KR20080036587A - 생물학적 물질 및 이의 용도 - Google Patents

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케이드 캠벨
라미로 알베리오
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Abstract

분화 세포, 또는 분화 세포의 핵을 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아로부터 유도된 세포 또는 이의 세포 추출물에 노출시키는 것을 포함하며, 상기 냉혈 척추동물은 하기 특성
(i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
(ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
(iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
중 하나 이상을 갖는 재프로그래밍된 세포 또는 재프로그래밍된 세포 핵을 생성하는 방법이 제공된다.
또한, 상기 재프로그래밍된 세포의 용도가 제공된다.
재프로그래밍, 분화, 배아, 난모 세포, Oct-4, nanog

Description

생물학적 물질 및 이의 용도{BIOLOGICAL MATERIALS AND USES THEREOF}
본 발명은 분화 세포 또는 세포 핵의 재프로그래밍 및 재프로그래밍된 세포 및 세포의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 분화 세포를 재프로그래밍하여 배아 간 세포성 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다.
배아 간 세포는 이들이 유도되는 조직에서 어느 다른 세포 타입을 생성할 수 있는 만능 간 세포이다. 만능 세포는 세가지 모든 배아 조직층으로 발달될 수 있으며, 차례로 모든 신체 조직의 세포를 형성할 수 있는 능력을 가지며, 신체의 어느 및 모든 세포와 조직을 형성할 수 있는 간 세포를 설명하는데 사용된다. 이는 배체 외막 및 조직, 배아, 및 모든 후배기의 조직 및 기관으로 분화하는 능력을 갖는 분화 전능성 세포와는 미세하게 다르다.
분화 세포는 기관내에 체조직을 형성하는 세포이며, 일반적인 생체내 환경하에 존재하며, 일반적으로 이들의 발달 포텐셜에 있어 제한이 있는 것으로 간주된다. 분화 세포는 최종적으로 분화되거나, 즉 특정 세포 타입으로 발달상 정지되거 나(예, 뉴런, 미오사이트 및 골세포), 또는 특정 계통에 있는 제한된 수의 다른 세포 타입으로(예, 호염기성 세포, 호산 백혈구, 및 호중성 백혈구를 포함하는 다양한 면역 세포를 생성할 수 있는 골수성 전구세포) 일어날 수 있는 포텐셜을 보유할 수 있다.
포유류, 및 특히 사람, 배아 간 세포는 다수의 인체 질병 또는 컨디션의 치료 및/또는 예방을 위한 포텐셜을 제공한다. 특히, 배아 간 세포는 우수한 치료 가치가 있는 세포와 같은 넓은 범위의 사람 세포 타입을 생성하기 위한 수단을 제공한다. 그러나, 선진국에서 포유류, 특히 사람 배아 간 세포를 획득하고 사용하는데 있어 윤리적 및 실행적인 문제가 있다.
배아 간 세포는 전체 기관이 유도되는 세포 집단인 내부세포괴(ICM)로 알려진 배아내의 전분화능 세포 집단으로부터 일반적으로 유도된다. 상기 ICM은 발달 초기에 일어나며, 전형적으로 수정후 3 내지 5일에 일어나며, 이는 해당 종에 따라 달라진다. 클로닝 방법을 이용하여 주어진 종의 어느 개체로부터 배아를 생성하는 것이 가능하다. 전형적으로, 현재의 클로닝 방법으로 핵 이식으로 알려진 공정으로 포유류 분화 세포의 핵을 일반적으로 동일한 종의 핵이 제거된 포유류 난모세포에 이식한다(Campbell et al., 2005, Reprod Dom Anim 40:256-268).
핵 이식은 수행하기가 어려운 것으로 알려져 있으며 낮은 성공률을 갖는 다(Campbell et al., 2005, Reprod Dom Anim 40:256-268). 성공시, 이식된 핵 DNA는 수용자 난모세포에 의해 재프로그래밍되며, 그 다음 상기 난모세포는 배아를 형성하기 위해 수정 효과를 모방함으로써 자극될 수 있다.
일반적으로 난모 세포는 유사 분열로 자극되며 상실배 또는 배반포 단계에서 '양(foster)' 모의 자궁내로 이식된다. 이 방법은 매우 낮은 성공율을 가지며 매우 적은 수의 생육가능한 배아를 생성한다. 배아가 형성되는 경우에, 상기 ICM은 다른 적용에 사용될 수 있는 배아 간 세포를 제공하기 위해 분리될 수 있다.
이러한 프로세스가 사람, 또는 포유류에 적용되는 경우에, 배아는 치료학적 클로닝으로 간주되며, 실행적 및 윤리적 고려를 가진다. 실행적인 면에서, 배아 간 세포를 획득하는 것은 여성으로부터 난자의 기능을 요구하며, 이는 포유류 난자가 회수하기에 비용적이며 한 여성으로부터 매우 적은 수의 난자가 획득될 수 있기때문에 제한된다. 윤리적인 면에서, 특히 사람과 관련하여, 예를 들어, 생성된 배아가 배아 간 세포의 기증자로만 제공되는 치료적 클로닝에서와 같이 다른 프로세스에서 중간체로서의 배아 생성에 대한 광범위한 결함이 있다.
따라서, 치료 방법에 사용될 수 있으나 클로닝 방법 없이, 특히 단순히 배아 간 세포를 제공하기 위해 배아를 생성하는 포유류 난모세포를 이용하지 않고 획득될 수 있는 만능 배아 간 세포성 세포를 개발할 필요가 있다.
분화 세포의 핵은 분화 세포를 이용한 클로닝 실험으로부터 생육가능한 수정 동물의 생산에 의해 만능 상태로 성공적으로 재프로그래밍되었다(Wilmut et al(1997) Nature 385:810-813; Polejaeva et al(2000) Nature 407:86-90). 이러한 방법은 매우 낮은 효율 및 성공율을 갖는다. 이러한 방법에서 분화된 핵은 핵 제거된 포유류 난모세포내로 이식되고, 배아 생성을 통해 상기 세포로의 전분화능성을 제공하는 세포 핵에서 유전자를 재활성화하는 포유류 난모세포내의 인자들에 노출됨으로써 전분화능성으로 재프로그래밍되었다. 이러한 경우에, 모든 조작은 관심있는 세포와 동일한 종의 물질을 이용하여 수행되었다.
세포에서 전분화능성은 다수의 마커 유전자의 발현에 대해 관찰함으로써 확인될 수 있다. 사람에서 이러한 유전자는 POU5F1(전사 인자 Oct-4를 암호함), NANOG, Rex-1, Sox-2 및 Tert를 포함한다(Ginis et al., 2004 Biol 269:Pages 360-380). 숙련자는 이러한 정황으로부터 POU5(Oct-4) 및 NANOG, 또는 어느 다른 유전자나 단백질이 언급되어질 어느 유전자 또는 유전자 산물을 칭하는지 이해할 것이다.
Oct-4는 배아 간 세포를 포함하는 만능 세포에서 일반적으로 발견 및 발현되나 일반 분화 세포에서는 발현되지 않는 전사 인자이다. Oct-4의 활성화는 전분화능성과 닮은 상태로 재프로그래밍되는 세포와 일치된다. Oct-4의 실험적 제거는 배 아에서 ICM의 완전 부재를 일으키며, 배아 간 세포에서 미분화 표현형의 손실을 일으킨다(Nichols et al(1998) Cell. 95:379-391).
nanog는 만능 세포에서 발견되는 다른 전사 인자이다. nanog 발현의 부재시 배아 간 세포는 이들의 전분화능을 잃는다(Chambers(2004) Cloning Stem Cell 6:386-391).
간 세포 분야의 실행적 및 윤리적 문제 모두를 극복하기 위해 전체 배아의 생성없이 배아 간 세포 또는 배아 간 세포를 닮은 세포(소위 배아 간 세포성 세포)를 생성하는 방법이 요구된다. 따라서, 본 발명은 예를 들어, 포유류의 분화 세포와 같은 분화 세포 및/또는 이들의 핵의 발달 포텐셜을 재프로그래밍과 같이 알려진 프로세스로 배아 간 세포와 유사한 보다 전분화능성 상태로 리디렉팅하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 1 견지로, 분화 세포, 또는 분화 세포의 핵을 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아로부터 유도된 세포 또는 이의 세포 추출물에 노출시키는 것을 포함하며, 상기 냉혈 척추동물은 하기 특성
(i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
(ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
(iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
중 하나 이상을 갖는 재프로그래밍된 세포 또는 재프로그래밍된 세포 핵을 생성하는 방법이 제공된다.
바람직하게 상기 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포는 고 보존 형태로 Oct-4 및 nanog 모두를 발현한다.
택일적으로 상기 방법은 분화 세포를 냉혈 척추동물의 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아, 또는 이의 추출물에 노출시키는 것을 포함하며, 상기 냉혈 척추동물은 하기 특성
(i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
(ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
(iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
중 하나 이상을 갖는, 분화 세포를 nanog를 발현하도록 그리고/또는 Oct-4를 발현하도록 그리고 전분화능성이 되도록 재프로그래밍하는 방법으로 기술될 수 있다.
바람직하게 상기 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포는 고 보존 형태로 Oct-4 및 nanog 모두를 발현한다.
또한 택일적으로 상기 방법은 본 발명이 분화 세포, 또는 분화 세포의 핵을 냉혈 척추동물의 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아, 또는 이의 추출물과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 냉혈 척추동물은 하기 특성
(i) 원시 척추동물 체제(body plan)
(ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
(iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
중 하나 이상을 갖는, 배아 간 세포성 세포를 생성하는 방법, 또는 재프로그래밍된 세포 핵을 생성하는 방법을 제공하는 것으로 기술될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 이의 정상적 분화 기능이 제거되거나 변환된 세포이다. 재프로그래밍된 세포 핵은 정상 분화 기능이 제거되거나 변환된 핵이다.
분화 세포는 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특정 기능을 갖는 특정 세포 타입으로 발달된 세포이다. 정상 환경하에서 이들 세포는 일반적으로 다른 세포 타입으로 발달되지 못한다. 본 발명의 정황상 재분화 세포는 일 특정 세포 타입을 가지며, 본 발명의 방법을 이용하여 조작되어 간 세포를 형성하며, 후속적으로 다시 분화 세포로 전환된 세포이다. 재분화 세포는 이의 본래 분화시와 동일한 타입 또는 다른 타입의 세포일 수 있다.
원시 척추동물 체제
기관이 원시 척추동물 체제를 갖는지 여부는 이들의 골격 구조와 관련된 두 특정 기준중 하나 또는 모두를 고려하여 정해진다. 첫번째 기준은 리브 구조에 관련되며 두번째 기준은 골반 뼈에 관련된다. 원시 어류 및 원시 양서류는 유사한 골격 구조를 가지며, 이는 소위 "파생" 골격(무미류(개구리) 골격; 경골 어류 골격)을 갖는 기관의 골격 구조와 현저히 상반된다.
폐어 또는 도롱뇽과 같은 원시 척추동물 체제를 갖는 기관은 척추 후면에 퍼지는 리브를 갖는다. 이는 포유류에서 리브 케이지가 일어나는 척추동물 골격의 초기 조건이다. 파생 체제를 갖는 경골 어류와 같은 기관에서와 상반적으로, 리브는 후면으로가 아닌 등배적으로 퍼진다. 이러한 차이는 원시 척추동물 체제를 갖는 어류가 이를 갖지 않는 것과 구별되도록 한다.
리브를 고려하여 택일적으로, 원시 척추동물 체제를 갖는 기관은 또한 골반 뼈를 고려하여 확인될 수 있다. 원시 척추동물 체제에서 부속지는 골반 뼈에서 골격의 배부로 확장된다. 경골어류의 골격에서 골반 뼈는 어류 몸의 대략 중간 지점에 골반 핀에 위치하거나 머리 부근에 상기 지점의 전방에 위치하는, 견대(pectoral girdle) 부근 또는 인접하거나 심지어 융합된 상당히 전방에 위치한 곳에서 발견된다. 도롱뇽(아흘로틀)으로 예시되는 원시 양서류 골격은 골격의 후반부에 결합된 골반 뼈를 보유한다. 반대로 개구리는 고 파생된 그리고 연장된 요대를 갖는다. 또한 개구리는 요대 전방에 상당히 감소된 수의 척추를 갖는다.
도 5는 어류 및 양서류에서 원시 척추동물 체제의 보유를 나타낸다. 원시 어류와 원시 양서류간의 골격 구조 유사성은 파생 골격과 비교한 구조적 차이로 알 수 있는 바와 같이 분명히 보여질 수 있다. 상기 도면은 파생 척추동물 체제를 대표하는 전형적인 경골어류 골격과 원시 척추동물 체제를 대표하는 폐어의 골격을 비교한다. 이는 또한 도롱뇽(아흘로틀)과 개구리(제노프스 라에비스(Xenopus laevis))의 골격을 비교한다.
폐어 골격은 (등 부위로부터) 후면도로 나타내어진다. 중요하게 경골어류는 측면도를 나타내며, 이는 척수 돌기/리브가 측면이 아닌 등배로 퍼짐을 나타낸다. 양서류는 모두 후면도이다. 어류에서 작은 화살표는 페어에서 척추로부터 측면으로 퍼지는 뼈/리브를 가리킨다. 이는 리브 케이지가 일어나는 척추동물 골격의 원시적 조건이다. 경골어류 리브는 측면이 아닌 등배로 퍼진다. 이는 경골어류 이노베이션이다. 지느러미를 지지하는 등 및 배 척수 돌기가 또한 경골어류 이노베이션이다. 원시 어류는 4개의 돌출부를 가지며, 이는 4다리를 가진 육상 동물인 4지 동물로 진화하였다. 중요하게 큰 화살표는 원시 어류 및 원시 양서류에서 골반 뼈를 가리킨다. 이는 경골어류에서 소실된 바와 같이 원시 어류를 정의하는 특징이다. 원시 척추동물 체제는 Johnson et al(2003) Evolution and Development 5:4, 414-431에 보다 상세히 기재되어 있다.
