KR20100084399A

KR20100084399A - 나노입자 형태로 세드롤을 포함하는 항암 조성물

Info

Publication number: KR20100084399A
Application number: KR1020090003868A
Authority: KR
Inventors: 김병우; 권현주; 서은진
Original assignee: 학교법인 동의학원
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2010-07-26
Also published as: WO2010082789A3; WO2010082789A2

Abstract

본 발명은 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 나노입자 형태로 제조하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 나노입자를 포함하는 암질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

세드롤, 나노입자, 암

Description

나노입자 형태로 세드롤을 포함하는 항암 조성물{Anticancer compositions comprising cedrol in nanoparticle form}

나노바이오 기술은 일차적으로 나노 크기의 구조 체를 제조하는 기술로부터 출발하며 현재 이 분야의 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 대다수의 방법들은 단순히 약물입자의 제조뿐만 아니라 다른 다양한 유기물입자의 제조에 이용될 수 있고, 또한 나노 피막형성(nano encapsulation)의 방법으로도 사용이 가능하다(Zhiping Zhang and Si-Shen Feng, The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles, Biomaterials, 27, 4025-4033. 2006.).

Genomics, proteomics, high through-put 기술 등 다양한 기초생물, 의학, 유기화학 분야의 기술 발전을 통하여 신약의 개발속도는 최근 들어 급격히 가속도가 붙기 시작하고 있다. 그 결과 신약 후보 물질들의 수가 급증하고 있는 추세이다. 신약 후보 물질의 발굴 속도에 비해 약물전달 기술은 상대적으로 발전이 늦어, 현재 많은 수의 신약 후보 물질들이 제제 기술부족으로 사장되는 상황이다. 이들의 대다수는 신약 개발 중 첫 제제 단계에서 폐기되는 경우들이다. 대표적인 경우가 난용성 약물인데, 본원에 포함된 세드롤도 여기에 속한다.

기존의 제약공정은 수 마이크론에서 수백 마이크론 크기의 약물결정 입자를 가지고 과립화(granulation), 혼합(mixing), 정제화(tabletting) 등의 공정을 통해 주로 고형경구제로 생산되고 있다(Peter J. A. Frinking, Ayache Bouakaz, Nico de Jong, Folkert J. Ten Cate and Siobhan Keating, Effect of ultrasound on the release of micro-encapsulated drugs, Ultrasonics, 36, 709-712, 1998.). 이러한 제한적인 약물크기 영역은 제제에 큰 제한을 가해 왔었다. 그러나 최근 들어 나노미터 크기의 약물입자들을 쉽게 가공할 수 있는 방법들이 개발됨으로써 약물의 용해 속도 범위가 획기적으로 늘어나게 되었고, 따라서 난용성 약물의 전달에 큰 개선이 이루어지게 되었다(Rong, Liu. Water-insoluble Drug Formation, Interpharm Press, Denver, 473, 2000.; M. J. Grau, O. Kayser and R. H. M, Nanosuspensions of poorly soluble drugs reproducibility of small scale production, International Journal of Pharmaceutics, 196, 155-159, 2000.). 최근에 개발된 약물로는 머크(MSD)사의 Emend, 와이어스(Wyeth)사의 Rapamune 등이 있다.

이러한 약물 나노입자의 이용은 약물의 흡수도 향상 외에도 다양한 장점을 가지고 있다. 약물의 함량 증가가 쉽고, 흡수속도를 빠르게 하며, 여러 유기용매의 사용이나 극단적인 pH를 사용할 필요도 없어질 수 있다(N. Hardas, S. Danviriyakul, J. L. Foley, W. W. Nawar and P. Chinachoti, Accelerated Stability Studies of Microencapsulated Anhydrous Milk Fat, Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 33, 506-513, 2000.). 또한 다양한 약물 전달 체와 결합되어 표적 지향성, 지능성 전달체를 만드는 기초기술로도 이용될 수 있다. 그 외 약물의 맛을 감추거나, 긴 약효지속효과를 기대할 수 있고, fed/fasted variability를 감소시킬 수 있는 효과도 있다(Y. H. Lee, C. A. Kim, W. H. Jang, H. J. Choi and M. S. Jhon, Synthesis and electrorheological characteristics of microencapsulated polyaniline particles with melamineformaldehyde resins, Polymer, 42, 8277-8283, 2001.).

