KR20080032246A

KR20080032246A - 시료 용액중의 알부민의 분석방법

Info

Publication number: KR20080032246A
Application number: KR1020087004763A
Authority: KR
Inventors: 가즈유키 구보타; 나오유키 야마다; 겐지 다케하나; 아사미 가와카미; 아키라 나카야마
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2005-07-27
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2008-04-14
Also published as: CN101273267A; US20080138846A1; EP1912065B1; CN101273267B; EP1912065A4; US7833798B2; WO2007013679A1; EP1912065A1; JP5024044B2; JPWO2007013679A1; KR101075012B1

Abstract

본 발명은 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 제공하기 전의 시료 용액의 전처리 방법에 특징을 갖는 시료 용액중의 알부민의 분석방법, 시료 용액중의 산화형 알부민과 환원형 알부민의 존재량 및 이들의 존재 비율을 정밀하게 안정적으로 분석하는 방법, 및 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 알부민 표준 시료를 제공한다.

알부민의 분석방법, 산화형 알부민, 환원형 알부민

Description

시료 용액중의 알부민의 분석방법{Method for analysis of albumin in sample solution}

본 발명은 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피를 사용하여 시료 용액중의 알부민을 분석하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 제공하기 전의 시료 용액의 전처리 방법에 특징을 갖는 시료 용액중의 알부민의 분석방법, 시료 용액중의 산화형 알부민과 환원형 알부민의 존재량 및 이들의 존재 비율을 정밀하게 안정적으로 분석하는 방법, 및, 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 알부민 표준 시료에 관한 것이다.

알부민은 생체내에 가장 다량으로 널리 분포하여 존재하고 있는 단백질이다. 사람 알부민은 아미노산 585개로 이루어지며, 분자량 66kDa이고, 분자내에 17개의 디설파이드 결합과 1개의 유리(遊離) 시스테인 잔기를 갖는 단순 단백질이다. 알부민은 간장에서 만들어지고, 혈액중으로 분비된다. 알부민은 전 혈장중에 존재하는 단백질의 약 60%를 차지하며, 이의 생리 기능으로서는, (1) 혈장 삼투압의 조절·유지, (2) 빌리루빈, 아미노산, 지방산, 호르몬, 금속 이온, 약물 등의 수송, (3) 영양 불량시의 아미노산 공급원, (4) 산화·환원 완충능 등이 알려져 있다. 특히, 약물과 알부민의 결합은 약물의 약효 발현에 크게 관여하고 있다. 이와 같이 알부민은 다양한 기능을 갖는 단백질이다.

생체내의 알부민에 관해서는, 환원형 및 산화형 알부민, 당화 알부민 등의 불균일성의 존재가 알려져 있다. 특히, 당뇨병에서는 일반적으로 알부민의 당화가 진행되는 것으로 보고되어 있고[참조: Suzuki E., Diabetes Res. 18(3), 153-158, 1992], 당이 결합하여 생성하는 당화 알부민은 헤모글로빈 Alc와 동일하게 혈당 상태를 모니터하는 마커로서, 당뇨병 임상의 장에서 주목받고 있다.

한편, 생체내에서의 환원형 알부민(Alb(red)) 및 산화형 알부민(Alb(ox))의 존재에 관해서도 생체의 질환과 관련이 있는 것이 알려져, 최근 주목받고 있다. N 말단으로부터 34번째의 시스테인의 SH기가 유리된 Alb(red)에 대하여, 34번째의 시스테인의 SH기에 시스테인 등의 황 함유 생체내 화합물이 디설파이드 결합으로 부가된 Alb(ox)가 혈중에 존재하고 있는 것이 알려져 있다[참조: Era S, Int. J. Peptide Protein Res. 31, 435-422, 1988].

디설파이드 결합은 단시간에 가역적으로 결합·해리할 수 있기 때문에, Alb(red)와 Alb(ox)는, 생체내에서 동적인 평형상태를 유지하고 있게 된다. 따라서, 혈장내의 Alb(red)와 Alb(ox)의 존재비는, 혈중의 산화 환원 상태를 반영하고 있게 된다. 요컨대, 어떠한 산화 스트레스를 받은 경우, Alb(ox)의 존재비가 증가한다. 구체적으로는, 고령자, 네프로제 증후군, 인공 투석, 간질환 등의 환자에서 Alb(ox)가 증가하고 있는 것이 알려져 있다[참조: Sogami M., J. Chromatogr, 332, 19-27, 1985; Akiharu Watanabe, Phama Medica, 19, 195-204, 2001; Suzuki E, Diabetes Res Clin Pract, 18, 153-158, 1992]. 또한, 당뇨병에서는, 혈중 산화 산물의 증가나 항산화 효소 활성의 저하, 미소 혈관 장해에 관한 프리 라디칼의 생성으로 볼때, 환자는 산화 스트레스 상태에 있다고 생각된다[참조: Oberley LW, Free Radical Biol. Med., 5, 113-124, 1988].

산화 스트레스 상태는, 생체의 산화반응과 항산화반응의 균형이 무너져 산화반응으로 기울어진 생체에 바람직하지 못한 상태이다. 산화 스트레스에 의해, 세포의 DNA, 세포막상의 인산 지질, 단백, 당질이 상해를 받아, 혈관 상해가 진행되어 건강 상태가 악화된다고 한다. 이와 같이 산화 스트레스는, 노화나 여러 가지 병을 야기한다고 하며, 폴리페놀 등의 항산화작용을 갖는 물질이 건강에 좋은 것이 알려져 있다. 따라서, 생체내의 산화 상태를 간편하게 모니터할 수 있게 되면, 건강 상태의 모니터나, 약물이나 건강 소재의 스크리닝이 가능해진다.

산화형 알부민이 증가하는 대표적인 질환으로서는, 간경변이 알려져 있다. 간경변 환자는, 간장에서의 알부민 생산능이 저하됨으로써, 혈중의 알부민량이 저하된다. 이러한 저알부민 혈증의 치료로서, 사람 혈장 알부민 제제나 측쇄 아미노산 제제가 사용된다. 간경변 등의 간질환에 있어서는, 알부민량의 저하와 함께, 산화형 알부민이 증가한다[참조: Watanabe A, Netrition 20, 351-357, 2004].

또한, 신장 기능 장해[참조: Terawaki H., Kidney Int. 65(5), 1988-1993, 2004], 당뇨병[참조: Suzuki E., Diabetes Res. 18(3), 153-158, 1992], 류머티즘[참조: Narazaki R., Arch. Toxicol. 14, 351-353, 1998] 또는 노화[참조: Era S., Biochim. Biophys. Acta., 1247(1), 12-16, 1995] 등에 의해서도 산화 스트레스에 의한 산화·환원 균형의 변동이 생긴다.

이와 같이 알부민은 스스로 환원체·산화체를 형성함으로써, 생체의 산화·환원의 완충능을 완수하고 있다. 따라서, 산화형 알부민과 환원형 알부민의 존재비는 생체의 산화·환원 상태를 반영하고 있다고 생각할 수 있기 때문에, 생체내 혈중의 환원형·산화형 알부민 비를 정확하게 구할 수 있으면, 산화 스트레스에 기인하는 질환의 진행 상황이나 치료 효과, 또는 건강 상태를 예민하게 모니터하는 것이 가능해진다. 즉, 생체내 혈중의 산화형/환원형 알부민 비를 용이하게 구할 수 있으면, 질환의 진행도나 치료 효과, 건강 상태를 용이하게 판정할 수 있다.

Alb(red)와 Alb(ox)의 비를 구하는 방법에는 몇가지 방법이 있다. 첫번째는, 알부민의 정량법인 색소결합법을 응용한 것이다. 색소결합법에 사용되는 색소에는, 브롬 크레졸 그린(BCG)과 브롬 크레졸 퍼플(BCP)의 2종류가 사용되고 있다. BCP법은 Alb(red)과 Alb(ox)에 대한 반응성이 다르기 때문에, BCP법과 BCG법으로 구한 알부민 정량치의 차이는, Alb(ox)의 존재비를 반영하고 있다고 생각할 수 있다. 그러나, 본 방법은 현저히 정량성이 부족하다.

또한, 엘만(Ellman) 시약 등의 유리 SH기 정량 시약을 사용하여, Alb(red) 유래의 SH기를 정량하는 방법도 있다[참조: Sogami M, Int. Pept. Protein Res., 24(2), 96-103, 1984]. 그러나, 이러한 방법은 알부민 이외의 SH기를 갖는 물질과 구별할 수는 없다.

현재 가장 우수한 방법은 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하는 방법 이다[참조: Sogami M., J. Chromatogr, 332, 19-27, 1985; 일본 공개특허공보 제(소)61-155397; 일본 특허공보 제(평)2-4863]. HPLC에 의한 혈청 알부민의 분석에서는, 환원형 알부민(Alb(red))과 산화형 알부민(Alb(ox))을 분리하여 검출할 수 있다. 분리한 크로마토그램 위에서의 피크 면적비로부터, Alb(red)와 Alb(ox)의 총량에 대한 Alb(red)량의 비율(Alb(red)%=Alb(red)의 피크 면적/(Alb(red)의 피크 면적+Alb(ox)의 피크 면적)×100)을 구할 수 있다.