철갑상어, 거북이, 폐어 및 포유류는 모두 장배 형성 이동으로 정의되는 바와 같이 유사한 발생을 공유한다.
따라서, 원시 척추동물 체제는 예를 들어, X-선상으로 리브 및/또는 척수 돌기의 측면 돌기 유무 및 등배 돌기의 유무에 의해 확인될 수 있다. 택일적인 골격 확인은 어류에서 골반 뼈를 확인하는 것이다.
생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포
여성에서 생식 세포는 난모 세포 또는 난모 세포의 전구 세포를 칭한다.
난모 세포는 난소에서 그리고 난자가 배란된 후의 여성 생식 세포를 정의하는 경우의 여성 생식 세포로 정의한다.
생식세포질은 난자, 난모세포 또는 일부 유기체의 배아에서 발견되는 세포질 부위이며, 생식 세포 계열로 일어날 결정자를 함유한다. 생식세포질이 없는 동물에서, 이와 동일한 분자는 난자 세포질 및 아마도 GV(germinal vesicle)를 통해 분배된다. nanos, vasa 및 dazl 유전자의 산물과 같은 이러한 분자는 전형적으로 RNA 바인딩 단백질, 또는 이를 암호하는 전령 RNAs이며, 이들이 배아 간 세포에서 발견되기 때문에 전분화능성 재프로그래밍 프로세스에 연루되는 경향이 있다. 생식세포질을 함유한 유기체에서 이러한 분자들은 국소화되고, 이에 따라 아마도 낮은 풍부성을 보이며 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아, 또는 이의 추출물에서 무익하며, 따라서 분화 세포를 재프로그래밍하기에 부적합한 생식세포질을 갖는 유기체를 형성하는 것으로 간주된다.
바람직하게, 본 발명과 관련하여, 원시 척추동물 체제를 갖는 냉혈 척추동물이 또한 생식세포질을 함유하지 않는 난모세포/난자(생식 세포)를 갖는다. 생식 세포질의 유무는 특정 유기체가 어떻게 발달하였는지 설명한다. 실제로 유기체의 체제를 관찰함으로써 그 유기체 안에 존재하는 난모세포/난자가 생식 세포질을 갖게 될 것인지 예측할 수 있다. 특히 바디 트렁크의 배면 끝을 정의하는 후방의 돌출부가 결정적이다. 생식 세포질의 부재하에서 생식 세포는 골반 뼈로 정의되는 척추 위치에서 포스테리아-레터럴 중배엽으로부터 유도되며, 이들은 배아의 이러한 배면부를 제외한 세포외 신호에 반응하여 형성된다. 이러한 세포는 후에 난모세포로 발달된다. 생식 세포질의 존재하에서 생식 세포는 보다 전방의 위치에서 발달하며 그 결과 유기체는 상대적으로 전방 성체 모폴로지를 갖는다. 생식 세포질을 갖는 유기체의 난모세포, 난자, 난소 및 초기 배아는 생식 세포질이 없는 경우와 비교하여 세포 및 핵 재프로그래밍에 있어 덜 효율적이다.
원시 척추동물 체제를 나타내는 유기체는 이들의 생식 세포내에 생식 세포질을 갖지 않는 것으로 이해된다. 원시 척추동물 체제의 보유는 생식 세포질 부재의 결과인 것으로 여겨진다.
난모세포/난자가 생식 세포질을 함유하는 동물을 확인할 목적으로, 바디 트렁크의 배면 끝을 정의하는 후방의 돌출부가 결정적이다. 생식 세포질의 부재하에서 생식 세포는 골반 뼈로 정의되는 척추 위치에서 포스테리아-레터럴 중배엽으로부터 유도된다. 난자가 생식 세포질을 함유하는 동물은 세포외 신호로부터가 아니라 세포가 난자에 의해 공급된 물질로 특정화됨에 따라 생식 세포를 생성하는데 필요한 세포외 배면 신호를 요구하지 않는다. 따라서, 개구리 및 경골 어류와 같은 생식 세포질을 함유하는 대부분의 동물에서, 상기 동물들은 상대적으로 전방 성체 모폴로지를 갖는다. 이러한 동물의 난모세포 및 난자는 재프로그래밍에 유용하지 않다.
포유류 이노베이션인 것으로 간주되었던, 포유류에서 생식 세포질의 부재는 원시 발생학적 특성을 보유하는 특정 계열의 종에 걸쳐 보존적인 것으로 나타났으며, 이는 결과적으로 이러한 계열의 동물에서 원시 척추동물 체제의 보유를 형성한다. 배아가 원시적 특성을 보유하며, 원시적 성체 척추동물 형태를 보유하는 포유류 및 냉혈 척추동물 종의 배아에서, PGCs로 알려진 생식선(정자 및 난자)으로 발생할 수 있는 간 세포는 발달 초기에 발생하는 전분화능 전구체로부터 유도된다. 반면에, 대부분의 실험에서, 제노프스(Xenopus) 또는 제브라피쉬(경골어류)와 같은 비-포유류 유기체에서 PGCs는 포유류와 완전히 다른 메카니즘에 의해 형성되며, 포유류의 전분화능 전구체와 상당하는 것은 결코 형성되지 않는다. 제노프스(Xenopus) 또는 제브라피쉬에서 생식 세포는 생식 세포 결정인자를 함유하는 생식 세포질의 불균일한 분포에 의해 체세포로부터 매우 초기에 분리된다. 그 다음 상기 생식 세포질을 물려받는 세포는 PGCs가 되고 체세포로 되지 않는다.
도 7은 다수의 다른 유기체의 난모세포에서 생식 세포질 분포를 나타낸다. 제노프스(Xenopus) 난모세포에서 Xdazl 및 Xcat2를 암호하는 RNAs가 나타나며, vasa를 암호하는 RNA가 폐어 난모세포에서 나타난다. dazl 및 vasa를 암호하는 RNA는 철갑상어 난모세포에서 나타난다. 난모세포의 부분이 이들 분자에 특이적인 프로브와 반응하였으며, 상기 프로브는 표준 방법에 의해 알칼린 포스파타아제 접합 항체 및 색 검출을 이용하여 검출되었다. Xdazi 및 Xcat2 RNAs는 세포질내에 국소화되며, 생식 세포질의 표지이다. 폐어 난모세포에서 Vasa RNA 및 철갑상어 난모세포에서 vasa 및 dazl RNA는 균일하게 분포하며 생식 세포질 부재의 표지이다.
포유류에서 PGCs를 생성하는 메카니즘은 일부 하등 동물에서 하지만, 특정 기준에 부합하는 종들에서만 존재하는 것으로 현재 여겨진다. 이러한 종들은 이들의 체제를 기준으로 확인될 수 있다. 아흘로틀(미국·멕시코산 도롱뇽)과 같이 기준에 부합하는 종들은 포유류와 유사한 PGC 발달을 가지며, Oct-4 및 nanog를 암호하는 유전자와 같이 생식 세포 발달을 제어하는 유사한 유전자 컴플리먼트를 가지며, 이에 따라 분화 세포를, 특히 포유류 분화 세포를 재프로그래밍할 수 있다. 따라서 상기 언급한 기준에 부합하는 특정 종의 난모세포는 아흘로틀과 동등한 재프로그래밍 포텐셜을 가질 것이다. 이러한 기준에 부합하지 않는 종들은 보존된 전분화능 유전자의 동일한 컴플리먼트를 갖지 않을 것이며, 따라서 동등한 재프로그래밍 능력을 갖지 않을 것이다. 상기 기준에 부합하는 종들은 생식 세포질의 부재하의 결과인 것으로 여겨지는 원시 척추동물 체제를 갖는다. 중요하게, Oct-4 및 nanog는 생식 세포질의 부재하에서 PGCs를 생성하는데 요구되기 때문에, Oct-4 및 nanog의 보유는 생식 세포질을 갖지 않는 것의 결과인 것으로 여겨진다. 성체는 이들의 발생 산물이다. 따라서, 성체 체제는 그 발생이 보존적이기 때문에 보존적이다. 개구리 및 경골어류에서 보여지는 주요 변화들을 억제하는 발생을 강요하는 것은 생식 세포를 생성하는 메카니즘이다. 생식 세포질이 없는 동물에서 PGCs는 보다 중요치 않은 존재이며, 만일 이들의 생성에 필요한 신고가 변환되는 경우 발생학적 세포 이동시 주요 변화로 일어날 수 있는 것과 같이 이들은 소멸될 수 있다. 만일 생식 세포질이 존재하는 경우, PGCs는 무엇이든 형성되기 때문에 이러한 신호의 변화에 순종적이다. 따라서, 발생시 구속이 없으며, 배아의 세포 이동이 변하며, 이는 생식 세포질을 함유한 동물이 원시 체제로부터 변환된 형태를 가질 수 있는 이유인 것이다. 생식 세포질이 없다면 이는 일어날 수 없다. 철갑상어, 거북이, 폐어 및 포유류 모두 장배형성 이동으로 정의되는 유사한 발생을 공유한다.
Oct -5 및/또는 nanog 의 발현
바람직하게 원시 척추동물 체제를 보유하는 냉혈 척추동물 또한 Oct-4 및/또는 nonog를 발효하는 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포를 갖는다.
Oct-4 및/또는 Nanog 발현은 상기 단백질을 암호하는 mRNA 또는 상기 단백질 상물 자체를 어세이함으로써 검출될 수 있다. 이를 수행하기 위한 어세이 방법의 예는 Makin et al. technique 2p 295-301(1990)에 기술된 mRNA 어세이 방법 또는 단백질 산물에 대한 항체 어세이 방법을 포함한다.
난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포에서 Oct-4 및/또는 nanog가 고 보전적으로 간주되기 위해서는 각각 사람 전사 인자 Oct-4 또는 사람 nanog 단백질의 DNA 바인딩 도메인(DBD)와 적어도 69% 아미노산 동일성을 공유해야 한다. 아흘로틀 Oct-4 단백질, AxOct-4의 경우에, 73%의 아미노산이 마우스 Oct-4 DBD와 일치하며, 75%가 사람 Oct-4 DBD와 일치한다. 각각 분화 세포를 재프로그래밍하는 능력을 제공하지 못하는 유전자 ZPOU-2 및 XLPOU91에 의해 암호화되는 제브라피쉬 및 제노프스와 가장 가까운 단백질은 필요한 69% 동일성보다 작은 63% 동일성을 갖는다. 기능적으로 동등한 Oct-4 유전자의 확인 및 활성은 실시예에 기술된 바와 같이 당업자에게 알려진 표준 방법을 이용하여 시험될 수 있다.
바람직하게 상기 사람 Oct-4 DBD와 냉혈 척추동물의 Oct-4 DBD간에 대한 아미노산 동일성은 아미노산 잔기의 극성 또는 전하를 변환시키지 않는 아미노산의 보존적 변화를 이끈다. 보존적 변화의 예는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 잔기에 있어서 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌과 같은 소수성 잔기의 치환, 또는 아르기닌이 리신으로 변환하는 극성 잔기의 치환을 포함한다. 바람직하게, 두 단백질 서열간의 아미노산 동일성 조사시 보존적 아미노산 변화는 동일한 아미노산인 것으로 간주된다. 따라서, 아미노산 서열의 보존적 아미노산 변화는 두 서열간의 아미노산 동일성 퍼센트에 영향을 미치지 않을 것이다.
상기 언급한 사항을 더욱 뒷받침하기 위해, 여러 가지 종에서 Oct-4를 암호하는 유전자가 비교되었으며, 확인된 형태학적 특징을 공유하는 것들은 형태학적 특징이 결여된 종보다 근접하게 관련된 Oct-4 암호 유전자를 갖는 것으로 나타났다. 이러한 실험에서 상기 Oct-4 암호 유전자는 newt(노토프탈머스 비리덴스(Notopthalmus viridens)), 걸프 철갑상어(아시퍼세르 옥시르힌커스(Asciperser oxyhynchus)), 아프리카 폐어(프로톱테러스 아넥탄(Protopterus annectans)) 및 레드 어드 슬라이더(거북이, 티.스크립타(T. scripta))로부터 분리되었으며, 이들 모두 원시 형태학 기준을 만족한다. 도 6에서, 이들 종으로부터 분리된 Oct-4 암호 관련 유전자의 DNA 서열을 공중 데이타베이스의 일부인 다른 종으로부터 분리된 가장 근접하게 관련된 서열과 비교하였으며, Oct-4 암호 유전자의 진화사를 추적하기 위해 설계된 유사 계통발생학적 계도를 도시하였다. 정상적 환경하에서 유전자 서열 진화는 동물의 진화 관련성(즉, 종 계통 발생론)을 추적한다. 따라서, 관련 유전자의 어느 서열은 이들이 진화적으로 보다 거리가 먼 어류, 파충류 또는 포유류와 같은 다른 종들과 동등한 유전자라기 보다는, 공통 양서류 시조로부터 이들의 보다 최근 개도로 인해 도롱뇽(아흘로틀 및 영원(newt)) 및 개구리(제노프스(Xenopus), 두꺼비(Bufo), 라나(rana))와 보다 유사한 것으로 예측될 수 있다. 포유류 및 양서류와 같은 고등 종에 비하여 모든 어류에 대해 동일한 논리가 적용된다. 그러나, 통상적인 계통 발생학적 예측과 상반적으로 도 6의 분석은 도롱뇽(즉, 아흘로틀), 영원(newt), 철갑상어, 폐어 및 거북이는 모두 마우스의 Oct-4 유전자 및 사람 Oct-4 유전자와 고 관련된 유전자를 함유하며, 이와 균등한 유전자는 이들의 가장 가깝게 관련된 자매 그룹들, 즉, 개구리, 제브라피쉬 등에서는 발견되지 않는다. 도 6에 나타낸 유전자 서열 관계는 과학사회에서 자명하지 않으며 어느 통상적인 진화 견지상으로 예측되지 않는 것이다.