한편, 국내에 자생하는 식물 중에 상록침엽교목인 향나무는 널리 분포하고 있으며, 예로부터 거풍, 산한, 활혈, 해독의 효능이 있으며, 풍한, 감기, 류머티즘으로 인한 관절통, 주마진, 경결, 초기의 종독을 치료하는데 사용되었다. 최근 향나무에서 많은 화학적 성분이 분리되고 그 구조가 밝혀지고 있다. 예를 들면 향나무의 잎에서 노르피마란(norpimarane)과 노르아비에탄(norabietanes) 등의 많은 화학적 성분이 분리되었으며, 향나무의 심재에서도 많은 화학적 물질(β-cuparenol, α-acorenol, thujopsen-12-ol, isolep-tographiol, caryophylleneoxide, 6,7-epoxycar- yophyll-3-en-14-ol, cedrol, cedran-3a -ol, cedrane-3/3,12-diol, ferruginol, hinokiol, dehy-droabietinol, abieta -8, 11,13- trien-7-one, sugiol, totarol, sandaracopI-maric, trans - communic acid, cis -communic acid, agathic acid, isocupr-essic acid, acety lisocup- ressic acid, 15-hydroxylabd-8-en-19-oic acid, 15,16-bisnor -13-oxolabda -8,11E-dien-19-oic acid)이 분리되었다. 또한 향나무 성분의 약리작용으로는 항균, 항진균, 항바이러스의 활성을 나타낸다고 알려져 있으며, 낙태와 피임 효과도 있다.

본 발명자는 대한민국 등록특허 제673574호에서 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 암질환의 치료 및 예방 효과가 우수함을 밝혔다. 그러나 세드롤은 난용성 화합물로서 과립화(granulation), 혼합(mixing), 정제화(tabletting) 등의 공정을 통해 고형경구제로 제조하는데 어려움이 있다. 이에 본 발명자는 세드롤의 인체 내 투여를 용이하게 하기 위한 다양한 방법을 고려하였으며, 본원에 기재된 제조방법에 의하여 나노입자 형태로 세드롤을 제조한 경우 미세크기로 인하여 생체 내에 용이하게 투여할 수 있을 뿐만 아니라 생체 내 서방성 방출 효율도 우수하여 암질환의 치료 및 예방을 위하여 효과적으로 사용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유기용매에 용해시키고 양수성 생체고분자와 혼합한 후 계면활성제를 전체의 3 내지 7% 농도로 혼합하는 단계; (b) 상기 (a)의 혼합물을 파쇄하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 에멀젼을 4 내지 6회의 원심분리 및 세척을 한 후 이를 건조하는 단계를 포함하는 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 나노입자 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법에 의하여 제조된 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 나노입자를 포함하는 암 질환의 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 약제학적 조성물을 인체에 투여하여 암 질환을 치료 및 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유기용매에 용해시키고 양수성 생체고분자와 혼합한 후 계면활성제를 전체 용액의 3 내지 7% 농도로 혼합하는 단계; (b) 상기 (a)의 혼합물을 파쇄하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 에멀젼을 4 내지 6회의 원심분리 및 세척을 한 후 이를 건조하는 단계를 포함하는 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 나노입자 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 대한민국 등록특허 제673574호에 기재하고 있다. 따라서 본 발명의 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 본 발명의 범위에 벗어나지 않는 한 대한민국 등록특허 제673574호는 본 발명에 포함된다.

상세하게는, 본 발명의 세드롤은 하기 화학식 1의 화합물로서, 암 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하고, 암세포 생장 억제 효과를 갖는 화합물을 말한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 세드롤은 암세포에 대해 핵모양의 변화와 미토콘드리아의 사이토크롬 C(cytochrome C) 방출, 캐스파아제-8(caspase-8) 활성화, 캐스파아제-9(caspase-9) 활성화, 캐스파아제-3(caspase-3) 활성화 및 폴리 폴리머라아제(poly(ADP-ribose)polymerase)의 분해가 유도되는 아폽토시스(apoptosis)에 의한 세포 사를 유도하고, 복제개시인자인 MCM 단백질(MCM protein)의 발현 저하의 효과를 가지고 있다. 이러한 세드롤(cedrol)은 당업자에게 잘 알려진 화학적 합성 방법에 의하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 측백나뭇과의 상록침엽교목인 향나무(Juniperus chinensis)로부터 분리하여 획득할 수 있다. 본 발명에서 있어서, 세드롤은 경우에 따라 세드롤의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 세드롤의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 염은 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약제학적으로 허용 가능한 염으로는 이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만텔레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업 계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

또한, 약제학적으로 허용 가능한 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼 화성 유기용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시 켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유기산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycolic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약제학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 나노입자를 제조하는 방법에 있어서, 첫 번째 단계는 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유기용매에 용해시키고 양수성 생체고분자와 혼합한 후 전체의 3 내지 7% 농도로 계면활성제를 혼합하는 단계이다.

