KR20080027325A - 펄스형 전자기장 치료를 이용한 뼈연골 성장 조절 방법 - Google Patents

Abstract

뼈, 연골 또는 다른 결합조직의 생육, 성장 및 치료를 조절하기 위한 구성 및 방법이 제공된다. 장치 및 자극 파형은, 체외 또는 체내 적용을 위한 분열증식, 분화, 세포간질 형성 또는 광물화를 촉진하기 위해 골아세포, 연골세포 및 또 다른 연결 조직세포의 행동을 분화적으로 조절하도록 제공된다. 차지-밸런스된 신호(charge-balanced signals)를 갖는 세포의 연속-모드(continuous mode) 및 펄스-버스트-모드(pulse-burst-mode) 자극이 이용될 수 있다. 뼈, 연골 및 또 다른 연결 조직 성장은 전기적인 자극을 통한 산화질소 방출에 의해 부분적으로 자극되며, NO 신타아제 반응억제제(NO synthase inhibitors) 및 NO 공여체(NO donors)의 공동-투여(co-administration)를 통하여 조절될 수 있다. 뼈, 연골 및 또 다른 연결 조직 성장은 세포의 분화를 촉진하기 위해서 전기 자극에 응답하여 BMP-2 및 BMP-7의 방출에 의해 부분적으로 자극된다. 상술한 본 방법 및 장치는 이식용 조직(engineering tissue for transplantation)에 대해서뿐만 아니라 골절의 치료, 연골 및 연결 조직 치료를 촉진함에 있어서 유용하다.

뼈, 연골, 결합조직, 성장, 치료, 조절, 자극

Description

펄스형 전자기장 치료를 이용한 뼈연골 성장 조절 방법 {METHODS FOR MODULATING OSTEOCHONDRAL DEVELOPMENT USING PULSED ELECTROMAGNETIC FIELD THERAPY}

본 발명은 펄스형 전자기장 치료를 이용한 뼈연골 성장 조절 방법에 관한 것이다.

뼈 및 연골과 관련된 질환과 손상은 사람들에게 심각한 충격을 야기한다. 대략 500만 건의 뼈 골절이 미국에서만 매년 발생한다. 그 중 10%는 치료가 지연되었고, 그 중 150,000 내지 200,000 건의 불유합(nonunion) 골절은 생산성과 자립성의 손실을 동반하여 발생한다. 연골의 경우에, 심각한 만성 형태의 무릎 관절 연골 손상은 관절 연골의 더 심각한 저하를 야기할 수 있으며, 결국 전체적인 무릎 관절의 교환을 야기한다. 약 200,000 건의 전체적인 무릎 관절 교환 수술이 매년 행해지며, 인공 관절은 일반적으로 단지 10 내지 15년을 견디므로 생산성과 자립성의 손실을 마찬가지로 야기한다.

더욱이, 골다공증의 발생이 4천 4백만명으로 추산되는 미국인에 대하여 주요한 대중 건강의 위협으로 대두되는 관점에서 볼 때 뼈 골절의 발생율이 또한 매우 높을 것으로 예상된다. 오늘날 미국에서, 1천만명이 이 질환을 이미 가지고 있는 것으로 추정되고, 약 3천 4백만명 이상이 골량 감소 증세를 가지고 있어 골다골증에 걸릴 위험이 많은 것으로 추정된다. 50세를 넘은 2명의 여성 중 1명과 4명의 남성 중 1명은 그 나머지 인생에서 골다공증과 관련된 골절을 가질 것이다. 골다공증은 300,000 건의 골반 골절, 700,000 건의 척추 골절, 250,000 건의 손목 골절, 및 300,000 건의 기타 부위 골절을 포함하여 매년 1백 5십만 건 이상의 골절을 초래한다. 골다골증의 골반 골절에 대하여 추정되는 국가의 직접 비용(병원 및 요양원)은 2002년에 180억 달러이다(국립 골다골증 재단(National Osteoporosis Foundation)의 연례 보고서, 2002).

내부 및 외부 고정과, 광물이 제거된 뼈의 세포간질, 혈소판 추출물 및 뼈의 세포간질 단백질을 포함하는 뼈의 이식 치환과, 외부의 고정기 또는 초음파 및 전자기장을 통해 인가된 기계적인 스트레인(strain)과 같은 생리학적 자극 등의 몇몇 치료법이 저항성의 골절을 치료하는 데에 현재 이용되고 있다.

마찬가지로, 손상 및 증상의 심각성에 따라, 연골 손상에 대한 전형적인 치료는 보존적인 치료와, 손상된 연골 부위의 표면을 깨끗이 하고 매끄럽게 하는 무위험의 관절경 검사식(arthroscopic) 수술과, 미세골절, 드릴링(drilling), 및 연마와 같은 다른 수술 과정이다. 이 모두는 증상의 완화를 제공하지만, 이득은 특히 사람의 예비-손상 활동 레벨이 유지된다면 보통 일시적이다.

뼈 및 연골과 같은 다른 조직은 전기 신호에 생리학적으로 유용한 방식으로 반응한다. 불유합(non-union) 및 지연유합(delayed-union)에 적용되는 생체 전기 자극은 1960년대에 시작되었으며, 현재 뼈 및 연골에 적용된다(Cimobor and Aaron, Foot Ankle Clin , 2005, (4):579-93). 현재, 임상 진료에 있어서의 이들의 역할이 시장에서 일반적으로 인정되었다. 생체 전기 자극에 기인한 보다 덜 알려진 결과는 양의(positive) 골밀도 변화이고(Tabrah, 1990), 및 골다공증의 방지이다(Chang, 2003). 최근의 보고서는 펄스식 전자기장(PEMF, pulsed electromagnetic field)에 의한 자극이 골 연장술(distraction osteogenesis) 중에 뼈가 형성되는 것을 상당히 촉진하는 부속의 증거를 제공하였다(Fredericks, 2003).

현재, 뼈의 치료를 위한 전기요법의 진료적인 사용은 치료 부위에 직접 이식된 전극 또는 비침습성의(noninvasive) 전기용량적이거나 유도적인 결합으로 이루어진다. 직류(DC, Direct Current)는 뼈의 치료 부위의 목표 조직에 설치된 하나의 전극(음극)과 연부 조직(soft tissue)에 설치된 양극을 통해 인가된다. 전기용량적 결합 기술은 골절 부위의 반대측에 설치된 외부의 피부 전극을 사용한다. 20-200 Hz의 사인파(sinusoidal wave)는 치료 부위에서 1-100 mV/cm의 전기장을 유도하는 데에 통상적으로 사용된다.

유도적인 결합(PEMF) 기술은 시변화 자기장을 1개 또는 2개의 전기 코일을 통해 인가함으로써 치료 부위에 시변화 전기장을 유도한다. 유도된 전기장은 수많은 성장 인자들에 의해 조정된 뼈 치료의 분자레벨의 조절의 정상 과정을 조절하는 유발 메커니즘(triggering mechanism)으로서 작용한다. 바세트(Bassett) 외 다수는 PEMF 신호가 송곳니에서 뼈의 치료를 150% 만큼 촉진한다. 뼈의 치료의 실험적인 모델은 DC 전류에 의해 증가된 세포의 분열증식, 경화, 및 기계적인 강도를 나 타낸다. 이러한 연구법은 연골 손상부에 대하여 전위를 또한 갖는다.

손상된 조직은 정상 조직에 비하여 전기적인 전위를 갖는다. "손상 전위" 또는 "손상의 전류"라고 일컬어지는, 손상된 부위에서 측정된 전기 신호는 DC(direct current) 뿐이며, 시간과 함께 천천히 변화한다. 뼈 골절의 치료와 신경의 재성장 전위는 음의(negative) 전극의 부근에서 평소보다 전형적으로 더 빠르지만 양의(positive) 전극의 근처에서 더 느리며, 여기에서 몇몇 경우에 조직의 퇴화 또는 괴사가 발생할 수 있다. 이러한 이유로 인해, 최근의 대부분의 연구는 보다 높은 주파수, 종종 순수한 DC 성분이 없는 보다 복잡한 신호에 역점을 두었다.

유감스럽게도, 현재 구입가능한 대부분의 전기요법 장치는 전극 또는 전체 전자 패키지의 직접적인 이식에 의존하거나 코일을 사용하여 피부를 통하는 유도 결합에 의존하는데, 이 코일은 시변화 자기장을 발생시켜서 신체 조직 내에 약한 와전류(eddy current)를 유도하여 조직에 신호를 비효율적으로 제공하고 따라서 부피가 큰 코일에 더하여 비교적 커다란 신호 발생기 및 배터리 팩을 필요로 한다. 하나의 경우에 수술 및 생체 친화성이 있는 물질과 다른 하나의 경우에 과도한 회로 복잡성 및 입력 전원에 대한 필요성은 이러한 대부분의 장치의 가격을 비교적 높게 유지시켰으며, 또한 이러한 장치를 고도의 숙련자에게 적용하는 것을 제한하였다. 따라서, 적절한 성장과 치료를 촉진하기 위해 뼈연골 조직의 성장을 분화적으로 조절하는 생체 전기 자극을 제공하는 데에 사용될 수 있는, 다목적으로 쓰이고, 비용-효율적인 장치에 대한 필요성이 있다.

본 발명의 주요 양태에 따르면 그리고 대체로 말하자면, 본 발명은 전기 신호를 성장하거나 손상된 뼈 또는 연골 조직에 인가함으로써, 예를 들어 뼈 조직 또는 연골의 성장 또는 치료를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 자연적인 신체 신호의 선택된 특징에 대응하도록 최적화된 생체 전기 신호의 전달을 가능하게 함으로써 종래 기술의 장치와 방법의 단점을 극복하여 보다 영구적인 치료를 촉진한다. 본 명세서에 기재된 신호는 자연적인 신호의 선택된 특징에 일치하며, 따라서 본 발명에 따른 전기자극을 받게 되는 조직은 최소한의 생리적 스트레스를 받게 된다. 또한, 본 발명은 비침습성이고 비용-효율적이므로 개인적인 별개의 사용에 대하여 다중의 적용이 바람직하게 한다. 또한, 본 발명의 방법은 전기 자극을 제공하며, 여기에서 전기 신호는 자연적인 신체 신호의 선택된 특징과 근접하게 유사하다. 따라서, 자극된 조직은 최소한의 스트레스를 받게 되며, 성장과 치료가 상당히 용이하게 된다.

신경계에서 고통 임펄스를 차단하는 것을 목적으로 하는 종래의 TENS-타입의 장치와 대비하여, 본 발명의 방법으로 사용되는 장치는 정상적인 사람의 고통 감지 한계 레벨 이하인 자극 레벨에서 작동하며, 이와 같이 대부분의 사용자는 뼈를 치료하거나 뼈의 성장을 촉진하기 위한 처리 중에 어떠한 것도 감지하지 않는다.

본 명세서에 기재된 기술은 일군의 파형을 사용하는데, 이들 중 일부는 신규한 것이고, 나머지는 유도 코일을 통해 인가될 때 조직에 대하여 양의(positive) 생리학적 효과를 갖는 것으로 알려져 있지만, 현재까지 전극을 통해 양의(positive) 생리학적 효과를 갖는 것으로 증명되지 않았다.

골다공증 치료에 대하여 상업적인 생체 전기 장치가 현재는 승인되지 않았지만, 본 발명은 장래성 있는 후보를 제공한다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, 독특한 펄스식 전자기장(PEMF) 파동 패턴은 유리하게도 거시적인 레벨(즉, 보통의 뼈 골절) 뿐만 아니라 미시적인 레벨(즉, 골아세포 성장)까지 모두에 적용될 수 있다. 본 발명의 소정의 실시예는 원하는 PEMF 파형의 유용성과 적용을 최대화하며, 예를 들어 척추, 골반 및/또는 손목은 골다공증에 의해 골절되는 공통의 부위이고, 이러한 타입의 골절에 대하여 본 발명자는 전기요법의 전달 매체와 같은 단순하고, 자체-생착적이고, 피부 접촉의 전극 패드를 제공한다. 이러한 전극 패드의 사용은 이렇게 중요한 해부학적 부위에서 뼈의 질량을 향상시킨다. 미시적인 레벨에서, 본 발명의 발명자는 골아세포의 성장을 최적화시키는 것으로 확인된 특유의 PEMF 파형과 주파수를 갖는다. 실험예들에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이(실험예 1 참조), 본 발명자는 PEMF 신호가 골아세포의 광물화(mineralization) 및 세포간질의 생성을 증대시키고, 이 신호가 구조적인 특징들을 또한 부여한다는 것을 나타낸다. 본 발명자는 다른 PEMF 신호가 뼈의 모르포겐 단백질(BMPs, bone morphogenic proteins)을 증가시킴으로써 세포의 분열증식을 증대시키는 것을 또한 보여준다. 펄스-버스트(pulse-burst) 신호와 연속적인 신호의 모두가 본 발명에 사용될 수 있지만, 펄스-버스트 신호보다 연속적인 신호를 인가하면 분열증식과 광물화에 대하여 더욱 현저한 효과를 제공한다.

본 발명의 전기 신호는 뼈 및 연골과 같은 구조적인 조직의 치료와 성장을 촉진하는 데에 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 시스템과 방법은 손상되지 않은 유기체와 사용하는 것으로 한정될 필요가 없는데, 분리된 세포 또는 조직이 전기요법의 파형에 의해 영향을 받을 수도 있기 때문이다(적절한 전기 자극이 세포의 신진대사율, 분비작용, 및 복제를 수정하는 것으로 관찰되었음). 전기 신호는 피부, 인대, 힘줄 등과 같은 다른 결합조직에 적용가능하다. 본 명세서에 기재된 전기 신호는 조직의 치료를 증가시키고 이식을 위한 조직의 성장을 촉진하기 위해 다른 조직을 자극하는 데에 사용될 수 있다. 분리된 피부 세포는, 예를 들어, 적절한 성장 배지에서 본 발명의 장치 및 파형으로 처리될 수 있으므로 조직-배양된 자생의 피부-이식 물질의 표본에서 세포의 분열증식과 분화를 증가시킨다. 이와 유사한 방식으로, 생체 전기 신호는 손상되거나 질환이 있는 피부 조직에 직접 인가되어 치료를 증대시킬 수 있다.

생체 전기 신호 및 골수기질세포(BMSCs, bone marrow stromal cells)와 같은 전구 세포를 골절부로 외인(外因)적으로 전달하는 것은 저항성 골절부의 치료와 회복을 증대시킬 수 있게 한다. 이러한 인자들(생체 전기 및 세포 보충)의 모두는, 사실상, 자연적인 치료 과정의 일부이다. 이러한 경우에, 본 명세서에서 기재된 파형을 사용하는 전기 자극은 손상 후에 직접 전기요법 시스템에 의해 인가될 수 있다. 전기요법 시스템은 무게가 가볍고 소형이고 휴대가능할 수 있다. 모든 전기 자극과 일반적인 세포 기반 요법은 손상 후 수일 내에 적용될 수 있다. 자가 조직의 세포는 손상 후 더 많은 시간이 지난 후에도 추가될 수 있다. 본 발명은 뼈의 치료 또는 성장을 유도하여 반흔 조직이 아닌 자연 조직을 재생하는 방법을 또한 제공한다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 뼈의 치료와 성장을 용이하게 하기 위하여 신규의 전기 신호를 뼈 조직에 인가함으로써 뼈 조직의 분열증식과 분화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 뼈 조직의 처리를 위한 PEMF의 사용을 포함하는 신규의 배양 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 전기 자극과 조합하여 전구 세포의 신규의 배양 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 필요시 숙주로의 이식을 위해 자생 및 자가 조직의 성장을 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 "시험관" 또는 "체내"에서 중간의 전구세포(uncommitted progenitor cells)를 전기적으로 자극하여 분열증식 또는 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 연골, 뼈 또는 다른 결합조직의 성장을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 뼈의 모르포겐 단백질(morphogenic protein)의 발현과 방출을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 이러한 그리고 다른 목적들, 특징들과 이점들은 개시된 실시예에 대하 이하의 상세한 설명과 첨부된 청구항을 참조하면 명료하게 될 것이다.

도 1은 골절 치료를 촉진하는 데에 사용되는 파형의 개략도이다.

