KR20080039645A - 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드공중합체의 서방출 및 생분해성 나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본원 발명은 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자, 그리고 W/O/W 에멀션 용매증발법에 의하여 수용성 약물이 담지된 미립자를 제조하는 방법에 있어서, (1) 폴리락타이드글리콜라이드를 디클로로메탄에 2-6%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계; (2) 시프로플록사신을 증류수에 1-2%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계; (3) 상기 폴리락타이드글리콜라이드가 용해된 디클로로메탄 용액과 시프로플록사신 수용액을 폴리락타이드글리콜라이드:시프로플록사신의 중량비가 8-10:1이 되도록 혼합한 다음 초음파분쇄기로 30~40 와트(W)의 출력으로 10ml당 1~3분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만드는 단계; 그리고 (4) 상기 W/O 에멀션을 다시 1.0 %(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer)로 600~800 bar에서 100ml당 1분 주기로 5~7 사이클 동안 처리하여 W/O/W 에멀션을 만드는 단계를 포함하는 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자 제조방법을 제공한다.

본원 발명에 따라 제조된 시프로플록사신이 담지된 나노입자는

폴리락타이드글리콜라이드 공중합체로 제조되므로 인체에 아무런 부작용 및 면역거부 반응이 없을 뿐만 아니라, 투여 후 일주일 이상 약물이 서서히 방출되게 조절할 수 있으므로 혈중반감기가 짧아 자주 투여해야하는 약물의 투여에 특히 유리하며, 약물을 모두 방출한 후에는 담체로서 기능하는 공중합체가 인체 내에서 자연적으로 분해되어 없어지므로 별도로 나노입자를 제거할 필요가 없다. 또한, 본원 발명은 폴리락타이드글리콜라이드를 디클로로메탄에 녹이고 시프로플록사신을 증류수에 녹인 후 용액을 섞어서, 초음파분쇄기로 W/O 에멀션을 만든 다음 다시 폴리비닐알코올 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer)를 이용하여 쉽게 시프로플록사신이 담지된 100-500nm 사이의 나노입자를 제조할 수 있는 새로운 제조 방법을 제공한다.

시프로플록사신, 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체, 나노입자

Description

시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 나노입자 및 그 제조방법{Bio-degradable nanoparticles of poly(DL-lactide-co-glycolide) encapsulating ciprofloxacin HCl having extended-release properties, and manufacturing method thereof}

도 1은 각각 (a) 본원 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노입자[180-20]와 (b) 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40]의 투과전자현미경 사진이고,

도 2는 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40]의 크기 분포를 나타내는 그래프이고,

도 3은 (a) 시프로플록사신[Ciprofloxacin HCl, CIP], (b) 본원 발명의 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자[Empty NP], (c) 본원 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노입자[180-20], (d) 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자 [360-40], (e) 본원 발명의 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자와 시프로플록사신을 단순 혼합[Empty NP/CIP=20/1] 하였을 때의 XRD 스펙트럼이고,

도 4는 (a) 본원 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노입자[180-20,●], (b) 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40,○]의 약물방출속도를 측정 한 결과이고,

도 5는 인산완충용액[PBS, ●], 시프로플록사신[Free CIP, ○], 본원 발명의 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자[Empty nanoparticles, ▼], 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40,CIP-nanoparticles, △], 본원 발명의 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자와 시프로플록사신을 단순 혼합한 것[Free CIP + Empty NP, ■]을 각각 (a) Escherichia coli (E. coli)와 (b) Salmonella typhimurium (S. typhimurium)에 처리하여 미생물의 생존율을 비교한 것이고,

도 6은 인산완충용액[PBS], 시프로플록사신[Free CIP] 및 본원발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[CIP-NP]를 각각 S. typhimurium이 감염된 마우스에 처리하여 (a) 3일 및 (b) 5일 동안, 항 박테리아 성능을 평가한 것이며, 그리고

도 7은 살균수[DW], 시프로플록사신[Free CIP] 및 본원발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[CIP-NP]를 각각 E. coli이 감염된 마우스에 처리하여 3일 동안, 항 박테리아 성능을 평가한 것이다.

<발명이 속하는 기술분야>

본 발명은 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드(poly-(DL-lactide-co-glycolide), PLGA) 공중합체의 서방출 및 생분해성 나노입자 및 제조방 법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본원 발명은 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자, 그리고 W/O/W 에멀션 용매증발법에 의하여 수용성 약물이 담지된 미립자를 제조하는 방법에 있어서, (1) 폴리락타이드글리콜라이드를 디클로로메탄에 2-6%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계; (2) 시프로플록사신을 증류수에 1-2%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계; (3) 상기 폴리락타이드글리콜라이드가 용해된 디클로로메탄 용액과 시프로플록사신 수용액을 폴리락타이드글리콜라이드:시프로플록사신의 중량비가 8-10:1이 되도록 혼합한 다음 초음파분쇄기로 30~40 와트(W)의 출력으로 10ml당 1~3분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만드는 단계; 그리고 (4) 상기 W/O 에멀션을 다시 1.0 %(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer)로 600~800 bar에서 100ml당 1분 주기로 5~7 사이클 동안 처리하여 W/O/W 에멀션을 만드는 단계를 포함하는 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자 제조방법을 제공한다.

<종래기술>

박테리아에 의한 인간 감염은 인류의 생존을 위협하는 가장 위험한 질병 중 하나다. 퀴놀론계 항생제를 비롯하여 수많은 항생제가 이러한 질병을 치료하기 위해 개발되고 사용되어 왔다. 퀴놀론계 항생제는 광범위한 항 박테리아 성능을 가지는 것으로 알려져 있으며 요도염 (urinary tract infections), 장관염 (respiratory tract infections), 전염성 성질환 (sexually transmitted diseases), 피부감염증 (skin infections), 만성 골수염 (chronic osteomyelitis) 등에 특히 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그 중 시프로플록사신은 가장 널리 사용되는 퀴놀론계 항생제 중의 하나이며 임상적으로 중요한 그람음성(Gram-negative), 그람양성(Gram-positive) 병원균에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 요도염, 장관염, 전염성 성질환, 피부감염증, 골수염 등에 널리 사용되고 있다. 특히 요도염에 치료효과가 있는 것으로 알려진 시프로플록사신은 혈중 반감기가 대단히 짧기 때문에 경구용 제제는 물론 주사제도 하루에 두 번 이상 투약하게 되어 있어 자주 주사를 맞아야 되는 불편함이 따르는 것으로 알려져 있다.

위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 종래기술에는 서방성 제제로서 다양한 미립자 및 이를 제조하는 방법이 보고되어 있다. 예를 들면, 한국등록특허 제92-7831호에는 지효성 미크로 캡슐의 제조방법이 기재되어 있으며, 한국등록특허 제202073호에는 마이크로캡슐형 서방성 제제 및 그 제조법이 기재되어 있기는 하나, 이 방법으로 제조된 미립자의 크기는 마이크로미터 범위(예컨대, 0.5~400㎛)의 입자 크기를 가지므로 정맥주사 등 혈관 내 주사가 요구되는 경우 주사제로 사용하는 것이 불가하고 주로 국부에 한정하여 투여가 가능하다는 점이 단점이며, 입자의 크기분포가 5~100 마이크로미터사이로 광범위하므로 약물의 방출 속도제어가 상대적으로 어려운 점이 있고, 입자의 형태가 일정하지 않으므로 미립자의 분해속도 및 약물 방출속도 등을 예측하기 어렵고, 또한 한국등록특허 제202073호, 또는 한국등록특허 제92-7831호에서 사용한 방법으로는 작고 균일한 미립자를 제조하기 어려우 며, 또한 수용성인 약물을 고농도로 입자 내에 봉입하기가 어려워 봉입효율이 낮다는 문제 때문에 제조과정에서 비싼 가격의 약물의 손실을 초래할 수 있다는 단점이 있다.

