JP2009515909A - 癌治療のためのアルファフェトプロテインおよびアポトーシス誘導剤の組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アルファフェトプロテイン(AFP)を備える新規組成物、および多剤耐性を伴う、または伴わないアルファフェトプロテイン受容体(AFPR)を発現する悪性新生物を予防、治療、または抑制するための方法に関する。外因性AFPと、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物であって、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合する、組成物を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本出願書は、内容がその全体において参照することにより本願に組み込まれる、米国特許第11/274,906号からの優先権を請求する。
(発明の技術分野)
本発明は、医学の分野、具体的には腫瘍学に関する。本発明は、アポトーシス誘導剤に結合するAFPを備える、哺乳類における悪性細胞増殖を治療、予防、および抑制するための新規組成物および方法を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。
本発明は、医学の分野、具体的には腫瘍学に関する。本発明は、アポトーシス誘導剤に結合するAFPを備える、哺乳類における悪性細胞増殖を治療、予防、および抑制するための新規組成物および方法を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。
(発明の背景)
アルファフェトプロテイン(AFP)は、シャトルの役割を果たし、3〜5日の半減期を有する、胎児中の主要な運搬体タンパク質である(非特許文献1;非特許文献2中)。AFPの発現は、発生期間に厳重に調節されるため、検出可能なレベルのAFP発現は、発生段階に左右されるところが大きい。研究によって、AFPが個体発生成長および腫瘍進行の両方の期間に成長調節因子の役割を果たすことを確証してきた。発生および腫瘍形成期間にAFPが発現することから、AFPは腫瘍胎児抗原と呼ばれる。
アルファフェトプロテイン(AFP)は、シャトルの役割を果たし、3〜5日の半減期を有する、胎児中の主要な運搬体タンパク質である(非特許文献1;非特許文献2中)。AFPの発現は、発生期間に厳重に調節されるため、検出可能なレベルのAFP発現は、発生段階に左右されるところが大きい。研究によって、AFPが個体発生成長および腫瘍進行の両方の期間に成長調節因子の役割を果たすことを確証してきた。発生および腫瘍形成期間にAFPが発現することから、AFPは腫瘍胎児抗原と呼ばれる。
AFPは、アルブミノイド遺伝子スーパーファミリに属する糖タンパク質であり、その中のアルブミンも構成要素である。AFPの分子量は、源、発生段階、およびその精製に使用される方法によって、64,000から72,000ダルトンまで様々であってもよい。炭水化物の関連割合は再度、源および発育段階によって、3%から5%まで様々である。
AFPは、1)非結合形態、および2)AFPが様々なリガンド(例えば、脂肪酸、エストロゲン、フィトステロイド)に共役する結合形態といった、2つの基本分子形態で存在すると考えられる。しかし、AFPの異型も確認されている。結合リガンドの性質および濃度に依存する、結合AFPの異なる立体構造(ホロ形態)が存在する。ヒトAFP(HAFP)の分子変異体が確認されており、該変異体は、炭水化物の微小不均一性(つまり、HAFP上のグリコシル化の部位における異なる炭水化物部分)が原因であり、ならびに等電点の差によるものである(非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6)。HAFP mRNAの発生位相特異的な発現が原因である、HAFPの遺伝的変異体が検出されている。
Mizejewski G.J.ら(非特許文献7)は、AFPの循環生理機能を「発生時計」として説明している。著者らは、AFPの構造および機能が発生の経過の全体を通して変化し、その場合、胎児の発育中にタンパク質が変動的なレベルで発現し、発現レベルが生後にごくわずかなレベルにまで減少して、50ng/mL未満の正常成人血清濃度を有することに注目している(非特許文献8)。しかし、AFP血漿中濃度は、様々な癌がある個人においては1,000倍高くなり得る(非特許文献9)。また、多数の癌はその細胞表面上で高レベルのAFP受容体を発現する(非特許文献10中;非特許文献11中)。したがって、ヒトでは、AFPは、胚形成の期間に胎児欠陥マーカーとなることに加えて、腫瘍マーカーの役割を果たす。
従来の技術で公知である、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アルカロイド、抗生物質、ホルモン、および免疫賦活剤などの様々な化学製品を使用して癌を治療する。しかし、これらの製剤は、腫瘍細胞を特異的に標的とせず、正常な非腫瘍細胞も抗癌剤の影響を受けやすい、「バイスタンダー効果」と呼ばれるものを結果としてもたらす。悪性細胞の表面上でのHAFP受容体(HAFPR)の過剰発現は、正常細胞上での受容体のごくわずかな発現と比べて、特異的に癌細胞を標的にするための抗癌剤の担体/輸送体としてのHAFPの使用の研究を促進した(非特許文献12;非特許文献13)。HAFPは、抗癌剤複合体を腫瘍細胞へと標的化することが可能であることが実証されている(非特許文献14;非特許文献15;特許文献1)。AFPに対する受容体を持つ癌細胞に対するHAFPの高特異性は、腫瘍細胞への特異的な標的化による、薬剤の有効性の増進を提供する。また、正常な周囲の細胞に危害が加えられないため、そのような様態の活性剤送達は患者にとってより安全である。
ドキソルビシン、ダウノマイシン、カリケマイシン、カルボキシホスファミド、ブレオマイセチン、クロルブチン、シスプラチン、メトトレキサート、およびカルミノマイシンを含む、多数の抗癌剤と結合するHAFPが報告されている(非特許文献16;非特許文献17)。これらの例では、活性剤は化学共役法を使用してHAFPに結合され、抗癌剤へのHAFPの共有結合を結果としてもたらした。その生物活性の損失のない成分の結合および薬剤の標的化送達の両方を可能にする、AFP−薬物複合体に対するAFP:薬剤の最適なモル比は、1:2であることが分かった(非特許文献18)。同じモル比1:2は、AFPおよびダイオキシンの非共有結合において達成することが可能である(非特許文献15)。
Herveら(非特許文献19)は、アルブミン上で見られるものと同様である、ラットAFP上のワルファリンおよびフェニルブタゾンの結合部位を実証した。また、彼らは、これらの薬剤が、エストロゲン、脂肪酸、ピラゾル化合物、およびプロピオン薬剤と同じ大型疎水ポケットにおいてAFPに結合することを実証した。Mizejewski(非特許文献20)において批評されるように、脂肪酸はヒトAFPおよびげっ歯類AFPに結合することが可能であるが、植物エストロゲンはげっ歯類AFPのみに結合することが可能であることが示されており、AFP結合能の種間差を示唆している。
AFP/薬剤標的化送達の実験で使用されるAFPの主要源は、女性の胎盤後血清(非特許文献14)またはヒト胎児物質(www.alfetin.ru)のいずれかから抽出されるヒトAFPである。ヒト胎児物質は、限定源(妊娠12週までの中絶物質から抽出される)のため入手が困難であり、さらに高価である。ロシアでは、ヒト胎児AFPは、「Alfetinum」(0.075mgの95%純粋AFPを含む1アンプル)という名で免疫調節注射剤として登録されている。よって、癌細胞への細胞毒性薬の送達に有用なAFPの代替源が有益となる。
異なる様態の作用がある抗癌剤は、化学感受性細胞におけるアポトーシスを誘発することが報告されている(非特許文献21)。ミトコンドリア膜透過性および/または透過性遷移孔複合体変化などの、ミトコンドリア作用の変化は、抗癌剤によって誘導される細胞死を含むアポトーシス細胞死で主要な役割を果たす(非特許文献22;非特許文献23;非特許文献24;非特許文献25;非特許文献26)。多くの従来の化学療法薬は、アポトーシスの生理学的制御に関与する、p53などの内因性エフェクタの誘導による間接的な方法で、ミトコンドリア透過化を引き出す。しかし、多くの異なるヒト癌におけるp53の頻繁な突然変異は、癌を従来の化学療法薬に対して難治性にする。ロニダミン、亜ヒ酸塩、ベツリン酸、およびCD437などのミトコンドリアに直接作用する細胞毒性薬の発見は、p53を伴うものなどの、内因性アポトーシス誘導経路の途絶により、従来の薬剤が機能しない状況における代替的治療方針を提供している(非特許文献27において再考)。ベツリン酸などのミトコンドリアを標的にし、細胞のアポトーシスを誘導する細胞毒性薬が説明されている(非特許文献28;特許文献2)。Costantiniらは、ミトコンドリア膜透過性の変化および/または透過性遷移孔複合体(PTPC)の変化によるミトコンドリア破壊を通してアポトーシスを誘導する機序を批評し、ミトコンドリアを標的にしてアポトーシスを誘導する細胞毒性薬を一覧化している(非特許文献29)。
単一のHAFP/抗癌剤複合体(つまり、HAFP−エストロン−ドキソルビシン複合体)の使用は、多くの異なる種類の癌が化学療法に対して難治性であり、多剤耐性(MDR)を示すと言われている事実により、悪性新生物の治療における限定因子であると考えられる(非特許文献30;非特許文献31)。さらに、多数の抗癌剤は、DNAを標的にすることによって腫瘍細胞死を誘導するアルキル化剤および抗生物質であり、よって、損なわれていないp53シグナル経路に頼るところが大きい(非特許文献32)。機能的p53が欠けている多数の腫瘍を前提とすると、これらの治療はしばしば無効である。
したがって、容易に導き出され、生成が安価であり、非侵襲的手段によって送達可能であり、癌細胞の殺滅において効率的および特異的の両方である、細胞毒性薬を癌細胞に送達する改良された機序の必要性がある。
本発明は、本出願書を見直した後に当業者にとって明白となる、先行の利点またはその他の利点のうちの1つ以上を提供することができる。
Murgita 米国特許第6,630,445号
Pezzuto et al. 米国特許出願公報第20030186945号
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(発明の開示)
簡潔に述べると、本発明は、AFPを備える新規組成物、およびアルファフェトプロテイン受容体(AFPR)を発現する悪性新生物を予防、治療、または抑制するための方法を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。
簡潔に述べると、本発明は、AFPを備える新規組成物、およびアルファフェトプロテイン受容体(AFPR)を発現する悪性新生物を予防、治療、または抑制するための方法を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。
一実施形態では、本発明は、外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群から選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物を提供し、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合する。一実施形態では、該組成物は、外因性AFPに可逆的に結合することが可能な2つのアポトーシス誘導剤を備える。別の実施形態では、該組成物は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、ロテノン、ピエリシジンA、ロニダミン、CD437、三酸化ヒ素、A23187、イオノマイシン、ビタミンD2およびD3、デキサメタゾン、およびAccutaneを備える群より選択されるアポトーシス誘導剤を備える。
