KR20080034212A - 알레르기 위험을 감소시키는 개선된 모유 수유를 위한 방법 - Google Patents

알레르기 위험을 감소시키는 개선된 모유 수유를 위한 방법 Download PDF

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Abstract

락토바실러스(Lactobacillus)의 선별된 균주 및 유아 수유를 위한 모유를 개선하기 위하여, 더욱 정확하게는 모유에서 소염성 사이토킨 IL-10의 수준을 증가시키고; 수유 유아(feeding baby)에서 알레르기의 발병 위험을 감소시키고, 이와 동시에 모유에서 TGF-베타-2의 원인과 양을 감소시켜 수유 모체(feeding mother)에서 유선염(mastitis)의 발병 위험을 감소시키기 위하여 이들 선별된 균주의 세포를 함유하는 산물을 제시한다.
락토바실러스(Lactobacillus)

Description

알레르기 위험을 감소시키는 개선된 모유 수유를 위한 방법{METHOD FOR IMPROVED BREAST MILK FEEDING TO REDUCE THE RISK OF ALLERGY}
본 발명은 유아 수유 목적으로 개선된 모유를 위한 유산균(lactic acid bacteria)의 선별과 용도에 관계한다.
알레르기 질환의 위생 가설에서는 선진화된 지역에서 환경적 변화가 유년기에 미생물 접촉을 감소시켜 아토피성 습진(atopic eczema), 알레르기성 코결막염(allergic rhinoconjunctivitis), 천식과 같은 알레르기 질환의 급격한 유행을 유발한다고 제안한다. 논의되고 있는 이와 같은 한가지 환경적 변화는 개선된 위생, 생활수준, 식습관 등에 기인한 다양한 종류의 자연 미생물의 변화된 섭취이다. 이는 자연적인 장 균총의 구성에서 변화(Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2001; 108: 516-520)뿐만 아니라 수유 모체의 모유 조성에서 변화를 유도하였다. 이런 변화는 다양한 종류의 알레르기의 유행(prevalence)과 연관된다. 또한, 대가족의 후기 구성원인 유아는 초기에 태어난 형제(한 배 새끼 중에서 첫째)보다 알레르기 위험이 낮다. 이는 모체의 모유가 임신 횟수가 증가함에 따라 “개선”된다는 것을 암시한다.
모유는 면역계에서 중요한 다양한 성분, 예를 들면, 대식세포, 면역글로불린, 또는 항균 단백질을 함유하는데, 이들은 수유 자손의 위장과 호흡기에서 감염과 염증을 억제하는 것으로 생각된다. 이에 더하여, 다른 잠재적인 면역조절 인자(가령, 복합 올리고사카라이드, 성장 인자, 효소, 호르몬 또는 사이토킨)의 존재가 논의되고 있다. 인간 모유에서 영양분의 높은 이용가능성 및 낮은 항원 함량과 함께 이들 유익한 특성으로 인하여, 모유는 유아, 특히, 알레르기 병력이 있는 가계에 태어난 유아에게 생리학적으로 최고의 식품으로서 소아과 전문의에 의해 권장되고 있다.
이런 이유로, 모유는 유아에서 알레르기의 발병에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 일련의 사이토킨과 케모킨을 함유한다. 알레르기 반응을 조절하는 성분, 예를 들면, 사이토킨, 케모킨, 유착 분자는 다양한 수유(lactation) 단계에서 모유에 분비되는 것으로 이미 보고되었다(S Rudloff et al, Allergy 1999, 54, 206-211). 사이토킨 또는 케모킨은 수유 유아에 유익하거나 유해할 수 있다.
또한, 동물의 모유에 의해 전달되는 사이토킨은 자손의 GI 관을 통한 이동을 견딜 수 있는 능력을 보유하는 것으로 알려져 있다. 가령, 동형접합성 TGF-베타-1-녹아웃 생쥐는 이유(weaning)이후 확산된 염증 질환으로 폐사하는데, 이유 때까지는 모유로부터 TGF-베타의 이전에 의해 생존하는 것으로 보인다(Kulkarni AB et al., Am J Pathology 1993; 143, 3-9). TGF-베타는 결장으로의 이동을 견뎌낸다. IL-10 역시, 아마도 이런 방식으로 생존하고, 따라서 모유로부터 전달은 IL-10이 GI 관에 도달하여 유익한 소염 효과를 잠재적으로 유도할 수 있도록 한다.
더 나아가, Hawkes JS et. al., Lipids 2001 Oct 36:1179-81에서는 장쇄 다중불포화 지방산이 사이토킨 생산을 비롯한 면역 조절의 측면과 연관한다고 보고하였다. 이 연구의 목적은 모유에서 전환 성장 인자(transforming growth factor) 베타 1(TGF-베타-1)과 TGF-베타-2의 농도에 대한, 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)이 풍부한 참치 오일로 모체 식이 보충의 효과를 조사하기 위한 것이었다. 무작위 식이 개입(dietary intervention) 시험에서, 만삭(term infant)의 모체는 위약(n = 40), 300 ㎎ DHA(n = 40), 또는 600 ㎎ DHA(n = 40)를 함유하는 2000 ㎎ 오일의 일일 보충물(daily supplement)을 섭취하였다. 모유와 혈장에서 DHA 증가는 식이 DHA에 비례하였다. 모유 DHA 상태 및 TGF-베타-1과 TGF-베타-2 수준 간에는 상관관계가 존재하지 않았다.