아흘로틀(도롱뇽 종 앰비스토마 멕시카넘(Ambystoma mexicanum))에서 Oct-4 유전자(Axoct-4)는 데이타베이스상 Oct-4와 관련된 제노프스(Xenopus)의 여러 유전자를 포함하는 어느 다른 유전자보다 포유류 Oct-4 유전자와 보다 높게 관련되며, 일부 경우에 상기 아흘로틀 Oct-4 유전자보다 우수한 XLPOU91과 같이 ES 세포를 구할 수 있다(Morrison and Brickman, 2006). (도 8은 아흘로틀과 마우수 서열의 비교를 나타낸다.). 이 결과는 Axoct-4 유전자가 포유류 Oct-4 유전자의 진정한 오르소로그(ortholog)(즉, 기원 및 기능적으로 관련된 유전자)임을 제시한다(즉 이는 또한 발현 패턴에 의해 뒷받침된다(Bachvarova et al(2004) Developmental Dynamics 231:871-880)). 보다 많은 수의 제노프스 유전자들은 Axoct-4에 보다 유사한 조상적(ancestral) Oct-4 서열의 복제 및 후속적인 하위기능화 메카니즘으로 형성된다(Prince and Pickett, 2002; Nat Rev. Genet.: 3; 827-37). 이 결과는 상기 아흘로틀 난모세포가 진정한 Oct-4 오르소로그를 함유하지 않는 제노프스의 난모세포보다 포유류의 난모세포와 생화학적으로 보다 유사함을 제시한다.
포유류에서, Oct-4는 PGCs를 생성하기위해 필요하다. 제노프스의 경우에는 그렇지 않으며, 이는 어느 Oct-4 등가의 유전자가 포유류 Oct-4의 진정한 오르소로그가 아님을 의미한다. 아흘로틀에서 Oct-4의 발현 패턴 및 메카니즘 호몰로지는 Oct-4가 PGCs를 생성하기 위해 필요함을 이제 제시한다. 이러한 관찰은 아흘로틀 난모세포가 제노프스 세포보다 포유류 분화 세포를 전분화능성으로 재프로그래밍하는데 보다 우수한 능력을 가지며, 재프로그래밍 능력에 있어 보다 포유류 난모세포처럼 행동하는 이유를 설명한다. 또한, 생식 세포질의 부재가 역시 이러한 난모세포/난자가 보다 포유류와 유사해지도록 하기 때문에, 이는 제노프스에 비해 보다 우수한 아흘로틀 재프로그래밍 능력에 연루되는 경향이 있다. 생식 세포질의 부재는 모두 생식 세포질과 관련된 RNA 바인딩 단백질인 Nanos, vasa 및 dazl과 같은 다른 인자들이 보다 재프로그래밍에 성공적이도록 한다.
Oct-4 유전자를 갖는 아흘로틀이 개구리의 Oct-4 유전자보다 포유류 Oct-4 유전자와 보다 근접하게 관련됨을 입증한다면, 포유류 Oct-4 유전자와 보다 근접하게 관련된 Oct-4 유전자를 갖는 다른 유기체가 또한 포유류 분화 세포를 재프로그래밍할 수 있을 것으로 이해된다. 또한, Axoct-4의 발현 패턴은 초기 포유류 배아와 동등하다. 따라서 철갑상어 및 폐어, 다른 도롱뇽, 및 "원시 어류"는 모두 아흘로틀과 동등한 재프로그래밍 능력을 가질 것이며, 제노프스, 다른 개구리 또는 경골어류보다 상당히 보다 우수한 재프로그래밍 능력을 가질 것이다.
바람직하게 재프로그래밍된 세포는 배아 간 세포성 세포이다.
용어 "배아 간 세포성 세포"는 재프로그래밍되어 배아 간 세포의 특성을 나타내는 분화 세포 또는 배아 간 세포의 특성을 나타내는 재프로그래밍된 분화 핵을 함유하는 세포를 지칭하는 것으로 사용된다. 배아 간 세포성 세포는 이에 한정하는 것은 아니나 다음 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 탈분화 또는 재프로그래밍되기전에 세포에서 이와 동일한 파라미터와 비교하여, 형질 변환없는 증식; 연속적 증식; 자가 재생 및 광범위한 조직을 생성하는 능력; 본래의 분화 세포와 동일하거나 다른 세포 타입으로 분화하는 능력(전분화능).
바람직하게, 재프로그래밍된 세포, 및/또는 재프로그래밍된 세포 핵은 Oct-4를 발현한다. 택일적으로 재프로그래밍된 세포, 또는 재프로그래밍된 세포 핵은 nonog만을 발현한다. 재프로그래밍된 세포 또는 또는 재프로그래밍된 세포 핵은 또한 전분화능성일 수 있다.
통상적으로 본 발명의 어느 방법에 따라 생성된 재프로그래밍된 세포, 및/또는 재프로그래밍된 세포 핵은 Oct-4 및 nanog 및/또는 전분화능의 다른 마커들을 발현할 수 있다. 전분화능의 다른 마커들은 Sox-2, Rex-1, 및 TERT를 포함한다.
세포가 전분화능성인지 여부는 세포가 자극되어 이로부터 유도되는 유기체내 대부분의 어느 세포타입으로 분화할 수 있는 전분화능 특성의 존재에 의해 확인될 수 있다. 전분화능 세포의 분화는 전분화능 세포를 프로제니터 배지 및/또는 특정 성장인자에 노출하여 유도될 수 있다(Lanza, 2004. Handbook of Stem Cells: Embryonic/Adult and Foetal Stem Cells).
바람직하게 냉혈 척추동물 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 세포 추출물에서 Oct-4 및/또는 nanog는 사람에 비해 고 보존적이며, 이는 냉혈 척추동물에서 Oct-4는 사람 전사 인자 Oct-4와 DNA 바인딩 도메인에 있어 적어도 69% 아미노산 동일성을 갖는다. 바람직하게 nanog 유전자의 경우 사람 nanog 단백질과 공유하는 호메오 도메인과 적어도 69% 및 가장 바람직하게 75% 동일성을 갖는다.
유익하게, 냉혈 척추동물 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포에서 Oct-4 및/또는 nanog는 사람 전사인자 Oct-4 또는 사람 nanog 단백질 각각의 DNA 바인딩 도메인(DBD)과 적어도 69% 아미노산 동일성을 갖는다.
아미노산 동일성은 ClustalW(Thompson et al. (1994) Nucl. Acids. Res., 22 p4673-4680) 또는 어느 택일적인 아미노산 서열 비교 툴을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 ClustalW 방법은 다음 파라미터로 사용될 수 있다:
페어와이즈 정렬 파라미터 - 방법: 어커레이트(accurate)
Matrix: PAM, 갭 오픈 페널티: 10.00, 갭 익스텐션 페널티: 0.10;
멀티플 정렬 파라미터 - Matrix: PAM, 갭 오픈 페널티: 10.00;
% 딜레이 아이덴티티: 30; 페널라이즈 및 갭: 온. 갭 분리 거리 0;
네거티브 매트릭스: 무, 갭 익스텐션 페널티: 0.20, 잔기 - 특이적 갭 페널티: 온, 소수성 갭 페널티: 온, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서의 서열 동일성은 단순히 유도화된 동일한 잔기를 포함하는 것으로 의된다.
택일적인 파라미터가 또한 적절할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 동일성은 또한 ClustalW(Thompson et al. (1994))를 사용하여 다음 파라미터를 이용하여 측정될 수 있다:
페어와이즈 정렬 파라미터 - 방법: 어커레이트(accurate)
Matrix: IUB, 갭 오픈 페널티: 15.00, 갭 익스텐션 페널티: 6.66;
멀티플 정렬 파라미터 - Matrix: IUB, 갭 오픈 페널티: 15.00;
% 딜레이 아이덴티티: 30; 네가티브 매트릭스: 무, 갭 익스텐션 페널티: 6.66, DNA 전이 웨이팅: 0.5.
택일적인 파라미터가 또한 적절할 수 있다.
바람직하게, 보존 Oct-4 및/또는 nanog를 암호하는 어느 뉴클레오타이드 서열은 (상기 언급한 시험에 따라) 사람 Oct-4 및/또는 nanog 서열 또는 0.1 x SSC, 65℃의 세정 조건하에서(여기서 SSC = 0.15 M NaCl, 0.015M 소디움 시트레이트, pH 7.2) 사람 Oct-4 및/또는 nanog와 기능적으로 동등한 단백질을 암호하는 사람 Oct-4 및/또는 nanog 서열과 하이브리드되는 서열과 예를 들어, 75%, 90% 또는 95% 동일성과 같이 69%이상의 동일성을 갖는다.
본 발명의 폴리펩타이드는 전장 및 프레그먼트 모두를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 어느 통상적 수단에 의해 제조될 수 있다.
기능적으로 동등한 단백질 또는 단백질 프레그먼트는 사람 Oct-4 및/또는 nanog와 적어도 69% 서열 동일성을 가지며 동일한 기능을 갖는 단백질 및/또는 프레그먼트를 칭한다. 이러한 기능은 본 명세서에 언급된 어느 방법에 의해 시험될 수 있다.
본 발명에 따른 "핵산 분자"는 단일 및 이중 가닥 DNA, RNA, cDNA를 포함한다. 기능적으로 동등한 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오타이드 서열의 유도체는 당해 기술분야에 잘 알려진 어느 통상적인 방법을 이용하여 획득될 수 있다.
모든 개구리, 모든 경골어류, 모든 조류 및 대다수의 파충류를 포함하는, 보존 Oct-4 유전자가 결여된 체제의 기준으로 예측되는 유기체 그룹은 원시 체제를 보유하며 Oct-4 유전자(양생류 양서류 포함) 및 nanog의 오르소로그를 암호하는 유전자를 보유하는 그룹보다 더 크다. 따라서 매우 소수 종의 난모세포, 난소, 난자 및 초기 배아, 또는 이의 추출물이 본 발명에 사용하기에 적절하다. 하기 계통이 보존된 척추동물 체제를 보유한다:
도롱뇽(아흘로틀 또는 노토프탈라머스)
거북이
도마뱀
악어류
하이퍼로트레티(먹장어);
하이퍼로아티아(칠성장어);
연골어류(상어, 가오리, 홍어, 키메라);
콘드로스테이(비커스, 철갑상어, 주걱철갑상어);
세미오노티포메스(가르스);
아미아목(아미아);
디프노이(폐어); 및
공극어아강(실러캔스).
따라서 상기 냉혈 척추동물은 양서류, 파충류 및 어류를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게 상기 냉혈 척추동물은 도롱뇽, 거북이, 도마뱀, 악어류, 하이퍼로트레티(먹장어); 하이퍼로아티아(칠성장어); 연골어류(상어, 가오리, 홍어, 키메라); 콘드로스테이(비커스, 철갑상어, 주걱철갑상어 등); 세미오노티포메스(가르스); 아미아목(아미아); 디프노이(폐어); 및 공극어아강(실러캔스)을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
가장 바람직하게 상기 냉혈 척추동물은 도롱뇽, 거북이, 폐어 및 철갑상어를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
편리하게 상기 냉혈 척추동물은 아흘로틀 또는 노토프탈라머스를 포함하는 도롱뇽이다.
도롱뇽에 택일적으로 상기 냉혈 척추동물은 철갑상어(학명: 아시펜서(Acipencer))이다.
언급된 다수 유기체들에서 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 이의 세포 추출물을 획득하는 것은 비교적 간단하며 그 물질은 풍부한 점에서 특히 잇점이 있다. 양서류, 및 경골어는 포유류 난자의 수천배 크기 체적의 난자를 가질 수 있으며 양적으로 예를 들어, 철갑상어(이로부터 캐비아가 획득됨)와 같은 포유류 난자 조직을 초과하며, 난자 세포에서 체중의 15-25%를 생산할 수 있다. 회수된 물질은 저장되고 필요에 따라 사용될 수 있다.
이와 상반적으로, 포유류 난모 세포, 난자, 난소 물질 및/또는 초기 배아는 진귀하며 얻기가 어려우며, 더욱이 상기 물질은 양적으로 매우 제한된다.
제노프스 라에비스(Xenopus laevis) 또는 어느 다른 개구리 또는 어느 경골어류의 난모 세포, 난자 또는 초기 배아 세포 및 세포 추출물은 본 발명의 어느 방법에 적절치 못하다. 개구리 및 경골어류(모두 냉혈 척추동물)는 원시 체제를 보유하지 않는 양서류 및 어류의 예이며, 이들의 난모세포는 생식 세포질을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 그리고 이들의 Oct-4 단백질은 사람 Oct-4 단백질에 비해 고 보존적이지 않다.
바람직하게 상기 난모 세포, 난자 또는 초기 배아 세포 추출물은 상기 난모 세포, 난자, 또는 초기 배아 세포의 핵 또는 배포(GV)의 물질을 포함한다.