또한 약물의 봉입효율을 높이는 방법으로 등록특허공보 162872호에 보고된 바와 같이 용매추출법을 이용하여 수용성 약물의 봉입효율을 높이는 방법이 개발되었으나 이 경우 용매의 완전한 제거가 힘들어 잔류 용매가 미립자내에 남아 있을 가능성이 있으며 또한 입자크기가 역시 수 십 마이크로미터 정도의 크기로 입자크기가 크며 입자의 크기분포를 조절하기 어려워 역시 약물의 조절방출이 어렵다는 문제점 등을 가지고 있다. 등록특허공보 10-481540호에는 치료약물이 함유된 나노입자의 제조방법이 보고된 바, 유화중합법에 의하여 나노입자를 제조 시에 약물을 봉입하는 방법으로 50 - 300 nm의 크기로 나노입자의 제조가 가능하지만 중합시의 온도가 40-90℃ 사이에서 이루어지므로 이러한 높은 온도에서는 약물의 분해와 활성을 쉽게 잃을 수 있으며 중합개시제 및 계면활성제의 제거가 용이하지 않아 실제 치료용으로 사용하는 데는 많은 제약이 있다.

상기와 같이 기존 특허에 보고된 W/O/W 이중 에멀젼 (double emulsion) 용매증발법으로는 1. 수용성 약물인 시프로플록사신의 봉입효율을 높이기가 어렵고, 2. 입자의 크기가 수 십 마이크로미터로 아주 커서 입자크기 조절이 어려우며, 3. 따라서 입자의 크기가 큰 미립자로는 주사제로 사용하는데 수많은 제약이 따르고, 4. 약물의 방출속도를 원하는 대로 조절하기가 용이하지 않은 문제가 있으며, 5. 나노입자 또는 미립자의 분해속도가 일정하지 않고 약물이 모두 방출된 뒤에도 장기간 체내에 남아 있을 수 있고, 6. 나노입자의 경우 입자가 균일치 않을 경우 감염부위로 입자가 가지 않고 인체 면역체계에 의해 체외 배출 또는 타장기로 이동할 수 있으며, 7. 결국 약물의 약효를 극대화시키기 어렵다는 단점을 가지고 있다. 본 발명에서는 이를 개선하여 일차적으로 약물이 지속적으로 방출되도록 지지하는 폴리락타이드글리콜라이드를 디클로로메탄에 녹이고 시프로플록사신을 멸균증류수에 녹여, 이 두 용액을 혼합하여 일차 W₁/O 에멀젼을 제조한 뒤, 이를 폴리비닐알코올이 1.0 %(w/v)으로 녹아있는 수용액에 분산시켜 이차 W₁/O/W₂ 에멀젼을 제조한 뒤 이를 고압균질기(high pressure homogenizer)를 사용하여 에멀젼을 세밀화 함으로써 나노입자를 제조할 수 있으며 위에서 언급한 기존의 방법이 가지는 단점을 개선하여 주사제로 사용하기가 용이하며 수용성 약물의 봉입효율이 높은 나노입자를 만들 수 있었다.

따라서 본원 발명에서는 폴리락타이드글리콜라이드를 이용하여 시프로플록사신이 봉입된 100-500nm의 나노 크기의 서방출성 미립자를 제공함으로써 물리화학적 특성과 약물 방출 특성을 조절하여 시프로플록사신이 일 ~ 이주일 동안 서서히 방출되도록 함으로써 위와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 하였다.

또한, 본원발명에서는 폴리락타이드글리콜라이드를 디클로로메탄에 녹이고 시프로플록사신을 증류수에 녹인 후 용액을 섞어서, 초음파분쇄기로 W/O 에멀션을 만든 다음 다시 폴리비닐알코올 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer)를 이용하여 쉽게 시프로플록사신이 담지된 100-500nm 범위의 크기를 갖는 나노입자를 제조할 수 있는 새로운 제조 방법을 제공함으로써 일정한 범위로 크기가 제어된 시프로플록사신이 담지된 생분해성 및 서방출성 나노입자를 제공하는 새로운 방법을 제공하고자 하였다.

본원 발명과 같이 제어된 크기를 갖는 시프로플록사신이 담지된 생분해성 및 서방출성 나노입자는 생체 내 적용 시 적절하게 작은 크기로 인해 주사용제로 사용이 용이하고 또한 인체에 주사시에는 세포간극 사이와 모세혈관 내로의 침투를 효과적으로 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 병소부위에 약물을 선택적으로 전달할 수 있는 잇점이 있다. 또한, 크기가 작으므로 미립자가 야기하는 중요한 문제 중의 하나인 약물 투여용 의료 용구(예컨대, 주사기)의 통로를 막는 문제점을 해결할 수 있다. 또한 약물의 방출을 일주일 내지 이주일 간 일정한 속도로 방출되게 함으로써 치료에 유효한 기간동안 적절히 약물을 방출하고 약효를 발휘하도록 하는 것이 가능하다는 특징이 있다.

특히 본원 발명은 여러 가지 약물 중에서 특히 시프로플록사신을 생분해성 고분자인 폴리락타이드글리콜라이드를 이용하여 고압균질기(HPH, high pressure homogenizer)로 일정 범위로 입자 크기가 제어되고 수용성 약물의 봉입효율이 우수한 나노입자를 만들기 위하여 최적화된 방법 및 그에 따라 제조된 특정 입자 크기를 갖는 나노입자를 제공하고자 함에 기술적 의의가 있다.

상기와 같은 목적을 위하여 본원 발명에서는 100-500nm의 입자 크기를 가지 며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자를 제공한다. 본원발명의 바람직한 일 실시예에 있어서 상기 나노입자의 크기는 바람직하게는 130-353nm이다. 또한, 나노입자의 총 중량에 대하여 시프로플록사신의 함량은 4.5 - 5.0(w/w)%이며, 상기 나노입자에 담지된 시프로플록사신은 10일 이상 지속적으로 나노입자로부터 방출될 수 있다.

입자의 크기를 100 nm이하로도 제조할 수 있으나 이 경우 약물의 봉입률이 너무 낮아지는 단점이 있으며, 500 nm이상으로 나노입자를 제조시 약물의 함량은 다소 증가하지만 주사제로서 적절한 범위를 넘어서는 단점이 있으므로 본원발명에서는 약 130-353 nm 범위의 나노입자가 약물의 봉입효율도 충분히 높고 주사제로 사용하기에도 적절하며 약물의 방출속도 또한 치료 유효기간에 적절하다.

또한 본원 발명에서는 W/O/W 에멀션 용매증발법에 의하여 수용성 약물이 담지된 미립자를 제조하는 방법에 있어서 하기의 단계를 포함하는 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자 제조방법을 제공한다. :

(1) 폴리락타이드글리콜라이드를 디클로로메탄에 2-6%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계;

(2) 시프로플록사신을 증류수에 1-2%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계;

(3) 상기 폴리락타이드글리콜라이드가 용해된 디클로로메탄 용액과 시프로플록사신 수용액을 폴리락타이드글리콜라이드:시프로플록사신의 중량비가 8-10:1이 되도록 혼합한 다음 초음파분쇄기로 30~40 와트(W)의 출력으로 10ml당 1~3분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만드는 단계; 그리고

(4) 상기 W/O 에멀션을 다시 1.0 %(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer)로 600~800 bar에서 100ml당 1분 주기로 5~7 사이클 동안 처리하여 W/O/W 에멀션을 만드는 단계.