IL-10은 널리 보고되고 수용되는 소염성 사이토킨이다. 이는 IL-10이 유아의 GI 관에서 소염 효과를 유도할 것이라는 것을 의미한다. 이는 유아에게 유익하다 - 모유는 일반적으로, 어린 시기에 장에서 나타나는 병원균/감염에 유아가 과잉반응하지 않는다는 점에서 유아에 대하여 소염성인 것으로 간주된다. 게다가, 동물 데이터는 모유에서 IL-10의 자손에 대한 이익 가능성을 암시한다. 한 오스트레일리아 그룹이 동물 모델에서 진드기에 대한 알레르기를 조사하였다. 진드기에 대한 피부 찌름 검사(skin prick test, SPT)에 음성인 동물은 IL-10과 IL-4를 생산하였는데, IL-10은 IgE(알레르기 반응)를 약화시키고, 이들 동물은 알레르기를 보이지 않았다. 알레르기성 SPT +ve(히스타민) 동물에서는 IL-4만 생산되고 IL-10 생산은 관찰되지 않았다. 이런 이유로, IgE가 약화되지 않고 알레르기가 유행하였다. 따라서, IL-10은 IgE의 알레르기-유도 효과를 약화시키고 알레르기 발병을 예방할 수 있다.
TGF-베타-2(전환 성장 인자) 역시 널리 보고된 성장 인자/사이토킨이다. 이의 출처는 예로써, 수 ㎎ 양의 TGF-베타/㎏의 양을 산출하는 혈소판이다. 상기 인자와 이의 동종형(isoform)은 다른 조직으로부터도 분리될 수 있고(microgram TGF/㎏) 비장과 뼈 조직에서 우세하게 발견된다. 인간 모유 역시 이 인자를 함유하는데, 이는 예로써 대식세포(TGF-베타-1), 림프구(TGF-베타-1), 내피세포(TGF-베타-1), 각화세포(TGF-베타-2), 과립층 세포(TGF-베타-2), 연골세포(TGF-베타-1), 교모세포종(glioblastoma) 세포(TGF-베타-2), 백혈병 세포(TGF-베타-1)에 의해서도 합성된다.
세포 유형과 조건에 따라, TGF-베타의 분비는 스테로이드, 레티노이드(retinoid), EGF(상피 성장 인자), NGF, 림프구 활성인자, 비타민 D3, IL-l을 비롯한 다수의 상이한 자극으로 유도될 수 있다. TGF-베타의 합성은 EGF, FGF(섬유아세포 성장 인자), 덱사메타손(dexamethasone), 칼슘, 레티노이드, 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone)에 의해 저해될 수 있다. TGF-베타는 그 자체 유전자의 발현에도 영향을 주는데, 이는 상처 치유에 중요할 수 있다. TGF-베타는 TGF-알파와 무관한 적어도 5가지 동종형, 다시 말하면, TGF-베타-1, TGF-베타-2, TGF-베타-3, TGF-베타-4, TGF-베타-5로서 존재한다. 이들 동종형의 아미노산 서열은 70-80% 상동성(homology)을 보인다. TGF-베타-1은 우성 형태로서, 거의 모든 곳에서 발견되는 반면, 다른 동종형은 세포와 조직의 더욱 제한된 스펙트럼에서 발현된다. 상이한 종으로부터 분리된 동종형은 진화적으로 밀접하게 보존되고, 98%의 서열 상동성을 갖는다. 성숙 인간, 돼지, 유인원, 소 TGF-베타-1은 동일하고, 단일 아미노산 위치에서 뮤린 TGF-베타-1과 상이하다. 인간과 닭 TGF-베타-1 역시 동일하다.
게다가, 전환 성장 인자 베타(TGF-베타) 집단의 구성원은 조직 형태형성(morphogenesis)과 성장에서 핵심적인 역할을 수행하는 다면발현성(pleiotropic) 사이토킨인 것으로 보고되었다(Ingman WV, Bioessays 2002 Oct 24:904-14). TGF-베타-1, TGF-베타-2, TGF-베타-3은 발생과 순환 리모델링이 유아기와 성인기에도 지속되는 포유동물 재생 조직에서 풍부하게 존재한다. TGF-베타에 대한 잠재적인 역할은 생식선과 2차 생식 기관 발달, 정자발생(spermatogenesis)과 난소 기능, 임신의 면역조정(immunoregulation), 배아 착상, 태반 발달에서 확인되었다.
Rautava et.al., Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 38:378-388, April 2004에서, TGF-베타-2와 IL-10은 TGF-베타-2가 IL-1O의 생산을 조장하는 상승적인 방식으로 기능하는 것으로 보고되었다.
유선염(mastitis)은 종종, 압통(tenderness)과 홍반(erythema) 및 가끔, 열병으로 특성화되고 TGF-베타-2와 관련된 유방의 염증이다. 유선염동안, 유방 폐포 세포(mammary alveolar cell)의 단단한 접점이 개방되는데, 이런 과정은 모유에서 나트륨, 염증 세포, 염증과 면역 매개물질의 증가를 동반한다. 유선염은 통상적으로 한쪽에만 제한되고, 수유이후 첫 몇주동안 최대로 발생된다. 선진화된 국가에서, 유선염은 일반적으로, 사망률(morbidity)이 낮은 문제로서 간주되는데, 발병된 여성은 주로 조산사(midwife)와 전문간호사로부터 치료를 받는다. 유선염은 미국, 핀란드, 오스트레일리아에 거주하는 수유기 여성을 추적한 대규모 종단적 연구(Semba R., Annals of the New York Academy of Sciences. November 2000;918: 156-62)에서 20-33%의 여성에서 임상적으로 명백한 유선염이 발병하는 것으로 나타남에 따라, 이전에 생각했던 것보다 훨씬 빈번한 것으로 보인다. 이런 이유로, 준임상적(sub-clinical) 유선염을 앓는 수유기 여성의 숫자는 논리적으로, 이보다 많다.
