BRPI0611082A2 - mÉtodos para modular desenvolvimento osteocondral usando terapia de campo eletromagnÉtico pulsado - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA MODULAR DESENVOLVIMENTO OSTEOCONDRAL USANDO TERAPIA DE CAMPO ELETROMAGNÉTICO PULSADO Composições e métodos são fornecidos para modular o crescimento, desenvolvimento e reparo de ossos, cartilagens ou outros tecidos conjuntivos. Dispositivos e formas de ondas de estímulo são fornecidos para diferencialmente modular o comportamento de osteoblastos, condrócítos e outras células de tecido conjuntivo para promover proliferação, diferenciação, formação de matriz ou mineralização para aplicações "in vitro" ou "in vivo". A estimulação de células em modo contínuo e em modo rajado de pulsos com sinais equilibrados por carga pode ser usada. O crescimento do osso, da cartilagem e de outro tecido conjuntivo é estimulado em parte por liberação de óxido nítrico através de estimulação elétrica e pode ser modulado através de co-administração dedoadores de NO e inibidores da sintase de NO. O crescimento do osso, da cartilagem e de outro tecido conjuntivo é esti- mulado em parte por liberação de BMP-2 e BMP-7 em resposta a estimulação elétrica para promover diferenciação de células. Os métodos e dispositivos descritos são úteis em promover reparo de fraturas nos ossos, de cartilagens e de tecidos conjuntivos bem como para elaborar tecido para transplante.

Description

"MÉTODOS PARA MODULAR DESENVOLVIMENTO OSTEOCONDRALUSANDO TERAPIA DE CAMPO MAGNÉTICO PULSADO"

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Esse pedido reivindica o beneficio do pedido depatente provisória Norte-Americana 60/687.430, depositado em3 de Junho de 2005, pedido de patente provisória Norte-Americana 60/693.490, depositado em 23 de Junho de 2005, pe-dido de patente provisória Norte-Americana 60/782.462, depo-sitado em 15 de Março de 2006 e pedido de patente provisóriaNorte-Americana 60/790.128, depositado em 7 de Abril de2006.

Fundamentos da Invenção

Doenças e ferimentos associados com ossos e carti-lagens têm um impacto significante na população. Aproximada-mente cinco milhões de fraturas nos ossos ocorrem anualmentesomente nos Estados Unidos. Aproximadamente 10% dessas re-tardaram a cicatrização e dessas, 150.000 a 200.000 fraturasde não união ocorrem acompanhadas por perda de produtividadee independência. No caso de cartilagem, formas severas ecrônicas de danos na cartilagem da junta do joelho podem le-var a maior deterioração da cartilagem da junta e podem e-ventualmente levar a uma total substituição da junta do joe-lho. Aproximadamente 200.000 operações de substituição dejoelho são executadas anualmente e a junta artificial geral-mente dura somente 10 a 15 anos levando a perdas similaresem produtividade e independência.

Além disso, a incidência de fraturas nos ossos étambém esperada para permanecer alta em vista da incidênciade osteoporose como um principal tratamento de saúde públicapara um número estimado de 44 milhões de americanos. Nos Es-tados Unidos atualmente, 10 milhões de indivíduos são esti-mados como já tendo a doença e quase mais 34 milhões são es-timados como tendo baixa massa óssea, localizando-os em ris-co aumentado de osteoporose. Uma em duas mulheres e um emquatro homens com mais de 50 anos terão uma fratura relacio-nada com osteoporose em sua vida restante. A osteoporose éresponsável por mais do que 1,5 milhões de fraturas anual-mente, incluindo: 300.000 fraturas de quadril; 700.000 fra-turas vertebrais; 250.000 fraturas de pulso; e 300.000 fra-turas em outros sítios. Os gastos diretos nacionais estima-dos (hospitais e enfermarias) para fraturas osteoporóticasde quadril foram $ 18 bilhões em 2002 (Relatório Anual daFundação Nacional de Osteoporose, 2002).

Vários tratamentos estão atualmente disponíveispara tratar fraturas recalcitrantes tal como fixação internae externa, enxertos de osso ou substitutos de osso incluindomatriz de osso desmineralizado, extratos de bandeja .de san-gue e proteína de matriz de osso, e èstimulação biofísicatal como tensão mecânica aplicada através de fixadores ex-ternos ou campos eletromagnéticos e ultra-som.

Similarmente, o tratamento típico para ferimentosde cartilagem, dependendo da lesão e da severidade dos sin-tomas, é descanso e outros tratamentos conservativos, cirur-gia artroscópica menor para limpar e suavizar a superfícieda área de cartilagem danificada, e outros procedimentos ci-rúrgicos tal como micro-fratura, perfuração e abrasão. Todosesses procedimentos podem fornecer alívio sintomático, mas obenefício é usualmente somente temporário, especialmente seo nível de atividade pré-ferimento da pessoa é mantido.

O osso e outros tecidos, tal como cartilagem, res-pondem a sinais elétricos de uma maneira psicologicamenteútil. Dispositivos de estimulação bioelétrica aplicados anão uniões e uniões retardadas foram iniciados nos anos 60 esão agora aplicados a ossos e cartilagens (Ciombor e Aaron,Foot Ankle Clin. 2005, (4) :579-93) . Atualmente, uma aceita-ção de mercado e geral de suas funções na prática clínicafoi estabelecida. Menos resultados bem conhecidos atribuídosà estimulação bioelétrica são alterações positivas na densi-dade do osso (Tabrah, 1990), e a prevenção de osteoporose(Chang, 2003). Um relatório recente ofereceu evidência se-cundária de que a estimulação com campo eletromagnético pul-sado significantemente acelera a formação de osso durante aosteogênese por distração (Fredericks, 2003).

No presente, o uso clínico de eletroterapia parareparo do osso consiste de eletrodos implantados diretamenteno sítio de reparo ou acoplamento capacitivo ou indutivo nãoinvasivo. A corrente contínua (DC) é aplicada via um eletro-do (catodo) localizado no tecido alvo no sítio de reparo doosso e o anodo localizado em tecidos macios. Correntes DC de5-100 μΑ são suficientes para estimular osteogênese. A téc-nica de acoplamento capacitivo usa eletrodos externos de pe-le localizados nas laterais opostas do sítio da fratura. On-das senoidais de 20-200 Hz são tipicamente empregadas parainduzir campos elétricos de I-IOOm V/cm no sítio de reparo.A técnica de acoplamento indutivo (PEMF) induz umcampo elétrico variável no tempo no sitio de reparo aplican-do-se um campo magnético variável no tempo via uma ou duasbobinas elétricas. 0 campo elétrico induzido age como um me-canismo de disparo que modula o processo normal de regulaçãomolecular de reparo do osso mediado por muitos fatores decrescimento. Bassett e outros foram os primeiros a relatarque um sinal PEMF poderia acelerar reparo do osso em 150% emum canino. Modelos experimentais de reparo do osso mostramproliferação melhorada de célula, calcificação, e força me-cânica aumentada com correntes DC. Tais aproximações tambémmantêm potencial para ferimentos de cartilaae_n.s_._

O tecido ferido tem um potencial elétrico em rela-ção ao tecido normal. Sinais elétricos medidos em sítios fe-ridos, chamados o "potencial de ferimento" ou "corrente deferimento", são DC (corrente contínua) somente, mudando len-tamente com o tempo. Os potenciais de re-crescimento de ner-vos e de reparo de fratura do osso são tipicamente mais rá-pidos do que o usual na vizinhança de um eletrodo negativo,porém mais lentos próximos a um positivo, onde em alguns ca-sos, a atropia ou necrose do tecido pode ocorrer. Por essarazão, pesquisas mais recentes têm focado em freqüência maisalta, sinais mais complexos freqüentemente sem componente DClíquido.

Infelizmente, a maior parte dos dispositivos ele-troterapêuticos agora disponíveis contam com implantação di-reta de eletrodos ou pacotes eletrônicos inteiros, ou em a-coplamento indutivo através da pele usando bobinas que geramcampos magnéticos variáveis no tempo, desse modo induzindocorrentes parasitas fracas nos tecidos do corpo, as quaisfornecem de forma ineficiente o sinal a tecidos e assim, emadição, a bobinas bulky que exigem pacotes de geradores desinal e bateria relativamente grandes. A necessidade por ci-rurgia e materiais biocompativeis em um caso, e a complexi-dade excessiva do circuito e energia de entrada no outro,têm mantido o preço da maior parte de tais aparelhos relati-vamente alto, e têm também restringido a aplicação de taisdispositivos a profissionais altamente treinados. Permaneceuma necessidade, portanto, por um aparelho versátil, de cus-to eficaz crue oossa ser usado Dara fornecer estimulacão bio-elétrica para modular de forma diferenciada o crescimento detecido osteocondral para promover desenvolvimento e cicatri-zação apropriados.

Sumário da Invenção

De acordo com seus aspectos principais e amplamen-te determinados, a presente invenção fornece um método paramodular o crescimento ou reparo de, por exemplo, tecido ós-seo ou cartilagem, administrando-se um sinal elétrico paradesenvolver ou tecido ósseo ou cartilagem danificada.

A presente invenção supera as desvantagens de dis-positivos e métodos da técnica anterior, habilitando a en-trega de sinais bioelétricos otimizados para corresponder acaracterísticas selecionadas de sinais naturais do corpo re-sultando em cicatrização acelerada e mais permanente. Os si-nais descritos aqui obedecem a características selecionadasde sinais naturais e conseqüentemente tecidos submetidos àeletro-estimulação de acordo com a presente invenção passampor mínima tensão fisiológica. Ademais, a presente invençãoé não invasiva e de custo eficaz, tornando-a desejável paramúltiplas aplicações para uso pessoal e individual. Alémdisso, os presentes métodos fornecem estimulação elétricaonde os sinais elétricos quase imitam características sele-cionadas de sinais naturais do corpo. O tecido estimulado é,portanto, submetido à tensão mínima e o crescimento e o re-paro são muito facilitados.

Em contraste a dispositivos do tipo TENS conven-cionais, que são direcionados a impulsos de dor de bloqueiono sistema nervoso, o aparelho usado com os presentes méto-dos opera em um nível de estímulo que está abaixo do nívellimite normal humano de sensação de dor e como tal, a maio-ria dos usuários não experimenta qualquer sensação durante otratamento para reparar ou promover o crescimento do osso.

A tecnologia descrita aqui usa uma classe de for-mas de onda, algumas das quais são novas e outras que sãoconhecidas como tendo efeitos biológicos positivos em teci-dos quando aplicadas através de bobinas indutivas, mas nãoforam demonstradas como tendo efeitos biológicos positivosatravés de eletrodos até agora.

Embora nenhum dispositivo bioelétrico comercialseja atualmente aprovado para terapia de osteoporose, a pre-sente invenção fornece um candidato promissor. Como demons-trado aqui, padrões de onda exclusivos de campo eletromagné-tico pulsado (PEMF) podem ser vantajosamente aplicados a am-bos um nível macroscópico (isto é, fraturas de osso comuns)bem como a um nível microscópico (isto é, desenvolvimento deosteoblasto). Certas modalidades da invenção maximizam a u-tilidade e aplicação de formas de onda PEMF desejadas: porexemplo, a espinha, quadril e/ou pulso são os sítios maiscomuns de fratura osteoporótica, para tais tipos de fraturasos inventores fornecem placas simples auto-adesivas de ele-trodo em contato com a pele como veículos de entrega eletro-terapêutica. O uso de tais placas de eletrodo resulta na me-lhora de massa óssea em tais sítios anatômicos chave. Em umnível microscópico, os presentes inventores identificaramformas de onda PEMF específicas e freqüências que otimizamdesenvolvimento de osteoblasto. Como descrito em maiores de-talhes nos Exemplos (ver Exemplo 1), os inventores demons-tram que os sinais PEMF melhoram a mineralização e produçãode matriz de osteoblasto, e que o sinal confere caracterís-ticas estruturais também. Os inventores também mostram queoutros sinais PEMF melhoraram a proliferação de célula e au-mentos em anexo nas proteínas morfogenéticas do osso (BMPs).Enquanto ambos os sinais elétricos contínuos e de rajada depulso podem ser usados na presente invenção, a administraçãode sinais contínuos ao invés de sinais de rajada de pulsoforneceu os efeitos mais pronunciados em proliferação e mi-neralização.

Os sinais elétricos da presente invenção podem serusados para promover o reparo e crescimento de tecidos es-truturais tais como osso e cartilagem. Entretanto, tais sis-temas e métodos não necessitam ser restritos ao uso com or-ganismos intactos, desde que culturas de células isoladas oude tecidos podem também ser afetadas por formas de onda ele-troterapêuticas (estímulos elétricos apropriados foram ob-servados para modificar as taxas de metabolismo da célula,secreção, e replicação). Os sinais elétricos são geralmenteaplicáveis a outros tecidos conjuntivos tais como pele, Ii-gamentos, tendões, e seus similares. Os sinais elétricosdescritos aqui podem ser usados para estimular outros teci-dos para aumentar o reparo dos tecidos e promover o cresci-mento dos tecidos para propósitos de transplante. Células dapele isoladas, por exemplo, devem ser tratadas com os dispo-sitivos e formas de onda da presente invenção em um meio decrescimento apropriado para aumentar a proliferação e dife-renciação de células na preparação de material de enxerto napele autógeno com cultura em tecido. De maneira similar, es-ses sinais bioeléticos podem ser aplicados diretamente a te-cidos de pele feridos ou com doenças para melhorar a cica-trização.