도 2의 (a)는 뼈에 광물화를 촉진하기 위한, 연속 모드의 효율적인 전기 신호 파형을 도시하는 도면을 제공한다.

도 2의 (b)는 뼈에 광물화를 촉진하기 위한, 유도성의 코일 파형에 기초하고 피부에 적용하기에 적합한 펄스 모드의 효율적인 전기 신호 파형을 도시하는 도면을 제공한다.

도 3의 (a)는 뼈 세포의 분열 증식을 촉진하기 위한, 연속 모드의 효율적인 전기 신호 파형을 도시하는 도면을 제공한다.

도 3의 (b)는 뼈 세포의 분열 증식을 촉진하기 위한, 펄스 모드의 효율적인 전기 신호 파형을 도시하는 도면을 제공한다.

도 4는 전류를 전달하기 위한 실험 챔버를 도시하는 도면을 제공한다.

도 5는 상청액(supernatent, 좌측), 및 멤브레인(우측)의 알칼리성 포스타파아제의 변화를 도시하는 막대 그래프를 제공한다.

도 6은 신호 "B"에 의한 오스테오칼신(osteocalcin) 및 칼슘 침전물의 변화를 도시하는 막대 그래프를 제공한다.

도 7은 L-NAME가 있거나 없을 때의 PEMF 신호 파형에 대한 컨트롤 ± 표준편차의 퍼센트로서 DNA에 의해 측정된 세포 개수의 증가를 도시하는 막대 그래프를 제공한다. L-NAME 만은 실험적인 컨트롤로서 표시된다.

도 8은 시험관 적용을 위해 기계적 및 전기적 촉진의 조합을 사용하는 구성의 개략도를 제공한다.

이하의 설명은 본 발명을 구체화한 가장 최근에 만들어진 모드를 포함한다. 이러한 설명은 본 발명의 전반적인 목적을 예시하기 위해 만들어진 것으로서 제한적인 의미로서 받아들여져서는 않 된다. 본 명세서에서 언급된 참고 자료는 이로써 그 전체가 원용되며, 미국 가출원번호 제60/687,430호, 제60/693,490호, 제60/782,462호 및 제60/790,128호를 포함한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 "시험관(in vitro)" 적용은 "체내(in vivo)" 적용, 치료 등에 대해서 추정될 수도 있음을 알 수 있을 것이다. 당업자라면, 감소된 표본 및 "시험관" 모델을 이용하여 개발된 기술은 궁극적으로 "체내" 적용에 대하여 이용될 수 있음을 알 수 있을 것이다. "체내"에서의 전기 자극에 대한 실효치는 "시험관" 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 얻어진 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

본 발명은 자연적인 인체 신호의 선택된 특성에 상응하도록 최적화된 생체 전기 신호의 전달을 가능하게 하여 치료가 빠르고 더욱 오래가게 한다. 본 명세서에 기재된 신호는 자연적인 신호의 선택된 특성에 유일하게 부합하며, 따라서 본 발명에 따라 전기자극된 조직은 최소한의 생리적 스트레스를 받는다. 또한, 본 발명은 비침습성(non-invasive)이고 비용 효율이 높으므로 사람에 대하여 다중 적용하고 개인적으로 사용하기에 바람직하다.

- 골개조(骨改造, bone remodeling) -

뼈는 인체에서 가장 견고한 조직의 하나이다. 사람 골격의 주요 구성요소로 서, 뼈는 근육 구조를 지지할 뿐만 아니라 생명 유지에 필요한 기관들을 두개골 및 흉강(胸腔) 내에 보호한다. 뼈는 세포 사이에 있는 경화성 물질(calcified material)(뼈 세포 밖의 세포간질(matrix))과 골아세포(osteoblast), 골세포(osteocyte) 및 용골세포(osteoclast) 등 여러 가지 종류의 세포들로 이루어져 있다. 뼈 세포 밖의 세포간질은 유기 및 무기 성분으로 이루어져 있다. 유기 성분은 세포, 콜라겐, 프로테오글리칸(proteoglycan), 히알우로난(hyaluronan) 및 다른 단백질들과, 인지질들(phospholipids)과 성장 인자들을 포함한다. 뼈의 강성은 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)의 형태로 결정화된 칼슘 및 인이 대부분인 광물화된 무기 성분으로부터 생긴다. 콜라겐과 하이드록시아파타이트의 화학 결합은 뼈에 견고성을 부여한다.

골아세포는 중간엽 기원(mesenchymal origin)의 전구세포(progenitor cell)로부터 얻어지며, 새로 만들어진 뼈의 세포간질 다음의 표면에 국부적으로 제한되어 나란히 위치되어 있다. 골아세포의 주요 기능은 뼈의 세포간질의 합성과 성장 및 세포간질의 광물화 역할을 하는 것이다. 골아세포는 뼈의 세포간질의 소강(lacuna) 내에 포함될 때 골세포(osteocyte)로서 일컬어지며, 약간 상이한 형태를 채택하며, 다른 골세포와의 접촉을 유지한다. 골아세포는 칼시토닌(calcitonin) 및 인테그린(integrin)에 대한 수용체와 다른 특수한 구조적 특징들을 내포하는 커다란 다핵 세포(multinucleate cell)이다. 골아세포의 주요 기능은 경화성 뼈 세포간질의 무기 및 유기 성분 모두를 재흡수하는 것이다.

골개조는 뼈 조직의 재흡수 및 형성에 대하여 기본적이며 고도로 통합된 공정으로서, 광물화된 세포간질의 재생으로 인해 정밀하게 균형잡힌 골격 크기를 유발한다. 이러한 재생가능한 공정은 뼈의 전체적인 해부학적 구조를 손상시키지 않고 달성된다. 이러한 내부적인 재편성에 대한 연속적인 공정은 뼈가 스트레스에 응답한 미세골절 및 변형에 대한 연속적인 치료에 의해 뼈의 본래 상태를 정확하게 재생하고 보존하기 위한 능력을 유지하는 것을 보장한다. 성인의 골격의 구조와 조성은 영구적으로 동역학적 평형상태이다. 골개조는 또한 항상성 요구(homeostatic demand)에 응답하여 칼슘을 방출하기 위한 수단을 제공한다. 골개조에 영향을 미치는 조건들은 고정 또는 무중력과 같은 기구적인 자극, 전기용량적으로 결합된 전기장 또는 펄스형 전자기장과 같은 전류 또는 전자기장, 소정의 염증성 질환에 반응하는 호르몬 변화를 포함한다.

골개조는 활성화, 재흡수, 치료, 형성, 및 정지 단계들을 포함하는 조정된 활동 사이클을 통해 일어난다. 활성화는 내막 세포의 얇은 층의 존재에 의해 특징지워진다. 다음 조혈모 계통의 단핵 세포는 활성화 부위로 이동하기 시작하여 함께 융합되어 골아세포를 형성한다. 활성화 다음에는 활성의 골아세포가 골면을 파는 재흡수가 이어진다. 이 단계는 전형적으로 약 2-4주 지속된다. 치료는 재흡수 다음에 일어나며 비활성 전구골아세포(pre-osteoblast)가 재흡수 저하 중에 있는 동안에 9일의 기간 동안 계속된다. 다음 단계는 형성이며 약 3-4개월 걸린다. 이 단계 중에 활성의 골아세포는 파여진 부위를 다시 채운다. 골개조의 마지막 단계는 다음의 개조 사이클이 시작될 때까지 개조 활동이 일어나지 않는 정지이다. 이 상적으로 뼈의 채워지는 양은 뼈의 질량의 손실이 없이 재흡수되는 양과 동일해야 한다.

- 파형 -

본 발명은 생물학적 조직에 특수한 작용을 가능하게 하는 전기 신호와 파형을 제공한다. 이러한 파형은 "체내" 적용과 "시험관" 적용 모두에 대하여 효과적이다. 뼈연골(osteochondral) 조직은 현저하게 상이한 주파수와 파형에 상이하게 반응하도록 본 명세서에 도시되어 있다.

양극성과 동일하지 않은 길이를 가지므로 직사각형의 비대칭 펄스 열(train)을 형성하는 교번의 직사각형 또는 유사 직사각형 펄스를 포함하는 신호에 특히 관심이 있다. 특정한 길이의 펄스는 특정한 세포의 생화학적 기전, 특히 칼슘 또는 다른 작은, 이동성의 하전 종(charged species)을 세포막 상의 수용체에 결합하거나 그 결합을 푸는 것(보통 더 느림)을 활성화하도록 이론화되었다. 양극성을 갖는 이러한 펄스 열의 일부는 실질적으로 순수한 제로(0)의 하전량을 산출하도록 맞춰질 수 있으며, 이 펄스 열은 연속적일 수 있거나 실질적으로 제로(0)의 신호의 간격으로 분리되는 펄스 버스트(pulse bursts)으로 나누어질 수 있다. 펄스-버스트 모드에서 인가된 자극은 연속적인 열로서 인가된 자극과 유사한 작용을 갖지만, 이러한 작용은 제로(0)-신호의 기간 중에 수용체로부터 결합을 푸는 하전 종의 성능(이론적인)으로 인해 상세하게는 상이하므로, 필요한 인가 일정도 또한 상이할 수 있다.

도 1은 뼈와 연골 조직을 자극하기에 효과적인 기초 파형(20)의 개략도를 도시하며, 여기에서, 라인(22)은 연속 모드의 파형을 나타내고, 라인(24)은 펄스-버스트 모드에서 장시간 동안의 동일한 파형을 나타내고, 레벨(26, 28)은 전압 또는 전류에 대한 2개의 서로 다른 특성치를 나타내고, 간격(30, 32, 34, 36)은 특정한 변이들 사이의 시기를 나타낸다. 레벨(26, 28)은 파형의 전체 사이클에 대하여 평균화될 때 레벨(26, 28)이 원한다면 순수한 양(陽)의 또는 순수한 음(陰)의 직류(D.C., direct-current) 성분를 유발하도록 선택되더라도 순수한 D.C. 성분이 없도록 통상 선택된다. 실제 적용에서, 참조부호 20과 같은 파형은 전형적으로 변경되는데, 모든 전압 또는 전류가 일정한, 바람직하게는 간격(34)보다 더 긴 감쇠 시간으로, 레벨(26, 28)들 사이의 어느 정도의 중간 레벨 쪽으로 감쇠한다. 이 결과는 라인(38)μ으로 나타내어진다. 여기에 기재된 파형은 일반적으로 2개의 신호 성분: 서로에 대하여 간격(30)으로서 도시된 긴 성분과 간격(32)으로서 도시된 짧은 성분을 갖는다.

짧고 긴 신호 성분의 길이에 있어서의 변화는 자극되는 조직에 대하여 특정한 효과를 부여한다. 본 발명에서 관심 있는 펄스 길이는 길이를 증가시키기 위해 다음과 같이 한정될 수 있다.

길이 α: 5 내지 75 μsec, 지속시간, 바람직하게는 10 내지 50 μsec 지속시간, 더 바람직하게는 20 내지 35 μsec 지속시간, 가장 바람직하게는 약 28 μsec 지속시간

길이 β : 20 내지 100 μsec 지속시간, 바람직하게는 40 내지 80 μsec 지속시간, 더 바람직하게는 50 내지 70 μsec 지속시간, 가장 바람직하게는 약 60 μsec 지속시간

길이 γ : 100 내지 1000 μsec 지속시간, 바람직하게는 150 내지 800 μsec 지속시간, 더 바람직하게는 180 내지 500 μsec 지속시간, 가장 바람직하게는 약 200 μsec 지속시간

길이 δ : 1 밀리세컨드(millisecond) 초과 지속시간, 바람직하게는 5 내지 100 msec 지속시간, 더 바람직하게는 10 내지 20 msec 지속시간, 가장 바람직하게는 약 200 μsec 지속시간

제1 실시예에서, 전기 신호는 길이 α의 짧은 성분과 길이 β의 긴 성분을 가지며, 따라서 각각의 타입의 가장 바람직한 펄스 길이(각각 28 μsec 및 60 μsec)에서, 약 11.4 KHz의 주파수를 갖는다. 길이 α와 길이 β의 펄스로 교번적으로 이루어진 신호는 본 명세서에서 "타입 A" 신호로 일컬어지고, 그 파형은 "타입 A"의 파형으로 일컬어진다. 연속적인 펄스 열로서 인가된 "타입 A" 신호의 예는 도 2의 (a)에 도시되어 있다. 이러한 신호는 다양한 생물학적 또는 치료상의 적용을 위해 조직 샘플의 분열 증식이나 배양을 촉진하는 데에 유용하다.

펄스-버스트 모드에서, "타입 A" 파형은 약 0.5 내지 500 msec, 바람직하게는 약 50 msec의 버스트(burst)으로 시작될 것이며, 여기에서 버스트는 0.1-10 Hz 또는 바람직하게는 약 1 Hz로 반복된다. 이러한 타입의 파형의 예는 도 2의 (b)에 도시되어 있다.

제2 실시예에서, 전기 신호는 길이 α의 짧은 성분과 길이 γ의 긴 성분을 가지며, 따라서 각각의 타입의 가장 바람직한 펄스 길이(각각 28 μsec 및 200 μsec)에서, 약 4.4 KHz의 주파수를 갖는다. 길이 α와 길이 γ의 펄스로 교번적으로 이루어진 신호는 본 명세서에서 "타입 B" 신호로 일컬어지고, 그 파형은 "타입 B"의 파형으로 일컬어진다. 이러한 파형은 미국특허출원번호 제10/875,801호(공개번호 제2004/0267333호)에 개시되어 있다. 연속적인 펄스 열로서 인가된 "타입 B" 신호의 예는 도 3의 (a)에 도시되어 있다. 이러한 신호는 고통을 경감하거나 뼈의 치료를 촉진하는 데에 유용하며, 또한 "시험관"에서 골아세포의 배양에 있어서 해면뼈형 구조의 성장을 자극하며, 외과적인 뼈의 치료 및 이식 물질의 분야에 적용된다.

펄스-버스트 모드에서, "타입 B" 파형은 약 1 내지 50 msec, 바람직하게는 약 5 msec의 버스트로 시작되며, 여기에서 버스트는 5-100 Hz 또는 바람직하게는 약 15 Hz로 반복된다. 이러한 타입의 파형의 예는 도 3의 (b)에 도시되어 있다. 이 파형은 불유합(Non-union)의 뼈 자극 제품, 예를 들어 상표명 EBI MEDICA, INC.(Parsippany, NJ)와 상표명 ORTHOFIX, INC.(McKinney, TX)의 제품에 통상적으로 사용되는 전형적인 유도성(코일)의 전자기 장치에 의해 전달되는 유효 전류와 형상 및 진폭이 유사하다.

제3 실시예에서, 전기 신호는 길이 β의 짧은 성분과 길이 γ의 긴 성분을 가지며, 따라서 각각의 타입의 가장 바람직한 펄스 길이(각각 60 μsec 및 200 μ sec)에서, 약 3.8 KHz의 주파수를 갖는다. 길이 β와 길이 γ의 펄스로 교번적으로 이루어진 신호는 본 명세서에서 "타입 C" 신호로 일컬어지고, 그 파형은 "타입 C"의 파형으로 일컬어진다. 이러한 신호는 뼈의 재생, 성숙 및 경화를 촉진하는 데에 유용하다.

펄스-버스트 모드에서, "타입 C" 파형은 "타입 B"와 같이 약 1 내지 50 msec, 바람직하게는 약 5 msec의 버스트로 시작되며, 여기에서 버스트는 5-100 Hz 또는 바람직하게는 약 15 Hz로 반복된다. 이 파형은 불유합(Non-union)의 뼈 자극 제품, 예를 들어 척수 융합의 치료를 촉진하도록 만들어진 상표명 ORTHOFIX, INC.(McKinney, TX)의 상표명 PhysioStim Lite에 통상적으로 사용되는 전형적인 유도성(코일)의 전자기 장치에 의해 전달되는 유효 전류와 형상 및 진폭이 유사하다.

