즉, 베튤린산과 CD 437).
AFP 상의 다수의 결합 도메인의 존재는 하나를 초과하는 부류의 세포자멸사 유도제가 시험관 내에서 AFP에 동시에 결합할 수 있을 가능성을 제기한다(Hirano, K. et al., Biochem. J., 231:189-191, 1985; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5):377-408, 2001). 이는 일부 결합 도메인이 소수성 약물과 상호작용하는 반면, 다른 결합 도메인은 친수성 또는 양쪽성 약물과 상호작용한다는 사실에 기인한다.
본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 암 환자는 본 발명 조성물의 1일 투여량을 수용할 것이며, 이때 AFP의 전체 1일 복용량은 상기 환자 및 질병의 공격성에 따라 0.07 내지 1.2 ㎎일 것이다. 상기 AFP의 농도는 임신 중 순환에서 통상적으로 발견되는 AFP의 생리 농도를 기준으로 한다. 쥐 대응물에서, 필적하는 투여량은 문헌[Boik, J., "Natural Compounds in Cancer Therapy", Natural Compounds in Cancer Therapy. Oregon Medical Press, 2001, pp. 8-10]에 제공된 지침에 따라 0.0014 내지 0.024 ㎎이다.
본 발명의 조성물은 변화하는 몰 비의 제 1 및 제 2 세포자멸사 유도제, 예를 들어 AFP에 대해 동 몰 비 내지 과잉의 제 1 세포자멸사 유도제 및 AFP에 대해 동 몰 비 내지 과잉의 제 2 세포자멸사 유도제를 함유할 수 있다. 상기 제 1 세포자멸사 유도제 및 AFP의 시험관 내 결합 조건은 상기 제 1 세포자멸사 유도제의 성질(즉 친수성 또는 소수성)에 따라 변할 것이다. 전형적으로는, AFP를 상기 제 1 세포자멸사 유도제와 혼합하며, 이때 상기 AFP와 제 1 세포자멸사 유도제의 몰 비는 1:1 내지 1:3의 범위이다. 보다 전형적으로는, AFP를 상기 제 1 세포자멸사 유도제와 혼합하며, 이때 상기 AFP와 제 1 세포자멸사 유도제의 몰 비는 1:1 내지 1:3 미만의 범위이다. 상기 제 1 세포자멸사 유도제는 하나 이상의 항암 약물로 구성될 수 있다. 그러나, 다중 약물을 사용해야 하는 경우, 상기 언급한 바와 같이 각각이 AFP 상의 상이한 결합 도메인에 결합함을 확인해야 한다.
상기 추출된 물질에 투석여과를 수행하여 상기 PAFP - 세포자멸사 유도제 복합체의 동요 없이 작은, 결합되지 않은 분자를 제거한다. 앞서, 소트니첸코 등(Sotnichenko et al. FEBS Letters 450:49-51, 1999)은 인간 태아 AFP가 1:2 몰 비로 다이옥신과 복합체를 형성하며 젤 여과가 상기 AFP-다이옥신 복합체의 동요 없이 결합되지 않은 분자를 유효하게 제거함을 입증하였다.
전형적으로는, 상기 제 2 세포자멸사 유도제는 종래 기술에 개시된 방법에 사용된 양보다 10 배 이상 더 낮은 양으로 존재한다. 예를 들어 페주토 등(Pezzuto et al. 미국 특허 출원 공보 제 20030186945 호)은 3000 ㎍의 베튤린산 투여량(0.2 내지 500 ㎎의 1일 경구 투여량)을 권장하는 반면, 본 발명에서 베튤린산(제 2 세포자멸사 유도제)의 투여량은 150 ㎍ 정도로 낮을 수 있다. 본 발명에서 PAFP 0.6 ㎎을 베튤린산 0.007 ㎎과 착화시킨다. 또 다른 실시태양에서 결합되지 않은 베튤린산 0.15 ㎎을 상기 제형에 포함시킨다.
PAFP는 불안정하며 앞서 개시된 화학적 접합 공정들 중 하나와 같은 조작 중에 응집되거나, 침전되거나 또는 불활성화될 수 있다(G.J. Mizejewski, "Alpha-fetoprotein", in Monographs on Endocrinology, ed. Ulrich Westphal, Steroid-protein interactions II, Springer-Verlag, Berlin, New-York, Tokyo, 1986, pp. 320-356; Nunez, E.A. et al, AFP의 생리화학적 및 생물학적 성질은 그의 리간드 환경에 좌우한다, J. Nucl. Med. Allied Sci., 33:18-16, 1989). 본 발명에서 18 내지 25 ℃에서 제 1 세포자멸사 유도제에 대한 PAFP의 시험관 내 결합을 성취하는데 필요한 시간은 10 분이며, 이는 종래 기술에 개시된 비 공유 결합 과정에 의해 필요한 시간보다 상당히 더 짧고, 이때 18 내지 25 ℃에서 유지시간은 10 내지 12 시간이다(예를 들어 미국 특허 제 6,878,688 호(Pak et al.) 참조). 상기 PAFP 및 상기 제 1 세포자멸사 유도제의 시험관 내 결합을 성취하는데 감소된 시간은 (1) 한외여과 및 본 발명의 부탄올 추출 방법에 의해 수득된 농축물 중에 존재하는 결합에 이용할 수 있는 결합되지 않은 PAFP의 보다 높은 농도, 및 (2) 다른 방법(상술한 바와 같이 미세불균일성이다)(Wu, J.T. and Clayton, F., "Detection and isolation of various isoforms of human AFP", in "Biological activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol. 2, pp. 3-14; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med., vol. 226(5):377-408, 2001)에 의해 수득된 HAFP에 비해 본 방법에 의해 수득된 PAFP의 미세균일성에 기인할 수 있다.
전형적으로, 상기 제 1 세포자멸사 유도제는 항암 약물의 한 부류이며, 150 ㎍ 이하의 1일 농도로 존재한다. 본 발명에 유용한 세포자멸사 유도제는 바람직하게는 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제, 이오노포어 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
다중약물 내성(MDR)은 흔히 암세포 표면에서의 gp170 펌프의 높은 발현 수준과 관련된다(Lehnert M., Eur J Cancer 32A:912-920, 1996; Germann U.A., Eur. J. Cancer 32A:927-944, 1996; Thomas, H., et al., Cancer Control 10(2):159-165, 2003). 그러나, MDR은 또한 손상된 p53, 또는 Bcl-2와 같은 세포자멸성 억제제의 상향조절된 발현을 갖는 세포에서 발생하는 것으로 공지되어 있다(Jaattela, M., Exp. Cell Res. 248:30-43, 1999). 다수의 화학요법제들은 p53 활성의 상부 표적, 예를 들어 DNA, RNA, 텔로머라제 및 국소이성화효소를 갖는다. 상기 작용제는 손상된 p53 또는 상향조절된 Bcl-2를 갖는 세포에서 세포자멸사를 유도하는데 유효하지 않다(Evan, G.I. and Vousden, K.H., Nature 411:342-348, 2001)(도 1). 모스카레바 등(Moskaleva et al. Cell Biol. Int., 21(12):793-799, 1997)은 AFP-약물 접합체가 MDR을 과발현하는 다중약물 내성 암세포를 살해하는데 유효함을 입증하였으며(p-당단백질 약물 유출 펌프), 이는 AFP-약물 접합체의 수용체-매개된 세포 이물흡수가 다중약물 내성 암을 극복함을 암시한다. 본 발명에서, 세포자멸사 유도제는 p53의 하부인 미토콘드리아의 수준에서 세포자멸사를 유도하는 능력을 기준으로 선택된다. 이들 세포자멸사 유도제들은 그들의 미토콘드리아 막 투과성 및 미토콘드리아 기공 변이 및/또는 카스파제 활성화에 대한 영향을 통해, 다중약물 내성 암세포에 세포독성 효과를 이끌어낼 수 있다(도 1).