유선염은 최근에, 모유에서 더욱 높은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 하중 및 HIV의 모자 감염(mother-to-child transmission)의 더욱 높은 위험과도 연계되었다(Semba, R.D., N. Kumwenda, T.E. Taha, et al. 1999. Mastitis and immunological factors in breast milk of human immunodeficiency virus-infected women. J. Hum. Lact. 15(4): 301-306).
모유에서 TGF-베타-2는 B-와 T-세포를 비롯한 많은 다른 세포에 의해 합성되기도 하지만, 상피로부터 대부분 기원한다. 이런 이유로, TGF-베타-2의 증가된 수준은 준임상적 유방 염증의 매개인자 또는 이의 결과물일 수 있다. 모유에서 나트륨과 칼륨 비율(Na/K 비율)은 감염 및 준임상적 유방 염증의 널리 공지된 예측인자로서 언급된다.
또한, Kalliomaki et.al., J Allergy Clin Immunol. 1999 Dec; 104(6): 1251-7에서는 초유(colostrum)에서 TGF-베타가 독점적인 수유동안 알레르기 질환의 발병을 예방하고 인간 개체에서 특이적인 IgA 생산을 촉진한다고 제안하였다.
더 나아가, 인간 및 다른 포유동물의 신체의 다양한 부위에는 다수의 상이한 락토바실러스(Lactobacillus) 종을 비롯한 많은 상이한 박테리아 종이 서식한다. 이들 박테리아는 숙주와 오랜 기간 공존하면서 오늘날 박테리아의 실제 균주에 의존하는 것으로 알려져 있는 다양한 종류의 상승적으로 유익한 효과를 제공한다. 상이한 유산균 균주, 예를 들면, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112는 그들의 표면에, 또는 상기 박테리아에 의해 모체의 위장관에서 방출되는 특이적인 항원을 보유한다. Valeur et al., AEM, 70, 1 176-1181(2004)에 제공된 데이터는 섭취된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112가 한가지 실례로서 건강한 인간의 회장에서 CD4+ T-보조 세포의 수준에 영향을 줄 수 있음을 보여준다. 이런 결과는 다른 포유동물 종과 조류에서도 관찰되었으며, 이 과정이 장 균총과 숙주 사이의 근본적인 신호전달 시스템임을 지시한다. 소위 장-유방 링크(entero-mammary link)를 통하여, 활성 균주로부터 항원은 GI 관의 상피 아래 림프 영역, 다시 말하면, 파이어 소절(Peyer's patch)로 활발하게 수송된다. 그 다음, 항원-특이적 B-세포가 활성화되고, 이후 이들은 순환을 통하여 GI 관 상피로부터 타액선과 유선을 비롯한 신체내 다른 점막으로 이동한다. 이들 세포에서 특정 분자의 발현은 상기 조직에 이들의 유착을 유도하는 것으로 생각된다. 유선에서 이들 면역 세포는 국소적으로 생산되는 사이토킨의 수준을 결정하는 다른 과정을 유도한다. 장-유선 링크를 통한 이런 유형의 신호전달은 모유에서 분비 IgA의 생산에서 예증되었고, 사이토킨 생산에도 적용될 가능성이 높다.
기존 문헌(Laiho et al, Pediatric Research 53:642-647, 2003)에서는 모유에서 영양 인자와 염증 인자 사이에 관찰된 연관이 모체의 식이 개입(dietary intervention)으로 모유의 면역학적 특성에 영향을 줄 수 있음을 입증한다고 제안하였다. 또한, 이들 저자들은 알레르기 질환을 앓는 모체가 알레르기 질환이 없는 모체와 비교하여 모유에서 더욱 낮은 농도의 TGF-베타-2를 보유한다고 주장하였다. 이들의 연구에서 IL-10은 모유에서 자연적으로 관찰되는 낮은 수준과 빈도로만 탐지되었고, 알레르기 질환을 앓는 모체와 그렇지 않은 모체 사이에 차이가 없었다. 알레르기 질환으로부터 보호는 주로 TGF-베타-2와 IL-10에 대한 경구 내성(oral tolerance)의 유도를 통하여 달성되고, 특히 모유 TGF-베타-2가 알레르기 질환의 예방과 관련하여 중요한 역할을 수행하는 것으로 제안되었다. 하지만, Weiner H.는 Microbes and Infection, Volume 3, Issue 11, September 2001, pages 947-954에서, 경구 항원에 의해 발생된 조절 T 세포가 항원-특이적 방식으로 유인되긴 하지만 항원-비특이적 방식으로 억제되기 때문에, 이들이 표적 기관에서 자가-항원을 직면했을 때 구경꾼 억제(bystander suppression)를 매개한다고 보고하였다. 따라서, 점막 내성(mucosal tolerance)은 성격상 자가면역이 아닌 염증 과정을 치료하는데 이용될 수 있다.