그러나, 현재의 HPLC법에는 몇가지 문제점이 있다. 첫번째 문제점은 시료의 안정성이다. 혈장중의 환원형 알부민은 매우 불안정하고, -20℃의 보존상태에서도 자연산화에 의해 산화형 알부민이 증가하여, Alb(red)% 값이 저하되어 버린다. 이러한 반응은 온도의 상승에 비례하고 있다. 따라서, 혈장의 보존은 적어도 -70℃ 이하가 아니면 안된다고 한다[참조: Ryozo Muramoto, Igakuno Ayumi, 198(13), 972-976, 2001]. HPLC법으로의 측정에서는, -70℃ 이하에서 보존한 혈장을, 융해후 즉시 HPLC 측정에 제공하지 않으면 안된다. 두번째 문제점은 Alb(red)과 Alb(ox)의 분리가 불충분한 것이다. Alb(red)와 Alb(ox)의 구조상의 차이는 매우 작기 때문에, HPLC로 이들을 완전히 분리하는 것은 매우 곤란하고, 크로마토그램 위에서 베이스라인을 분리할 수 없다[참조: Keiko Yasukawa, Rinsyou Kensa, 44(8), 907-910, 2000]. 세번째 문제점은 산화형 알부민의 구조 정보가 부족한 것이다. Alb(ox)는, 알부민의 N 말단으로부터 34 잔기째의 시스테인에, 디설파이드 결합에 의해, 시스테인이나 글루타티온 등의 황 함유 화합물이 결합한 것이지만, HPLC법에서 검출되는 Alb(ox)가 어떠한 구조인지는 HPLC법으로는 구체적으로 알 수 없다.

상기 두번째와 세번째 문제점을 해결할 가능성이 있는 방법으로서, 질량 분석계를 사용한 알부민의 분석방법이 최근 보고되었다[참조: Keiko Yasukawa, Rinsyou Kensa, 44(8), 907-910, 2000]. 최근의 질량 분석법의 진보는 눈부시며 분자량이 큰 단백질이라도 정밀하고 높은 질량 분해능으로 측정할 수 있게 되었다. Alb(ox)는, 부가한 화합물(예를 들면 시스테인)의 질량분, Alb(red)보다도 무거워진다. 따라서, 충분한 질량 분해능을 갖는 질량 분석계로 측정함으로써, Alb(red)와 Alb(ox)를 분리하여 검출하는 것이 가능해진다. 상기 문헌에서, 야스가와 등은 건강한 사람과 당뇨병 환자의 알부민을 전기분무 이온화법 질량 분석계(ESI-MS)로 측정하여, Alb(red)와 Alb(ox)의 검출, 또한 당화 알부민의 검출을 실시하고 있다.

그러나, 상기 첫번째 문제점은 ESI-MS법에 있어서도 여전히 동일하게 심각한 문제이다. -70℃ 이하가 아니면 혈장중의 산화형 알부민의 비율은 보존중에 증가되어 버리기 때문에, 샘플의 보존 관리가 엄격하다. 또한, 동결 보존한 혈장을 용해하여, 측정에 이를 때까지, 산화형 알부민의 비율은 시시 각각 증가되어 버리기 때문에, 측정치의 변동을 야기시켜 버린다. 따라서, 종래의 방법에서는, -70℃ 이하에서 보존한 혈장을 융해후, 즉시 HPLC 측정 또는 ESI-MS 측정에 제공하지 않으면 안된다. 측정까지의 시간이나 실온이 Alb(red)% 값의 불균일을 야기시켜 버린다. 또한, 분석의 정밀도를 높이기 위한 표준 물질을 안정적으로 보존할 수도 없기 때문에, 분석 정밀도를 관리하는 것이 매우 곤란하다. 또한, 오토 인젝터를 사용한 자동 분석이나 측정의 자동화·절력화가 곤란하다. 이로 인해, 환원형 알부 민과 산화형 알부민의 존재비의 측정은 아직 일반적으로는 보급되고 있지 않고, 특정한 연구기관에서만 실시되고 있는 것이 현재 상황이다. 또한, 현재 사용되고 있는 혈청 알부민 정량법은 주로 색소결합법이지만, 산화형과 환원형 알부민의 반응차가 있기 때문에 정확한 정량을 할 수 없는 것이 문제가 되고 있다[참조: Ryozo Muramoto, Rinsyou Kensa, 48(5), 537-544, 2004].

또한, 표준 시료는 분석 전반에 있어서, 분석의 정밀도와 확실도를 보증하기 때문에 중요하다. 산화형 알부민은 시스테인이나 글루타티온 등의 티올기를 갖는 화합물과 반응시킴으로써, 시험관내에서 작성하는 방법이 알려져 있다[참조: Gabaldon M., Arch. Biochem. Biophys. 431, 178-188, 2004]. 그러나, 상기와 같이 이러한 반응은 가역적이기 때문에, 산화형 알부민이 환원형 알부민으로 용이하게 변환된다고 하는 문제점을 갖고 있다. 이러한 점으로부터, 정밀도가 높은 분석을 실시하기 위해서 항상 산화형과 환원형 알부민 비가 장기간 일정한 표준 시료가 요망되고 있었다.

발명의 개시

본 발명자들은 예의 검토한 결과, 시료 용액의 pH를 특정 범위로 조정하여, 바람직하게는 시료를 특정 범위의 비율로 희석한 희석 용액으로 하거나 또는 친화성 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 수단이나 한외여과 등에 의해 저분자 물질을 제거함으로써 알부민이 안정화되고, 시료 용액중의 환원형 알부민의 산화를 현저히 억제할 수 있는 것을 밝혀내고, 이러한 안정화 된 용액을 직접, 또는, 여과후에 질량 분석에 가하거나, 또는 액체 크로마토그래피에 가함으로써, 종래의 방법에 비해 훨씬 안정적으로 분석 정밀도가 높은 알부민 측정을 가능하게 하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 요지는 이하와 같다.

[1] 시료 용액을 pH 4 내지 9로 조정하여 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 제공하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 알부민을 분석하는 방법.

[2] 상기 항목 [1]에 있어서, pH의 조정이 완충액에 의한 것인 방법.

[3] 상기 항목 [1]에 있어서, 시료 용액이 시료를 완충액에 의해서 50 내지 100000배로 희석한 것인 방법.

[4] 상기 항목 [3]에 있어서, 시료 용액을 0 내지 100시간 인큐베이팅한 후에, pH 조정하여, 희석한 시료 용액을 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 제공함을 특징으로 하는 방법.

[5] 상기 항목 [2] 내지 [4] 중의 어느 한 항에 있어서, 완충액이 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것인 방법.

[6] 상기 항목 [1] 내지 [5] 중의 어느 한 항에 있어서, 시료가 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장인 방법.

[7] 상기 항목 [4]에 있어서, 인큐베이팅 온도가 4 내지 60℃인 방법.

[8] 상기 항목 [1] 내지 [7] 중의 어느 한 항에 있어서, 질량 분석 또는 액 체 크로마토그래피 전에 한외여과처리를 실시하는 방법.

[9] 상기 항목 [1] 내지 [8] 중의 어느 한 항에 있어서, 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피 전에 크로마토그래피 정제를 포함하는 방법.

[10] 상기 항목 [9]에 있어서, 크로마토그래피가 고속 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 소수 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것인 방법.

[11] 상기 항목 [1] 내지 [10] 중의 어느 한 항에 있어서, 질량 분석이 전기분무 이온화-비행 시간형 질량 분석계, 4중 극형 질량 분석계, 이온 트랩형 질량 분석계, 푸리에 변환 이온 사이클로트론형 질량 분석계, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화-비행 시간형 질량 분석계, 자장형 질량 분석계 및 탠덤형 4중 극형 질량 분석계로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 장치에 의해서 이루어지는 방법.

[12] 상기 항목 [1] 내지 [11] 중의 어느 한 항에 있어서, 시료중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 분석하는 것인 방법.

[13] 상기 항목 [12]에 있어서, 시료가 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 상태에 있거나 당해 상태에 있는 것이 의심되는 피검체로부터 채취한 것인 방법.

[14] 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 상태에 있거나 당해 상태에 있는 것이 의심되는 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 상기 항목 [1] 내지 [11] 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 분석하는 것을 포함하는, 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 상태에 있거나 당해 상태에 있는 것이 의심되는 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장의 분석방법.

[15] 피험 물질 투여시와 비투여시의 각각에서의 피검체 시료중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 상기 항목 [1] 내지 [11] 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 측정하고,

피험 물질 투여시에 수득된 당해 존재량 및/또는 존재비와, 피험 물질 비투여시에 수득된 당해 존재량 및/또는 존재비를 비교하며,

피험 물질 비투여시에 비해 피험 물질 투여시의 환원형 알부민의 존재량 및/또는 존재비가 커진 것을 선택함을 포함하는, 피험 물질의 스크리닝 방법.

[16] 상기 항목 [15]에 있어서, 피험 물질이 항산화물질인 방법.

[17] 정제에 의해 저분자 물질을 제거하고, pH를 조정하는 것을 포함하는, 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 환원형 또는 산화형 알부민 표준 시료의 제조방법.

[18] 상기 항목 [17]에 있어서, 알부민 정량 분석이 분석 시료중에 포함되는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 또는 존재비의 분석인 방법.

[19] 상기 항목 [17] 또는 [18]에 있어서, pH를 4 내지 9로 조정하는 방법.

[20] 상기 항목 [17] 내지 [19] 중의 어느 한 항에 있어서, pH의 조정이 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 완충액을 사용하여 이루어지는 방법.

[21] 상기 항목 [17] 또는 [18]에 있어서, 정제가 한외여과 또는 크로마토그래피에 의한 것인 방법.

[22] 시스테인 또는 호모시스테인을 부가시킨 후, 한외여과 또는 크로마토그래피 정제에 의해 저분자 물질을 제거하고, pH를 조정하는 것을 포함하는, 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 산화형 알부민 표준 시료의 제조방법.

[23] 상기 항목 [22]에 있어서, 알부민 정량 분석이 분석 시료중에 포함되는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 또는 존재비의 분석인 방법.

[24] 상기 항목 [22] 또는 [23]에 있어서, pH를 4 내지 9로 조정하는 방법.

[25] 상기 항목 [22] 내지 [24] 중의 어느 한 항에 있어서, pH의 조정이 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 완충액을 사용하여 이루어지는 방법.