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 세포자멸사 유도제는 천연 공급원으로부터 유도된다(Pessayre et al., "Apoptosis Trigged by Natural Substances", in "Apoptosis and Its Modulation by Drugs", eds. R.G. Cameron, G. Feuer, Springer Press, 2000, pp. 86-108). 예를 들어, 베튤린산은 백자작나무(Betula alba)의 외피에서 풍부하게 발견되는 물질인 베튤린으로부터 유도된다. 본 발명에 유용한 전형적인 세포자멸사 유도제로는 비 제한적으로 탑시가진, 아트락틸로사이드, 베튤린산, CD437, 아르센 트라이옥사이드, 로테논, 피에르시딘 A 및 로니다민이 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 세포자멸사 유도제의 다른 예들은 비 제한적으로 덱사메타손, 올리고미신 B, 하이드록시클로로퀸 포스페이트, 퀘르세틴, 비타민 A, 비타민 D2 및 D3, 커큐민, 캅사이신, 및 중금속, 예를 들어 아연, 납, 구리, 니켈, 카드뮴, 및 화학요법제들을 포함하거나 또는 이들로부터 유도된다.
본 발명의 조성물을 임의의 현재 공지된 투여 방법, 예를 들어 비 제한적으로 경구 투여 형태(즉, 캡슐, 연질젤, 및 정제), 좌약, 흡입, 코 또는 눈 점적제, 붕대; 냄새 분말, 주사가능물질, 리나멘트 및 국소 제형에 의해 암세포에 전달할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 조성물을 연질젤로서 경구 투여용으로 제조한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 조성물을 주사가능물질로서 정맥내 투여용으로 제조한다.
실시예 1
PAFP 단리 및 정제
PAFP를, 간 및 돼지 태아, 양막 액 및 태반의 혈액으로부터 추출하였다. 상기 추출을 수행하는 태아 단계는 PAFP의 생물 활성(예를 들어 수용체 결합)뿐만 아니라 세포자멸사 유도제에 결합하는 그의 능력 모두에 영향을 미칠 수 있는 상기 PAFP의 동요하는 번역 후 성질로 인해 중요하다. 조기 잉태기간(3 주보다 일찍) 또는 늦은 잉태기간(14 주 초과)의 태아 물질로부터 추출한 PAFP는 3 내지 14 주 잉태기간의 태아 물질로부터 추출한 PAFP에 비해 상이하게 당화된다(Ruoslahti, E. et al., Int. J. Cancer, 22:515-520, 1978; Keel, B.A. et al., "Biological Activities of Alpha1-Fetoprotein", Boca Raton, Florida, CRC Press vol 2, pp. 24-31, 1989; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5):377-408, 2001; Parker, M.H. et al., Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004; Mizejewski, G.J., in "Monographs on Endocrinology", ed. Ulrich Westphal, Steroid-protein interactions II, Springer-Verlag, Berlin, New-York, Tokyo, 1986, pp. 320-356). 상기 상이한 당화 상태는 HAFP의 결합 성질에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 따라서 상기 태아로부터 체액의 추출 시기는 PAFP의 당화가 태아 발생 중에 변하고 상기 체액 수율이 잉태기간 14 주 후에 현저하게 감소하므로 중요하다. 이상적으로는, 돼지 태아 물질을 태아발생 3 내지 14 주째에 수거하여 추출 과정을 수행한다.
추출에 이어서, 상기 혈액 및 양막 액(이후부터 "원료 물질"이라 칭한다)을 자연 침강이 일어나도록 4 내지 10 ℃에서 12 내지 24 시간 동안 유지시켰다. 상등액을 수거하고 상이한 용기로 옮기고 후속적으로 50 kDa 멤브레인을 사용하여 한외여과에 의해 3 내지 5 회 농축시켰다. 상기 한외여과 과정 중에 온도는 15 ℃를 초과하지 않았다. 상기 농축 단계 결과 고 수율의 PAFP가 생성되었다. 이어서 부탄올을 5 내지 10%의 최종 농도로 가하였으며; 전형적으로는 부탄올의 최종 농도는 약 8%이었다. 상기 원료 물질 및 부탄올을 2 분간 교반하고 상기 혼합물을 추가로 1 분간 배양하여 상기 용액을 상부의 비 수성 상과 하부의 수성 상으로 분리할 수 있었다. 상기 결합되지 않은 PAFP를 함유하는 상부의 비 수성 상을 보류시키고 상기 혼합물로부터 잔류 부탄올을 제거하기 위해 투석 여과하였다. PAFP를 함유하는 생성 용액에, 난치성 암의 치료에 사용하기 위한 세포자멸사 유도제와의 시험관 내 결합을 수행하였다.
본 발명의 PAFP 추출 방법은 결합되지 않은 PAFP의 증가되고 보다 고도로 농축된 수율을 생성시킨다는 점에서 전통적인 AFP 추출 방법들보다 유리하다. 결합되지 않은이란 PAFP가 내생의 결합 짝에 결합하지 않은 것을 의미한다. 보다 고 농도의 결합되지 않은 PAFP의 결과로서, 관심의 세포자멸사 유도제에 결합된 PAFP의 증가된 농도가 성취될 수 있을 것으로 예상되었다.
상기 상세히 나타낸 방법들에 의해 추출된 PAFP에 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 가하였다(도 2). 2 개의 주요 단백질 밴드는 쿠마씨 젤 염색(도 2, 레인 A 및 레인 C) 시 분명하였다. 상부 밴드(대략 70 kDa)는 PAFP에 해당하며 하부 밴드(대략 67 kDa)는 알부민에 해당한다.
실시예 2
PAFP는 HAFP에 비해 유사한 결합 성질을 갖는다.