本発明は、哺乳類において、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤を、癌細胞に送達するための外因性AFPの使用も提供し、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合し、癌細胞は少なくとも1つのAFP受容体を有し、外因性AFPは、少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する。
一実施形態では、本発明は、哺乳類において、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤を、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有する癌細胞に標的化送達するための薬剤の調製における、外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用を提供し、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合し、外因性AFPは、少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する。
別の実施形態では、本発明は、哺乳類の癌細胞の増殖の抑制のための、外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用を提供し、前記癌は、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有し、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合し、外因性AFPは細胞表面上の少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する。
さらに別の実施形態では、本発明は、難治性悪性新生物における多剤耐性を治療するための、外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用を提供し、前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有する癌細胞から成り、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合し、外因性AFPは、細胞表面上の少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する。
別の実施形態では、本発明は、哺乳類の癌細胞増殖を抑制する方法も提供し、前記癌細胞は、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有し、前記方法は、外因性AFPと、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を哺乳類に投与するステップを備え、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合し、外因性AFPは、細胞表面上の少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する。
別の実施形態では、本発明は、難治性悪性新生物における多剤耐性を治療する方法を提供し、前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有する癌細胞から成り、該方法は、外因性AFPと、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を哺乳類に投与するステップを備え、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、外因性AFPに可逆的に結合し、外因性AFPは、細胞表面上の少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する。
さらに別の実施形態では、本発明は、
(a)妊娠約3週から約14週のブタ胚から血液および羊水を採取するステップと、
(b)(a)で採取される前記血液および前記羊水を浮遊物および沈殿物に分離するステップと、
(c)(b)に起因する前記浮遊物を採取するステップと、
(d)濃縮溶液を形成するように(c)に起因する前記浮遊物を濃縮するステップと、
(e)溶液中で約5%から約10%のブタノールの最終濃度まで、(d)の前記濃縮溶液にブタノールを添加するステップ、
(f)(e)に起因する前記ブタノール溶液を攪拌するステップと、
(g)(f)に起因する前記ブタノール溶液を、上層非水相および下層水相に分離するステップと、
(h)非結合ブタAFPを含む最終溶液を生成するように(g)に起因する前記非水相を採取するステップ、
という順次的なステップを備える、ブタノールを使用した、原料からのブタAFPの抽出のための過程を提供する。
(a)妊娠約3週から約14週のブタ胚から血液および羊水を採取するステップと、
(b)(a)で採取される前記血液および前記羊水を浮遊物および沈殿物に分離するステップと、
(c)(b)に起因する前記浮遊物を採取するステップと、
(d)濃縮溶液を形成するように(c)に起因する前記浮遊物を濃縮するステップと、
(e)溶液中で約5%から約10%のブタノールの最終濃度まで、(d)の前記濃縮溶液にブタノールを添加するステップ、
(f)(e)に起因する前記ブタノール溶液を攪拌するステップと、
(g)(f)に起因する前記ブタノール溶液を、上層非水相および下層水相に分離するステップと、
(h)非結合ブタAFPを含む最終溶液を生成するように(g)に起因する前記非水相を採取するステップ、
という順次的なステップを備える、ブタノールを使用した、原料からのブタAFPの抽出のための過程を提供する。
特定の具体的実施形態内で、上記のような組成物は、独自の用量を有する第1および第2のアポトーシス誘導剤から成る。
一実施形態では、該組成物で使用される外因性AFPは、哺乳類源由来である。別の実施形態では、AFPはブタ源からである(PAFP)。その他の実施形態では、AFPは、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、またはヒツジ源からである。AFPは自然から分離することができ、またはAFPの組み換え型であってもよい。
(発明の詳細な説明)
本発明は、癌細胞へのアポトーシス誘導剤の標的化送達に有用な組成物に関する。本発明の組成物は、ミトコンドリア作用に直接影響を及ぼし、初期核シグナル伝達を通してアポトーシス応答を引き出す必要性を回避することによって、アポトーシスを誘導する化合物に非共有複合する外因性AFPから成る。AFPの源は、一実施形態ではブタであり、別の実施形態では、妊娠3週から14週の胚および羊水から抽出されるブタAFPである。本発明におけるAFPとの非共有結合性会合に有用な具体的化合物は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、CD437、ロテノン、ピエリシジンA、およびロニダミンを含む。
本発明は、癌細胞へのアポトーシス誘導剤の標的化送達に有用な組成物に関する。本発明の組成物は、ミトコンドリア作用に直接影響を及ぼし、初期核シグナル伝達を通してアポトーシス応答を引き出す必要性を回避することによって、アポトーシスを誘導する化合物に非共有複合する外因性AFPから成る。AFPの源は、一実施形態ではブタであり、別の実施形態では、妊娠3週から14週の胚および羊水から抽出されるブタAFPである。本発明におけるAFPとの非共有結合性会合に有用な具体的化合物は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、CD437、ロテノン、ピエリシジンA、およびロニダミンを含む。
本願で使用されるようなアポトーシス誘導剤という用語は、アポトーシス細胞死を誘導する能力がある化学または天然化合物を指す。本発明の一実施形態では、アポトーシス誘導剤は、ミトコンドリアに直接作用する。そのような化合物は、ミトコンドリア膜透過性、ミトコンドリア孔開放の誘導、ミトコンドリア膜電位、ならびにカスパーゼ3および9などの実行カスパーゼの活性化のうちのいずれかに影響することによって、アポトーシスを誘導することができる。
本発明との関連で、アポトーシス誘導剤は、細胞表面上でAFP受容体を発現する標的化癌細胞のアポトーシスを誘導する。本発明での使用に適したアポトーシス誘導剤の例は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、CD437、ロニダミン、三酸化ヒ素、およびロテノンなどのミトコンドリア膜透過性誘導剤;Pac−1などのカスパーゼ活性剤(Putt et al.,Nature Chem.Biol.2:543−550,2006)、カルシマイシン/A23187およびバリノマイシンなどのイオノフォア;およびAccutaneおよびシスレチノイン酸などのレチノイド;ならびにデキサメタゾンなどの既知の化学療法薬;オリゴマイシンBなどの抗生物質;リン酸ヒドロキシクロロキン;ケルセチンなどの酸化防止剤、ビタミンA、ビタミンD2およびD3、クルクミン、およびカプサイシン;および亜鉛、鉛、銅、ニッケル、およびカドミウムなどの重金属(http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/TablePage/9560323、http://www.biomol.com/Online_Catalog/Online_Catalog/Products/36/?categoryId=234、http://www.emdbiosciences.com/html/cbc/apoptosis_inducers.html、http://www.axxora.com/apoptosis_inducers__inhibitors/opfa.1014.2.1.0.html)を含むか、またはそれらに由来するが、それらに限定されない。
本願で使用されるような可逆的という用語は、元の(「非結合」)状態に戻ることが可能であることを意味し、外因性AFPは、第1のアポトーシス誘導剤(つまり、アトラクチロシド、タプシガルギン、ベツリン酸、CD437、三酸化ヒ素、ロテノン、およびロニダミン)を腫瘍細胞に送達した後、非結合形態で細胞外培地へ再循環され、その場合、それが固有結合親和力を有する別の化合物(つまり、アトラクチロシド、タプシガルギン、ベツリン酸、CD437、三酸化ヒ素、ロテノン、およびロニダミン)に結合することが可能である。外因性AFPが1度以上細胞外培地に再循環されることは可能である。以前に、多数のインビトロ研究は、AFPがAFP受容体媒介エンドサイトーシスを介して、多価不飽和脂肪酸(PUFA)を細胞に送達することが可能であり、後に細胞外培地へ分解されずに再循環されることを実証した(Torres et al.,Int.J.Cancer 47:110−117,1991;Uriel et al.,“Biological activities of alpha−fetoprotein”,Florida Congresses,edited by Mizejewski,GJ,CRC Press Inc.,Boca Raton,Vol.2,1987中;およびLaborda et al.,Int.J.Cancer 40:314−318,1987)。これらの研究は、再循環AFPは、2度目に細胞外空間へ戻されると、アポトーシス誘導剤に結合することが可能であることを示唆している。