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)를 비롯한 상이한 락토바실러스(Lactobacillus) 종이 소위 생균 조성물에 이용되는데, 이는 인간을 비롯한 동물에 살아있는 유익 미생물을 제공하는 것을 목적한다. 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)는 동물의 위장관의 자연 발생 서식균의 하나이며, 통상적으로 인간을 비롯한 동물의 장에서, 때때로 출생 채널(birth channel), 모유, 입에서 발견된다. 이는 항균 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다(참조: U.S. Patent No. 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238, 5,849,289). 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 세포가 혐기성 조건하에 글리세롤의 존재에서 성장되는 경우에, 이들은 루테린(β-하이드록시-프로피온알데히드)로 알려져 있는 항생 물질을 생산한다.
유산균은 이미, 다양한 종류의 알레르기를 예방하고 치료할 수 있는 것으로 보고되었다(가령, 새로운 재조합 균주와 관련하여 EP 1239032(Stadler et al.); 락토바실러스(Lactobacillus)로 IgE의 양을 감소시키는 것과 관련하여 WO 01/37865).
이런 이유로, 본 발명은 유아 수유 목적으로 개선된 모유를 위한 선별된 유산균과 이의 성분 및 이런 선별 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 더욱 정확하게는, 본 발명은 수유 유아(feeding baby)에서 알레르기의 발병 위험을 감소시키고, 이와 동시에 모유에서 TGF-베타-2의 원인과 양을 감소시켜 수유 모체(feeding mother)에서 유선염(mastitis)의 발병 위험을 감소시키기 위하여 모유에서 소염성 사이토킨 IL-10의 수준을 증가시키는 것을 목적으로 한다.
이런 이유로, 본 발명은 수유 이전과 수유 동안, 특별하게 선별된 유산균 균주를 모체에 제공함으로써 미생물 균총(microbial flora)에서 부정적 변화를 보충하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 유관한 세포형에 대한 검사 균주의 특이적인 사이토킨 영향을 구별하는 본 명세서에 기술된 방법 또는 유사한 방법을 이용하여 특정 유산균 균주를 선별하고; 모유 선(breast milk gland)과 다른 조직에서 준임상적 염증의 낮아진 수준 및 이에 다른 유선염의 감소된 위험을 지시하는 모유에서 IL-10의 증가된 생산과 TGF-베타-2 수준의 감소를 촉진하기 위하여 이런 유산균 균주를 이용하는 것을 목적으로 한다. 유선염과 준임상적 유선염은 수유를 간섭하고, 따라서 모유가 유아에게 제공하는 이점을 차단하는 것으로 간주될 수 있다 - 본 발명의 방법으로 선별된 락토바실러스(Lactobacillus)는 모체 건강을 개선하여 이들이 더욱 오랜 기간동안 모유를 생산할 수 있도록 한다.
또한, 본 발명은 인간을 비롯한 동물 투여용 약품을 비롯하여, 상기 균주, 변이체, 대사산물 또는 이의 성분을 함유하는 산물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다른 목적과 이점은 아래의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백하다.
본 발명의 요약
본 발명은 유아 수유를 위한 모유를 개선하는, 더욱 정확하게는 모유에서 소염성 사이토킨 IL-10의 수준을 증가시키고; 수유 유아(feeding baby)에서 알레르기의 발병 위험을 감소시키고, 이와 동시에 모유에서 TGF-베타-2의 원인과 양을 감소시키는 능력의 관점에서 선별된 락토바실러스(Lactobacillus) 균주와 이의 성분에 관계하는데, 이는 수유 모체(feeding mother)에서 유선염(mastitis)의 발병의 감소된 위험 및 모유 제공 능력, 전반적인 보호, 모유가 유아에게 제공하는 최적 성장에서 향상을 의미한다. 또한, 본 발명은 이런 락토바실러스(Lactobacillus) 균주의 선별 방법에 관계한다. 또한, 본 발명은 활성 성분의 전달 수단으로서, 조제된 오일 산물에서 생존 락토바실러스(Lactobacillus)를 보호하는 신규한 방법에 관계한다.
본 발명의 다른 목적과 특징은 아래의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백하다.
본 발명은 유아 수유를 위한 모유를 개선하는, 더욱 정확하게는 모유에서 소염성 사이토킨 IL-10의 수준을 증가시키고; 수유 유아(feeding baby)에서 알레르기의 발병 위험을 감소시키고, 이와 동시에 모유에서 TGF-베타-2의 원인과 양을 감소시키는 능력의 관점에서 선별된 락토바실러스(Lactobacillus) 균주와 이의 성분에 관계하는데, 이는 수유 모체(feeding mother)에서 유선염(mastitis)의 발병의 감소된 위험 및 모유 제공 능력, 전반적인 보호, 모유가 유아에게 제공하는 최적 성장에서 향상을 의미한다.
실시예 1. 균주의 선별 방법
본 발명에 이용될 수 있는 락토바실러스(Lactobacillus) 균주의 선별은 아래의 단계적 방식으로 수행될 수 있다:
균주 선별을 위한 락토바실러스 ( Lactobacillus ) 균주의 세포에 의한 인간 모유에서 IL-10 생산과 TGF-베타-2 감소의 자극 평가
이는 선별 방법의 한 예이다; 이 방법의 특정 개변이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 달성될 수 있다.