선행 연구는 PAFP가 HAFP에 비해 유사한 생물학적 성질들을 갖는지의 여부를 다루지 않았다. 상기 상세히 나타낸 방법들에 의해 추출된 PAFP를, 상기 상세히 나타낸 방법으로부터 수득한 추출에서 PAFP의 존재를 검출하기 위해 2 개의 상이한 면역-효소 키트를 사용하여 분석하였다. PAFP 샘플을 인간 혈청 및 양막 액으로부터 단리한 AFP와 비교하였다. 처음에, 샘플들에 HAFP에 대한 단클론 항체를 포함하는 멤브레인 EIA 알파-태아 단백질 시험(catalog #410-1, IND Diagnostic Inc., Vancouver, Canada)을 수행하였다. PAFP는 인간 AFP 샘플에 비해 상기 EIA 알파-태아 단백질 시험 키트와 반응을 생성시키지 않았으며, 이는 PAFP 대 인간 AFP의 화학 구조의 잠재적인 차이를 암시한다. 이어서 HAFP에 대한 다클론 항체를 포함하는 두 번째 시험 키트(catalog number T-8456, AFP-EIA-BEST-Strip, Vector-BEST, Novosibirsk, Russia)를 사용하여 상기 추출에서 PAFP의 존재를 분석하였다. 양성 반응은 인간 AFP에 대해 생성된 항체와 반응하는 PAFP의 능력을 가리켰다. 상기 면역분석 연구의 결과는 PAFP가 HAFP에 대한 항체에 의해 인식이 가능함을 암시하며, 이는 PAFP가 HAFP와 구조적으로 유사함을 시사한다.
앞서, HAFP 자체가 세포자멸사를 유도할 수 있음이 입증되었다. 종양 세포사의 유도는 AFP의 높은 생리 용량(>250 ㎎/㎖)에서 입증되었으나, 낮은 용량(<200 ㎎/㎖)에서는 입증되지 못했다(Dudich et al., Eur. J. Biochem. 266:1-13, 1999). 또한, 연구는 HAFP가 다양한 소수성 및 친수성 화합물들에 결합할 수 있음을 입증 하였다(Hirano, K., et al., Biochem. J. 231;189-191, 1985). 그러나, PAFP가 유사하게 세포자멸사 또는 다른 하부 생물 반응들을 유도할 수 있는지, 및 PAFP가 HAFP와 유사하게, HAFP에 비해 PAFP의 아미노산 서열의 차이(82% 아미노산 유사성)로 인해 다양한 작용제들에 결합할 수 있는지는 공지되지 않았다(Kim et al., Animal Genetics, 33:468-485, 2002).
쥐 암 모델에서 수행된 연구는 PAFP가 세포자멸사 유도제(예를 들어 아트락틸로사이드, 탑시가진 및 베튤린산)를 암세포에 전달하는 능력, 및 결과적으로 종양 부하를 감소시키는 능력을 입증하였다(실시예 4 및 6 참조). 이들 결과는 결과적으로 PAFP에 결합된 세포자멸사 유도제가 종양 억제 효과를 유도하는 것으로 밝혀진 인간 연구에서 반복되었다(실시예 5, 7 및 8 참조). 함께, 상기 데이터는 PAFP는 인간과 쥐 AFP 수용체 모두에 의해 인식됨을 암시한다.
실시예 3a
PAFP 및 세포자멸사 유도제의 시험관 내 결합
상기 상세히 나타낸 추출 과정으로부터 수득한 PAFP를 세포자멸사 유도제와 1 분간 결합시키고 10 내지 15 ℃에서 추가로 10 분간 배양하였다. 보다 긴 배양 기간이 허용될 수 있지만, 상기 배양 시간의 연장은 PAFP에 결합되는 작용제의 양에 관하여 현저한 이점을 제공하지 않았다. 이어서 상기 PAFP - 세포자멸사 유도제 혼합물에, 원료 물질 수거 중 선행의 추출 단계들에서 생물학적 완충제로서 사용된 작은 분자 및 다른 불순물들, 예를 들어 염을 제거하기 위해 50 kDa 멤브레인을 사용하는 한외여과 및 투석여과 단계를 수행하였다. 상기 투석여과 단계는 남 아있는 결합되지 않은 세포자멸사 유도제의 제거를 추가로 지원하였다. 상기 체류물은 후속 단계들에 유용한 PAFP - 세포자멸사 유도제 혼합물을 함유하였다.
최종 여과 단계를 상기 생성 용액의 여과 멸균을 위해 0.22 마이크론 멤브레인을 사용하여 수행하였다. 상기 혼합물 중에 알부민이 남았지만 이는 본 발명 조성물의 효능을 방해하지 않는다.
생성 용액을 완전히 동결될 때까지 -45 ℃에서 플래시 동결시켰다. 이어서 상기 PAFP - 세포자멸사 유도제 조성물을 상기 층이 완전히 건조될 때까지 동결 건조기를 사용하여 건조시켰다. 이어서 상기 동결 건조된 PAFP - 세포자멸사 유도제 조성물을 분말 온도가 35 ℃를 초과하지 않도록 하면서 미세 입자로 분쇄하였다. 상기 조성물의 다양한 제제 또는 전달 시스템 내로의 혼입을 촉진하기 위해서 80 메쉬 이하의 분말을 수득하였다. 상기 분말 중의 PAFP의 정확한 양은 HPLC- 또는 PAAG-전기영동 데이터를 사용하여 계산할 수 있다.
실시예 3b - PAFP - 아트락틸로사이드
35 g/L의 최종 총 단백질 농도 및 대략적으로 21 g/L의 PAFP를 갖는 PAFP 체류물 1 리터를 1:1 몰 비의 PAFP:악트락틸로사이드를 성취하기 위해서 물 50 ㎖에 용해된 아트락틸로사이드(MW = 803) 250 ㎎과 합하였다. 상기 용액을 4 내지 15 ℃에서 10 분간 혼합하고 이어서 한외여과하고 2 내지 3 부피의 물로 투석 여과하였다. 최종 용액 1 리터를 동결 건조시켜 PAFP-아트락틸로사이드 조성물을 제조하였다.
실시예 3c - PAFP - 탑시가진
8 g/L의 총 단백질 농도 및 대략적으로 1.7 g/L의 PAFP를 갖는 PAFP 체류물 1/2 리터를 1:1 몰 비의 PAFP:탑시가진을 성취하기 위해서 알콜 10 ㎖에 용해된 탑시가진(MW = 650) 10 ㎎과 합하였다. 상기 용액을 15 내지 25 ℃에서 30 분간 혼합하고 이어서 한외여과하고 2 내지 5 부피의 물로 투석 여과하였다. 최종 용액 200 밀리리터를 동결 건조시켜 PAFP-탑시가진 조성물을 제조하였다.
실시예 3d - PAFP - 베튤린산
20 g/L의 총 단백질 농도 및 대략적으로 14 g/L의 PAFP를 갖는 PAFP 체류물 2 리터를 1:1 몰 비의 PAFP:베튤린산을 성취하기 위해서 적가된 DMSO 100 ㎖에 용해된 베튤린산(MW = 456) 500 ㎎과 합하였다. 상기 용액을 25 내지 37 ℃에서 10 분간 혼합하고 이어서 투석여과하였다. 최종 용액 1 리터를 동결 건조시켜 PAFP-베튤린산 조성물을 제조하였다.