本願で使用されるような治療的有効量という用語は、患者に投与されると、本願で説明される癌(固体または非固体)の症状を改善または緩和する、本発明の組成物の量を意味する。本発明により投与される組成物の具体的用量は、勿論、例えば、投与される組成物、投与の経路、患者の状態、および治療されている癌の種類を含む、症例をめぐる特定の状況によって決定される。本発明による治療に適した癌は、癌細胞がAFPRを発現する癌である。AFPRの実証された発現を伴う癌の例は、膀胱癌、乳癌、結腸および直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(腎細胞)、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌(非黒色腫)、精巣癌、および甲状腺癌を含むが、それらに限定されない(Moro−Vidal,R.,,Curex Technologies Inc.,www.biocurex.com)。
患者という用語は、ヒトを含むあらゆる哺乳類を意味する。患者の例は、ヒト、その他の霊長類、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびウサギを含む。
本発明は、直接癌細胞に対するアポトーシス誘導剤の担体または輸送体の役割を果たす、外因性アルファフェトプロテイン(AFP)の使用を伴い、癌細胞のアポトーシスを結果としてもたらす。米国特許第6,630,445号および第6,534,479号は、細胞毒性薬との共役のための組み換え型ヒトAFPの使用を説明している。以前に、Nishiら(Ann.New York Acad.Sci.259:109−118,1975)は、AFPの代替哺乳類源の可能性を高める免疫学的および抗原特性に関して、哺乳類AFP間の異種間類似点を実証した。ブタおよびヒトAFP間の類似点は、ブタAFPは、ヒトAFPの代わりに、アポトーシス誘導剤を癌細胞へ送達するために使用することが可能であることを示唆している(表1)。
本願で使用されるような外因性という用語は、患者または生物外に起因することを意味する。
本発明は、外因性AFP、およびインビトロで外因性AFPに可逆的に結合してAFP−第1アポトーシス誘導剤複合体を形成する第1のアポトーシス誘導剤の組成物に関し、第2のアポトーシス誘導剤を含むことも可能であり、第1のアポトーシス誘導剤および第2のアポトーシス誘導剤は、抗癌剤(つまり、アトラクチロシド、タプシガルギン、ベツリン酸、CD437、三酸化ヒ素、ロテノン、およびロニダミン)であり、第2のアポトーシス誘導剤は、インビボで再循環された外因性AFPに可逆的に結合することが可能である。第1のアポトーシス誘導剤および第2のアポトーシス誘導剤は同じであってよく(つまり、ベツリン酸)、または異なってもよい(つまり、ベツリン酸およびCD437)。
AFP上の複数の結合領域の存在は、1つ以上の部類のアポトーシス誘導剤が、インビトロで同時にAFPに結合することができる可能性を高める(Hirano,K.et al.,Biochem.J.,231:189−191,1985;Mizejewski,G.J.,Exp.Biol.Med.226(5):377−408,2001)。これは、一部の結合領域は疎水性薬物と相互作用する一方で、その他の結合領域は親水性または両親媒性薬物と相互作用するという事実によるものである。
本発明の一実施形態によると、癌患者は、1日用量の本発明組成物の投与を受け、AFPの総1日摂取量は、患者および疾病の悪性度によって、0.07mgから1.2mgの間となる。AFPのこの濃度は、妊娠中の循環中でよく見られるAFPの生理的濃度に基づく。マウスのカウンターパートでは、「Natural Compounds in Cancer Therapy」(Boik,J.,Natural Compounds in Cancer Therapy.Oregon Medical Press,2001,pp.8−10)で定められているガイドラインによると、同程度の用量は0.0014mgから0.024mgである。
本発明の組成物は、等モル比からAFPに関する第1のアポトーシス誘導剤の過多まで、および等モル比からAFPに関する第2のアポトーシス誘導剤の過多までなど、第1および第2のアポトーシス誘導剤の様々なモル比を含むことができる。第1のアポトーシス誘導剤およびAFPのインビトロ結合条件は、第1のアポトーシス誘導剤の特性(つまり、親水性または疎水性)に左右される。典型的に、AFPは、第1のアポトーシス誘導剤と混合され、その場合、AFPおよび第1のアポトーシス誘導剤のモル比は1:1から1:3に及ぶ。さらに典型的に、AFPは、第1のアポトーシス誘導剤と混合され、その場合、AFPおよび第1のアポトーシス誘導剤のモル比は1:1から1:3未満に及ぶ。第1のアポトーシス誘導剤は、1つ以上の抗癌剤から成ることができる。しかし、複数の薬剤が使用される場合、それぞれが上記のようにAFP上の異なる結合領域に結合することを確認しなければならない。
抽出された物質は、透析ろ過の対象となり、PAFP−アポトーシス誘導剤複合体を阻害することなく、小非結合分子を排除する。以前に、Sotnichenkoら(FEBS Letters 450:49−51、1999)は、ヒト胎児AFPが1:2のモル比でダイオキシンとの複合体を形成し、ゲルろ過がAFP−ダイオキシン複合体を阻害することなく、非結合分子を効果的に排除することを実証した。
典型的に、第2のアポトーシス誘導剤は、従来技術で説明される方法で使用される量よりも、少なくとも10倍少ない量で存在する。例えば、Pezzutoら(米国特許出願公報第20030186945号)は、3,000μg(0.2mgから500mgの1日経口用量)のベツリン酸の用量を推奨したが、本発明では、ベツリン酸(第2のアポトーシス誘導剤)の用量は150μgほども少なくなり得る。本発明では、0.6mgのPAFPは0.007mgのベツリン酸と複合される。別の実施形態では、0.15mgの非結合別リン酸が剤形に含まれる。。
PAFPは不安定であり、以前に説明されている化学共役過程のものなど、操作中に凝集、沈殿、または不活性化し得る(G.J.Mizejewski,“Alpha−fetoprotein”,Monographs on Endocrinology,ed.Ulrich Westphal,Steroid−protein interactions II,Springer−Verlag,Berlin、New−York,Tokyo,1986,pp.320−356中;Nunez,E.A.et al,physiochemical and biological properties of AFP depend on its ligand environment,J.Nucl.Med.Allied Sci.,33:18−16,1989)。本発明において、18〜25℃で第1のアポトーシス誘導剤へのPAFPのインビトロ結合を達成するために必要とされる時間は、10分であり、これは、18〜25℃での固定時間が10〜12時間である、従来技術で説明されている非共有結合過程によって必要とされる時間よりも大幅に短い(例えば、Pakらの米国特許第6,878,688号を参照)。PAFPおよび第1のアポトーシス誘導剤のインビトロ結合を達成するための短縮された時間は、(1)本発明の限外ろ過およびブタノール抽出法によって得られる濃縮物中に存在する、結合に利用可能なより高い濃度の非結合PAFP、および(2)上記のように、微小不均一性である、その他の方法によって得られるHAFPと比べた、本発明の過程によって得られるPAFPの微小均一性(Wu,J.T.and Clayton,F.,“Detection and isolation of various isoforms of human AFP”,“Biological activities of AFP”,CRC Press,1987,Boca Raton,Florida,vol.2,pp.3−14中;Mizejewski,G.J.,Exp.Biol.Med.,vol.226(5):377−408,2001)が原因であってよい。
典型的に、第1のアポトーシス誘導剤は、1部類の抗癌剤であり、わずか150μgの1日濃度で存在する。本発明において有用なアポトーシス誘導剤は、好ましくは、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、イオノフォア、およびレチノイドを備える群より選択される。
多剤耐性(MDR)は、癌細胞の表面における高発現レベルのgp170ポンプと関連することが多い(Lehnert M.,Eur J Cancer 32A:912−920,1996;Germann U.A.、Eur.J.Cancer 32A:927−944、1996;Thomas,H.et al.,Cancer Control 10(2):159−165、2003)。しかし、MDRは、損傷p53またはBcl−2などのアポトーシス阻害物質の上方調節された発現を伴う細胞中で発生することも知られている(Jaattela,M.,Exp.Cell Res.248:30−43,1999)。多くの化学療法薬は、DNA、RNA、テロメラーゼ、およびトポイソメラーゼなど、p53活性の上流に標的を有する。これらの薬剤は、損傷p53または上方調節されたBcl−2を伴う細胞中のアポトーシスを誘導するのに無効である(Evan,G.I.and Vousden,K.H.,Nature 411:342−348,2001)(図1)。Moskalevaら(Cell Biol.Int.,21(12):793−799,1997)は、AFP−薬物複合体は、MDR(p糖タンパク質薬物排出ポンプ)を過剰発現する多剤耐性癌細胞を殺滅するのに効果的であったことを実証し、AFP−薬物複合体の受容体媒介エンドサイトーシスが多剤耐性癌を克服することを示唆した。本発明では、アポトーシス誘導剤は、p53の下流である、ミトコンドリアのレベルでアポトーシスを誘導するその能力に基づいて選択される。ミトコンドリア膜透過性およびミトコンドリア孔遷移および/またはカスパーゼ活性化への影響を通して、これらのアポトーシス誘導剤は、多剤耐性癌に対する細胞傷害効果を引き出すことが可能である。
好ましくは、本発明で使用するためのアポトーシス誘導剤は、天然源由来である(Pessayre et al.,“Apoptosis Trigged by Natural Substances”,“Apoptosis and Its Modulation by Drugs”,eds.R.G.Cameron,G.Feuer,Springer Press,2000,pp.86−108中)。例えば、ベツリン酸は、白樺の木(ベチュラ・アルバ)の外皮中に豊富に発見される物質である、ベツリン由来である。本発明において有用な典型的アポトーシス誘導剤は、タプシガルギン、アトラクチロシド、ベツリン酸、CD437、三酸化ヒ素、ロテノン、ピエリシジンA、およびロニダミンを含むが、それらに限定されない。
本発明との使用に適したアポトーシス誘導剤のその他の例は、デキサメタゾン、オリゴマイシンB、リン酸ヒドロキシクロロキン、ケルセチン、ビタミンA、ビタミンD2およびD3、クルクミン、カプサイシン、および亜鉛、鉛、銅、ニッケル、カドミウムなどの重金属、および化学療法薬を含むか、またはそれらに由来するが、それらに限定されない。