상기 핵 및 GV는 특정 전사인자 Oct-4 및 Nanog를 함유한다.
개구리, sna, 경골어류에서 생식 세포질에 위치한 생식 세포 특이 RNA 바인딩 단백질을 암호하는 RNA, Dazl, VASA, 및 Nanos는 세포질에 균일하게 분포하며(Johnson et al., 2001, 243:402-415; Dev. Biol.; Bachvarova et al., Dev. Dyn. 231, 871-880), 생식 세포질을 갖는 생식 세포에서 전분화능 및 생식 세포 특이화를 유지할 수 있으나 세포를 재프로그래밍할 수 없다.
분화 세포를 본 발명에 따라 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 또는 초기 배아의 핵 또는 배포, 또는 이의 추출물에 노출하는 것은 막투과 분화 세포를 상기 난모 세포, 난자, 난소 세포 또는 초기 배아 세포내로 주입함으로써 또는 막투과 분화 세포를 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아의 추출물과 배양함으로써 달성될 수 있다.
바람직하게 상기 막투과 분화 세포는 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 배아, 또는 이의 추출물내의 인자들이 상기 세포내로 통과하고 이를 재프로그래밍하도록 하며, 바람직하게 상기 난모 세포, 난자, 난소 세포 또는 배아 세포의 미토콘드리아 또는 핵은 상기 막투과 세포내로 통과할 수 없으며 이에 따라 유전 물질의 변화는 없다. 분화 세포의 막투과는 세포를 Triton-X-100, 디지토닌 또는 사포닌으로 처리하는 것과 같이 당해 기술분야에 잘 알려진 어느 방법에 의해 달성될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따라 냉혈 척추동물과 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 배아, 또는 이의 추출물의 접촉 후, 재프로그래밍된 세포는 당해 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 현미경 슬라이드 또는 배양 디쉬상에서 원심분리에 의해 회수된다.
바람직하게, 분화 세포 핵을 재프로그래밍하기 위한 본 발명의 어느 방법으로, 분화 세포 핵은 잘 알려진 핵 전이 기술을 이용하여 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아와 접촉될 수 있으며, 이는 숙련자에게 쉽게 이해될 것이다(참조 상기 언급한 인용문헌). 이러한 기술은 분화된 핵을 핵이 제거된 난모 세포 또는 난자내로 주입하거나, 또는 분화 세포를 핵이 제거된 난모 세포 또는 난자와 융합하는 것을 포함한다.
세포 기초 작업은 재프로그래밍된 세포가 냉혈 척추동물 세포내에 완전히 함유되는 잇점을 갖는다.
텍일적으로, 상기 분화 세포 핵은 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아의 추출물과 함께 배양될 수 있다.
추출물의 사용은 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아내의 인자들이 분화 세포 또는 핵에 작용하여 재프로그래밍을 일으키기 위해 분화 세포 또는 핵을 손상되지 않은 본래의 난모 세포, 난자 또는 초기 배아내로 주입하는 필수적인 조작을 회피하는 잇점을 갖는다. 또한 추출물을 이용하는 경우 상기 물질을 리트리브(retrieve)하는 것을 용이하게 하며, 한 번에 수천 내지 수백만 세포 또는 핵이 재프로그래밍되도록 한다. 더욱이, 본 발명에 따른 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 및 초기 배아 추출물은 다량으로 생성될 수 있으며 편의상 지시에 따라 사용하기위해 저장될 수 있다.
바람직하게 전체 난소 추출물이 사용된다. 전체 난소 추출물을 사용함으로써 세포 성분들을 분리할 필요가 없으며, 이는 냉혈 척추동물의 일부 종으로는 불가능할지 모르는 것이다. 택일적으로, 추출물의 조 물질은 예를 들어, 0.2% 콜라게나아제 분해와 같은 통상적인 기술에 의해 난소 기질로부터 유리된 난모 세포일 수 있다.
분화 세포는 성숙 상태의 분화에 이른 세포를 칭한다. 전형적으로, 분화 세포는 주어진 세포에서 분화-관련 단백질을 암호하는 유전자의 발현으로 특성화된다. 예를 들어, 글리아 세포에서 미엘린 단백질의 발현 및 미엘린 쉬쓰의 형성은 말기 분화 글리아 세포의 전형적인 예이다. 분화된 세포는 더욱 분화할 수 없거나 단지 특정 세포 계열의 특정 세포로만 분화할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 어느 방법에 사용되는 분화 세포는 진핵 세포이다. 바람직하게 상기 분화 세포는 포유류로부터 획득된다. 가장 바람직하게 상기 세포는 사람의 것이다.
바람직하게, 본 발명의 어느 방법에서, 상기 분화 세포 또는 이의 핵은 약 5-30℃, 보다 바람직하게 약 5-21℃의 온도에서 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 이의 추출물에 노출된다. 보다 바람직하게, 상기 분화 세포 또는 핵은 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 배아 초기 세포 또는 이의 세포 추출물이 유도되는 유기체의 체온과 일치하는 온도에서 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 배아 초기 세포 또는 이의 추출물과 접촉된다. 숙련자에게는 인식되는 바와 같이, 냉혈 동물은 이들 자체의 체온을 갖지 않으며, 이들의 몸은 이들의 환경의 온도이다. 보다 바람직하게 상기 접촉 온도는 약 18℃이거나, 또는 냉혈 척추동물이 일반적으로 거주하는 환경의 온도이다.
바람직하게, 본 발명에 따라 재프로그래밍된 세포 핵은 전분화능의 마커인 유전자를 발현한다. 바람직하게 상기 전분화능 마커 유전자는 Oct-4 및 nanog를 암호하는 유전자를 포함한다. 상기 Oct-4 유전자는 Oct-4 프로모터의 디메틸화가 일어나는 경우에 마커로서 사용될 수 있다.
본 발명의 제 2 견지로, 본 발명의 제 1 견지의 방법에 따라 생성된 재프로그래밍된 세포가 제공된다. 바람직하게 상기 재프로그래밍된 세포는 배아 간 세포성 세포이다.
본 발명의 제 3 견지로, 본 발명의 제 1 견지의 방법에 따라 생성된 재프로그래밍된 세포 핵이 제공된다.
바람직하게, 상기 재프로그래밍된 세포 핵은 후속적으로 표준 공지 체세포 핵 이식(SCNT) 기술에 사용될 수 있다. 상기 SCNT 기술의 효능은 본 발명에 따라 분화된 세포를 일차 재프로그래밍하여 증가된다.
본 발명의 제 4 견지로,
(a) 본 발명의 제 1 견지에 기재된 재프로그래밍된 세포를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 재프로그래밍된 세포를 이로부터 유도되는 분화 세포와 동일한 타입, 또는 다른 타입의 분화 세포로 재분화시키는 단계
를 포함하는 재-분화 세포를 생성하는 방법이 제공된다.
바람직하게, 상기 재분화는 프로제니터 배지를 이용하여 이루어진다. 한 번 생성되면, 재프로그래밍된 분화 세포는 이들의 분화를 특정 세포 타입으로 유도하는 특정 성장인자 및 기타 신호전달 분자(프로제니터 배지)의 존재하에서 배양될 수 있다. 다른 프로제니터 배지는 다른 세포 타입을 생성하는데 요구된다.
본 발명의 방법은 전분화능 재프로그래밍된 세포가 다른 개체의 세포로부터 획득되도록 하며, 그 다음 이러한 재프로그래밍된 세포는 그 환자를 치료하는데 필요한 세포 타입으로 분화될 수 있다.
본 발명의 제 5 견지로, 본 발명의 제 4 견지의 방법에 따라 생성된 재분화 세포가 제공된다.
본 발명의 제 6 견지로, 다음 특성
(i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
(ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
(iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
중 하나 이상을 갖는 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아로부터 유도된 분리 세포 또는 세포 추출물이 제공된다.
바람직하게 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 상기 세포 추출물이 유도되는 세포는 고 보존 형태로 Oct-4 및 nanog를 발현한다.
바람직하게 상기 세포 및/또는 세포 추출물은 상기 난모 세포, 난자, 또는 초기 배아 세포의 핵 또는 배포(GV)의 물질을 포함한다.
본 발명의 제 7 견지로, 본 발명의 제 6 견지에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물 및 약학적으로 허용되는 캐리어, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 제 2 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포 및/또는 본 발명의 제 3 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 또는 본 발명의 제 5 견지에 정의된 재분화 세포, 및 약학적으로 허용되는 캐리어, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 적절한 약학 캐리어, 부형제, 및 희석제와 그리고 배합물이 실시예로 제공된다.
본 발명의 제 8 견지에 따라, 본 발명의 제 6 견지에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물의 유효량 및/또는 본 발명의 제 2 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포의 유효량 및/또는 본 발명의 제 3 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 또는 본 발명의 제 5 견지에 정의된 재분화 세포를 동물에 투여하는 것을 포함하는 세포의 대체 또는 재생이 요구되는 질병을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 9 견지에 따라, 본 발명의 제 6 견지에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물 및/또는 본 발명의 제 2 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포 및/또는 본 발명의 제 3 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 및/또는 본 발명의 제 5 견지에 정의된 재분화 세포의 의약으로서의 용도가 제공된다.
본 발명의 제 10 견지에 따라 본 발명의 제 6 견지에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물 및/또는 본 발명의 제 2 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포 및/또는 본 발명의 제 3 견지에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 및/또는 본 발명의 제 5 견지에 정의된 재분화 세포의 세포 대체 또는 재생이 요구되는 질병의 치료를 위한 의약 제조용 용도가 제공된다.
다른 세포/조직 타입은 다른 의학적 컨디션에 후속적인 사용을 위해 필요하다.
예를 들어, 조혈모세포가 백혈병으로 고통받는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 신경 전구세포가 알츠하이머 또는 파킨슨 병과 같은 신경퇴화 질환으로 고통받는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 피부 세포가 심한 화상 또는 흉터로 고통받는 환자의 경우에 이식을 위해 사용될 수 있다.
이식용 기관 및 조직의 재생을 위한 간 세포의 사용은 굳이 몇가지만 대자면, 당뇨병, 간 질환, 심장 질환 및 자가면역 질환에 대한 전도유망한 대체 치료법을 제공한다. 이식과 관련된 주요 문제는 기증자 부족 및 수용자의 면역 시스템과 이식된 조직의 잠재적 불일치성이다.
즉, 수용자에서 이식 조직의 면역거부는 외래적인 이식물로 판단된다. 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 배아 간 세포성 세포는 이식물이 요구되는 환자에서 유도될 수 있으며, 그 다음 동일한 환자에게 이식하기 위한 조직 또는 기관을 생성하는데 사용될 수 있다. 이는 조직 불일치성 및 면역거부의 어떠한 문제를 해소한다. 따라서 특히 이들이 환자와 유전학적으로 동일한 전분화능 배아 간 세포성 세포를 생성할 수 있게 되는 우수한 치료학적 포텐셜이 있다.
따라서 본 발명의 제 8, 제 9 및 제 10 견지에서 상기 질병은 신경학적 질병(파킨슨병, 알츠하이머병, 척수 손상, 뇌졸증), 피부 변질, 화상, 심장 질환, 당뇨병, 골 관절염 및 류마티즘성 관절염을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게 상기 질병은 신경학적 질병이며, 편의상 상기 질병은 파킨슨병, 알츠하이머병, 척수 손상, 뇌졸증을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 11 견지에 있어서,
다음 특성
(i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
(ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
(iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
중 하나 이상을 갖는 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아로부터 유도된 세포 또는 세포 추출물
및 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아, 또는 이의 추출물을 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 분화 세포를 재프로그래밍하거나 또는 분화 세포의 핵을 재프로그래밍하는 키트가 제공된다.
바람직하게 상기 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포는 고 보존형태로 Oct-4 및 nanog를 모두 발현한다.
임의로 상기 키트는 재프로그래밍되는 하나 이상의 다른 세포를 더 포함한다.
또한, 임의로 상기 키트는 상기 재프로그래밍된 세포의 재분화의 추가 단계가 이루어지도록 프로제니터 배지를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 12 견지로, 본 발명의 제 6 견지에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물에 클로닝하고자 하는 세포(들)를 노출시키는 것을 포함하는 세포 클로닝 증진 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 견지로, 상기 세포 및/또는 세포 추출물은 클로닝하고자 하는 세포가 노출되는 "프리-딥"의 형태로 사용된다. 본 발명의 세포 및/또는 세포 추출물은 세포를 클로닝하기에 필요한 기회 및 실험 작업을 향상시키기 위해 보다 전분화능성 상태로 클로닝하고자 하는 세포의 리버전(reversion)을 보조할 수 있다.
바람직한 구현
본 발명의 특정 바람직한 견지를 구현하는 예를 하기 도면을 참조하여 설명한다.