실시예 4
생체 내 쥐 백혈병 모델: PAFP + 세포자멸사 유도제는 종양 세포 접종 24일 후 상기 마우스에서 종양 세포를 살해한다.
DBA2 주 마우스를, 앞서 AFP 수용체를 발현하는 것으로 입증된(Severin et al., Dokl. Acad. Nauk, 366(4):561-564, 1999; Moro-Vidal, R., Curex Technologies Inc., www.biocurex.com), 20,000 개의 P-388 쥐 백혈병 세포로 몸통 쪽에 피하 접종하였다. 모든 동물들이 접종 후 생존하였다. 10 마리 마우스 각각에 대해 하기의 1일 처리 중 하나를 수행하였다:
1-제제 A(PAFP - 아트락틸로사이드 조성물)
2-제제 T(PAFP - 탑시가진 조성물)
3-제제 S(비장 추출물)
4-제제 A + S
5-제제 T + S
6-대조용 오일
7-대조용 물
10 마리의 마우스로 이루어진 각각의 그룹에 P-388 세포 접종 후의 날짜인 제 2 일에 시작하여 오일 전달 비히클 중의 상기 지시된 처리의 1일 0.2 ㎖ 경구 투여량을 제공하였다. 상기 동물들을 접종 후 24일째에 종양 성장에 대해 평가하였다. 결과를 표 2에 요약한다.
처리 그룹 생존률%(24일) 평균 종양 크기(㎤)
1-PAFP-아트락틸로사이드 조성물, 0.02 ㎎/일(제제 A) 90% 0.92 +/- 1.17
2-PAFP-탑시가진 조성물, 0.08 ㎎/일(제제 T) 80% 1.33 +/- 0.68
3-비장 추출물, 4.0 ㎎/일(제제 S) 70% 2.97 +/- 2.62
4-제제 A + S (0.02 ㎎A + 4.0 ㎎S) 40% 4.17 +/- 0.65
5-제제 T + S (0.08 ㎎T + 4.0 ㎎S) 20% 5.59 +/- 3.36
6-대조용 오일 10% 6.34
7-대조용 물 0% 측정하기 위한 살아있는 동물 없음
마우스의 측부에 피하 접종하고 접종 후 1일째에 시작하여 지시된 바와 같이 매일 처리한 P-388 림프구성 백혈병 세포 주의 성장을 도 3에 나타낸다.
결과:
1. 그룹 1(PAFP - 아트락틸로사이드) 및 그룹 2(PAFP - 탑시가진) 동물에서 종양의 성장은 접종 후 24일째에 대조군 6(오일)에 비해 평균 각각 79% 및 53%까지 억제되었다. 접종 후 22일째에, 상기 종양의 성장은 대조군 7(물)에 비해 평균 각각 85% 및 79%까지 억제되었다.
2. 생존률은 각 그룹의 10 마리 동물의 50%(예를 들어 5 마리 동물)가 살아있는 경우를 측정하였다. 그룹 1 동물(PAFP-아트락틸로사이드 조성물을 투여하였다)에서 50% 생존률(30 일)은 대조용(그룹 7)으로서 물을 제공한 동물의 생존률(21 일)에 비해 1.4 배 증가하였다. 그룹 2 동물(PAFP-탑시가진 조성물을 투여하였다)에서 50% 생존률(27 일)은 대조용 동물에 비해 1.28 배 증가하였다(도 4).
3. 접종 후 38일째에, PAFP-아트락틸로사이드("제제 A") 매일 처리를 제공한 10 마리의 마우스 중 3 마리가 여전히 살아있었으며 PAFP-탑시가진("제제 T")을 투여한 10 마리의 마우스 중 한 마리가 살아있었다(도 4). 물 대조군 중의 모든 마우스는 24일까지 사망한 반면 오일 대조군 중의 모든 마우스는 25일까지 사망하였다.
4. "제제 A"의 매일 처리가 제공된 접종 후 38일째에 여전히 살아있는 3 마리의 마우스 중 하나에서, 종양 퇴행이 관찰되었다(표 3).
접종후 일수 13 15 17 20 22 24 38
종양크기(㎤) 0 0.05 0.05 0.05 0.03 0.01 *ND
*ND = 측정 안됨
유사한 종양 성장 퇴행이, AFP가 공유적으로 접합된 항생제 에스페라미신 A1에 대한 전달 비히클로서 상기 AFP를 사용하여 세베린(Severin) 등에 의해 입증되었다(Severin, S.E. et al., Dokl, Akad. Nauk. 366(4):561-4, 1999).
결론:
1. 상기 입증된 농도에서 각각 PAFP-아트락틸로사이드 및 PAFP-탑시가진으로 구성된 "제제 A" 및 "제제 T"는 종양 성장을 억제하였다.
2. PAFP에 결합된 세포자멸사 유도제 아트락틸로사이드 및 탑시가진의 투여는 백혈병 쥐 모델에서 생존을 연장하였다.
실시예 5
시험관 내 데이터 - 종양: PAFP-아트락틸로사이드 조성물은 인간에서 종양 세포를 살해한다
각 담당 의사들에 의해 암 진행이 IV 기로 분류된 8 명의 환자에게 1 개월 동안 매일 캡슐 형태의 PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 경구 투여량(2 내지 6 캡슐)을 투여하였다. 이어서 이들 환자의 진행이 추가로 4 개월 동안 이들의 각 담당의사에 의해 추적되었다. 상기 환자들 자신은 향상된 삶의 질을 기록하였다. 상기 환자들에 대해 수행된 CT 스캔에 따르면, 상기 PAFP-아트락틸로사이드 처리를 제공받은 환자들은 원발 종양의 성장 속도의 감소, 일부의 경우 상기 원발 종양 크기의 감소뿐만 아니라 전이 정도의 감소를 경험하였다. 상기 초기 인간 연구의 결론은 하기와 같다:
1. 2 내지 6 캡슐의 1일 용량의 PAFP-아트락틸로사이드 생성물(전분 및 오일 전달 비히클 중의)의 경구 복용은 안전하며 상기 처리기간 동안 최소의 부작용과 관련되는 것으로 밝혀졌다.
2. 원발 및 전이 종양 크기뿐만 아니라 상기 전이 부위 통증의 감소는 PAFP-아트락틸로사이드 생성물의 특이적인 항암 작용을 입증하였다.
3. 신체 활동 및 일반적인 행복에 대해 환자가 묘사한 향상에 의해 측정된 삶의 질의 현저한 개선이 상기 PAFP-아트락틸로사이드 조성물을 단독으로 또는 다른 약물과 함께 투여한 환자에서 관찰되었다.