본원 발명에서 사용되는 활성 성분인 시프로플록사신(ciprofloxacin hydrochloride, C₁₇H₁₈FN₃O_{3 ·}HCl·H₂O)은 독일의 화학·제약회사인 바이엘(Bayer)이 개발한 항생제로, 약칭 '시프로'로 부른다. 전문의약품으로 호흡기 감염, 귀·코·목구멍 감염, 패혈증 등 각종 감염에 대한 항생제로 이용되는데, 특히 동물 탄저(炭疽)에 항생 효과가 높아 미국식품의약국(FDA)에서 유일한 탄저병 치료제로 인정받은 제품이며, 아래와 같은 구조를 갖는다.

본원 발명에서 사용되는 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA, poly-(DL-lactide-co-glycolide))는 공지 기술에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들면 DL-lactide로부터 DL-poly lactic acid(PLA)와 glycolide를 일정한 비율로 반응시켜 제조될 수 있고 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체를 이용한 약물방출, J. Korean Ind, Eng. Chem . Vol. 12, NO. 2, April 2001, 148-153, 나재운 et al.), 상업적으로 시판되 는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 본원 발명에서는 바람직하게는 공중합체의 조성비가 50/50 (lactide/glycolide ratio) 인 것이 바람직하다.

본원 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단계 (1)에서 폴리락타이드글리콜라이드는 디클로로메탄에 2-6%(w/v, g/ml)의 농도로 용해되며, 상기 단계 (2)에서 시프로플록사신은 증류수에 1-2%(w/v, g/ml)의 농도로 용해되고, 상기 단계 (3)에서 상기 폴리락타이드글리콜라이드가 용해된 디클로로메탄 용액과 시프로플록사신 수용액은 폴리락타이드글리콜라이드:시프로플록사신의 중량비가 8-10:1, 바람직하게는 9:1이 되도록 혼합된다.

폴리락타이드글리콜라이드의 농도가 상기의 범위보다 낮은 경우에는 입자의 크기에 그다지 큰 차이가 없으나 상대적인 약물의 봉입효율이 낮아지고, 상기의 범위보다 더 높아지는 경우에는 입자의 사이즈가 증가하는 반면에 봉입효율에서 큰 이득이 없으므로 상기의 범위로 폴리락타이드글리콜라이드를 사용하는 것이 바람직하다.

또한 시프로플록사신의 농도가 상기 범위보다 낮은 경우에는 단위 나노입자 무게비당 시프로플록사신의 함량이 낮아서 주사제로 사용할 시 약물의 농도를 치료에 유효한 수준으로 적절하게 맞추기가 어려우며, 시프로플록사신의 증류수에 대한 용해도가 약 2.5 % (w/v, g/ml)이므로 그 이상의 농도에서는 약물이 증류수에서 침전이 되는 심각한 문제가 있고 이로 인해 약물의 봉입효율이 낮아지는 문제점이 있으므로 상기의 약물 농도 범위가 바람직하다.

또한, 폴리락타이드글리콜라이드 : 시프로플록사신의 중량비가 상기 범위보다 낮은 경우에는 입자의 크기가 작아지고 약물의 봉입효율이 낮아지는 문제점이 있으며, 상기 범위보다 높은 경우에는 폴리락타이드글리콜라이드의 사용량 및 입자평균크기가 증가하는 것에 비하여 봉입 효율은 증가하지 않는 문제점이 있으므로, 상기 중량비 범위가 바람직하다.

본원 발명의 바람직한 일 실시예에서 있어서, 상기 단계 (3)에서 상기 초음파 분쇄기는 30~40 와트(W), 바람직하게는 40 와트의 출력으로, 10ml당 1~3분, 바람직하게는 1분 동안 적용한다.

상기 범위보다 출력이 낮은 경우에는 W/O 에멀젼이 충분히 세밀하게 생성되지않아 입자의 크기가 마이크로미터 크기로 커지고 약물의 봉입효율이 낮아지는 문제점이 있으며, 그 범위보다 높아지는 경우엔 크기와 약물의 봉입효율에 큰 변화를 보이지 않았으며 에멀젼 용액 내의 온도가 상승함으로써 약물의 성능감소가 우려되고 반응 후 정제과정에서 응집(aggregation)이 일어나 입자의 수득율이 낮아지는 문제점이 있다.

또한 초음파분쇄기의 적용 시간이 1-3분보다 길어지는 경우에는 에멀젼의 온도가 점차 상승함으로써 정제과정에서 응집되는 등 문제점이 발생하여 입자 수득율이 낮아지는 문제점이 있으며, 상기 범위보다 짧은 경우 충분히 세밀한 에멸젼 (즉 충분히 유화가 되지 않아)이 생성되지 않아 아예 입자생성이 안되거나 응집[aggregation]이 되고 입자가 커지는 등의 문제점을 일으켰으며 약물의 봉입효율도 낮아지는 문제점도 있다.

본원 발명의 바람직한 일 실시예에서 있어서, 상기 단계 (4)는 상기 W/O 에멀션과 상기 1.0 %(w/v) 폴리비닐알코올 수용액의 혼합액을 고압균질기(High-pressure homogenizer)에서 600~800 bar, 바람직하게는 600 bar에서, 100ml당 1분 주기로 5~7회(사이클), 바람직하게는 5회 동안 처리한다.

상기 범위보다 압력이 낮은 경우에는 W₁/O/W₂ 에멀젼이 충분히 세밀해지지 않으므로 입자의 크기가 커지는 문제점이 있으며 약물의 봉입효율 또한 낮아지는 단점이 있다. 또한 그 이상보다 높아지면 온도가 상승하여 에멀젼이 응집하는 경우가 발생하며 역시 입자의 사이즈가 커지거나 형성이 안 되는 문제점이 있다.

또한 상기 범위보다 많은 사이클로 (즉, 장시간 돌리는 경우) 고압균질기로 처리하는 경우에는 온도가 상승하여 에멀젼이 응집하는 경우가 발생하며 역시 입자의 사이즈는 큰 변화가 없으나 응집되는 등의 문제점이 있으며, 상기 범위보다 적은 사이클로 (즉, 단시간 돌리는 경우) 고압균질기로 처리하는 경우에는 W₁/O/W₂ 에멀젼이 충분히 형성되지 않으므로 입자의 크기가 커지는 문제점이 있으며 약물의 봉입효율 또한 낮아지는 단점이 있다.

본원 발명의 제조방법은 특히 여러 가지 약물 중에서 특히 시프로플록사신을 폴리락타이드글리콜라이드를 이용하여 100-500nm, 바람직하게는 130-353nm 범위로 입자 크기가 제어된 나노입자로 만들기 위하여 최적화된 방법 및 그에 따라 제조된 특정 입자 크기를 갖는 나노입자를 제공하고자 함에 기술적 의의가 있다.

본원 발명의 바람직한 일 실시예에서 있어서, 본원 발명의 제조방법은 (5) 상기 W/O/W 에멀션을 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, molecular weight 15,000) 0.4%(w/v) 수용액에 넣고 교반기로 500-1500rpm에서 30~90분 동안 교반한 후 초원심분리기로 나노입자를 회수하여 냉동건조 시키는 단계를 더 포함한다.

본원 발명은 또한 상기와 같은 방법으로 제조된, 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자를 제공한다. 바람직하게는 상기 나노입자의 크기는 130-353nm이다.

본원 발명에 따른, 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자는 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체로 제조되므로 인체에 아무런 부작용 및 면역거부 반응이 없을 뿐만 아니라, 투여 후 일주일 이상 약물이 서서히 방출되게 조절할 수 있으므로 혈중반감기가 짧아 자주 투여해야하는 약물인 시프로플록사신의 투여에 특히 유리하며, 약물을 모두 방출한 후에는 담체로서 기능하는 공중합체가 인체 내에서 자연적으로 분해되어 없어지므로 별도로 나노입자를 제거할 필요가 없다.