도 1 - 아흘로틀(PFFA) 또는 제노프스(Xenopus) 난모세포(PFFX)의 GV내로 주입된 배아 간 세포(ES), 막투과 태아 섬유아세포(PFF), 및 PFFs에서 β-액틴, nanog 및 Oct-4 유전자의 발현을 관찰하는 RT-PCT 실험 결과를 나타내며;
도 2 - Bordzilovskaya et al; 1989. Developmental stage series of axolotl embryos. In Developmental Biology of the Axolotl. (ed. J. B. Armstrong and G. M. Malacinski), pp. 210-219. New York: Oxford University Press. EC = Early Cleavage, LC = Late Cleavage 에서 정의된 40 발달 단계에 걸친 Axananog 발현 프로필;
도 3 - 아흘로틀 난소의 추출물에서 PFF의 배양은 메틸화 DNA의 양을 감소시킴을 나타낸다. 분화 세포는 미처리 또는 아흘로틀 난소(AxOvEx)로부터 준비된 추출물에 3시간(3h) 배양되었다. 세포를 메틸화 DNA에 대한 항체로 염색하였다;
도 4 - 아흘로틀 난소 추출물(AxOvEx)에서 PFF의 배양은 H3K9 염색을 제거함을 보여준다;
도 5 - 어류 및 양서류에서 진화적으로 보존된 원시 및 유도 성체 체제를 나 타내는 골격의 비교를 나타낸다. A. 정면으로 나타낸 폐어 골격. B. 측면으로 나타낸 경골어류. C. 정면으로 나타낸 도롱뇽(아흘로틀) 골격. D. 정면으로 나타낸 개구리(제노프스) 골격. 작은 화살표는 리브를 나타낸다. 큰 화살표는 골반 골격을 나타낸다;
도 6 - 클래스 V POU 도메인 전사 인자(Oct-4 성 유전자)의 계통발생학적 분석을 나타낸다. 유전자는 종의 난소로부터 분리되었으며, 파시모니에 의해 비교되어 가장 근접히 관련된 서열을 검출하였다. 동일한 집단내의 그룹은 가장 근접히 관련된다; 그리고
도 7 - 생식 세포질의 유무의 표지로서 냉혈 척추동물의 세포질내 생식 세포 특이 RNAs의 분포예를 나타낸다.
도 8 - Clustal-W를 이용한 마우스와 아흘로틀의 Oct-4 아미노산 배열.
도 9 - Clustal-W를 이용한 마우스, 랫트, 사람, 소, 개, 주머니쥐, 병아리 및 아흘로틀의 nanog 아미노산 배열.
도 10 - A - 포유류 세포의 주입후 2일에서 분리된 아흘로틀 생식 세포질 B - 사람 일차 섬유아세포로 주입된 난모세포가 상기 배양일에 수집되어 Actin, Nanog 및 Oct-4의 발현을 RT-PCR로 분석하였다.
도 11 - 분화 세포를 제노프스, 아흘로틀 및/또는 철갑상어에 노출 후 Nanog 및 β-액틴 발현을 나타내는 RT-PCR 겔.
도 12 - nanog 바인딩 사이트가 존재하는 리포터 유전자의 활성화.
도 13 - Clustal-W를 이용한 Oct-4 DNA 바인딩 도메인 서열 비교 - 고 보존 종.
도 14 - Clustal-W를 이용한 Oct-4 DNA 바인딩 도메인 서열 비교 - 고 보존 종 및 제노프스(XLPOU-60 및 XLPOU-91) 및 제브라피쉬(zPou2)와 같은 비관련종.
도 15 - 제노프스 및 제브라피쉬에서 비보존 Oct-4 등가물과 비교한 고 보존 Oct-4 유전자의 서열 동일성을 나타내는 표.
도 16 - 아흘로틀 난모세포 추출물(AOC)에서 배양된 세포에서의 DNA 메틸화는 5-메틸시토신에 대한 염색에 의해 평가되었다. 처리된 세포는 처리 1시간 및 3시간 후 FACS(형광성 활성화 세포 선별기)에 의해 선별되었다. 또한 프로세스가 에너지 의존적인지 나타내기위해 아피라아제(ATPase 인히비터)가 보충된 그룹이 포함 되었다. AP: 막투과 조절 후(after permeabilization control).
도 17 - 아흘로틀 난모세포 추출물에서 배양된 트리메틸화 히스톤 H3 리신 9(TriH3K9)은 특정 항체로 TriH3K9을 염색하여 평가되었다. 처리된 세포는 추출물에서 처리배양 1시간 및 3시간 후 FACS에 의해 선별되었다. 또한, 프로세스가 에너지 의존적인지 나타내기위해 아피라아제(ATPase 인히비터)가 보충된 그룹이 포함되었다. AP: 막투과 조절 후(after permeabilization control).
실시예 1 - 아흘로틀 난모세포의 분화 포유류 세포 재프로그래밍 능력
아흘로틀 난모세포의 분화 포유류 세포 재프로그래밍 능력을 입증하기 위해, 제노프스만 사용한 Byrne et al(2003) Curr Biol 15:13(14) 1206-13의 방법과 같은 방법을 이용하여 마우스 태아 섬유아세포를 직접 제노프스(PFFX) 및 아흘로틀(PFFA) 난모세포의 GV(배포)내로 주입하였다.
배양된 마우스 태아 섬유아세포는 Alberio et al(2005) Exp Cell Res. 307(1):131-41의 방법에 따라 순한 세제(디지토닌)로 처리하여 막투과되었다. 막투과되는 경우 GV의 분자들은 분화 세포 또는 PFF(permeabilised foetal fibroblast)내로 확산될 수 있다. GV 당 약 50 내지 200 PFF 세포가 주입되었으며, 주입된 난 모세포들은 21℃에서 밤새 배양되었다. 이 시기에 상기 GV를 난모세포로부터 절개하고 PFF가 함유된 것들을 더욱 관찰하였다. RNA는 상기 GV로부터 추출되었으며, PFF로부터 전분화능성 유전자의 발현을 지시하기 위해 cDNA로 역전사하고 PCR을 수행하였다. 보다 상세하게 nanog 및 Oct-4를 암호하는 유전자의 발현을 검출하기 위해 PCR이 사용되었다. β-액틴 수준이 컨트롤로서 검출되었다.
상술한 방법은 포유류 분화 세포에 의해 발현된 RNA를 농축하고 포유류 전사물을 검출하는데 있어 보다 우수한 민감성을 이룰 수 있는 점에서 기존 알려진 방법에 비해 잇점을 갖는다. 목적은 토탈 RNA의 매우 작은 분획인 포유류 RNA를 검출하는 것이기 때문에, GV의 단순 분리는 거대한 정제 단계를 제공하며 이에 따라 민감도를 향상시킨다.
결과
PFF 세포에서 Oct-4 및 nanog를 암호하는 전분화능성 마커 유전자의 발현을 검출하기 위해 RT-PCR이 수행되었다. β-액틴의 발현이 또한 컨트롤로 조사되었다. β-액틴은 모든 시기에 모든 세포에서 발현되며 어세이 방법의 효능을 확실히 하기 위해 파지티브 컨트롤로 제공된다. 도 1은 아가로즈겔상에 런닝시 RT-PCR 반응의 결과를 보여준다. 숙련자는 백색 밴드의 존재가 cDNA의 존재를 나타내며, 밴드의 강도는 cDNA의 표지(유전자 특이 산물)임을 알 것이다.
도 1에 사용된 약어는 다음과 같다:
ES - 마우스 배아 간 세포(Chemicon으로부터 이용가능함)
PFF - 마우스 막투과 태아 섬유아세포(Alberio et al(2005) Exp Cell Res. 307(1): 131-41의 방법에 따라 제조됨).
PFFA - 아흘로틀 난모세포 GVs에 주입된 PFF
PFFX - 제노프스 난모세포 GVs에 주입된 PFF.
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 조사된 모든 시료들은 β-액틴에 대한 유전자를 강하게 발현하며, 이는 각 처리 세포의 RNA는 RT-PCT에 의해 검출가능하며, 구성적인 고 수준 유전자 발현이 처리에 상관없이 세포로부터 검출가능함을 나타낸다. nanog를 암호하는 nanog 유전자 및 Oct-4를 암호하는 유전자는 ES 세포가 전분화능성이기 때문에 예측된 ES 세포에서 발현된다. Oct-4 및 nanog(전분화능의 마커)는 정상의 미처리 PFF 세포에서 발현되지 않으며 그 이유는 이들 세포는 전분화능성이 아닌 분화 섬유아세포이기 때문이다. PFF 세포가 아흘로틀 난모세포의 GV(PPFA)에서 밤새 배양된 경우, Oct-4 및 nanog의 발현이 검출되었다. PFF 세포가 제노프스 난모세포의 GV(PPFA)에서 배양된 경우, Oct-4 또는 nanog의 발현이 검출될 수 없었다. 제노프스 난모세포의 GV에서 PFF 세포를 2일 배양 후, 저 수준의 Oct-4 발현이 검출되었으나 여전히 nanog 발현이 검출되지 않았다(데이타로 나타내 지 않음). 2일 후 검출된 Oct-4 발현은 RT-PCR 어세이의 검출 성능의 거대 증가, 즉, 30 내지 60라운드의 복제 사이클 증가에 의해서만 관찰되었다. 각 추가 라운드의 PCR은 실제로 민감도를 두배 증가시키므로, 60 라운드로의 증가는 민감도에 있어 2 내지 30th 파워의 증가를 나타낸다. 증가된 민감도 조건하에서조차 nanog 발현을 검출할 수 없었다.
결론적으로, 아흘로틀 난모세포는 막투과 포유류 분화 세포와 접촉시 배양 18시간내에 Oct-4 및 nanog를 암호하는 전분화능성 마커 유전자의 강한 발현을 유도한다.
이는 수일 후에도 Oct-4의 저 수준 발현을 유도하며, nanog 발현이 검출되지 않는 제노프스 난모세포와 비교된다. 따라서 아흘로틀 난모세포는 제노프스 난모세포보다 포유류 분화 세포에서 전분화능성 마커 유전자의 발현을 재프로그래밍하는데 상당히 보다 효과적이다. 따라서 아흘로틀 난모세포는 분화 세포를 배아 간 세포성 세포로 재프로그래밍하는데 상당히 보다 효과적이다.
이러한 실시예 및 후속적인 실시예에서, 유전자의 발현은 그 유전자에 의해 암호화된 RNA를 어세이함으로써 검출된다.
실시예 2 - 제노프스와 비교된 아흘로틀 및 철갑상어
재료 및 방법
난자, 난모세포 및 난소 추출물의 준비
제노프스 난모세포 및 난자 추출물은 Hutchison et al., (1988) Development, 103, 553-566에 따라 준비되었다. 수정되지 않은 제노프스 난자를 성숙 암컷으로부터 수집하고 디젤링 용액(20mM TrisHCl pH 8.5, 1mM DTT 및 110mM NaCl)에 5분간 배양하였다. 디젤링 후, 난자를 0.9% NaCl 염수에 3회 린스하고 프로테아제 인히비터(3㎍ ml-1 루펩틴, 1㎍ ml-1 펩스태틴 및 1㎍ ml-1 아프로티닌)를 함유하는 아이스-콜드 추출 버퍼(20mM Hepes, pH 7.5, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 2mM β-머캅토에탄올)에 2회 린스하였다. 상기 난자를 10-ml 원심분리 튜브에 포장하고 과잉 버퍼를 제거한 다음 4℃에서 10분간 10,000g로 원심분리하였다. 세포질층을 제거하고 50㎍ ml-1 시토칼신 B를 보충한 다음 4℃에서 30분간 10,000g로 원심분리하였다. 투명 세포질에 10% 글리세롤을 보충하고 100-200㎕ 분액으로 액체 질소에서 스냅 동결하였다. 난모 세포 추출물은 OR2 배지(82.5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaHCO3, 5 mM Hepes, pH 7.8)에 1mg/ml 콜라게나아제를 이용하여 25℃에서 2시간동안 난포 세포를 다이제스팅함으로써 성숙 난소로부터 준비되었다. 단계 4-6 난모 세포를 크기로 선별하고, 추출 버퍼로 세정하여 난자 추출용으로 준비하였다.
아흘로틀 및 제노프스 난소 추출을 위해, 난소들을 아이스 콜드 추출 버퍼로 세정하고 Dounce 호모게나이저를 이용하여 얼음상에서 5-10 스트로크를 적용하여 용해하였다. 라이세이트를 제노프스 난자 추출에 대해 기재한 바와 같이 원심분리하고 저온보존하였다.
철갑상어(코철갑상어; 학명: 아시펜서 루테너스(Acipenser ruthenus)) 추출물을 다음과 같이 준비하였다: 난소 추출을 위해, 난소들을 아이스 콜드 추출 버퍼로 세정하고(실시예 1에서 개구리 난자 추출과 같이), Dounce 호모게나이저를 이용하여 얼음상에서 5-10 스트로크를 적용하여 용해하였다. 라이세이트를 제노프스 난자 추출에 대해 기재한 바와 같이 원심분리하고 저온보존하였다.
추출물에서의 세포 배양, 세포 막투과 및 배양
35-45일령의 소 태아 또는 12.5-13.5일령의 마우스로부터 섬유아세포를 분리하고, 배지(CM: 2 mM 글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 2 mM 비필수 아미노산, 100 IU ml-1 페니실린 및 100㎍ml-1 스트렙토마이신을 함유하며 10% FBS가 보충된 DMEM)에서 소에 대해서는 39℃에서, 마우스 및 사람에 대해서는 37℃에서 5% CO2에 서 최대 5회 패시지로 배양하였다. 섬유아세포는 생식융기를 포함하지 않은 13.5일 마우스로부터 분리되었다(마우스 배아 섬유아세포, MEFs). MEFs는 37℃에서 5% O2 및 CO2에서 배양되고 패시지 3 또는 4에서 사용되었다.
세포를 80% 컨플루언스로 성장시키고 실험에 사용하였다. 트립신처리 후, 세포를 막투과 버퍼(PB: 20 mM Hepes, pH 7.3, 110 mM 포타슘 아세테이트, 5 mM 소디움 아세테이트, 2 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 및 프로테아제 인히비터)에 세정하고 후속적으로 얼음상에서 1분 15초간 20-30㎍ml-1 디지토닌 1ml에서 배양하였다(Adam et al(1992) Methods Enzymol. 219, 97-110).
