KR20080064422A - 광센서 프로브 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

광센서 프로브 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 a) 표면에 형광염료가 고정화된 센서막; b) 일정한 파장의 빛을 발산하는 발광다이오드; c) 발산되는 빛을 검출하는 포토다이오드; d) 발광다이오드나 형광염료에 의해 발산되는 빛을 통과시키는, 센서막과 발광다이오드 및 포토다이오드, 또는 센서막과 포토다이오드를 연결하는 광섬유; e) 발광다이오드로부터 발산되는 빛 중 형광염료가 감응할 수 있는 여기광만을 선택적으로 투과시키는, 발광다이오드 앞에 위치하는 여기 필터; 및 f) 형광염료에 의해 발산되는 형광만을 선택적으로 투과시키는, 포토다이오드 앞에 위치하는 발산 필터: 를 포함하는, 광센서 프로브(optical sensor probes) 및 이를 이용하여 생물반응기에서 인시투(in-situ) 방식으로 용존 산소, 용존 이산화탄소, pH 등을 검출하는 방법에 관한 것이다.
광섬유, 발광다이오드, 센서 프로브, 인시투, 형광염료

Description

광센서 프로브 및 이를 이용한 검출방법{Optical sensor probes and detection methods using the same}
도 1은 두 가닥의 광섬유를 이용하여 형광을 검출하는 광센서 프로브의 구조를 나타낸 도면이고;
도 2는 한 가닥의 광섬유를 이용하여 형광을 검출하는 광센서 프로브의 구조를 나타낸 도면이며;
도 3 내지 5는 광센서 프로브의 본체를 나타낸 도면이고;
도 6은 졸-겔 법을 이용하여 석영판에 형광염료를 스핀 코팅하여 제작된 센서막을 나타낸 도면이고;
도 7은 실리콘을 이용하여 석영판에 형광염료를 코팅하여 제작된 센서막을 나타낸 도면이다.
본 발명은 광센서 프로브(optical sensor probes) 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 용존 산소, 용존 이산화탄소 또는 pH 검출용 형광염료, 발광다이오드(LED: Light Emitting Diode) 및 광섬유를 이용하여 제작되 는 광센서 프로브 및 이를 이용하여 용존 산소, 용존 이산화탄소 또는 pH를 검출하는 방법에 관한 것이다.
생물공정에서 용존 산소, 용존 이산화탄소 및 pH는 미생물 생장과 밀접한 관계를 지니고 있다. 따라서 최근 배양기 내 용존 산소, 용존 이산화탄소 또는 pH를 모니터링하기 위한 기술개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히 광학 검출기술을 이용하여 광섬유 이산화탄소 센서, pH 및 용존 산소 센서의 개발이 많이 이루어지고 있다. 광학기술을 이용한 분석 및 온라인 모니터링 기술은 기존의 전기화학적 방법을 이용한 시스템 보다 구성이 간단하고 전자기적 잡음을 일으키지 않으며, 특히 소형으로 제작이 용이하다. 최근에는 용존산소, pH 및 이산화탄소를 감응할 수 있는 형광염료를 고정화시킨 졸-겔(sol-gel) 기술이 연구되고 있다. 졸-겔 기술은 다른 고정화기술에 비하여 간단하고 결합력이 강하며 다른 환경 인자에 대한 저항성이 크다는 장점을 가지고 있다. 또한 투명한 결정을 이루기 때문에 광학 검출 시스템으로의 적용성이 뛰어나다.
한편, 용존 산소, pH 및 이산화탄소를 감응할 수 있는 형광염료로는 루테니움(ruthenium) 복합체, HPTS(8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 트리소디움염), 플루오르세인아민(fluoreceinamine)을 들 수 있다. 루테니움을 이용한 복합체들은 특정 파장에서 형광 특성을 갖는데, 대표적으로 RuDPP(트리스(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린)루테니움 (Ⅱ) 복합체)는 470 ㎚의 여기광을 입사시켰을 때 580 ㎚의 형광을 방출하는 특성을 지니고 있으며, 산소의 농도에 반비례하여 형광을 발생시킨 다. 또한, HPTS는 이산화탄소 검출용 형광염료로 사용되며, 플루오르세인아민은 pH 검출용 형광염료로 사용되는 물질이다.