A entrega exógena de sinais bioelétricos e célulasprogenitoras, tais como células estromais de medula - BMSCs,a uma fratura podem levar a cicatrização melhorada e reparode fraturas recalcitrantes. Ambos esses fatores (bioeletri-cidade e recrutamento de células) são, de fato, partes doprocesso de cicatrização natural. Para essas aplicações, aestimulação elétrica usando as formas de onda descritas aquipode ser aplicada imediatamente depois de ferimento com umsistema de eletroterapia. 0 sistema de eletroterapia podeser leve, compacto e portátil. Ambas a estimulação elétricae a terapia baseada em célula universal podem ser aplicadasem uns poucos dias depois do ferimento. Células autólogaspodem ser adicionadas em tempo adicionalmente depois do fe-rimento. A presente invenção também fornece métodos de indu-zir reparo ou desenvolvimento de osso que regenera tecidosnaturais ao invés de cicatriz no tecido.

Conseqüentemente, é um objetivo da presente inven-ção fornecer métodos para modular a proliferação e diferen-ciação de tecido ósseo para facilitar o reparo e desenvolvi-mento do osso administrando-se novos sinais elétricos ao te-cido ósseo.

É um outro objetivo da presente invenção fornecernovos sistemas de cultura que compreendem o uso de PEMF paraengenharia de tecido ósseo.

É um outro objetivo da presente invenção fornecernovos sistemas de cultura de células progenitoras em combi-nação com estimulação elétrica.

É um outro objetivo da presente invenção fornecerkits para o crescimento de tecidos autólogos e alogeneicospara transplante em um hospedeiro em necessidade desses.

É um outro objetivo da presente invenção fornecermétodos para eletricamente estimular células progenitorasnão comprometidas in vitro ou in vivo para induzir prolife-ração ou diferenciação.

É um outro objetivo da presente invenção fornecermétodos para modular o crescimento de cartilagem, osso ououtro tecido conjuntivo.É um outro objetivo da presente invenção fornecermétodos para modular a expressão e liberação de proteínasmorfogênicas.

Esses e outros objetivos, características, e van-tagens da presente invenção se tornarão aparentes depois darevisão da seguinte descrição detalhada das modalidades des-critas e das reivindicações em anexo.

Breve Descrição dos Desenhos

A FIG. 1 é uma vista esquemática de uma forma deonda usada na estimulação de cicatrização de fratura óssea.

A FIG. 2A fornece uma ilustração que mostra umaforma de onda de sinal elétrico eficaz em modo de pulso ba-seado em uma forma de onda de bobina indutiva e adaptado pa-ra aplicação na pele para promover mineralização do osso.

A FIG. 2B fornece uma ilustração que mostra umaforma de onda de sinal elétrico eficaz em modo contínuo parapromover mineralização do osso.

A FIG. 3A fornece uma ilustração que mostra umaforma de onda de sinal elétrico eficaz em modo de pulso parapromover proliferação de células ósseas.

A FIG. 3B fornece uma ilustração que mostra umaforma de onda de sinal elétrico eficaz em modo contínuo parapromover proliferação de células ósseas.

A FIG. 4 fornece uma ilustração que mostra uma câ-mara de laboratório experimental para liberar corrente.

A FIG. 5 fornece um gráfico de barras que mostraas mudanças em fosfatase alcalina no supernatante (esquer-da) , e na membrana (direita).A FIG. 6 fornece um gráfico de barras que mostraas mudanças nos depósitos de osteocalcina e cálcio com o si-nal nB".

A FIG. 7 fornece um gráfico de barras que mostra oaumento em número de células medido por DNA como uma porcen-tagem de controle ± desvio padrão para formas de onda de si-nal PEMF na presença e ausência de L-NAME. L-NAME sozinho éapresentado como um controle experimental.

A FIG. 8 fornece esquemas de configurações parausar uma combinação de estimulação mecânica e elétrica paraaplicações in vitro.

Descrição Detalhada da Invenção

A seguinte descrição inclui o melhor modo presen-temente observado para executar a invenção. Essa descrição éfeita com o propósito de ilustrar os princípios gerais dainvenção e não deveria ser tomada em um sentido limitante. Otexto das referências mencionadas aqui é incorporado em suasintegridades como referência, incluindo o Pedido ProvisórioNorte-Americano Nos. Serial 60/687.430, 60/693.490,60/782.462 e 60/790.128.

Deveria-se entender que as aplicações in vitropresentes da invenção descrita aqui podem ser extrapoladaspara aplicações in vivo, terapias e seus similares. Um ver-sado na técnica apreciará que a tecnologia desenvolvida u-sando preparações reduzidas e modelos in vitro pode no fimdas contas ser usada para aplicações in vivo. Valores efeti-vos e faixas para estimulação elétrica in vivo podem ser ex-trapolados a partir de curvas de resposta à dose derivadasde sistemas de teste modelo em animal ou in vitro.

A presente invenção habilita a entrega de sinaisbioelétricos otimizados para corresponder a característicasselecionadas de sinais naturais do corpo resultando em cica-trização acelerada e mais permanente. Os sinais descritosaqui obedecem exclusivamente a características selecionadasde sinais naturais e conseqüentemente os tecidos submetidosa eletro-estimulação, de acordo com a presente invenção,passam por mínima tensão fisiológica. Em adição, a presenteinvenção é não invasiva e eficaz em custo tornando-a desejá-vel para múltiplas aplicações de uso pessoal e individual.

Re-modelagem de osso

0 osso é um dos tecidos mais rígidos do corpo hu-mano. Como o componente principal do esqueleto humano, elenão somente suporta estruturas musculares, mas protege ór-gãos vitais no crânio e em cavidades torácicas. 0 osso écomposto de material calcificado intercelular (a matriz ex-tracelular do osso) e diferentes tipos de célula: osteoblas-tos, osteócitos e osteoclastos. A matriz extracelular é com-posta de componentes orgânicos e inorgânicos. 0 componenteorgânico inclui células, colágenos, proteoglicanos, hialurô-nios e outras proteínas, fosfolipídios e fatores de cresci-mento. A rigidez do osso vem do componente inorgânico mine-ralizado que é predominantemente cálcio e fósforo cristali-zado na forma de hidroxiapatita Cai0(PO4)6(OH)2. A combinaçãode colágeno e hidroxiapatita confere as características dedureza e rigidez do osso.Os osteoblastos são derivados de células progeni-toras de origem mesenquimal e estão localizados nas superfí-cies próximas à matriz do osso emergente e arranjados lado alado. A função principal dos osteoblastos é a elaboração edesenvolvimento de matriz de osso e executar uma função namineralização da matriz. Os osteoblastos são chamados osteó-citos quando embutidos na lacuna da matriz do osso e adotamuma morfologia levemente diferente e retêm contato com ou-tros osteócitos. Os osteoclastos são células multinucleadasmaiores contendo receptores para calcitonina e integrina eoutras características estruturais especializadas. A funçãoprincipal dos osteoclastos é reabsorver ambos componentesorgânicos e inorgânicos de matriz de osso calcifiçada.

A remodelagem do osso é o processo fundamental ealtamente integrado de reabsorção e formação de tecido ósseoque resulta em massa esquelética precisamente equilibradacom renovação da matriz mineralizada. Esse processo de reno-vação é alcançado sem comprometer a arquitetura anatômicatotal dos ossos. Esse processo contínuo de regeneração in-terna assegura que o osso mantém uma capacidade de regenera-ção verdadeira e manutenção da integridade do osso por repa-ração contínua de micro-fraturas e alterações em resposta àtensão. A arquitetura e a composição do esqueleto adulto es-tão em equilíbrio perpetuamente dinâmico. A remodelagem tam-bém fornece um dispositivo para liberação de cálcio em res-posta a demandas homeostáticas. As condições que influenciama remodelagem do osso incluem estímulos mecânicos tais comoimobilização ou leveza, corrente elétrica ou campos eletro-magnéticos, tais como campo elétrico acoplado de forma capa-citiva ou campo eletromagnético pulsado, mudanças hormonaisou em resposta a certas doenças inflamatórias.

A remodelagem do osso ocorre através de ciclos or-questrados de atividade que incluem as etapas de ativação,reabsorção, reversão, formação, e de quiescência. A ativaçãoé caracterizada pela existência de uma fina camada de reves-timento de células. Então, as células mononucleadas de cir-culação de linhagem hematopoética começam a migrar no sitiode ativação e se fundem para formar osteoclastos. A ativaçãoé seguida por reabsorção onde osteoclastos ativos escavamuma superfície do osso. Essa etapa tipicamente dura aproxi-madamente 2-4 semanas. A reversão ocorre seguindo a reabsor-ção e continua por um período de 9 dias durante esse tempoinativo, pré-osteoblastos estão presentes nas depressões dereabsorção. A próxima etapa é a formação e dura aproximada-mente 3-4 meses. Durante esse estágio ativo, os osteoblastosre-preenchem o sítio de escavação. A última fase de remode-lagem do osso é a quiescência onde nenhuma atividade de re-modelagem ocorre até o início do próximo ciclo de remodela-gem. Idealmente a quantidade de preenchimento de osso deveser igual à quantidade reabsorvida sem perda de massa óssea.

Formas de Onda

A presente invenção fornece sinais elétricos eformas de onda que habilitam ações específicas em tecidosbiológicos. Tais formas de onda são efetivas para ambas asaplicações in vivo e in vitro. Tecidos osteocondrais sãomostrados aqui para responder diferentemente a freqüências eformas de onda acentuadamente diferentes.

De interesse particular são sinais que compreendempulsos retangulares ou quase-retangulares alternados tendopolaridades opostas e comprimentos desiguais, desse modoformando trens de pulso retangulares assimétricos. Os pulsosde comprimentos específicos têm sido teorizados para ativarmecanismos específicos bioquímicos de célula, especialmentea ligação de cálcio ou outras pequenas espécies carregadasmóveis para receptores na membrana da célula, ou seu desli-gamento (usualmente mais lento). As partes de tal trem tendopolaridades opostas podem equilibrar para resultar substan-cialmente em uma carga líquida zero, e o trem pode ser oucontínuo ou dividido em rajadas de pulsos separadas por in-tervalos de sinal substancialmente zero. Os estímulos admi-nistrados em modo de rajada de pulso têm ações similares à-queles administrados como trens contínuos, mas suas açõespodem diferir em detalhes devido à capacidade (teoricamente)de espécies carregadas para desligar de receptores duranteos períodos de sinal zero, e programações de administraçãoexigida podem também diferir.

A FIG. 1 mostra uma vista esquemática de uma formade onda base 20 eficaz para estimular tecido ósseo e carti-lagem, onde uma linha 22 representa a forma de onda no modocontínuo, e a linha 24 representa a mesma forma de onda emuma escala de tempo maior em modo de rajada de pulso, os ní-veis 26 e 28 representam dois valores característicos dife-rentes de voltagem ou corrente, e intervalos 30, 32, 34 e 36representam o intervalo entre as transições especificas. Osníveis 26 e 28 são usualmente selecionados tal que, quandotirada a média sobre um ciclo completo da forma de onda, nãohá componente de corrente contínua líquida (DC) embora osníveis 26 e 28 podem ser selecionados para resultar em umcomponente DC líquido positivo ou negativo se desejado. Emaplicações reais, a forma de onda, tal como 20, é tipicamen-te modificada em que as voltagens ou correntes caem exponen-cialmente em direção a algum nível intermediário entre osníveis 26 e 28, com um tempo de caimento constante preferen-cialmente maior do que o intervalo 34. 0 resultado é repre-sentado por uma linha 28. As formas de onda descritas aquigeralmente têm dois componentes de sinal: um componente mai-or mostrado como intervalo 30 e um componente menor mostradocomo intervalos 32 em relação ao outro.

A variação nos comprimentos do componente de sinalcurto e longo confere efeitos específicos de um tecido esti-mulado. Os comprimentos do pulso de interesse nessa invençãopodem ser definidos como segue, de modo a aumentar o compri-mento:

Comprimento a: entre 5 e 75 μseg de duração, pre-ferencialmente entre 10 e 50 μseg de duração, mais preferen-cialmente entre 20 e 35 μseg de duração e mais preferencial-mente aproximadamente 28 μseg de duração.

Comprimento β: entre 20 e 100 μseg de duração,preferencialmente entre 40 e 80 μseg de duração, mais prefe-rencialmente entre 50 e 70 μseg de duração e mais preferen-cialmente aproximadamente 60 μseg de duração.Comprimento γ: entre 100 e 1000 μββς de duração,preferencialmente entre 150 e 800 μεθς de duração, mais pre-ferencialmente entre 180 e 500 μεθς de duração e mais prefe-rencialmente aproximadamente 200 μεες de duração.

Comprimento δ: em excesso de 1 milisegundo de du-ração, preferencialmente entre 5 e 100 μΞες de duração, maispreferencialmente entre 10 e 20 μεες de duração e mais pre-ferencialmente aproximadamente 13 μεες de duração.

Em uma primeira modalidade, o sinal elétrico temum componente menor de comprimento α e um componente maiorde comprimento β: assim tendo, com os comprimentos de pulsomais preferenciais de cada tipo (28 e 60 μΞθς, respec-tivamente) , uma freqüência de aproximadamente 11,4 KHz. Ossinais compreendidos de pulsos alternadamente de comprimentoα e comprimento β são preferenciais aqui como sinais "tipoA" e suas formas de onda como formas de onda "tipo A". Umexemplo de um sinal tipo A administrado como um trem conti-nuo de pulsos é mostrado na FIG. 2A. Os sinais tal como es-ses são úteis para promover a proliferação de uma amostra detecido ou cultura de tecido para uma variedade de aplicaçõesbiológicas ou terapêuticas.