제4 실시예에서, 전기 신호는 길이 γ의 짧은 성분과 길이 δ의 긴 성분을 가지며, 따라서 각각의 타입의 가장 바람직한 펄스 길이(각각 200 μsec 및 13 μsec)에서, 약 75 Hz의 주파수를 갖는다. 길이 γ와 길이 δ의 펄스로 교번적으로 이루어진 신호는 본 명세서에서 "타입 D" 신호로 일컬어지고, 그 파형은 "타입 D"의 파형으로 일컬어진다. 이러한 신호는 연골의 치료와 뼈의 경화와 골다공증 및 골관절염의 치료 또는 회복에 유용하다. 본 명세서에 원용된 미국 특허 제5,273,033호의 도 3에 도시된 바와 같이, 상표명 BIONICARE MEDICAL TECHNOLOGIES INC.의 상표명 BIO-1000의 전극을 통해 전달된 것과 광범위하게는 유사하지만, "타입 B" 신호는 파동의 형상이 실질적으로 다르며(경사진 것이 아니라 직사각형임) 사실상 하전이 균형잡힌 것이 바람직하다.

펄스-버스트 모드에서, "타입 D" 파형은 적어도 100 msec, 바람직하게는 약 1 msec의 버스트로 시작되며, 여기에서 버스트는 1초 이상의 간격으로 반복된다.

신호 강도는 변화될 수도 있으며, 실제로, 더 강한 신호가 더 약한 신호보다 더 많은 이득을 주지 않으며, 때로는 더 작은 이득을 준다. 전형적인 신호(도 1의 신호와 같은)에 대하여, 피크의 유효성은 전형적으로 1 내지 10 ㎂/㎠ 정도로 되고 교차 지점은 이 값의 약 100배가 될 것이다. 이 지점을 넘어서면, 신호는 치료를 늦게 하거나 추가의 손상을 야기한다.

본 발명의 방법에 특히 관련이 있는 것은 버스트 모드가 아닌 연속 모드로 공급되는 전기 신호 또는 파형이다(도 2의 (a) 또는 도 3의 (a)). 연속적으로 공급되는 신호는 펄스-버스트 신호와 유사한 효과를 가지지만, 유사한 결과를 얻기 위해서는 상이한 전달 일정을 필요로 할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 파형에 대하여, 전형적인 신체 조직에 인가된 전형적인 평균 전류 밀도는 0.1 내지 1000 ㎂/㎠ 이고, 바람직하게는 0.3 내지 300 ㎂/㎠ 이고, 더 바람직하게는 1 내지 100 ㎂/㎠ 이고, 가장 바람직하게는 약 10 ㎂/㎠ 이며, 그 결과 전압의 증감 범위는 각각 0.01 내지 1000, 0.03 내지 300, 0.1 내지 100, 및 1 내지 10 ㎂/㎝ 이다. 거의 정방형에 가까운 각각의 파장 신호는 긴 양(陽)의 부분과 짧은 음(陰)의 부분을 갖거나 또는 그 반대로 갖는 비동기식이다. 양 또는 음의 부분들은 제로(0)의 순수한 하전을 산출하도록 맞춰지거나 펄스의 끝에서 균등화 펄스와 선택적으로 하전이 불균형하게 되어 파형에 대하여 전체적으로 제로(0)의 순수한 하전 균형을 제공할 수 있다. 피부 전극에 의해 전달된 이러한 파형은 사인곡선이거나 매우 급격하게 감쇠하는 파형이 아니라 연속적인 직사각형 또는 대략 직사각형을 사용한다. 본 발명의 방법에 유용한 다른 파형은 그 전체가 본 명세서에 원용된 미국특허출원번호 제10/875,801호(공개번호 제2004/0267333호)에 개시되어 있다.

전술한 전기 신호는 간헐적인 치료 간격으로 또는 하루 종일 연속적으로 치료가 필요한 세포, 생물학적 조직 또는 개체에게 인가된다. 본 명세서에서 치료 간격은 파형이 펄스 또는 연속 모드로 인가되는 시간 간격으로서 정의된다. 치료 간격은 약 10분 내지 약 4시간 지속시간, 약 30분 내지 약 2.5시간 지속시간 또는 약 1시간 지속시간이 될 수 있다. 치료 간격은 매일 약 1 내지 100회 일어날 수 있다. 치료 간격의 지속 시간 및 주파수는 세포 분열증식, 세포 분화, 뼈의 발육, 성장 또는 치료를 촉진시키는 데에 유효한 양의 전기 자극을 얻기 위하여 각각의 경우에 대하여 조절될 수 있다. 가장 효율적인 처리 변수들을 결정하도록 변수들이 조절될 수 있다.

신호는 원한다면 24시간 인가가 사용될 수 있다고 하더라도 치료 간격에서 긴 지속 시간을 필수적으로 필요로 하지 않는다. 전형적으로, 30분(매일 수회 반복됨)은 생물학적 유효성을 위해 필요하다. "시험관"에서의 세포 분열증식은 세포 카운트, 핵산의 증가 또는 단백질 합성과 같은 표준 수단에 의해 측정될 수 있다. 세포간질의 단백질(콜라겐 타입 Ⅰ,Ⅲ 및 Ⅳ) 뿐만 아니라 성장 인자 및 사이토카인(cytokine)(TGF-B, VEGF, SLPI, FN, MMPs 등)의 상향 조절 또는 하향 조절이 또한 측정될 수 있다(mRNA 및 단백질 합성). "체내"에서의 효과는 손상에 대한 치료 율에 의해 또는 뼈의 질량 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 뼈 조직의 분열증식, 분화 또는 광물화에 대한 다른 진단 방법은 당업자라면 쉽게 알 수 있을 것이다.

하나의 실시예에서, 분열증식-촉진 신호와 분화-촉진 신호는 순차적으로 사용된다. 이러한 파형의 조합은 세포 갯수를 증가시킨 다음 세포의 분화를 촉진시키는 데에 사용된다. 예로서, 분열증식 신호와 분화 신호의 순차적인 사용은 골아세포의 분열증식을 촉진한 다음 골아세포의 광물 생성 골세포로의 분화를 촉진하여서 뼈의 광물화를 촉진하거나 이와 반대로 사용될 수 있다. 예를 들어, 분열증식-촉진의 A-타입 신호가 먼저 "시험관"의 또는 "체내"의 세포 개체군에 수시간, 수일 또는 수주일 동안 인가된 다음, 분열증식 촉진 신호는 광물화-촉진의 B-타입 신호로 교체되어 뼈의 광물화가 이루어질 때까지 수시간, 수일 또는 수주일 동안 인가되는 치료 체계가 사용될 수 있다. 다음, 생성된 조직은 환자를 위해 이식될 수 있다. 모든 신호는 분열증식, 분화 및 광물화를 동시에 촉진하기 위해 동시에 인가될 수도 있다.

전기 신호는 피부 전극, 또는 전기화학적 결합에 의해 전달될 수 있다. 피부 전극은 척추, 골반, 팔에 각각 적용하여 사용할 수 있는 1 ½ × 12, 2 × 3 ½, 및 2 × 2 인치의 크기로 구입가능하다. 이러한 재사용가능한 전극은 라텍스를 함유하지 않고 심각한 피부 염증을 유발하지 않기 때문에 이점이 있다. 재사용가능한 전극은 여러 가지의 시간으로 사용될 수 있으며, 또한 환자에게 비용을 감소시킬 수 있다. 이러한 전극은 전극 ＃214(1/5' × 13"), ＃220(2" × 2"), ＃ 230(2" × 3/5")(상표명 KOALATY PRODUCT, Tampa, FL.) 또는 전극 ＃T2020(2" × 2") 및 ＃2030(2" × 3.5")(상표명 VERMED, INC, Bellows Falls, VT.)를 포함할 수 있다.

전자기 코일 대신 피부 전극을 사용하는 것은 여러 가지의 이점이 있다. 첫째, 피부 전극은 더 효율적이다. 전극에 의해, 신체로 실제 보내어질 신호만이 발생되어야 한다. 코일에 의하면, 조직과의 약한 전자기적 결합으로 인해, 입력되는 신호는 조직에서 원하는 것보다 몇 배나 더 강해야만 한다. 이것은 코일보다 어쩌면 더 간단한 전극에 대해서 필요한 회로를 생성하지만, 더 적은 작동 전력을 필요로 한다. 둘째, 피부 전극은 사용자에게 더 친화적이다. 피부 전극은 동등한 신호 레벨을 전달하는 데에 필요한 코일의 무게와 부피의 겨우 몇 퍼센트만을 갖는다. 마찬가지로, 양호한 결합 성능 때문에, 전극을 구동하는 신호 생성기는 코일의 신호 생성기보다 더 작고 더 가볍게 만들어질 수 있다. 짧은 시간이 지나면, 착용자는 전극이 있는 지를 거의 인식하지 못한다. 셋째, 피부 전극은 더 경제적이다. 각각 수백 내지 수천 달러의 비용이 드는 코일과 달리, 전극은 통상 1달러 미만의 비용이 드는 "1회성"의 물품이다. 또한, 더 좋은 효율성과 단순성으로 인해, 이들을 구동하는 신호 생성기와 배터리는 코일의 신호 생성기에 비하여 작고 제조하기에 비용이 적게 든다. 넷째, 피부 전극은 더 단순한 배터리 구조와 더 긴배터리 수명을 허용하여 이 장치를 사용함에 있어 환자의 편의성을 용이하게 한다. 마지막으로, 피부 전극은 전자기 코일보다 더 다용도로 사용된다. 코일은 적용할 신체 부분의 기하학적 특성에 맞도록 만들어져야 하며, 각각 치료하고자 하는 부분 을 에워싸거나 둘러싸기에 충분하게 커야 한다. 이것은 신체를 "감싸는" 것을 의미하며, 코일의 크기 및 형상이 상당히 달라야 하며, 어떤 것은 상당히 크다. 다른 한편, 전극에 의하면, 전류 분배는 전극 설치에 의해서만 결정될 수 있으며 사이 체적의 전체를 통해 용이하게 예측할 수 있으므로, 신체가 몇몇의 전극 타입들에 일련의 양호하게 선택된 설치를 추가함으로써 "감싸질" 수 있다.

- 자극 시스템 -

본 발명에 의하면 세포와 전기 신호를 세포에 전달하기 위한 자극기를 포함하는 생물학적 시스템이 또한 고려된다. 이러한 세포는 줄기 세포와 같은 전구 세포, 수임된 전구세포(committed progenitor), 비수임된 전구세포(uncommitted progenitor), 다기능 전구 세포, 만능 전구 세포 또는 분화의 다른 단계에 있는 세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 세포는 배아기, 태아기 또는 성숙기의 세포일 수 있으며, 자가 조직으로부터 또는 동종이계(同種異系)의 공급원으로부터 채취되거나 분리될 수 있다. 하나의 실시예에서, 비증식성 세포가 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있지만 증식성 세포가 사용되었다. 이러한 세포는 "시험관"에서, 예를 들어 조직 배양시, 또는 조직을 처리하거나 조직을 치료하기 위해 "체내"에서 결합될 수 있다. 이식된 줄기 세포는 손상 부위 또는 환부에 선택적으로 유인된 다음 치료를 증대시키기 위해 전기적으로 자극을 받을 수 있다.

본 발명의 방법 및 목적에 따라 세포 배양체를 자극하는 것은 또한 배양 공정을 방해하거나 오염을 야기하지 않으면서 다수의 배양 용기에 균일한 파형을 동 시에 전달하는 효과적인 수단을 필요로 한다. 바람직하게는 신호의 인가를 위해 특수하게 설계되고 용량적으로 결합되어 양극산화피막처리된(anodized) 전극 시스템을 사용하는 다중-용기 시스템으로서 연결된 6개의 조직 배양 용기를 포함하는 배양 중에 배양체를 전기적으로 자극하기 위한 장치가 본 발명에 제공된다. 리본형의 케이블 부착물을 사용함으로써, 배양기의 시일에서의 누설이 최소화되어 배양을 위해 제어된 CO₂ 분위기를 유지한다. 도 4에는 전형적인 장비가 부분적으로 개략적인 형태로 도시되어 있다.

예를 들어 도 4에 도시된 장비에서, 6개의 조직 배양 용기(110a 내지 110f)들은 서로 연결되어 있으며, 각각의 용기는 챔버의 양단부에서 2개의 15 mm 직선 와이어 부분들과 1개의 7.5 mm 직선 와이어 부분으로 형성되고, U자형 벤드(bend)로 접합되고, 브릿지(112)의 중간 부분에 직각으로 연결된 전극(140)들을 포함한다. 이러한 7개의 브릿지들은 도 4에 도시되어 있다. 전극(14)은 충전 깊이가 통상 3 mm이고 내부가 18 mm × 48 mm 인 Lab-Tek Ⅱ 미끄럼 챔버의 단부 용기(end well)에 맞도록 치수가 정해진다. 이러한 전극의 전기용량은 약 0.56 마이크로패럿(microfarad)이다. 브릿지(112a, 112g)는 약 15cm의 와이어를 각각 내포한 단부-용기 나선부(144)를 구비한다는 점에서 다른 것과 다르다. 그 결과 브릿지 와이어(112a 또는 112g)와 상응하는 은(silver) 전극(104) 사이의 전기용량은 약 2.3 마이크로패럿이 된다.

견고하고 비교적 비활성인 금속으로 형성된 브릿지(112a, 112b) 등은 챔 버(110a, 110b) 등을 단부 용기(106a, 106b)들 사이에서 전기적으로 직렬로 연결한다. 본 명세서에는 6개의 챔버들(110a 내지 110f)과, 7개의 브릿지들(112a 내지 112g)이 도시되어 있지만, 다른 편리한 숫자인 챔버의 "n"과 브릿지의 "n ＋ 1"이 사용될 수 있다. 또한, "n"개의 챔버, "n ＋ 1"개의 브릿지 및 2개의 단부 용기로 각각 이루어져서 이렇게 직렬 연결된 복수의 그룹들은 단일의 신호 공급원(100)으로 사용될 수 있으며, 저항기 회로망과 같은 신호 분배 수단을 사용하여 그룹들 사이에서 신호 에너지를 분배하며, 이것은 전자공학의 신호 전송 분야에서 널리 공지되어 있다.

12개의 챔버 전극 단부, 2개의 단부-용기 나선 전극(106) 및 기술된 바와 같은 6개의 챔버를 구비한, 도시된 장비의 전체 전기 임피던스는, 주로 0.045 마이므로패럿의 전기용량성 성분과 약 10,000 옴(ohm)의 저항성 성분을 합한 것이다. 신호 공급원(100)과 단부 용기(106a) 사이에 연결된 직렬 저항기(도시하지 않음)는 인가된 전류를 원하는 레벨로 조절할 수도 있고 직렬 리액턴스(reactance)의 전기용량성 부분을 낮출 수도 있다. 예를 들어, 1 메그옴(Megohm)의 저항기에 의해, 주파수 응답은 5 Hz 로부터 3 MHz 까지 +/- 3 dB 내에서 균일하다.

원한다면, 챔버 내에서의 신호 에너지 분배는 확대된 챔버(110b)에서 도시된 바와 같이 프로브로 측정된다. 적절한 비활성 금속이지만 바람직하게는 전극(104a, 104b)과 같이 99.9%의 순수한 은(silver)으로 만들어지고, 팁을 제외하고는 절연되고, 이들 팁이 공지의 고정된 거리로 이격된 프로브(120)들은 배지(medium, 122) 내에 침지되어 연속적으로 위치 이동하는데, 바람직하게는 직사각 형의 격자를 나타낸다. 각각의 위치에서의 분화(differential) 전압은 Analog Devices AD522와 같은 분화 증폭기(124)에 의해 판독되고, 디스플레이 또는 기록을 위한 오실로스코프 또는 다른 장치(126)로 보내진다.

이 결과는 확대된 챔버(110b)에 대하여 다시 도 4의 하단에 도시된 바와 같이 각각의 지점에서의 신호 강도의 비율을 전체 평균으로 나타내는 숫자의 배열로서 알맞게 나타내어진다. 변경적으로, 색상-코딩 또는 3차원 그래핑(graphing)과 같은 다른 수단이 사용될 수 있다.

도 4에서 격자로 도시된 바와 같이, 직사각형 챔버의 폭이 좁은 단부에 설치된 전극에 의한 신호 분배는 전극 자체에 근접한 적은 부분을 제외하고는 전형적으로 매우 균일하다. 도 4에서 하단 좌측의 상기 평균 기록은, 예를 들어, 절단된 와이어 단부에서 불완전하게 정화된 산화물로부터 생겼을 수 있다.