세드롤은 난용성 화합물로서 물에 잘 녹지 않는 성질을 가지고 있다. 이러한 성질로 인하여 세드롤을 포함하는 암 질환의 치료 및 예방용 약제를 제조하는데 상당한 어려움이 있다. 따라서, 본 발명은 이를 해결하고자 하는 것으로서, 먼저 세드롤을 유기용매에 용해시킨다. 상기 유기용매는 임의의 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride), 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸술포옥사이드, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 메탄올을 사용한다. 필요한 경우에는 이들 용매를 혼합하여 사용할 수도 있다. 또한 필요한 경우에는 소량의 물을 혼화해도 된다.

유기용매에 용해된 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 다시 양수성 생체고분자와 혼합한다. 상기 양수성 생체고분자는 임의의 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리(락트산) 또는 폴리(락트산-코-글리콜산)이다. 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 양수성 생체고분자는 1: 10의 비율로 혼합하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1: 5의 비율로 혼합한다.

다음으로, 계면활성제를 상기 용액에 3 내지 7%의 농도로 용해시킨다. 바람직하게는, 계면활성제는 4 내지 6%의 농도로 상기 용액에 용해시킨다. 계면활성제의 농도가 7% 이상일 경우 최종적으로 제조되는 나노입자의 크기가 상대적으로 크고, 나노입자 내에 포집되는 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 효율이 낮아지며, 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 서방성 방출량이 증가하는 단점을 가진다. 따라서, 계면활성제의 농도가 적정농도, 즉 3 내지 7%의 농도, 바람직하게는 4 내지 6%의 농도일 때 상기 단점들을 극복할 수 있으나, 계면 활성제의 농도가 0.5% 미만인 경우에는 나노입자(nanoparticle) 형성에 문제점을 야기할 수 있다.

계면활성제는 다양한 임의의 계면활성제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산 또는 이들의 유도체, 크레모포어, 트윈류를 사용한다.

두 번째 단계는, 상기 혼합물을 초음파 분쇄하여 에멀젼을 형성하는 단계이다. 파쇄는 당해 분야에 알려진 임의의 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 초음파를 이용하여 파쇄한다. 파쇄의 시간 등의 조건은 파쇄 방법 및 형성되는 에멀젼 상태와 관련하여 당업자에 의하여 용이하게 결정할 수 있다. 구체적인 하나의 예로서, 초음파 파쇄 시간은 3분 내지 12분이며, 바람직하게는 4분 내지 10분이다. 상기 초음파 파쇄 시간이 12분을 초과하는 경우에는 제조되는 나노입자의 세포독성에 악영향을 미치는 문제점이 있으며, 초음파 파쇄 시간이 3분 미만인 경우에는 에멀젼이 충분히 형성되지 않는 문제점이 있다.

세 번째 단계는, 상기 에멀젼을 4 내지 6회 원심분리 및 세척을 하고, 이를 건조하는 단계이다.

원심분리는 에멀젼의 층이 충분히 분리될 정도이며 당해 분야의 기술자에게 알려진 원심분리 속도 및 시간 동안 진행을 할 수 있다. 또한 세척은 제조되는 나노입자에 혼합될 가능성이 있는 불순물을 제거하기 위한 과정이다. 이러한 원심분 리 및 세척은 순수한 나노입자의 제조를 위한 것으로서 그 회수는 4 내지 6회이며, 바람직하게는 4회 또는 5회이다.

다음으로 나노입자의 분말을 수득하기 위하여 건조시키는 단계를 포함한다. 상기 건조 단계는 반드시 본 발명에 있어서 필요한 과정은 아니며, 제조되는 나노입자의 최종 제형에 따라 선택적으로 할 수 있다. 상기 건조는 공정 중에 사용되는 임의의 물 또는 다른 화합물을 제거하여 입자 형태로 만드는 것을 의미한다. 건조 방법은 동결건조, 분무 과립화, 분무 건조 등을 포함하는 당해 분야에서 공지된 건조 방법일 수 있다. 이러한 방법들 중에서 동결건조가 특히 바람직하다. 이러한 건조 방법에 관한 기술은 당해 분야에서 잘 공지되어 있다.

상기한 방법에 의하여 제조된 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 나노입자의 크기는 100 내지 500nm이며, 바람직하게는 200 내지 500nm이며, 보다 바람직하게는 200 내지 400nm이다.