Em modo de rajada de pulsos, as formas de onda"tipo A" seriam ligadas em rajadas de aproximadamente 0,5 a500 mseg, preferencialmente aproximadamente 50 mseg, com ra-jadas repetidas de 0,1-10 Hz ou preferencialmente aproxima-damente 1 Hz. Um exemplo desse tipo de forma de onda é mos-trado na FIG. 2B.Em uma segunda modalidade, o sinal elétrico tem umcomponente menor de comprimento α e um componente maior decomprimento γ: assim tendo, com os comprimentos de pulsosmais preferenciais de cada tipo (28 μεες e 200 μseg, respec-tivamente), uma freqüência de aproximadamente 4,4 KHz. Ossinais compreendidos de pulsos alternadamente de comprimentoα e comprimento γ são referidos aqui como sinais "tipo B" esuas formas de onda como formas de onda "tipo B". Tais for-mas de onda foram previamente descritas no Pedido de PatenteNorte-Americana no. 10/875.801 (publicação no.2004/02 67 333). Um exemplo de um sinal "tipo B" administradocomo um trem de pulsos continuo é mostrado na FIG. 3A. Ossinais tais como esses são úteis em alivio da dor e em pro-mover cicatrização do osso, e também estimular o desenvolvi-mento de estruturas tipo estruturas porosas do osso em cul-turas de osteoblastos in vitro, com aplicações no campo dereparo cirúrgico de osso e materiais de enxerto.

Em modo de rajada de pulso, as formas de onda "ti-po B" são ativadas em rajadas de aproximadamente 1 a 50mseg, preferencialmente aproximadamente 5 mseg, com rajadasrepetidas em 5-100 Hz ou preferencialmente aproximadamente15 Hz. Um exemplo desse tipo de forma de onda é mostrado naFIG. 3B. Essa forma de onda é similar em forma e amplitudepara correntes efetivas entregues a dispositivos eletromag-néticos indutivos (bobinas) típicos que são comumente usadosem produtos de estimulação da não união de osso, por exem-plo, EBI MEDICA, INC® (Parsippany, NJ) e ORTHOFIX, INC® (Mc-Kinney, TX).Em uma terceira modalidade, o sinal elétrico temum componente menor de comprimento β, mas um comprimentomaior de comprimento γ: assim tendo, com os comprimentos depulso mais preferenciais de cada tipo (60 μεες e 200respectivamente), uma freqüência de aproximadamente 3,8 KHz.Os sinais compreendidos de pulsos alternadamente de compri-mento β e de comprimento γ referem-se aqui como sinais "tipoC" e suas formas de onda como formas de onda "tipo C". Ossinais, tais como esses, são úteis em promover regeneração,maturação e calcificação do osso.

Em modo de rajada de pulso, as formas de onda "ti-po C" são ativadas em rajadas de aproximadamente 1 a 50mseg, preferencialmente aproximadamente 5 mseg, com rajadasrepetidas em 5-100 Hz ou preferencialmente aproximadamente15 Hz, a mesma do "tipo B". Essa forma de onda é similar emforma e amplitude a correntes efetivas entregues por outrosdispositivos eletromagnéticos indutivos (bobinas) típicoscomumente usados em produtos de estimulação da não união deosso, por exemplo, o ORTHOFIX, INC.® (McKinney, TX) PhysioS-tim Lite® que é projetado para promover" cicatrização de fu-sões espinhais.

Em uma quarta modalidade, o sinal elétrico tem umcomponente menor de comprimento γ e um componente maior decomprimento δ: assim tendo, com os comprimentos de pulsomais preferenciais de cada tipo (200 μseg e 13 mseg, respec-tivamente) , uma freqüência de aproximadamente 75 KHz. Os si-nais compreendidos de pulsos alternadamente de comprimento γe de comprimento δ referem-se aqui como sinais "tipo D" esuas formas de onda como formas de onda "tipo D". Os sinais,tais como esses, são úteis especialmente em promover cica-trização de cartilagem e calcificação do osso, e no trata-mento ou reversão de osteoporose e osteoartrite. Enquantoamplamente similar àqueles entregues através de eletrodospela BIONICARE MEDICAL TECHNOLOGIES INC® BIO-lOOO™, comomostrado na FIG. 3 da Patente Norte-Americana #5.273.033 queé aqui incorporada como referência, o sinal "tipo D" diferesubstancialmente em forma de onda (é retangular ao invés deexponencial) e do fato que é preferencialmente equilibradoem carga.

No modo de rajada de pulso, as formas de onda "ti-po D" são ativadas em rajadas de pelo menos 100 mseg, prefe-rencialmente aproximadamente 1 segundo, com rajadas repeti-das em intervalos de um segundo ou mais.

A intensidade do sinal pode também variar; de fa-to, sinais mais poderosos freqüentemente não dão mais bene-ficio do que os mais fracos, e algumas vezes menos. Para umsinal típico (tal como o sinal da FIG. 1) , uma efetividadede pico tipicamente cai em algum lugar entre um e dez micro-ampéres por centímetro quadrado (μΑ/cm2), e um ponto de cru-zamento em aproximadamente 100 vezes esse valor. Além desseponto, o sinal pode cicatrizar lentamente ou pode ele pró-prio causar ferimento adicional.

De particular relevância aos métodos presentes es-tão sinais elétricos ou formas de onda, que correm em modocontínuo ao invés de em modo de rajada. (Por exemplo, FIGs.2A ou 3A). Sinais que correm continuamente têm efeitos simi-lares àqueles sinais de rajada de pulso, mas podem exigirdiferentes programações de entrega para alcançar resultadossimilares.

Para as formas de onda usadas com os métodos dapresente invenção, densidades típicas de corrente média a-plicadas estão entre 0,1 e 1000 micro-ampéres por centímetroquadrado, preferencialmente entre 0,3 e 300 micro-ampérespor centímetro quadrado, mais preferencialmente entre 1 e100 micro-ampéres por centímetro quadrado, e mais preferen-cialmente aproximadamente 10 micro-ampéres por centímetroquadrado, resultando em gradientes de voltagem na faixa en-tre 0,01 e 1000, 0, 03 e 300, 0, 1 e 100, e 1 e 10 micro-ampéres por centímetro, respectivamente, em tecidos típicosdo corpo. O sinal de onda individual quase quadrado é assín-crono com um longo segmento positivo e um curto segmento ne-gativo ou vice versa. As partes positiva e negativa se equi-libram para resultar uma carga líquida zero ou opcionalmentepodem ser desequilibradas em carga com um pulso de equaliza-ção no fim do pulso para fornecer equilíbrio de carga líqui-da zero sobre a forma de onda como um todo. Essas formas deonda fornecidas por eletrodos na pele usam formas de ondacontínuas de caimento retangular ou aproximadamente retangu-lar ao invés de formas de onda de caimento fortemente expo-nencial. Outras formas de onda úteis nos métodos da presenteinvenção são descritas no pedido de patente Norte-Americanapublicada 10/875.801 (publicação no. 2004/02 67 333) incorpo-rada aqui como referência em sua integridade.Os sinais elétricos descritos acima podem ser ad-ministrados a células, tecidos biológicos ou indivíduos emnecessidade de tratamento por intervalos de tempo intermi-tentes ou continuamente por todo o dia. Um intervalo de tra-tamento é definido aqui como um intervalo de tempo que umaforma de onda é administrada em modo de pulso ou modo contí-nuo. Os intervalos de tempo podem ser aproximadamente 10 mi-nutos a aproximadamente 4 horas de duração, aproximadamente30 minutos a aproximadamente 2,5 horas de duração ou aproxi-madamente 1 hora de duração. Os intervalos de tratamento po-dem ocorrer entre aproximadamente 1 e 100 vezes por dia. Aduração e a freqüência de intervalos de tratamento podem serajustadas para cada caso para obter uma quantidade efetivade estimulação elétrica para promover proliferação de célu-la, diferenciação de célula, crescimento, desenvolvimento oureparo de osso. Os parâmetros são ajustados para determinaros parâmetros de tratamento mais eficazes.

Os sinais não necessariamente exigem longas horasde duração no intervalo de tratamento, embora a administra-ção de 24 horas possa ser usada se desejado. Tipicamente, 30minutos (repetido várias vezes ao dia) são exigidos para e-ficácia biológica. A proliferação de células in vitro podeser medida por meios padrão tais como contagens de células,aumentos em ácido nucléico ou síntese de proteínas. A regu-lação para cima ou para baixo de proteínas de matriz (tiposde colágeno I, III e IV) bem como fatores de crescimento ecitoquinas (tais como TGF-B, VEGF, SLPIf FN, MMPs) podem sertambém medidos (mRNA e síntese de proteína). Efeitos in vivopodem ser determinados pela taxa de cicatrização de um feri-mento ou medição de densidade de massa óssea. Outros métodosde diagnóstico para proliferação, diferenciação ou minerali-zação de tecido ósseo estarão prontamente aparentes a umversado na técnica.

Em uma modalidade, os sinais de promoção de proli-feração e de promoção de diferenciação são usados seqüenci-almente. Essa combinação de formas de onda é usada para au-mentar o número de células e então promove a diferenciaçãodas células. Como um exemplo, o uso seqüencial de sinais deproliferação e diferenciação pode ser usado para promoverproliferação de osteoblastos e então a diferenciação dos os-teoblastos em mineral produzindo osteócitos que promovem mi-neralização de osso ou vice versa. Por exemplo, um paradigmade tratamento pode ser usado onde um sinal tipo A de promo-ção de proliferação é administrado primeiramente a uma popu-lação de célula in vitro ou ex vivo por horas, dias ou sema-nas e então o sinal de promoção de proliferação é substituí-do com um sinal tipo B de promoção de mineralização por ho-ras, dias ou semanas até que a mineralização do osso foi e-fetuada. 0 tecido produzido pode então ser transplantado pa-ra benefício do paciente. Ambos os sinais podem também seraplicados simultaneamente para promover ambas proliferação,diferenciação e mineralização simultaneamente.

Os sinais elétricos podem ser entregues por ele-trodos na pele, ou conexão eletroquímica. Eletrodos de peleestão disponíveis comercialmente em tamanhos tais como 38,1χ 304,8 mm (1 H X 12 polegadas), 50,8 χ 88,9 mm (2 X 3 ^ po-legadas), e 50,8 χ 50,8 mm (2x2 polegadas) que podem serúteis para aplicação na espinha, nos quadris, e no braço,respectivamente. Esses eletrodos reutilizáveis são vantajo-sos porque eles não contêm látex e não mostraram significan-te irritação da pele. Os eletrodos reutilizáveis podem serusados múltiplas vezes; também reduzindo os custos para opaciente. Tais eletrodos podem incluir eletrodos #214 (5,08χ 330,2 mm) (1/5" χ 13"), #220 (50,8 χ 50,8 mm) (2" χ 2") e#230 (50,8 χ 15,24 mm) (2" χ 3/5") (KOALATY PRODUCTS®, Tam-pa, FL) ou eletrodos #T2020 (50, 8 χ 50,8 mm) (2" χ 2") e#T2030 (50,8 χ 15,24 mm) (2" χ 3,5") (VERMED, INC®, BellowsFalls, VT).

Há múltiplas vantagens de usar eletrodos de peleao invés de bobinas eletromagnéticas. Primeiramente, eletro-dos de pele são mais eficientes. Com eletrodos, somente osinal que será realmente enviado no corpo deve ser gerado.Com uma bobina, por causa do pobre acoplamento eletromagné-tico com os tecidos, o sinal colocado deve ser muitas, mui-tas vezes mais forte do que aquele desejado nos tecidos. Is-so torna o circuito de geração exigido para eletrodos poten-cialmente mais simples do que para bobinas, enquanto muitomenos potente para operar. Em segundo, eletrodos de pele sãomais amigáveis ao usuário. Os eletrodos de pele têm na maio-ria uma pouca porcentagem do peso e volume das bobinas ne-cessárias para entregar níveis de sinal equivalentes. Simi-larmente, por causa de melhor eficiência de acoplamento, osgeradores do sinal para acionar os eletrodos podem ser fei-tos muito menores e mais leves do que aqueles para bobinas.Depois de um tempo curto, um usuário dificilmente nota queeles estão lá. Em terceiro, eletrodos de pele são mais eco-nômicos. Diferente das bobinas, que custam de centenas a mi-lhares de dólares cada um, os eletrodos são itens "descartá-veis" tipicamente custando menos do que um dólar. Também,por causa da maior eficiência e simplicidade, os geradoresde sinal e baterias para acioná-los podem ser pequenos e ba-ratos para fabricar comparados àqueles para bobinas. Emquarto, os eletrodos de pele permitem construção de bateriamais simples e vida de bateria mais longa facilitando a fle-xibilidade do usuário em usar o dispositivo. Por último, oseletrodos de pele são mais versáteis do que bobinas eletro-magnéticas. As bobinas devem ser construídas para alcançaras características geométricas de partes do corpo às quaiselas serão aplicadas, e cada uma deve ser grande o suficien-te para rodear ou envolver a parte a ser tratada. Isso sig-nifica que para "cobrir" o corpo, deve haver muitos, muitostamanhos diferentes de bobinas e formas, alguns dos quaismuito grandes. Com os eletrodos, por outro lado, a distribu-ição de corrente é determinada por localização do eletrodosomente e prontamente previsível por todo o volume entre e-les, assim o corpo pode ser "coberto" com somente uns poucostipos de eletrodos mais uma lista de localizações bem esco-lhidas.

Sistemas de Estimulação

Também observados pela presente invenção estãosistemas biológicos que incluem células e estimuladores paraentregar sinais elétricos a células. Tais células podem in-cluir, mas não estão limitadas a, células precursoras taiscomo células-tronco, células progenitoras não comprometidas,células progenitoras comprometidas, células progenitorasmultipotentes, ou células progenitoras pluripotentes ou cé-lulas em outros estágios de diferenciação. Tais células po-dem ser embriônicas, fetais, ou células adultas e podem serceifadas ou isoladas de fontes autólogas ou alogeneicas. Emuma modalidade, células proliferativas são usadas, emboracélulas não proliferativas possam também ser usadas nos mé-todos descritos aqui. Tais células podem ser combinadas invitro, por exemplo, em cultura de tecido, ou in vivo paraaplicações de engenharia de tecido ou de reparo de tecido.Células-tronco transplantadas podem ser seletivamente atraí-das a sítios de ferimento ou doença e então eletricamenteestimuladas para fornecer cicatrização aperfeiçoada.