[26] 상기 항목 [17] 내지 [21] 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해서 수 득된 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 환원형 또는 산화형 알부민 표준 시료.

[27] 상기 [22] 내지 [25] 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해서 수득된 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 산화형 알부민 표준 시료.

[28] N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기가 변형되지 않은 알부민과, 알부민 이외의 티올 화합물이 N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기에 디설파이드 결합을 통해 결합한 알부민을 포함하는, 분석 시료중에 포함되는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비 측정용 표준 시료.

[29] 상기 항목 [28]에 있어서, 티올 화합물이 시스테인, 호모시스테인 또는 글루타티온인 표준 시료.

[30] 상기 항목 [28]에 있어서, 혈액으로부터 제조된 알부민을 사용하여 제조된 표준 시료.

[31] 상기 항목 [28]에 있어서, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 알부민을 사용하여 제조된 표준 시료.

[32] 상기 항목 [28]에 있어서, pH가 4 내지 9로 조정된 표준 시료.

[33] 상기 항목 [28]에 있어서, 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 완충액에 용해된 용액인 표준 시료.

[34] 상기 항목 [28]에 있어서, N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기가 변형되지 않은 알부민 이외의 티올 화합물이 포함되어 있지 않은 표준 시료.

도 1은 실시예 1의 Alb(red)% 값의 산출법을 도시한 도면이다.

도 2는 래트 유래의 시료 용액을 pH 6으로 조정한 경우의 Alb(red)% 값의 시간 추이를 도시한 그래프이다(실시예 1).

도 3은 사람 유래의 시료 용액을 여러 가지 pH로 조정한 경우의 Alb(red)% 값의 시간 추이를 도시한 그래프이다(실시예 1).

도 4는 래트 유래의 시료 용액의 희석율이 다른 경우의 Alb(red)% 값의 시간 추이를 도시한 그래프이다(실시예 1).

도 5는 사람 유래의 시료 용액의 희석율이 다른 경우의 Alb(red)% 값의 시간 추이를 도시한 그래프이다(실시예 1).

도 6은 실시예 2의 결과를 도시한 그래프이다.

도 7은 실시예 3의 결과를 도시한 크로마토그램이다.

도 8은 실시예 4의 결과를 도시한 질량 스펙트럼이다. 위에서부터 순차적으로, 당뇨병 모델 마우스의 혈장을 동결 융해후 37℃에서 2시간 인큐베이팅한 경우에 수득된 데이터, 당뇨병 모델 마우스의 혈장을 동결 융해후 인큐베이팅하지 않은 경우에 수득된 데이터, 정상 모델 마우스의 혈장을 동결 융해후 37℃에서 2시간 인큐베이팅한 경우에 수득된 데이터, 정상 모델 마우스의 혈장을 동결 융해후 인큐베이팅하지 않은 경우에 수득된 데이터를 도시하고 있다. Alb-Cys는 시스테인 부가 산화형 알부민, Alb-GSH는 글루타티온 부가 산화형 알부민, Alb-glc은 당화 알부민의 피크를 나타내고 있다.

도 9는 실시예 5의 결과를 도시한 그래프이다.

도 10은 실시예 6의 결과를 도시한 그래프이다.

도 11은 실시예 8의 결과를 도시한 그래프이다.

도 12는 실시예 9의 HPLC-ESI-TOFMS 측정의 결과를 도시한 차트이다.

본 발명의 알부민의 분석방법은 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 시료 용액을 제공하기 전에, 시료 용액을 pH 4 내지 9로 조정하는 것을 특징으로 한다. pH를 5.8 내지 6.2로 조정하는 것이 더욱 바람직하다. 시료 용액의 pH가 4보다 작거나 또는 9보다 큰 경우에는, 시료 용액의 제조중에도 환원형 알부민으로부터 산화형 알부민으로의 산화가 촉진되어 버리기 때문에, 알부민을 안정적으로 분석하는 것이 곤란해진다.

pH의 조정방법으로서는, 예를 들면, 완충액으로의 용해, 약산 용액 또는 약염기 용액의 첨가 등을 들 수 있다.

이 중에서도, 후술하는 희석을 동시에 실시할 수 있는 점에서 완충액을 사용하여 pH를 조정하는 것이 바람직하다. 사용될 수 있는 완충액으로서는, 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 염산 완충액, 석신산 완충액 등의 관용의 완충액을 들 수 있지만, 특히 시트르산 완충액 및 인산 완충액이 바람직하다.

본 발명은 특히, 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장 시료의 분석에 적합하다.

본 발명에 있어서는, 시료중의 산화 환원 균형을 모니터할 때는, pH 조정이나 희석전, 또한 한외여과 또는 크로마토그래피 처리할 때에는 그 전에, 혈액 또는 혈장 시료를, 0 내지 100시간, 바람직하게는 2 내지 12시간 인큐베이팅하여, 환원형 알부민의 산화 반응을 촉진시키는 것이 바람직하다. 이러한 인큐베이팅에 의해 시료중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 존재비의 차이가 보다 명확해지기 때문에, 시료중의 산화 환원 균형을 보다 간편하게 모니터할 수 있다.

인큐베이팅 온도로서는, 4 내지 60℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 들 수 있다.

시료를 희석 용매에 의해서 50 내지 100000배로 희석한 것을 시료 용액으로서 사용하는 것이 바람직하다. 50배보다도 희석도가 작은 경우에는, 저분자 물질과 환원형 알부민의 접촉 빈도가 높은 점에서, 환원형 알부민으로부터 산화형 알부민으로의 변환율이 높아진다. 또한, 이 경우에 완충액을 희석액으로서 사용한 경우에는, 완충액의 pH 완충능이 상실되어 버린다. 한편, 100000배보다도 희석도가 큰 경우에는, 알부민 농도가 장치의 검출 감도 이하가 될 수 있지만, 이 경우에는, 희석율을 크게 하더라도 그만큼 시료 주입량을 증대함으로써 검출 가능해진다.

희석 용매로서는, 완충액, 물, 아세토니트릴, 메탄올, 포름산 용액 등을 들 수 있지만, 상술과 같이, pH의 조정도 동시에 실시할 수 있는 점에서 완충액이 바람직하다. 완충액으로서는 pH의 조정에서 예시한 것을 들 수 있지만, 이 중에서도, 인산 완충액이 특히 바람직하다.

알부민의 산화반응을 억제하기 위해서는, 시료에 포함될 수 있는 저분자 물질을 제거하는 것이 바람직하다.

저분자 물질을 제거하는 수단으로서는, 한외여과처리, 또는 고속 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 정제를 들 수 있다.

이 중에서도, 알부민 흡착능이 높은 친화성 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의한 정제가 바람직하다. 시료를 친화성 칼럼으로 처리하여, 시료중의 알부민을 칼럼 수지에 흡착시킨다. 인산 완충액으로 알부민을 보유시킨 조건으로 칼럼내를 세정하여, 저분자 물질을 제거한다. 세정 종료후, 염 농도가 높은 인산 완충액을 알부민 용출 용액으로서 칼럼에 흘리면, 알부민은 수지로부터 박리되어 저분자 물질이 제거된 시료가 수득된다.

여기에서, 저분자 물질이란, 분자량 2000 이하, 바람직하게는 1000 이하, 보다 바람직하게는 500 이하의 물질을 의미한다. 이와 같은 물질로서는, 예를 들면, 상기 분자량 이하의 아미노산, 유기산, 당류, 지방산, 지질, 핵산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 금속 이온, 스테로이드 화합물, 펩타이드 등을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 시스테인, 시스틴, 호모시스테인, 호모시스틴, 환원형 글루타티온, 산화형 글루타티온을 들 수 있다.

한외여과를 사용하는 경우는, 여과 필터의 구멍 직경은 통상적으로 분자량 컷 1000 내지 60000Da이고, 10000 내지 30000Da의 구멍 직경의 필터를 사용하는 것이 바람직하다.

저분자 물질의 제거는, 통상적으로 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피의 직전에 실시하지만, 혈액이나 혈장 등의 시료 채취시에, 겔을 내봉(內封)한 채취구나 pH 조정용 희석 용매를 내봉한 채취구를 사용하는 등하여, 미리 처리하는 것도 가능하다. 예를 들면, 플라스미노겐 활성인자 검정용의 Biopool사의 채혈관(미국특허 제5175087호)은 시트르산 완충액을 사용하고 있는 점에서, 이를 사용함으로써, 채혈시에 pH 조정을 할 수 있어 알부민을 안정화할 수 있다.

또한, 알부민 이외의 협잡 성분에 의한 피크의 발생을 방지하기 위해서, 질량 분석전에 크로마토그래피 정제를 실시하거나, LC-MS를 사용하는 것이 바람직하다.

크로마토그래피로서는, 상술의 저분자 물질의 제거에서 예시한 것을 들 수 있지만, 이 중에서도, LC-MS로서 질량 분석과의 접속이 용이한 역상 고속 액체 크로마토그래피가 바람직하다.

혈액이나 혈장중의 환원형 알부민은 매우 불안정하기 때문에, 통상적으로 시료 용액이 혈액(전혈)인 경우에는, 동결에 의해 적혈구가 파괴되어 적혈구중의 헤모글로빈이 측정에 영향을 미치기 때문에 동결처리를 하는 것은 바람직하지 못하다. 따라서, 채혈후 즉시 pH 조정 또는 희석을 실시하여, 바람직하게는 그 후 한외여과처리를 하고, 측정 장치로 처리하는 것이 양호하다. pH 조정용 희석 용매를 내봉한 채취관 등의 pH를 조정할 수 있는 채혈관을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 시료 용액이 혈장인 경우에는, 채혈후에 혈장 분리를 한 후, 액체 질소를 사용한 신속 동결후, -70℃ 이하에서 냉동 보존해도 양호하다.