그러나 지금까지 개발된 광섬유 센서는 플라스틱 재질로서, 고온고압 멸균이 불가능하여 생물반응기에 인시투(in-situ) 방식으로 적용할 수 없다는 단점이 있었으며, 용존 산소, 이산화탄소, pH 중 어느 한 가지만을 검출 모니터링할 수 있는 것이었다.
본 발명자들은 고온고압 멸균이 가능하여 생물반응기에 인시투 방식으로 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 용존 산소, 이산화탄소, pH 등과 같은 다양한 분석물질을 검출할 수 있는, 형광염료를 이용한 광센서 프로브를 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행해왔다. 그 결과, 용존 산소, 용존 이산화탄소 또는 pH 검출용 형광염료, 발광다이오드 및 광섬유를 이용하여 광센서 프로브를 제작함으로써 상기 목적을 달성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 고온고압 멸균이 가능하여 생물반응기에 인시투 방식으로 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 용존 산소, 이산화탄소, pH 등과 같은 여러 분석물질을 동시에 검출할 수 있는, 형광염료를 이용한 광센서 프로브를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 광센서 프로브를 이용하여 생물반응기에서 인시투 방식으로 여러 분석물질을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은
a) 표면에 형광염료가 고정화된 센서막;
b) 일정한 파장의 빛을 발산하는 발광다이오드;
c) 발산되는 빛을 검출하는 포토다이오드;
d) 발광다이오드나 형광염료에 의해 발산되는 빛을 통과시키는, 센서막과 발광다이오드 및 포토다이오드, 또는 센서막과 포토다이오드를 연결하는 광섬유;
e) 발광다이오드로부터 발산되는 빛 중 형광염료가 감응할 수 있는 여기광만을 선택적으로 투과시키는, 발광다이오드 앞에 위치하는 여기 필터; 및
f) 형광염료에 의해 발산되는 형광만을 선택적으로 투과시키는, 포토다이오드 앞에 위치하는 발산 필터:
를 포함하는, 광센서 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 따른 광센서 프로브에서, 광섬유는 발광다이오드로부터 발산되는 빛을 통과시키고 센서막과 발광다이오드를 연결하는 제1광섬유와, 형광염료로부터 발산되는 빛을 통과시키고 센서막과 포토다이오드를 연결하는 제2광섬유로 이루어지거나, 발광다이오드로부터 발산되는 빛과 형광염료로부터 발산되는 빛을 통과시키고 센서막과 포토다이오드를 연결하는 한 가닥의 광섬유로 이루어질 수 있다. 한 가닥의 광섬유를 이용하는 경우에는, 발광다이오드와 포토다이오드가 직각으로 위치하며, 그 중간에 45°에서 여기광을 반사시키고 180°에서 입사광을 투과시키는 다이크로익 필터(dichroic filter)를 위치시킬 수 있다. 또한, 형광염료는 루테니움 복합체, HPTS 및 플루오르세인아민으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있 으며, 졸-겔(sol-gel) 법 또는 실리콘을 이용하여 센서막의 표면에 고정화될 수 있다. 본 발명에 따른 광센서 프로브는 스테인레스 스틸 재질의 외부 용기 및/또는 포토다이오드로 들어오는 신호를 증폭시키는 증폭기를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 센서막과 광섬유가 광센서 프로브로부터 탈착가능한 형태인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 제2면은 상기 광센서 프로브를 이용하여 생물반응기에서 인시투 방식으로 용존 산소, 용존 이산화탄소 또는 pH를 검출하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 광센서 프로브는 하기 구성요소를 포함하는 것이다:
a) 표면에 형광염료가 고정화된 센서막;
b) 일정한 파장의 빛을 발산하는 발광다이오드;
c) 발광다이오드로부터 발산되는 빛 중 형광염료가 감응할 수 있는 여기광만을 선택적으로 투과시키는 여기 필터;
d) 발산되는 빛을 검출하는 포토다이오드;
e) 형광염료에 의해 발산되는 형광만을 선택적으로 투과시키는 발산 필터; 및
f) 발광다이오드나 형광염료에 의해 발산되는 빛을 통과시키는 광섬유.