또한, 본 발명에서는, 수용성 약물인 시프로플록사신의 봉입효율을 높이기가 어렵고, 입자의 크기 조절이 어려우며, 따라서 입자의 크기가 큰 미립자로는 주사 제로 사용하는데 수많은 제약이 있었고, 약물의 방출속도를 원하는 대로 조절하기가 용이하지 않았던 기존 선행기술의 문제들을 개선하여, 일차적으로 나노입자의 크기분포가 100~500nm 로 일정하고, 구형으로 모두 균일한 형태를 갖도록 제조함으로써 방출제어속도 및 미립자의 분해속도를 예측할 수 있고, 주사제 등의 약제로 사용하기가 용이하며, 또한 수용성 약물의 봉입효율이 우수하여 약물의 손실을 최소화한 작용효과를 나타낸다.

이하에서는 본원 발명의 바람직한 제조예 및 실험예를 통하여 발명을 상세히 설명하고, 또한, 요도염 및 감염증의 원인이 되는 병원성 세균에 대한 본원 발명의 나노입자의 항 박테리아 성능을 시험관 내(in vitro)와 생체 내(in vivo)에서 평가하였다. 그러나 이는 본원 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님에 유의하여야 한다. 또한, 본원 발명에서 인용하고 있는 국내외의 특허공보를 포함하는 문서는 본원 발명에 그 전체가 편입되어 있음을 유의하여야 한다.

실시예 1. 시프로플록사신이 봉입된 나노입자의 제조예 1

각각 폴리락타이드글리콜라이드 180mg을 (Resomer RG504H, lactide/glycolide ratio = 50/50, Boeringher Ingelheim Co. Germany) 디클로로메탄 7ml에 녹이고, 시프로플록사신 20mg은 증류수 2ml에 녹였다.

상기의 두 용액을 섞은 후, 초음파분쇄기 (Vibra Cell VCX-400, Sonics & materials Inc. USA)로 40와트(W)에서 10 ml당 1분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만 들었다.

W/O 에멀션을 폴리비닐알코올(PVA) 1% (w/v) 수용액 10 ml에 넣은 후, 고압균질기(High-pressure homogenizer,R5-12.38, SMT Co. Japan)를 이용하여 600 bar (kg/cm²)에서 1분 주기로 5 사이클 처리하여 W/O/W 에멀션을 만들었다.

이를 다시 40ml의 폴리비닐알코올(PVA) 0.4% (w/v) 수용액에 넣고 교반기(Top-loading stirrer, Direct Driven Digital Stirrer SS-11D, Young HANA Tech., Co. Ltd. Korea)로 1000 rpm으로 1시간 동안 교반한 후 초원심분리기(Supra 30K, Vacuum High Speed Centrifuge, Hanil Co. Korea)로 나노입자를 회수하여 3일 동안 냉동건조 하여 시프로플록사신이 봉입된 나노입자를 얻었다.

실시예 2. 시프로플록사신이 봉입된 나노입자의 제조예 2

폴리락타이드글리콜라이드 360mg을 디클로로메탄 7ml에 녹이고 시프로플록사신 40mg을 증류수 2ml에 녹인 것을 제외하고는 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 시프로플록사신이 봉입된 나노입자를 얻었다.

실시예 3. 시프로플록사신이 봉입된 나노입자 제조의 최적 조건 확인

3-1) PLGA 농도에 따른 나노입자의 평균 크기/봉입효율 변화 측정

본 발명에서 사용하는 폴리락타이드글리콜라이드의 농도(w/v%) 에 따른 나노입자의 평균 크기 및 약물의 봉입효율을 확인하였다.

폴리락타이드글리콜라이드(Resomer RG504H, lactide/glycolide ratio = 50/50, Boeringher Ingelheim Co. Germany)를 7 ml의 메틸렌클로라이드에 0.5 ~ 10%(w/v)의 농도 범위로 용해시켰다(표 1). 이를 시프로플록사신 20 mg을 녹인 증류수 2 ml와 혼합하여 초음파분쇄기 (Vibra Cell VCX-400, Sonics & materials Inc. USA)로 40 와트(W)에서 10 ml당 1분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만들었다.

상기 W/O 에멀션을 폴리비닐알코올(PVA) 1%(w/v) 수용액 10 ml에 넣은 후, 고압균질기(High-pressure homogenizer,R5-12.38, SMT Co. Japan)를 이용하여 600 bar (kg/cm²)에서 1분 주기로 5 사이클 처리하여 W/O/W 에멀션을 만들었다.

이를 다시 40 ml의 폴리비닐알코올(PVA) 0.4%(w/v) 수용액에 넣고 교반기(Top-loading stirrer, Direct Driven Digital Stirrer SS-11D, Young HANA Tech., Co. Ltd. Korea)로 1000 rpm으로 1시간 동안 교반한 후 초원심분리기(Supra 30K, Vacuum High Speed Centrifuge, Hanil Co. Korea)로 나노입자를 회수하여 3일 동안 냉동건조 하여 시프로플록사신이 봉입된 나노입자를 얻었다.

상기 수득한 나노입자의 입자 평균크기는 동적 광산란 입도 분석기(Dynamic light scattering, ELS-8000, Otsuka electronics Co. Japan)를 이용하여 측정하였으며, 평균값을 표 1에 나타내었다.

또한, 상기 수득한 나노입자의 시프로플록사신 봉입효율은 하기와 같이 측정하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.

상기 제조된 나노입자 5 mg을 5ml의 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹인 후 증류수 5 ml을 첨가하여 3시간 동안 교반한 다음, 증류수 층에서 1 ml을 채취하여 100배 희석한 후 UV 분광광도계 (UV-spectrophotometer 1601, Shamdzu Co. Ltd. Japan)를 이용하여 277 nm에서 흡광도를 측정하여 봉입 효율을 다음 식을 이용하여 측정하였다.

봉입 효율 = [나노입자 내에 남아 있는 시프로플록사신의 무게/시프로플록사신 총 투여량] X 100

폴리락타이드글리콜 라이드(PLGA) 농도(w/v%)	입자평균크기 (nm)	봉입효율 (%, w/w)
0.5	101	20.1
1	110	32.7
2	130	42.4
6	353	47.4
8	570	48.1
10	980	50.2

표1의 결과를 보면, 폴리락타이드글리콜라이드 농도가 높아질수록 나노입자의 평균크기도 증가하고 봉입효율도 높아짐을 알 수 있다.

그러나 폴리락타이드글리콜라이드 농도가 8%(w/v)일 경우 입자평균크기가 500 nm 이상이 되고, 또한 10%(w/v)일 경우 입자의 평균크기가 980 nm로 크기가 증가하는 것에 비하여, 봉입 효율은 증가하지 않았다.

또한, 폴리락타이드글리콜라이드 농도가 1%(w/v) 이하인 경우 입자의 크기에는 큰 차이가 없으나 상대적으로 약물의 봉입효율이 감소하였다.

따라서, 최종 제조되는 나노입자의 크기 및 봉입효율을 고려하여 폴리락타이드글리콜라이드 농도가2 ~ 6%(w/v)인 것을 사용하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

3-2) 시프로플록사신 농도에 따른 나노입자의 평균 크기/봉입효율 변화 측정

본 발명에서 사용하는 약물인 시프로플록사신의 농도에 따른 나노입자의 평균 크기 및 약물의 봉입효율을 확인하였다.