재료와 방법
동물: 51마리의 무균 BALB/c 생쥐(수컷과 암컷)를 Wisconsin University(USA)로부터 구입한다. 이들 생쥐는 무균 플라스틱 필름 수송기에 담겨 수송된다. 15마리의 생쥐를 3개의 격리장치(격리 장치 # 2, 3, 4)에 각각 이전한다. 각각 2마리 수컷과 4마리 암컷이 포함된 2개의 우리를 격리장치 #1(사육장치) 에 위치시킨다.
동물 취급
생쥐는 무균 유연성 필름 격리장치(Class Biologically Clean, Ltd, Madison, WI, USA)에 유지시킨다. 격리장치는 0.1% Naconal(Stepan Co., Rocksport, IL. USA)을 함유하는 2% 과초산(peracetic acid)(FMC Corporation, Philadelphia, PA, USA) 용액으로 멸균한다. 5마리 내지 6마리를 스테인리스강 와이어 격자가 달린 과초산 멸균된 폴리스티렌 우리에 수용한다. 동일 성(性)의 생쥐를 각 우리에 위치시킨다. 생쥐는 압열멸균 Agway rodent chow 3500(Agway, Granville, Creedmoore, NC, USA)을 공급한다. 사료, 물, 깔짚은 압열멸균한다. 사료와 깔짚은 스테인리스강 실린더 내에서 압열멸균하고, 이후 무균 상태에서 분리장치로 이전한다. 수돗물이 담긴 병을 압열멸균하고, 이후 분리장치에 위치시킬 때 과초산으로 멸균한다. 모든 생쥐는 사료와 물을 자유롭게 섭취한다. 사료와 물 수준은 매일 점검한다. 깔짚은 주1회 교체한다. 이들 동물은 12시간 명암 주기에 유지시킨다. 실온과 상대 습도는 매일 점검한다.
박테리아
검사되는 유산균은 생화학적 기술과 분자생물학적 기술로 확인하고 특성화한다. 이들 락토바실러스(Lactobacillus) 균주는 먼저, 10 ㎖의 Man-Rogosa-Sharp(MRS) 배지(BBL, Cockeysville, MD)에서 성장시키고 37℃에서 18시간동안 배양하며, 이후 90 ㎖의 MRS로 이전하고 37℃에서 18시간동안 배양하며 1000 ㎖의 MRS로 이전한다. 37℃에서 18시간 배양한 이후, 배양액은 냉각된 원심분리 기(SORVALL RC2-B, SORVALL, Norwalk, CN, USA)에서 10분간 3000 rpm으로 회전시키고, 상층액은 따라 버리고, 펠릿은 10분간 3000 rpm에서 무균 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세척한다. 각 균주의 펠릿은 30 ㎖의 PBS에 재-부유시킨다. 배양액은 1.2-㎖ 냉동바이알(cryovial)에 위치시키고 이용 때까지 -70℃에 보관한다. 이들 박테리아를 생쥐에 제공하기에 앞서, 배양액의 순도와 농도를 점검한다. 락토바실러스(Lactobacillus) 현탁액의 연속 1/10 희석액은 1.5% 아가가 포함된 MRS 배지 평판에 배양하고 혐기성 발생장치(Anaero Gen:Oxoid Ltd., Wake Road, Basingstoke, Hampshire, England, GB)를 포함하는 혐기성 병(GasPaK:BBL, Cockeysville, MD, USA)에서 37℃에서 48시간동안 배양한다. 배양액은 집락 형태와 루테린(reuterin) 생산을 검사한다.
검사 처리물(본 실시예에서 )
대조.
균주: 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) SD2112, ATCC 55730.
균주: 락토바실러스(Lactobacillus) 4000
균주: 락토바실러스(Lactobacillus) 4020
락토바실러스 ( Lactobacillus ) 집락화(colonization)의 결정
생쥐를 분리장치에 위치시킨 이후 익일에, 각 우리에서 생쥐로부터 분변 샘플을 채취하여 미생물의 부재를 검사한다. 생쥐는 11:00 am에서부터 7:00 pm까지 물 공급을 중단한다. 이후, 200 ㎖의 물을 포함하는 각각의 병에 1.2 ㎖의 유산균 현탁액을 첨가하고 생쥐에게 제공한다. 분리장치 #2의 생쥐는 락토바실러스 루테 리(L. reuteri) SD2112를 섭취한다. 물에 첨가된 현탁액은 2.0 x 1010 cfu/㎖의 락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112를 함유한다. 분리장치 #4의 생쥐는 락토바실러스(Lactobacillus) 4000 균주를 섭취하고, 분리장치 #5의 생쥐는 락토바실러스(Lactobacillus) 4020 균주를 섭취한다. 각 물병에 첨가되는 유산균 현탁액은 3.0 x 1010 cfu/㎖를 함유한다. 분리장치 #3의 생쥐는 물만을 섭취한다(대조). 각 분리장치에서 생쥐(우리 군(cage group))로부터 분변 샘플(10개의 펠릿)은 매주 채취하여 유산균 집락화 및 다른 미생물로의 가능 오염을 검사한다.