4. 상기 데이터는 원발 및 전이 종양 덩어리 모두에 대해 관찰된 감소에 의해 측정된 바와 같이 PAFP-아트락틸로사이드 조성물을 투여한 환자에서 용량-의존성 반응을 나타내었다.
5. PAFP-아트락틸로사이드의 투여는 상기 용량의 증가에 따라 급성 면역 반응(체온, 종양/전이 부위에서의 국소 통증의 증가)을 단지 드물게 수반하였다.
6. 상기 PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여에 대한 IV 기 암 환자의 종양 부하 감소는 상기 조성물을 경구로 생체이용할 수 있음을 암시하였다.
실시예 6
생체 내 데이터 - 백혈병: 시험관 내에서 제 1 세포자멸사 유도제 및 제 2 세포자멸사 유도제에 가역적으로 결합한 외부 PAFP를 포함하는 조성물은 마우스에서 종양 세포를 살해한다
매일 처리는 하기로 이루어졌다:
1-대조용 물
2-대조용 오일
3-시험관 내에서 제 1 세포자멸사-유도제(베튤린산)에 결합된 PAFP(PAFP - 베튤린산 조성물)
4-추가의, 결합되지 않은 베튤린산과 함께, 시험관 내에서 제 1 세포자멸사-유도제(베튤린산)에 결합된 PAFP(PAFP - 베튤린산 조성물)
마우스에게 제 1 일에 20,000 개의 P-388 쥐 백혈병 세포를 접종하고 제 2 일에 0.2 ㎖의 물(1) 또는 오일(2) 대조용 처리 또는 0.2 ㎖ 투여량의 시험 제제 3 또는 4의 1일 경구 투여량을 투여하였다. 실험은 각 처리 그룹에 10 마리의 마우스를 포함하도록 디자인하였다. 도 5는 물(1), 오일(2), PAFP-결합된 베튤린산(3) 또는 추가의, 결합되지 않은 베튤린산과 결합된 PAFP-결합된 베튤린산(4)의 1일 경구 투여량들 중 하나를 제공받은 동물에서 시간의 함수로서 P-388 백혈병 세포의 성장 그래프를 나타내며, 이때 나중의 두 제제는 각각 오일 0.2 ㎖에 현탁된다.
그룹 4 처리는 과잉의 베튤린산을 DMSO에 0.5 ㎎/㎖로서 용해시키고, 이어서 상기 용액 2 ㎕(1 ㎍)를 PAFP-결합된 베튤린산 제제 0.2 ㎖에 가하여 제조하였다. 일단 상기 PAFP-결합된 베튤린산이 종양 세포에 전달되면, PAFP는 세포 외로 재순환되어 상기 외부 PAFP가, I125-표지된 AFP가 종양 림프구 세포주에 의해 세포이물흡수되고 상기 세포로부터 방출되어 실제적으로 분해됨을 입증한 시험관 내 연구의 결과를 근거로 후속의 종양 세포로의 전달을 위한 종양 미세환경 하에서 상기 과잉의 베튤린산에 결합할 수 있게 되는 것으로 가정된다(Torres et al., Int. J. Cancer 47(1):110-117, 1991).
베튤린산(BA)은 악성 흑색종의 치료에 사용되어 왔으나(미국 특허 출원 공보 제 2003/0186945), 큰 용량의 BA가 요구된다(매일 0.2 내지 500 ㎎). PAFP를 BA와 1:2의 몰 비로 혼합하며, 이때 상기 조성물은 인간의 경우, 담체로서 작용하는 오일 0.2 ㎖ 중 0.6 ㎎의 양으로 존재한다. 중량 비에서, 베튤린산은 0.008 ㎎의 1일 용량으로 존재한다. PAFP와의 복합체의 경우, 베튤린산은 마이크로그램 농도로 인간에서 유효한 것으로 밝혀졌다. 보이크(Boik)(Natural Compounds in Cancer Therapy, 2001)는 인간 용량으로부터 등가의 쥐 경구 용량을 계산하기 위해서 하기 식을 제공한다: 인간 용량(g/㎏) = 마우스 용량(㎎/㎏)/104. 체중 75 ㎏의 인간 및 중량 0.02 ㎏의 마우스는: 0.0006 g(인간 용량) x 104 = 마우스 용량(㎎/㎏) = 0.0624 ㎎/㎏을 제공한다. 0.02 ㎏ 마우스의 경우, 상기 용량은 0.0624 ㎎/㎏ x 0.02 ㎏ = 0.01248 ㎎ 또는 12 ㎍으로서 계산될 수 있다. 인간 용량으로부터 쥐 용량을 계산하기 위한 계수는 600 ㎍(인간 1일 용량)/12 ㎍(마우스 1일 용량) = 50이다. 과잉의 제 2 세포자멸사 유도제를 상기 용량에 포함시키는 경우, 상기 제 2 세포자멸사 유도제를 나중에 오일 현탁액 형태로 상기 제 1 복합체(PAFP/제 1 세포자멸사 유도제)의 이미 제조된 오일 현탁액에 가한다. 예를 들어, 전형적인 쥐 용량은 오일 0.05 ㎖과 혼합되고 오일 0.2 ㎖의 최종 부피로 오일 중에 용해된 베튤린산 0.15 ㎎과 배합된 건조 형태의 PAFP-베튤린산 복합체 7 ㎍으로 이루어진다.
과잉의 베튤린산 부재 하의 PAFP-결합된 베튤린산을 제공받은 동물(그룹 3)의 종양 부피와, 과잉의 베튤린산과 함께 PAFP-결합된 베튤린산을 제공받은 동물(그룹 4)의 종양 부피의 비교는 후자의 처리가 감소된 종양 부피를 생성시켰음을 나타낸다. 상기 결과는 PAFP-결합된 베튤린산과 과잉의 결합되지 않은 베튤린산과의 조합이 치료 이점을 가중시킴을 시사한다. 상기 데이터는 또한 PAFP에 결합할 수 있는 세포자멸사 유도제를 사용하여, 1) 세포자멸사 유도제와 결합된 PAFP의 종양 세포에의 전달 및 2) 생체 내에서 PAFP에 결합할 수 있는 추가의, 제 2 세포자멸사 유도제의 후속 전달에 의해 악성 종양(그의 세포는 AFP 수용체를 발현한다)을 치료하여 치료 결과를 개선시킬 수 있음을 시사한다.
상기 결과는 상기 PAFP-결합된 베튤린산 제제 중의 과잉의, 결합되지 않은 베튤린산의 포함이 PAFP-결합된 베튤린산 단독보다 종양 성장의 감소에 더 유효함을 입증한다. 더욱 또한, 상기 데이터는 본 발명 조성물 중에 제 2 세포자멸사 유도제를 사용함에 있어서 치료 이점을 암시한다.
실시예 7
생체 내 데이터 - 종양: 인간 환자에서 고형 종양 유형의 암을 살해하기 위해 사용되는 시험관 내 제 1 화합물 및 제 2 화합물에 가역적으로 결합된 외부 PAFP를 포함하는 조성물.