폴리락타이드글리콜라이드 180 mg을 디클로로메탄 7 ml에 녹이고, 시프로플록사신을 증류수 2 ml에 각각 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4 %(w/v)로 용해시켜, 상기 3-1)과 같은 방법으로 나노입자를 제조하였다. 이렇게 수득한 나노입자의 입자 평균크기 및 봉입효율을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시프로플록사신(CIP) 농도(w/v%)	입자평균크기 (nm)	봉입효율 (%, w/w)
0.2	117	37.9
0.5	121	40.1
1	130	42.4
2	148	43.7
3	360	30.1
4	575	27.6

표 2의 결과를 보면, 시프로플록사신 농도가 높아질수록 나노입자의 평균크기는 증가하나 봉입효율은 1~2 %(w/v)에서 40% 가 넘는 우수한 봉입율을 나타냄을 알 수 있었다.

시프로플록사신 농도가 3%(w/v) 일 경우 봉입효율이 30.1%로 감소하고, 4%(w/v) 일 경우 27.6 %로 감소하는데, 이는 시프로플록사신의 증류수에 대한 용해도가 약 2.5% 이므로, 그이상의 농도에서는 약물이 증류수에서 침전됨으로써 약물의 봉입효율이 낮아지게 된다.

또한, 시프로플록사신 농도가 1%(w/v) 미만인 경우 입자의 크기에는 큰 차이가 없고, 봉입효율도 크게 감소하지 않으나, 최종 제조된 단위 나노입자 무게당 시프로플록사신의 함량이 낮아서 주사제로 사용할 경우 약물의 농도를 치료에 유효한 수준으로 조절하기 어렵게 된다.

따라서, 최종 제조되는 나노입자의 크기, 시프로플록사신의 함량 및 봉입효율을 고려하여 시프로플록사신 농도가 1 ~ 2 %(w/v)인 것을 사용하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

3-3) 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA)/시프로플록사신(CIP) 중량비율에 따른 나노입자의 평균 크기/봉입효율 변화 측정 시험

본 발명에서 사용하는 폴리락타이드글리콜라이드 및 시프로플록사신의 중량비율에 따른 나노입자의 평균 크기 및 약물의 봉입효율을 확인하였다.

폴리락타이드글리콜라이드 180 mg을 디클로로메탄 7 ml에 녹이고, 시프로플록사신 20 mg을 증류수 2 ml에 용해시킨 것을 사용하고, 폴리락타이드글리콜라이드/시프로플록사신 중량비율을 6~15: 1로 다양하게 하여 상기 3-1)과 같은 방법으로 나노입자를 제조하였다. 이렇게 수득한 나노입자의 입자 평균크기 및 봉입효율을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.

폴리락타이드글리콜라이드(PLGA)/시프로플록사신(CIP) 비율(mg/mg)	입자평균크기 (nm)	봉입효율 (%, w/w)
6	97	37.1
8	110	39.8
9	130	42.4
10	258	43.1
12	303	43.9
15	334	45.1

표3의 결과를 보면, 폴리락타이드글리콜라이드/시프로플록사신 비율이 높아질수록 나노입자의 평균크기도 증가하고 봉입효율도 높아짐을 알 수 있다.

그러나 폴리락타이드글리콜라이드/시프로플록사신 비율이 12 이상인 경우 PLGA의 사용량 및 입자평균크기가 증가하는 것에 비하여 봉입 효율은 증가하지 않았다.

또한, 폴리락타이드글리콜라이드/시프로플록사신 비율이 8 이하인 경우 입자의 크기가 작아지고 약물의 봉입효율이 감소하였다.

따라서, 최종 제조되는 나노입자의 크기 및 봉입효율을 고려하여 폴리락타이드글리콜라이드/시프로플록사신 비율이 8~10인 것을 사용하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

3-4) 유화단계의 초음파분쇄기 에너지 출력 및 적용시간에 따른 나노입자의 평균 크기/봉입효율 변화 측정

본 발명의 제1에멀션(W/O)으로의 유화단계에서 사용하는 초음파분쇄기의 에너지 출력 범위에 따른 나노입자의 평균 크기 및 약물의 봉입효율을 확인하였다.

폴리락타이드글리콜라이드 180 mg을 디클로로메탄 7 ml에 녹이고, 시프로플록사신 20 mg을 증류수 2 ml에 용해시킨 것을 사용하여 상기 3-1)과 같은 방법으로 나노입자를 제조하였다. 이 제조과정 중 제1에멀션(W/O)으로의 유화단계에서 사용하는 초음파 분쇄기의 에너지 출력을 5, 10, 20, 30, 40, 60 와트로 변화시켜 나노입자를 제조하였다.

이렇게 수득한 나노입자의 입자 평균크기 및 봉입효율을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.

출력(watt)	입자평균크기 (nm)	봉입효율 (%, w/w)
5	입자형성실패	-
10	3000 nm 이상	-
20	375	37.8
30	230	40.1
40	130	42.4
60	128	41.9

표 4의 결과를 보면, 출력이 20~60 와트일 경우 수백 nm 수준의 나노입자가 형성되었고, 그 중에서도 출력이 높아질수록 나노입자의 평균크기는 감소하고 봉입효율은 높아짐을 알 수 있다.

출력이 높아지는 경우에는 약물의 봉입효율에 큰 변화는 없었으나 에멀젼 용액 내의 온도가 상승함으로써 약물의 성능 저하가 우려되고 반응 후 정제과정에서 응집(aggregation)이 일어나 입자의 수득률이 감소하였다.

또한, 출력이 낮은 경우에는 W/O 에멀젼이 나노 단위로 세밀하게 생성되지 않고 마이크로미터 단위로 크기가 커지며 약물의 봉입효율이 감소하였다.

따라서, 최종 제조되는 나노입자의 크기 및 봉입효율을 고려하여 출력은 30~40 와트로 사용하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 제조과정에서 초음파분쇄기로 유화시 적용시간에 따른 봉입효율을 측정하였다.

폴리락타이드글리콜라이드 180 mg을 디클로로메탄 7 ml에 녹이고, 시프로플록사신 20 mg을 증류수 2 ml에 용해시킨 것을 사용하고, 초음파분쇄기의 출력은 40 와트로 하여 10 ml당 다양한 적용시간 (10~240초)에 따른 나노입자의 입자 평균크기 및 봉입효율을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

적용 시간(sec)	입자평균크기 (nm)	봉입효율 (%, w/w)
10	620	25.7
30	259	37.1
60	130	42.4
120	121	41.9
180	117	40.7
240	aggregation	-

표 5의 결과를 보면, 적용시간이 10~180 초일 경우 수백 nm 수준의 나노입자가 형성되었고, 그 중에서도 적용시간이 길어질수록 나노입자의 평균크기는 감소하고 봉입효율은 높아짐을 알 수 있다. 240초 이상인 경우 응집이 일어나 입자의 수득률이 감소하였다.

적용시간이 길어지는 경우에는 약물의 봉입효율에 큰 변화는 없었으나 에멀젼 용액 내의 온도가 상승함으로써 약물의 성능 저하가 우려되고 반응 후 정제과정에서 응집(aggregation)이 일어나 입자의 수득률이 감소하였다.

또한, 적용시간이 짧은 경우에는 W/O 에멀젼이 나노단위로 세밀하게 생성되지 않고 500 nm 이상으로 크기가 커지며, 응집되는 현상을 보였고 약물의 봉입효율이 감소하였다.

따라서, 최종 제조되는 나노입자의 크기 및 봉입효율을 고려하여 적용시간은 1~3분으로 하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

3-5) 제 2 에멀션(W/O/W)으로의 유화 단계의 고압균질기의 압력 및 적용 주기/사이클 조절 범위에 따른 입자의 평균 크기/봉입효율 변화 측정

본 발명의 제2에멀션(W/O/W)으로의 유화단계에서 사용하는 고압균질기의 압력 및 적용 사이클에 따른 나노입자의 평균 크기 및 약물의 봉입효율을 확인하였다.