본 발명에 따른 광센서 프로브에서, 센서막으로는 석영판을 사용할 수 있는 바, 석영판의 표면에 형광염료를 졸-겔 법을 이용하여 고정화시킬 수 있다. 산소 검출을 위해 사용되는 루테니움 복합체나 pH 검출을 위해 사용되는 플루오르세인아민의 경우, 먼저 테트라에틸오르쏘실리케이트와 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란을 혼합한 후 질소 상에서 보관한다. 테트라메틸암모늄 하이드록사이드 용액을 고순도 에탄올과 혼합하여 빙냉시킨 후, 상기 용액과 혼합 교반하여 졸-겔 용액을 제조한다. 얻어진 졸-겔 용액에 고순도 에탄올에 용해시킨 루테니움 복합체 용액을 1:1 비율로 혼합하여 교반하고 센서막 표면에 코팅한 후, 실온에서 공기 건조 후 80 ℃에서 건조하여 고정화한다. 이산화탄소 검출을 위해 사용되는 HPTS를 고정화하기 위해서는, 3-아미노프로필-트리에톡시실란, 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란 및 테트라에틸오르쏘실리케이트와 공기 중의 이산화탄소만을 확산시키기 위해 소수성 고분자인 하이드록시-말단 폴리(디메틸실록산)을 사용한다. 먼저 테트라에틸오르쏘실리케이트와 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란, 하이드록시-말단 폴리(디메틸실록산) 및 3-아미노프로필-트리에톡시실란, 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란을 혼합하여 빙냉시키고 교반하여 졸-겔 용액을 제조한다. 테트라메틸암모니움 하이드록사이드를 고순도 에탄올과 혼합하여 빙냉시키며 교반한 후 상기 졸-겔 용액과 혼합하고 교반하여 졸-겔 용액을 제조한다. 고순도 에탄올에 용해된 HPTS를 졸-겔 용액과 혼합하고 실온에서 교반한 후 센서막 표면에 코팅한 후, 상기와 같이 건조하여 고정화한다. 한편, 실리콘을 이용하여서도 고정화를 수행할 수 있는 바, 센서막 표면에 실리콘과 형광염료를 톨루엔에 용해시킨 용액을 코팅하고 실온에서 공기 건조시킨다.
본 발명에 따른 광센서 프로브에서, 광섬유는 발광다이오드로부터 발산되는 빛을 통과시키는 제1광섬유와, 형광염료로부터 발산되는 빛을 통과시키는 제2광섬유로 이루어질 수 있다(도 1 참조). 또한, 광섬유는 발광다이오드로부터 발산되는 빛과 형광염료로부터 발산되는 빛을 통과시키는 한 가닥의 광섬유로 이루어질 수 있는 바, 이 경우에는 발광다이오드와 포토다이오드를 직각으로 위치시키며, 그 중간에 45°에서 여기광을 반사시키고 180°에서 입사광을 투과시키는 다이크로익 필터를 위치시킬 수 있다(도 2 참조). 또한, 본 발명에 따른 광센서 프로브는 포토다이오드로 들어오는 신호를 증폭시키는 증폭기를 추가로 포함하는 것이 바람직하다(도 1 및 2 참조). 본 발명에 따른 광센서 프로브의 본체를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
본 발명에 따른 센서 프로브는 스테인리스 스틸 재질의 외부용기를 사용하여, 일반 생물반응기에서 적용가능하도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 센서막과 광섬유가 광센서 프로브로부터 탈착가능한 형태로, 광섬유 부분을 분리하여 프로브만을 생물반응기에 결합하여 고온고압 멸균이 가능하도록 하고, 분석대상에 따라 센서막을 교환하여 사용함으로써 하나의 센서 프로브로 용존 산소, 용존 이산화탄소, pH 등 다양한 분석물질을 검출 모니터링할 수 있도록 하는 것이 보다 바람직하다.