상기한 방법에 의하여 제조된 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 나노입자는 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 포집율이 우수하며, 이들 화합물의 생체 내 서방성 방출 효과도 우수하여 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 원형 그대로 사용하는 경우보다 생체 내 적용시 많은 장점을 가진다. 또한, 이들 화합물은 MCM 단백질의 과발현을 억제하는데 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 원형과 동일한 효과를 가지고 있다.

따라서, 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 나노입자를 포함하는 암질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

상기 암 질환은 일반적인 암 질환을 포함하며, 바람직하게는 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암봉, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNA: central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종을 포함한다.

본 발명의 암 질환의 치료 및 예방용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 나노입자를 0.1 내지 50중량%로 포함한다. 특히, 상기 나노입자는 세드롤 화합물보다 작은 양으로 포함되더라도 상기한 바와 같은 생체 내 서방성 방출율이 우수하므로 오래동안 약효를 지속시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 임의의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 등에서 1종 또는 2종 이상을 선택적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 정제 또는 경질 캅셀제 등의 고형 제형으로 제조할 경우, 부형제로서 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 또한 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등에서 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 무수 이염기성 인산칼슘과 같은 정제에 광택을 제공하는 첨가제를 사용할 수 있으며, 수불용성 물질로 피복시킴으로서 공기 중의 수분이 정제 내로 침투하는 것을 방지할 수 있다. 이때 피막기제는 분자구조가 치밀해야 하고, 수용액에 쉽게 용해되지 않는 것이 바람직하다. 이러한 피막제로서 메타크릴산 코폴리머, 히드록시프로필메틸셀룰로오즈프탈레이트, 셀룰로오즈아세테이트프탈레이트, 히드록시프로필메칠셀룰로오즈아세테이트석시네이트, 폴리비닐알코올 등의 고분자물질을 사용할 수 있다. 이들 고분자 물질은 단독 또는 혼합하여 피복에 사용할 수 있다. 또한, 상기 피막은 당업계에서 통상적으로 피막기제에 첨가할 수 있는 첨가제, 예를 들면 가소제, 방부제, 착색제, 차광제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 멸균 수용액 등의 액제 및 주사제의 형태일 수 있으며, 필요시 10 내지 40%의 프로필렌글리콜, 및 용혈현상을 방지하는데 충분한 양(예로, 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료 방법에 따라 약제학적 분야에서 통상의 방법에 따라 약제학적 분야에서 통상적인 제제로 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 주사제, 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유제, 시럽제, 유탁제, 경고제, 연고제, 에어로졸제, 오일제, 겔제, 주정제, 틴크제, 욕제, 리니먼트제, 로션제, 패취제, 패드제, 크림제 등을 포함한다. 주사제, 정제, 캅셀제, 산제, 에어로졸제, 패취제 등의 형태가 바람직하며, 경구 투여를 위한 정제 또는 캅셀제, 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 또는 국소 피부를 통하여 흡수가 가능하도록 하는 패취제 및 비경구 투여를 위한 주사제로서 더 바람직하게 사용될 수 있다.

에어로졸제로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

패취제로 제형화하는 경우, 피부를 통한 화합물의 흡수를 증가시키기 위해서 흡수촉진제를 사용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하여 암 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "개체"란 인간, 영장류 및 가축, 사육, 애완용 또는 스포츠 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 암 질환의 치 료가 필요한 임의의 포유동물을 말한다. 특히, 본 발명의 치료는 인간이 바람직할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구, 비경구, 국소 투여, 직장 투여, 비내 투여 등 다양한 투여방식으로 투여할 수 있다.

비경구 투여는 전신 효과를 가져오는 주사 또는 고통받는 영역에 직접 투여되는 주사를 포함한다.비경구 투여의 예로는, 피하, 정맥내, 근육내, 진피내, 경막내, 안내 및 일반적인 주입 기법이 있다.

국소 투여는, 예를 들어 눈, 외이 및 중이 감염을 비롯한 귀, 질, 열리고 봉합된 상처 또는 닫힌 상처 및 피부와 같은 국소 적용에 의해 용이하게 접근가능한 감염 영역 또는 기관의 치료를 포함한다.또한, 전신 효과를 가져오는 경피 전달을 포함한다.

비내 투여는 코 에어로졸 또는 흡입 적용을 포함한다.