상기 pH 조정, 희석, 한외여과, 크로마토그래피는, 혈장 시료를 냉동 보존하기 전에 실시해도 양호하며, 보존 이전에는 실시하지 않고, 냉동 보존되어 있던 혈장 시료를 동결 융해한 후에 실시해도 양호하다. 냉동 보존전, 또는 채혈시에, 겔을 내봉한 채취구나 pH 조정용 희석 용매를 내봉한 채취구를 사용하는 등하여, 미리 처리하는 것도 가능하다. 이에 의해, 보다 높은 보존 온도에서도 안정적으로 장기간 보존할 수 있게 된다.

본 발명에서 사용될 수 있는 질량 분석 장치로서는, 전기분무 이온화-비행 시간형 질량 분석계(ESI-TOFMS), 4중 극형 질량 분석계, 이온 트랩형 질량 분석계, 푸리에 변환 이온 사이클로트론형 질량 분석계, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화-비행 시간형 질량 분석계(MALDI-TOFMS), 자장형 질량 분석계, 탠덤형 4중 극형 질량 분석계 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 간이성, 질량 고분해능, 고감도의 점에서, ESI-TOFMS가 바람직하다.

본 발명의 알부민의 분석방법에 의하면, 시료 용액중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비, 당화 알부민의 존재 여부, 수종류 존재하는 산화형 알부민의 동정 등을 분석을 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 환원형 알부민이란, N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기가 변형되지 않은 알부민을 의미한다.

본 발명에 있어서, 산화형 알부민이란, N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기에 알부민 이외의 생체내의 티올 화합물이 디설파이드 결합을 통해 결합한 알부민을 의미한다.

간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 상태에 있거나 당해 상태에 있는 것이 의심되는 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 본 발명의 알부민의 분석방법에 의해 분석함으로써, 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상태에 피검체가 있는지 여부를 판정할 수도 있다.

혈액 또는 혈장 시료를 채취할 수 있는 피검체로서는, 포유 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 원숭이, 사람 등)을 들 수 있다.

간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환, 폐질환 등의 상태는, 산화 스트레스를 발생시키는 것이 공지되어 있는 상태이고, 피검체의 산화 환원 균형에 혼란을 발생시키는 질환이다. 즉, 피검체는 이러한 상태가 되면 피검체중의 산화형 알부민과 환원형 알부민의 총량에 대한 산화형 알부민의 비율이 커진다. 따라서, 이 상태를 분석함으로써, 피검체가 이러한 상태로 되어 있지 않은지 여부를 판정할 수 있다.

간질환으로서는, 예를 들면, C형 간염, B형 간염, 간경변, 간성뇌증, 원발성 담즙성 간경변, 간암 등을 들 수 있다.

신장질환으로서는, 예를 들면, 신부전, 사구체신염, 네프로제 증후군, 신우신염, 통풍신을 들 수 있다.

뇌질환으로서는, 예를 들면, 뇌졸중, 뇌경색, 간성뇌증, 운막하출혈 등을 들 수 있다.

심질환으로서는, 예를 들면, 협심증, 심근경색, 부정맥, 선천성 심질환 등을 들 수 있다.

폐질환으로서는, 예를 들면, 폐렴, 폐기종, 천식, 기관지염 등을 들 수 있다.

본 발명의 알부민의 분석방법을 사용하면, 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 지표로 한, 피험 물질의 스크리닝도 가능하다. 당해 스크리닝은 피험 물질 투여시와 비투여시의 피검체내의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 본 발명의 알부민의 분석방법에 의해 측정하고; 피험 물질 투여시에 수득된 당해 존재량 및/또는 존재비와, 피험 물질 비투여시에 수득된 당해 존재량 및/또는 존재비를 비교하며; 및, 피험 물질 비투여시에 비해 피험 물질 투여시의 환원형 알부민의 존재량 및/또는 존재비가 커진 것을 선택함을 포함한다.

피험 물질로서는, 항산화물질, 알부민과 결합성의 물질 등, 각종 약물이나 건강 소재 등을 들 수 있다. 여기에서 말하는 건강 소재란, 건강 유지·향상에 효과가 있는 식품 소재 및 이를 포함하는 식품을 의미한다. 약물로서는, 간질환, 신장질환(특히, 네프로제 증후군), 당뇨병, 심질환, 노화의 예방·치료약 등을 들 수 있다. 또한, 건강 소재로서는, 항산화물질, 비타민, 아미노산, 미네랄, 탄수화물, 지방산, 효소 등의 영양원/영양보조제 등을 들 수 있다.

피험 물질 비투여시에 비해, 피험 물질 투여시에, 환원형 알부민의 존재량이 0.1mg/mL 정도, 바람직하게는 0.2mg/mL 정도 커진 것이 약물 및 건강 소재로서 유용한 후보 물질이 될 수 있다. 또한, 존재비의 경우에는, 피험 물질 비투여시에 비해, 피험 물질 투여후에, 전체 알부민중에 차지하는 환원형 알부민의 존재비가 투여전과 비교하여 2% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상 증가한 것이 약제 및 건강 소재로서 유용한 후보 물질이 될 수 있다.

본 발명의 알부민의 분석방법에서 사용하고 있는 시료 용액의 전처리 방법은 pH 조정과, 바람직하게는 희석 및/또는 한외여과나 크로마토그래피에 의한 저분자 물질의 제거에 의해, 혈액이나 혈장중의 알부민의 산화반응을 현저하게 억제할 수 있다. 이에 의해, 시료 용액의 보존 관리 및 수송 관리가 현저하게 용이해진다. 또한, 본 전처리 방법을 이용한 본 발명의 알부민의 분석방법은 종래의 HPLC법보다도, 알부민 자연 산화에 의한 측정 결과에 대한 영향을 상당히 억제하여, 안정적인 Alb(red)% 값이 수득된다. 또한, 본 발명의 알부민의 분석방법을 사용하면, 종래의 혈청 알부민 정량법과는 달리, 정확한 알부민의 정량을 실현할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피를 분석 수법으로서 사용하지만, 특히, LC-MS에 의한 분석이 감도, 분리능 및 검출법의 점에서 보다 효과적이다. 질량 분석을 사용하는 경우에는, 1회의 측정에 소비되는 시료가 종래의 HPLC법에서는 10μL인 데 대하여, 최소 0.2nL 정도의 시료로부터 측정이 가능하다. 또한, 액체 크로마토그래피에 비해 질량 분석쪽이 일반적으로 고감도이기 때문에, 시료 용액의 충분한 희석이 가능해지며, pH를 특정 범위로 설정하기 쉬운 데다가, 희석율을 높게 할 수 있는 등, 시료 용액 중에서 Alb(red)와 반응할 수 있는 화합물과의 접촉을 경감시킬 수 있다. 여기에서, 분리능이란 Alb(red)과 Alb(ox)의 분리능이지만, 질량 분석을 사용한 경우에는, 액체 크로마토그래피를 사용한 경우보다도 분리능이 높은 경우도 있고, Alb(red)와 Alb(ox)에 관해서 베이스라인 분리를 달성할 수 있다. 또한, 질량 분석을 사용한 경우에는, m/z값에 의해서 검출되기 때문에, 수득된 질량 스펙트럼상의 피크로부터 Alb(red)% 값에 가하여, 필요에 따라, 구조 정보를 수득할 수 있다.

알부민은 매우 불안정하고, 인큐베이션 시간에 따라, 자연 산화에 의해 산화형 알부민이 증가한다. 실제로, 혈장을 일정 시간 인큐베이팅한 후에, pH 조정, 희석한 시료 용액을 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 제공한 경우, Alb(red)%는 시료에 따라서 변화 속도가 다르다. 즉 알부민이 혈장중의 산화 환원 상태를 반영하는 프로브의 역할을 담당하는 것을 나타낸다.

한편, 약 제조 수법의 어프로치의 하나로, 대규모 콤비나트리얼 합성을 중심으로 하는 탐색 연구가 있다. 본 발명의 방법은 매우 간편한 점, 측정 시간이 1검체당 35분이라는 신속 측정인 점, 시료를 동결 융해후 바로 분석하지 않아도 되기 때문에 오토 인젝터에 의한 자동 분석이 가능한 점에서, 약물 효과의 스크리닝을 간편하면서 신속하게 실시할 수 있다.

본 발명은 또한 정제에 의해 저분자 물질을 제거하고, pH를 조정하는 것을 포함하는, 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 환원형 또는 산화형 알부민 표준 시료의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 알부민 표준 시료란, 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비가 안정적인 알부민 용액을 의미한다. 알부민 표준 시료중, 용액중에, 산화형 알부민에 대하여 환원형 알부민이 많이 존재하는 것(환원형 알부민과 산화형 알부민을 합친 전체의 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상이 환원형 알부민인 것)을 환원형 알부민 표준 시료라고 하며, 환원형 알부민에 대하여 산화형 알부민이 많이 존재하는 것(환원형 알부민과 산화형 알부민을 합친 전체의 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상이 산화형 알부민인 것)을 산화형 알부민 표준 시료라고 한다.

본 발명은 또한, 시스테인, 호모시스테인 또는 글루타티온을 부가시킨 후, 한외여과 또는 크로마토그래피 정제에 의해 저분자 물질을 제거하고, pH를 조정하는 것을 포함하는, 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 산화형 알부민 표준 시료의 제조방법을 제공한다.

이러한 알부민 표준 시료의 제조방법을 사용하여 수득된 안정적인 알부민 표준 시료도 본 발명의 범위에 포함된다. 특히, 상기 알부민 표준 시료는 Alb(red)%의 측정에 있어서의 정밀도를 관리하는 데 적합하다.

pH의 조정이나 저분자 물질의 제거에 관해서는, 본 발명의 알부민의 분석방법에 관해서 상술한 바와 같다.