전이가 있거나 없는, 고형 종양이 있는 5 명의 환자(여성 4 명 및 남성 1 명)에서 예비 결과:
환자 #1: 여성, 57 세, 국소적인 유방암
환자 #2: 여성, 63 세, 뼈로 전이된 유방암
환자 #3: 여성, 44 세, 난소 유방암이 있음
환자 #4: 여성, 60 세, 림프절로 전이된 유방암
환자 #5: 남성, 58 세, 고환암
상기 연구의 목적은 수술 불가능하거나, 기존의 치료에 부반응성이거나, 수술 후 재발된 것으로서 분류된 고형 유형의 암이 있는 환자에서 PAFP-베튤린산 조성물에 대한 반응을 평가하는 것이었다.
상기 환자들은 공복에 2 개(하나는 아침에, 하나는 자기 전에)의 연질젤 1일 투여량을 복용하였다. 각각의 연질젤은 PAFP-베튤린산 생성물(즉 시험관 내에서 외부 PAFP에 가역적으로 결합된 베튤린산) 및 과잉의 베튤린산(즉 PAFP에 결합되지 않은 추가의 베튤린산)을 포함하였다. 상기 PAFP-베튤린산 생성물을 연질젤 당 PAFP 300 ㎍ 및 베튤린산 6 ㎍의 1 회 단위 투여량으로 제공하였다. 상기 과잉 또는 추가의 베튤린산은 연질젤 당 150 ㎍으로서 존재하였다.
상기 예비 결과는 5 명의 환자 중 4 명이 암 진행 속도의 감소, 및 감소된 통증, 개선된 에너지 수준 및 증가된 식욕을 보고한 환자에 의해 측정된 바와 같이 전반적으로 보다 양호한 삶의 질을 나타냄을 보였다. 상기 환자들은 상기 연질젤 치료와 관련된 어떠한 부작용도 보고하지 않았다.
실시예 8
생체 내 데이터 - 인간 환자에서 전이성 종양 부피의 감소
본 연구의 목적은 고형 종양의 치료에서 PAFP-아트락틸로사이드 복합체의 치료 이점을 평가하는 것이었다. 상기 연질젤을 전이성 질병이 있는 환자에게 공복에 매일 2 캡슐(하나는 아침에 하나는 자기 전에), 경구 투여하였다.
13 명의 환자를 평가하였다. 12 명의 환자가 결장암으로 진단되었고 한 명의 환자는 유방암으로 진단되었다. 각 환자들은 적어도 하나의 부위에서 전이성 질병을 나타내었다. 7 명의 환자는 여성이었고 6 명은 남성이었으며, 연령은 각각 45 내지 65 세의 범위였다.
각 환자에게 4 내지 8 주간 매일 2 캡슐(캡슐당 0.3 ㎎ PAFP + 0.006 ㎎ 아트락틸로사이드)의 투여량으로 상기 PAFP-결합된 세포자멸사 유도제(CPA란 이름 하에)를 투여하였다. 컴퓨터 단층촬영(CT)(Siemens, 16 층) 스캔을 상기 처리 전후에 수행하였다.
하기는 상기 연구의 결과이다. CT 스캔 데이터를 근거로, 환자 반응을 하기 중 하나로서 분류하였다:
완전: 명백한 전이가 없음
부분: 하나 이상의 전이가 사라졌거나 크기가 감소됨
안정: 안정화에 대한 세계 보건 기구 표준 내의 전이 성장(25% 미만의 성장)
진행: 전이 크기가 증가(25% 초과)하거나 신체 상태가 악화됨
중단: 부작용이 상기 치료를 중단시킴
상기 환자 데이터의 요약을 표 4에 제공한다. 처리 전후에 촬영한 CT 스캔을 환자 P. 및 P.N.G.에 대해 도 6 및 7에 제공하며, 이들은 각각 상기 처리에 대해 완전 반응을 나타내었다.
환자 성별 연령(세) 종양 선행 치료 반응
P 남성 56 결장 선암종 종양 절제 완전
P.N.G. 남성 62 결장 선암종 종양 절제 완전
A.N.A. 여성 48 결장 선암종 화학요법 부분
A.N.P. 여성 63 결장 선암종 우측 반결장절제; 화학요법 부분
S.V.A. 여성 45 결장 선암종 좌측 반결장절제; 부분
Z.T.P. 여성 49 유방 암종 유방절제; 국부림프절의 방사선요법 안정
G.N.K. 여성 62 결장 선암종 종양 절제 안정
P.A.G. 남성 65 결장 선암종 화학요법 안정
B.L.N. 여성 57 결장 선암종 종양 절제 진행
K.A.R. 남성 52 결장 선암종 화학요법 진행
K.V.I. 남성 48 결장 선암종 화학요법 진행
P.A.V. 남성 65 결장 선암종 종양 절제; 화학요법 진행
R.D.P. 여성 62 결장 선암종 종양 절제 중단
완전한 환자 정보는 하기와 같다:
환자: P.
성별: 남성. 연령: 56 세
임상 진단: 결장암(T2 N0 M0) 선암종(2005년 1월 21일로부터 B-123256-68)
선행 치료: 수술(종양 절제) - 2005년 1월 15일
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 5월 - 진행: 1 개의 간 전이(Mts)(13 x 15 ㎜)(2006년 5월 15일로부터 CT)
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 5월 5일 - 2006년 7월 15일
치료 결과: 간 전이 없음(2006년 8월 2일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 80%
부작용: 없음
결론: 완전 반응. 전이 사라짐.
환자 P의 경우, 치료 전(좌측) 및 치료 후(우측) 취한 CT 스캔(도 6)의 비교는 치료 후 더 이상 전이(화살표)가 뚜렷하지 않음을 보인다.
환자: P.N.G.
성별: 남성. 연령: 62 세
임상 진단: 결장암(T2 N0 M0), 선암종(2005년 9월 1일로부터 O-1045-48)
선행 치료: 수술(종양 절제, 좌측) - 2005년 8월
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 5월 - 진행: 1 개의 간 전이: 7 x 10 ㎜(2006년 5월 20일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 10일 - 2006년 7월 22일
치료 결과: 간 전이 없음(2006년 8월 16일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 완전 반응. 전이(7 x 10 ㎜) 사라짐.
환자 P.N.G.의 경우, 치료 전(좌측) 및 치료 후(우측) 취한 CT 스캔(도 7)의 비교는 치료 후 더 이상 전이(화살표)가 뚜렷하지 않음을 보인다.
환자: A.N.A.