취급상의 편의를 위해, 최소한의 배지 증발을 위해, 그리고 무균 상태 유지를 용이하게 하기 위해, 하나의 그룹 내의 모든 챔버, 브릿지 및 단부 용기는 견고한 유리판 또는 다른 무균화 가능한 캐리어 위에 적절히 조립될 수 있으며, 다음, 일단 조립된 이러한 하나 이상의 판은 견고한 플라스틱 박스와 같은 외부 용기 내에 둘러싸여 질 수 있다.

또한, 본 발명은 뼈의 성장 또는 치료를 촉진하기 위해 전기 신호를 전달하는 신규의 자극 장치를 제공한다. 상세하게는, 신규의 수동적인 전극 시스템은 전기 신호를 전달하기 위해 마련된다. 이러한 전극 시스템은 "시험관" 또는 "체내"의 적용을 위하여 시변화(time-varying) 전기 신호를 결합하는데, 전기용량적인 결 합을 위해 유도에 의해 PEMF 타입 신호를 전달하는 종래의 전해질 브릿지 기술을 대신한다. 전극 시스템은 니오브(niobium), 탄탈(tantalum), 티타늄(titanium), 지르코늄(zirconium), 몰리브덴(molybdenum), 텅스텐 및 바나듐(vanadium)과 같은 양극산화피막처리된 금속으로 만들어지지만 이에 제한되지는 않는다. 알루미늄과 스테인레스강은 염화물 이온을 함유하는 용액에 의해 침식되지 않으므로 이러한 특성을 훨씬 더 적은 정도로만 공유한다. 약 1 Hz 이하로부터 약 30 MHz를 초과하는 것까지 회로를 조정한 통상 약 5 Hz 내지 3 MHz사용가능한 주파수에서, DC 전류 통과는 무시할 수 있다.

니오브는 자체-부동태화(self-passivating)인 여러 금속들 중의 하나이므로, 산소와 습기에 노출될 때 얇지만 상당히 내구성이 있는 표면 산화물층을 형성한다. 이 공정은 양극산화피막처리에 의해 제어된다. 일반적으로 자체-부동태화는 다른 금속과의 확실한 결합을 어렵게 하지만, 본 발명의 설계는 독특하게도 전기용량적 결합을 사용하여 전극에 전류를 유도하며 이에 의해 다른 금속들과의 전기적인 결합의 형성의 어려움을 회피한다. 이 전극 시스템은 무시할 수 있는 전기분해를 제공하고 생리적으로 심각한 세포독성을 제공하지 않으며, "체내" 적용에 또한 유용하다.

본 발명의 전극 시스템에 사용되는 와이어는 "자체-보호"이므로, 습기 또는 산소에 노출될 때 얇지만 상당히 내구성이 있고 단단하게 부착되는 비반응적 산화물의 표면층을 형성한다. 이렇게 형성된 산화물은 높은 유전체 상수를 가지며, 산화물의 두께는 실질적으로 균일하며 미세하게 조절될 수 있다. 보호 산화물 코팅 은 금속이 교류 전류(제로(0)의 순수한 하전, 즉 ZNC(zero net charge)의 전기 신호를 배양 배지에 균등하게 분배하고 전기분해를 무시하면서 유도하기 위한 결합 축전지로서 작용하게 한다.

전체에 걸쳐 참조번호 100으로 표시된 자극기 또는 다른 신호 공급원은, 와이어, 클립형 도선을 통하거나 다른 적절한 수단(102)에 의해, 단부 용기(106a, 106b) 내의 전기 전도성 유체 내에 침지되는 한 쌍의 비활성 금속 전극(104a, 104b)에 연결된다. 이것들은 신호가 배양 챔버(106a, 106b)의 조립체 등으로 인가될 진입 지점을 제공한다. 순수한(순도 99%) 은(silver)이 전극(104a, 104b)용으로 바람직하고, 염류(saline)가 단부 용기(106a, 106b) 내의 유체용으로 바람직한데, 사용시 얇은 층의 은 염화물이 경계면에서 형성되고 가역적인 전기화학적인 반응을 통해 전류의 통과를 용이하게 하기 때문이다. 그러나, 다른 금속과 유체도 사용될 수 있다.

브릿지(112a, 112b) 등은 세포독성이 없다면 임의의 비교적 비활성인 금속으로 형성될 수 있다. 생물학적 유체에 대한 비활성 전극으로서 통상적으로 사용된 금속은 은, 금, 백금 및 다른 백금류 금속이다. 불행하게도 이러한 금속은 비싸며, 그 표면에서(특히 약간의 불순물이 존재한다면) 전기화학 반응을 허용하거나 심지어 촉진하며, 이러한 반응의 생성물은 세포독성을 가질 수 있다.

이러한 이유로, 물 또는 수성 용액과 접촉하여 얇고, 연속적이고, 상당히 불용해성의 생물학적으로 비활성인 표면 산화물층을 형성하여 금속이 더 이상 유체와 접촉하지 않도록 밀봉하는 소위 "자체-보호" 금속의 그룹이 본 발명에 바람직하다. 이 산화물은 전기 신호 전달 시스템과 배양 배지 사이에서만 접촉을 형성한다. 이러한 금속은 니오브(niobium), 탄탈(tantalum), 티타늄(titanium), 지르코늄(zirconium), 몰리브덴(molybdenum), 텅스텐 및 바나듐(vanadium)을 포함한다. 알루미늄과 스테인레스강은 염화물 이온을 함유하는 용액에 의해 침식되지 않으므로 이러한 특성을 훨씬 더 적은 정도로만 공유한다(생물학적 유체와 거의 유사하게 작용함).

이러한 금속 위의 산화물 형성이 증대될 수 있으며, 산화물의 두께는 양극산화피막처리를 통해 미세하게 제어가능한 방식으로 증가된다. 균일한 산화물 두께는 금속 표면의 단위 면적에 대하여 균일한 전기용량을 부여하며, 표면에 대하여 유체 내에서의 형상에 거의 상관없이 비교적 균일한 신호 강도를 산출한다. 절단 및 형성에 의해 야기된, 산화물 내의 작은 파손은 유체와의 추가 반응에 의해 신속하게 고쳐진다.

니오브가 이러한 적용에 특히 바람직한데, 양극산화피막처리에 의해 생성된 표면 산화물(Nb₂O₅) 내에서 빛의 간섭에 의해 야기된 선명하고 안정적인 색상으로 인해, 장신구에서 인기가 있고 따라서 비싸지 않은 가격으로 편리한 형태로 구입할 수 있으며 다양한 저장 색상이다. 예를 들어, Rio Grande Jeweler's Supply는 미리 양극산화피막처리된 20 및 22 게이지의 둥근 니오브 와이어를 "자주색", "분홍색", "암청색(dark blue)", "암회색(teal)", "녹색" 및 "금색"으로 저장할 수 있으며, 각각의 색상은 서로 다른 산화물 두께를 나타낸다. 이 와이어는 임의의 원하 는 전극 형상으로 용이하게 가공 및 형성된다. Nb₂O₅의 굴절율(N_D)이 2.30 이고, 그 유전체 상수(ε_R)가 41ε_O 이면, 산화물의 두께는 광반사 스펙트럼으로부터 쉽게 측정될 수 있으며, 그 결과 단위 면적 또는 와이어 길이 당 전기용량이 계산될 수 있다. "자주색" 와이어는 420-nM 피크 반사율에서 48 nM으로 측정된 가장 얇은 산화물을 가지며, 따라서 22 게이지의 "자주색" 와이어(.0644 cm 직경; Rio Grande 카탈로그 번호 638-240)에 대하여 전기용량은 와이어 길이의 센티미터 당 0.154 마이크로패럿으로 계산된다. 직접적인 측정은 산화물의 파손으로 인해 초기에 매우 높은 기록을 나타내지만, 염류 내에서 24시간 지난 후에 측정된 전기용량은 센티미터 당 0.158 마이크로패럿으로 안정화되어 예상치에 접근하였다.

따라서, 브릿지(112a, 112b) 등은 유체 또는 이온 유동이 통과할 가능성이 없다는 것을 제외하고는 종래의 염류 브릿지와 같이 전기적으로 많은 작용을 하며, 따라서, 챔버들 사이에서 또는 챔버와 단부 용기 사이에서 교차-오염 가능성을 회피한다. 또한, 종래의 염류 브릿지에서 생기는 증발 및 파손 가능성의 문제와 한천 배지 또는 다른 겔 작용제로 작업함에 있어서의 불편함이 회피된다. 브릿지들은, 전기용량성이기 때문에, 직류를 차단하고 따라서 챔버에 도달하는 신호는 직류 성분이 제거된 위상들 사이에서 전하-균형이 맞춰진다.

성장 배지와 접촉하는 모든 브릿지 단부들은 바람직하게는 거의 동일한 부피를 가지고 거의 동일한 와이어 길이를 포함하며, 따라서 모두 거의 동일한 전기용량을 가지며, 도 4의 확대된 챔버(110b)에 도시된 바와 같이 자체가 바람직하게는 직사각형인 배양 챔버의 폭 좁은 단부에 대하여 설치된다. 단부 용기들 내의 유체와 접촉하는 브릿지 단부들(예를 들어, 도 4에서 브릿지의 좌측 단부들(112a, 112g))은 원한다면 접촉을 증가시키고 전기용량을 감소시키고, 그리고/또는 단부 용기가 배양 챔버와 다른 경우 이에 크기와 형상에 잘 맞도록 여러 가지의 형상으로 될 수 있다. 예를 들어, 둥근 단부 용기가 사용되면 그 안에 침지되는 브릿지 단부들은 도 4에 도시된 바와 같이 나선부(144)로 적절하게 형성될 수 있다.

따라서, 요약하면, 본 발명에서 의도된 바와 같은 생물학적 시스템은 이하의 요소들을, 즉, 전기 자극기, 양극산화피막처리된 금속 전극, 및 세포를 포함한다. 이러한 시스템에 사용하기에 적절한 PEMF 신호는 예를 들어 도 2 또는 도 3에 도시된 바와 같은 파형을 포함한다. 이러한 신호의 실제 적용은 뼈 조직의 분열증식, 분화 또는 광물화, BMP 발현의 증가, 또는 산화질소 생성의 증가를 포함한다.

- 조직 처리 -

본 발명의 방법은 조직 처리의 용도로 사용될 수도 있다. 세포는 시험관 내의 즉 "시험관"의 또는 "체외"의 기능 조직 또는 "체내"에서 기능 조직을 형성하도록 이식된 기능 조직을 생성하기 위해 생물학적으로 융화가능한 지지체(scaffold)와 결합하여 본 발명의 배양 시스템 및 방법을 사용하여 배양될 수 있다. 이식된 또는 숙주 줄기 세포는 손상 부위 또는 환부에 선택적으로 이식되거나 유인된 다음 치료 또는 회복을 증가시키기 위해 본 명세서에 기재된 전기 신호로 자극될 수 있다. 조직 지지체는 생물학적으로 융화가능한 천연 폴리머, 합성 폴리머, 또는 이 들의 화합물로부터 실질적으로 개방된 구조를 갖는 부직 개방 셀형(non-woven open celled) 세포간질로 형성될 수 있으며, 이것은 지지체의 숙주 내에서 목표 부위 내로의 융합 중에 지지체 내에서 성장하는 세포에 의해 가해지는 수축성의 압축력 또는 인장력에 견디기에 충분한 기계적 강도를 유지하면서 배양기 또는 "체내"에서 세포 침투하기에 충분한 공간을 제공한다. 조직 지지체는 제한된 형상의 견고한 3차원 구조를 생성하도록 강성 구조일 수 있고, 변경적으로 지지체는 가용성 조직을 생성하도록 약간 견고한 세포간질일 수 있다.

본 발명의 방법과 배양 시스템은 폴리머 단독, 코폴리머, 또는 이들의 혼합물로 만들어진 지지체의 사용을 포함한다. 폴리머는 생물학적으로 분해될 수 있거나 생물학적으로 안정하거나 그 조합일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생물학적으로 분해될 수 있는" 물질은 화학 접착제의 효소분해 또는 가수분해를 포함하는 생리학적 조건 하에서 부착되는 접착제를 포함하는 것이다.

적절한 천연 폴리머는 알지네이트(alginate), 셀룰로오스(cellulose), 덱스트란(dextran), 풀란(pullane), 폴리히알우론산(polyhyaluronic acid), 키틴(chitin), 폴리(3-히드록시알카노에이트(hydroxyalkanoate)), 폴리(3-히드록시옥타노에이트(hydroxyoctanoate)와 같은 다당류를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 알킬(alkyl), 알킬렌(alkylene), 히드록실레이션(hydroxylations), 옥시데이션(oxidations), 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 변형물과 같은 화학 군의 대체 및/또는 부가를 포함하는 상기 천연 폴리머의 화학적 유도체가 본 발명 내에서 또한 고려된다. 천연 폴리머는 콜라겐(collagen), 제인(zein), 카세인(casein), 젤라틴(gelatin), 글루텐(gluten) 및 혈청 알부민(serum albumin)과 같은 단백질로부터 선택될 수도 있다. 적절한 합성 폴리머는 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리(비닐 알콜), 폴리아미드, 폴리에스터 아미드, 폴리(아미노산), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리알킬렌(polyalkylenes), 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycols), 폴리알킬렌 산화물(polyalkylene oxides), 폴리알킬렌 테레프탈염산(polyalkylene terephthalates), 폴리오르소 에스테르(polyortho esters), 폴리비닐 에스테르(polyvinyl esters), 폴리비닐 할로겐화물(polyvinyl halides), 폴리에스테르(polyesters), 폴리락타이드(polylactides), 폴리실록산(polysiloxanes), 폴리카프로락톤(polycaprolactones), 폴리히드록시부티레이트(polyhydoxybutyrates), 폴리우레탄(polyurethanes), 스티렌 이소부틸 스티렌 블록 폴리머(SIBS, styrene isobutyl styrene polymer), 및 코폴리머와 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

생물학적으로 분해할 수 있는 합성 폴리머가 바람직하며, 이는 폴리 엘-락틱산(poly L-lactic acid, PLA), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid, PGA) 및 그 코폴리머(즉, 폴리 디,엘-락틱 코-글리콜릭산(poly D,L-lactic co-glycolic acid, PLGA)와 같은 폴리 알파-히드록시산(poly α-hydroxy acid)과 히알우론산(hyaluronic acid)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 폴리 알파-히드록시산은 FDA에서 인체 임상용으로 승인되었다. 다당류와 히알우론산을 포함하는 폴리머는 수용성임에 유념해야 한다. 수용성 폴리머를 사용할 때, 이러한 폴리머를 화 학적인 변형에 의해, 예를 들어, 가교제의 사용에 의해 부분적인 불수용성으로 만드는 것이 중요하다.

생물학적으로 분해할 수 있는 중합의 세포간질의 이점들의 하나는 혈관생성(angiogenic) 및 다른 대(對)생물활성(bioactive) 화합물이 세포간질 내로 직접 혼합되어 세포간질이 "체내"에서 퇴화됨에 따라 천천히 방출되는 점이다. 세포-폴리머 구조가 혈관을 발달시키고 이 구조가 퇴화함에 따라, 세포는 그 고유의 특성에 따라 분화할 것이다. 영양소, 성장 인자, 분화 또는 역분화(de-differentiation)(즉, 분화된 세포가 분화의 특성을 잃고 분열증식 및 보다 일반적인 기능과 같은 특성을 얻게 함)의 유도 인자, 분비물, 면역조절인자(immunomodulator), 염증억제인자, 퇴화인자, 림프계 또는 신경섬유의 내부 성장을 증대시키거나 허용하는 생물학적으로 활성인 화합물, 히알우론산, 당업자에게 공지되어 있으며, Collaborative Research, Sigma Chemical Co.와 같은 제조자로부터 유효량을 구성하는 것에 대한 사용설명서와 함께 구입가능한 약품, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), EGF, 및 HB-EGF와 같은 혈관 성장 인자를 포함하는 인자들이 세포간질 내에 혼합되거나 세포간질과 결합되게 제공될 수 있다. 마찬가지로, 부착 펩티드 RGD(Arg-Gly-AsP)와 같은 펩티드를 포함하는 폴리머가 세포간질을 형성하는 데에 사용하기 위해 합성될 수 있다.