본 발명은 또한, N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기가 변형되지 않은 알부민(환원형 알부민)과, 알부민 이외의 티올 화합물이 N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기에 디설파이드 결합을 통해 결합한 산화형 알부민을 포함하는, 분석 시료중에 포함되는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비 측정용 표준 시료를 제공한다. 여기에서, 알부민 이외의 티올 화합물의 구체예로서는, 시스테인, 호모시스테인 및 글루타티온을 들 수 있다.

상기 표준 시료는, 혈액으로부터 제조되거나, 또는, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 알부민을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.

혈액으로부터 알부민을 제조하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 혈액으로부터 알부민을 제조하는 데 당해 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 방법을 적절하게 사용할 수 있지만, 예를 들면, 채혈한 시료를 크로마토그래피에 제공하여, 알부민을 분리·정제하는 방법을 들 수 있다. 이 경우, 표준 시료의 용액중의 알부민(환원형 알부민+산화형 알부민) 농도는, 0.1 내지 50mg/ml이 바람직하다.

유전자 재조합 기술에 의해 알부민을 제조하는 방법도, 특별히 한정되지 않으며, 유전자 재조합에 의해 알부민을 제조하는 데 당해 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 방법을 적절하게 사용할 수 있다. 효모를 발현계로 하여 생성되는 유전자 재조합 사람 혈청 알부민이 보고되어 있으며[참조: Fleer R. et al, Biotechnology(NY). 1991 Oct; 9(10): 968-75], 예를 들면, 이 문헌에 기재된 방법을 사용할 수 있다.

상기 표준 시료의 pH는, 환원형 및 산화형 알부민의 안정성의 점에서, 4 내지 9로 조정하는 것이 바람직하다.

상기 표준 시료가 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 완충액에 용해된 용액인 것이 바람직하다.

또한, 상기 표준 시료에는, 환원형 알부민 이외의 티올 화합물이 포함되어 있지 않은 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 시료 용액중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 존재비를 간편하게 정밀하게 측정할 수 있기 때문에, 피검체의 산화 환원 균형을 모니터할 수 있다. 이에 의해, 산화 스트레스 상태나, 산화형 알부민이 증가하는 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 심질환, 폐질환 등의 상태로 피검체가 되어 있지 않은지 여부의 판정이 가능하다. 또한, 본 발명에 의하면, 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환, 폐질환 등의 상태의 예방·치료용 약물의 스크리닝을 실시할 수 있다. 건강소재가 되는 항산화물질의 스크리닝도 가능하다. 또한, 약물 투여시의 산화 스트레스 상태를 모니터함으로써, 기존 또는 신규 약물의 적용 질환의 탐색도 가능하다.

이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이러한 실시예는 본 발명을 조금도 한정하는 것이 아니다.

실시예 1

래트 혈장 시료는 이하와 같이 제조하였다. 흡입 마취제로서 디에틸에테르를 사용하여 래트를 마취 상태로 하여, 채혈을 실시하였다. 수득된 혈액은 즉시, 원심처리에 의해서 혈장 분리하였다. 이어서, 혈장 분획을 다른 용기에 옮기고, 액체 질소로 혈장을 동결하여, 사용시까지 -80℃에서 동결 보존하였다.

-80℃로 동결 보존한 상기 정상 래트 혈장 시료를 빙욕 위에서 융해후, 50mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH 6.0)를 사용하여 시료를 100배 희석하였다. 이어서, HPLC-ESI-TOFMS로 분석을 하였다.

사람 혈장 시료는 이하와 같이 제조하였다. 사람 피검체로부터 헤파린 함유 진공 채혈관에 채혈하여, 폴리프로필렌제 원심용 튜브에 옮겼다. 이를 4℃, 3000rpm, 20분간 원심처리하여, 상청 분획을 혈장 성분으로 하였다.

HPLC-ESI-TOFMS는, 고속 액체 크로마토그래피 장치(HPLC: Ultimate Plus Capillary/Nano LC System, Dionex Corporation, USA)와 전기 이온 분무식-비행 시간형 질량 분석계(ESI-TOFMS: micro TOF^TM, BRUKER Daltonics Inc., USA)를 연결한 시스템으로 실시하였다. HPLC 장치는, 마이크로 오토 인젝터(FAMOS)와 스플리트 방식 마이크로 유량 펌프(Ultimate) 및 스위칭 밸브 탑재 펌프(Switchos)의 3채워 모듈로 구성된다.

시료중의 알부민의 분리·농축은 트랩 칼럼(MonoCap 농축 칼럼: GL Science Inc., 내부 직경 0.2mm, 길이 150mm)과 분리 칼럼(MonoCap for Fast-flow: 내부 직경 0.2mm, 길이 50mm)을 사용하여 실시하였다.

HPLC용 용리액은 아세토니트릴/물(Milli-Q)(25:75v/v) 혼합액 1L에 포름산을 1mL 가한 것을 (A)액, 아세토니트릴/물(Milli-Q)(90:10v/v) 혼합액 1L에 포름산을 1mL 가한 것을 (B)액으로 하였다. 오토 인젝터의 샘플 트레이는 4℃로 설정하고, 샘플 바이알은 항상 냉각되는 상태로 하였다.

트랩 칼럼은 (A)액을 유속 0.05mL/min, 분리 칼럼은 (B)액을 유속 15μL/min(펌프 설정 유속 0.125mL/min, 스플리트 유로에 의해 실유속 15μL/min) 송액함으로써, 각각 평형화하였다.

상기 희석 및 여과처리를 한 용액을 바이알에 옮기고, 샘플 트레이에 세팅한 후, 측정을 개시하였다. 시료 주입량은 2μL로 하고, 측정 개시 0분에서 10분까지는, Swichos로부터 (A)액을 0.05mL/min로 송액하였다. 이 동안에, 시료중의 염이나 협잡 성분은 트랩 칼럼을 그냥 통과하고, 알부민은 트랩 칼럼에 흡착됨으로써, 탈염·농축이 달성되었다. 측정 개시 10분에서 15분까지는, 스위칭 밸브에 의해 유로를 바꾸어 트랩 칼럼과 분리 칼럼이 연결되는 유로로 하였다. 이 때 Ultimate로부터 (B)액을 유속 15μL/min 송액함으로써, 트랩 칼럼에 흡착된 알부민은 분리 칼럼으로 이행하고, 분리 칼럼에 보유되었다. 측정 개시 15분에서 35분까지는, 다시 유로를 바꾸어 트랩 칼럼과 분리 칼럼을 다른 유로로 하였다. 이 동안에, Ultimate로부터 (B)액이 유속 15μL/min로 송액되어, 알부민을 포함하는 다른 협잡 성분을 조분리하였다. 한편, 측정 개시 15분에서 25분까지는 Switchos로부터 (B)액을 유속 0.07μL/min 송액함으로써, 트랩 칼럼에 보유된 잔존 시료를 용출하였다. 측정 개시 25분에서 35분까지는, Switchos로부터 (A)액을 유속 0.07μL/min 송액함으로서, 트랩 칼럼을 (A)액으로 초기화하였다.

분리 칼럼으로부터 용출된 알부민은 고속 액체 크로마토그래피와 질량 분석 장치의 인터페이스가 되는 전기분무 이온 소스부에서 이온화후, 질량 분석 장치에 의해서 검출하였다. 모든 질량 스펙트럼은 이온화 및 이온 검출 파라미터를 최적화한 방법을 적용하였다. 질량 분석 장치의 검출 질량 범위는 m/z 50 내지 3000로 하고, 포지티브 이온에 다가 대전한 알부민을 검출하였다. 이온화 파라미터 조건은 하기의 값을 설정하였다.

End Plate Offset: -500V, Capillary: -5000V, Neblizer Gas: 0.4Bar, Dry Gas: 5.0L/min, Dry Temp: 200℃.

질량 분석계 제어 소프트웨어: micro TOF Control에 의해 이온화한 알부민을 검출하였다. 최적화한 조건은 Capillary Exit: 150 내지 250V, Skimmer 1: 50 내지 100V, Hexapole 1: 24 내지 36V, Skimmer 2: 25 내지 35V, Hexapole 2: 18 내지 24V, Hexapole RF: 500 내지 800V, Transfer Time: 30 내지 50μs, Pre Puls Storage: 20 내지 40μs, Lens 1 Storage: 30 내지 60V, Lens 1 Extraction: 18 내지 24V, Lens 2: -15 내지 +15V, Lens 3: -70 내지 -10V, Lens 4: -15 내지 +15V, Lens 5: -60 내지 +20V, Detector: 1400 내지 1600V, Rolling Average: 3, Summation: 20000, Pulser Push/Pull: 380 내지 400V, Corrector Fill: 40 내지 50V, Corrector Extract: 800 내지 1000V, Flight Tube: 9000V, Reflector: 1300V, TOF Detector: 1800 내지 2000V로 하였다.

데이터 해석은 질량 분석계 데이터 해석 소프트웨어 micro TOF Data analysis를 사용하였다. 전기분무 이온화법에 의해 이온화된 알부민은 다가 이온을 형성하여, 복수의 피크로서 검출되었다(도 1(1)). 질량 스펙트럼은 스무징 처리(가우스 알고리즘: m/z 폭=0.1, 사이클=1), 베이스라인 처리를 실시한 후, 디컨볼루션(Deconvolution) 기능으로부터 동일한 가수를 나타내는 피크를 결정하였다. 동 가수를 나타내는 피크는 각각 2개 검출되며, m/z가 작은 것을 Alb(red), 큰 것을 Alb(ox)라고 간주하였다(도 1(2)). m/z 1220 내지 1410의 범위에 검출되는 피크는 46가 내지 53가에 다가 차지한 알부민에 유래한다. 각 가수의 피크 강도(높이)로부터, Alb(red)%={Alb(red)의 피크 강도(높이)/(Alb(red)의 피크 강도(높이)+Alb(ox)의 피크 강도(높이))}×100를 구하여, 평균치를 산출하였다.