Estimular culturas de células de acordo com o mé-todo e propósito da presente invenção também exige um meioprático de entregar formas de onda uniformes simultaneamentea muitos poços de cultura sem perturbar o processo de incu-bação ou causar contaminação. Os dispositivos são fornecidosaqui para eletricamente estimular culturas durante a incuba-ção que preferencialmente contêm seis poços de cultura detecido conectados como um sistema de múltiplos poços usandosistemas de eletrodo anodizado acoplado de forma capacitivaespecialmente projetados para administração de sinal. Usan-do-se uma conexão de cabos de fita, vazamentos na vedação doincubador são minimizados mantendo o ambiente de CO2 contro-lado para as culturas. Uma configuração típica é mostrada,na forma parcialmente esquemática, na FIG. 4.

Na configuração mostrada, por exemplo, na FIG. 4,seis poços de cultura de tecido IlOA até IlOF são interco-nectados e cada poço inclui eletrodos 140 nas extremidadesda câmara formadas por dois segmentos retos de fio de 15 mme um de 7,5 mm, unidos por curvas fechadas e conectados poruma dobra em ângulo reto à parte central 142 da ponte 112.Sete pontes são mostradas na FIG. 4. Os eletrodos 140 são detamanho a se ajustarem nas paredes de extremidade de uma câ-mara de deslizamento Lab-Tek II, que mede 18 por 48 milíme-tros internamente com uma profundidade típica de preenchi-mento de 3 mm. A capacitância de tal eletrodo é aproximada-mente 0,56 micro-faraday. As pontes 112A e 112G diferem namedida em que têm espirais de extremidade do poço 144 cadauma contendo aproximadamente 15 cm de fio. A capacitânciaentre o fio da ponte 112A ou 112G e o eletrodo de prata cor-respondente 104, é aproximadamente 2,3 micro-faradays.

As pontes 112A, 112B e assim por diante, formadasde metal sólido relativamente inerte conectam as câmaras1.10Δ, 110B e assim por diante eletricamente em série entreos poços de extremidade 106A e 106B. Enquanto seis câmaras110A até 110F, e sete pontes 112A até 112G, são mostradasaqui, qualquer outro número conveniente "n" de câmaras e"n+1" de pontes poderia ser usado. Em adição, uma pluralida-de de tais grupos conectados em série, cada um compreendidode "n" câmaras, "n+1" pontes e dois poços de extremidade,poderia ser usada com uma única fonte de sinal 100, usandoum dispositivo de distribuição de sinal tal como uma rede deresistores para dividir a energia do sinal entre os grupos,como é bem conhecido na técnica de sinalização eletrônica.

A impedância elétrica total da configuração mos-trada, com doze extremidades de eletrodo de câmara, dois e-letrodos em espiral de poço de extremidade 106 e seis câma-ras como descritas, é principalmente capacitiva em 0,045 mi-cro-faradays, mais um componente resistivo de aproximadamen-te 10.000 ohms. Um resistor em série (não mostrado) conecta-do entre a fonte de sinal 100 e o poço de extremidade 106Apodem ambos regular a corrente aplicada a um nivel desejadoe também "inunda" a parte capacitiva da reatância em série.Por exemplo, com um resistor de 1 Mega ohm, a resposta emfreqüência é uniforme em +/- 3 dB de 5 Hz a 3 MHz.

Se desejado, a distribuição de energia de sinal emuma câmara pode ser medida com sondas como mostrado na câma-ra ampliada 110B. As sondas 120, feitas de qualquer metalrazoavelmente inertes, mas preferencialmente de 99,9% deprata pura como os eletrodos 104A e 104B, isolados exceto emsuas pontas, e com essas pontas configuradas separadas poruma distância fixa conhecida, são imersas no meio 122 e mo-vidas em uma sucessão de posições, preferencialmente marcan-do uma grade retangular. A voltagem diferencial em cada po-sição é lida por um amplificador diferencial 124, tal comoum Dispositivo Analógico AD522, e enviada a um osciloscópioou outro dispositivo, geralmente indicado por 126, para exi-bição ou gravação. Os resultados são convenientemente repre-sentados como um arranjo de números representando a razão deintensidade de sinal em cada ponto com a média total, comomostrado na base da FIG. 4 novamente para a câmara ampliada110B. Alternativamente, outros meios, tais como codificaçãopor cor ou gráfico tridimensional, podem ser usados.

Os resultados são convenientemente representadoscomo um arranjo de números representando a razão de intensi-dade do sinal em cada ponto com a média total, como mostradona base da FIG. 4 novamente para a câmara ampliada 110B. Al-ternativamente, outros meios, tais como codificação por corou gráfico tridimensional, podem ser usados.

Como é mostrado pela grade na FIG. 4, a distribui-ção de sinal com eletrodos localizados nas extremidades es-treitas de uma câmara retangular é tipicamente quase unifor-me salvo nas pequenas regiões imediatamente adjacentes aopróprios eletrodos. A uniformidade também melhora com o tem-po, ou em solução salina média ou plena, à medida que óxidocortado ou quebrado cicatriza. As leituras médias acima naesquerda inferior na FIG. 4, por exemplo, podem ter resulta-do de óxido incompletamente cicatrizado na extremidade dofio cortada.

Para conveniência de manipulação, evaporação médiamínima e facilidade em manter a esterilização, todas as câ-maras, pontes e poços de extremidade em um grupo podem con-venientemente ser montados em uma lâmina de vidro rígida ououtro transportador esterilizável, e uma ou mais dessas lâ-minas uma vez montadas podem então ser envoltas em um reci-piente externo tal como uma caixa plástica rígida.A presente invenção também fornece novos disposi-tivos de estimulação para entregar sinais elétricos de modoa promover crescimento ou reparo do osso. Especificamente,novos sistemas de eletrodo passivos são fornecidos para en-tregar sinais elétricos. Esses sistemas de eletrodo acoplamsinais elétricos variáveis no tempo para aplicações in vitroou in vivo; e substituem a tecnologia de ponte de eletrólitoconvencional para a entrega de sinais do tipo PEMF por indu-ção em favor de um acoplamento capacitivo. Os sistemas deeletrodo podem ser feitos de materiais tais como, mas nãolimitados a, metais anodizados tais como nióbio, tântalo,titânio, zircônio, molibdênio, tungstênio e vanádio. Alumí-nio e aço inoxidável compartilham essa propriedade, mas emum nível muito menor, desde que eles são lentamente atacadospor soluções contendo íon de cloreto. Em freqüências utili-záveis, tipicamente entre aproximadamente 5 Hz e 3 MHz e,com refinamento do circuito, de abaixo de aproximadamente 1Hz em excesso de aproximadamente 30 MHz, a passagem de cor-rente DC é desprezível.

Nióbio é um dos vários metais que é auto-passivante desse modo formando finas camadas de óxido na su-perfície, mas muito duráveis quando expostas a oxigênio eumidade. Esse processo pode ser controlado por anodização.Geralmente, a auto-passivação torna a conexão confiável comoutros métodos difícil, entretanto, o presente projeto ex-clusivamente usa acoplamento capacitivo para induzir umacorrente no eletrodo e desse modo evita a dificuldade deformar conexões elétricas com outros metais. Esse sistema deeletrodo fornece eletrolise desprezível e nenhuma citoxidadefisiologicamente significante e é também útil para aplica-ções in vivo.

Os fios que são usados com o sistema de eletrodosda presente invenção são "autoprotegidos", formando finascamadas de superfície firmemente aderentes finas, mas muitoduráveis de óxidos não reagentes quando expostas à umidadeou oxigênio. O óxido assim formado tem uma alta constantedielétrica, e a espessura do óxido é substancialmente uni-forme e pode ser intimamente controlada. 0 revestimento deóxido de proteção permite ao metal agir como um capacitor deacoplamento para introduzir sinais elétricos de corrente al-ternada (carga líquida zero, ou ZNC) aos meios de culturacom distribuição regular e eletrolise desprezível.

Um estimulador ou outra fonte de sinal, geralmenteindicado por 100, é conectado através de fios, condutores emgarra ou por qualquer outro dispositivo conveniente 102, aum par de eletrodos de metal relativamente inertes 104A e104B, que são imersos em fluido eletricamente condutivo empoços de extremidade 106A e 106B. Esses fornecem um ponto deentrada para o sinal ao conjunto de câmaras de cultura 110A,110B e assim por diante, às quais ele é aplicado. Prata fina(99,9% pura) é preferencial para eletrodos 104A e 104B, esolução salina (solução de cloreto de sódio) para o fluidoem poços de extremidade 106A e 106B, desde que em uso, umafina camada de cloreto de prata, que se forma na interface eatravés de uma reação eletroquímica reversível, facilita apassagem de corrente elétrica. Outros metais e fluidos, en-tretanto, podem ser também usados.

As pontes 112A, 112B e assim por diante podem serformadas de qualquer metal relativamente inerte já que elenão é citotóxico. Metais tipicamente usados como eletrodosinertes para fluidos biológicos são prata, ouro, platina eos outros metais do grupo da platina. Infelizmente, essessão muito dispendiosos, podem permitir ou até catalisar al-gumas reações eletroquimicas em suas superfícies (especial-mente se impurezas menores estão presentes) , e os produtosde tais reações podem ser citotóxicos.

Por essa razão, o grupo dos assim chamados "auto-protegidos", que em contato com água ou soluções aquosasformam finas camadas de óxido de superfície biologicamenteinertes e altamente insolúveis vedando a superfície do metalde contato adicional com fluido, são preferenciais nessa in-venção. Esse óxido forma o único contato entre o sistema dedistribuição de sinal elétrico e o meio de cultura. Tais me-tais incluem nióbio, tântalo, titânio, zircônio, molibdênio,tungstênio e vanádio. Alumínio e aço inoxidável compartilhamessa propriedade, mas em um nível muito menor, desde que e-Ies são lentamente atacados por soluções contendo íons decloreto (como quase todos os fluidos biológicos).

A formação de óxido em tal metal pode ser melhora-da, e a espessura de óxido aumentada de uma maneira intima-mente controlável, através de anodização. A espessura de ó-xido uniforme fornece capacitância uniforme por unidade deárea de superfície metálica, por sua vez, resultando em in-tensidade de sinal relativamente uniforme sobre a superfíciequase sem considerar sua forma no fluido. Pequenas quebrasno óxido, causadas por corte e formação, cicatrizam rapida-mente por reação adicional com o fluido.

O nióbio é preferencialmente especialmente paraessa aplicação desde que, graças às cores vividas e estáveiscriadas pela interferência de luz no óxido de superfície(Nb2C>5) produzidas por anodização, é popular em jóias e as-sim disponível em custo razoável em formas convenientes e emuma variedade de cores em estoque. O Fornecedor de Joalheirodo Rio Grande, por exemplo, estoca fio de nióbio redondo decalibre 20 e 22 pré-anodizado em "roxo", "rosa", "azul escu-ro", "azul-petróleo", "verde" e "dourado", cada cor repre-sentando uma espessura de óxido diferente. 0 fio é facilmen-te trabalhado e formado em qualquer forma de eletrodo dese-jada. Dado um índice de refração de Nb2O5 (ND = 2,30) e suaconstante dielétrica (sR = 41 ε0) , a espessura de óxido podeser medida facilmente a partir do espectro de reflexão deluz, e a capacitância resultante por unidade de área ou com-primento de fio pode ser calculada. 0 fio "roxo" tem o óxidomais fino, medido em 48 nM a partir da refletância de pico420 nM, e assim para o fio "roxo" de calibre 22 (0, 0644 cmde diâmetro; Número de catálogo de Rio Grande 638-240), acapacitância foi calculada em 0,154 micro-faradays por cen-tímetro de comprimento de fio. A medição direta inicialmentefornece leituras muito mais altas devido a quebras de óxido,mas depois de 24 horas em solução salina, a capacitância me-dida estabilizou em 0,158 micro-faraday por centímetro, pró-ximo ao valor previsto.

As pontes 112A, 112B e assim por diante, assimfuncionam eletricamente como as pontes de sal convencionaisfazem, salvo que não há possibilidade de fluxo de fluido oude íons através delas, assim evitando possível contaminaçãocruzada entre as câmaras ou entre uma câmara e um poço deextremidade. Em adição, os problemas de evaporação e possí-vel quebra encontrada com as pontes de sal, e a inconveniên-cia de trabalhar com ágar-ágar ou outros agentes geleifican-te, são evitados. Desde que eles são eletricamente capaciti-vos, as pontes bloqueiam corrente contínua e assim o sinalque alcança as câmaras é equilibrado com carga entre as fa-ses, com qualquer componente de corrente contínua removido.

Todas as extremidades de ponte fazendo contato como meio de crescimento preferencialmente têm as mesmas dimen-sões e contêm grosso modo o mesmo comprimento de fio, entãotodos têm grosso modo capacitância igual, e são localizadoscontra as extremidades estreitas de câmaras de cultura quesão preferencialmente retangulares, como mostrado na câmaraampliada IlOB na FIG. 4. Às extremidades de ponte fazendocontato com o fluido nos poços de extremidade (por exemplo,as extremidades esquerdas das pontes 112A e 112G na FIG. 4)podem ser, se desejado, dadas uma forma diferente para me-lhorar o contato, diminuir a capacitância, e/ou ajustar me-lhor o tamanho e forma dos poços de extremidade se esses di-ferem das câmaras de cultura. Por exemplo, quando usando po-ços de extremidade redondos, as extremidades da ponte imer-sas neles podem ser convenientemente formadas como espirais144 como mostrado na FIG. 4.