- 키트(Kits) -

세포들의 단일 조직으로의 성장 및 융합을 지원하는 생물학적으로 융화가능 한 지지체를 갖춘 전기 자극기를 결합한 키트가 또한 본 발명에 제공될 수 있다. 전극을 설치한 용기가 키트에 제공될 수 있으며, 전극은 자체-부동태화 물질 또는 다른 종래의 전극 물질로 만들어질 수 있다. 이러한 키트는 성장 배지, 및 세포의 지지체에 대한 융합을 촉진하는 성장 인자와 같은 시약을 선택적으로 포함한다. 키트 내에 포함된 지지체는 성장 촉진 및 착생 분자가 그 표면에 고정되게 하도록 설계될 수 있다. 이러한 키트는 적절한 사용 및 최적 활용에 대한 설명서를 선택적으로 함께 포장할 수 있다.

세포는 적당한 조직을 생성하기 위해 키트의 다른 요소들과 결합하는 시점까지 보호 물질로 보존된 형태로 키트 내에 제공될 수 있다. 하나의 실시예에서, 액체 질소 내에 저온 보존되거나 트레할로스(trehalose)와 같은 화합물에 의해 건조된 세포가 제공된다. 세포는 만능 줄기 세포, 다기능 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함하는 미분화(undifferentiated) 전구세포, 또는 수임된 전구세포(committed progenitor)일 수 있다. 변경적으로, 최종적으로 분화된 세포는 또한 이러한 키트와 함께 사용될 수 있다. 이러한 키트는 뼈, 연골, 근육, 신장, 간, 신경계, 폐, 심장, 혈관계 등과 같은, 하지만 이에 한정되지 않는 기관계에 사용하기 위한 대체 조직을 생성하도록 설계될 수 있다.

세포는 환자 자신의 조직을 대체 조직으로 처리하기 위해 치료시에 환자로부터 채취될 수도 있다. 환자 자신의 조직을 사용하면, 조직 거부반응에 관련된 합병증이 감소되는 이식 조직을 생성하는 방법을 제공한다.

순수하게 전기적인 자극에 더하여, "시험관"에서 전기적인 자극과 기계적인 자극을 조합하는 것이 어떤 목적에 대하여 이로움을 발견할 수 있다. 기계적인 자극은 인장 하중 인가, 압축 하중 인가, 또는 전단 하중 인가로 이루어질 수 있다. 전형적인 장비는 도 8의 (a) 내지 (e)에 단면으로 도시되어 있다.

각각의 하중 인가의 경우에, 시험 장비는 배양 용기의 견고한 기계적인 바닥부(208)의 일부일 수도 있고 아닐 수도 있는 바닥 시트 또는 멤브레인(206)에 통상적으로 부착된 세포층(204) 및 배지(202)를 포함하는 당해 기술분야에서 공지된 타입의 배양 용기 또는 챔버(200)의 주위에 설치된다. 기재된 임의의 재사용가능한 금속이며, 특히 바람직하게는 자체-보호 금속이며, 더 바람직하게는 양극산화피막처리된 니오브인 전극(210)은 배지(202)의 전체에 걸쳐 비교적 균일한 전류 분배를 발생하는 방식으로 챔버(200) 내에 설치된다.

인장 하중 인가를 위해, 멤브레인(206)은 도 8의 (a)에 도시된 바와 같이 배양 용기 즉 챔버(200) 내에 부가적인 이중 바닥(false bottom)을 형성한다. 멤브레인(206)은 플라즈마 에칭된 실리콘 고무와 같은, 세포가 부착할 적절히 가요성이고 탄성적인 물질로부터 만들어질 수 있다. 튜브(212)는 멤브레인(206)과 견고한 챔버 바닥부(208) 사이의 공간을 외부 펌프 또는 일정하거나 변동하는 다른 압력 또는 진공 공급원(216)과 연결한다. 압력 또는 진공 공급원(216)의 간헐적인 작동은 멤브레인(06)을 상하로 구부려서, 멤브레인 및 이에 부착된 세포층(204)에 간헐적인 인장을 발생시킨다. 변경적으로, 공급원(216)은 장기간 동안 멤브레인(206)을 가로질러 압력을 거의 또는 전혀 인가하지 않을 수 있으므로, 세포(204)가 멤브레인을 팽창하지 않은 상태로 이식하게 한 다음, 예를 들어 세포(204)가 막 합류에 도달하고 간극-이음 접촉을 이루는 배양 성장 지점에 상이한 압력을 가함으로써 멤브레인(206)을 팽창시킨다.

압축 하중 인가를 위해, 배양 용기 또는 챔버(200)는 도 8의 (b)에 도시된 바와 같이 커버(220)로 대신 밀봉되고 압력 공급원(21)에 직접된다. 공급원(216)은 일정하거나 변동하는 유체 정역학적 압력을 배지(202) 내에 발생시키며, 따라서 이 압력은 세포층(204)에 직접 가해진다.

압력 하중 인가를 위한 변경적인 수단으로서, 튜브(212)와 압력 공급원(216)는 제거되고, 챔버 커버(220)는 도 8의 (c)에 도시된 바와 같이 일정하거나 변동하는 압력이 배지(202) 및 세포(204)에 직접 가해질 수 있게 하는 가동 피스톤의 형태를 갖는다.

전단 하중 인가를 위해, 배양 용기(200)는 도 8의 (d)에 도시된 바와 같이 배지(202)가 순환되게 하는 2개의 튜브(212a, 212b)를 통하지 않고 압력 공급원(216)에 연결되어 있다. 이러한 유동은 단일 방향으로 일정하거나, 간헐적이거나, 변동할 수 있다. 각각의 튜브는, 개략적으로 화살표(222)로 도시된 바와 같이, 보다 균일한 유동을 이루도록 배플(baffle, 220)을 구비하는 것이 바람직하다. 배플(220)은 도시된 바와 같이 전극(210)과 별개로 만들어질 수 있으며, 또는 변경적으로 전극은 그 자체가 배플을 형성하도록 천공되거나 아니면 비연속적으로 만들어질 수 있다. 배지(202)의 이동과 세포층(204)에 대한 그 마찰은 원하는 전단 하중 인가를 발생시킨다.

전단 하중 인가를 제공하기 위한 다른 수단으로서, 튜브(212a, 212b)와 압력 공급원(216)은 개략적으로 화살표(232)로 도시된 바와 같이 배지(202)를 세포층(204)에 대하게 이동하게 유지시키는 이동 임펠러(230)로 대체된다. 임펠러(230)는 여러 가지의 형태를 가지지만, 도 8e에 도시된 원통 형태인 것이 유리하며, 여기에서 견고한 챔버(200)의 바닥부(208)는 임펠러와 동일한 형상으로 되고 임펠러의 표면으로부터 비교적 균일한 간극을 유지한다. 이에 의해 배지(202)는 단순히 임펠러(230)를 일정한 속도로 회전하게 유지시킴으로써 세포(204)에 대하여 연속적으로 일정한 속도로 씻겨진다. 변경적으로, 임펠러(230)의 속도의 변화는 유동 속도 및 전단 하중 인가의 레벨을 변화시킬 것이다. 전극(210)은 이 장치에서 다양한 위치를 가지므로 도시하지 않았다. 그러나, 바람직하게는 견고한 세포 바닥(208)과 임펠러(230) 자체는 적절한 전극 금속으로 만들어지고, 더 바람직하게는 자체-보호 금속으로 만들어지고, 가장 바람직하게는 양극산화피막처리된 니오브로 만들어지고, 자체가 전극으로서 기능한다.

- 뼈 성장의 분화(differential) 조절 -

전술한 본 발명의 파형은 "체내"에서 뼈 조직의 성장 및 치료를 촉진하는 방법에 또한 유용하다. 전술한 바와 같이, A-타입의 파형에 의한 자극은 세포의 분열증식을 촉진한다. A-타입의 파형은 또한 뼈의 모르포겐 단백질(morphogenic protein, BMP)을 증가시켜 분화를 촉진한다. 하나의 실시예에서, A-타입의 또는 보다 작은 정도의 B-타입 전기 신호를 사용하여 BMP-2 및 BMP-7 생성물의 증가가 야기된다. 이러한 결과는 상당히 유용하며 "체내"에서 조직을 적절히 치료하거나 조직 이식을 유발하기에 충분한 조직의 생성을 증대시키는 방법을 제공한다. 이 신호는 또한 조직 처리를 위해 폴리머 지지체 내로 침투하기에 충분한 세포 질량을 제공하기에 또한 유용하다. 다른 하나의 실시예에서, "시험관" 시험에서 증명된 바와 같이, "체내"에서의 자극은 골아세포의 분열증식 및 분화를 제공하여 광물화를 위한 골아세포의 갯수를 증가시킨다. 이러한 세포 갯수의 증가는 전기 자극을 통해 뼈를 성장시키거나 재생시킴에 있어 간극 또는 구멍을 채우는 방법을 제공한다. A-타입의 파형에 의해 유도된 분열증식을 통해 생성된 세포는 즉시 사용될 수 있거나 추후 필요성이 있을 때까지 종래의 세포 보존 방법을 사용하여 보존될 수 있다.

B-타입의 파형에 의한 자극은 분열증식을 적은 정도로 촉진하며, A-타입의 파형과 상이한 작용을 갖는다. B-타입의 파형에 의해 촉진된 작용은 광물화, 세포 밖의 단백질 생성, 및 세포간질 조직화를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. B-타입의 파형의 작용은 또한 매우 유용하며 광물화 단계 및 새로운 뼈 조직의 골화작용을 증가시키는 방법을 제공한다. B-타입의 파형이 칼슘/칼모둘린(calmodulin)의 경로를 통해 그리고 뼈 세포 위의 G-단백질 결합 수용기 또는 기계적 자극 수용기(mechanoreceptor)의 자극에 의해 작용할 수 있는 것이 제시되었다(Bowler, Front Biosci, 1998, 3:d769-780; Baribault et al., Mol Cell Biol, 2006, 26(2):709-717). 이와 같이, 칼슘/칼모둘린-조절 작용 뿐만 아니라 전기 자극을 사용하는 G-단백질 결합 수용기 또는 기계적 자극 수용기의 활동을 조절하는 방법이 또한 제공될 수 있다. 이러한 세포 경로 및 수용기의 조절은 "체외" 또는 "체 내"에서의 뼈 조직의 성장 및 치료를 촉진하는 데에 매우 유용하다.

C-타입의 파형에 의한 자극은 뼈의 재생, 성숙 및 경화를 촉진한다. 이러한 파형은 또한 매우 유용하며, 새로운 뼈 조직의 광물화 단계 및 골화작용을 증가시키는 방법을 제공한다.

D-타입의 파형을 사용한 자극은 연골의 성장과 치료 및 뼈의 경화를 촉진하며, 골다공증 또는 골관절염의 치료 또는 전환에 유용하다. 이러한 파형의 적용은 손상된 연골의 치료, 골다공증을 가진 환자의 골밀도 증가와 같은 "체내" 적용 뿐만 아니라 예를 들어 연골의 조직 처리에 관련된 "체외" 적용을 포함한다.

치료 체제의 발전을 위해 본 명세서에 기재된 파형의 조합 또는 연속적인 사용에 대한 방법이 또한 제공되어 뼈연골 조직을 성장시키거나 재생시키는 데에 있어서 특효가 있는 생물학적 결과를 초래한다.

하나의 실시예에서, 뼈에 병이 환자의 골절은 골절을 치료하는 신호로 치료되어 뼈를 강화한다. 이 실시예에 대하여 한정하지 않는 예로서, 골절이 있는 골다공증 환자는 먼저 A-타입의 신호로 자극되어 분열증식 및 성장 인자의 방출을 촉진한 다음 B-타입의 파형으로 자극하여 치료 부위의 골밀도 증가를 증가시켜서 뼈의 질량 밀도를 증가시키고 재골절을 방지함으로써 치료될 수 있다.

다른 하나의 실시예에서, 본 명세서에서 기술된 2개 이상의 타입의 파형을 조합하는 것은 뼈연골 조직의 연속적인 분열증식, 분화 및 광물화를 촉진하는 데에 사용될 수 있다. 이 실시예를 한정하지 않는 실시예로서, 골아세포의 배양은 폴리머 세포간질과 연결되거나 연결되기 전에 A-타입의 신호의 영향 하에서 성장될 수 있다. 폴리머 세포간질을 심은 다음, B-타입의 신호가 세포-세포간질의 구성체에 인가되어 뼈의 이식에 유용한 구성체의 광물화를 촉진한다.

제3 실시예에서, 2개 이상의 신호들이 동시에 인가되어 "체내" 또는 "시험관"에서 부수되는 분열증식, 분화 및 광물화를 촉진할 수 있다. 하나의 신호만을 전달하는 것보다 더 많은 효과를 내기 위해 상이한 신호들이 뼈연골 조직에 연속적으로 가해질 수도 있다. 연속적인 공정은 추가의 조직(뼈와 같은)을 생성할 필요가 있음에 따라 원하는 생물학적 효과를 얻기에 충분한 시간 동안에 2 단계 공정을 통해 순환함으로써 반복될 수 있다. 특효가 있는 비한정적인 예로서, A-타입의 신호가 먼저 인가되어 분열증식에 의해 더 많은 뼈 세포를 생성할 수 있으며, B-타입의 신호가 인가되어 더 많은 갯수의 뼈 세포를 유도하여 더 많은 뼈 조직(세포간질, 광물 및 유기조직)을 생성한 다음, 필요하다면 반복된다. 연속적인 자극 프로토콜(protocol)의 반복을 사용하여 생성된 뼈의 양은 단일의 신호 만에 의해 또는 단일의 신호를 조합하여 생성된 것보다 더 많을 것이다.

- 전구 세포 자극 -

본 명세서에 기재된 방법과 파형은 미분화 전구세포에 적용되어 수임된 계통으로의 분열증식 및/또는 분화를 촉진할 수 있다. 이러한 전구세포는 줄기 세포, 수임된 전구세포, 비수임된 전구세포, 다기능 전구세포, 만능 전구세포 또는 다른 분화 단계에 있는 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 골아세포와 연골아세포도 또한 특별히 포함된다. 또한 하나의 실시예에서, 다기능 성체줄기세 포(간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 또는 골수줄기세포(bone marrow stem cell))는 "시험관"에서 A-타입의 신호로 자극되어 다기능 성체줄기세포의 뼈, 결합 조직, 지방 등과 같은 특수한 통로로의 분열증식 및 분화를 촉진한다. 양 신호의 조합 또는 연속적인 인가가 전술한 바와 같이 전구세포 자극을 위해 또한 고려된다.

변경적으로, 본 명세서에 기재된 파형과 방법은 "체내"에서 다기능 성체줄기세포(간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 또는 골수줄기세포(bone marrow stem cell))에 적용되어 A-타입의 신호로 자극되어 다기능 성체줄기세포의 뼈, 결합 조직, 지방 등과 같은 특수한 경로로의 분열증식 및 분화를 촉진할 수 있다. 양 신호의 조합 또는 연속적인 인가가 또한 고려된다.

전구세포의 전기적인 자극은 전구세포의 분열증식 또는 분화를 촉진하는 것으로 알려진 분열증식 및 분화 인자와 함께 인가될 수 있다. 분열증식 인자는 세포에 미토겐 작용(mitogenic action)을 하는 화합물을 포함한다. 이러한 분열증식 인자는 bFGF, EGF, 과립구-콜로니(granulocyte-colony) 자극 인자, IGF-I 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 분화 인자는 세포에 대하여 분화 작용을 하는 화합물을 포함한다. 이러한 분화 인자는 레티노산(retinoic acid), BMP-2, BMP-7 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에 기재된 전기적인 파형은 "시험관" 또는 "체내"에서 뼈연골 조직의 생육과 성장에 대하여 분화적 및 조합적 조절을 제공한다. 광물화 전에 A-타입의 신호로 세포의 분열증식을 증가시키는 것은 뼈 세포의 갯수를 증가시키고 따라 서 B-타입의 신호에 의한 자극에 의해 이루어지는 후속의 광물화의 증가를 제공한다. 본 발명의 파형은 산화질소 및 뼈 모르포겐 단백질의 방출을 통해 전구 세포의 분열증식과 분화를 또한 촉진한다.