성별: 여성. 연령: 48 세
임상 진단: 결장암(T3a N1 M1), 전이: 1(간), 선암종(2005년 9월 25일로부터 B-1167-75)
선행 치료: 수술 없음; 화학요법(엘록사틴, 알림타), 2005년 10월 - 2006년 2월; 종양 성장의 안정화
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 5월 - 진행: 간 전이(좌측 엽): 25 x 27 ㎜(2006년 5월 28일로부터 CT) 삶의 질(Karnofsky Index) = 80%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 10일 - 2006년 8월 12일
치료 결과: 간 전이(좌측 엽): 16 x 11 ㎜(2006년 8월 21일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 부분 반응: 전이 감소
상기 CT 스캔은 매일 2 회 용량의 PAFP-아트락틸로사이드 조성물을 제공받은 환자의 간에서 결장 암종 전이 크기의 73%(25 x 27 = 675, 16 x 11 = 176, 675-176 = 499, 499/675 = 73.9%) 감소를 보인다.
환자: A.N.P
성별: 여성. 연령: 63 세
임상 진단: 결장암(T3 N0 M0), 선암종(2005년 1월 14일로부터 O-1117-29)
선행 치료: 수술(우측 반결장절제) - 2004년 12월
2005년 8월 - 진행. 화학요법 - 엘록사틴, 젤로다, 5-FU; 부분 반응
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 5월 - 진행, Retzidiv: 3 개의 간 전이: 21 x 28 ㎜, 27 x 29 ㎜, 10 x 12 ㎜(2006년 5월 17일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 70 - 80%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 5일 - 2006년 7월 30일
치료 결과: 2 개의 간 전이: 21 x 28 ㎜, 27 x 29 ㎜(2006년 8월 8일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 부분 반응: 간 전이 중 하나(10 x 12 ㎜) 사라짐.
환자: S.V.A.
성별: 여성. 연령: 45 세
임상 진단: 결장암(T2 N1 M0) 선암종(2004년 3월 25일로부터 O-1135-42)
선행 치료: 수술(좌측 반결장절제) - 2005년 3월
2006년 5월 - 증상 치료
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 4월 - 진행: 3 개의 간 전이: 45 x 65 ㎜, 26 x 42 ㎜, 7 x 9 ㎜(2006년 4월 26일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 80%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 29일 - 2006년 7월 24일
치료 결과: 2 개의 간 전이: 42 x 55 ㎜, 26 x 42 ㎜(2006년 8월 3일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 부분 반응: 1 개의 전이 제거됨(7 x 9 ㎜), 2 개의 전이 안정화됨.
환자: Z.T.P.
성별: 여성. 연령: 49 세
임상 진단: 유방암(T3b N1 M0)
선행 치료: 수술(유방절제) - 2004년 12월; 방사선요법(림프절 부위); 탁소테레에 의한 치료; 안정화
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 7월 - 진행. 1 개의 간 전이: 67 x 69 ㎜(2006년 7월 18일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 8월 5일 - 2006년 9월 2일
치료 결과: 1 개의 간 전이: 68 x 66 ㎜(2006년 8월 30일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 안정화.
환자: G.N.K.
성별: 여성. 연령: 62 세
임상 진단: 결장암(T2 N0 M0), 선암종(2005년 6월 14일로부터 O-1086-92)
선행 치료: 수술(우측 종양 절제) - 2005년 6월
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 6월 - 진행: 2 개의 간 전이: 8 x 6 ㎜, 6 x 6 ㎜(2006년 6월 10일로부터 CT) 삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 7월 1일 - 2006년 9월 2일
치료 결과: 2 개의 간 전이: 8 x 6 ㎜, 6 x 6 ㎜(2006년 9월 15일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 안정화.
환자: P.A.G.
성별: 남성. 연령: 65 세
임상 진단: 결장암(T2 N0 M0). 선암종(2005년 9월 25일로부터 O-1256-65)
선행 치료: 수술 - 2005년 9월.
2005년 12월 - 진행; 간 전이.
5 회 과정의 화학요법: 5-FU
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 6월 - 진행: 2 개의 간 전이: 32 x 24 ㎜, 32 x 26 ㎜(2006년 6월 14일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 19일 - 2006년 8월 13일
치료 결과: 2 개의 간 전이: 32 x 24 ㎜, 32 x 26 ㎜(2006년 8월 22일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 안정화.
환자: B.L.N.
성별: 여성. 연령: 57 세
임상 진단: 결장암(T3b N0 M0) 선암종(2006년 1월 14일로부터 O-1245-61)
선행 치료: 수술(우측 종양절제) - 2005년 12월
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 6월 - 진행: 간 전이: 18 x 12 ㎜(2006년 6월 19일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 7월 2일 - 2006년 8월 27일
치료 결과: 간 전이: 22 x 18 ㎜(2006년 9월 4일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 진행. 전이가 25% 초과하여 증가함.
환자: K.A.R.
성별: 남성. 연령: 52 세
임상 진단: 결장암(T3b N1 M1-Hep.), 선암종(B-1189-96)
선행 치료: 수술 없음. 화학요법 - 엘록사틴(2005년 12월 - 2006년 2월). 안정화
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 6월 - 진행: 1 개의 간 전이: 118 x 85 ㎜(2006년 6월 19일로부터 CT) 삶의 질(Karnofsky Index) = 60 - 70%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 26일 - 2006년 8월 27일
치료 결과: 1 개의 간 전이: 118 x 85 ㎜(2006년 6월 19일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 40 - 50%
저녁에 발열. 걸을 수 없음.
부작용: 구토, 오심
결론: 임상 진행. 전이 - 동적이 아님(안정화).
환자: K.V.I.
성별: 남성. 연령: 48 세
임상 진단: 결장암(T3b N1 M1-Hep.), 선암종(B-1245-50)
선행 치료: 수술 없음. 화학요법 - 엘록사틴(2005년 10월 - 11월).
부분 반응
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 5월 - 진행: 1 개의 간 전이: 19 x 9 ㎜(2006년 5월 16일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 5일 - 2006년 7월 30일
치료 결과: 1 개의 간 전이: 28 x 32 ㎜(2006년 8월 8일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 진행.
환자: P.A.V.
성별: 남성. 연령: 65 세
임상 진단: 결장암(T3a N0 M0), 선암종(2005년 2월 12일로부터 O-1212-34)
선행 치료: 수술(종양 절제) - 2005년 2월.
2005년 10월 - 진행; 간 전이
2005년 10월 - 11월 - 화학요법(엘록사틴) - 부분 반응
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 6월 - 진행: 2 개의 간 전이: 7 x 8 ㎜ 및 5 x 6 ㎜(2006년 6월 6일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월 5일 - 2006년 8월 6일
치료 결과: 2 개의 간 전이: 12 x 9 ㎜ 및 6 x 8 ㎜(2006년 8월 7일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
부작용: 없음
결론: 진행.
환자: R.D.P.