Em resumo, portanto, os sistemas biológicos comoobservados pela presente invenção, compreendem os seguinteselementos: simuladores elétricos, eletrodos de metal anodi-zado, e células. Sinais PEMF adequados para uso em tais sis-temas incluem formas de onda como descritas, por exemplo,nas FIGs. 2 ou 3. Aplicações praticas de tais sinais incluemaumentar a proliferação, diferenciação ou mineralização detecido ósseo, aumentar expressão de BMP, ou aumentar a pro-dução de óxido· nitrico.

Engenharia de Tecido

Os métodos da presente invenção podem ser tambémusados em aplicações de engenharia de tecido. As células po-dem ser cultivadas usando os métodos e sistemas de culturada presente invenção em combinação com andaimes biologica-mente compatíveis para gerar tecidos funcionais in vitro ouex vivo ou transplantadas para formar tecidos funcionais invivo. Células-tronco transplantadas ou hospedeiras podemtambém ser seletivamente transplantadas ou atraídas para umalocalização de ferimento ou doença e então estimuladas comos sinais elétricos descritos aqui para fornecer cicatriza-ção ou recuperação melhorada. Andaimes de tecido podem serformados a partir de polímeros naturais biocompatíveis, po-límeros sintéticos, ou combinações desses, em uma matriz decélula aberta não entrelaçada tendo uma arquitetura substan-cialmente aberta, que fornece espaço suficiente para infil-tração de célula em cultura ou in vivo, enquanto mantendosuficiente força mecânica para resistir às forças contrá-teis, compressivas ou de tensão exercidas por células cres-cendo no andaime durante a integração do andaime em um sitioalvo em um hospedeiro. Andaimes de tecido podem ser estrutu-ras rígidas para gerar sólidas estruturas tridimensionaiscom uma forma definida ou alternativamente, os andaimes po-dem ser matrizes semi-sólidas para gerar tecidos flexíveis.

Os métodos e sistemas de cultura da presente in-venção incluem o uso de andaimes feitos de polímeros sozi-nhos, copolímeros, ou misturas desses. Os polímeros podemser biodegradáveis ou bioestáveis ou combinações desses. Co-mo usado aqui, materiais "biodegradáveis" são aqueles quecontêm colas que podem ser partidas sob condições fisiológi-cas, incluindo cisão enzimática ou hidrolítica de colas quí-micas.

Polímeros naturais adequados incluem, mas não es-tão limitados a, polisacarídeos, tais como alginato, celulo-se, dextran, pullane, ácido poli-hialurônico, chitina, po-li ( 3-hidroxialcanoato) , poli (3-hidroxioctanoato) e poli(3-ácido hidróxi graxo). Também observado na invenção estão de-rivativas químicas dos ditos polímeros naturais incluindosubstituições e/ou adições de grupos químicos tais como al-quil, alquileno, hidroxilações, oxidações, bem como outrasmodificações familiares àquelas versadas na técnica. Os po-límeros naturais podem ser também selecionados a partir deproteínas, tais como colágeno, zein, caseína, gelatina, glú-ten e albumina sérica. Polímeros sintéticos adequados inclu-em, mas não estão limitados a, polifosfazenas, poli(vinil)álcoois, poliamidas, poliéster amidas, poli(amino ácidos),polianidridos, policarbonatos, poliacrilatos, polialquile-nos, polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, teref-talatos de polialquileno, poliortoésteres, polivinil éteres,polivinil ésteres, polivinil haletos, poliésteres, polilac-tideos, poliglicolideos, polissiloxanas, policaprolactonas,poliidroxibutratos, poliuretanas, polímero em bloco de esti-reno isobutil estireno (SIBS) , e copolímeros e combinaçõesdesses.

Polímeros sintéticos biodegradáveis são preferen-ciais e incluem, mas não estão limitados a, poli(a-hidroxiácidos), tais como o ácido poli-L-lático (PLA), ácido poli-glicólico (PGA) e copolímeros desses (isto é, ácido co-glicólico poli-D,L-lático (PLGA), e ácido hialurônico. Ospoli (α-hidroxi ácidos) são aprovados pela FDA para uso emclínica humana. Deveria-se notar que certos polímeros, in-cluindo os polissacarídeos e ácido hialurônico, são solúveisem água. Quando usando polímeros solúveis em água, é impor-tante tornar esses polímeros parcialmente insolúveis em águaatravés de modificação química, por exemplo, pelo uso de umligador cruzado.

Uma das vantagens de uma matriz polimérica biode-gradável é que compostos angiogênicos e outros compostos bi-oativos podem ser incorporados diretamente na matriz tal queeles são lentamente liberados à medida que a matriz degradain vivo. À medida que a estrutura de célula-polímero é vas-cularizada e a estrutura degrada, as células diferenciarãode acordo com suas características inerentes. Fatores, in-cluindo nutrientes, fatores de crescimento, indutores de di-ferenciação ou de de-diferenciação (isto é, levando as célu-las diferenciadas a perder características de diferenciaçãoe adquirir características tais como proliferação e funçãomais geral), produtos de secreção, imunomoduladores, inibi-dores de inflamação, fatores de regressão, compostos biolo-gicamente ativos que melhoram ou permitem o crescimento paradentro da rede linfática ou fibras de nervo, ácido hialurô-nico, e drogas, que são conhecidas àqueles versados na téc-nica e comercialmente disponíveis com instruções como para oque constitui uma quantidade efetiva, a partir de fornecedo-res tais como Collaborative Research, Sigma Chemical Co., osfatores de crescimento vascular, tais como o fator de cres-cimento endotelial vascular (VEGF), EGF, e HB-EGF, poderiamser incorporados na matriz ou fornecidos em conjunto com amatriz. Similarmente, polímeros contendo peptídeos, tal comoo peptídeo RGD de conexão (Arg-Gly-AsP) , podem ser sinteti-zados para uso em matrizes de formação.

Kits

Kits são também fornecidos na presente invençãoque combinam estimuladores elétricos com andaimes biologica-mente compatíveis para suportar o crescimento e integraçãode células em um tecido unificado. Os recipientes com ele-trodos embutidos podem ser fornecidos com o kit e os eletro-dos podem ser feitos de um material auto-passivante ou ou-tros materiais de eletrodo convencionais. Esses kits podemopcionalmente incluir reagentes, tais como meios de cresci-mento, e fatores de crescimento para promover a integraçãodas células com os andaimes. Os andaimes incluídos no kitpodem ser projetados para ter moléculas de promoção de cres-cimento e de aderência fixadas a suas superfícies. Tais kitssão opcionalmente embalados juntos com instruções do uso a-propriado e otimização.

As células podem ser fornecidas com o kit de umaforma preservada com um material de proteção até que a horaem que as células são combinadas com outros elementos do kitpara produzir um tecido apropriado. Em uma modalidade, ascélulas são fornecidas, e são criopreservadas em nitrogêniolíquido ou ressecadas na presença de um composto tal comotrealose. As células podem ser células progenitoras indife-renciadas, incluindo células-tronco; células-tronco pluripo-tentes, células-tronco multipotentes ou células progenitorascomprometidas. Alternativamente, células terminalmente dife-renciadas podem ser também usadas com esses kits. Tais kitspodem ser projetados para produzir tecido de substituiçãopara uso em qualquer sistema de órgão tal como, mas não li-mitado a, osso, cartilagem, músculo, rim, fígado, sistemanervoso, pulmão, coração, sistema vascular, etc.

As células podem ser também colhidas a partir deum paciente em necessidade de tratamento para engenhar teci-do de substituição a partir do próprio tecido do paciente. 0uso do próprio tecido do paciente fornece uma forma de pro-duzir tecido de transplante com complicações reduzidas asso-ciadas à rejeição de tecido.

Em adição à estimulação puramente elétrica, umacombinação de estimulação elétrica e mecânica in vitro podeser benéfica para alguns propósitos. A estimulação mecânicapode consistir de carga de tensão, carga compressiva, oucarga de corte. As configurações típicas são mostradas emseção transversal nas FIGs. 8A até 8E.

Em cada caso de carga, a configuração teste éconstruída em torno de um poço de cultura ou câmara 200 dequalquer tipo familiar na técnica, contendo o meio 202 e umacamada de células 204 tipicamente conectada a uma lâmina in-ferior ou membrana 206 que pode ou não ser uma parte de umabase mecânica rígida 208 do poço de cultura. Os eletrodos210, de qualquer metal utilizável como descrito entre o res-to, mas preferencialmente de um metal com autoproteção emais preferencialmente de nióbio anodizado, são localizadosna câmara 200 de tal forma a criar uma distribuição de cor-rente relativamente uniforme por todo o meio 202.

Para carga de tensão, a membrana 206 forma uma ba-se adicional ou "falsa" no poço de cultura ou câmara 200 co-mo mostrado na FIG. 8A. A membrana 206 pode ser feita dequalquer material adequadamente flexível e elástico ao qualas células se conectarão, tal como borracha de silicone quefoi cauterizada por plasma. 0 tubo 212 conecta o espaço 214entre a membrana 206 e a base da câmara rígida 208 com umabomba externa ou outra fonte de pressão estável ou flutuanteou vácuo 216. A operação intermitente da fonte de pressão oude vácuo 215 leva a membrana 206 a flexionar para cima e pa-ra baixo, criando tensão intermitente na membrana e assim nacamada de célula 204 conectada a ela. Alternativamente, afonte 216 pode aplicar pouca ou nenhuma pressão através damembrana 206 por um período estendido, permitindo às células204 colonizarem a membrana em seu estado não deformado, en-tão aplica uma pressão diferente desse modo esticando a mem-brana 206, por exemplo, em um ponto do crescimento da cultu-ra no qual as células 204 já alcançaram confluência e esta-beleceram contato de junção de hiato.

Para carga compressiva, o poço de cultura ou câma-ra 200 é ao invés de selado com uma tampa 220 e conectado àfonte de pressão 216 diretamente como mostrado na FIG. 8B. Afonte 216 cria uma pressão hidrostática estável ou flutuanteno meio 202, que é assim aplicada diretamente à camada decélula 204.

Como um meio alternativo para carga compressiva, otubo 212 e a fonte de pressão 216 são eliminados e a tampada câmara 220 toma a forma de um pistão móvel através doqual a pressão estável ou flutuante pode ser aplicada dire-tamente ao meio 202 e assim às células 204, como mostrado naFIG. 8C.

Para carga de corte, o poço de cultura 200 é co-nectado à fonte de pressão 216 ao invés de via dois tubos212A e 212B através dos quais o meio 202 é circulado, comomostrado na FIG. 8D. Esse fluxo pode ser ou constante em umaúnica direção, intermitente, ou oscilatório. Cada tubo épreferencialmente equipado com abafadores 220 para alcançarfluxo mais uniforme, como geralmente indicado pela seta 222.Os abafadores 220 podem ser feitos separados dos eletrodos210 como mostrado, ou alternativamente, os eletrodos podemser perfurados, ou de outra forma, feitos descontínuos talcomo eles próprios para formar abafadores. 0 movimento domeio 202 e seu atrito contra a camada de célula 204 geram acarga de corte desejada.

Como um meio alternativo a fornecer carga de cor-te, os tubos 212A e 212B e a fonte de pressão 216 são subs-tituídos com um impulsor de movimento 230 que mantém o meio202 em movimento em relação à camada de célula 204 como ge-ralmente indicado pela seta 232. 0 impulsor 230 pode tomarqualquer das várias formas, mas pode vantajosamente ser deforma cilíndrica como mostrado na FIG. 8E, onde a base rígi-da 208 da câmara 2 00 se aproxima da mesma forma e mantém umadistância relativamente uniforme da superfície do impulsor.O meio 202 é, desse modo, varrido continuamente e em uma ve-locidade estável sobre as células 204 simplesmente mantendo-se o impulsor 230 em rotação em uma velocidade constante.Alternativamente, alterando a velocidade do impulsor 230 mu-dará a velocidade do fluxo e assim, o nível da carga de cor-te. Os eletrodos 210 não são mostrados desde que eles podemtomar uma variedade de posições nesse arranjo. Preferencial-mente, entretanto, o piso de célula rígido 208 e o impulsor230 são feitos de metais de eletrodo adequados, mais prefe-rencialmente de metais com autoproteção e mais preferencial-mente de nióbio anodizado, e funcionam como os eletrodos.

Modulação Diferencial de crescimento de osso

As formas de onda da presente invenção como des-critas acima são também úteis em métodos para promover ocrescimento e reparo de tecido ósseo in vivo. Como descritoacima, a estimulação com formas de onda tipo A promove aproliferação de células. As formas de onda tipo A também re-sultam em um aumento nas proteínas morfogênicas do osso parapromover diferenciação. Em uma modalidade, um aumento naprodução de BMP-2 e BMP-7 é efetuado usando sinais elétricostipo A ou em um grau menor, tipo B. Esse efeito é altamentevalioso e fornece um método para aperfeiçoar a geração detecido suficiente para cicatrização apropriada do tecido invivo, ou para criar enxertos de tecido. Esse sinal é tambémvalioso para fornecer massa de célula suficiente para infil-tração em um andaime de polímero para propósitos de engenha-ria de tecido. Em uma outra modalidade, como demonstrado porteste in vitro, a estimulação in vivo fornece proliferação ediferenciação de osteoblastos para aumentar o número de os-teoblastos para mineralização. Tal aumento em número de cé-lulas fornece um método para preencher os espaços ou orifí-cios no desenvolvimento ou regeneração do osso através deestimulação elétrica. As células geradas através de prolife-ração induzida pelas formas de onda tipo A podem ser usadasimediatamente, ou preservadas usando métodos de preservaçãode célula convencionais até que uma necessidade futura apa-reça.