변화된 쇠들러 ( schaedler ) 균총으로 “양식화( Conventionalization )”
검사 균주로 집락화이후 60일 시점에, 생쥐는 변화된 쇠들러 균총으로 “양식화”된다. 변화된 쇠들러 균총을 보유하는 C3H 생쥐는 Taconic Farms, Inc.(Germantown, NY, USA)로부터 구입하였다. 2마리 생쥐를 각 분리장치에 위치시키고 분변 샘플을 즉시 채취하여 검사 균주의 존재를 검사한다. 대조 생쥐 및 검사 균주로 집락화된 생쥐는 하룻밤동안 물 공급을 중단한다. 다음날, C3H 생쥐로부터 채취한 10개의 분변 펠릿은 각각의 음용수 병에 넣고 물에 부유시키며 생쥐에게 공급한다. 이런 절차는 3일 연속 반복한다. BALB/c와 C3H 생쥐로부터 분변은 한 달 동안 주1회 채취하여 변화된 쇠들러 균총 집락화 및 검사 균주의 존재를 검사한다.
*평가
검사 균주로 단일집락화(monocolonization)이후 45일 시점 및 양식화이후 30 일 시점에, 각 처리 군으로부터 5마리 생쥐를 안락사시키고, T-림프구 분리와 사이토킨 결정을 위하여 이들 동물로부터 비장 샘플을 채취한다.
비장 세포의 준비: 비장은 무균 상태에서 떼어내고 차가운 PBS + 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) + 0.1% 아지드화나트륨(sodium azide)(NaN3)(Sigma)에 위치시킨다. 각 비장으로부터 단일 세포 현탁액은 이를 5 ㎖의 RPMI-1640 배지(Sigma) + 0.1 ㎎/㎖의 젠타마이신(Sigma)로 살포함으로써 제조된다. 세포 현탁액은 15 ㎖ 무균 원뿔형 튜브로 이전하고 냉각된 원심분리기에서 2000 rpm으로 10분간 원심분리한다. 상층액은 따라 버리고, 각 튜브로부터 적혈구 세포는 이들 세포를 0.5 ㎖ PBS 1X에 재부유시키고 9 ㎖의 증류수를 첨가하며 충분히 혼합하고, 최종적으로 1 ㎖의 PBS 1OX를 신속하게 첨가하고 충분히 혼합함으로써 용해된다. 현탁액은 상기한 바와 같이 원심분리하고, 상층액은 따라 버리고, 이후 이들 세포는 5 ㎖의 RPMI-1640 완전 배지에 재부유시킨다. 현탁액 샘플은 현미경하에 검사하고, 세포 이외의 다른 입자가 존재하면 현탁액은 무균 나일론 천을 통하여 여과하고 다시 한번 원심분리한다. 펠릿은 5 ㎖의 완전 RPMI-1640 배지에서 재부유시키고 2회 세척하며, 최종적으로 5 ㎖의 완전 배지에서 재부유시킨다. 세포 생존능(cell viability)은 트리판 블루(trypan blue)(Sigma) 배제로 결정한다. 20 ㎕의 세포 현탁액은 380 ㎕의 0.1% 트리판 블루 용액(1:20 희석)에 희석하고 혈구계(hematocytometer)에서 산정한다. 세포 현탁액의 농도는 완전 RPMI-1640에서 1.0 x 106 세포/㎖로 조정한다.
세포 배양: 세포는 유도 물질(inducing agent), 예를 들면, 콘카발린(Concavalin) A (5 ㎍/㎖), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로부터 LPS(1 ㎍/㎖), 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA; 10 ng/㎖), 이노마이신(I; 0.5 ㎍/㎖), 열 불활화된 락토바실러스 루테리(L. reuteri)(4.5 ㎎ 단백질/㎖)의 부재(자극되지 않음)와 존재하에 RPMI-1640 완전 배지를 포함하는 무균 96 웰 편평-바닥 조직 배양 평판(Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에서 배양한다. 1.0 x 105개 세포를 보유하는 100 ㎕의 세포 현탁액 및 50 ㎕의 열 불활화된 락토바실러스 루테리(L. reuteri)(4.5 ㎎ 단백질/㎖)를 각 웰에 첨가한다. 각 세트는 5회 반복하여 작업한다. 세포 배양액은 5% CO2 대기하에, 유사분열원(mitogen)과 함께 37℃에서 48시간동안, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)와 함께 96시간동안 배양한다. 5개의 웰로부터 상층액을 수집하고 집합시키며 사이토킨 분석에 이용할 때까지 -70℃에서 보관한다.
사이토킨 정량: 사이토킨(IL-10, TGF-베타-2)은 제조업자에 의해 권장된 절차에 따라, 뮤린 Quantikine™ M 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용한 ELISA로 상층액에서 측정한다.
결과
사이토킨은 생물학적 반응 조절인자로서 기능하는 면역계 단백질이다. 이들은 항체와 T 세포 면역계 상호작용을 조정하고 면역 반응성을 증폭한다. 사이토킨에는 대식세포에 의해 합성되는 모노카인(monokine) 및 활성화된 T 림프구와 자연 킬러(NK) 세포에 의해 생산되는 림포카인(lymphokine)이 포함된다.
락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112 검사 균주는 균주 4000, 4020 또는 대조 생쥐로부터 세포보다 높은(P<O.05) IL-10 농도를 보인다. TGF-베타-2 수준 역시 SD2112 균주에서 더욱 높다. 상기 균주는 본 발명에서 선별된다.
b. 락토바실러스 ( Lactobacillus ) 균주 세포에 의한 인간 모유에서 IL -10 생산과 TGF-베타-2 감소의 자극 확인
본 실시예에서는 선별된 균주가 생체내에서 유익한 효과를 제공한다는 것을 확인한다. 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), ATCC 55730(The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)을 검사한다. 상기 검사 락토바실러스(Lactobacillus) 균주는 MRS 액체배지(Difco)에서 성장시키고 1000 x g에서 원심분리로 지수적 성장기동안 수거하며 인산염 완충액(PBS; pH 6.8)으로 2회 세척하고 동일 완충액에서 재-부유시킨다. 이후, 배양액은 아래 실시예 3에 기술된 방법에 따라, 유적(oil drop) 산물로 조제한다.