시료 중에서는 자연 산화 반응에 의해서 Alb(red)가 차지하는 비율은 감소되기 때문에 Alb(red)% 값은 시간과 함께 감소되는 경향이 있다. 그래서, 완충액을 사용하여 혈장 시료를 100배로 희석·여과하고, 시료의 pH 제어를 실시하였다.

래트 혈장에 관해서는, 50mM 인산 완충액(pH 6.0)을 희석 용액에 사용한 경우, 약간 감소 경향은 있지만, 처리후 24시간에서도 안정적인 Alb(red)% 값이 수득되었다(도 2).

또한, 사람 혈장에 관해서 pH 범위를 확대하여 Alb(red)의 안정성 시험을 실시하였다. 희석용 완충액은 50mM 아세트산 완충액(pH 3.0, pH 4.0 및 pH 5.0), 50mM 인산 완충액(pH 6.0, pH 7.0 및 pH 8.0), 0.1M 탄산 완충액(pH 9.0 및 pH 10.0)을 사용하였다. 산성측의 pH 적용 범위를 확인한 결과, pH 3.0에서는 질량 스펙트럼 위에서 알부민 유래의 시그널이 관측되지 않았지만, pH 4.0에서 pH 7.0의 범위에서는, 샘플 트레이 위에서의 방치후 48시간 경과해도 안정적인 Alb(red)% 값이 수득되었다(도 3(1)). 동일하게 알칼리성측의 적용 범위를 확인한 결과, pH 6.0에서 pH 9.0의 범위에서는 샘플 트레이 위에서의 방치후 24시간 경과하더라도 안정적인 Alb(red)% 값이 수득되었다. 그러나, pH 10.0에서는 방치 시간의 경과와 함께 Alb(red)% 값의 증가 경향이 확인되었다(도 3(2)). 이와 같이 사람 혈장은 pH 4.0 내지 pH 9.0의 희석용 완충액을 적용함으로써 안정적인 Alb(red)% 측정이 가능하다.

이와 같이, 본 발명의 방법에 의해 처리한 시료 용액은 샘플 트레이 위에 24시간 방치하더라도 Alb(red)% 값이 안정적이기 때문에, 오토 인젝터에 의한 측정의 자동화가 가능해진다.

또한, 50mM 인산 완충액(pH 6.0)에 의해, 희석율을 10배, 20배, 50배, 100배로 변화시킨 경우의 희석율이 Alb(red)%에 주는 영향도 검토하였다.

래트 혈장의 경우, 희석율 100배 처리한 결과, 희석·여과 처리후 24시간 경과후에도 안정적인 Alb(red)% 값이 수득되었다. 그러나, 희석율 10배, 20배 및 50배의 경우에는, 샘플 트레이 위의 방치 2시간에 Alb(red)% 값에 감소가 확인되며, 경향은 시간 경과와 함께 진행하였다(도 4).

사람 혈장의 경우, 희석율 50배 또는 100배 처리한 결과, 희석·여과 처리후 24시간 경과후에도 안정적인 Alb(red)% 값이 수득되었다. 그러나, 희석율 10배 또는 20배의 경우에는, 샘플 트레이 위에서의 방치후 3시간에 Alb(red)% 값에 감소가 확인되며, 그 후 더욱 저하되어 6시간 이후에는 거의 일정값이 되었다(도 5).

실시예 2

사염화탄소 반복 투여에 의한 간질환 모델 래트의 혈장 샘플의 측정을 실시하였다.

SD계 래트에 주 2회, 사염화탄소(CCl₄)와 올리브 오일을 당량 혼합한 것을 1mL/kg 피하 투여하여, 간질환을 유발시킨 모델 래트를 작성하였다. CCl₄ 투여 개시로부터, 1개월을 두고 에테르 마취하, 쇄골하 대정맥으로부터 1mL 채혈하였다. 동시에 대조군으로서 정상 래트의 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 즉시 빙욕하여, 1시간 이내에 원심분리함으로써 혈장 분리를 실시하였다. 분리한 혈장은 즉시 액체 질소로 동결하여, -80℃에서 보존하였다. 보존한 시료는 측정전에 융해하여, 하기 (1) 또는 (2)의 처리를 실시하여, 정상 래트 및 간질환 모델 래트(CCl₄ 투여 개시후 22주)의 혈장 샘플에 관해서 각각의 Alb(red)% 값을 구하였다.

(1) 동결 융해후, 즉시 50mM 인산 완충액(pH 6.0)에 의해 100배 희석하였다. 이어서, 당해 용액을 바이알에 옮겨 설정 온도 4℃의 오토 샘플러에 세팅하여, HPLC-ESI-TOFMS로 분석하였다.

(2) 동결 융해후, 혈장을 37℃, 2시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료후에는, (1)의 동결 융해후에 실시한 처리와 동일한 처리를 하였다.

HPLC-ESI-TOFMS와 Alb(red)% 값의 산출은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

처리 (1)의 경우, Alb(red)% 값은 각각 정상 래트(80.8±1.1), 간질환 모델 래트(82.8±2.3)를 나타내었다. 한편, 처리 (2)의 경우, Alb(red)% 값은 각각 정상 래트(65.2±3.7), 간질환 모델 래트(54.2±5.6)를 나타내었다(표 1 및 도 6).

처리 (1)의 경우에는 정상군-간질환 모델군 사이에 유의차는 확인되지 않았지만, 처리 (2)를 실시함으로써, 정상 래트군과 간질환 모델 래트군 사이에 유의차가 발생하여(p<0.05), Alb(red)%에 의해 간질환의 병태를 간편하게 모니터할 수 있었다.

실시예 3

지금까지의 실시예에서는, Alb(red)%을 액체 크로마토그래피-질량 분석 장치(LC-ESI-TOFMS)에 의해서 분석해 왔지만, 본 실시예에서는 분석 장치로서 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 장치만을 사용하였다.

고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 장치는, AKTAexplorer 10S(GE Healthcare(formerly Amersham Biosciences AB), Sweden) 시스템을 사용하였다. HPLC용 용리액은 0.15M 황산나트륨을 포함하는 30mM 인산 완충액(pH 6.85)을 유속 0.8mL/min로 사용하였다. 분리 칼럼은 Shodex Asahipak GS-520 7E를 사용하였다. 측정 시그널은 UV 검출(검출 파장 280nm)로 모니터하였다.

-80℃로 동결 보존한 정상 래트 혈장 시료를 빙욕 위에서 융해후, 50mM 인산 완충액(pH 6.0)을 사용하여 시료를 5배 희석하였다. 5배 희석한 시료를, 즉시 HPLC 장치로 처리한 경우와, 실온에서 2시간의 프리인큐베이션 처리를 한 경우에 관해서 분석을 하였다. 그 결과, 크로마토그램 위에서 10.5분 부근에 환원형 알부민 유래의 피크가 관측되었다. 프리인큐베이션 처리 전후에도 크로마토그램 패턴의 변화를 볼 수 없는 점에서, 래트 혈장중의 알부민은 pH 6.0의 완충액을 사용함으로써 안정되고 있는 것이 확인되었다(도 7).

실시예 4

KK-Ay 마우스는, 비만 유전자 Ay가 도입되어, KK 마우스보다 조기 및 심한 비만·고혈당을 발현하는 <2형 당뇨병 모델>로서 개량되어 왔다. KK-Ay 마우스는, KK 마우스에게 Ay 유전자를 도입한 <합병 모델>로, KK 마우스보다 조기(7 내지 8주령) 및 심한 비만·고혈당을 발현하는 특징을 갖는다. 본 마우스[참조: 니혼 쿠레아 가부시키가이샤 제조]를, 유전성 자연 발증 당뇨병 모델 마우스로서 사용하여, 혈장 샘플을 측정하였다. 정상 마우스 또는 당뇨병 모델 마우스로부터 채혈한 혈액을, 즉시 빙욕하여, 1시간 이내에 원심분리함으로써, 혈장 샘플을 수득하였다. 혈장 샘플은 즉시 액체 질소로 동결하여, -80℃에서 보존하였다. 보존한 시료는, 하기 (1) 또는 (2)의 처리를 실시하여, 정상 마우스 및 당뇨병 마우스의 혈장 샘플에 관해서 각각의 Alb(red)% 값을 구하였다.

(1) 동결 융해후, 즉시 50mM 인산 완충액(pH 6.0)에 의해 100배 희석하였다. 이어서, 당해 용액을 바이알에 옮기고 설정 온도 4℃의 오토 샘플러에 세팅하여, HPLC-ESI-TOFMS로 분석하였다.

(2) 동결 융해후, 혈장을 37℃, 2시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료후에는, (1)의 동결 융해후에 실시한 처리와 동일한 처리를 실시하였다. HPLC-ESI-TOFMS와 Alb(red)% 값의 산출은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

처리 (1)의 경우, Alb(red)%는 각각, 정상 마우스(80.3%), 당뇨병 모델 마우스(80.1%)를 나타내었다. 한편, 처리 (2)의 경우, Alb(red)% 값은 각각, 정상 마우스(72.4±0.8), 당뇨병 모델 마우스(68.9±1.7)를 나타내었다. 이와 같이, 프리인큐베이션 처리에 의해 샘플간의 Alb(red)%의 차가 현저하게 되었다.

또한, 환원형 알부민 및 산화형 알부민에 가하여, 당화 알부민의 피크가 확인되었다(도 8). 전체 알부민중에 당화 알부민이 차지하는 비율은 정상 마우스가 9.9%, 당뇨병 마우스가 13.9%이고, 당뇨병 마우스에 의해 보다 많은 당화 알부민이 확인되었다.