막투과 반응은 10ml의 PB를 첨가하여 정지되었으며, 그 다음 4℃에서 10분간 700 g로 원심분리하였다. 이러한 조건하에서, 혈장 막 막투과율은 95-100%이었다.
막투과 세포를 에너지 재생 시스템(ERS: 150㎍ ml-1 크레아틴 포스포키나아제, 60 mM 포스포크레아틴)이 보충된 난모 세포/난자/난소 추출물에 첨가하였다. 막투과 MEFs는 20㎕의 난모세포 추출물(또는 아흘로틀, 철갑상어 또는 제노프스)에 5,000 cells/㎕로 첨가하고 15℃에서 3시간, 6시간 또는 밤새 배양하였다. 컨트롤 세포는 20㎕의 PB로 배양되었다.
배양 후, 0.5 mL의 PB를 첨가하여 세포를 린스하고 그 다음 3,500 G에서 5분간 펠렛화하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 필요로 할 때까지 -80℃로 동결하였다.
역전사 ( RT ) PCR 반응에 대해
MEF 세포 펠렛을 수거하고 -80℃에 보관하였다. 토탈 RNA를 RNAeasy system(Qiagen) 및 DNAse treated(Ambion)을 이용하여 추출한 다음 Superscript III system(Invitrogen)을 이용하여 역전사하였다. 2ng의 RT 반응물을 RT-PCR에 사용하였다.
사용된 프라이머 및 조건은 다음과 같다: B-actin: ttctttgcagctccttcgtt, cttttcacggttggccttag(402bp; 56℃ 어닐링, 1분 10초 연장, 32 사이클). Nanog: atgaagtgcaagcggcagaaa, cctggtggagtcacagagtagttc(464bp; 56℃ 어닐링, 1분 10초 연장, 35 사이클). Oct-3/4: gtttgccaagctgctgaagc, caccagggtctccgatttgc(238bp; ℃ 어닐링, 1분 10초 연장, 38 사이클). RediTaq 시스템이 PCRs에 사용되었다(Sigma). 마우스 ES 세포 cDNA가 파지티브 컨트롤로 사용되었으며, RT를 하지않은 것이 네가티브 컨트롤로 사용되었다.
반응 산물은 에티디움 브로마이드로 염색된 표준 1.2% 아가로즈겔에 런닝하 고, UV 광하에 가시화되고 사진촬영되었다(도 11). 3시간, 6시간, 또는 밤새(18시간)동안, 아흘로틀 추출물(AX); 제노프스 라에비스 추출물(XL); 또는 철갑상어 추출물(ST)내의 세포, 또는 추출물로 처리되지 않은 세포(-)로부터 추출된 RNA에 상응하는 겔 래인들.
좌측 래인은 분자량 마커로 작용하는 Invitrogen의 100 bp DNA 래더를 나타낸다. 상부 겔은 nanog 프라이머를 이용한 PCR 증폭으로부터 예측된 464 bp DNA 밴드가 아흘로틀 또는 철갑상어 추출물로 처리된 세포에 상응하는 래인에 존재하지만, 제노프스 추출물에 처리된 또는 추출물로 처리되지 않은 세포에 상응하는 래인에는 존재하지 않음을 나타낸다.
바닥부 래인은 파지티브 컨트롤로서 마우스 β-액틴 cDNA의 증폭을 나타낸다. 예측된 402 bp 밴드는 기대 대로 모든 래인에 존재하는 것이 주목되며, 이 유전자는 재프로그래밍에 의해 유도되지 않기 때문에 항상 모든 마우스 세포에 존재한다. nanog를 검출하기 위해서는 이는 조절 유전자이며 일반적으로 세포에서 저수준으로 발현되기 때문에 기대 대로 보다 많은 사이클의 PCR이 요구되었다. β-액틴은 구조 유전자에서 기대되는 바와 같이 풍부하게 발현된다.
이러한 실험에서 Oct-4 발현은 활성화되지 않는다. 이는 Oct-4 프로모터가 메틸화에 의해 음 조절되기 때문인 것으로 예측된다. 따라서 활성화는 전사 활성화 를 위한 전조로서 프로모터의 디메틸화를 필요로 하며, 이는 이러한 실험에 사용된 잠시의 배양 시간이 프로모터를 완전히 디메틸화하는데 충분치 않은 것으로 예측된다.
이와 부합하여, 실시예 1 및 5(주입 실험)는 아흘로틀 난모세포의 GV내로 주입 후 nanog가 상대적으로 활성화되기 쉬워짐을 나타낸다. 활성화를 위해 1일이 요구된다. Oct-4 전사는 아마도 Oct-4 프로모터를 디메틸화하는데 필요한 시간을 반영하여 약 5일이 요구된다. nanog는 디메틸화전에 요구되지 않음에도 불구하고 제노프스 난모세포내로 주입된 세포에서 결코 활성화되지 않는다.
실시예 3 - 후생유전학적( epigenetic ) 마크를 이용한 재프로그래밍 확인
분화 세포의 보다 전분화능적 상태로의 재프로그래밍을 관찰하기 위한 다른 방법은 세포의 후생유전학적 프로필을 관찰하는 것이다. 후생유전학적 마크는 분화 세포의 DNA와 단백질(크로마틴)의 복합체에서 쉽게 또렷이 보인다. 다수의 경우에 후생유전학적 마크는 세포내 일부 유전자의 전사를 영구히 불활성화한다. 후생유전학적 마크는 종종 헤테로크로마틴으로 알려진 형태로 단단히 밀집된 라지 리전의 DNA로 군집된다. 분화 세포를 전분화능적 상태로 재프로그래밍하는 것을 이루기 위해 이러한 억제적 후생유전학적 마크의 일부 또는 모두의 역전이 요구되며 이에 따라 대부분의 DNA가 활성화되기에 접근가능해지도록 된다. 이와 관련하여, 배아 간 세포와 같은 전분화능 세포는 상당히 적은 헤테로크로마틴을 함유하며 전형적인 분화 세포보다 상당히 적은 후생유전학적 마크를 함유한다. 아마도 이는 활성화를 위한 전분화능 세포내의 모든 또는 대부분의 유전자들이 명확히 접근가능함을 반영하며, 이는 전분화성에 필수적인 것으로 추측되는 특성이다.
두 후생유전학적 마크가 전형적으로 불활성 유전자와 관련된다. 대부분의 세포의 DNA는 CpG 아일랜드내의 시토신 잔기에 공유 결합된 메틸기(CH3)를 함유한다. 메틸화 DNA(CH3-DNA)는 헤테로크로마틴에서 매우 현저하며, 이곳에서 면역화학 실험으로 CH3-DNA 특이 항체에 의해 뉴클리어 스폿을 밝게 염색하여 검출될 수 있다. CH3-DNA에 부가적으로, 제 2 후생유전학적 마크는 DNA에 바인딩되어 크로마틴으로 칭하여지는 보다 높은 정렬 구조의 핵 DNA를 제공하는 작은 고 전하 핵 단백질인 히스톤의 특정 잔기에 CH3 기의 첨가이다. 일반적으로, 불활성화 유전자는 히스톤 H3, H3K9의 리신 잔기 9(K9)에 첨가되는 CH3 기의 존재에 의해 마킹된다. 이러한 경우 메틸화 히스톤(CH3-히스톤)이 DNA에 바인딩되고 이의 전사 활성을 저해한다. 세포의 전분화능 상태로의 유전자 발현을 재프로그래밍하기 위해, 분화 세포 핵내에 CH3-DNA 및 CH3-히스톤의 수준을 저감시키는 것이 필수적일 것이다. 이와 관련하여, 배아 간 세포는 저수준의 CH3-DNA 및 CH3-히스톤 잔기를 함유한다.
도 3은 마우스 태아 섬유아세포(PFF)의 크로마틴내에 존재하는 후생유전학적 마크를 제거하는 아흘로틀의 난소로부터 준비된 추출물의 능력을 나타낸다. 보다 상세하게, 도 3은 상기 추출물의 DNA 메틸화 제거능력을 나타낸다. 미처리된 컨트롤 세포(A) 또는 아흘로틀 난소 추출물(AxOvEx)에서 3시간 배양된 세포(B)는 녹색 형광을 내는 FITC-안티 5-Mec 항체를 첨가함으로써 CH3-DNA의 존재에 대해 면역화학법으로 분석되었다. 그러나, 이는 흑백 사진으로 이미지 A, B, E 및 F에서 밝은 스폿으로 보여질 수 있다. 컨트롤 세포(C) 및 미처리 세포(D)는 또한 추출물에서 세포의 막투과성을 평가하기 위해 프로피디움 요오드로 처리되었다. 프로피디움 요오드는 적색으로 염색되지만 흑백 이미지에서 이는 C 및 D에서 본질적으로 세포를 채우는 검은 회색으로 보여진다. 도 E 및 F는 프로피디움 요오드 및 FITC-안티 5-MeC 항체로 염색된 세포를 나타낸다. 3시간동안 추출물에서 배양된 PFF는 컨트롤 세포와 비교하여 상당히 감소된 수준의 CH3-DNA 염색을 함유한다. 상기 데이타는 아흘로틀 난소의 추출물은 PFF의 DNA를 디메틸화하는 강력한 능력을 가짐을 나타내며, 이는 전사 억제된 DNA의 주요 후생유전학적 마크 중 하나를 제거한다.
도 4는 아흘로틀 난소 추출물(AxOvEx)에서 PFF의 배양은 H3K9 염색을 제거하여 후생유전학적 마크의 제거를 나타냄을 보여준다. PFF는 아흘로틀 난소 추출물에서 3시간동안 배양되었다(처리된 세포). 처리된 세포 및 미처리 컨트롤 PFF는 H3K9 염색의 존재에 대해 면역화학법으로 분석되어 전사 억제와 관련된 히스톤의 주요 변형을 확인하였다. A(미처리) 및 B(처리) 세포에서, 상기 세포들은 녹색 형광을 내는 FITC-안티 H3K9 항체로 배양되었다. 흑백 사진에서 이는 밝은 스폿으로 보여질 수 있다. 양 그룹의 세포들은 또한 DNA의 위치를 나타내기 위해 DNA 특이 염료 DAPI로 처리되었다. 이러한 염색은 청 형광을 발하지만 흑백 사진에서 이는 검은 회색으로 보여질 수 있다(참조 도 4에서 C 및 D). H3K9 염색 및 DAPI 염색에서 형광 이미지는 각 시료에 대해 병합되었다. 상기 데이타는 아흘로틀 난소의 추출물에서 PFF의 처리는 PFF의 크로마틴으로부터 H3K9 염색을 실질적으로 제거함을 나타내며, 이는 보다 전분화적 상태로 재프로그래밍하는 것과 부합된다.
실시예 4 - 원시 동물로부터 nanog 의 클로닝
아흘로틀 nanog 전장 cDNA가 다음과 같이 분리되었다: 아흘로틀 난소 cDNA는 (각각 호메오도메인 및 호메인도메인내의 아미노산 서열 N-말단에 대한) 디제너레이트 프라이머 F(포워드)(F1으로 칭함): A(G/C)(C/T)CC(A/G/T)GA(T/C)TCT(G/T)C(C/T)AC(A/T/C)AG(T/C) 및 R(리버스)(R4로 칭함): C(G/T)(T/C)TGGTT(T/C)TG(A/G)AACCA(C/G)GT(T/C)TT(C/A)를 이용하여 주형으로 사용되었다.
PCR(56℃ 어닐링, 1분 10초 연장, 35 사이클)은 ~260bp 프레그먼트를 생산하 였다.
이 프레그먼트는 플라스미드 벡터로 클로닝되고 시퀀싱되었다. 프라이머는 RACE-ready 아흘로틀 난소 cDNA를 이용하여 5' 및 3' RACE에 대해 디자인되었다.
Smart RACE 키트(Clontech)가 사용되었으며, 프라이머 및 cDNAs가 준비되고 RACE 반응은 키트 설명서에 따라 수행되었다. 사용된 RACE 프라이머는 해당 키트 프라이머에 따라 다음과 같다: 5' RACE(RACE-R2라 칭함): TTCGTCTCACCTCCCACCGCTACAT, 3' RACE(RACE-F1이라 칭함) CGGCGGATCTCAACCTCACATACAA. 5' RACE는 ~360bp 프레그먼트를 생성하였으며, 3' RACE는 ~1150bp 및 ~750bp의 두 프레그먼트를 생성하였으며, 이는 아흘로틀 nanog cDNA의 택일적인 폴리아데닐화를 반영한다. 이러한 산물들은 TA 클로닝되고 시퀀싱되었다. 3 오버래핑 산물의 서열 콘티그(contig)가 제작되었으며 이는 ~1.7 kb 길이의 전장 아흘로틀 nanog cDNA 서열을 제공하였다. 아흘로틀 nanog 아미노산 서열은 여러 포유류의 nanog 서열과 비교한 도 9에 주어진다(nanog는 이전에 비-포유류 종으로부터 분리되지 않았다).
실시예 5 - 아흘로틀 난모세로에 의한 사람 성체 세포의 재프로그래밍
막투과 BJ 사람 성체 일차 섬유아세포(ATCC 셀뱅크 컬렉션 http://www.lgcpromochem-atcc.com/(CRL-2522))를 실시예 1의 마우스 실험에 기재된 바와 같이 아흘로트 난모세포의 배포(핵)내로 주입하고, 주입된 난모 세포를 18℃에서 5일간 배양하였다.
배포를 그룹내 난모세포들로부터 절개하고, 사람 세포를 함유하는 것들을 분석을 위해 동결시켰다(도 10A).