- 전기용량적 결합(capacitive coupling) -

"시험관" 및 "체내" 표본에서의 자극은 자체-부동태화 금속들에서 의해서는 종종 어려운데 금속들 사이에서 전기 접속을 얻기가 어렵기 때문이다. 본 발명은 견고한 전기적 접속을 얻는 것과 관련된 문제점이 없이 자체-부동태화(self-passivating) 금속 전극을 사용하는 이점을 얻는 방법을 제공한다. 이러한 전극의 전기용량적 결합은 전기적인 접속에 대한 필요성을 없앤 자체-부동태화 금속 전극을 통해 직류를 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 니오브(niobium), 탄탈(tantalum), 티타늄(titanium), 지르코늄(zirconium), 몰리브덴(molybdenum), 텅스텐, 바나듐(vanadium), 알루미늄 및 스테인레스강과 같은 자체-부동태화 금속으로부터 만들어진 전극은 살균되어 자극할 세포의 개체군에 근접하게 설치된다. 회로 와이어는 염류 용액과 같은 도전성 배지 내에서 금속 전극에 근접하게 설치되며, 전기 신호는 와이어로부터 염류 및 산화물층을 통해 자체-부동태화 금속 전극으로 전기용량적으로 결합되는 전류에 의해 회로 와이어를 통해 전류로 전달되어 세포 개체군을 자극한다. 하나의 실시예에서, 전기용량적 결합 자극은 이에 한정되지는 않지만 세포 배양과 같은 "시험관" 적용에 사용된다. 하나의 배양 접시가 이 방법을 사용하여 자극될 수 있거나 여러 개의 배양 접시 또는 용기가 균일한 전 기 자극을 위해 함께 연결될 수 있다.

다른 하나의 실시예에서, 전기용량적 결합 자극은 살균하여 양극산화피막처리된 전극이 치료할 필요가 있는 환자 내로 이식되고 회로 와이어가 환자의 외부에 피부와 접촉하도록 설치되어 이식된 금속 전극에 유효 시간 동안 전류를 유도하여 조직의 치료 또는 성장을 촉진하는 "체내" 적용에 사용된다. 예를 들어, 전극의 외부 단부는 피부의 바로 밑에 편평한 코일을 형성할 수 있으며, 신호는 이 코일의 바로 위의 피부 위에 설치된 종래의 피부 접촉 전극을 사용하여 그 내에 결합될 수 있다. 조직에 근접한 전기용량적 결합이 필요하지 않은 전기용량적으로 결합된 전극의 일부는, 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이, 이식된 회로에 사용하기에 적합한 절연 물질로 덮여질 수 있으며, 따라서 신호의 손실 및 처리되지 않은 조직에 대한 불필요한 자극을 최소화한다. 뼈 치료와 같은 특수한 예에서, 자체-부동태화 금속으로부터 만들어진 것으로서 살균하여 양극산화피막처리된 금속 전극은 치료 및 자극될 필요가 있는 환자에 이식된다. 뼈의 치료를 위한 충분한 시간이 지난 후에, 전극은 환자로부터 제거될 수 있다.

- BMP 발현의 증가 -

본 발명은 자극된 세포로부터 BMPs(bone morphogenic proteins)의 발현과 방출을 촉진하기 위해 A-타입 및 B-타입의 파형을 사용하는 방법과 장치를 더 포함한다. 본 명세서에 기재된 전기 신호는 신호에 노출된 조직에 이득을 유도하기에 충분한 레벨로 BMPs의 방출을 야기하는 데에 사용될 수 있다. 이득은 신호에 직접 노출되지 않은 조직에서 발생할 수 있다.

BMPs는 골유도(osteoinduction)에 포함된 폴리펩티드(polypeptides)이다. 이것은 BMP-1을 제외한 변형 성장인자-베타 슈퍼패밀리(beta superfamily)의 일부이다. 적어도 20개의 BMPs가 데이터로 확인되어 연구되었지만, BMP-2, BMP-4 및 BMP-7만이 줄기 세포의 골아세포 성숙 세포로의 분화의 전체 공정을 자극하기 위해 "시험관"에서 가능하다. 최근의 연구는 정형외과적 조직 재생을 위해 BMPs를 전달하는 방법을 개발하고자 노력하고 있다(Seeherman, Cytokine Growth Factor Rev. 2005 Jun; 16(3): 329-45). 정형외과적 조직 재생을 위해 전문적으로 요구되고 비용이 많이 드는 전달 방법의 외인성(外因性) BMPs의 전달에 의하지 않고 전기 자극에 의해 "시험관" 또는 "체내"에서 BMPs의 방출을 유도하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

하나의 실시예에서, A-타입의 파형 및 이보다 적은 정도인 B-타입의 파형은 내생적인 BMPs의 발현과 방출을 유도하는 데에 사용된다. BMPs의 발현과 방출은 목표 조직의 성장과 분화를 촉진한다. 자극 전극의 설치는 BMP 발현을 증가할 필요가 있는 환자의 "체내" 또는 "시험관" 표본의 국부 영역에 BMP 발현의 목표를 정하는 방법을 제공한다. 하나의 실시예에서, BMP-2 또는 BMP-7 또는 이들의 조합은 목표 조직의 분화와 성장을 이루기 위해 내생적으로 방출된다. 특별한 실시예에서, BMP-2 또는 BMP-7 중 어느 하나 또는 둘 다의 방출은 뼈 또는 연골 조직에서 분화, 광물화, 단백질 생성 및 세포간질 체계화를 촉진한다.

- 산화질소에 의한 뼈, 연골 또는 다른 결합조직세포의 자극 -

본 명세서에 기재된 방법 및 전기 신호는 뼈, 연골 또는 다른 결합조직의 치료와 성장을 촉진하는 데에 또한 사용될 수 있다. 하나의 실시예에서, B-타입의 파형은 산화질소(NO)의 방출을 통해 세포의 성장을 증가시킨다. 이 파형은 신호에 노출된 조직에 이득을 유도하기에 충분한 레벨로 산화질소가 방출되게 한다. 이득은 신호에 직접 노출되지 않은 조직에서 발생할 수 있다. 뼈, 연골, 또는 다른 결합조직 세포의 성장은 전기적인 자극과 조합하여 산화질소 공여체(NO donor)의 공동 인가에 의해 더 증가될 수 있다. 산화질소 공여체는 니트로프루시드나트륨(sodium nitroprusside, SNP), SIN-1, SNAP, DEA/NO 및 SPER/NO를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 뼈, 연골, 또는 다른 결합조직 세포의 성장은 전기적인 자극과 조합하여 산화질소 신타아제 억제제(NO synthase inhibitor)의 공동 인가에 의해 감소될 수 있다. 이러한 산화질소 신티아제 억제제는 N(G)-니트로-l-아르기닌 메틸 에스테르(N(G)-nitro-l-arginine methyl ester, L-NAME), NG-모노메틸-L-아르기닌(NG-monomethyl-L-arginine, L-NMMA), 및 7-니트로인다졸(7-Nitroindazole, 7-NI)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 방법을 사용하여, 뼈, 연골, 또는 다른 결합조직 세포의 성장은 특별한 요구에 따라 조절될 수 있다.

- 본 발명의 장치 및 방법의 적용 -

본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 장치 및 방법을 사용함으로써, 이 장치와 방법은 뼈연골 조직의 생육, 분화, 성장 및 광물화를 촉진하는 데에 효과적이다.

이 장치는 다양한 생리적 조건에 대한 세포의 반응에 포함되는 사이토카인(cytokines)과 같은 화학적 인자의 방출을 증대시킴으로써 처리 부위에 직접 작용하는 것으로 생각된다. 이것은 혈액 유동의 증가를 유발하고 치료 부위에서의 추가의 염증을 억제하여서, 신체 고유의 치료 과정을 강화한다.

본 발명은 특히 수술 중에 잘라지거나 부러진 뼈를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단순하거나 복잡한(다중의 또는 분쇄된) 뼈 골절의 치료를 촉진하는 데에 사용된다. 본 발명은 척수 융합 수술 후에 척추의 융합을 촉진하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명은 불유합 골절(nonunion fracture)을 처리하고, 골다공증을 치료하거나 방지하거나 역행시키고, 골감소증을 치료하거나 방지하거나 역행시키고, 골괴사증을 치료하거나 방지하거나 역행시키고, 교직골(woven bone)(가골(callus), 뼈돌기)의 형성을 지연시키거나 역행시키고, 침대에서의 장기간 요양에서 뼈 칼슘의 손실을 지연시키거나 역행시키고, 극미중력에서 뼈 칼슘의 손실을 지연시키거나 역행시키는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 국부적인 혈액의 순환을 증가시키고, 외상 부위로의 혈액의 유동을 증가시키고, 만성 피부 궤양의 부위로의 혈액의 유동을 증가시키고, 혈액의 응고를 조절하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명이 또한 사용될 수 있는 영역의 하나는 손상되거나 찢어진 연골의 치료를 촉진하는 것이다. 또한, 본 발명은 피부의 상처나 궤양의 치료(표피화)를 촉 진하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명은 배양되는 세포 또는 조직의 생육을 조절하고, 세포의 분열증식을 조절하고, 세포의 분화를 조절하고, 세포의 사이클 진행을 조절하고, 변형 성장 인자의 발현을 조절하고, 뼈형성 단백질(bone morphogenetic proteins)의 발현을 조절하고, 연골 성장 인자의 발현을 조절하고, 인슐린유사 성장 인자(insuline-like growth factors)의 발현을 조절하고, 섬유아세포성장 인자(fibroblast growth factors)의 발현을 조절하고, 종양 괴사 인자의 발현을 조절하고, 인터루킨(interleukin)의 발현을 조절하고, 사이토카인의 발현을 조절하는 데에 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 방법과 장치는 이하의 비한정적인 실험예들에 의해 더 예시된다. 한 당업자라면 본 발명의 사상 및/또는 첨부된 청구항의 범위를 벗어나지 않는 본 명세서를 읽은 다음 그 여러 가지의 다른 실시예, 변경, 균등물이 제안될 수 있음을 알 수 있을 것이다.

실험예

실험예 1

1기 골아세포 배양액(Primary Osteoblast Culture) 내에서 광물화(Mineralization) 및 형태학(Morphology) 상의 PEMF 신호 구성(Configuration)의 효과

본 연구의 목적은 1기 골세포 배양액 내에서 생화학 및 형태학적인 변이를 평가함으로써 전기용량적 결합(capacitative coupling)으로 전달되는 2개의 PEMF 파형 구성을 비교하기 위한 것이다.

- 방법 -

골아세포 배양액(Osteoblast cell culture): 1기 인간 골아세포(CAMBREX^®, Walkersville, MD)는 75% 컨플루언스(confluence)까지 팽창되었고, 상술한 LAB-TEK^TM(NALGE NUNC INTERNATIONAL^TM, Rochester, NY) 챔버 내에서 직접 50,000 cells/ml의 밀도로 평판 배양되었다. 처음에 배양액은 분화 인자 없이 기본 골아세포 배지로 유지되었다. 이 배양액이 챔버 내에서 70% 컨플루언스에 도달하였을 때, 배지는 하이드로코르티손-21-헤미석시네이트(hydrocortisone-21-hemisuccinate) (200mM 최종 농도), β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) (10mM 최종 농도), 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 보충되었다. 골아세포는 21일까지 동안 37℃, 5% CO₂, 95% 공기로 습공기 내에서 배양되었다. 배지는 실험의 과정 동안, 각 챔버에 4ml를 보충하여, 2일마다 변경되었다.

전기 자극 : 배양액은 하루에 2번씩 30분 또는 2시간 동안 자극되었다. 2개의 전기 신호 양생법(electrical signal regimens)이 세포들에 선택적으로 적용되었는데, 그 하나는 "신호 A" (마이크로초 단위로 60/28 양/음 신호 지속시간(duration))로서 표시되는 연속 파형이고, 다른 하나는 “신호 B" (마이크로초 단위로 200/28 양/음 신호 지속시간)로서 표시되는 연속 파형이다. 세기는 2.4 mV/cm(피크에서 피크까지) 만큼의 샘플 런(sample runs)으로 측정되었다. 비-자극된 골아세포들(Non-stimulated osteoblasts)(NC)은 유사한 방식으로 균일한 밀도(대조로서)로 평판 배양되었다. 다음 내용은 상세한 방법에서의 절차를 이용하여 측정되었다: 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 칼슘, 오스테오칼신(osteocalcin), 및 조직학(histology). 각각의 이어지는 그래프는 "A" 신호, "B" 신호, “1”은 30분 지속시간, “2”은 2시간 지속시간, 및 전류 없음은 NC(또는 컨플루언스)로 표기하였(즉, A1은 A 신호 - 30분; B2는 B 신호 - 2시간이다).

여기에 사용된 전기 장치는, 다중 외부배양(multiple explants)에 대하여 연속 파형, 동시 전기 자극의 적용을 가능하게 한다. 각각의 실험에 대하여, 6쌍의 외부 배양이 4ml의 배양액 배지 내에서 개별적인 용기 내에 위치되었다. 대조 표본들은 유사한 조건에서 배양되었으며, 단지 신호 전달의 부족만이 차이가 있었다. 본 테스트 구성은 니오브 와이어(niobium wire)의 감겨진 단면을 통하여 직렬로 연결된 6개의 테스트 배양액 용기(17 x 42 mm)로 이루어진다.

인간 골아세포는 LAB-TEK^TM II 슬라이드 용기(slide wells) (NALGE NUNC INTERNATIONAL^TM, Rochester, NY) 내에서, 각각 대략 10㎠의 표면적을 가지도록 수립되었다. 신호는 결합 전기용량(couple capacitance)으로서 작용하는 니오브 와이어를 통하여 직렬로 챔버들을 연결함으로써 동시적으로 몇 개의 챔버들에 적용되었다. 자극은, 신호 B로서 15m/sec로 반복되는 200/28 μsec 쌍극성 사각형 펄스 의 9 msec 버스트(burst)로서 9mV/cm를 전달(표준 임상 골 치료 신호(standard clinical bone healing signal)와 유사)하는 것이거나, 신호 A로서 60/28 μsec 의 본질적으로 단극성인 펄스의 48 msec 버스트로서 4 mV/cm를 전달하는 것 중 어느 하나이다. 배양액은 하루에 두번씩 30분 또는 2시간 자극 중 어느 하나를 받았다. 샘플들은 배지로부터 취해졌으며 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 오스테오칼신(osteocalcin), 세포간질 칼슘(matrix calcium) 및 조직학(histology)에 대하여 7, 14, 및 21일 시점에서 분석되었다. 형태학을 수반하는 광물화는 폰 코싸 스테인(Von Kossa stain)으로 확인되었다. 모든 생화학적 분석들은 종래의 평가 기술들에 의해 수행되었다.

- 결과 -

PGE₂, 생산은 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(R&D SYSTEMS^TM, Minneaplis MN; INVITROGEN, INC.^TM, Carlsbad, CA)를 이용하여 평가(assess)되었다. 결과는 24시간 당 조직의 pg/mg(μM/g/24hrs)로서 기재되었다.

알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)(AP): 연구 디자인에 있어서 지시된 시점에서, 세포들은 용해(lyse)되었고(Mammalian-PE, Genotech, St. Louis, MO) 상청액(supernatant)은 수집되었다. 알칼리 포스파타아제는 마그네슘이 존재하는 기본 조건 하에서 니트로페닐(PNP)로의 파라-니트로페닐 인산염(para-nitrophenyl phosphate)(PNPP)의 절단(cleavage)에 의해 측정되었다. 최종 생산물 PNP는 405 나노미터에서 흡수 피크(obsorption peak)를 갖는 비색(colorimetric)이다. 기본 조건은 pH 10.3에서 0.5M 탄산염 완충제를 이용하여 성취되었다. 배양액 배지는 ALP 활성에 대하여 직접 분석(assay)되었다. 세포 층 ALP는 트리톤(triton) X-100 의 용액으로 추출되었고 ALP 활동에 대하여 약수(aliquot)가 측정되었다. 알칼리 포스파타아제는 상청액(supernatant) 및 용해 완충액 추출후의 막(membrane following lysis buffer extraction) 양자 모두에서 측정되었다(도 5). 또 다른 연구들(Lohman, 2003)로부터 기대되는 바와 같이, 알칼리 포스파타아제 발현은 막 내에서 7일 가까이 피크(peak)였다. 그렇지만, "B" 자극 하에서 배양된 세포들 내에서, 배양액 배지는 측정 가능한 AP 내의 증가를 증명하기 위해 계속되었다.