本発明の組成物は、経口投与形態(つまり、カプセル、ソフトゲル、および錠剤)、坐薬、吸入剤、点鼻および点眼薬、包帯、嗅粉末、注射剤、塗布薬、および局所製剤を含むが、それらに限定されない、任意の現在知られている投与の方法によって、癌細胞へ送達することができる。一実施形態では、該組成物は、ソフトゲルとして経口投与のために調製される。別の実施形態では、該組成物は、注射剤として静脈投与のために調製される。
(実施例1)
PAFP分離および精製
PAFPは、ブタ胚の肝臓および血液、羊水、および胎盤から抽出した。抽出が行われる胎児期は、その生物活性(例えば、受容体結合)ならびにアポトーシス誘導剤に結合するその能力の両方に影響を及ぼし得る、PAFPの変動翻訳後特性により、重要である。妊娠初期(3週間より前)または妊娠後期(14週間以降)の胎児物質から抽出されるPAFPは、妊娠3週から14週の胎児物質から抽出されるPAFPと比べると、異なってグリコシル化している(Ruoslahti,E.et al.,Int.J.Cancer,22:515−520、1978;Keel,B.A.et al.,“Biological Activities of Alpha1−Fetoprotein”Boca Raton,Florida、CRC Press vol 2,pp.24−31,1989中;Mizejewski,G.J.,Exp.Biol.Med.226(5):377−408、2001;Parker,M.H.et al.,Protein Expression and Purification,38:177−183,2004;Mizejewski,G.J.“Monographs on Endocrinology”ed.Ulrich Westphal,Steroid−protein interactions II,Springer−Verlag,Berlin,New−York,Tokyo,1986,pp.320−356中)。グリコシル化の異なる状態は、HAFPの結合特性に影響することが示されており、よって、PAFPのグリコシル化が胚形成の期間に変化し、妊娠14週後に流体の収率が有意に減少するため、胚からの流体の抽出のタイミングが重要である。理想的には、ブタ胎児物質は、胚形成の第3週から第14週の間に採取し、抽出過程の対象とした。
PAFP分離および精製
PAFPは、ブタ胚の肝臓および血液、羊水、および胎盤から抽出した。抽出が行われる胎児期は、その生物活性(例えば、受容体結合)ならびにアポトーシス誘導剤に結合するその能力の両方に影響を及ぼし得る、PAFPの変動翻訳後特性により、重要である。妊娠初期(3週間より前)または妊娠後期(14週間以降)の胎児物質から抽出されるPAFPは、妊娠3週から14週の胎児物質から抽出されるPAFPと比べると、異なってグリコシル化している(Ruoslahti,E.et al.,Int.J.Cancer,22:515−520、1978;Keel,B.A.et al.,“Biological Activities of Alpha1−Fetoprotein”Boca Raton,Florida、CRC Press vol 2,pp.24−31,1989中;Mizejewski,G.J.,Exp.Biol.Med.226(5):377−408、2001;Parker,M.H.et al.,Protein Expression and Purification,38:177−183,2004;Mizejewski,G.J.“Monographs on Endocrinology”ed.Ulrich Westphal,Steroid−protein interactions II,Springer−Verlag,Berlin,New−York,Tokyo,1986,pp.320−356中)。グリコシル化の異なる状態は、HAFPの結合特性に影響することが示されており、よって、PAFPのグリコシル化が胚形成の期間に変化し、妊娠14週後に流体の収率が有意に減少するため、胚からの流体の抽出のタイミングが重要である。理想的には、ブタ胎児物質は、胚形成の第3週から第14週の間に採取し、抽出過程の対象とした。
抽出後、血液および羊水(以降「原料」)は、自然沈殿を発生させるために、12から24時間にわたって4〜10℃で維持した。浮遊物を収集して異なる容器に移し、その後、50kDa膜を使用した限外ろ過によって3〜5倍に濃縮した。限外ろ過の過程中、温度は15℃を越えなかった。この濃縮ステップは、高収率のPAFPを結果としてもたらした。そしてブタノールを5%〜10%の間の最終濃度にまで加えた;典型的にはブタノールの最終濃度は約8%であった。原料およびブタノールを2分間攪拌し、混合物をさらに1分間インキュベートさせ、上層非水相および下層水相への溶液の分離を可能にした。非結合PAFPを含む上層非水相は、混合物から残留ブタノールを除去するために、保持して透析ろ過の対象とした。PAFPを含む結果として生じた溶液は、難治性癌を治療する際に使用するためのアポトーシス誘導剤とのインビトロ結合の対象とした。
本発明のPAFP抽出の方法は、増大し、さらに高濃縮された非結合PAFPの産物を結果としてもたらすという点で、AFP抽出の従来方法よりも有利である。非結合とは、内因性結合パートナーに結合していないPAFPを意味する。より高濃度の非結合PAFPの結果として、関心のアポトーシス誘導剤に結合した増大した濃度のPAFPが達成可能である。
上記に詳述される方法によって抽出されるPAFPは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の対象とした(図2)。2つの主要タンパク質バンドは、クマシーゲル染色時に明白であった(図2、レーンAおよびレーンC)。上方バンド(約70kDa)はPAFPに対応し、下方バンド(約67kDa)はアルブミンに対応する。
(実施例2)
PAFPには、HAFPと比べて同様の結合特性がある
以前の研究は、PAFPがHAFPと比べて同様の生物学的特性を保有するかどうかを扱っていなかった。上記に詳述されている方法によって抽出されるPAFPは、上記に詳述されている方法から得られる抽出物中のPAFPの存在を検出するために、2つの異なる免疫酵素キットを使用して分析した。PAFPサンプルは、ヒト血清および羊水から分離されたAFPと比較した。最初は、サンプルは、HAFPに対するモノクローナル抗体を組み込む、膜EIAアルファフェトプロテイン検査(カタログ番号410−1、IND Diagnostic Inc.、Vancouver、Canada)の対象とした。PAFPは、ヒトAFPサンプルと比べて、EIAアルファフェトプロテイン検査キットとの反応を引き起こさず、PAFP対ヒトAFPの化学構造の潜在的差異を示唆した。そして、HAFPに対するポリクローナル抗体を組み込む第2の検査キット(カタログ番号T−8456、AFP-EIA−BEST−Strip、Vector−BEST、Novosibirsk、Russia)を使用して抽出物中のPAFPの存在を分析した。ヒトAFPに対して樹立された抗体と反応するPAFPの能力を示す、陽性反応が発生した。免疫学的検定研究の結果は、PAFPはHAFPに対する抗体による認識が可能であることを示唆し、PAFPがHAFPと構造的に同様であることを示唆する。
PAFPには、HAFPと比べて同様の結合特性がある
以前の研究は、PAFPがHAFPと比べて同様の生物学的特性を保有するかどうかを扱っていなかった。上記に詳述されている方法によって抽出されるPAFPは、上記に詳述されている方法から得られる抽出物中のPAFPの存在を検出するために、2つの異なる免疫酵素キットを使用して分析した。PAFPサンプルは、ヒト血清および羊水から分離されたAFPと比較した。最初は、サンプルは、HAFPに対するモノクローナル抗体を組み込む、膜EIAアルファフェトプロテイン検査(カタログ番号410−1、IND Diagnostic Inc.、Vancouver、Canada)の対象とした。PAFPは、ヒトAFPサンプルと比べて、EIAアルファフェトプロテイン検査キットとの反応を引き起こさず、PAFP対ヒトAFPの化学構造の潜在的差異を示唆した。そして、HAFPに対するポリクローナル抗体を組み込む第2の検査キット(カタログ番号T−8456、AFP-EIA−BEST−Strip、Vector−BEST、Novosibirsk、Russia)を使用して抽出物中のPAFPの存在を分析した。ヒトAFPに対して樹立された抗体と反応するPAFPの能力を示す、陽性反応が発生した。免疫学的検定研究の結果は、PAFPはHAFPに対する抗体による認識が可能であることを示唆し、PAFPがHAFPと構造的に同様であることを示唆する。
HAFP自体がアポトーシスを誘導することが可能であることは、以前に実証されている。腫瘍細胞死の誘導は、低用量(<200mg/mL)ではなく、高生理学的用量のAFP(>250mg/mL)で示された(Dudich et al.,Eur.J.Biochem.266:1−13,1999)。また、研究は、HAFPが様々な疎水性および親水性化合物に結合することが可能であることを示している(Hirano et al.,Biochem.J.231;189−191,1985)。しかし、PAFPが同様にアポトーシスまたはその他の下流生物学的反応を誘導する可能性があるかどうか、そしてHAFPと比べて、PAFPのアミノ酸配列の違いにより(82%アミノ酸類似)、PAFPはHAFPと同様に様々な薬剤に結合することが可能であるかどうかは不明であった(Kim et al.,Animal Genetics,33:468−485,2002)。
マウス癌モデルにおいて行われた研究は、アポトーシス誘導剤(例えば、アトラクチロシド、タプシガルギン、およびベツリン酸)を癌細胞に送達し、結果として全身腫瘍組織量を低減するPAFPの能力を実証した(実施例4および6参照)。これらの結果は、PAFPと結合したアポトーシス誘導剤が癌予防効果を引き出すことが分かったヒト研究において、結果として再現された。共に、データは、PAFPがヒトおよびマウス両方のAFP受容体によって認識されることを示唆している。
(実施例3a)
PAFPおよびアポトーシス誘導剤のインビトロ結合
上記に詳述されている抽出手順より得られたPAFPを、アポトーシス誘導剤と1分間組み合わせ、10〜15℃でさらに10分間インキュベートさせた。より長いインキュベーション期間が容認可能であるが、インキュベーション時間の延長は、PAFPに結合された薬剤の量に関して、有意な利益を提供しなかった。そして、小分子、および例えば、原料の採取中の以前の抽出ステップにおいて生理的緩衝剤として使用される塩といったその他の不純物を取り除くために、PAFP−アポトーシス誘導剤混合物を、50kDa膜および透析ろ過を使用した限外ろ過のステップの対象とした。限外ろ過のステップはさらに、残っている非結合アポトーシス誘導剤の排除を支援した。未透過物は、後のステップで有用なPAFP−アポトーシス誘導剤混合物を含んだ。
PAFPおよびアポトーシス誘導剤のインビトロ結合
上記に詳述されている抽出手順より得られたPAFPを、アポトーシス誘導剤と1分間組み合わせ、10〜15℃でさらに10分間インキュベートさせた。より長いインキュベーション期間が容認可能であるが、インキュベーション時間の延長は、PAFPに結合された薬剤の量に関して、有意な利益を提供しなかった。そして、小分子、および例えば、原料の採取中の以前の抽出ステップにおいて生理的緩衝剤として使用される塩といったその他の不純物を取り除くために、PAFP−アポトーシス誘導剤混合物を、50kDa膜および透析ろ過を使用した限外ろ過のステップの対象とした。限外ろ過のステップはさらに、残っている非結合アポトーシス誘導剤の排除を支援した。未透過物は、後のステップで有用なPAFP−アポトーシス誘導剤混合物を含んだ。