A estimulação com formas de onda do tipo B promovea proliferação em um grau pequeno, e tem ações diferentesdas formas de onda tipo A. As ações promovidas pelas formasde onda tipo B incluem, mas não estão limitadas à minerali-zação, produção de proteína extracelular, e organização dematriz. As ações de formas de onda tipo B são também valio-sas e fornecem métodos para aperfeiçoar a etapa de minerali-zação e ossificação de novo tecido ósseo. Em uma modalidade,o desenvolvimento ou a regeneração de tecido ósseo é estimu-lado com formas de onda tipo B para melhorar a taxa de mine-ralização. Foi proposto que as formas de onda tipo B podemagir através de passagens de cálcio/calmodulina e também porestimulação de proteína G acoplada a receptores ou mecanore-ceptores em células do osso. (Bowler, Front Biosci, 1998,3:d769-780; Baribault e outros, Mol Cell Biol, 2006,26(2):709-717) . Como tal, os métodos são também fornecidospara modular a atividade de ações mediadas por cál-cio/calmodulina bem como receptores e mecanoreceptores aco-plados por proteína G usando estimulação elétrica. A modula-ção dessas passagens celulares e receptores é valiosa parapromover o crescimento e reparo de tecido ósseo in vitro ouin vivo.

A estimulação com formas de onda tipo C promove aregeneração, maturação e calcificação do osso. Essas formasde onda são também valiosas e fornecem métodos para melhorara etapa de mineralização e ossificação de novo tecido ósseo.

A estimulação usando formas de onda tipo D promovedesenvolvimento de cartilagem e cicatrização e calcificaçãode osso, e é útil para tratar ou reverter osteoporose e os-teoartrite. As aplicações dessas formas de onda incluem a-plicações in vivo tal como reparar cartilagem danificada,aumentar a densidade do osso em pacientes com osteoporosebem como aplicações in vitro relacionadas à engenharia detecido da cartilagem, por exemplo.Métodos são também fornecidos para combinação ouuso seqüencial das formas de onda descritas aqui para o de-senvolvimento de um regime de tratamento para efetuar resul-tados biológicos em desenvolver ou regenerar tecido osteo-condral.

Em uma modalidade, fraturas em pacientes com umdistúrbio de osso podem ser tratadas com sinais para cica-trizar fraturas e então reforçar o osso. Como um exemplo nãolimitante dessa modalidade, um paciente osteoporótico comuma fratura pode ser tratado por primeiro estimular com umsinal tipo A para promover proliferação e liberação de fato-res de crescimento e então uma forma de onda tipo B parapromover um aumento na densidade do osso no sitio do reparopara aumentar a densidade de massa do osso e impedir re-fratura.

Em uma outra modalidade, a combinação de dois oumais tipos de formas de onda descritas aqui pode ser usadapara promover a proliferação seqüencial, diferenciação e mi-neralização de tecidos osteocondrais. Como um exemplo nãolimitante dessa modalidade, uma cultura de osteoblastos podecrescer sob a influência de um sinal tipo A em conjunto comou anterior à conexão com uma matriz polimérica. Depois desemear a matriz polimérica, os sinais tipo B são então admi-nistrados à construção de matriz de célula para promover mi-neralização de uma construção útil como um enxerto de osso.

Em uma terceira modalidade, dois ou mais sinaispodem ser administrados simultaneamente para promover proli-feração, diferenciação e mineralização concomitantes de te-cido osteocondral in vivo ou in vitro. Diferentes sinais po-dem ser também aplicados seqüencialmente a tecido osteocon-dral de modo a resultar em um efeito maior do que entregarqualquer sinal sozinho. 0 processo seqüencial pode ser repe-tido à medida que necessário para produzir tecido adicional(tal como osso) oscilando através do processo de duas etapassuficientes vezes para obter o efeito biológico desejado.

Como um exemplo não limitante especifico, sinais tipo A po-dem ser aplicados primeiro para produzir mais células ósseaspor proliferação e então os sinais tipo B podem ser aplica-dos para induzir o maior número de células ósseas para pro-duzir mais tecido ósseo (matriz, mineral e organização), eentão repetido se necessário. A quantidade de osso produzidausando repetição de um protocolo de estimulação seqüencialseria maior do que aquela produzida por ou o sinal sozinhoou em combinação.

Estimulação de Célula Progenitora

Os métodos e formas de onda descritas aqui podemser aplicados a células precursoras não diferenciadas parapromover proliferação e/ou diferenciação em linhagens com-prometidas. Tais células progenitoras podem incluir, mas nãoestão limitadas a, células-tronco, progenitoras não compro-metidas, células progenitoras comprometidas, células proge-nitoras multipotentes, células progenitoras pluripotentes oucélulas em outros estágios de diferenciação. Também incluí-dos estão especificamente osteoblastos e condroblastos. Emuma modalidade, células-tronco adultas multipotentes (célu-las-tronco mesenquimais ou células-tronco de medula óssea)são estimuladas com sinais tipo A in vitro para promoverproliferação e diferenciação das células-tronco adultas mul-tipotentes em passagens especificas tais como ossos, tecidosconjuntivos, gordura, etc. A combinação ou administração se-qüencial com ambos sinais é também observada para estimula-ção de célula progenitora como previamente descrito.

Alternativamente, as formas de onda e métodos des-critos aqui podem também ser aplicadas a células-tronco a-dultas multipotentes (células-tronco mesenquimais ou célu-las-tronco de medula óssea) in vivo para estimular célulascom sinais tipo A para promover proliferação e diferenciaçãodas células-tronco adultas multipotentes em passagens espe-cificas tal como osso, tecidos conjuntivos, gordura, etc. Acombinação ou administração com ambos os sinais é também ob-servada.

A estimulação elétrica de células progenitoras po-de também ser executada por fatores de proliferação e de di-ferenciação conhecidos para promover proliferação ou dife-renciação de células progenitoras. Os fatores de prolifera-ção incluem qualquer composto com ações mitogênicas em célu-las. Tais fatores de proliferação podem incluir, mas não es-tão limitados a bFGF, EGF, fator de estimulação de colôniade granulócito, IGF-I, e seus similares. Os fatores de dife-renciação incluem qualquer composto com ações de diferencia-ção em células. Tais fatores de diferenciação podem incluir,mas não estão limitados a ácido retinóico, BMP-2, BMP-7 eseus similares.As formas de onda elétricas descritas aqui forne-cem modulação diferencial e de combinação no crescimento edesenvolvimento de tecido osteocondral in vitro ou in vivo.

0 aumento da proliferação de células com os sinais do tipo Aantes da mineralização aumenta o número de células ósseas e,portanto, fornece um aumento na mineralização subseqüenteefetuada por estimulação com sinais tipo B. As formas de on-da da presente invenção também promovem proliferação e dife-renciação de células progenitoras através da liberação deóxido nitrico e proteínas morfogênicas do osso.

Acoplamento Capacitivo

A estimulação de preparações in vitro e in vivo éfreqüentemente difícil com metais auto-passivantes porque édifícil obter conexões elétricas entre metais. A presenteinvenção fornece métodos de obter os benefícios de usar ele-trodos de metal auto-passivantes sem problemas associadoscom a obtenção de conexões elétricas sólidas. O acoplamentocapacitivo desses eletrodos fornece um método para induzircorrente contínua através do eletrodo de metal auto-passivante iludindo a necessidade por qualquer conexão elé-trica. Nesse método, os eletrodos feitos de metais auto-passivantes, tais como nióbio, tântalo, titânio, zircônio,molibdênio, tungstênio e vanádio, a alumínio e aço inoxidá-vel, são esterilizados e localizados em proximidade íntimacom uma população de células a serem estimuladas. Os fios docircuito são localizados em proximidade íntima com os ele-trodos de metal em um meio condutivo, tal como solução sali-na, e sinais elétricos são transmitidos através dos fios docircuito com corrente sendo acoplada de forma capacitiva apartir do fio através da solução salina e a camada de óxidono eletrodo de metal auto-passivante para, desse modo, esti-mular a população de células. Em uma modalidade, a estimula-ção por acoplamento capacitivo é usada para aplicações invitro tais como, mas não limitadas a, cultura de célúlas. Umprato de cultura pode ser estimulado usando esse método ouvários pratos de cultura ou poços podem ser ligados juntospara estimulação elétrica uniforme.

Em uma outra modalidade, a estimulação por acopla-mento capacitivo é usada para aplicações in vivo onde o ele-trodo de metal anodizado esterilizado é implantado em um pa-ciente em necessidade de tratamento e os fios de circuitosão localizados fora do paciente em contato com a pele parainduzir uma corrente no eletrodo de metal implantado parauma quantidade efetiva de tempo para promover reparo oucrescimento de um tecido. Por exemplo, a extremidade externado eletrodo pode formar uma bobina plana exatamente embaixoda pele e o sinal pode ser acoplado nele usando um eletrodoem contato com a pele, localizado na pele diretamente sobreessa bobina. Partes do eletrodo acoplado de forma capacitivaa partir das quais o acoplamento capacitivo intimo a tecidosnão é desejado podem ser cobertas com qualquer material iso-lante adequado para uso em circuitos implantados, como é bemconhecido na técnica, assim minimizando perda de sinal e es-timulação indesejada de tecidos que não estão sendo trata-dos. Em um exemplo especifico, tal como reparo de osso, umeletrodo de metal anodizado esterilizado feito de um metalauto-passivante é implantado em um paciente em necessidadede tratamento e estimulado. Depois de um período suficientede tempo para reparo do osso, o eletrodo pode ser removidodo paciente.

Aumento de Expressão de BMP

A presente invenção adicionalmente inclui métodose aparelhos que usam formas de onda tipo A e tipo B parapromover a expressão e liberação de proteínas morfogênicasde osso (BMPs) a partir de células estimuladas. Os sinaiselétricos descritos aqui podem ser usados para levar a libe-ração de BMPs em níveis suficientes a induzir um benefícioaos tecidos expostos aos sinais. 0 benefício pode ocorrer emtecidos não diretamente expostos aos sinais.

As BMPs são polipeptídeos envolvidos em osteoindu-ção. Elas são membros da superfamília de fator beta de cres-cimento de transformação com a exceção da BMP-I. Pelo menos20 BMPs foram identificados e estudados até agora, mas so-mente a BMP 2, 4 e 7 foram capazes in vitro de estimular oprocesso inteiro de diferenciação de células-tronco em célu-Ias maduras osteoblásticas. A pesquisa atual está tentandodesenvolver métodos para entregar BMPs para regeneração detecido ortopédico. (Seeherman, Ver. De Fator de Crescimentode Citoquina, Junho de 2005; 16 (3) :329-45) . Métodos são for-necidos aqui para induzir a liberação de BMPs in vitro ou invivo para regeneração de tecido ortopédico através de esti-mulação elétrica ao invés de através de entrega de BMPs exó-genas em métodos de entrega custosos e de demanda técnica.Em uma modalidade, formas de onda do tipo A e deum grau menor e de tipo B são usadas para induzir expressãoe liberação de BMPs endógenas. A liberação de BMPs endógenaspromove o crescimento e diferenciação de tecidos alvo. A Io-calização de eletrodos de estimulação fornece uma forma demirar a expressão de BMP em áreas localizadas de uma prepa-ração in vitro ou in vivo em um paciente em necessidade deexpressão de BMP aumentada. Em uma modalidade, BMP-2 ou BMP-7 ou combinações dessas são liberadas de forma endógena paraefetuar diferenciação e crescimento de tecido alvo. Em umamodalidade especifica, a liberação de qualquer uma ou ambasa BMP-2 e BMP-7 promove diferenciação, mineralização, produ-ção de proteína e organização de matriz em tecido ósseo outecido de cartilagem.

Estimulação de osso, de cartilagem e de outras cé-lulas de tecido conjuntivo por óxido nítrico

Os métodos e sinais elétricos descritos aqui podemser também usados para promover reparo e crescimento de os-so, cartilagem ou outros tecidos conjuntivos. Em uma modali-dade, uma forma de onda tipo B aumenta o crescimento de cé-lulas através da liberação de óxido nítrico (NO) . As formasde onda podem levar a liberação de óxido nítrico em níveissuficientes a induzir um benefício aos tecidos expostos aossinais. 0 benefício pode ocorrer em tecidos não diretamenteexpostos aos sinais. 0 crescimento de osso, de cartilagem,ou de outras células do tecido conjuntivo pode ser aumentadoadicionalmente pela co-administração de um doador de NO emcombinação com a estimulação elétrica. Os doadores de NO in-cluem, mas não estão limitados a, nitroprussiato de sódio(SNP), SIN-I, SNAPf DEA/NO e SPER/NO. 0 crescimento de osso,de cartilagem, ou de outra célula de tecido conjuntivo podeser reduzido através da co-administração de um inibidor desintase de NO em combinação com a estimulação elétrica. Taisinibidores de sintase de NO incluem, mas não estão limitadosa, N(G)-nitro-l-arginina metil éster (L-NAME), NG-monometil-L-arginina (L-NMMA), e 7-Nitroindazol (7-NI). Usando essesmétodos, o crescimento de osso, de cartilagem, ou de outracélula de tecido conjuntivo pode ser modulado dependendo denecessidades especificas.

A aplicação do Aparelho e dos Métodos da PresenteInvenção

Usando-se o aparelho e os métodos da presente in-venção como descrito aqui, eles são eficazes em promover ocrescimento, diferenciação, desenvolvimento e mineralizaçãode tecido osteocondral.