실시예 5

야생형 래트(Sparague-Dawley계 또는 F344계 래트, 수컷, 니혼쿠레아 가부시키가이샤)의 혈장을, 50mM 인산 완충액(pH 6.0)을 사용하여 희석하였다. 당해 용액을 0.45㎛ 구멍 직경의 여과 처리후, 50mM 인산 완충액에 의해 평형 상태에 이른 친화성 크로마토그래프 Blue HP 칼럼으로 처리하였다. 혈장중의 알부민은 칼럼 수지에 보유되고, 그 외 협잡 성분은 칼럼을 그냥 통과하거나 또는 세정 제거된다. 마지막에 1.5M 염화칼륨을 포함한 50mM 인산 완충액(pH 6.0)을 사용하여 칼럼에 흡착된 알부민을 용출시켰다. 이어서, 37℃에서 인큐베이션 처리를 2시간 동안 실시하였다. 이 때의 Alb(red)% 변화를 실시예 1과 동일하게 하여 측정하고, Blue HP 칼럼 처리 시료와 미처리 시료 사이에서 비교하였다(도 9). 그 결과, Blue HP 칼럼 처리를 실시한 시료쪽이 Alb(red)%의 변화가 작은 것이 나타났다. 이와 같이, 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써 시료중의 협잡 성분이 제거되기 때문에, Alb(red)의 안정화를 달성할 수 있었다.

실시예 6

지금까지의 데이터는, 혈장 분리후의 안정성에 관한 데이터이지만, 본 실시예는 보다 임상 검사에 적합한 상황으로서, 채혈한 혈액중의 Alb(red)의 안정성을 조사하였다.

<샘플 처리>

건강한 사람으로부터 혈액(N=3)을 채취하고, 1) 헤파린을 첨가, 2) 0.5M 시트르산나트륨 완충액(pH 4.3)을 혈액의 1/9량 첨가, 3) 75mM 인산나트륨 완충액(pH 6)을 혈액의 9배량 첨가한 것 중 어느 하나의 방법으로 처리하여, 냉장(4℃) 보관하였다.

처리 직후, 3, 6, 24, 30, 48시간후에, 각 처리 혈액으로부터 일정량을 분취하여, 원심 분리하여 혈장 성분을 수득하였다. 혈장은 채취 직후에 액체 질소로 동결하여, 측정까지 냉동고(-80℃)에서 보관하였다.

<측정방법>

처리 혈액 1), 2)에 관해서는, 희석액(50mM 인산나트륨 완충액, pH 6.0)으로 100배, 처리 혈액 3)에 관해서는, 동 희석액으로 10배 희석한 후, 실시예 1 기재의 HPLC-ESI-TOFMS에 따라서, 산화형 알부민 비율 및 환원형 알부민 비율을 산출하였다.

<측정 결과>

환원형 알부민 비율(Alb(red)%)의 잔존율을 산출한 결과, 처리 혈액 1)에 관해서는, 보관 시간의 경과와 함께 잔존율이 저하되어 48시간후에 95%가 되었다. 한편, 처리 혈액 2), 3)에 관해서는, 보관 48시간후의 잔존율은 100 내지 101%이고, 변동이 보이지 않았다(도 10). 따라서, pH 조정 또는 희석에 의해, 환원형 알부민 비율의 변동을 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 7

HPLC법으로 실시예 6과 동일하게 채혈로부터 측정까지의 시료중의 환원형 알부민의 안정성을 확인하였다.

<샘플 처리>

건강한 사람으로부터 혈액(N=5, 시료 1 내지 5)을 채취하고, 0.5M 시트르산나트륨 완충액(pH 4.3)을 채취한 혈액의 1/10량 첨가하여 냉장(4℃) 보관하였다.

처리 직후, 24, 72시간후에, 처리 혈액으로부터 일정량을 분취하여, 원심분리하여 혈장 성분을 수득하였다.

<측정방법>

혈장을 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 50배 희석하여, HPLC 샘플로 하였다.

HPLC 조건

칼럼: ES-502N 7.6mm i.d.×100mm DEAE-form(Shodex)

칼럼 온도: 35℃

용매 A: 50mM 아세트산나트륨-400mM 황산나트륨(pH 4.85)

용매 B: 에탄올

구배: A/B=100/0→5min→100/0→25min→95/5→5min→100/0→5min→100/0

유속: 1.0mL/min

검출: 형광 ex. 280nm em. 340nm

샘플 주입량: 20μL

<측정 결과>

환원형 알부민 비(HPLC법)

환원형 알부민 비의 잔존율(HPLC법)

보관 72시간후의 환원형 알부민 비 잔존율은 99.4 내지 100.4%이고, 처리 직후에 비해 변동이 나타나지 않았다. 이 결과로부터, 채혈후 72시간까지의 환원형 알부민의 안정성을 확인할 수 있으며, 병원에서 분석 기관까지의 분석 시료의 수송이 가능한 것이 보증되었다.

실시예 8

본 실시예에서는, 크로마토그래피로서 고상(固相) 추출을 사용하여 혈장중의 저분자 물질을 제거한 경우의 시료의 안정성을 확인하였다.

<샘플 처리>

건강한 사람으로부터 혈액(N=3, A 내지 C)을 채취하고, 1) 헤파린을 첨가, 2) 0.5M 시트르산나트륨 완충액(pH 4.3)을 혈액의 1/9량 첨가, 중 어느 하나의 방법으로 처리를 하여, 원심분리하여 혈장 성분을 수득하였다.

<고상 추출>

1. 혈장 20μL 에 대하여, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 1980uL을 첨가하였다.

2. 고상 추출 칼럼(Bond Elut-C18 EWP 200mg/3cc)의 활성화, 평형화를 실시하였다. 활성화는 0.1% 포름산을 포함하는 90% 아세토니트릴 2mL, 평형화는 물 1mL에서 실시하였다.

3. 1의 샘플을 2의 고상 추출 칼럼에 적용하였다.

4. 0.1% 포름산을 포함하는 10% 아세토니트릴 2mL로 세정하고, 0.1% 포름산을 포함하는 90% 아세토니트릴 1mL로 용출하였다.

5. 4의 용출액을 그대로, 측정 샘플로 하였다.

<ESI-TOFMS 측정 조건>

용리액: 0.1% 포름산을 포함하는 90% 아세토니트릴을 유속 15μL/min로 흘려, 오토 샘플러를 사용하여, 측정 샘플 1μL을 플로우인젝션법으로 ESI-TOFMS에 주입하였다. MS 조건에 관해서는, 실시예 1 기재의 HPLC-ESI-TOFMS의 MS 부분과 동일 조건으로 측정을 하였다.

<측정 결과>

상기에 따라서, 사람 혈액을 처리하여 제조한 혈장을 고상 추출하여 수득된 시료에 관해서, ESI-TOFMS 측정의 오토 샘플러중에서의 안정성을 조사하였다. 첫날, 1일 후 및 2일 후에 측정을 하였을 때의 환원형 알부민 비 잔존율(%)을 이하의 표에 기재하였다.

처리 혈액 1), 2) 중 어느 것에 관해서도, 오토 샘플러 중에서는 2일간 안정적이었다. 따라서, 어느 쪽의 채혈법이더라도, 그 후, 크로마토그래피로서 고상 추출함으로써, 분석에 이르기까지의 2일간 안정적이었다. 이 결과로부터, 크로마토그래피에 의해, 혈장중의 저분자 물질을 제거함으로써, 산화형 알부민의 생성이 억제되어, 안정적인 분석이 가능해지는 것을 알 수 있다. 본 실시예의 결과는, 본 발명의 분석방법의 안정성을 보증하는 것이다.

또한, 병원 등에서의 실제의 채혈을 상정하여, 혈장 보존 안정성의 확인을 고상추출법으로 실시하였다.

<샘플 처리>

건강한 사람으로부터 혈액(N=3)을 채취하고, 1) 헤파린을 첨가, 2) 0.5M 시트르산나트륨 완충액(pH 4.3)을 혈액의 1/9량 첨가, 중 어느 하나의 방법으로 처리를 하여, 원심분리하여 혈장 성분을 수득하였다.

수득된 혈장을, 혈장 분리 직후, 냉장 보관 1일후, 냉장 보관 2일 후에, 상기와 동일하게 하여, 고상 추출한 후에 ESI-TOFMS 측정을 실시하였다.

<측정 결과(도 11)>

환원형 알부민 비율의 잔존율을 산출한 결과, 처리 혈액 1)에 관해서는, 보관 시간의 경과와 함께 잔존율이 저하되어, 2일 후에 92 내지 94%가 되었다. 한편, 처리 혈액 2), 3)에 관해서는, 보관 2일 후의 잔존율은 100 내지 101%이고, 처리 직후에 비해 변동이 보이지 않았다. 이 결과로부터, pH 조정 처리에 의해, 냉장에서 2일간은 환원형 알부민이 안정적으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 고상 추출과 ESI-MS를 조합한 플로우인젝션법에서는, MS의 측정 시간이 5분 이하로, 측정 시간을 대폭 단축할 수 있다.

실시예 9

본 실시예에서는, 환원형 또는 산화형 알부민 표준 시료의 제조법을 기재한다.

건강한 사람으로부터 혈액을 채취하여, 혈장 분리한 사람 혈장 샘플을, 실시예 5에서 나타낸 순서에 준하여, 친화성 크로마토그래피에 의한 알부민 정제에 제공하였다. 정제한 용출액을, 1.5M 염화칼륨을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 4mg/mL로 희석하였다(이를 환원형 알부민 표준 시료로 하였다). 당해 용액에, 티올기 함유 저분자 물질로서, 시스테인과 이의 산화체인 시스틴, 호모시스테인과 이의 산화체인 호모시스틴, 또는, 환원형 글루타티온과 이의 산화체인 산화형 글루타티온 중 어느 하나를 첨가하여 산화형 알부민 표준 시료를 제조하였다.