본 발명의 조성물은 약제학적 유효량으로 투여한다. 용어 "약제학적 유효량"이란, 본 발명의 조성물의 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 환자의 연령, 체중, 건강, 성별 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에서 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다. 예를 들면, 증상의 심각성에 따라 하루 또는 매 4 내지 6시간마다 1회 투여할 수 있다. 급성인 경우, 매 4 내지 6 시간마다 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 바람직하며, 예방(또는 유지) 또는 치료로 사용하는 경우 하루에 1회 또는 2회 투여하는 것이 바람직하나, 본 발명에 따른 암 질환 치료 및/또는 예방용 조성물의 경우, 질환의 특성에 따라 2회 이상 투여하는 것도 가능하다.

기존의 항암제 및 치료제의 경우 치료부위뿐만 아니라 정상부위에도 작용하기 때문에 부작용의 문제를 항상 내포하고 있다. 나노약물전달시스템은 치료제가 가진 이러한 문제점을 해결하여 선택적, 국소적인 치료가 가능한 장점을 가지고 있어 획기적인 치료방법을 제시할 도구로서 각광받고 있다. 본 발명의 NM은 약물 혹은 용해되기 어려운 분자를 나노입자를 이용하여 부작용을 줄이고 약물의 효과를 극대화할 수 있으며, 특히 본 발명에 의하여 제조된 조성물은 암 치료 및 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

본 발명은 이하 실시예를 통하여 좀더 구체적으로 설명될 것이다. 이러한 실시예는 단지 본 발명이 좀 더 이해될 수 있도록 예시적으로 제시되는 것이므로, 이들 실시예로서 본 발명의 범위를 한정해서는 안 될 것이다.

참고예 : 재료의 준비

폴리(락트산-코-글리코산)(Poly(DL-lactic-co-glycolic acid), PLGA; L/G=50/50; Resomer RG 503H; MW 40,000-75,000)은 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co.사에서 구입하였으며, 폴리비닐알콜(Poly viniyl alcohol, PVA; MW: 30,000-70,000; the viscosity of a 0.5~10% solution 4-6 cp at 20℃; the degree of hydrolysis is 87-90%)은 Sigma Chemica 사에서 구입하였다. 메틸렌클로라이드(Methylene chloride; Dichloromethane, DCM, analytical grade)는 Merck(Germany)사에서 구입하였고, 아세톤니트릴(Acetonitrile)은 HPLC grade로 Malinckrodt Baker 사에서 구입하였다.

실시예 1 : 세드롤의 나노입자(Nanomedicin, NM)의 제조

세드롤의 나노입자(Nanomedicin, NM)을 제조하기 위하여 양수성 생체고분자(Biopolymer)로 폴리(락트산-코-글리코산)(Poly(DL-lactic-co-glycolic acid, PLGA)를 사용하였고 계면활성제로는 폴리비닐알콜(Polyviniyl alcohol, PVA)을 사용하였다. 실험방법은 16ml의 메틸렌클로라이드(methylene chloride, DCM)에 세드롤 40mg을 넣고 완전히 녹인 후 PLGA 200mg을 혼합하였다. 이 혼합액에 전체의 0.5%, 5% 및 10% 농도의 PVA 용액을 100ml 가하고 초음파파쇄(sonication; 60W)를 5분 또는 10분하여 에멀젼을 형성시켰다. 생성된 에멀젼은 50ml 원심관에 넣고 12,000rpm, 15분 간 원심분리한 후 3차탈이온수 100ml로 세척하고, 이를 다시 12,000rpm에서 15분간 원심분리시켰다. 이 과정을 5회 반복한 후 PPT를 증류수 10ml에 현탁시킨 다음 -80℃에 동결하고 48시간 동안 동결건조시켜 NM 입자를 만들었다. 이 과정을 도 1에 나타내었다.

실시예 2 : 제조된 세드롤 나노입자의 물성평가

2-1. 입자크기 분석(Particle size analysis)

NM의 평균 크기와 균질성은 Laser Diffraction Particle Size Analyzer (BECKMAN COULTER, LS 13320, USA)으로 분석하였다. 이에 대한 결과를 표 1 및 도 2와 도 3에 나타내었다.

NM의 평균 크기는 표 1에서 보듯이 50 내지 800nm 이며, poly-dispersity는 0.243 내지 0.373이었다. 특히 PVA 농도별, 초음파파쇄(sonication)의 시간별로 그 크기(size)가 각각 다른 양상을 나타내었다. PVA 농도가 높을수록 크기가 증가하였으나, 초음파파쇄 시간이 증가할수록 크기는 감소하였다. 도 2에서 NP1과 NP3의 크기는 200 내지 500nm로 큰 차이를 보이지 않았으나 NP5에서는 600 내지 900nm로 큰 차이를 보였다. 도 3에서 NP4가 입자의 크기가 가장 작았으며 다음으로 NP2가 작고 균질하였다. NP5는 도 2에서의 NP6과 큰 차이를 보이지 않았다.