Crê-se que o aparelho opere diretamente no sitiode tratamento melhorando a liberação de fatores quimicostais como citoquinas que são envolvidas em respostas celula-res a várias condições fisiológicas. Isso resulta em fluxode sangue aumentado e inibe inflamação adicional no sitio detratamento, desse modo melhorando os processos de cicatriza-ção inerentes ao corpo.

A presente invenção é especialmente usada em ace-lerar a cicatrização de fraturas de osso simples ou comple-xas (múltiplas ou cominutivas) incluindo, mas não limitadasa, ossos serrados ou quebrados durante cirurgia. A presenteinvenção pode ser usada para promover fusão de vértebras de-pois de cirurgia de fusão espinhal.

A presente invenção pode ser usada para tratarfraturas de não união; tratar, impedir ou reverter osteopo-rose; tratar, impedir ou reverter osteopenia; tratar, impe-dir ou reverter osteonecrose; retardar ou reverter formaçãode osso entrelaçado (calo, esporão de osso), retardar ou re-verter perda de cálcio no osso em descanso em cama prolonga-do, retardar ou reverter perda de cálcio no osso em micro-gravidade. Em adição, a presente invenção pode ser usada pa-ra aumentar circulação de sangue local, aumentar fluxo desangue em áreas de ferimento traumático, aumentar o fluxo desangue nas áreas de úlceras crônicas na pele e modular a co-agulação do sangue.

Uma das áreas onde a presente invenção pode tambémser usada é para acelerar a cicatrização de cartilagem dani-ficada ou rasgada. Também, a presente invenção pode ser usa-da para acelerar a cicatrização (epitelialização) de feridasou úlceras na pele.

A presente invenção pode adicionalmente ser usadapara acelerar o crescimento de células ou tecidos cultiva-dos, modular a proliferação de célula, modular a diferencia-ção de célula, modular a progressão de ciclo de célula, mo-dular a expressão de fatores de crescimento de transforma-ção, modular a expressão de proteinas morfogenéticas de os-so, modular a expressão de fatores de crescimento de carti-lagem, modular a expressão de fatores de crescimento tipoinsulina, modular a expressão de fatores de crescimento defibroblasto, modular a expressão de fatores de necrose detumor, modular a expressão de interleuquinas e modular a ex-pressão de citoquinas.

Os métodos e aparelhos da presente invenção sãoadicionalmente ilustrados pelos seguintes exemplos não Iimi-tantes. Recursos podem existir para várias outras modalida-des, modificações, e equivalentes dessas, depois de ler adescrição exibida aqui, pode-se sugeri-los àqueles versadosna técnica sem abandonar o espirito da presente invençãoe/ou o escopo das reivindicações em anexo.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Efeito da configuração de Sinal PEMF na Minerali-zação e Morfologia em uma Cultura Primária de Osteoblasto

O objetivo desse estudo foi comparar duas configu-rações de forma de onda PEMF entregue com acoplamento capa-citivo avaliando-se variações bioquímicas e morfológicas emuma cultura de célula óssea primária.

Métodos

Cultura de célula de osteoblasto: Osteoblastos hu-manos primários (CAMBREX®, Walkersville, MD) foram expandi-dos para confluência de 75%, e localizados em uma densidadede 50.000 células/ml diretamente nas câmaras LAB-TEK™(NALGE NUNC INTERNATIONAL™, Rochester, NY) descritas ante-riormente. As culturas foram suportadas inicialmente commeios de osteoblastos básicos sem fatores de diferenciação.

Quando as culturas alcançaram confluência de 70% nas câma-ras, os meios foram suplementados com hidrocortisona-21-hemissuccinato (concentração final de 200mM),glicerofosfato (concentração final de 10 mM), e ácido ascór-bico. Os osteoblastos foram incubados em ar umidificado em37°C, 5% de C02, 95% de ar para mais de 21 dias. Os meiosforam mudados a cada dois dias para o curso do experimento,4 ml suplementando cada câmara.

Estimulação elétrica: As culturas foram estimula-das para ou 30 minutos ou para 2 horas duas vezes por dia.

Dois regimes de sinal elétrico foram seletivamente aplicadosàs células, um uma forma de onda continua indicada como "Si-nal A" (sinal positivo/negativo de 60/28 jxseg de duração) , eo outro uma forma de onda continua indicada como "Sinal B"(sinal positivo/negativo de 200/28 |_iseg de duração) . A in-tensidade foi medida em amostra que corre como 2,4 mV/cm(pico a pico). Osteoblastos não estimulados (NC) foram lami-nados em densidades idênticas (como controles) de uma manei-ra similar. Os seguintes foram medidos usando procedimentosem Métodos Detalhados: fosfatase alcalina, cálcio, osteocal-cina, e histologia. Cada um dos seguintes gráficos é codifi-cado com o sinal "A", o sinal "B", 30 minutos de duração co-mo "1", 2 horas de duração como "2", e NC (ou confluência)como nenhuma corrente (isto é, Al seria sinal A - 30 minu-tos; B2 seria B - 2 horas).

O dispositivo elétrico usado aqui habilita a apli-cação de forma de onda continua, estimulação elétrica a múl-tiplas explantes simultaneamente. Para cada experimento, 6pares de explantes foram localizados em poços individuais em4 ml de meio de cultura. Os espécimes de controle foram cul-tivados em condições similares, a única diferença sendo aausência de sinal entregue. A presente configuração de testeconsistiu de seis poços de cultura de teste (17 x 42 mm) co-nectados em série via uma seção em bobina de fio de nióbio.

Células de osteoblasto humanas foram estabelecidasem poços deslizantes LAB-TEK™ II (NALGE NUNCINTERNATIONAL™, Rochester, NY) , cada um com uma área de su-perfície de aproximadamente 10 cm2. Os sinais foram aplica-dos a várias câmaras simultaneamente conectando-os em série,via fios de nióbio que agiram como uma capacitância de aco-plamento. 0 estimulo foi ou uma rajada de 9 mseg de 200/28(iseg de pulsos retangulares bipolares repetindo em 15/seg,entregando 9mV/cm (similar ao sinal de cicatrização de ossoclinico padrão), designado Sinal B, ou uma rajada de 48 msegde 60/28 fj,seg de pulsos essencialmente unipolares entregando4 mV/cm, designado Sinal A. Culturas recebidas em um estimu-lo de 30 minutos ou de 2 horas duas vezes por dia. As amos-tras foram obtidas a partir do meio e analisadas em 7, 14, e21 pontos de tempo no dia para fosfatase alcalina, osteocal-cina, cálcio matriz e histologia. A mineralização acompa-nhando morfologia foi confirmada com corante de Von Kossa.Todas as análises bioquímicas foram executadas por técnicasde ensaio convencionais.

Resultados

A produção de PGE2 foi acessada usando kits comer-cialmente disponíveis ELISA (R&D SYSTEMS™, Minneapolis, MN;INVITROGEN, INC™, Carlsbad, CA) . Os resultados são expres-sos como pg/mg de tecido por 24 horas (nM/g/24horas).Fosfatase Alcalina (AP): Nos pontos no tempo indi-cados no projeto de estudo, as células passaram por Iise(MammaIian-PE, Genotech, St. Louis, MO) e o supernatante co-letado. A fosfatase alcalina foi medida pela segmentação depara-nitrofenil fosfato (PNPP) com nitrofenil (PNP) sob con-dições básicas na presença de magnésio. O produto final PNPé colorimétrico com um pico de obsorção em 405 nanômetros.

As condições básicas foram alcançadas usando 0,5 M de tampãocarbonato em pH 10,3. Os meios de cultura foram ensaiadosdiretamente para atividade ALP. A camada de célula ALP foiextraida com uma solução de triton X-IOO e uma aliquota me-dida para atividade ALP. A Fosfatase Alcalina foi medida emambos o supernatante e na membrana seguindo a extração detampão de Iise (FIG. 5). Como esperado a partir de outrosestudos (Lohman, 2003), a expressão de fosfatase alcalinaobteve pico próximo de 7 dias na membrana. Nas células cul-tivadas sob o estimulo "B", entretanto, os meios de culturacontinuaram a demonstrar um aumento em AP mensurável.

Osteocalcina: A osteocalcina (5800 daltons) é umproduto especifico do osteoblasto. Uma pequena quantidade deosteocalcina é liberada diretamente na circulação; é princi-palmente depositada na matriz do osso. Estudos mostraram quea osteocalcina circula como ambos a proteina intacta (1-49)e como os fragmentos de terminal N. 0 fragmento de terminalN principal é o peptideo (1-43). Uma osteocalcina de produ-ção média Elisa Kit foi selecionada por sua alta especifici-dade. 0 ensaio é altamente sensivel (0,5 ng/ml) e exigidosomente uma amostra de 25 microlitros. Padrões que corremsimultaneamente com nossos grupos experimentais ofereceramuma forte correlação com os valores esperados fornecidos pe-los fabricantes BTI (BTI, Stoughton, MA) . 0 depósito de os-teocalcina, medido subseqüente à imersão das culturas e de-terminado a partir do componente matriz, foi mais pronuncia-do seguindo o estimulo "B" e mais alto em 21 dias (FIG. 6).

Conteúdo de DNA: A camada de célula foi extraidacom 0,1 N de hidróxido de sódio e uma aliquota ensaiada paraconteúdo de DNA usando kit de ensaio CyQuant (INVITROGEN,INC™, Carlsbad, CA) . Para amostras de célula extraídas paraconteúdo ALP com triton X-100, a extração foi ajustada para0,1 N de hidróxido de sódio usando 1 N de hidróxido de só-dio. As curvas padrão contêm tampão de combinação. Para a-mostras também exigindo conteúdo de proteina, uma aliquotafoi medida para proteina usando método de ligação de molde(Bradford).

Cálcio: Cálcio foi determinado pela metodologiaSchwarzenbach com complexo de o-cresolftaleina, que forma umcomplexo de cor violeta. Adicionando-se 2 ml de 0,5M de áci-do acético durante a noite, cálcio foi dissolvido e conteúdofoi quantificado contra padrões por ensaio colorimétrico em552 nm (CORE LABORATORY SUPPLIES™, Canton, MI).

A distribuição de cálcio na cultura foi também a-cessada por histologia. Células foram fixadas em 2% de glu-taraldeido, lavadas com tampão cacodilato, lavadas com PBS eentão hidratadas para coloração como indicado. Cada periodode tempo foi corrido em conjunto; a morfologia representati-va é apresentada por 21 dias, comparando o sinal "A" com osinal "B", e comparando ambos os sinais com o controle (FIG.6). Para o sinal B, a observação mais evidente foi na dis-tribuição do cálcio com um alinhamento preferencial aparenteque nós interpretamos como um osso "pseudoporoso". Para osinal A, pareceu haver quantitativamente mais proliferaçãode célula e menos produção de matriz do que o sinal B (en-tretanto, o sinal A claramente teve mais matriz do que comcontroles).

A análise osteométrica foi desenvolvida e modifi-cada a partir da metodologia de Croucher. Nesse sistema decâmara bidimensional, a área média trabecular relativa à á-rea total da grade amostrada foi estudada. Usando um minimode 20 campos a partir das duas câmaras em cada intensidade,o estudo examinou formação de osso, largura de osteóide, enúmero de células. Grades especificas aleatórias foram de-senvolvidas para comparação direta e para remover polariza-ção. Adicionalmente, culturas de osteoblastos em ambas câma-ras estimuladas e de controle foram coloridas diretamentepelo método Von Kossa (Mallory, 1961) para examinar histolo-gia e qualificar a distribuição de cálcio nas culturas.

Conclusão

A fosfatase alcalina, que levanta em um pico pró-ximo do nivel de 10-14 dias, e então gradualmente abaixa,foi aumentada no supernatante estimulada pelo Sinal B. A de-posição de osteocalcina, medida subseqüente à imersão dasculturas e determinada a partir do componente matriz, foimais pronunciada seguindo o Sinal B somente e aumentada paraseu ponto mais alto em 21 dias. 0 cálcio de matriz medido emmg/dl, e o cálcio de matriz como uma função da área da lâmi-na de cultura de tecido foi o maior com o sinal B somente. Adistribuição mineral como notado por histologia e coloraçãoVon Kossa validou os dados bioquímicos a partir dos ensaios.

0 estimulo B conferiu uma quantidade maior de mineral, e,além disso, sugeriu um padrão bidimensional reticulado quepode oferecer dinâmicas de tensão analógica como seria espe-rado em um arranjo trabecular tridimensional. A proliferaçãode células apareceu qualitativamente maior com o Sinal A vscontrole, onde a mineralização significantemente aumentou eo padrão estava aparente em 21 dias com o Sinal B.

A configuração de dois sinais que produziu muitosefeitos diferentes é prontamente explicável por uma análisede relação sinal para ruido (SNR) que mostrou que a detecta-bilidade do sinal B foi IOX maior do que do sinal A, assu-mindo um Ca/CaM alvo. Esse estudo demonstra pela primeiravez que PEMF tem o potencial para efetuar ressonância estru-tural alterada com morfologia do tecido. 0 padrão geométricoaparente em 21 dias de cultura, espelhou a reticulação tra-becular consoante com osso poroso e contrastou durante a o-rientação aleatória das células em ambos o controle e asculturas expostas ao sinal A em todos os pontos no tempo a-valiados. Tais resultados sugerem que as configurações desinal preferenciais podem efetuar hierarquias estruturaisque previamente foram confinadas a observações em nivel detecido.