最終的なろ過のステップは、結果として生じる溶液をろ過殺菌するために、0.22ミクロン膜を使用して行った。混合物中に残ったアルブミンは、本発明の組成物の有効性に干渉しない。
結果として生じる溶液は、完全に凍結するまで、−45℃で急速冷凍した。そしてPAFP−アポトーシス誘導剤組成物を、層が完全に乾燥するまで、凍結乾燥機を使用して乾燥した。そして凍結乾燥したPAFP−アポトーシス誘導剤組成物は微粒子に磨砕し、粉末の温度が35℃を越えないことを確実にした。組成物を様々な製剤または送達システムに組み込むことを容易にするために、80メッシュ以下の粉末を得た。粉末中のPAFPの正確な量は、HPLCまたはPAAG電気泳動データを使用して算出することが可能である。
(実施例3b−PAFF−アトラクチロシド)
1:1モル比のPAFP:アトラクチロシドを達成するために、35g/Lの最終総タンパク質濃度、および約21g/LのPAFPを有する1リットルのPAFP未透過物を、50mLの水に溶解した250mgのアトラクチロシド(MW=803)と組み合わせた。該溶液は4〜15℃で10分間混合させ、そして2〜3容積の水で限外ろ過および透析ろ過した。1リットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、PAFP−アトラクチロシド組成物を生成した。
1:1モル比のPAFP:アトラクチロシドを達成するために、35g/Lの最終総タンパク質濃度、および約21g/LのPAFPを有する1リットルのPAFP未透過物を、50mLの水に溶解した250mgのアトラクチロシド(MW=803)と組み合わせた。該溶液は4〜15℃で10分間混合させ、そして2〜3容積の水で限外ろ過および透析ろ過した。1リットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、PAFP−アトラクチロシド組成物を生成した。
(実施例3c−PAFF−タプシガルギン)
1:1モル比のPAFP:タプシガルギンを達成するために、8g/Lの最終総タンパク質濃度、および約1.7g/LのPAFPを有する半リットルのPAFP未透過物を、10mLのアルコールに溶解した10mgのタプシガルギン(MW=605)へ滴下により加えた。該溶液を15〜25℃で30分間混合させ、そして2〜5容積の水で限外ろ過および透析ろ過した。200ミリリットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、PAFP−タプシガルギン組成物を生成した。
1:1モル比のPAFP:タプシガルギンを達成するために、8g/Lの最終総タンパク質濃度、および約1.7g/LのPAFPを有する半リットルのPAFP未透過物を、10mLのアルコールに溶解した10mgのタプシガルギン(MW=605)へ滴下により加えた。該溶液を15〜25℃で30分間混合させ、そして2〜5容積の水で限外ろ過および透析ろ過した。200ミリリットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、PAFP−タプシガルギン組成物を生成した。
(実施例3d−PAFP−ベツリン酸)
1:1モル比のPAFP:ベツリン酸を達成するために、20g/Lの最終総タンパク質濃度、および約14g/LのPAFPを有する2リットルのPAFP未透過物を、100mLのDMSOに溶解した500mgのベツリン酸(MW=456)と組み合わせた。該溶液は25〜37℃で10分間混合させ、そして透析ろ過の対象とした。1リットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、PAFP−ベツリン酸組成物を生成した。
1:1モル比のPAFP:ベツリン酸を達成するために、20g/Lの最終総タンパク質濃度、および約14g/LのPAFPを有する2リットルのPAFP未透過物を、100mLのDMSOに溶解した500mgのベツリン酸(MW=456)と組み合わせた。該溶液は25〜37℃で10分間混合させ、そして透析ろ過の対象とした。1リットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、PAFP−ベツリン酸組成物を生成した。
(実施例4)
インビボマウス白血病モデル:PAFP+アポトーシス誘導剤は、腫瘍細胞接種の24日後のマウスにおける腫瘍細胞を殺滅する。
DBA2系のマウスに、以前AFP受容体を発現することが示された20,000個のP−388マウス白血病細胞を体の側面に皮下接種した(Severin et al.,Dokl.Acad.Nauk,366(4):561−564,1999;Moro−Vidal,R.,Curex Technologies Inc.,www.biocurex.com)。全ての動物は接種後に生存した。10匹ずつのマウスを、下記の毎日の治療のうちの1つの対象とした。
1−製剤A(PAFP−アトラクチロシド組成物)
2−製剤T(PAFP−タプシガルギン組成物)
3−製剤S(脾臓抽出物)
4−製剤A+S
5−製剤T+S
6−対照油
7−対照水
インビボマウス白血病モデル:PAFP+アポトーシス誘導剤は、腫瘍細胞接種の24日後のマウスにおける腫瘍細胞を殺滅する。
DBA2系のマウスに、以前AFP受容体を発現することが示された20,000個のP−388マウス白血病細胞を体の側面に皮下接種した(Severin et al.,Dokl.Acad.Nauk,366(4):561−564,1999;Moro−Vidal,R.,Curex Technologies Inc.,www.biocurex.com)。全ての動物は接種後に生存した。10匹ずつのマウスを、下記の毎日の治療のうちの1つの対象とした。
1−製剤A(PAFP−アトラクチロシド組成物)
2−製剤T(PAFP−タプシガルギン組成物)
3−製剤S(脾臓抽出物)
4−製剤A+S
5−製剤T+S
6−対照油
7−対照水
10匹のマウスから成る各群は、P−388細胞接種の翌日である第2日より始まる、油送達媒体中の指示された治療の0.2mLの1日経口用量を服用した。該動物は、接種後第24日に腫瘍成長について評価した。結果を表2にまとめる。
マウスの側面に皮下接種され、指示されるように接種後第1日より始まって毎日治療された、P−388リンパ性白血病細胞株の増殖を図3に示す。
結果:
1. 群1(PAFP−アトラクチロシド)および群2(PAFP−タプシガルギン)の動物における腫瘍の成長は、接種後第24日における対照群6(油)と比べて、平均でそれぞれ79%および53%抑制された。接種後第22日では、腫瘍の成長は対照群7(水)と比べて、平均でそれぞれ85%および79%抑制された。
2. 生存率は、10匹の各群内の動物の50%(例えば5匹)が生存していた時に測定した。PAFP−アトラクチロシド組成物を投与された群1の動物における50%生存率(第30日)は、対照として水を投与した動物(群7)の生存率(第21日)と比べて、1.4倍増加した。PAFP−タプシガルギン組成物を投与された群2の動物における50%生存率(第27日)は、対照動物と比べて、1.28倍増加した(図4)。
3. 接種後38日、PAFP−アトラクチロシド(「製剤A」)の毎日の治療を受けている10匹のマウスのうち3匹がなお生存しており、PAFP−タプシガルギン(「製剤T」)を投与されている10匹のマウスのうち1匹がなお生存していた(図4)。水対照群内の全てのマウスが第24日までに死亡した一方で、油対照群内の全てのマウスは第25日までに死亡した。
4. 「製剤A」の毎日の治療を受けている、接種後38日になお生存していた3匹のマウスのうち1匹において、腫瘍の緩解が認められた(表3)。
1. 群1(PAFP−アトラクチロシド)および群2(PAFP−タプシガルギン)の動物における腫瘍の成長は、接種後第24日における対照群6(油)と比べて、平均でそれぞれ79%および53%抑制された。接種後第22日では、腫瘍の成長は対照群7(水)と比べて、平均でそれぞれ85%および79%抑制された。
2. 生存率は、10匹の各群内の動物の50%(例えば5匹)が生存していた時に測定した。PAFP−アトラクチロシド組成物を投与された群1の動物における50%生存率(第30日)は、対照として水を投与した動物(群7)の生存率(第21日)と比べて、1.4倍増加した。PAFP−タプシガルギン組成物を投与された群2の動物における50%生存率(第27日)は、対照動物と比べて、1.28倍増加した(図4)。
3. 接種後38日、PAFP−アトラクチロシド(「製剤A」)の毎日の治療を受けている10匹のマウスのうち3匹がなお生存しており、PAFP−タプシガルギン(「製剤T」)を投与されている10匹のマウスのうち1匹がなお生存していた(図4)。水対照群内の全てのマウスが第24日までに死亡した一方で、油対照群内の全てのマウスは第25日までに死亡した。
4. 「製剤A」の毎日の治療を受けている、接種後38日になお生存していた3匹のマウスのうち1匹において、腫瘍の緩解が認められた(表3)。
同様の腫瘍成長の緩解は、AFPをそれが共有接合される抗生エスペラマイシンA1に対する送達媒体として使用して、Severinらによって実証された(Severin,S.E.et al.,Dokl.Akad.Nauk.366(4):561−4,1999)。
結論:
1. それぞれPAFP−アトラクチロシドおよびPAFP−タプシガルギンから成る「製剤A」および「製剤T」は、実証された濃度で、腫瘍成長を抑制した。
2. アポトーシス誘導剤であるPAFPと結合したアトラクチロシドおよびタプシガルギンの投与は、白血病のマウスモデルにおいて生存を延長した。
1. それぞれPAFP−アトラクチロシドおよびPAFP−タプシガルギンから成る「製剤A」および「製剤T」は、実証された濃度で、腫瘍成長を抑制した。
2. アポトーシス誘導剤であるPAFPと結合したアトラクチロシドおよびタプシガルギンの投与は、白血病のマウスモデルにおいて生存を延長した。
(実施例5)
インビボデータ−腫瘍:PAFP−アトラクチロシド組成物は、ヒトにおける腫瘍細胞を殺滅する
各医師によって癌の進行においてIV期として分類された8名の患者は、1ヶ月にわたって毎日、カプセル形態(2〜6カプセル)のPAFP−アトラクチロシド組成物の経口用量を投与された。そしてこれらの患者の進展を、さらに4ヶ月にわたって各医師によって追跡した。患者自身は、生活の質の向上を報告した。これらの患者において行われたCTスキャンによると、PAFP−アトラクチロシド治療を受けている者は、原発腫瘍の成長率の減少、症例によっては原発腫瘍のサイズの減少、ならびに転移の程度の減少を経験した。初期ヒト研究の結論は次のとおりである:
インビボデータ−腫瘍:PAFP−アトラクチロシド組成物は、ヒトにおける腫瘍細胞を殺滅する
各医師によって癌の進行においてIV期として分類された8名の患者は、1ヶ月にわたって毎日、カプセル形態(2〜6カプセル)のPAFP−アトラクチロシド組成物の経口用量を投与された。そしてこれらの患者の進展を、さらに4ヶ月にわたって各医師によって追跡した。患者自身は、生活の質の向上を報告した。これらの患者において行われたCTスキャンによると、PAFP−アトラクチロシド治療を受けている者は、原発腫瘍の成長率の減少、症例によっては原発腫瘍のサイズの減少、ならびに転移の程度の減少を経験した。初期ヒト研究の結論は次のとおりである:
1. 2〜6カプセルの1日用量におけるPAFP−アトラクチロシド製品(でんぷんおよび油送達媒体中)の経口摂取は、安全であり、治療の経過中の最小限の副作用と関連することが分かった。
2. 原発および転移性腫瘍サイズならびに転移部位の痛みの減少は、PAFP−アトラクチロシド製品の具体的な制癌作用を確定した。
3. 身体活動性および一般的な健康の患者が説明した向上によって測定された、生活の質の顕著な改善は、PAFP−アトラクチロシド組成物の投与を、単独またはその他の薬剤との組み合わせいずれかで受けた患者において、認められた。
4. データは、原発および転移性両方の腫瘤において認められた減少によって判定されるように、PAFP−アトラクチロシド組成物を投与された患者における用量依存反応を示した。
5. PAFP−アトラクチロシドの投与は、用量を増加させるにつれて、まれにしか急性免疫反応(体温の上昇、腫瘍/転移の部位における局所疼痛)を伴わない。
6. PAFPアトラクチロシド組成物の投与に応じたIV期癌患者における全身腫瘍組織量の減少は、組成物が経口投与可能であることを示唆した。
2. 原発および転移性腫瘍サイズならびに転移部位の痛みの減少は、PAFP−アトラクチロシド製品の具体的な制癌作用を確定した。
3. 身体活動性および一般的な健康の患者が説明した向上によって測定された、生活の質の顕著な改善は、PAFP−アトラクチロシド組成物の投与を、単独またはその他の薬剤との組み合わせいずれかで受けた患者において、認められた。
4. データは、原発および転移性両方の腫瘤において認められた減少によって判定されるように、PAFP−アトラクチロシド組成物を投与された患者における用量依存反応を示した。
5. PAFP−アトラクチロシドの投与は、用量を増加させるにつれて、まれにしか急性免疫反応(体温の上昇、腫瘍/転移の部位における局所疼痛)を伴わない。
6. PAFPアトラクチロシド組成物の投与に応じたIV期癌患者における全身腫瘍組織量の減少は、組成物が経口投与可能であることを示唆した。
(実施例6)
インビボデータ−白血病:インビトロで第1のアポトーシス誘導剤と、第2のアポトーシス誘導剤とに可逆的に結合する外因性PAFPを備える組成物は、マウスにおける腫瘍細胞を殺滅する
毎日の治療は、
1−対照水
2−対照油
3−インビトロで第1のアポトーシス誘導剤(ベツリン酸)に結合したPAFP(PAFP−ベツリン酸組成物)
4−付加的な非結合ベツリン酸と組み合わせた、インビトロで第1のアポトーシス誘導剤(ベツリン酸)に結合したPAFP(PAFP−ベツリン酸組成物)
から成った。
インビボデータ−白血病:インビトロで第1のアポトーシス誘導剤と、第2のアポトーシス誘導剤とに可逆的に結合する外因性PAFPを備える組成物は、マウスにおける腫瘍細胞を殺滅する
毎日の治療は、
1−対照水
2−対照油
3−インビトロで第1のアポトーシス誘導剤(ベツリン酸)に結合したPAFP(PAFP−ベツリン酸組成物)
4−付加的な非結合ベツリン酸と組み合わせた、インビトロで第1のアポトーシス誘導剤(ベツリン酸)に結合したPAFP(PAFP−ベツリン酸組成物)
から成った。
マウスは、第1日に20,000個のP−388マウス白血病細胞を接種され、第2日に0.2mLの水(1)または油(2)の対照治療、または0.2mL用量の試験製剤3または4といった、1日経口用量を投与された。実験は、各治療群に10匹のマウスを含むように設計された。図5は、1日経口用量の水(1)、油(2)、PAFP結合ベツリン酸(3)、または付加的な非結合ベツリン酸と組み合わされたPAFP結合ベツリン酸(4)のうちの1つを投与されている動物における、時間の関数としてのP−388白血病細胞の増殖のグラフを示し、この場合、後半2つの製剤のそれぞれは、0.2mLの油中に懸濁される。
群4の治療は、過剰なベツリン酸をDMSO中に0.5mg/mLとして溶解し、そして2μL(1μg)のこの溶液を0.2mLのPAFP結合ベツリン酸製剤に加えることによって調製した。PAFP結合ベツリン酸が腫瘍細胞に送達されると、PAFPは細胞外に再循環されることが仮定されており、I125標識AFPが新生リンパ細胞系によって取り込まれ、細胞から実質的に分解されずに解放されることを実証したインビトロ研究の結果に基づいて、腫瘍細胞への後の送達のために腫瘍内微小環境において、外因性PAFPが過剰ベツリン酸と結合することを可能にする(Torres et al.,Int.J.Cancer 47(1):110−117,1991)。
ベツリン酸(BA)は、悪性黒色腫を治療するために使用されている(米国特許出願公報第2003/0186945号)が、大量のBAが必要とされる(毎日0.2mg〜500mg)。PAFPは、1:2のモル比でBAと混合され、その場合、組成物は、担体の役割を果たす0.2mLの油内の0.6mgのヒト用の量で存在している。重量比では、ベツリン酸は0.008mgの1日用量で存在している。PAFPと複合している場合、ベツリン酸はマイクログラム濃度でヒトにおいて有効であることが分かっている。Boik(Natural Compounds in Cancer Therapy、2001)は、ヒト用量(グラム/kg)=マウス用量(mg/kg)/104という、ヒト用量から同等のマウス経口用量を算出するための方程式を提供している。75kgのヒト体重および0.02kgのマウス体重は、0.0006g(ヒト用量)×104=マウス用量(mg/kg)=0.0624mg/kgをもたらす。0.02kgのマウスに対しては、用量は0.0624mg/kg×0.02kg=0.01248mgまたは12μgとして算出することが可能である。ヒト用量からマウス用量を算出するための係数は、600μg(ヒト1日用量)/12μg(マウス1日用量)=50である。過剰な第2のアポトーシス誘導剤が用量に含まれる場合、この第2のアポトーシス誘導剤は後に、油懸濁形態で、第1の複合体(PAFP/第1のアポトーシス誘導剤)の既に調製された油懸濁に加えられる。例えば、典型的なマウス用量は、0.05mLの油と混ぜられ、0.2mLの最終量の油まで、油中で溶解された0.15mgのベツリン酸と組み合わせられた、乾燥形態の7μgのPAFP−ベツリン酸複合体から成る。
過剰なベツリン酸がないPAFP結合ベツリン酸を投与されている動物(群3)における腫瘍容積の、過剰なベツリン酸と組み合わせてPAFP結合ベツリン酸を投与されている動物(群4)における腫瘍容積との比較は、後者の治療が腫瘍容積の減少を結果としてもたらしたことを示す。結果は、過剰な非結合ベツリン酸とのPAFP結合ベツリン酸の組み合わせにおける、治療的利益の追加を示唆している。データは、悪性新生物を治療するために、PAFPに結合することが可能であるアポトーシス誘導剤を使用することが可能であり、その細胞は、1)アポトーシス誘導剤と結合したPAFPの腫瘍細胞への送達、および2)インビボでPAFPに結合して治療成績を向上することが可能である第2のアポトーシス誘導剤の結果的な送達により、AFP受容体を発現することを、さらに示唆している。
結果は、PAFP結合ベツリン酸製剤中の過剰な非結合ベツリン酸の含有は、PAFP結合ベツリン酸単独よりも、腫瘍成長を低減させるのに効果的であることを実証している。さらに、データは、本発明の組成中に第2のアポトーシス誘導剤を使用する際の治療的利点を示唆している。
(実施例7)
インビボデータ−腫瘍:インビトロで第1の化合物と、第2の化合物とに可逆的に結合する外因性PAFPを備える組成物は、ヒト患者における固形腫瘍型の癌を殺滅するために使用される。
転移を伴う、または伴わない固形腫瘍がある5名の患者(女性4名および男性1名)における予備結果:
患者#1:女性、57歳、局所的乳癌
患者#2:女性、63歳、骨に転移した乳癌
患者#3:女性、44歳、卵巣・乳癌
患者#4:女性、60歳、リンパ節への転移を伴う乳癌
患者#5:男性、58歳、精巣癌
インビボデータ−腫瘍:インビトロで第1の化合物と、第2の化合物とに可逆的に結合する外因性PAFPを備える組成物は、ヒト患者における固形腫瘍型の癌を殺滅するために使用される。
転移を伴う、または伴わない固形腫瘍がある5名の患者(女性4名および男性1名)における予備結果:
患者#1:女性、57歳、局所的乳癌
患者#2:女性、63歳、骨に転移した乳癌
患者#3:女性、44歳、卵巣・乳癌
患者#4:女性、60歳、リンパ節への転移を伴う乳癌
患者#5:男性、58歳、精巣癌
本研究の目的は、手術不可能、既存の治療に対して難治性、または術後再発として分類される固形型癌の患者における、PAFP−ベツリン酸組成物に対する奏功を評価することであった。
患者は、朝に1つおよび就寝前に1つ、空腹時に2つのソフトゲルという1日投与量を服用した。各ソフトゲルは、PAFP−ベツリン酸製品(つまり、インビトロで外因性PAFPに可逆的に結合するベツリン酸)、および過剰なベツリン酸(つまり、PAFPに結合されない付加的なベツリン酸)から成っていた。PAFP−ベツリン酸製品は、1ソフトゲルにつき300μgのPAFPおよび6μgのベツリン酸という単一単位用量で提供した。過剰な、または付加的なベツリン酸は、1ソフトゲルにつき150μgで存在していた。
予備結果は、5名の患者中4名が、癌の進行率の減少、および痛みの軽減、エネルギーレベルの向上、および食欲の増進という患者報告によって判定されるような全体的により良い生活の質を実証したことを示した。患者は、ソフトゲルによる治療に関わる副作用を報告しなかった。
(実施例8)
インビボデータ−ヒト患者における転移性腫瘍容積の減少
本研究の目的は、固形腫瘍の治療における、PAFP−アトラクチロシド複合体の治療的利益を評価することであった。ソフトゲルは、転移性疾患の患者において空腹時に、朝に1つおよび就寝前に1つ、経口で毎日2カプセル投与した。
インビボデータ−ヒト患者における転移性腫瘍容積の減少
本研究の目的は、固形腫瘍の治療における、PAFP−アトラクチロシド複合体の治療的利益を評価することであった。ソフトゲルは、転移性疾患の患者において空腹時に、朝に1つおよび就寝前に1つ、経口で毎日2カプセル投与した。
13名の患者を評価した。12名の患者が結腸癌、1名の患者が乳癌と診断されていた。各患者は、少なくとも1部位に転移性疾患を呈した。7名の患者が女性で6名が男性であり、それぞれ年齢は45歳から65歳であった。
各患者は、4から8週間にわたって毎日、2カプセル(1カプセルにつき0.3mgのPAFP+0.006mgのアトラクチロシド)の投与量で、PAFP結合アポトーシス誘導剤(CPAという名)を投与された。コンピュータ断層撮影法(CT)(Siemens、16層)スキャンを治療の前後に行った。
下記は該研究の結果である。CTスキャンデータに基づき、患者奏功を次のうちの1つとして分類した:
完全: 明白な転移なし
部分的:少なくとも1つの転移が消滅したか、または大きさが減少した
安定: 安定化についての世界保健機関標準内の転移成長(25%未満の成長)。
進行: 転移の大きさの増加(25%以上)または健康状態の悪化のいずれか。
中断: 副作用が治療の中断につながった。
完全: 明白な転移なし
部分的:少なくとも1つの転移が消滅したか、または大きさが減少した
安定: 安定化についての世界保健機関標準内の転移成長(25%未満の成長)。
進行: 転移の大きさの増加(25%以上)または健康状態の悪化のいずれか。
中断: 副作用が治療の中断につながった。
患者データの概要を表4に提供する。治療の前後にとられたCTスキャンを、各々が治療の完全奏功を実証した患者P.およびP.N.G.について図6および7に提供する。
完全な患者情報は次のとおりである:
患者:P.