본 연구는 선별된 유산균의 알레르기에서 잠재력을 확인하는 이중 맹검, 위약 통제된 연구이며, Jonkoping, Motala, Norrkoping의 지역 병원과 Linkoping 대학 병원(Sweden)의 소아과에서 수행되었다.
알레르기 질환의 병력이 있는 가계로부터 임신 여성은 출산에 앞서 4주동안 무작위로, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) SD2112, ATCC 55730(일일 분량 1x108 CFU), 또는 위약을 경구 복용하였다. 알레르기 질환의 병력은 한 명의 숙련된 알레르기 연구 간호사에 의한 전화 인터뷰로 확인하였다. 전체 232 가계가 시험에 포함되었고 2001년 1월부터 2003년 4월까지 실험 군과 위약 군간에 균등하게 무작위화되었다.
연구 산물의 사용된 병을 수집하고 여기에 남아있는 것을 평가함으로써 순응도(compliance)를 사정하였다.
방법
본 연구에는 109명의 모체로부터 출산후 첫 3일 이내에 획득된 초유 및 출산이후 1개월 시점에 획득된 성숙 모유가 이용된다. 모유 샘플은 수동 유축기(breast pump)를 이용하여 무균 플라스틱 튜브로 수집하고 분석 때까지 -70℃에서 보관하였다.
해동이후, 모유 샘플은 원심분리하여 지방과 세포 구획을 제거하였다(Bottcher, 2000). 남아있는 유장(whey)은 IL-10의 양과 관련하여 즉시 분석하고, 나머지 유장은 분량으로 -70℃에서 보관하고, 이후 TNF-α, IL-4, TGF-베타-1, TGF-베타-2, 가용성 CD14(sCD14), 전체 IgA, 분비성 IgA(slgA), 나트륨과 칼륨에 관하여 분석하였다. TGF-베타-1, TGF-베타-2, sCD14(가용성 CD14)의 수준은 제조업자의 권고에 따라, 상업용 ELISA 키트(R&D Systems, Abingdon, UK)로 분석하였다. TGF-베타-1과 TGF-베타-2의 분석은 기존 문헌(Bottcher 2000)에 기술된 바와 같이, 잠재성 TGF-베타를 전활성화시키는 산 처리(acid treatment)이후 수행하였다. IL-10과 TNF-α의 수준은 제조업자의 프로토콜에 따라, 상업용 ELISA 시약 키트(CLB PeliPair 시약 세트, Amsterdam, the Netherlands)로 측정하였다. 검출의 하한선은 TGF-베타-1과 TGF-베타-2의 경우 62.5 pg/㎖, sCD14의 경우 250 pg/㎖, IL-10의 경우 2.3 pg/㎖, TNF-α의 경우 7.8 pg/㎖이었다.
전체 IgA와 slgA는 기존 문헌(Bottcher 2000)에 기술된 바와 같이, ELISA로 분석하였다. 검출의 하한선은 양 검사 모두에서 31.2 ng/㎖이었다. 나트륨과 칼륨 수준은 표준 절차(이온 선별성 전극)에 따라, Linkoping 대학 병원의 임상 화학과(Clinical Chemistry Department)에서 측정하였다. 한 패널의 흡입 알레르기에 대한 혈청 IgE 수준은 UniCapPharmacia CAP System™ Phadiatop(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)으로 분석하였다.
통계학적 분석
연구 군의 크기는 위약 군과 비교하여 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 군에서 임상적 양상(clinical manifestation)의 진정한 차이를 탐지하는 80% 효능(power)을 추정하여 산정하였다. 이런 산정은 알레르기 또는 습진의 임상적 양상이 위약 군에서 개체의 적어도 40%에서 발생하고 실험 군에서 절반으로 감소될 수 있다는 추정에 기초한다. 필요한 인원은 군(group)으로 평가될 수 있는 91명의 개체이었고, 중도탈락 빈도(dropout frequency)는 25%인 것으로 추정되었다. 무작위화 목록은 외부 기업에 의해 작성되었고, 4의 블록 크기(block size)에서 센터별로 분류되었다. 예상된 중도탈락 빈도와 블록 크기를 비롯한 상기 산정에 기초하여, 등록이 필요한 개체의 전체 인원수는 군당 116명의 여성과 이들의 자손으로 판단되었다.
윤리적 고려사항
인간 개체를 대상으로 하는 의료 연구에 관한 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 의해, 참가자들은 문서로 작성된 정보를 제공받았고, 충분한 정보에 근거한 동의서에 서명하였다. 오일에 담긴 락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112 검사 균주는 충분히 보고되고 유아와 성인 모두에게 안전한 산물로서 간주되었고, 결과적으로 임신 여성과 이들의 자손을 등록시키는 것은 윤리적인 문제로서 간주되지 않았다.