따라서, 본 발명에 따른 광센서 프로브는 생물반응기에 장착하여 반응기 내 용존 산소, 용존 이산화탄소 및 pH를 인시투 방식으로 온라인 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라, 각종 환경 모니터링 및 공정 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 하나의 센서 프로브를 사용하여 동시에 여러 가지 분석물질을 모니터링할 수 있으며, 빛을 이용한 분석이므로 특히 전자기장에 민감한 분석 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.
제조예 1: 졸-겔 법을 이용한 루테니움 복합체 및 플루오르세인아민의 고정화
루테니움 복합체 또는 플루오르세인아민을 석영판 표면에 고정화하기 위하여, 테트라에틸오르쏘실리케이트(98%) 0.6 ㎖와 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란(98%) 0.6 ㎖를 혼합한 후 질소 상에서 보관하였다. 0.4 ㎖의 테트라에틸암모늄 하이드록사이드(25%) 용액을 1.5 ㎖의 고순도 에탄올과 혼합한 후, 이 용액을 빙냉시킨 후 상기 용액과 혼합하고 실온에서 3 시간 동안 교반하여 졸-겔 용액을 얻었다. 얻어진 졸-겔 용액과 고순도 에탄올에 5 ㎎/ℓ의 농도로 용해시킨 루테니움 복합체 용액을 1:1 비율로 혼합한 후, 실온에서 하루 동안 교반하고 용액을 석영판 표면에 코팅하였다. 상기 코팅된 석영판을 실온에서 5 일간 공기 중에서 건조시킨 후 80 ℃에서 2 일간 건조하여 고정화하였다.
제조예 2: 졸-겔 법을 이용한 HPTS의 고정화
HPTS를 석영판 표면에 고정화하기 위하여, 3-아미노프로필-트리에톡시실란, 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란 및 테트라에틸오르쏘실리케이트와 공기 중의 이산화탄소만을 확산시키기 위해 소수성 고분자인 하이드록시-말단 폴리(디메틸실록산)을 사용하여 졸-겔을 형성하였다. 먼저 0.6 ㎖의 테트라에틸오르쏘실리케이트와 0.4 ㎖의 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란, 0.4 ㎖의 하이드록시-말단 폴리(디메틸실록산) 및 0.6 ㎖의 3-아미노프로필-트리에톡시실란, 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란을 혼합하여 빙냉 하에 교반하여 졸-겔 용액을 제조하였다. 테트라에틸암모늄 하이드록사이드(25%) 0.4 ㎖를 1.5 ㎖의 고순도 에탄올과 혼합하여 빙냉시키며 교반하였다. 상기 졸-겔 용액과 혼합하고 3 시간 동안 교반하여 졸-겔 용액을 제조하였다. 고순도 에탄올에 용해된 5 ㎎/ℓ의 HPTS를 졸-겔 용액과 혼합하고 실온에서 하루 동안 교반한 후 석영판 표면에 코팅하고, 상기 제조예 1과 동일하게 건조하여 고정화하였다.
제조예 3: 실리콘을 이용한 루테니움 복합체, HPTS 및 플루오르세인아민의 고정화
석영판 표면에 실리콘과 형광염료를 톨루엔에 용해시킨 용액을 코팅하고 실온에서 공기 건조시켜 고정화하였다.
실시예 1: 두 가닥의 광섬유로 이루어지는 광센서 프로브의 제작
광원으로 470 ㎚의 빛을 발광하는 블루 발광다이오드(blue LED)를 사용하고, 형광염료가 감응할 수 있는 여기광만을 조사하기 위하여 LED 앞에 광학 밴드 통과 필터(optical band pass filter)를 위치시켰다. 또한 검출기(실리콘 포토다이오드)로 입사되는 빛 중의 원하는 파장의 빛(형광염료에 의해 발생된 형광)만을 선택 적으로 받아들이기 위하여 광학 밴드 통과 필터를 두었다. 상기 제조예 1 내지 3에 따라, 형광염료를 두께 2 ㎜, 직경 12 mm의 석영판에 고정화하였다. 또한 LED에서 일정한 광량을 방출시키기 위하여 전자제어부에 LED를 연결하고, 검출기로 들어오는 신호를 증폭시키기 위하여 록-인 증폭기(lock-in amplifier)를 포토다이오드에 연결하여, 도 1에 나타낸 바와 같은 광센서 프로브를 제작하였다.