2-2. 표면구조(Surface morphology)

NM의 표면구조는 field emission scanning electron microscopy (FE-SEM, Quanta 200 FEG ESEM, Czech)로 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 4 내지 9에 나타내었다.

이들 도 4 내지 9에서 알 수 있듯이, PVA 농도가 5% 이하일 때 그 크기가 작고 균일하게 분포되어 있음을 알 수 있었다. 또한 초음파파쇄 시간을 증가했을 시 그 크기가 감소되고 NM의 제조가 증가되었다. 따라서 최적의 초음파 파쇄 시간은 크기와 균질성을 볼 때 10분 내외가 가장 적당하며, PVA농도는 최대 5% 이내가 가장 적당한 결과를 나타내었다.

2-3. DSC analysis

사용한 DSC는 열분석 데이터 처리 장치를 갖춘 Perkin-Elmer사의 모델 DSC-7(Fig. 2.)이며, 인듐(Tm=156.6℃, ΔHf=28.5J/g)을 이용하여 온도 검정을 하였다. 고분자 시료의 분해를 막기 위하여 질소 분위기 하에서 측정하였으며, 약 5mg의 블렌드 시료를 사용하여 측정하고자 하는 성분 고분자의 질량이 블렌드 내에서 일정하도록 하였다.

도 10은 이에 대한 결과로써 NM의 물리적인 상태를 보여주는 것으로 겔화온도, 융해온도, 결정화온도를 각각 나타내주고 있다. 이 도면은 첫 번째, 두 번째 heating cycle을 거쳐 결정화 과정을 거치는 cycle로써 첫 번째 세드롤(CR)의 Tg는 55℃, Tm은 90℃부근, Tc는 50℃로 나타났다. 생분해성 고분자인 PLGA는 57℃에서 융해되고, NM은 CR과 PLGA에서 나타나는 융해온도를 모두 가지고 있었으며, 이 결과로 미루어 볼 때 NM은 나노입자로써 미셀(micelle)이 형성됐음을 알 수 있었다.

실시예 3 : NM(Nanomedicin)의 활성평가

3-1. 약물 포집 효율(Encapsulation efficiency)

NM의 약물 포집 효율은 HPLC (Waters alliance 2690)를 사용하여 분석하였다. 컬럼(column)은 reverse phase Inertsil XTrra^TM RP18 (4.6´ 150mm i.d.,pore size 5μm, Waters, Tokyo, Japan), 전개용매는 Acetonitrile-water(60:40)을 사용하여 용출시킨 후 195nm에서 측정하였다. 실시예 1에서 제조된 NM 3의 6mg을 1ml의 DCM에 용해시키고 DCM을 완전히 증발시킨 후, 1.5 ml acetonitrile-water(60:40)에 용해시킨 후 용출된 약물의 양을 HPLC로 측정하였다. 약물포집효율은 하기 실험식 1에 의하여 산출하였다.

[실험식 1]

이에 대한 결과를 상기 표 1에 나타내었다. 약물포집효율(EE)은 48 내지 90% 정도로 많은 차이를 보였으며, 이의 보정 실험에서 10% 내외의 차이를 보였다. 이에 상기 표 1은 보정하여 그 값을 나타내었다. 상기 표 1에서 알 수 있듯이, PVA농도가 높을수록 약물 봉입 효율이 현저하게 낮았으며, PVA농도가 낮을수록 약물 봉입 효율이 증가하였다. 따라서 PVA 농도가 5% 이내일 경우 약물 봉입 효율에 있어서 최상의 조건임을 알 수 있었다.

3-2. 약물의 서방성 방출실험(Sustain release)

약물의 서방성 방출 효율은 상기 실시예 1에서 제조된 NM 8mg을 10ml PBS(pH 7.4)에 현탁시켜 37℃ shacking water bath에 120분간 100rpm으로 진탕하면서 일정 시간 간격으로 방출된 약물의 양을 HPLC로 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