性別:男。年齢:56歳。
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)、腺癌(2005年1月21日よりB−123256−68)
以前の治療:手術(腫瘍切除)−2005年1月15日
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:1肝転移(Mts)(13×15mm)(2006年5月15日からのCT)
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年5月5日〜2006年7月15日
治療の結果: 肝Mtsなし(2006年8月2日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=80%
副作用:なし
結論:完全奏功。転移は消滅した。
患者P.については、治療の前(左)および後(右)にとられたCTスキャン(図6)の比較は、転移(矢印)が治療後にもはや明瞭ではないことを示す。
性別:男。年齢:56歳。
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)、腺癌(2005年1月21日よりB−123256−68)
以前の治療:手術(腫瘍切除)−2005年1月15日
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:1肝転移(Mts)(13×15mm)(2006年5月15日からのCT)
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年5月5日〜2006年7月15日
治療の結果: 肝Mtsなし(2006年8月2日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=80%
副作用:なし
結論:完全奏功。転移は消滅した。
患者P.については、治療の前(左)および後(右)にとられたCTスキャン(図6)の比較は、転移(矢印)が治療後にもはや明瞭ではないことを示す。
患者:P.N.G.
性別:男。年齢:62歳。
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)。腺癌(2005年1月9日よりO−1045−48)。
以前の治療:手術(腫瘍切除、左)−2005年8月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行;1肝臓Mts:7×10mm(2006年5月20日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月10日〜2006年7月22日
治療の結果:肝Mtsなし(2006年8月16日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:完全奏功。転移(7×10mm)は消滅した。
患者P.N.G.については、治療の前(左)および後(右)にとられたCTスキャン(図7)の比較は、転移(矢印)が治療後にもはや明瞭ではないことを示す。
性別:男。年齢:62歳。
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)。腺癌(2005年1月9日よりO−1045−48)。
以前の治療:手術(腫瘍切除、左)−2005年8月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行;1肝臓Mts:7×10mm(2006年5月20日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月10日〜2006年7月22日
治療の結果:肝Mtsなし(2006年8月16日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:完全奏功。転移(7×10mm)は消滅した。
患者P.N.G.については、治療の前(左)および後(右)にとられたCTスキャン(図7)の比較は、転移(矢印)が治療後にもはや明瞭ではないことを示す。
患者:A.N.A.
性別:女。年齢:48歳。
臨床診断:結腸癌(T3a N1 M1)、転移:1(肝臓)、腺癌(2005年9月25日よりB−1167−75)。
以前の治療:手術なし、化学療法(Eloxatin、Alimta)、2005年10月〜2006年2月、腫瘍成長の安定化
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:肝臓Mts(左葉):25×27mm(2006年5月28日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=80%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月10日〜2006年8月12日
治療の結果:肝臓Mts(左葉):16×11mm(2006年8月21日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:部分的奏功:転移縮小。
CTスキャンは、1日2回投与量のPAFP−アトラクチロシド組成物を投与された患者の肝臓における結腸癌転移の大きさの73%(25×27=675、16×11=176、675−176=499、499/675=73.9%)縮小を示す。
性別:女。年齢:48歳。
臨床診断:結腸癌(T3a N1 M1)、転移:1(肝臓)、腺癌(2005年9月25日よりB−1167−75)。
以前の治療:手術なし、化学療法(Eloxatin、Alimta)、2005年10月〜2006年2月、腫瘍成長の安定化
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:肝臓Mts(左葉):25×27mm(2006年5月28日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=80%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月10日〜2006年8月12日
治療の結果:肝臓Mts(左葉):16×11mm(2006年8月21日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:部分的奏功:転移縮小。
CTスキャンは、1日2回投与量のPAFP−アトラクチロシド組成物を投与された患者の肝臓における結腸癌転移の大きさの73%(25×27=675、16×11=176、675−176=499、499/675=73.9%)縮小を示す。
患者:A.N.P.
性別:女、年齢:63歳
臨床診断:結腸癌(T3 N0 M0)、腺癌(2005年1月14日よりO−1117−29)。
以前の治療:手術(片側結腸切除術、右)−2004年12月
2005年8月−進行。化学療法−Eloxation、Xeloda、5−FU;部分的奏功
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行、Retzidiv:3肝臓Mts:21×28mm、27×29mm、10×12mm(2006年5月17日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=70−80%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月5日〜2006年7月30日
治療の結果:2肝臓Mts:21×28mm、27×29mm(2006年8月8日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:部分的奏功:肝転移のうちの1つ(10×12mm)の消滅。
性別:女、年齢:63歳
臨床診断:結腸癌(T3 N0 M0)、腺癌(2005年1月14日よりO−1117−29)。
以前の治療:手術(片側結腸切除術、右)−2004年12月
2005年8月−進行。化学療法−Eloxation、Xeloda、5−FU;部分的奏功
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行、Retzidiv:3肝臓Mts:21×28mm、27×29mm、10×12mm(2006年5月17日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=70−80%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月5日〜2006年7月30日
治療の結果:2肝臓Mts:21×28mm、27×29mm(2006年8月8日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:部分的奏功:肝転移のうちの1つ(10×12mm)の消滅。
患者:S.V.A.
性別:女。年齢:45歳
臨床診断:結腸癌(T2 N1 M0)。腺癌(2005年3月25日よりO−1135−42)。
以前の治療:手術(片側結腸切除術、左)−2005年3月
2006年5月−対症療法
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年4月−進行:3肝臓Mts:45×65mm、26×42mm、および7×9mm(2006年4月26日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=80%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月29日〜2006年7月24日
治療の結果:2肝臓Mts:42×55mmおよび26×42mm(2006年8月3日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:部分的奏功:1転移は消去(7×9mm)し、2転移は安定化した。
性別:女。年齢:45歳
臨床診断:結腸癌(T2 N1 M0)。腺癌(2005年3月25日よりO−1135−42)。
以前の治療:手術(片側結腸切除術、左)−2005年3月
2006年5月−対症療法
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年4月−進行:3肝臓Mts:45×65mm、26×42mm、および7×9mm(2006年4月26日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=80%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月29日〜2006年7月24日
治療の結果:2肝臓Mts:42×55mmおよび26×42mm(2006年8月3日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:部分的奏功:1転移は消去(7×9mm)し、2転移は安定化した。
患者:Z.T.P
性別:女。年齢:49歳
臨床診断:乳癌(T3b N1 M0)
以前の治療:手術(乳腺切除術)−2004年12月、放射線治療(リンパ節の部位)
Taxotereによる治療、安定
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年7月−進行。1肝臓Mts:67×69mm(2006年7月18日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年8月5日〜2006年9月2日
治療の結果:1肝臓Mts:68×66mm(2006年8月30日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:安定化。
性別:女。年齢:49歳
臨床診断:乳癌(T3b N1 M0)
以前の治療:手術(乳腺切除術)−2004年12月、放射線治療(リンパ節の部位)
Taxotereによる治療、安定
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年7月−進行。1肝臓Mts:67×69mm(2006年7月18日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年8月5日〜2006年9月2日
治療の結果:1肝臓Mts:68×66mm(2006年8月30日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:安定化。
患者:G.N.K.
性別:女、年齢:62歳
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)、腺癌(2005年6月14日よりO−1086−92)
以前の治療:手術(腫瘍切除、右)−2005年6月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:2肝臓Mts:8×6mmおよび6×6mm(2006年10月6日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年7月1日〜2006年9月2日
治療の結果:2肝臓Mts:8×6mmおよび6×6mm(2006年9月15日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:安定化。
性別:女、年齢:62歳
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)、腺癌(2005年6月14日よりO−1086−92)
以前の治療:手術(腫瘍切除、右)−2005年6月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:2肝臓Mts:8×6mmおよび6×6mm(2006年10月6日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年7月1日〜2006年9月2日
治療の結果:2肝臓Mts:8×6mmおよび6×6mm(2006年9月15日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:安定化。
患者:P.A.G.
性別:男。年齢:65歳
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)。腺癌(2005年9月25日よりO−1256−65)。
以前の治療:外科手術−2005年9月。2005年12月−進行:肝臓内のMts
5コースの化学療法:5−FU。
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:2肝臓Mts:32×24mmおよび32×26mm(2006年6月14日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月19日〜2006年8月13日
治療の結果:2肝臓Mts:32×24mmおよび32×26mm(2006年8月22日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:安定化
性別:男。年齢:65歳
臨床診断:結腸癌(T2 N0 M0)。腺癌(2005年9月25日よりO−1256−65)。
以前の治療:外科手術−2005年9月。2005年12月−進行:肝臓内のMts
5コースの化学療法:5−FU。
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:2肝臓Mts:32×24mmおよび32×26mm(2006年6月14日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月19日〜2006年8月13日
治療の結果:2肝臓Mts:32×24mmおよび32×26mm(2006年8月22日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:安定化
患者:B.L.N.