성별: 여성. 연령: 62 세
임상 진단: 결장암(T2 N1 M0), 선암종(2004년 9월 29일로부터 O-1187-48)
선행 치료: 수술(종양 절제, 좌측) - 2004년 9월
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여 전:
2006년 5월 - 진행: 2 개의 간 전이: 65 x 85 ㎜ 및 46 x 22 ㎜, 융합되는 경향이 있음(2006년 5월 14일로부터 CT)
삶의 질(Karnofsky Index) = 90%
PAFP-아트락틸로사이드 조성물의 투여: 2006년 6월
치료 결과: 측정 안됨
부작용: 구토, 오심; 진토제에 의해 억제되지 않음
결론: 부작용(구토, 오심)으로 인해 치료 중단함.
본 연구에서 치료되는 암의 진행 단계를 고려할 때, CPA의 1일 투여량이 투여된 13 명 환자의 결과는 61%(8/13)가 반응을 나타내었다. 반응은 전이 덩어리가 치료 후 검출될 수 없거나(15%, 2/13), 하나 이상의 전이 덩어리가 제거되거나 또는 크기 감소되거나(23%, 3/13), 또는 전이 성장에서 진행이 관찰되지 않음(안정화, 23%, 3/13)을 의미한다.
4 명의 환자는 질병의 진행을 경험하였고(31%) 한 명(8%)은 부작용(구토, 오심)으로 인해 상기 연구로부터 배제되었다. 주 연구자는 상기 부작용이 상기 치료와 직접 관련된 것인 지를 결정할 수 없었으며 이는 간 중의 초기 전이 크기(65 x 85 ㎜ 및 46 x 22 ㎜, 융합되는 경향이 있음)가 영향을 미칠 수 있었음을 암시한다.
상기 생성물의 복용과 직접 관련지을 수 없는 한 가지 구토 사례를 제외하고 심각한 부작용은 보고되지 않았다.
환자 A.N.A. 및 A.N.P.는 각각 엘록사틴/알림타, 및 엘록사틴/젤로다/5-FU로 치료 후 나타난 다중 약물 내성 전이가 있었다. PAFP-아트락틸로사이드 조성물 치료 후, 상기 환자들은 전이성 종양 크기의 감소를 나타내었다. 이러한 데이터는 생체 내에서 다중약물 내성을 극복하는 상기 PAFP-아트락틸로사이드 복합체의 능력을 지지한다.
상기는 본 발명의 몇몇 태양들의 특정 예들이다. 변경 및 변화를 포함하여, 다수의 다른 실시태양들도 또한 가능하며 이들은 본 원에 개시된 바와 같은 본 발명을 고찰할 때 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 따라서, 모든 적합한 변경, 변화 및 등가물들이 본 원에 개시된 본 발명의 범위 및 첨부된 청구의 범위에 따를 수 있으며 상기와 같은 변경, 변화 및 등가물을 이들 범위 내에 포함시키고자 한다.
참고문헌
Figure 112008041427370-PCT00001
Figure 112008041427370-PCT00002
Figure 112008041427370-PCT00003
Figure 112008041427370-PCT00004

Claims (14)

  1. 외부 알파-태아 단백질(AFP); 및
    미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제
    의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물로서, 여기에서 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제가 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하는 2 개의 세포자멸사 유도제가 존재하는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포자멸사 유도제가 아트락틸로사이드, 베튤린산, 탑시가진, 로테논, 피에리시딘 A, 로니다민, CD437, 아르센 트라이옥사이드, A23187, 이오노미신, 비타민 D2 및 D3, 덱사메타손 및 액쿠탄을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물의 AFP가 세포 표면상의 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 세포에 특이적으로 결합하는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AFP가 돼지 AFP인 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 돼지 AFP가 약 3 내지 약 14 주 잉태기간의 돼지 태아로부터 추출되는 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구투여용 캡슐, 연질젤 또는 정제; 좌약; 주사가능물질; 흡입 제형; 코 점적제; 점안제; 붕대; 리나멘트제; 또는 국소 제형의 형태인 조성물.
  8. 미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제를, 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 포유동물의 암 세포에 전달하기 위한 외부 AFP의 용도로서, 이때 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제가 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP가 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합하는 용도.
  9. 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 포유동물의 암 세포에 하나 이상의 세포자멸사 유도제의 표적화된 전달을 위한 약제의 제조에서
    외부 알파-태아 단백질(AFP); 및
    미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제
    의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물의 용도로서, 이때 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제가 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP가 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합하는 용도.
  10. 포유동물에서 암 세포의 증식을 억제하기 위한,
    외부 알파-태아 단백질(AFP); 및
    미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제
    의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 암 세포가 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 가지며, 이때 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제가 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP가 상기 세포 표면상의 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합하는 용도.
  11. 난치의 악성 종양에서 다중약물 내성을 치료하기 위한,
    외부 알파-태아 단백질(AFP); 및
    미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제
    의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 난치의 악성 종양이 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 암 세포를 포함하고, 이때 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제가 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP가 상기 세포 표면상의 상기 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합하는 용도.
  12. 포유동물에서 암 세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 암세포가 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖고, 이때 상기 방법이 포유동물에게 치료 유효량의
    외부 알파-태아 단백질(AFP); 및
    미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제
    의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하며, 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제가 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP가 상기 세포 표면상의 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합하는 방법.
  13. 난치의 악성 종양에서 다중약물 내성을 치료하는 방법으로서, 상기 난치의 악성 종양이 세포 표면상에 하나 이상의 AFP 수용체를 갖는 암세포를 포함하고, 상기 방법이 포유동물에게 치료 유효량의
    외부 알파-태아 단백질(AFP); 및
    미토콘드리아 막 투과제, 미토콘드리아 기공 개방 유도제, 이오노포어, 카스파제 9 활성화제, 카스파제 3 활성화제 및 레티노이드를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포자멸사 유도제
    의 비 공유 복합체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하며, 이때 상기 하나 이상의 세포자멸사 유도제가 상기 외부 AFP에 가역적으로 결합하고, 상기 외부 AFP가 상기 세포 표면상의 하나 이상의 AFP 수용체에 특이적으로 결합하는 방법.
  14. (a) 약 3 내지 약 14 주 잉태 기간의 돼지 태아로부터 혈액 및 양막 액을 수거하고;
    (b) 상기 (a)에서 수거한 혈액 및 양막 액을 상등액과 침전물로 분리하고;
    (c) 상기 (b)로부터 생성된 상등액을 수거하고;
    (d) 상기 (c)로부터 생성된 상등액을 농축시켜 농축된 용액을 제조하고;
    (e) 부탄올을 상기 (d)의 농축된 용액에, 용액 중 부탄올 약 5 내지 약 10%의 최종 농도로 가하고;
    (f) 상기 (e)로부터 생성된 부탄올 용액을 교반하고;
    (g) 상기 (f)로부터 생성된 부탄올 용액을 상부 비 수성 상과 하부 수성 상으로 분리시키고;
    (h) 상기 (g)로부터 생성된 비 수성 상을 수거하여 결합되지 않은 돼지 AFP를 함유하는 최종 용액을 제조하는
    연속 단계들을 포함하는, 부탄올을 사용하여 원료 물질로부터 돼지 AFP를 추출하는 방법.
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