상업적 추출 키트(RNAeasy kit)를 이용하여 토탈 RNA를 추출하고 게노믹 DNA 오염을 막기위해 DNAse I을 처리하였다. 각 시료로부터 추출된 RNA를 역전사시켜 컴플리먼터리 DNA(cDNA)를 생성하였다.
하기 유전자들에 대해 디자인된 특정 프라이머들을 이용한 표준 PCR에 의한 증폭을 위해 상기 cDNA를 사용하였다: human Nanog(포워드 5' aggcaaacaacccacttctg 3', 및 리버스 5' tcttcggccagttgtttttc 3'), human POU-5F1(Oct-4 유전자; 포워드 5' tcccttcgcaagccctcat 3'), 리버스 5' tgacggtgcagggctccggggaggccccat 3'), 및 human β-Actin(포워드 5' ggacttcgagcaagagatgg 3', 및 리버스 5' agcactgtgttggcgtacag 3').
도 10B에 나타낸 바와 같이, Nanog 발현은 48시간 후 아흘로틀 난모세포로 배양된 세포에서 검출된다. 이와 반대로, 제노프스가 주입된 난모세포에서는 Nanog 발현은 검출되지 않는다. Oct-4 발현은 아흘로틀 주입된 난모세포에서 5일 후 검출된다.
따라서, 성체 사람 세포(분화 세포)는 이들이 아흘로틀 난모세포내로 주입된 후 Oct-4 및 nanog 유전자를 발현하도록 재프로그래밍되었다. 제노프스 난모세포내로의 주입은 nanog의 활성화를 일으키지 않는다.
이러한 결과는 사람 및 마우스 세포 모두 본 발명의 특성을 갖는 냉혈 척추동물(예, 원시 척추동물 체제)로부터 얻어진 세포/세포 추출물에 의해 재프로그래밍될 수 있으며 그 성체 세포들이 재프로그래밍될 수 있는 것으로 나타나기 때문에 중요하다. 분화 성체 세포들은 이들의 발달이 아직 진행중이며 크로마틴상에 놓여진 영구적 후생유전학적 마크를 갖지 않는 태아 세포보다 재프로그래밍하기 어렵다.
주입된 난모세포를 18℃에서 배양하는 것은 실온에서 배양하는 것보다 주입된 난모세포의 증가된 생존율면에서 유리하며, 이는 Oct-4의 활성화를 유발하기에 충분한 시간을 이루는 적어도 5일동안 배양될 수 있다. 또한, 포유류 게놈으로부터의 전사가 온도 의존성이므로(Alberio et al, 2005), 이러한 온도에서 전사의 억제는 더욱 재프로그래밍을 보조할지 모른다.
실시예 6 - nanog 바인딩 사이트를 함유하는 리포터 유전자의 활성화
nanog가 존재하는 것을 나타내기 위해, nanog가 GATA-4의 프로모터와 같이 nanog 바인딩 사이트를 함유하는 리포터 유전자를 활성화할 수 있는지를 나타내는 것이 가능하다. 도 12에서 아흘로틀 nanog(Axnanog)의 리포터 유전자를 활성화시키는 능력을 시험하는 실험 결과를 나타내었다. GATA-4 프로모터는 반딧불이 루시페라아제(어두운 곳에서 반딧불이 글로를 생성하는 단백질)를 암호하는 리포터에 융합된다. 이 단백질은 루미노미터라 불리는 기계로 측정될 수 있는 빛을 제공한다. 산출물은 정량될 수 있다.
이 실험에서 공 DNA가 사람 nanog 및 Axnanog의 발현을 유도하는 두 클론과 비교되었다.
도 12의 방법
NIH3T3 세포를 24웰 플래이트에 시딩하고, Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)을 이용하여 GATA-4 리포터 0.25㎍/웰, pTK-RL(Promega) 0.05㎍/웰, 그리고 공 벡터(cDNA), 사람 nanog, 또는 아흘로틀 nanog 비표지(CMV) 또는 RFP 표지(mR)로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 24시간에 세포를 수거하고 Dual luciferase assay(Promega)로 처리하였다. RLU(상대적 루시페라아제 유니트)는 상 기 공 벡터 컨트롤로 비율화되었다. 바는 표준 편차를 나타내며; n=3이다.
실시예 7 - 아흘로틀에서 nanog 분리의 확인
Axnanog의 발현 프로필을 조사하였으며 마우스 nanog 유전자의 프로필과 비교하였다. Axnanog가 발현되어 아흘로틀 발달도중 전분화능에 역할을 하는 것으로 예측되는 시기에 정확히 발현되는 것으로 발견되었다.
마우스 배아에서 nanog 유전자는 내세포괴(inner cell mass) 및 초기 배반포의 세포에서 초기 발달도중에 매우 잠시 발현된다. 이는 이 기간도중 전분화성의 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Axnanog가 이와 동등한 기간도중에 발현되는지 시험하기 위해, 본 발명자들은 초기 배아에서 그 발현을 분석하였다. 저수준의 모계 Axnanog RNA는 초기 및 말기 분할 단계(EC; LC)도중에 검출가능하며, 왕성한 발현은 아흘로틀 배아의 접합체 게놈으로부터 전사가 시작되는 경우인 중간-포배 전이를 나타내는 9단계에서 시작된다. 발현은 초기 장배(10단계)에서 피크를 나타내며, 말기 장배(12단계)에서 감소한다. 발현은 이후의 단계에서는 검출불가능하다. 따라서, Axnanog는 전분화성 세포의 존재와 일치하는 발달 윈도우 도중에 발현되며, 발현은 모든 세포가 체세포계열에 대한 커미트먼트를 겪는 것으로 여겨지며 전분화성으로 기대되지 않는 시기인 장배 단계이후에 사라진다.
초기 배아에서 AxNanog 발현
RNA는 도 2에 나타낸 각 단계에서(8, 9, 10, 12, 16, 20, 25, 30, 35 및 40 발달 단계) 5 아흘로틀 배아로부터 트리졸을 이용한 표준 방법을 이용하여 추출되었으며(Bordzilovskaya et al; 1989. Develpopment stage series of axolotl embryos. In Developmental Biology of the Axolotl. (ed. J. B. Armstrong and G. M. Malacinski), pp. 210-219. New York: Oxford University Press.), 그 다음 DNAse I으로 처리하였다.
그 RNA는 Superscript(Invitrogen)를 이용하여 역전사되었다. 각 단계로부터 cDNA의 0.5 배아 당량을 하기 프라이머를 이용한 PCR에 사용하였다: Axnanog에 대한 프라이머(F1: GTTCCAGAACCGAAGGATGA; R1: CGAAGGGTACTGCAGAGGAG 58℃, 45초, 72℃, 1분) 또는 Axolotl 오르니틴 디카르복실라아제(ODC; F1: TGCGTTGGTTTAAAGCTCTC; R1: ACATGGAAGCTCACACCAAT 56℃, 45초; 72℃, 1분). 구성적으로 발현되는 유전자를 cDNA 보전성에 대한 파지티브 컨트롤로 사용하였다. PCR은 35 사이클(Axnanog) 또는 30 사이클(ODC)로 하였다.
반응 산물은 에티디움 브로마이드를 함유하는 1.2% 아가로즈겔상에서 분리된 다음, UV 광하에 사진촬영되었다(도 2).
실시예 8 - DNA 디메틸화 확인
전체적인 DNA 디메틸화는 기존에 기재된 프로토콜(Habib et al., (1999). Exp. Cell Res. 249, 46-53.)을 약간 변형하여 플로우 사이토메트리에 의해 확인되었다.
서스펜션내에 있는 세포들을 연속적인 저속(300g) 펠렛팅하고, 0.1% 트윈 20 및 1% BSA(bovine serum albumin)가 보충된 PBS(인산염 완충수)로 2회 세척되는 온순한 재현탁 단계를 수행한 다음, -20℃에서 20분간 냉각된 9vol의 메탄올/PBS(88% 메탄올/12% PBS vol/vol)으로 고정하였다. 실온에서 PBST-BSA로 2회 세정후, 세포들을 연속적으로 37℃에서 30분간 2N HCl로 처리한 다음, Tris HCl 버퍼(pH 8.8)로 5분간 처리하였다. 그 다음 세포들을 5% BSA가 보충된 PBS-T로 제조된 블로킹 용액으로 37℃에서 1시간동안 처리한 다음, 4℃에서 밤새 항-5-MeC 항체로 배양하였다.
그 다음 세포들을 연속적으로 PBS-T로 3회 린스하고, PBST-BSA으로 200분의 1로 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트(Dako, Trappes, France)에 접합된 토끼 항-마우스 면역글로블린으로 실온에서 1시간동안 배양되었다. 최종적으로 시료를 PBS로 3회 세정하고 30분간 프로피디움 요오드(PI)(PBS내에 50mg/ml)로 염색하고 플로우사이트메트리를 수행하였다. 분석은 Epics XL flow cytometer(Beckman Coulter)에 의해 수행되었다.
유사한 프로토콜은 플로우 사이토메트리에 의해 H3K9 및 HP1 알파의 변화를 검출하는데 사용되었다. 간략히, 세포들을 1% BSA 및 0.1% Tween 20(PBST-BSA)가 보충된 pH 7.4 PBS로 2회 세정한 다음, -20℃에서 20분간 냉각된 9vol의 메탄올/PBS(88% 메탄올/12% PBS vol/vol)으로 고정하였다.
그 다음 세포를 5% BSA가 보충된 PBS-T로 이루어진 블로킹 용액으로 37℃에서 1시간동안 처리한 다음, 항-Tri 메틸화 H3K9 또는 항-HP1 알파 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 다음 세포를 연속적으로 PBS-T로 3회 린스하고 각각 PBST-BSA에 200분의 1로 희석된 플루오로세인 이소티아시아네이트(Dako, Trappes, France)에 접합된 Dunkey 항 토끼(1:100 Juckson USA) 또는 고트 항-마우스 면역글로블린으로 실온에서 1시간동안 배양하였다.
최종적으로 시료들을 PBS로 3회 세정하고 프로피디움 요오드(PI)(PBS에 50 mg/ml)로 30분간 염색하고 플로우 사이토메트리에 적용하였다.
분석은 Epics flow cytometer(Beckman Coulter)에 의해 수행되었다.
플로우 사이토메트리 결과를 도 16 및 17에 나타내었다.
고찰
세포를 CH3-DNA 항체 및 히스톤 H3K9 항체를 이용한 형광 염색에 기초하여 선별한 다음, 몇 퍼센트의 세포가 전체 컨트롤 수준의 염색을 갖는지, 그리고 몇 퍼센트가 시간에 따른 감소된 형광도를 나타내는지 조사하였다.
도면으로 나타낸 바와 같이, 세포에서 전체 형광 수준은 양쪽 실험에서 모두 감소된다. 이는 초기 결과를 확인하는 것이며, 메틸화 DNA 및 히스톤 H3K9의 소실이 이루어짐을 입증한다.
실시예 9 - 양( sheep ) 복제력을 높이는데 사용되는 아흘로틀 난모세포 추출물의 용도
본 발명의 세포 및 세포 추출물은 핵 이식(NT) 전에 아흘로틀 난모세포 추출물을 이용하여 세포를 배양함으로써 양 복제와 같은 복제 공정을 강화하는데 사용될 수 있다.
양 섬유아세포는 Alberio et al., (2005)에 의해 소 세포에 대해 기술된 바와 같이 막투과되었다. 상기 세포는 18℃에서 3시간동안 아흘로틀 난모세포에서 배 양된 다음 NT를 위해 핵 공여자로 사용되었다. 막투과 세포는 일반적으로 팽창된 둥근 형태로 현미경으로 쉽게 인지되며, 이에 따라 NT용으로 선별되었다. 핵 이식 공정은 Lee et al., (2006) Biol Reprod. 74:691-8에 의해 기재된 바와 같은 방식으로 수행되었다.
배양 7일 후 배반포로의 발달을 현미경으로 평가하였다. 5개의 클로닝된 배아가 7일 후 배반포로 발달되었으며, 이는 아흘로틀 추출물에서 배양된 세포가 NT용으로 가시적인 공여자임을 나타낸다.
이 실험은 포유류 체세포를 아흘로틀 난모세포 추출물에 노출하는 것은 포유류 복제 배아의 전이식 발달에 해롭지 않음을 보여주었다.
이러한 배아는 본 발명의 추출물에 노출된 세포로 이루어진 클로닝된 배아로 보아 발달시 개선을 나타낼 것으로 기대된다. 배아의 잉태 및 발달이 진행중이다.
실시예 10 - 재프로그래밍화용 키트
본 발명의 세포 및 세포 추출물은 본 발명의 방법에 사용되는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키트는 바람직하게 상기 세포/세포 추출물 리전트, 및 하기 중 적어도 하나를 함유한다:
사용 설명서; 재프로그래밍된 세포의 재분화용 프로제니터 배지; 예를 들어, 멀티-웰 플래이트, 프리-로드 파이펫과 같은 분배기와 같은 재프로그래밍을 수행하기 위한 일회용 장치; 재프로그래밍하고자 하는 분화 세포 및 막투과 버퍼.
상기 키트는 프로제니터 배지 및 사용 설명서는 상기 세포 타입 및 최종 용도에 따라 달라질 수 있는 면에서 요구되는 재분화 세포 타입에 따라 주문제작될 수 있다.
실시예 11 - 약학 배합물 및 투여
본 발명의 다른 견지는 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 캐리어와 함께 본 발명의 제 1 견지에 따른 화합물을 포함하는 약학 배합물이 제공된다.