오스테오칼신(osteocalcin): 오스테오칼신(5800 달튼)은 골아세포의 특정 생산물이다. 소량의 오스테오칼신은 순환계(circulation) 내로 직접 방출(release)되며; 그것은 주로 뼈의 세포간질 내로 침지된다. 연구들은 오스테오칼신이 손상되지 않은(intact)(1-49) 단백질로서 그리고 N-터미널 조각들(N-terminal fragments)로서 순환한다는 것을 보여주고 있다. 주요 N-터미널 조각은 펩타이드(peptide)(1-43)이다. 미드-택 오스테오칼신 엘리사 키트(Mid-Tact Osteocalcin Elisa Kit)는 그 높은 특이성(specificity)으로 선택되었다. 분석은 매우 민감하여(0.5 ng/ml) 단지 25 마이크로리터 샘플만이 필요하다. 표준(standards)은 BTI 제조자(BTI, Stoughton, MA)에 의해 제공되는 기대값에 대해 강한 상호작용을 제공하는 우리의 실험 그룹과 함께 동시에 진행(run)한다. 배양액의 퀀칭(quenching) 다음에 측정되며 세포간질의 성분으로부터 결정되는 오스테오칼신 침전은, "B" 자극 다음에 더욱 뚜렷하며 21일에서 가장 높았다(도 6).

DNA 함량 : 세포 층은 0.1N 수산화나트륨으로 추출되고 CyQuant 분석 키트(INVITROGEN, INC.^TM, Carlsbad, CA.)를 이용하여 DNA 함량에 대하여 분석된 앨러쿼트(aliquots)로 분석되었다. 트리톤 X-100으로 ALP 함량을 위해 추출된 세포 샘플에 대하여, 이 추출물은 1N 수산화나트륨을 이용하여 0.1N 수산화나트륨으로 조정되었다. 표준 곡선들은 매칭 완충액(matching buffer)을 함유한다. 단백질 함량을 또한 요구하는 샘플에 대하여, 앨러쿼트 염색결합법(Bradford)을 이용하여 단백질에 대하여 측정되었다.

칼슘: 칼슘은, 보라색 복합체(violet colored complex)를 형성하는, o-크레솔프탈레인 컴플렉손(o-cresolphhtalein complexone)으로 슈바루첸바흐 방법론(Schwarzenbach methodology)에 의해 결정된다. 오버나이트로 2ml 의 0.5M 아세트산을 첨가함으로써, 칼슘은 용해되었고 함량은 552 nm로 비색 분석(colorimetric assay)(CORE LABORATORY SUPPLIES^TM, Canton, MI)에 의한 표준에 대하여 정량(quantify)되었다.

배양액 내에서의 칼슘 분포는 또한 조직학에 의해 평가되었다. 세포들은 2% 클루타르알데히드(glutaraldehyde) 내에서 고정되었고, 카코딜레이트(cacodylate) 완충제로 세척되었고, PBS로 세척되었고, 그 다음 지시된 바와 같이 착색(staining)을 위하여 수화(hydrate)되었다. 각각의 시간 과정(time period)은 직렬로 진행(run)되었으며; 대표적인 형태(morphology)는 21일 동안 제공되어, "A" 신호를 "B" 신호와 비교하고, 양 신호를 대조와 비교하였다(도 6). 신호 B에 대하여, 가장 두드러진 관찰은, 우리가 "의사-망상조직" 뼈("pseudo-cancellous" bone)로 설명하였던 명백한 우선 정렬(preferential alignment)을 갖는 칼슘의 분포에 있다. 신호 A에 대하여, 정성적으로 세포 분열증식(cell proliferation)이 더욱 많아지고 신호 B보다 세포간질의 생성이 더욱 적다는 것이 나타난다(그렇지만, 신호 A는 명백하게 대조보다는 많은 세포간질을 가졌다).

오스테오메트릭 해석(osteometric analysis)은 크로처(Croucher)의 방법론으로부터 발전되었으며 수정되었다. 이러한 2 차원 챔버 시스템에 있어서, 그리드 샘플(grid sampled)의 전체 면적에 대한 평균 섬유주 면적(trabecular area)이 연구되었다. 각각의 세기(intensity)로 2개의 챔버로부터 최소 20 필드(fields)를 이용하여, 이 연구는 골 형성, 뼈 폭(osteoid width), 및 세포 수를 검사하였다. 임의의 특정 그리드들은 직접 비교를 위하여 그리고 바이어스(bias)를 제거하기 위해서 성장(develop)되었다. 추가적으로, 자극 챔버 및 대조 챔버의 양쪽 모두에서 골아세포 배양액은, 조직학을 검사하기 위해서 그리고 배양액 내에서 칼슘의 분포를 분석하기 위해서 폰 코싸 법(Von Kossa method) (Mallory, 1961)에 의해 직접 착색(stain)되었다.

- 결론 -

10-14일 레벨 부근에서 피크이고 그 다음 점진적으로 감소되는 알칼리 포스파타아제는, 신호 B에 의해 자극된 상청액 내에서 증가되었다. 배양액의 퀀칭 이후에 측정되고 세포간질의 성분으로부터 결정되는 오스테오칼신 침지물은, 이어지는 신호 B만을 적용한 다음에 더욱 뚜렷하였고 21일에서 가장 높은 점까지 증가되었다. mg/dl로 측정된 세포간질 칼슘, 및 조직 배양액 플레이트의 면적의 함수로서의 세포간질 칼슘은 신호 B 만으로 가장 컸다. 조직학 및 폰 코싸 착색에 의해 주목된 바와 같은 광물 분포는 분석으로부터의 생화학 데이터를 실증한다. B 자극은 가장 많은 양의 미네랄을 부여하였고, 더욱이 3-D 섬유주 배열(trabecular array) 내에서 기재되는 바와 같은 상사 텐션 다이내믹(analogous tension dynamics)을 제공할 수 있는 망상 2차원 패턴을 시사한다. 세포 분열증식은 대조에 비해 신호 A를 가진 경우가 정성적으로 보다 높게 나타났으며, 반면에 신호 B를 가진 경우에는 상당히 증가된 광물화 및 패턴이 21일에서 뚜렷하였다.

매우 다른 효과를 만들어낸 그 2개의 신호 구성은, Ca/CaM 타깃(target)을 가정하면, 신호 B의 검출이 신호 A보다 10배 높다는 것을 나타내는 노이즈 비(noise ratio) (SNR) 해석에 대한 신호에 의해 용이하게 설명될 수 있다. 이 연구는 PEMF가 조직 형태학으로 구조적인 변화 공명(structural changed resonant)을 초래하기 위한 잠재성(potential)을 가진다는 것을 처음으로 증명한다. 배양액의 21일에서 명백한 기하학적인 패턴은, 망상조직의 뼈(cancellous bone)와 일치하는 섬유주 망상조직(trabecular reticulation)을 반영하였고, 평가된 모든 시점에서 신호 A에 노출되는 배양액과 대조 양쪽 모두에 있어서 세포의 임의의 방향을 뚜렷하게 대비하였다. 그러한 성과들은 바람직한 신호 구성이 조직-레벨 관찰(tissue-level observations)로 사전에 한정된 구조적인 체계들(hierarchies)을 초래할 수 있다는 것을 시사한다.

실험예 2

체외 PEMF 자극(In Vitro PEMF stimulation)에 대한 니오브 "염" 브리지(Niobium "Salt" Bridge)의 활용

- 서론 -

양극처리된 니오브 와이어(anodized niobium wire)를 이용한 비활성 전극 시스템(passive elecrode system)은 배양액 챔버 내로 시간-변화 전기 신호(time-varying electric signals)를 결합하기 위해 개발되었다. 디자인의 취지는, 세포의, 조직 연구를 위한 체외에서의, 유도적으로라기 보다는 오히려 전기용량적으로, EBI 반복성 펄스 버스트 골 성장 자극기(EBI repetitive pulse burst bone grown stimulator)에 의해 조직 내로 유도되는 것과 같은, PEMF-타입 신호의 전달을 위한 종래의 전해질 브리지 기술(eletrolyte bridge technology)을 교체함으로써 복잡성을 감소시키고 재현성을 향상시키기 위한 것이다. 양극처리된 니오브 와이어는 용이하게 활용 가능하며 전극 브리지를 형성하기 위해 간단한 공구만을 필요로 한다. 사용가능한 주파수에서, 즉 전형적으로 5Hz와 3MHz 사이에서, DC 전류 통로는 무시 해도 좋다.

- 배경 -

전기용량적으로 결합된 전기장은, 확장된 노출 시간동안 오염의 위험 없이 사용되기에 어렵고 제한된 주파수 응답을 가지는 종래의 전해질 염 브리지(electrolyte salt bridges)로 배양액 배지에 전형적으로 유도되어 왔었다. 니오브(niobium)(컬럼븀(columbium))은 산소 또는 습기에 노출될 때 얇지만 매우 튼튼한 표면 산화층을 자기-보호(self-passivating), 형성하는 몇몇 금속들 중 하나이다. 그 밖에는 탄탈룸, 티타늄, 그리고 보다 약한 정도이지만, 스테인리스강이 있다. 프로세스는 양극처리(anodization)에 의해 촉진 및 제어될 수 있다. 자기-보호가 갖는 문제점은 그것이 또 다른 금속들과 신뢰성 있는 연결을 만들기 어렵다는 것이다. 본 디자인은 그러한 어려움을 회피한다.

- 재료 및 방법 -

산화 니오브(niobium oxide), Nb₂O₅ 는 단단하고, 투명하고, 전기적으로 절연되며, 물, 일반적인 반응물(common reagents) 및 넓은 pH 범위에 걸친 생화학적인 유동물(biological fluids)에 대해 비활성이다. 양극처리된 니오브는 균일한 두께를 갖는 Nb₂O₅ 를 형성하며, 염료가 추가되지 않기 때문에 보석류로 가치있는 선명한 광-간섭 색의 범위를 나타내며, 안정적이고 재현가능한 전기용 량(capacitances)을 야기(yield)한다. 보석상의 니오브는 상이한 산화물 두께를 각각 나타내는 표준 색으로 판매된다. Nb₂O₅ 의 유전체 접촉(dielectric contact)은 유별나게 높고(ε_R = 41ε₀) 층은 얇기(48-70 nm) 때문에, 그 전기용량은 놀랄만큼 크다. "보라색" 니오브는 가장 얇은 산화물과 가장 높은 전기용량을 가진다: 48 nM 산화물(420nM 피크 반사율(reflectance))에 대하여 계산된 값 부근에서, 22-게이지 와이어(Rio Grande #638-240)에 대하여 0.158 μF/cm. 물 또는 생리 식염수 내에서, 절단된 와이어 단부 및 굽힘시 형성된 작은 흠집은, 재-양극처리할 필요 없이, 산화물로 빠르게 회복된다.

- 니오브 브리지(Niobium bridge) -

본 출원에 있어서 산화 니오브는 배지와 단지 전기적인 접촉만을 형성하며 PEMF-타입 신호는 전기용량적으로 통과한다. 수 밀리암페어 이하의 신호 레벨에서, 인공물을 야기시키는 pH 변화 또는 전기분해는 무시할 수 있다. 다중 챔버들은 시리즈로 연결될 수 있고, 각각 동일한 신호를 수신한다. 각각의 니오브 브리지는, 0.56μF의 전형적인 전기용량으로, 각 단부에서 시트상 전극을 굽힘 형성된다. 사각형 챔버의 단부들에 전극 브리지를 위치시키는 것은 배지의 구석구석까지 전압 구배 및 거의 균일한 전류 분포를 야기시킨다. 도 4에 이미 도시되었던 바와 같이 그리고 그에 따른 설명에 나타난 바와 같이 배양액 체인저(changer), 전극 및 PEMF-타입 신호의 전형적인 셋업에 있어서 측정된 구배는, 주로 전극 근처에서 또 는 배지가 깊이에 있어서 상당히 변화되는 곳에서, ±3% 의 평균 변화를 나타낸다. 하나의 챔버 또는 시리즈로 연결된 몇개의 챔버들은, 접속 터미널을 형성하는 실버 스트립 전극에 염류(saline)를 통하여 전기용량적으로 결합된 외부 단부를 각각 갖는, 특정 니오브 단부 브리지를 통하여 전기가 공급된다. 이것은 그 자체에 또는 또 다른 금속에 니오브를 접속할 필요가 없게 한다. 전류는 시리즈 한계 저항 R_lim에 의해 제어된다. 결과적인 대역(bandpass)(명목상 ±3dB)은 R_lim으로 약간 변화하지만, 5Hz 내지 3MHz에서 진행되는 테스트시 셋업에 있어서, 가장 높은 주파수가 시도된다. 따라서 PEMF-타입 신호는 전기용량 결합을 경유하여 체외(in vitro)에서 왜곡되지 않고 전달될 수 있다.

- 실험 -

니오브 전극 브리지의 활용은, 상술된 바와 같은 B-타입 파형을 이용하여 골아세포 및 연골세포 배양액에 대해 시험되었다. 세포 제공 없이 OGM^TM 골아세포 배지(CAMBREX^®, Walkersville, MD)에 적용된 이 신호로, 24시간 이후에 측정된 pH는 전기가 공급되지 않게 제어된 것의 8.27에 비하여 8.29 이었으며, 무시해도 좋은 전기분해를 시사한다. 생리적으로 현저한 세포독성(cytotoxicity)의 부재는, A-타입 및 B-타입 파형 양쪽 모두를 이용하여 OGM^TM 내에서 21일에 걸쳐 망상조직 골상 구조(cancellous bone-like structure)의 성장, 분화 및 골아세포의 튼튼한 분열증 식(proliferation)에 의해 보여진다. 배양액 내에서의 파형에 대한 21일 동안 30분 및 2시간 노출 이후에, 세포 및 세포간질은 에너지-분산 X-레이(energy-dispersive X-ray) (EDX)로 해석되었다. 니오브는 검출되지 않았다. 또 다른 연구들에서, B-타입 신호는 96시간 동안 1%의 소 태아 혈청을 함유하는 배양 배지 내에서 인간 연골 세포에 적용되었다. B-타입 신호는 세포 중의 DNA 함량에 의해 측정됨에 따라 세포 수에 있어서 154% 증가를 야기하였으며, 현저한 세포독성을 다시 나타내지 않았다. 각각 4일 동안 매일 30분 전달된 것으로서, 전기용량적으로 결합된 신호와 또 다른 동일한 그러나 전자기적으로 결합된 신호와의 사이의 직접적인 비교에 있어서, DNA에 따른 골아세포 수의 증가는 대조와 대비하여 크게 상이하지만(니오브에 대하여 157%, 결합된 EM에 대하여 164%), 서로 간에는 별 차이가 없다.

- 결론 -

신규한 니오브 전극 브리지는 배양액 내에서 세포들/조직들에 전기용량적으로 결합된 PEMF-타입 신호를 적용하기 위해 개발되었다. 니오브 브리지의 대역은 5Hz 내지 3MHz이며, 따라서 손상된 뼈의 치료를 위하여 임상적으로 사용되는 그와 같은 PEMF-타입 신호들은 만곡(distortion) 없이 통과한다. 표준 전해물 브리지 구성(standard electrolyte bridge configurations)과는 달리, 니오브 브리지는 배양접시 내에 균일한 전류 밀도를 제공한다. 확장된 PEMF 노출을 위한 적용은 전기분해 또는 생리적으로 현저한 세포독성이 없음을 보여준다.