폴리락타이드글리콜라이드 180 mg을 디클로로메탄 7 ml에 녹이고, 시프로플록사신 20 mg을 증류수 2 ml에 용해시킨 것을 사용하여 상기 3-1)과 같은 방법으로 나노입자를 제조하였다. 이 제조과정 중 제2에멀션(W/O/W)으로의 유화단계에서 사용하는 고압균질기의 적용압력을 50 ~ 1000 bar의 범위에서 다양하게 선택하여 나노입자를 제조하였다. 상기 수득한 나노입자의 입자 평균크기 및 봉입효율을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.

압력(bar)	입자평균크기 (nm)	봉입효율 (%, w/w)
50	791	25.3
100	536	32.7
300	311	38.1
600	130	42.4
800	121	41.0
1000	aggeregation	-

표 6의 결과를 보면, 고압균질기의 적용압력이 100~800 bar일 경우 수백 nm 수준의 나노입자가 형성되었고, 그 중에서도 적용 사이클이 증가할수록 나노입자의 평균크기는 감소하고 봉입효율은 높아짐을 알 수 있다. 1000 bar 이상인 경우 응집이 일어나 입자의 수득률이 감소하였다.

고압균질기의 적용압력이 높은 경우는 에멀젼 용액 내의 온도가 상승함으로써 에멀젼이 응집(aggregation)이 일어나는 경우가 발생하였으며 역시 입자의 크기가 커지거나 형성이 안되는 등의 문제점이 나타났다.

또한, 고압균질기의 적용압력이 낮은 경우는 W/O/W 에멀젼이 충분히 나노단위로 세밀하게 생성되지 않고 입자의 크기가 커지며, 약물의 봉입효율이 감소하는 문제점이 나타났다.

따라서, 최종 제조되는 나노입자의 크기 및 봉입효율을 고려하여 고압균질기의 적용압력은 600~800 bar로 하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 제조과정에서 고압균질기로 유화시 에멀션 100 ml 당 적용 사이클을 1, 3, 5, 7, 10, 15 사이클로 변화시켜 사이클 수에 따른 봉입효율을 측정하였다.

적용 사이클	입자평균크기 (nm)	봉입효율 (%, w/w)
1	386	30.1
3	170	35.9
5	130	42.4
7	128	42.1
10	131	41.7
15	aggregation	-

표 7의 결과를 보면, 적용 사이클이 1~10 회일 경우 수백 nm 수준의 나노입자가 형성되었고, 그 중에서도 적용 사이클이 증가할수록 나노입자의 평균크기는 감소하고 봉입효율은 높아지나 5회 이상에서는 크기나 봉입효율이 유사하게 나타났다.

15회 이상인 경우에는 응집이 일어났는데, 적용사이클이 많아지는 경우는 장시간 고압균질기로 처리되는 것이므로 에멀젼 용액 내의 온도가 상승함으로써 에멀젼이 응집(aggregation)이 일어나는 등의 문제점이 나타났다.

또한, 적용 사이클이 적은 경우는 W/O/W 에멀젼이 충분히 나노단위로 세밀하게 생성되지 않고 500 nm 이상으로 크기가 커지며, 약물의 봉입효율이 감소하였다.

따라서, 최종 제조되는 나노입자의 크기 및 봉입효율을 고려하여 적용 사이클은 에멀션 100 ml 당 5~7회로 하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 나노입자 제조의 여러 조건을 변화시켜 최적의 제조 조건을 찾은 결과, 폴리락타이드글리콜라이드 2~6 %(w/v, g/ml), 시프로플록사신 1~2%(w/v, g/ml) 용액을 폴리락타이드글리콜라이드:시프로플록사신 중량비가 8-10:1이 되도록 혼합한 다음 초음파분쇄기로 40 와트(W)의 출력으로 10 ml당 1분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만들고, 다시 1.0 %(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer)로 600 bar에서 100 ml당 1분 주기로 5 사이클 동안 처리하여 W/O/W 에멀션을 만드는 것이 최적의 제조 조건임을 확인하였다.

이 경우 130~353 nm 범위의 시프로플록사신이 봉입된 나노입자를 제조할 수 있었다.

비교예 1. 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자의 제조

폴리락타이드글리콜라이드 200mg을 디클로로메탄 7ml에 녹이고 증류수 2ml과 섞은 후, 초음파분쇄기 (Vibra Cell VCX-400, Sonics & materials Inc. USA)로 40 와트(W)에서 10 ml당 1분 동안 W₁/O 에멀션(1차 에멀션)을 만들었다.

W₁/O 에멀션을 폴리비닐알코올(PVA) 1% (w/v) 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer, 600 bar 5 cycle, [R5-12.38, SMT Co. Japan])로 처리하여 W₁/O/W₂(2차 에멀션) 에멀션을 만들었다.

이를 다시 40 ml의 폴리비닐알코올(PVA) 0.4% (w/v) 수용액에 넣고 교반기(Top-loading stirrer, Direct Driven Digital Stirrer SS-11D, Young HANA Tech., Co. Ltd. Korea)로 1000 rpm으로 1시간 동안 교반한 후 초원심분리기(Supra 30K, Vacuum High Speed Centrifuge, Hanil Co. Korea)로 나노입자를 회수하여 3일 동안 냉동건조 하여 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자를 얻었다.

실험예 1. 본 발명의 바람직한 나노입자 내의 시프로플록사신의 함량과 봉입 효율 측정

상기 실시예 1, 2 및 비교예 1에서 제조된 나노입자 내의 시프로플록사신의 함량을 측정하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1, 2 및 비교예 1에서 제조된 나노입자 각각 5 mg을 5 ml의 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹인 후 증류수 5 ml을 첨가하여 3시간 동안 교반하였다. 3시간 후 증류수 층에서 1 ml을 채취하여 100배 희석한 후 UV 분광광도계 (UV-spectrophotometer 1601, Shamdzu Co. Ltd. Japan)를 이용하여 277 nm에서 흡광도를 측정하여 약물함량과 봉입 효율을 다음 식을 이용하여 측정하였다.

약물함량 = [나노입자 내의 시프로플록사신의 무게/나노입자의 총무게] X 100 … 식(1)

봉입 효율 = [나노입자 내에 남아 있는 시프로플록사신의 무게/시프로플록사신 총 투여량] X 100 … 식(2)

	폴리락타이드글리콜라이드(PLGA):시프로플록사신(CIP) 중량비 (mg: mg)	약물함량 (%, w/w)		봉입 효율 (% w/w)	입자크기 (nm)
		이론치	실측치
실시예 1	180:20	10	4.5	42.4	130
실시예 2	360:40	10	5.0	47.4	353

표 8에 나타낸 바와 같이 실시예 1[180-20] 및 실시예 2[360-40]에서 제조된 나노입자에서 약물의 함량은 각각 4.5 및 5.0 % (w/w)이었으며, 봉입 효율은 42.4, 47.4 % (w/w)이었다.

즉, 제조 초기에 각각의 용매에 대한 시프로플록사신, 폴리락타이드글리콜라이드의 농도를 조절하여 약물의 함량과 봉입 효율을 조절할 수 있었으며, 제조 초기에 각각의 용매에 대한 약물과 고분자의 농도를 증가시켰을 때 (180mg/7ml:20mg/2ml -> 360mg/7ml:40mg/2ml) 약물의 함량과 봉입 효율이 증가함을 알 수 있었다.