초기방출은 첫째날 방출되는 중합체의 4가지 유형모두에서 10%를 넘었다. 단계적으로 방출했음에도 불구하고 1달 후에도 여전히 일정하게 남아 있었다. PLGA와 cedrol을 혼합한 군과 낮은농도, 중간농도의 PVA양으로 인해 분자간의 이동이 쉽지 않았기 때문인 것으로 예상된다. Nanoparticle의 크기가 커질수록 방출되는 비율과 기울기는 낮아짐을 알 수 있다. 도 11은 PLGA와 cedrol을 각각 5:1로서 혼합한 방출 곡선을 나타낸다. 이 결과는 중간 농도의 군보다 높은 방출량을 나타내는데, nanoparticle이 더 친수성이 되었기 때문으로 생각된다. Nanoparticle 내에서 구성 물질과 약물, 계면활성제의 물리화학적인 상관관계에 의해 만들어 지기 때문에 그 방출 속도와 크기 등이 다양하게 만들어 질 수 있다. 다시 말해서, 더 작은 입자 크기로부터 방출된 약물은 더 큰 입자의 방출 속도보다 빨랐으며, 유화제인 PVA를 처리하지 않은 군에서는 50%, 낮은 PVA농도에서는 방출되는 cedrol의 양이 증가하였고, PVA농도가 높아질수록 방출되는 cedrol의 양이 현저하게 감소하였다. 이 결과로 미루어 볼 때 PVA농도가 5% 이내일 때, 초음파파쇄 시간이 증가될수록, 즉 입자의 크기가 작고 균질할수록 그 방출이 서서히 진행되고 방출되는 양 또한 증가되었다.

3-3. NM의 세포독성 실험(Cytotoxic effect)

세포 독성 실험은 MTT (3-(4,-dimethylthiazol -2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliu - mbromide) 방법으로 측정하였다. HT29 세포(1.5× 10⁴cells/well)를 96-well plate에 접종하고 NM을 농도별로 처리하여 24, 48 및 72시간 배양시킨 후, MTT 용액(1.0 ㎎/㎖) 50㎕를 각 well에 첨가하고 4시간 배양시킨 다음 상등액을 제거하였다. MTT에 의해 생성된 세포내의 formazen 결정은 DMSO 150㎕를 첨가하여 용해한 후 540nm OD값에서 microplate reader를 사용하여 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 12 내지 16에 나타내었다.

도 12 내지 16에서 보는 바와 같이, NM(15 내지 30 ㎍/㎖)을 처리한 HT29 세포 (1.5×10⁴cells/well)는 농도 의존적으로 세포생존율이 감소하였다. 그 중, PVA 5%, 초음파 파쇄 10분의 조건이 HT-29세포에 가장 강한 세포독성 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 4 : NM을 처리한 HT29 세포의 MCM 단백질 발현 결과

MCM 단백질은 헬리카제(helicase) 활성을 지니는 진핵 DNA 복제에 필수 인자로 정상세포에서 인산화와 탈인산화에 의한 DNA 중복복제를 제어하는 단백질이다. 이러한 MCM 단백질의 발현이 조절되지 못하면 암세포로 전환되고 세포는 무한 증식하게 된다. MCM 단백질은 정상세포에 비해 암세포에서 대량 발현되는 것으로 보고되어 있다.

NM을 처리한 HT29 세포의 MCM 단백질의 발현 저하를 확인하기 위해 실시예 1에서 제조된 NM을 PBS에 용해시키고 농도별로 HT29 세포에 처리한 후 시료가 처리된 암세포를 CSK buffer (10 mM Pipes, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA ,1 mM dithiothreitol, 1mM phenylmethanesulfonyl fluoride)에 0.1% TritonX-100, 1 mM ATP 와 Protease inhibitor (Pharminogen A)가 첨가된 용액을 사용하여 현탁한 후 MCM-2, -3, -5, -6, -7, PCNA, actin단백질을 얻기 위하여 세포 현탁액을 sonication을 행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포는 20,000 x g로 30분간 원심 분리하여 상층액을 획득하였으며, 상층액의 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 동일 양의 단백질(40 )을 사용하였고, 액틴은 대조군으로 사용하여, SDS-PAGE를 행하였다. 액틴은 15% 분리겔을 사용하였으며, MCM-2, -3, -5, -6, -7은 10% 분리 겔을 사용하였다. 단백질 전기영동 후 겔 내의 단백질은 PVDF 막에 전사시키고 blocking solution (Blockace^TM, Dai-Nippon)을 사용하여 실온에서 1시간 blocking과정을 거쳤다. 1차 항체는 37에서 1시간 반응시켰으며 TBS(50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl)에 0.1% TritonX-100이 첨가된 용액을 사용하여 PVDF막을 세척하였다. Peroxidase-conjugated 이차 항체(Pierce)를 사용하여 37에서 1시간 반응시키고 chemiluminescence system (SuperSignal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Pierce)으로 검출하였다. 반응의 정도는 Fluorchem^TM5500 (Alpha Innotech)를 사용하여 정량하였다. 그에 대한 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에서 보는 바와 같이, NM을 처리한 HT29 세포에서 MCM 2 내지 7 단백질의 발현저하를 확인할 수 있었다. 따라서 헬리카제(helicase) 활성을 지니는 DNA 복제 필수 인자인 MCM 단백질의 저하로 암세포에서의 MCM 단백질의 과발현의 억제가 가능함을 확인하였다.