실험예 3

전기용량적으로 결합된 PEMF 신호를 사용한 연골 세포의 자극

- 서론 -

뼈의 치료를 위해 임상적으로 사용된 것과 유사한 PEMF 신호는 관절염 환자의 관절에서 통증을 완화시키기 위해 현재 그 성능이 시험된다. 이러한 통증 완화 신호가 손상된 연골의 잠재된 문제점을 개선할 수도 있는지가 관심사이다.

- 배경 -

약물 치료법 및 생물제제(製劑)(biologics)와 비교하여, PEMF에 기초한 치료법은 사용하기가 쉽고, 비침습성이고, 전위적인 측면의 효과를 갖는 외부 작용제를 포함하지 않고, 제거시간(clearance time)을 갖지 않는 치료법을 제공한다. PEMF 치료법과 관련된 문제는 반응하는 세포를 식별하는 것과, 세포에서 물리적 변화 부위를 명료하게 하는 것과, 세포 반응을 유발하는 작용의 생물학적 메커니즘을 결정하는 것을 포함한다. 이 연구의 목적은 통증 완화를 위해 현재 시험되는 특유의 PEMF 신호(상표명 MEDRELIEF, Healthonics, Inc, GA)가 "시험관"에서 연골 세포를 자극할 수 있는지와 작용의 생물학적 메커니즘이 해결될 수 있는지를 판단하는 것이다.

- 방법 -

정상인의 연골 세포(HCC; CAMBREX, Walkersville, MD)는 장방형의 세포 챔버에 단층으로 평판 배양된다. PEMF의 인가는 시변 전류가 챔버를 통해 균일하게 유동하게 하는 니오브 전극 브릿지를 통해 전기용량적으로 결합되어 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같은 펄스-버스트 B-타입의 신호는 폭이 200/28 μsec이고, 15 Hz로 반복되는, 10 msec 버스트의 비대칭 장방형 펄스로 이루어져 있다. PEMF 신호는 치료시마다 30분간 인가된다. 세포 성장은 세포층의 DNA 함유량에 의해 평가된다. 배양 배지의 산화질소(NO) 함유량은 INVITROGEN INC.(Calsbad, CA)로부터의 평가 키트를 사용하여 그리스(Griess) 반응에 의해 평가된다. 결과는 세포층의 DNA 함유량으로 평가된 바와 같이 세포 갯수 당 마이크로몰(micromoles)로서 표시된다.

- 결과 -

PEMF 신호는 400 micro-amperes, 피크-피크로, 1%의 소 태아 혈청을 함유하는 배양된 배지에서 성장하는 HCC 세포에, 96시간 동안 12시간마다 인가되어 153 ± 22%, p<0.001의 증가된 세포 성장을 유발한다. 제1의 PEMF 치료가 나타난 다음 24시간 동안 수집된 조절 배양 배지와 96시간에서 심각하지 않은 레벨로 하락하는 196 ± 14%, p<0.001의 NO(산화질소)의 증가가 관심사이다. 이와 유사한 조건에서 SNP(NO 공여체-니트로프루시드나트륨(sodium nitroprusside))가 3 microgram/ml의 최종 농도로 부가되면, 비치료 대조에 비하여 24 시간에서 NO가 또한 증가되고(174 ± 26%, p<0.001), 96 시간에서 세포의 갯수가 증가된다(168 ± 22%, p<0.001). 후속의 실험에서 혈청 농도는 0.1% 감소되고, PEMF는 24시간 마다 40 microAmps로 한번 인가되고, 측정은 72 시간 후에 이루어진다. PEMF 치료는 조절된 배양 배지의 NO 함유량을 154 ± 30%, p<0.01로 증가시킨다. 도 7에 도시된 바와 같이, PEMF 치료는 세포의 갯수를 증가시키고, 이러한 세포의 반응은 L-NAME(a nitric oxide synthase inhibitor)에 의해 감소된다.

- 결론 -

이들 결과들은 관절염으로 인한 관절 고통을 감소시키기 위해 현재 시험되는 PEMF 신호가 연골조직에도 이점을 제공할 수 있음을 시사한다. 데이터는 인간 연골세포가 증가된 세포 성장으로 이 신호에 응답할 수 있다는 것을 나타낸다. 나아가서, PEMF 자극 연골세포 성장(PEMF stimulated cartilage cell growth)을 위한 가능한 생물학적 기구의 작용은 NO의 방출을 통하여 일어난다. NO-공여체(NO-donor)에 대한 연골세포의 유사한 응답은 이러한 가설을 지지한다. 결정적이지는 않지만, 데이터는 증가된 세포 성장 추종 PEMF 처리가 NO에 의해 중재되거나, 또는 NO가 증가된 세포 성장을 야기하기 위해서 PEMF를 위한 기구 내에서 필요한 단계라는 것을 시사한다.

실험예 4

1차 골아세포 배양에서 BMP 생성에 대한 PEMF 자극 : 신호의 형상 및 노출 시간에 따라 좌우됨

- 서론 -

척추 융합 수술에 대한 부가로서, 또는 긴 뼈의 저항성 불유합을 치료하기 위해, PEMF는 비수술적 치료법으로서 효과적인 것으로 증명되었다. 시험적인 작업은 골아세포가 신호의 형상(configuration)과 시간의 모두에 다르게 반응하는 것을 증명하였다. 하나의 중요한 차이점은 세포의 분열증식 대신에 세포간질을 침지시키는 성향을 포함하였다. 척추 융합 및 불유합에서 BMP의 증명된 효능과, BMP-2 및BMP-4가 PEMF에 의해 자극되는 것을 나타내는 작용에 근거하여(Bodamyali, 1998), 우리의 연구는 이전의 세포 반응이 BMP 조절과 상호연관이 있는 지에 대한 더 나은 이해에 역점을 두었다.

- 목적 -

이 연구는 전기용량적 결합에 의해 전달된 2개 PEMF 파형을 비교하여, 1차 뼈 세포 배양에서 BMP 조절에 의한 생체 전기적 및 형태적(morphologic) 변화를 상호연관시킨다.

- 방법론 -

정상인의 골아세포는 10㎠의 개별적 배양 챔버에서 자리를 잡았다. 신호는 결합 전기용량으로서 작용하는 니오브 와이어를 통해 여러 개의 챔버를 일렬로 동시에 연결함으로써 여러 개의 챔버에 동시에 인가되었다. 자극은 "신호 A"로 표시된 60/28 μsec의 장방형의 양극(bipolar) 펄스, 또는 "신호 B"로 표시된 200/28 μsec의 장방형의 양극(bipolar) 펄스의 연속적인 열로 구성되었으며, 1.2 mV/cm(A 내에서) 또는 2.4 mV/cm(B 내에서)의 피크-피크(peak to peak) 전기장을 배양체에 균일하게 인가한다. 배양체는 30분(1) 또는 2시간(2)씩 매일 2번 노출되며, 비교를 위해 군들(A1, A2, B1, B2)이 만들어진다. 멤브레인 단백질의 측정을 위해 이전에 사용된 앨러쿼트(aliquots)는 ELISA 분석에 의해 BMP 단백질에 대하여 분석되며, 칼슘을 측정하고 형태를 해석하기 위해 이전에 사용된 세포간질은 RNA를 분리시키는 데에 사용되며, 이 RNA는 후속해서 (18 RNA) BMP-2 및 BMP-7에 대하여 공지의 구입가능한 연속 프리머(primer)를 사용하여 2단계의 RT-PCR(reverse-transcriptase polymerase chain reaction)에 의해 분석된다. 이 신호는 분열증식을 자극하고, 이렇게 자극된 세포간질 침지물은 BMP 조절 및 단백질 전이를 위해 분석되었다. 7일, 14일, 21일 지점으로부터 샘플들은 분석을 위해 동일한 비교를 보장하는 데에 사용되었다.

- 결과 -

이러한 실험의 주요한 결과는 지지체이다. 1) BMP 단백질 및 BMP용 mRNA는 모든 자극, 특히 "A" 신호의 자극에 반응하여 향상되었다. 2) 매일 2번씩 전달된 30분의 자극은 2시간의 치료에 비하여 21일에서 BMP-2 발현의 거의 40배의 증가를 나타내었으며, 증가의 대부분은 14-21일 사이에서 이루어졌다. 3) "A" 신호에 대한 30분의 자극은 BMP-7 발현의 15배의 증가를 제공하였으며, 이는 14-21일 사이의 분석에서 다시 거의 전체적으로 알게 되었다. 4) "B" 신호에 대해서는 BMP-2 또는 BMP-7의 적당한 증가만이 관측되었다. 5) 이 연구는 BMP-7의 발현이 PEMF 자극에 의해 촉진된다는 제1의 증거를 제공한다. 6) 분열증식의 평가가 질적이지만, BMP 침지물의 미토게닉(mitogenic) 특성은 이전에 알려진 작업에 따른다. 짧은 기간 동안 변형된 세포주(cell line)에 대한 작업 평가 PEMF는 BMP-2와 BMP-7가 전혀 자극되지 않았다는 것을 시사한다(Yajima, 1996). 우리는 우리의 모델을 이들 성장 인자들에 대하여 평가하지 않았다.

- 결론 -

작업이 BMP-2가 모르포게닉(morphogenic) 및 미토케닉(mitogenic) 특성을 갖을 나타낸다면, "A" 신호에 반응하는 세포의 분열증식은 놀라운 일이 아니다. 2개의 신호 형상들이 상당히 다른 효과를 발생하는 것은 SNR 분석에 의해 전위적으로 설명가능하며, 이는 일정량의 신호 "B"가 Ca/CaM 변환 통로의 가정하에 신호 "A" 보다 10배 더 높을 수 있다는 것을 시사한다. 비대해진 세포간질 침지물이 "B" 신호에 의해 제공되더라도 정상화된 BMP-2 및 BMP-7 레벨을 더 이상 기대할 수는 없을 것이다. 뼈의 형성은 성장 인자의 균형과 표면의 미세형태(microtopography)에 민감하게 좌우된다. 사실상, 매끈한 표면은 BMP-2에 대한 세포 반응을 무시하고 영양 결핍에 의한 광물화를 증대시킨다. 높은 정도의 세포간질의 유기조직 및 침지물이 "B" 신호에 반응하는 것으로 나타난다면, 그 자체의 BMP 변환은 생산적인 뼈 형성에 대하여 불충분한 것으로 보이며, 별개의 약물 표적화(targeting) 메커니즘에 의해 발행할 수 있다.

실험예 5

사례 연구 : PEMF 자극에 의한 골다공증의 치료

1명의 골다공증 환자(여성, 50세, T = -3.092에서 시작)가 신호 B(200/30)를 4-5일 동안 매일 3-5 시간씩 사용하여 전기 자극을 사용하였다. 이 환자는 1년간 동일한 약물치료, 영양공급 및 활동도를 유지하였다. 6개월 및 12개월 후의 골밀도 추적조사에서, 골 질량 밀도가 16% 및 29% 증가한 것으로 나타났다.

Claims (35)

1. 뼈, 연골 또는 다른 결합조직의 성장(development) 또는 치료를 조절하는 방법으로서,

   성장하거나 재생하는 조직을 A-타입, B-타입, C-타입 또는 D-타입의 신호를 포함하는 전기 신호로 상기 조직의 성장 또는 치료를 조절하기에 충분한 기간 동안 자극하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, A-타입, B-타입, C-타입 또는 D-타입의 신호를 포함하는 제2의 전기 신호로 성장을 자극하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 A-타입의 신호는 β의 길이를 갖는 긴 성분과 α의 길이를 갖는 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 A-타입의 신호는 약 60 μsec 지속시간의 긴 성분과 약 28 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 청구항 2에 있어서, 상기 B-타입의 신호는 γ의 길이를 갖는 긴 성분과 α의 길이를 갖는 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 청구항 2에 있어서, 상기 B-타입의 신호는 약 200 μsec 지속시간의 긴 성분과 약 28 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 청구항 2에 있어서, 상기 2개의 전기 신호는 조직 내의 세포의 분열증식, 분화, 또는 세포간질 생성을 촉진하도록 동시에 또는 연속해서 인가되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은 전구 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 전구 세포는 줄기 세포, 수임된 전구세포(committed progenitor), 비수임된 전구세포(uncommitted progenitor), 다기능 전구세포, 또는 만능 전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 전기 자극은 BMP-2 또는 BMP-7의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 전기 자극은 산화질소의 생성을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 뼈, 연골 또는 다른 결합조직을 생성하거나 치료하는 방법으로서,

    성장하거나 재생하는 조직을 A-타입, B-타입, C-타입 또는 D-타입의 전기 신호를 포함하는 전기 신호로 자극하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 전기 신호와 조합하여 기계적인 하중 인가를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 12에 있어서, 상기 전기 자극은 전기용량적으로 결합된 전극을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 뼈, 연골 또는 다른 결합조직을 생성하거나 치료하는 방법으로서,

    조직-형성 세포의 분열증식, 분화, 또는 세포간질 생성을 자극하도록 제1의 전기 신호로 상기 조직을 자극하는 단계와,

    상기 단계에 이어지는 것으로서, 조직-형성 세포의 분열증식, 분화, 또는 세포간질/광물(mineral) 생성을 자극하도록 제1의 전기 신호로 상기 조직을 자극하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 제1의 전기 신호는 A-타입의 신호를 포함하고 상기 제2의 전기 신호는 B-타입의 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 15에 있어서, 상기 A-타입의 신호는 β의 길이를 갖는 긴 성분과 α의 길이를 갖는 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 15에 있어서, 상기 A-타입의 신호는 약 60 μsec 지속시간의 긴 성분과 약 28 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 청구항 15에 있어서, 상기 B-타입의 신호는 γ의 길이를 갖는 긴 성분과 α의 길이를 갖는 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 청구항 15에 있어서, 상기 B-타입의 신호는 약 200 μsec 지속시간의 긴 성분과 약 28 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 양극산화피막처리된 금속으로 만들어진 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 전기용량적으로 결합된 브릿지 전극.
22. 청구항 21에 있어서, 상기 양극산화피막처리된 금속은 니오브(niobium), 탄탈(tantalum), 티타늄(titanium), 지르코늄(zirconium), 몰리브덴(molybdenum), 텅스텐, 바나듐(vanadium), 알루미늄 또는 스테인레스강인 것을 특징으로 하는 전극.
23. 세포와 상기 세포에 A-타입의 신호 또는 B-타입의 신호를 전달하는 전기 자 극기를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
24. 청구항 23에 있어서, 상기 세포에 기계적인 하중을 인가하기 위한 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
25. 청구항 23에 있어서, 상기 A-타입의 신호는 약 20 μsec 지속시간 내지 100 μsec의 긴 성분과 약 5 μsec 내지 95 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
26. 청구항 23에 있어서, 상기 A-타입의 신호는 약 60 μsec 지속시간의 긴 성분과 약 28 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
27. 청구항 23에 있어서, 상기 B-타입의 신호는 약 100 μsec 내지 1000 μsec 지속시간의 긴 성분과 약 5 μsec 내지 75 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
28. 청구항 23에 있어서, 상기 B-타입의 신호는 약 200 μsec 지속시간의 긴 성분과 약 28 μsec 지속시간의 짧은 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
29. 청구항 23에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 수임된 전구세포(committed progenitor), 비수임된 전구세포(uncommitted progenitor), 다기능 전구세포, 만능 전구세포 또는 다른 분화 단계에 있는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
30. 청구항 23에 있어서, 양극산화피막처리된 금속으로 만들어지고 전기용량적으로 결합된 브릿지 전극을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
31. 이식에 적합한 조직을 마련하기 위한 키트로서,

    세포와 전기 자극 파형을 제공하는 전기 자극기를 포함하고,

    상기 전기 자극 파형은 A-타입, B-타입, C-타입 또는 D-타입의 신호를 포함하고,

    상기 파형은 상기 세포의 이식에 적합한 조직으로의 분열증식, 분화, 또는 세포간질 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 키트.
32. 청구항 31에 있어서, 생물학적으로 분해될 수 있거나 생물학적으로 안정한 지지체(scaffold)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
33. 청구항 32에 있어서, 상기 지지체는 천연 또는 합성 폴리머로부터 선택된 물질로 만들어진 것을 특징으로 하는 키트.
34. 청구항 32에 있어서, 상기 지지체는 성장-촉진 또는 착생-촉진 분자와 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
35. 청구항 31에 있어서, 세포에 기계적인 하중을 인가하기 위한 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

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