바람직하게, 상기 배합물은 활성 성분의 일일 투여량 또는 유니트, 일일 서브-도즈 또는 이의 적절한 분획을 함유하는 유니트 조제이다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 약학적으로 허용되는 투여 형태로 임의로 무독성 유기, 또는 무기, 산성 혹은 염기성 첨가염의 형태로, 상기 활성 성분을 포함 하는 약학 배합물의 형태로 경구 투여 또는 어느 비경구 투여될 것이다. 치료하고자 하는 질병 또는 환자에 따라 투여 경로 뿐만 아니라 상기 조성물은 투여량을 달리하여 투여될 수 있다.
사람 치료시, 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 의도된 투여 경로 및 표준 약학 실행과 관련하여 선택된 적절한 약학 부형제, 희석제 또는 캐리어와 함께 혼합하여 투여될 것이다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 즉시-, 지연- 또는 조절된-방출 적용으로 정제, 캡슐, 소란(ovules), 엘릭시르, 용액 또는 서스펜션의 형태로 경구, 구강 또는 설하 투여될 수 있으며, 이는 향료나 착색제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 해면내(intracavernosal) 주입으로 투여될 수 있다.
이러한 정제는 미정질 셀룰로오즈, 락토오즈, 소디움 시트레이트, 칼슘 카보네이트, 디베이직 칼슘 포스페이트 및 글리신과 같은 부형제, 전분(바람직하게, 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 소디움 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로즈 및 특정 복합 실리케이트와 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오즈(HPMC), 히드록시-프로필셀룰로오즈(HPC), 수크로즈, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립 바인더를 함유할 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 비헤네이트 및 탤크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다.
이와 유사한 타입의 고형 조성물이 젤라틴 캡슐내에 필러로서 또한 사용될 수 있다. 이와 관련된 바람직한 부형제는 락토오즈, 전분, 셀룰로오즈, 밀크 슈가 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 서스펜션 및/또는 엘릭시르에 대해, 본 발명의 화합물은 여러 감미료 또는 향료, 착색물 또는 염료와, 유화제 및/또는 서스펜딩제와 그리고 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제, 및 이의 혼합물과 혼합될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 수막내, 뇌실내(intraventricularly), 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하와 같은 비경구 투여될 수 있으며, 또는 이들은 인퓨전 기술에 의해 투여될 수 있다. 이들은 예를 들어, 혈액과 등장성인 용액을 만들기 위해 충분한 염 또는 글루코즈와 같은 다른 물질을 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 적절히 사용된다. 상기 수용액은 필요에 따라 적절히 (바람직하게 pH 3-9로) 완충되어야 한다. 멸균 조건하에서 적절한 비경구 배합물의 제조는 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려진 표준 약학 기술에 의해 쉽게 수행된다.
비경구 투여용을 적합한 배합물은 항산화제, 버퍼, 세균 발육 저지제 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성 배합물을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주입 용액; 및 서스펜딩제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수 성 멸균 서스펜션을 포함한다. 상기 배합물은 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이얼과 같은 유니트-투여 다중-투여 용기내에 존재할 수 있으며, 예를 들어, 사용 직전 주입용 물과 같은 멸균 액체 캐리어의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(lyophilised) 조건으로 저장될 수 있다. 즉석 주입용액 및 서스펜션은 앞서 기술한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
사람 환자에 대해 경구 및 비경구 투여시, 본 발명 화합물의 일일 투여량은 일반적으로 1-30mg/kg이 될 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명 화합물의 정제 또는 캡슐은 동시에 적절히 단일 또는 둘 이상으로 투여하기 위한 활성 화합물의 투여량을 함유할 수 있다. 어느 이벤트에서 의사는 어느 각 환자에 가장 적절하게 될 실제 투여량을 정할 것이며, 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 상기 투여량은 예시적인 평균 사례이다. 물론, 보다 높거나 낮은 투여량 범위가 가치있는 환자예가 있을 수 있으며, 이러한 범위는 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 비강내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA134A3 또는 1,1,1,2,3,3,-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3)과 같은 히드로플루오로알칸, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스와 같은 적절한 추진체의 사용으로 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기로부터 건 조 분말 흡입기 또는 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 운반될 수 있다. 상기 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기는 예를 들어, 에탄올 및 용매와 같은 추진체의 혼합물을 이용하여 활성 화합물의 용액 또는 서스펜션을 함유할 수 있으며, 이는 부가적으로 소르비탄 트리올레이트와 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 구성된)가 본 발명의 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적절한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하도록 제조될 수 있다.
에어로졸 또는 건조 분말 배합물은 바람직하게 각 칭량된 투여량 또는 "퍼프(puff)"가 본 발명 화합물의 적절한 투여량을 환자에게 운반하도록 정렬된다. 에어로졸을 이용한 전체 일일 투여량은 환자마다 달라질 것이며, 단일 투여로 투여될 수 있으며, 또는 보통 하루에 나누어 투여될 수 있는 것이 인식될 것이다.
택일적으로, 본 발명의 화합물은 좌약 또는 페서리의 형태로 투여될 수 있으며, 또는 이들은 로션, 용액, 크림, 연고 또는 더스팅 파우더의 형태로 국소 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 예를 들어, 피부 패치의 사용에 의한 것과 같이 경피 투여될 수 있다. 이들은 또한 안과학적 경로에 의해, 특히 눈 질환 치료용으로 투여될 수 있다.
안과용으로, 본 발명의 화합물은 등장서, pH 조정된 멸균 염수에 미분화된 서스펜션으로 또는 바람직하게, 임의로 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제와 함께, 등장성, pH 조정된 멸균 염수내에 용액으로서 배합될 수 있다. 택일적으로, 이들은 광유와 같은 연고에 배합될 수 있다.
피부에 국소 적용시, 본 발명의 화합물은 예를 들어, 미네랄 오일, 액체 광유, 화이트 광유, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물 중 하나 이상과의 혼합물에 서스펜딩되거나 용해된 활성 화합물을 함유하는 적절한 연고로 배합될 수 있다. 택일적으로, 이들은 예를 들어, 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물 중 하나 이상의 혼합물에 서스펜딩되거나 용해된 적절한 로션 또는 크림으로 배합될 수 있다.
구강에서 국소 투여용으로 적절한 배합물은 향 베이시스, 일반적으로 수크로즈 및 아카시아 또는 트라가칸트내에 활성 성분을 포함하는 로젠즈; 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로즈 및 아카시아와 같은 비활성 베이시스내에 활성 성분을 포함하는 패스틸; 및 적절한 액체 캐리어내에 활성 성분을 포함하는 구강-청결제를 포함한다.
일반적으로, 사람에서 본 발명 화합물의 구강 또는 국소 투여가 바람직한 경 로이며 가장 편리하다. 수용자가 목넘김 이상으로 고통받거나 구강 투여후 약물 흡수 장애로 고통받는 경우에 약물은 예를 들어, 설하 또는 볼과 같은 비경구 투여가 적용될 수 있다.
수의학적 용도로, 본 발명의 화합물은 일반적인 수의학적 수행에 따라 적절히 수용가능한 배합물로 투여되며, 수의사는 특정 동물에 가장 적합한 투여 처방계획 및 투여 경로를 정할 것이다.

Claims (43)

  1. 분화 세포, 또는 분화 세포의 핵을 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아로부터 유도된 세포 또는 이의 세포 추출물에 노출시키는 것을 포함하며, 상기 냉혈 척추동물은 하기 특성
    (i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
    (ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
    (iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
    중 하나 이상을 갖는 재프로그래밍된 세포 또는 재프로그래밍된 세포 핵을 생성하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포는 배아 간 세포성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포, 및/또는 재프로그 래밍된 세포 핵은 Oct-4를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포, 또는 재프로그래밍된 세포 핵은 nanog를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포, 또는 재프로그래밍된 세포 핵은 전분화능(pluripotent)성인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 세포 추출물내의 Oct-4 및/또는 nanog는 사람 전사인자 Oct-4 및 사람 nanog 단백질과 각각 적어도 69% 아미노산 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 세포 추출물내의 Oct-4 및/또는 nanog는 사람 전사인자 Oct-4 또는 사람 nanog 단백질의 DNA 바인딩 도메인(DBD)과 각각 적어도 69% 아미노산 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉혈 척추동물은 양서류, 파충류 및 어류로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 냉혈 척추동물은 도롱뇽, 거북이, 도마뱀, 악어류, 하이퍼로트레티(먹장어); 하이퍼로아티아(칠성장어); 연골어류(상어, 가오리, 홍어, 키메라); 콘드로스테이(비커스, 철갑상어, 주걱철갑상어 등); 세미오노티포메스(가르스); 아미아목(아미아); 디프노이(폐어); 및 공극어아강(실러캔스)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 냉혈 척추동물은 도롱뇽, 거북이, 폐어 및 철갑상어를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 냉혈 척추동물은 도롱뇽인 것을 특징으로 하는 방 법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 도롱뇽은 아흘로틀(axolotl) 또는 노토프탈머스(notopthalmus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 냉혈 척추동물은 철갑상어인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 재 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 난모세포, 난자 또는 초기 배아 세포 추출물은 상기 난모세포, 난자 또는 초기 배아 세포의 핵 또는 배포(GV)의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 세포는 막투과화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 분화 세포는 포유류의 것임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 분화 세포는 사람의 것임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항의 방법에 따라 생성된 재프로그래밍된 세포.
  20. 제 2항 내지 제 18항의 방법에 따라 생성된 배아 간 세포성 세포.
  21. 제 1항 내지 제 18항의 방법에 따라 생성된 재프로그래밍된 세포 핵.
  22. (a) 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 기재된 재프로그래밍된 세포를 생 성하는 단계; 및
    (b) 상기 재프로그래밍된 세포를 이로부터 유도되는 분화 세포와 동일한 타입 또는 다른 타입의 분화 세포로 재분화시키는 단계
    를 포함하는 재분화 세포 생성 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 재분화는 프로제니터 배지를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22항 또는 제 23항의 방법에 따라 생성된 재분화 세포.
  25. 다음 특성
    (i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
    (ii) 생식 세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
    (iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
    중 하나 이상을 갖는 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아로부터 유도된 분리 세포 또는 세포 추출물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 추출물은 상기 난모세포, 난자, 또는 초기 배아 세포의 핵 또는 배포(GV)의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 추출물.
  27. 제 25항 및 제 26항에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물 및 약학적으로 허용되는 캐리어, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  28. 제 19항에 정의된 재프로그래밍된 세포 및/또는 제 21항에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 또는 제 24항에 정의된 재분화 세포, 및 약학적으로 허용되는 캐리어, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  29. 제 25항 및 제 26항에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물의 유효량 및/또는 제 19항에 정의된 재프로그래밍된 세포의 유효량 및/또는 제 21항에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 및/또는 제 24항의 방법에 의해 생성된 재분화 세포의 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하는 세포의 대체 또는 재생이 요구되는 질병을 치료하는 방법.
  30. 제 25항 및 제 26항에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물 및/또는 제 19항에 정의된 재프로그래밍된 세포 및/또는 제 21항에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 및/또는 제 24항에 정의된 재분화 세포의 의약용 용도.
  31. 제 25항에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물 및/또는 제 19항에 정의된 재프로그래밍된 세포 및/또는 제 21항에 정의된 재프로그래밍된 세포 핵 및/또는 제 24항에 정의된 재분화 세포의 세포 대체 또는 재생이 요구되는 질병의 치료를 위한 의약 제조용 용도.
  32. 제 29항 또는 제 30항 또는 제 31항에 있어서, 상기 질병은 신경학적 질병(파킨슨병, 알츠하이머병, 척수 손상, 뇌졸증), 피부 변질, 화상, 심장 질환, 당뇨병, 골 관절염 및 류마티즘성 관절염을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 질병은 신경학적 질병인 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 신경학적 질병은 파킨슨병, 알츠하이머병, 척수 손상, 뇌졸증을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  35. 다음 특성
    (i) 후부에 위치한 골반 뼈로부터 연장되는 어류에서 옆으로 돌출된 리브 및/또는 척수 돌기 및/또는 골반 부속지를 포함하는 원시 척추동물 체제(body plan)
    (ii) 생식세포질을 함유하지 않는 생식 세포; 및/또는
    (iii) 고 보존 형태로 Oct-4를 발현하며 그리고/또는 고 보존 형태로 nanog를 발현하는, 난모세포, 난자, 난소 또는 초기 배아 세포 또는 그 세포 추출물이 유도되는 세포
    중 하나 이상을 갖는 냉혈 척추동물의 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아로부터 유도된 세포 또는 세포 추출물
    및 상기 난모 세포, 난자, 난소 또는 초기 배아, 또는 이의 추출물을 사용하 기 위한 설명서를 포함하는, 분화 세포를 재프로그래밍하거나 또는 분화 세포의 핵을 재프로그래밍하는 키트.
  36. 제 35항에 있어서, 재프로그래밍하고자 하는 하나 이상의 분화 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 35항 또는 제 36항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포의 재분화의 추가 단계가 이루어지도록 프로제니터 배지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 클로닝하고자 하는 세포(들)를 제 25항 및 제 26항에 정의된 분리 세포 또는 세포 추출물에 노출시키는 것을 포함하는 세포 클로닝 강화 방법.
  39. 실질적으로 본 실시예 및 도면을 참고로 본 명세서에 기재된 방법.
  40. 실질적으로 본 실시예 및 도면을 참고로 본 명세서에 기재된 분리 방법 또는 세포 추출물.
  41. 실질적으로 본 실시예 및 도면을 참고로 본 명세서에 기재된 조성물.
  42. 실질적으로 본 실시예 및 도면을 참고로 본 명세서에 기재된 용도.
  43. 실질적으로 본 실시예 및 도면을 참고로 본 명세서에 기재된 성분 키트.
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