실시예 5 : NM의 암 조직 감소 효과

NM의 동물 모델에서의 고형암 조직 감소효과를 알아보기 위하여 4 내지 5주령의 C57bl/6 수컷 마우스(체중 15-20g)를 사용하여 각 그룹 당 6마리씩 4개 그룹으로 구성하였다. 1주일의 적응기간을 가진 후, 세포 계대 배양한 B16/F10 melanoma cell을 5× 10⁶cells/㎖ 이 되도록 오른쪽 겨드랑이에 주사하여 암을 유발시켰다. 암 조직이 외견상 10mm 정도일 때(암세포 주사 후 10일 후) NM을 PBS에 현탁하여 미정맥주사, 복강주사, 경구투여하여 18일이 경과한 후 이를 해부하여 암 조직을 적출하였다. NM 투여 후 암질환 동물모델의 몸무게 변화를 하기 표 2 및 도 18에 나타내었다. 또한, 일차암에 대한 항암효과를 측정한 결과 복강주사의 경우 암 조직의 무게가 대조군 5.1g에 비해 크게 줄어 평균 2.24g로 50% 이상 암 조직이 감소했음을 알 수 있었다. 그리고 미정맥주사와 경구투여의 경우에도 각각 3.61g, 3.76g로 대조군에 비해 30% 내외의 암 조직 감소를 확인하였다(표 3 및 도 19 내지 21).

[실험식 2]

도 1은 본 발명의 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 나노입자를 제조하는 공정을 나타낸 그림이다.

도 2 및 도 3은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자의 PVA 농도 및 초음파 파쇄 시간에 따른 입자 크기를 나타낸 그림이다.

도 4 내지 도 9는 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자의 PVA 농도 및 초음파 파쇄 시간에 따른 입자 상태를 FE-SEM으로 관찰한 그림이다.

도 10은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자의 물리적인 상태를 DSC thermogram으로 분석한 결과를 나타낸 그림이다.

도 11은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자의 세드롤 화합물의 방출실험으로써 PVA 농도별로 처리한 NM의 시간별 방출량을 측정한 그래프이다.

도 12 내지 도 16은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자를 HT29 세포에 처리하였을 때 PVA 농도 및 초음파 파쇄 시간에 따른 세포 독성 효과를 관찰한 그림이다.

도 17은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자를 HT29 세포에 처리하였을 때의 MCM 단백질의 발현 저해 정도를 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.

도 18은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자를 암질환 동물모델에 주입하였을 때 몸무게 변화를 백분율을 그래프로 나타낸 결과이다.

도 19는 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자를 암질환 동물모델에 주입하였을 때 종양크기를 날짜별 그래프로 나타낸 결과이다.

도 20은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자를 암질환 동물모델에 주입하였을 때 최종 적출된 종양의 무게를 나타낸 결과이다.

도 21은 본 발명에 따라 제조된 세드롤 나노입자를 암질환 동물모델에 주입하였을 때 외관상 관찰되는 암조직 감소 정도를 나타낸 그림이다.

Claims

(a) 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유기용매에 용해시키고 양수성 생체고분자와 혼합한 후 계면활성제를 전체의 3 내지 7% 농도로 혼합하는 단계;

(b) 상기 (a)의 혼합물을 파쇄하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및

(c) 상기 (b)의 에멀젼을 4 내지 6회의 원심분리 및 세척을 한 후 이를 건조하는 단계를 포함하는 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 나노입자 제조방법.
제1항에 있어서, (a) 단계의 양수성 생체고분자는 폴리(락트산) 또는 폴리(락트산-코-글리콜산)인 방법.
제1항에 있어서, (b) 단계의 계면활성제는 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 방법.
제1항에 있어서, (b) 단계의 파쇄가 초음파 파쇄이며, 3분 내지 12분 동안 초음파 파쇄를 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 제조된 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 100 내지 420nm 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제5항 중의 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 나노입자를 포함하는 암질환의 치료 및 예방용 조성물.