또한, 각각의 용매에 대한 약물과 고분자의 농도에 따라 130-353nm 범위의 입자크기로 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 2. 본 발명의 바람직한 나노입자의 분석

상기 실시예 1 및 2에서 제조된 나노입자의 형태를 투과전자현미경(JEOL JEM-2000, FX-II)을 이용하여 120kV에서 관찰하였다. 나노입자의 입도 분포는 동적 광산란 입도 분석기(Dynamic light scattering, ELS-8000, Otsuka electronics Co. Japan)를 이용하여 측정하였으며 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1은 각각 (a) 본원 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노입자[180-20]와 (b) 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40]의 투과전자현미경 사진이다. 도 1에 도시된 바와 같이 전자현미경으로 시프로플록사신이 봉입된 나노입자의 형태를 관찰한 결과 모두 구형의 형태를 가지는 것을 알 수 있었으며 (a) 실시예 1에서 제조된 나노입자[180-20]의 경우 주로 약 100-200 nm의 크기 분포를 갖는 것을 알 수 있었고, (b) 실시예 2에서 제조된 나노입자[360-40]의 경우 주로 약 200-400 nm의 크기 분포를 나타내었다.

또한, 도 2는 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40]의 크기 분포를 나타내는 그래프이다. 도 2에 도시된 바와 같이 실시예 2에서 제조된 나노입자의 입도 분포 [360-40]를 찍어 본 결과 약 100 - 500 nm의 크기 분포를 나타내었으며 나노입자의 평균크기는 상기의 표 8에 도시하였다. 이 결과를 보아 상기의 도 1에서 나타낸 투과전자현미경 사진과 거의 일치함을 알 수 있었다.

실험예 3. 본 발명의 바람직한 나노입자의 X-선 회절 패턴분석

시프로플록사신 및 나노입자의 결정 특성을 X-선 분말 회절기(Rigaku D/MAX 1200 automated powder diffractometer)를 이용하여 10 ~ 80^o 의 범위에서 측정하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 (a) 시프로플록사신[Ciprofloxacin HCl], (b) 본원 발명의 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자[Empty NP], (c) 본원 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노입자[180-20], (d) 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자 [360-40], (e) 본원 발명의 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자와 시프로플록사신을 단순 혼합[Empty NP/CIP=20/1] 하였을 때의 XRD(X-ray diffraction) 스펙트럼이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, (a) 시프로플록사신은 약 20^o 부근에서 강한 피크가 관찰되었으며 (b) 비교예 1에서 제조한 약물이 봉입되지 않은 나노입자는 10~60 부근까지 부드러운 피크 특성을 보였다. (c)~(d) 시프로플록사신이 봉입된 [180-20, 360-40] 나노입자는 모두 다 약물이 봉입되지 않은 나노입자와 마찬가지로 부드러운 피크를 보였으나, (e) 약물이 봉입되지 않은 나노입자와 시프로플록사신의 단순혼합은 시프로플록사신의 강한 피크 (20^o) 와 약물이 봉입되지 않은 나노입자의 부드러운 피크를 모두 보임을 알 수 있었으며, 이 결과가 보여주듯이 약물이 나노입자 내에 잘 봉입되었음을 알 수 있었다.

실험예 4. 본 발명의 바람직한 나노입자의 약물방출실험

실시예 1 및 2에서 제조된 10 mg의 나노입자를 5 ml의 인산완충용액 (phosphate buffered saline, 0.1M, pH 7.4)에 분산시켜 투석막(dialysis tube, MWCO: 12,000 g/mol)에 넣고 이것을 200 ml 크기의 유리병에 95 ml의 인산완충용액과 함께 넣었다. 방출실험은 교반기에서 37 ℃, 100 rpm의 조건으로 수행하였다. 일정한 조건을 유지하기 위해 인산완충용액을 매일 교환하였으며 일정한 시간 간격으로 방출된 약물의 농도를 UV 분광광도계 (UV-1601, Shamdzu Co. Ltd. Japan)를 이용하여 277nm에서 측정하였다. 모든 실험은 세 번 반복하였다.

도 4는 (a) 본원 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노입자[180-20] [●], (b) 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40,○]의 약물방출속도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도시된 바와 같이 시프로플록사신은 본원 발명의 실시예에 따라 제조된 나노입자로부터 10일간 서서히 방출되었다. 특히 실시예 2에서 제조된 나노입자[360-40]의 경우 상대적으로 느린 약물 방출 특성을 보였으며, 두 경우 공히 약 15일 이내에 약물이 모두 방출되었음을 알 수 있다.

이 결과는 시프로플록사신이 수용성 약물이므로 상대적으로 소수성약물에 비해 약물의 방출 속도가 빠른 것으로 사료된다.

실험예 5. 본 발명의 나노입자의 항 박테리아 성능 평가

(1) In vitro 항 박테리아 효과 확인

본 발명의 시프로플록사신을 봉입한 나노입자의 in vitro상 항 박테리아 효과를 확인하였다.

미생물은 Escherichia coli (E. coli)와 Salmonella typhimurium (ATCC 14028) (S. typhimurium)을 사용하였고, 한국질병관리본부(Korea Centers for Disease Control and Prevention. KCDC)로부터 구입하여 사용하였다.

저장 용액(Stock solution)은 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute, formerly NCCLS) M7-A6 method (15 National Committee for Clinical Laboratory Standards 2003)의 지침에 따라 조제하고 희석하였다.

냉동 보관된 미생물 용액을 선배양(subcultue)한 뒤, 시프로플록사신 또는 실시예 2의 나노입자를 다양한 농도(0.0005~ 1㎍/ml)로 미생물 용액에 첨가하여 항박테리아 효과를 확인하였다. 모든 실험은 세 번 반복을 하였다. 미생물의 성장은 분광광도기로 600nm에서 광학밀도(OD, optical density)를 읽어서 평가하였다.

도 5는 인산완충용액[PBS, ●], 시프로플록사신[Free CIP, ○], 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자[Empty nanoparticles, ▼], 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[360-40, CIP-nanoparticles, △], 비교예 1에 따라 제조된 시프로플록사신이 들어 있지 않은 나노입자와 시프로플록사신을 단순 혼합한 것[Free CIP + Empty NP, ■]을 각각 (a) Escherichia coli (E. coli)와 (b) Salmonella typhimurium (S. typhimurium)에 처리하여 미생물의 생존율을 비교함으로써 항 박테리아 성능을 평가한 결과를 도시한다.

도시된 바와 같이 완충용액과 비교예 1의 나노입자는 미생물의 성장에 별다른 영향을 미치지 않은 것을 알 수 있다. 반면에 E. coli(a)에 대해 시프로플록사신은 0.05 mg/ml까지 농도의존적인 미생물 성장저해 효능을 가지고 있었으며, 시프로플록사신과 약물을 봉입하지 않은 나노입자의 단순 혼합한 경우에도 거의 비슷한 경향을 가지는 것을 알 수 있었다. 또한, 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자의 경우 시프로플록사신과 동일한 약물 농도에서 시프로플록사신보다 더 낮은 미생물 성장저해 효능을 보였는데 이는 나노입자에서 시프로플록사신이 서서히 방출되기 때문인 것으로 사료된다.

도 5(b)에서 보는 바와 같이 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자가 S. typhimurium에 대해서도 역시 E. coli와 비슷한 항 박테리아 성능을 보이는 것으로 나타났다. 이 경우에도 역시 약물을 봉입하지 않은 나노입자는 미생물의 성장에 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 알 수 있었으며 이는 나노입자를 구성하는 폴리락타이드글리콜라이드는 미생물의 성장에 영향이 없다는 것을 나타낸다.

또한, S. typhimurium에 대해서도 본원 발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자가 시프로플록사신과 마찬가지로 항 박테리아 효능을 나타내었다.