性別:女、年齢:57歳
臨床診断:結腸癌(T3b N0 M0)、腺癌(2006年1月14日よりO−1245−61)
以前の治療:手術(腫瘍切除、右)−2005年12月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:肝臓Mts:18×12mm(2006年6月19日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年7月2日〜2006年8月27日
治療の結果:肝臓Mts:22×18mm(2006年9月4日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:進行。転移が25%以上増加した。
性別:女、年齢:57歳
臨床診断:結腸癌(T3b N0 M0)、腺癌(2006年1月14日よりO−1245−61)
以前の治療:手術(腫瘍切除、右)−2005年12月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:肝臓Mts:18×12mm(2006年6月19日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年7月2日〜2006年8月27日
治療の結果:肝臓Mts:22×18mm(2006年9月4日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:進行。転移が25%以上増加した。
患者:K.A.R.
性別:男。年齢:52歳
臨床診断:結腸癌(T3b N1 M1−Hep.)、腺癌(B−1189−96)
以前の治療:手術なし。化学療法−Eloxation(2005年12月〜2006年2月)安定化
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:1肝臓Mts:118×85mm(2006年6月19日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=60〜70%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月26日〜2006年8月27日
治療の結果:1肝臓Mts:118×85mm(2006年6月19日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=40〜50%
夜に体温が上がる。歩行不可。
副作用:嘔吐、悪心
結論:臨床的進行。転移−非動的(安定化)
性別:男。年齢:52歳
臨床診断:結腸癌(T3b N1 M1−Hep.)、腺癌(B−1189−96)
以前の治療:手術なし。化学療法−Eloxation(2005年12月〜2006年2月)安定化
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:1肝臓Mts:118×85mm(2006年6月19日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=60〜70%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月26日〜2006年8月27日
治療の結果:1肝臓Mts:118×85mm(2006年6月19日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=40〜50%
夜に体温が上がる。歩行不可。
副作用:嘔吐、悪心
結論:臨床的進行。転移−非動的(安定化)
患者:K.V.I.
性別:男、年齢:48歳
臨床診断:結腸癌(T3b N1 M1−Hep.)。腺癌(B−1245−50)
以前の治療:手術なし。化学療法−Eloxation(2005年10月〜11月)。部分的奏功
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:1肝臓Mts:19×9mm(2006年5月16日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月5日〜2006年7月30日
治療の結果:1肝臓Mts:28×32mm(2006年8月8日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:進行。
性別:男、年齢:48歳
臨床診断:結腸癌(T3b N1 M1−Hep.)。腺癌(B−1245−50)
以前の治療:手術なし。化学療法−Eloxation(2005年10月〜11月)。部分的奏功
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:1肝臓Mts:19×9mm(2006年5月16日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月5日〜2006年7月30日
治療の結果:1肝臓Mts:28×32mm(2006年8月8日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし
結論:進行。
患者:P.A.V.
性別:男。年齢:65歳
臨床診断:結腸癌(T3a N0 M0)。腺癌(2005年2月12日よりO−1212−34)。
以前の治療:手術(腫瘍切除)−2005年2月
2005年10月−進行;肝臓内のMts
2005年10月〜11月−化学療法(Eloxation)−部分的奏功
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:2肝臓Mts:7×8mmおよび5×6mm(2006年6月6日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月5日〜2006年8月6日
治療の結果:2肝臓Mts:12×9mmおよび6×8mm(2006年8月7日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし。
結論:進行。
性別:男。年齢:65歳
臨床診断:結腸癌(T3a N0 M0)。腺癌(2005年2月12日よりO−1212−34)。
以前の治療:手術(腫瘍切除)−2005年2月
2005年10月−進行;肝臓内のMts
2005年10月〜11月−化学療法(Eloxation)−部分的奏功
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年6月−進行:2肝臓Mts:7×8mmおよび5×6mm(2006年6月6日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月5日〜2006年8月6日
治療の結果:2肝臓Mts:12×9mmおよび6×8mm(2006年8月7日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
副作用:なし。
結論:進行。
患者:R.D.P.
性別:女。年齢:62歳
臨床診断:結腸癌(T2 N1 M0)。腺癌(2004年9月29日よりO−1187−48)。
以前の治療:手術(腫瘍切除、左)−2004年9月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:2肝臓Mts:65×85mmおよび46×22mm、融合傾向(2006年5月14日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月
治療の結果:判定されず
副作用:嘔吐、悪心;制吐薬によって抑制されず
結論:治療は副作用(嘔吐、悪心)のために中断された。
性別:女。年齢:62歳
臨床診断:結腸癌(T2 N1 M0)。腺癌(2004年9月29日よりO−1187−48)。
以前の治療:手術(腫瘍切除、左)−2004年9月
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与の前:
2006年5月−進行:2肝臓Mts:65×85mmおよび46×22mm、融合傾向(2006年5月14日からのCT)
生活の質(カルノフスキー指数)=90%
PAFP−アトラクチロシド組成物の投与:2006年6月
治療の結果:判定されず
副作用:嘔吐、悪心;制吐薬によって抑制されず
結論:治療は副作用(嘔吐、悪心)のために中断された。
本研究で治療されている進行癌を考慮すると、1日用量のCPAを投与された13名の患者の結果は、61%(8/13)が奏功を実証したことを示す。奏功とは、転移性腫瘤が治療後に検出不可能であった(15%、2/13)、少なくとも1つの転移性腫瘤が消去またはサイズが縮小した(23%、3/13)、または転移成長において進行が認められなかった(安定化、23%、3/13)、のうちのいずれかを意味する。
4名の患者が疾患の進行を経験し(31%)、および1名(8%)は副作用(嘔吐、悪心)により研究から排除された。主要治験責任医師は、副作用が治療に直接関連していたかどうかを判定することができず、肝臓内の初期転移の大きさ(65×85mmおよび46×22mm、融合傾向)が影響を及ぼした可能性を示唆している。
製品の摂取に直接相関していた可能性がない嘔吐の1症例を除いて、重篤な副作用は報告されなかった。
患者A.N.A.およびA.N.P.には、それぞれEloxatin/AlimtaおよびEloxatin/Xeloda/5−FUによる治療後に発生した多剤耐性転移があった。PAFP−アトラクチロシド組成物治療の後、これらの患者は転移性腫瘍サイズの縮小を実証した。これらのデータは、インビボで多剤耐性を克服するPAFP−アトラクチロシド複合体の能力を支持する。
前述のものは、本発明の特定の側面の具体例である。その変更および変形物を含む、その他多くの実施形態も可能であり、本願に記載の本発明を再考することによって当業者にとっては明白となる。したがって、全ての適切な変更、変形物、および同等物を用いてもよく、そのような変更、変形物、および同等物は、本願で説明されるような本発明の範囲内および添付請求項の範囲内であることを目的としている。
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Claims (14)
- 外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物であって、
前記少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性AFPに可逆的に結合する、組成物。 - 前記外因性AFPに可逆的に結合する2つのアポトーシス誘導剤が存在する、請求項1に記載の組成物。
- 前記アポトーシス誘導剤は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、ロテノン、ピエリシジンA、ロニダミン、CD437、三酸化ヒ素、A23187、イオノマイシン、ビタミンD2およびD3、デキサメタゾン、およびAccutaneを備える群より選択される、請求項1または2のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物の前記AFPは、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有する細胞に特異的に結合する、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 前記AFPは、ブタAFPである、請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
- 前記ブタAFPは、妊娠約3週から約14週のブタ胚から抽出される、請求項5に記載の組成物。
- 前記組成物は、経口投薬用のカプセル、ソフトゲル、または錠剤;坐薬;注射剤;吸入処方;点鼻薬;点眼薬;包帯;塗布薬;または局所製剤の形態である、請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
- 哺乳類において、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤を、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有する癌細胞に送達するための外因性AFPの使用であって、前記少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性AFPに可逆的に結合し、前記外因性AFPは、前記少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する、使用。
- 哺乳類において、少なくとも1つのアポトーシス誘導剤を、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有する癌細胞に標的化送達するための薬剤の調製における、
外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用であって、
前記少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性AFPに可逆的に結合し、前記外因性AFPは、前記少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する、使用。 - 哺乳類の癌細胞の増殖の抑制のための、
外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用であって、
前記癌細胞は細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有し、前記少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性AFPに可逆的に結合し、前記外因性AFPは、前記細胞表面上の前記少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する、使用。 - 難治性悪性新生物における多剤耐性を治療するための、
外因性アルファフェトプロテイン(AFP)と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用であって、
前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有する癌細胞から成り、前記少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性AFPに可逆的に結合し、前記外因性AFPは、前記細胞表面上の前記少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する、使用。 - 哺乳類の癌細胞増殖を抑制する方法であって、前記癌細胞は細胞表面に少なくとも1つのAFP受容体を有し、前記方法は、
外因性AFPと、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を、哺乳類に投与するステップを備え、
前記少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性AFPに可逆的に結合し、前記外因性AFPは、前記細胞表面上の前記少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する、方法。 - 難治性悪性新生物における多剤耐性を治療する方法であって、前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも1つのAFPを有する癌細胞を備え、
外因性AFPと、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ9活性剤、カスパーゼ3活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも1つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を、哺乳類に投与するステップを備え、
前記少なくとも1つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性AFPに可逆的に結合し、前記外因性AFPは、前記細胞表面上の前記少なくとも1つのAFP受容体に特異的に結合する、方法。 - (a)妊娠約3週から約14週のブタ胚から血液および羊水を採取するステップと、
(b)(a)で採取される前記血液および前記羊水を浮遊物および沈殿物に分離するステップと、
(c)(b)に起因する前記浮遊物を採取するステップと、
(d)濃縮溶液を形成するように(c)に起因する前記浮遊物を濃縮するステップと、
(e)溶液中で約5%から約10%のブタノールの最終濃度まで、(d)の前記濃縮溶液にブタノールを添加するステップと、
(f)(e)に起因する前記ブタノール溶液を攪拌するステップと、
(g)(f)に起因する前記ブタノール溶液を、上層非水相および下層水相に分離するステップと、
(h)非結合ブタAFPを含む最終溶液を生成するように(g)に起因する前記非水相を採取するステップ、
といった順次的なステップを備える、ブタノールを使用した、原料からのブタAFPの抽出のための過程。
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