생체내에 존재하는 산화형 알부민으로서, 시스테인 부가형 알부민, 호모시스테인 부가형 알부민 및 글루타티온 부가형 알부민의 3종류를, 이하와 같이 하여 각각 제조하였다.

시스테인 부가형 알부민 제조의 경우, 4mg/mL 정제 알부민 용액 120mL에 0.6mM 시스테인[참조: 시그마사 제조] 수용액을 12mL 및 0.6mM 시스틴[참조: 시그마사 제조] 수용액을 108mL 혼합하였다.

호모시스테인 부가형 알부민 제조의 경우, 4mg/mL 정제 알부민 용액 120mL에 3mM 호모시스테인[참조: 시그마사 제조] 수용액을 8mL 및 3mM 호모시스틴[참조: 시그마사 제조] 수용액을 72mL 혼합하였다.

글루타티온 부가형 알부민 제조의 경우, 4mg/mL 정제 알부민 용액 120mL에 3mM 환원형 글루타티온[참조: 와코준야쿠사 제조] 수용액을 8mL 및 3mM 산화형 글루타티온[참조: 와코준야쿠사 제조] 수용액을 72mL 혼합하였다.

제조한 모든 용액은 팔콘튜브(50cc 사이즈) 수개에 나누어 튜브 내에는 아르곤 가스를 충전하였다. 튜브를 37℃ 인큐베이터내(옆에 놓음)에 48시간 방치하였다. 반응 종료후, 한외여과법에 의해, 마이크로콘 YM-30(500μL 사이즈: MILLIPORE 제조)에 의해서, 과잉의 티올기 함유 저분자 물질과 이의 산화체를 제거하여, 용액을 농축하였다. 2000rpm의 원심처리를 하고, 0.9w/v% 염화나트륨을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.3)으로 버퍼 교환을 하였다. (1) 알부민 용액 농축, (2) 여과액 제거, (3) 0.9w/v% 염화나트륨을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH 7.3)의 충전이라는 (1)에서 (3)까지의 공정을 15회 이상 반복함으로써, 제조한 용액중의 티올기 함유 저분자 물질과 이의 산화체의 제거를 달성하였다.

본 제조법에 의해서 수득된 산화형 알부민 표준 시료(3종류)의 환원형 또는 산화형 알부민 순도(%)(환원형 알부민과 산화형 알부민을 합친 전체에 차지하는 환원형 또는 산화형 알부민의 비율)을 실시예 1 기재의 HPLC-ESI-TOFMS 측정에 의해서 확인하였다(도 12). 그 결과, 시스테인 부가형 알부민(도 12의 [B]), 호모시스테인 부가형 알부민(도 12의 [C]), 글루타티온 부가형 알부민(도 12의 [D])의 산화형 알부민 순도는 각각, 95%, 96%, 65%이었다. 한편, 환원형 알부민 표준 시료(도 12의 [A])의 환원형 알부민 순도는 78%이었다.

상기의 방법으로 제조한 환원형 알부민 표준 용액 및 각종 산화형 알부민 표준 시료를, 4℃, -20℃ 및 -80℃에서 보존하였을 때의 안정성을 평가하였다. 정기적으로 샘플링을 하여, 실시예 1 기재의 HPLC-ESI-TOFMS를 사용하여 순도의 변화율을 측정하였다.

그 결과, 어느 온도에서도 산화형 알부민 표준 시료의 순도에 관해서는 거의 변화가 없고, 산화형 알부민 표준 시료의 보존안정성이 나타났다.

또한, 제조한 표준 시료를 사용하여, 실시예 7에 기재된 HPLC법에 따라서 알부민의 분석을 실시한 결과, 분석에 의해서 수득된 환원형 알부민, 시스테인 부가형 알부민, 글루타티온 부가형 알부민의 순도의 분석값은 보다 분석 정밀도가 높은 ESI-TOFMS에서 측정한 값과 잘 일치하였다. 이로부터, 본 발명의 알부민 표준 시료를 사용하여, HPLC법의 분석 정밀도를 보증할 수 있었다.

본 발명에 의하면, 환원형·산화형 알부민 및 당화 단백질 성분의 존재량이나 존재 비율이 간편하고 고감도로 측정할 수 있기 때문에, 생화학적 연구, 질환의 진단, 약제의 스크리닝에 유용한 방법을 제공할 수 있다. 특히, 산화형·환원형 알부민의 존재비 및 당화 알부민의 존재비를 간편하고 고감도로 수득할 수 있기 때문에, 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환, 폐질환 등의 산화 스트레스를 발생시키는 각종 상태가 적합하게 분석될 수 있다.

이상, 본 발명의 구체적인 형태의 몇가지를 상세하게 설명하였지만, 당업자라면 나타낸 특정한 형태에는, 본 발명의 교시와 이점으로부터 실질적으로 일탈하 지 않는 범위에서 여러 가지 수정과 변경을 가하는 것은 가능하다. 따라서, 이와 같은 수정 및 변경도, 전부 후술하는 청구의 범위에서 청구되는 본 발명의 정신과 범위내에 포함되는 것이다.

본 출원은 일본에서 출원된 일본 특허출원 2005-217993을 기초로 하고 있고, 이들의 내용은 본 출원에 전부 포함되는 것이다.

Claims

시료 용액을 pH 4 내지 9로 조정하여 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 제공함을 특징으로 하는, 시료중의 알부민을 분석하는 방법.
제1항에 있어서, pH의 조정이 완충액에 의한 것인 방법.
제1항에 있어서, 시료 용액이 시료를 완충액에 의해서 50 내지 100000배로 희석한 것인 방법.
제3항에 있어서, 시료 용액을 0 내지 100시간 인큐베이팅한 후에, pH 조정하여, 희석한 시료 용액을 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피에 제공함을 특징으로 하는 방법.
제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 완충액이 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 시료가 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장인 방법.
제4항에 있어서, 인큐베이팅 온도가 4 내지 60℃인 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피 전에 한외여과처리를 실시하는 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피 전에 크로마토그래피 정제를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 크로마토그래피가 고속 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 소수 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 질량 분석이 전기분무 이온화-비행 시간형 질량 분석계, 4중 극형 질량 분석계, 이온 트랩형 질량 분석계, 푸리에 변환 이온 사이클로트론형 질량 분석계, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화-비행 시간형 질량 분석계, 자장형 질량 분석계 및 탠덤형 4중 극형 질량 분석계로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 장치에 의해서 이루어지는 방법.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 시료중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 분석하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 시료가 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 상태에 있거나 당해 상태에 있는 것이 의심되는 피검체로부터 채취한 것인 방법.
간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 상태에 있거나 당해 상태에 있는 것이 의심되는 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장중의 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 분석하는 것을 포함하는, 간질환, 신장질환, 당뇨병, 류머티즘, 뇌질환, 피로, 노화, 산화 스트레스, 심질환 및 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 상태에 있거나 당해 상태에 있는 것이 의심되는 피검체로부터 채취한 혈액 또는 혈장의 분석방법.
피험 물질 투여시와 비투여시의 각각에서의 피검체 시료중의 환원형 알부민 과 산화형 알부민의 존재량 및/또는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비를 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 측정하고,

피험 물질 투여시에 수득된 당해 존재량 및/또는 존재비와, 피험 물질 비투여시에 수득된 당해 존재량 및/또는 존재비를 비교하며,

피험 물질 비투여시에 비해 피험 물질 투여시의 환원형 알부민의 존재량 및/또는 존재비가 커진 것을 선택함을 포함하는, 피험 물질의 스크리닝 방법.
제15항에 있어서, 피험 물질이 항산화 물질인 방법.
정제에 의해 저분자 물질을 제거하고, pH를 조정하는 것을 포함하는, 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 환원형 또는 산화형 알부민 표준 시료의 제조방법.
제17항에 있어서, 알부민 정량 분석이 분석 시료중에 포함되는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 또는 존재비의 분석인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, pH를 4 내지 9로 조정하는 방법.
제17항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, pH의 조정이 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 완충액을 사용하여 이루어진 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 정제가 한외여과 또는 크로마토그래피에 의한 것인 방법.
시스테인 또는 호모시스테인을 부가시킨 후, 한외여과 또는 크로마토그래피정제에 의해 저분자 물질을 제거하고, pH를 조정하는 것을 포함하는, 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 산화형 알부민 표준 시료의 제조방법.
제22항에 있어서, 알부민 정량 분석이 분석 시료중에 포함되는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재량 또는 존재비의 분석인 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, pH를 4 내지 9로 조정하는 방법.
제22항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, pH의 조정이 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 완충액을 사용하여 이루어지는 방법.
제17항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해서 수득된 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 환원형 또는 산화형 알부민 표준 시료.
제22항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해서 수득된 알부민 정량 분석의 정밀도 관리용의 산화형 알부민 표준 시료.
N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기가 변형되지 않은 알부민과, 알부민 이외의 티올 화합물이 N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기에 디설파이드 결합을 통해 결합한 알부민을 포함하는, 분석 시료중에 포함되는 환원형 알부민과 산화형 알부민의 존재비 측정용 표준 시료.
제28항에 있어서, 티올 화합물이 시스테인, 호모시스테인 또는 글루타티온인 표준 시료.
제28항에 있어서, 혈액으로부터 제조된 알부민을 사용하여 제조된 표준 시료.
제28항에 있어서, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 알부민을 사용하여 제조된 표준 시료.
제28항에 있어서, pH가 4 내지 9로 조정된 표준 시료.
제28항에 있어서, 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액, 탄산 완충액, HEPES 완충액 및 석신산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 완충액에 용해된 용액인 표준 시료.
제28항에 있어서, N 말단으로부터 34번째의 유리 시스테인 잔기가 변형되지 않은 알부민 이외의 티올 화합물이 포함되어 있지 않은 표준 시료.