실시예 2: 한 가닥의 광섬유로 이루어지는 광센서 프로브의 제작
광원과 검출기는 상기 실시예 1과 같이 설치하되, 한 가닥의 광섬유를 이용하기 위하여 LED와 포토다이오드를 직각으로 위치시키고, 그 중간에 45°에서 여기광을 반사시키고 180°에서 입사광을 투과시키는 다이크로익 필터를 위치시켜 도 2에 나타낸 바와 같은 광센서 프로브를 제작하였다.
상기한 바와 같은 광센서 프로브는 생물반응기에 장착하여 반응기 내 용존 산소, 용존 이산화탄소 및 pH를 온라인 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라, 각종 환경 모니터링 및 공정 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 하나의 센서 프로브를 사용하여 동시에 여러 가지 분석물질을 모니터링할 수 있으며, 빛을 이용한 분석이므로 특히 전자기장에 민감한 분석 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. a) 표면에 형광염료가 고정화된 센서막;
    b) 일정한 파장의 빛을 발산하는 발광다이오드;
    c) 발산되는 빛을 검출하는 포토다이오드;
    d) 발광다이오드나 형광염료에 의해 발산되는 빛을 통과시키는, 센서막과 발광다이오드 및 포토다이오드, 또는 센서막과 포토다이오드를 연결하는 광섬유;
    e) 발광다이오드로부터 발산되는 빛 중 형광염료가 감응할 수 있는 여기광만을 선택적으로 투과시키는, 발광다이오드 앞에 위치하는 여기 필터; 및
    f) 형광염료에 의해 발산되는 형광만을 선택적으로 투과시키는, 포토다이오드 앞에 위치하는 발산 필터:
    를 포함하는, 광센서 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 광섬유가 발광다이오드로부터 발산되는 빛을 통과시키고 센서막과 발광다이오드를 연결하는 제1광섬유와, 형광염료로부터 발산되는 빛을 통과시키고 센서막과 포토다이오드를 연결하는 제2광섬유로 이루어지는 광센서 프로브.
  3. 제1항에 있어서, 광섬유가 발광다이오드로부터 발산되는 빛과 형광염료로부터 발산되는 빛을 통과시키고 센서막과 포토다이오드를 연결하는 한 가닥의 광섬유로 이루어지고, 발광다이오드와 포토다이오드가 직각으로 위치하며, 그 중간에 45 °에서 여기광을 반사시키고 180°에서 입사광을 투과시키는 다이크로익 필터를 추가로 포함하는 광센서 프로브.
  4. 제1항에 있어서, 형광염료가 루테니움 복합체, HPTS(8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 트리소디움염) 및 플루오르세인아민으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 광센서 프로브.
  5. 제4항에 있어서, 형광염료가 졸-겔(sol-gel) 법 또는 실리콘을 이용하여 센서막 표면에 고정화되는 광센서 프로브.
  6. 제1항에 있어서, 스테인레스 스틸 재질의 외부 용기를 추가로 포함하는 광센서 프로브.
  7. 제1항에 있어서, 포토다이오드로 들어오는 신호를 증폭시키는 증폭기를 추가로 포함하는 광센서 프로브.
  8. 제1항에 있어서, 센서막과 광섬유가 광센서 프로브로부터 탈착가능한 형태인 광센서 프로브.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 광센서 프로브를 이용하여 생물반응 기에서 인시투(in-situ) 방식으로 용존 산소, 용존 이산화탄소 또는 pH를 검출하는 방법.
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