(2) In vivo 항 박테리아 효과 확인 1

본 발명의 시프로플록사신을 봉입한 나노입자의 in vivo상 항 박테리아 효과를 확인하였다.

동물실험을 위해 S. typhimurium을 Luria-Bertani (LB) 배지에서 하루 저녁 배양하였고, 그 다음 원심분리하여 수득한 펠렛을 인산완충용액으로 세척하여 최종농도가 100 CFU/ml이 되도록 희석하여 준비하였다.

상기 S. typhimurium을 BALB/c 마우스(암컷, 6 주령)의 복강에 마리 당 20 CFU가 되도록 주입하였다. 24시간 후, 마우스에 시프로플록사신 또는 본 발명의 실시예 2의 나노입자를 25 mg/kg의 분량으로 복강 내 주사하였으며, 각각 3일째와 5일째에 마우스를 죽여서 비장 (spleen)을 꺼내서 0.05% (w/v) 트윈 20이 들어 있는 멸균 완충용액으로 균일하게 간 다음 S. typhimurium을 LB 아가(agar)에 도말하여 미생물의 숫자를 평가하였다.

도 6은 나노입자와 시프로플록사신의 항 박테리아 성능을 평가하기 위해 BALb/C 마우스에 S. typhimurium을 하루 동안 감염시킨 후 인산완충용액[PBS], 시프로플록사신[Free CIP] 및 본원발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[CIP-NP]를 각각 동일한 투여량으로 처리하여 (a) 3일 및 (b) 5일 동안 항 박테리아 성능을 평가한 결과이다.

도 6(a)에서 보는 바와 같이 처리 후 3일째에 미생물의 숫자를 평가한 결과, 시프로플록사신과 나노입자의 경우 완충용액을 처리한 경우와 비교해서 훨씬 더 낮은 미생물 숫자를 기록하였으며 시프로플록사신을 처리한 경우와 나노입자 사이의 차이는 크지 않은 것을 알 수 있었다. 반면에 5일 후 (도 6(b)) 시프로플록사신은 미생물의 숫자가 급격히 늘어난 것을 알 수 있으며 본 발명의 나노입자의 경우 시프로플록사신에 비하여 훨씬 미생물의 숫자가 적은 것을 알 수 있었다.

(3) In vivo 상 항 박테리아 효과 확인 2

요도염에 걸린 동물 모델 실험을 위해, E. coli를 Luria-Bertani (LB) 배지에서 37 ℃에서 하루 저녁 배양하고 1x10⁶ cell/ml의 세포를 투석막 (dialysis tube, MWCO 10000 Da, Spectra, USA)에 넣고, 이것을 케타민(ketamine, (100 mg/Kg))으로 마취시킨 ICR 마우스의 복강에 수술하여 삽입하였다. 수술 4시간 후, 멸균증류수(DW), 시프로플록사신(CIP)과 나노입자(CIP-NP)를 각각 마우스의 피하에 주사하였다(dose: 25 mg/kg). 3일 후, 마우스를 죽여서 투석막 내의 미생물의 숫자를 HI agar 에 도말하여 평가하였다.

도 7은 멸균수[DW], 시프로플록사신[Free CIP] 및 본원발명의 실시예 2에 따라 제조된 나노입자[CIP-NP]를 각각 E. Coli가 감염된 마우스에 처리 3일 후 박테리아의 성장을 나타낸 결과이다.

도 7에서 보는 바와 같이, 시프로플록사신을 처리한 경우에 비하여 본 발명의 나노입자의 경우에 미생물의 성장이 훨씬 억제됨을 알 수 있었다.

상기와 같은 동물실험결과, 본 발명에 의한 새로운 방법으로 제조된 나노입자가 더 오랜 시간 동안 병원성 미생물의 생체 내 증식을 억제할 수 있음을 밝혀내었으며, 따라서 본 발명의 시프로플록사신이 봉입된 나노입자는 요도염 및 감염성 질환에 효과적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면 요도염을 유발하는 병원성 미생물에 광범위하게 사용되는 시프로플록사신의 고유의 항 박테리아 성능에 큰 변성이 없이 간단한 공정으로 폴리락타이드글리콜라이드 나노입자에 봉입하여 서방성 제제로 제조할 수 있었다. 또한, 매일 투여해야 하는 시프로플록사신의 문제점을 개선하였으며 항 박테리아 성능에 있어서 나노입자가 시험관 내 실험에서는 시프로플록사신과 거의 동등의 항 박테리아 성능을 가지는 것을 알 수 있었으며 동물실험결과 나노입자가 더 오랜 시간 동안 병원성 미생물의 생체 내 증식을 억제할 수 있음을 밝혀내었으며 이를 요도염 및 감염성 질환에 효과적으로 사용할 수 있다.

Claims (12)

100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자

제1항에 있어서, 상기 나노입자의 크기는 130-353nm임을 특징으로 하는 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자

제1항에 있어서, 나노입자의 중량에 대하여 시프로플록사신의 함량은 4.5-5.0(w/w)%임을 특징으로 하는 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자

제1항에 있어서, 상기 시프로플록사신은 10일 이상 지속적으로 나노입자로부터 방출됨을 특징으로 하는 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자

W/O/W 에멀션 용매증발법에 의하여 수용성 약물이 담지된 미립자를 제조하는 방법에 있어서,

(1) 폴리락타이드글리콜라이드를 디클로로메탄에 2-6%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계;

(2) 시프로플록사신을 증류수에 1-2%(w/v, g/ml)의 농도로 용해시키는 단계;

(3) 상기 폴리락타이드글리콜라이드가 용해된 디클로로메탄 용액과 시프로플록사신 수용액을 폴리락타이드글리콜라이드:시프로플록사신의 중량비가 8-10:1이 되도록 혼합한 다음 초음파분쇄기로 30~40 와트(W)의 출력으로 10ml당 1~3분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만드는 단계; 그리고

(4) 상기 W/O 에멀션을 다시 1.0 %(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 넣어 고압균질기(High-pressure homogenizer)로 600~800 bar에서 100ml당 1분 주기로 5~7 주기(사이클) 동안 처리하여 W/O/W 에멀션을 만드는 단계를 포함하는 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자 제조방법

제5항에 있어서, (5) 상기 W/O/W 에멀션을 폴리비닐알코올 0.4 %(w/v) 수용액에 넣고 교반기로 500-1500rpm에서 30~90분 동안 교반한 후 초원심분리기로 나노입자를 회수하여 냉동건조 시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자 제조방법

제5항에 있어서, 상기 3단계에서 초음파분쇄기로 40 와트(W)의 출력으로 10ml당 1분 동안 처리하여 W/O 에멀션을 만드는 것을 특징으로 하는 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공 중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자 제조방법

제5항에 있어서, 상기 4단계에서 고압균질기로 600 bar에서 100ml당 1분 주기로 5(사이클) 동안 처리하여 W/O/W 에멀션을 만드는 것을 특징으로 하는 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 기공성 나노입자 제조방법

제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되며, 100-500nm의 입자 크기를 가지며 내부에 시프로플록사신이 담지된 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 나노입자

제9항에 있어서, 상기 나노입자의 크기는 130-353nm임을 특징으로 하는 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 나노입자

제9항에 있어서, 상기 나노입자의 중량에 대하여 시프로플록사신의 함량은 4.5-5.0(w/w)%임을 특징으로 하는 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분해성 나노입자

제9항에 있어서, 상기 시프로플록사신은 10일 이상 지속적으로 나노입자로부터 방출됨을 특징으로 하는 폴리락타이드글리콜라이드 공중합체의 서방출 및 생분 해성 나노입자

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