또한, 여러 상이한 검사에서 본 연구 절차는 이런 위험 개체군의 상당수에서 알레르기 질환이 발병할 수 있어 알레르기 스크리닝 절차를 수행해야 한다는 사실과 관련하여 경미한 문제로서 간주된다. 본 프로토콜은 Linkoping 대학 병원의 윤리 검토 위원회(Ethical Review Board)로부터 승인을 받았다.
결과
본 연구에서는 임신 여성이 출산 4주전에 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 SD2112를 경구 복용하는 경우에 모유에 대한 효과를 조사하였다.
두 군을 비교하는 모체 프로필(maternal profile)은 유사하였다. 모체가 연구 산물을 매일 섭취한 주간(week) 총수는 1개월의 독점적인 수유에 관해서는 두 군간에 차이가 없었다. 최대 1월령까지 두 군에서 차이는 신생아 병실로의 위탁(배제 기준중의 하나)에 의해 주로 유발되었다. 두 군간에 차이는 관찰되지 않았다.
락토바실러스 루테리(L. reuteri) 검사 균주 군에서, 모유의 사이토킨 프로필은 위약 군에서 모체로부터 얻은 샘플(4.78 pg/㎖ [1.15 - 150])에서보다 초유 (평균 6.61 pg/㎖ [범위 1.15 - 150])에서 증가된 수준의 소염성 사이토킨 IL-10에 의해 변하였다(p = 0.046). 한편, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112 군에서 TGF-베타-2의 수준에서 감소가 관찰되었다. TGF-베타-2는 위약 군(965 pg/㎖ [211.7 - 2800])에서보다 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 군(평균 674 pg/㎖ [102.5 - 2800])에서 훨씬 낮았다(p = 0.020). 다른 파라미터의 수준은 두 군에서 유사하였다.
출산후 4주 시점 및 생균제의 매일 섭취의 중단이후 획득된 모유는 위약 군과 비교하여 차이를 보이지 않았다.
실시예 3: 선별된 균주를 함유하는 산물의 제조
본 실시예에서, “Reuteri Drops”이라는 제품이 제조된다. 이 산물은 우수한 안정과 반감기를 보유하고 락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112를 함유하는 오일-기초된 조성물이다. 생산 공정의 독특한 특징은 오일에서 대부분의 수분을 제거하는 오일의 건조 단계이다.
본 발명에 이용되는 오일은 순수한 식용 식물성 오일, 바람직하게는 해바라기 오일이다. 순수한 해바라기 오일과 같은 오일이 수분을 함유하지 않을 것으로 예상되긴 하지만, 오일을 진공하에서 건조시키는 가공 단계의 예상치 못한 효과는 조성물에서 락토바실러스(Lactobacillus)의 현저하게 증가된 안정성이다. 이런 이유로, 본 발명에 이용된 오일은 수분이 제거될 수 있는 오일이어야 한다. 이들 배양액의 안정성이 조제물의 수분활성도(water activity)와 밀접하게 상관하는 것은 이미 알려져 있었지만, 락토바실러스(Lactobacillus)의 안정화를 위하여 오일을 진 공하에 건조시키는 것은 알려진 바가 없다.
제조 공정의 설명
선호되는 제조 공정의 흐름도는 도 1에 도시한다. 본 발명에 이용될 수 있는 이와 같은 한가지 가능 공정의 상세는 아래와 같다.
1. 성분의 혼합: Bolz 혼합 기계/탱크(Alfred BOLZ Apparatebau GmbH, Wangen im Allgau, Germany)에서, 중간-사슬 트리글리세리드(가령, Akomed R, Karlshamns AB, Karshamn Sweden)와 해바라기 오일(가령, Akosun, Karlshamns)을 실리콘다이옥사이드(Cab-o-sil M5P, M5P, Cabot)와 혼합한다.
2. 균질화(homogenization): 싸인 펌프(Sine pump)와 디스팩스(dispax)(Sine Pump, Arvada, Colorado)를 Bolz 혼합기에 연결하고, 혼합물을 균질화시킨다.
3. 진공-건조: 혼합물을 Bolz 탱크에서 10 mBar 진공하에 12시간동안 건조시킨다.
4. 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 첨가: 대략 20 ㎏의 건조된 오일 혼합물을 50 ℓ 스테인리스강 용기로 이전한다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 분말(가급적, 동결-건조됨; 사용된 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 양은 오일에서 요구되는 양에 따라 변화되지만 한가지 실례로써 1011 CFU/g를 갖는 0.2 ㎏ 배양액이 첨가된다)을 첨가한다. 이를 균질해질 때까지 천천히 혼합한다.
5. 혼합: 락토바실러스 루테리(L. reuteri)와의 전혼합물(premix)을 Bolz 혼합기로 환원한다.
6. 방출. 현탁액을 200 ℓ 유리 용기로 방출하고 질소를 덮어씌운다. 병에 충전할 때까지 현탁액을 용기에 유지시킨다.
도 1은 본 발명의 산물을 제조하는데 이용될 수 있는 제조 공정의 흐름도이다.

Claims (3)

  1. 제 8항에 있어서, 오일은 진공 건조 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 산물.
  2. 건조된 미생물 배양액의 증가된 생존을 가능하게 하는 오일 산물에 있어서, 상기 오일의 진공 건조 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 오일 산물.
  3. 활성 성분으로 생존 락토바실러스(Lactobacillus)의 건조된 배양액 및 진공 건조된 식용 식물성 오일을 함유하는 모유 수유유아에서 알레르기 예방용 약학 조성물.
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