Exemplo 2Uso de uma Ponte "Salina" de Nióbio para estimula-ção PEMF In Vitro

Introdução

Um sistema de eletrodo passivo usando fio de nió-bio anodizado foi desenvolvido para acoplar sinais elétricosvariáveis no tempo em câmaras de cultura. A intenção do pro-jeto foi reduzir a complexidade e aperfeiçoar a reprodutibi-lidade substituindo tecnologia de ponte de eletrólito con-vencional para entrega de sinais tipo PEMF, tal como aquelesinduzidos em tecido pelo estimulador de crescimento de ossopor rajada de pulso repetitivo EBI, de forma capacitiva ouinvés de, indutivamente, in vitro para estudos de tecido ce-lular. 0 fio de nióbio anodizado está prontamente disponívelem exige somente ferramentas manuais simples para formar aponte de eletrodo. Em freqüências utilizáveis, tipicamenteentre 5 Hz e 3 MHz, a passagem de corrente DC é desprezível.

Fundamento

Campos elétricos acoplados de forma capacitiva têmsido tipicamente introduzidos em meios de cultura com pontessalinas de eletrólito convencionais que têm resposta de fre-qüência limitada e são difíceis de usar sem risco de conta-minação por tempos de exposição estendidos. 0 nióbio (colúm-bio) é um dos vários metais que são auto-passivantes, for-mando finas camadas de óxido de superfície, mas muito durá-veis quando expostas a oxigênio ou umidade. Outros metaissão tântalo, titânio, e em um grau muito menor, aço inoxidá-vel. 0 processo pode ser acelerado e controlado por anodiza-ção. Um problema com a auto-passivação é que ela torna a co-nexão confiável com outros metais dificil. 0 presente proje-to evita essa dificuldade.

Materiais e Métodos

O óxido de nióbio, Nb2O5, é duro, transparente, e-letricamente isolante e inerte em água, reagentes comuns efluidos biológicos sobre uma ampla faixa de pH. Formas denióbio anodizado Nb2O5 com espessura uniforme, mostram umafaixa de cores vividas de interferência de luz valiosa parajóias, desde que nenhum molde seja adicionado, e resultam emcapacitâncias estáveis e reproduziveis. 0 nióbio de jóia évendido em cores padrão, cada uma representando uma espessu-ra de óxido diferente. Desde que o contato dielétrico deNb205 é raramente alto (eR = 41s0) e as camadas são finas (48- 70 nm), suas capacitâncias são surpreendentemente grandes.0 nióbio "roxo" tem o óxido mais fino e a capacitância maisalta: 0,158 |^F/cm para fio de calibre 22 (Rio Grande #638-240), próximo ao valor calculado para 48 nM de óxido (420 nMde refletância de pico). Em água ou soluções salinas fisio-lógicas, extremidades de fio cortadas e pequenas fendas for-madas em curvar rapidamente cicatrizam com óxido, sem a ne-cessidade de re-anodização.

A Ponte de Nióbio

Nessa aplicação, o óxido de nióbio forma o únicocontato elétrico com o meio e sinais do tipo PEMF passam a-través dele de forma capacitiva. Em niveis de sinal abaixode uns poucos miliampéres, há eletrolise desprezível ou o pHmuda para causar artefatos. Múltiplas câmaras podem ser uni-das em série, cada uma recebendo sinais idênticos. Cada pon-te de nióbio é curvada formando um eletrodo tipo lâmina emcada extremidade, com uma capacitância tipica de 0,56 |J.F.

Localizando as pontes de eletrodo nas extremidades de umacâmara retangular cria distribuição de corrente quase uni-forme e gradientes de voltagem por todo o meio. Os gradien-tes medidos em uma configuração tipica de seletor de cultu-ra, eletrodos e sinal tipo PEMF, como foi previamente mos-trado na FIG. 4 e descrito no texto em anexo, mostram umavariação média de ± 3%, principalmente próximo aos eletrodosou onde o meio varia significantemente em profundidade. Umacâmara ou várias unidas em série é energizada através depontes de extremidade de nióbio especiais, cada uma com suaextremidade externa acoplada de forma capacitiva através desolução salina a um eletrodo de tira de prata formando umterminal de conexão. Isso remove qualquer necessidade de co-nectar nióbio a ele mesmo ou a qualquer outro metal. A cor-rente é controlada por uma resistência limitante em sérieRiim- A passagem de banda resultante (± 3dB de nominal) variade alguma forma com Rnm, mas em uma configuração de testevai de 5 Hz a 3 MHz, a mais alta freqüência tentada. Os si-nais tipo PEMF podem assim ser entregues não distorcidos invitro via acoplamento capacitivo.

Experimental:

A utilidade da ponte de eletrodo de nióbio foitestada em culturas de osteoblasto e condrócito usando umaforma de onda tipo B como previamente descrito. Com esse si-nal aplicado ao meio de osteoblasto 0GM™ (CAMBREX®, Wal-kersville, MD) sem células presentes, o pH medido depois de24 horas foi 8,2 9 comparado com 8,27 em controles não ener-gizados, sugerindo eletrólise desprezível. A ausência de ci-totoxicidade foi mostrada por proliferação robusta de osteo-blastos, diferenciação e desenvolvimento de uma estruturatipo osso porosa por 21 dias em OGM™ usando ambas formas deonda tipo A e tipo B. Depois da exposição de 30 minutos e de2 horas por 21 dias à forma de onda na cultura, as células ematriz foram analisadas com raio X de energia dispersiva(EDX). Nenhum nióbio poderia ser detectado. Em outros estu-dos, um sinal tipo B foi aplicado a células de cartilagemhumana (HCC) em meio de cultura contendo 1% de soro fetal debezerro por 96 horas. O sinal tipo B causou um aumento de154% no número de células como medido por conteúdo de DNA decamada de células, novamente não mostrando citotoxicidadesignificante. Em uma comparação direta entre o sinal acopla-do de forma capacitiva e, de outra forma, idêntico, mas aco-plado de forma eletromagnética, cada um entregue em 30 minu-tos diários por quatro dias, mediu aumentos no número de os-teoblasto por DNA diferiu significantemente dos controles(157% para nióbio, 164% para EM acoplado) mas não um do outro.

Conclusões

Uma nova ponte de eletrodo de nióbio foi desenvol-vida para aplicar sinais do tipo PEMF acoplados de forma ca-pacitiva a células/tecido em cultura. A passagem de banda daponte de nióbio é 5 Hz a 3 MHz, então os sinais do tipo PEMFcomo aqueles usados clinicamente para reparo de osso e feri-da sem distorção. Diferente de configurações de ponte de e-letrólito padrão, a ponte de nióbio fornece densidade decorrente uniforme no prato de cultura. A aplicação para ex-posições PEMF estendidas mostra nenhuma eletrólise ou cito-toxicidade fisiologicamente significante.

Exemplo 3

Estimulação de células de cartilagem usando um si-nal PEMF acoplado de forma capacitiva

Introdução

Um sinal PEMF similar àquele usado clinicamentepara reparo de osso está atualmente sendo testado em sua ca-pacidade de reduzir dor em juntas de pacientes artriticos. Ointeresse é se esse sinal de alivio de dor pode melhorar oproblema base de cartilagem prejudicada.

Fundamento

Comparado a terapias com drogas e biológicas, te-rapêuticas baseadas em PEMF oferecem um tratamento que é fá-cil de usar, não invasivo, não envolve nenhum agente estra-nho com efeitos laterais potenciais, e tem tempo de espaça-mento zero. Eventos com terapêuticas PEMF incluem identifi-car células responsivas, elucidar um sitio fisico de trans-dução em uma célula, e determinar o mecanismo biológico deação que resulta em uma resposta de célula. 0 propósito des-se estudo foi determinar se um sinal PEMF especifico atual-mente sendo testado para alivio de dor (MEDRELIEF®, Healtho-nics, Inc, GA) poderia estimular células de cartilagem invitro e se um mecanismo biológico de ação poderia ser resolvido.

MétodosCélulas normais de cartilagem humana (HCC;CAMBRIEX®, Walkersville, MD) foram laminadas em câmaras decélula retangulares em monocamadas. A aplicação PEMF foi a-coplada de forma capacitiva através de um sistema de pontede eletrodo de nióbio que permitiu uma corrente variável notempo para fluir uniformemente através das câmaras. Um sinaltipo B de rajada de pulsos como descrito aqui é composto deuma rajada de 10 mseg de pulsos retangulares assimétricos,200/28 microsegundos em largura, repetidos em 15 Hz. O sinalPEMF foi aplicado por 30 minutos por tratamento. O cresci-mento das células foi avaliado por conteúdo de DNA da camadade células. O conteúdo de óxido nitrico de meios de culturafoi avaliado pela reação Griess usando um kit de ensaio apartir de INVITROGEN INC® (Carlsbad, CA). Resultados são ex-pressos como micromoles de NO por número de célula como ava-liado por conteúdo de DNA da camada de célula.

Resultados

Um sinal PEMF aplicado em 400 micro-ampéres, picoa pico, a células HCC crescidas em meios de cultura contendo1% de soro fetal de bezerro, a cada 12 horas por um periodode 96 horas resultou em crescimento de células aumentado de153 ± 22%, p < 0,001. O interesse foi condicionado a meiosde cultura coletados 24 horas depois que o primeiro trata-mento PEMF mostra e aumenta em NO de 196 ± 14%, p < 0,001que declinou a niveis não signif icantes em 96 horas. Sobcondições similares quando SNP (um doador de NO - nitroprus-siato de sódio) foi adicionado a uma concentração final de 3microgramas/ml, houve também um aumento em NO em 24 horas(174 ± 26%, p < 0,001) e um aumento no número de células em96 horas (168 ± 22%, p < 0,001) comparado a controles nãotratados. Em um experimento subseqüente, a concentração desoro foi reduzida a 0,1%, o PEMF aplicado em 40 micro-ampéres uma vez a cada 24 horas, e medições obtidas depoisde 72 horas. O tratamento PEMF aumentou o conteúdo de NO emmeios de cultura condicionados em 154 ± 30%, p < 0,01. Comomostrado na FIG. 7, o tratamento PEMF aumentou o número decélulas e essa resposta de célula foi atenuada por L-NAME(um inibidor de sintase de óxido nitrico).

Conclusão

Esses resultados sugerem que um sinal PEMF atual-mente sendo testado para reduzir dor na junta devido à ar-trite pode também fornecer um beneficio à cartilagem. Os da-dos indicam que as células de cartilagem humana podem res-ponder a esse sinal com crescimento de células aumentado.Além disso, um possivel mecanismo mecânico de ação paracrescimento de célula de cartilagem estimulado é através deliberação de NO. Uma resposta similar de cartilagem que cha-ma doador de NO suporta essa hipótese. Embora não conclusi-vos, os dados sugerem que crescimento de células aumentadoseguindo o tratamento PEMF é ou mediado por NO, ou que NO éuma etapa exigida no mecanismo para PEMF produzir crescimen-to de célula aumentado.

Exemplo 4

A estimulação PEMF de produção de BMP em uma cul-tura de osteoblasto primária: Dependência de configuração desinal e duração de exposiçãoIntrodução

Como um auxiliar à cirurgia em fusão de espinha,ou para tratamento de não uniões recalcitrantes em longosossos, PEMF se provou eficaz como uma terapêutica não cirúr-gica. Trabalho piloto demonstrou que osteoblastos respondemdiferentemente a ambas configuração e duração de sinal. Umadiferença chave incluiu uma proclividade para depositar ma-triz em lugar de proliferação de célula. Baseado em uma efi-cácia provada de BMP em fusão de espinha e em não uniões, eem esforços demonstrando que BMP-2 e BMP-4 são estimuladaspor PEMF (Bodamyali, 1998), nosso estudo focou em melhor en-tender se prévias respostas de células poderiam ser correla-cionadas com regulação BMP.

Objetivo

Esse estudo, comparado às configurações de formade onda PEMF entregues com acoplamento capacitivo, correla-ciona variação bioquímica e morfológica em uma cultura decélula óssea primária com regulação de BMP.

Metodologia

Células de osteoblasto humano normal foram estabe-lecidas em câmaras de cultura individuais de 10 cm2. Os si-nais foram aplicados a várias câmaras simultaneamente conec-tando-as em série via fios de nióbio que agiram como uma ca-pacitância capacitiva. Os estimulos consistiam de um tremcontinuo retangular de pulsos bipolares de 60/28 microsegun-dos, designados como "sinal A", ou pulsos bipolares retangu-lares de 200/28 microsegundos designado como sinal B, apli-cando campos elétricos pico a pico de 1,2 mV/cm (em A) ou2,4 mV/cm (em B) uniformemente às culturas. As culturas fo-ram expostas por 30 minutos (1), ou 2 horas (2), duas vezesao dia, resultando em grupos Al, A2, Bl e B2 para compara-ção. Alíquotas previamente usadas para determinações de pro-teina de membrana foram analisadas para proteina BMP por en-saio ELISA, e matrizes previamente usadas para determinarcálcio e interpretar morfologia foram usadas para isolar RNAque foi subseqüentemente analisada por uma reação de corren-te de polimerase de transcriptase reversa de duas etapas(RT-PCR) usando iniciadores de seqüência disponíveis e co-nhecidos para (18s RNA) BMP-2 e BMP-7. Ambos o sinal que es-timulou proliferação e que estimulou deposição de matriz fo-ram analisados para regulação de BMP e translação de protei-na. As amostras de 7, 14 e 21 pontos de tempo no dia foramusadas para assegurar comparações idênticas para o ensaio.

Resultados

Os resultados chefe desse experimento foram seis;1) proteina BMP e mRNA para BMP foram elevados em resposta aambos os estímulos, particularmente aquele do sinal "A"; 2)o estimulo de 30 minutos entregue duas vezes por dia ofere-ceu aumento perto de 40 vezes na expressão de BMP-2 em 21dias comparado com o tratamento de 2 horas, com a maior par-te do ganho alcançada durante o período entre 14-21 dias; 3)o estimulo de 30 minutos para o sinal "A" forneceu um aumen-to de 15 vezes em expressão de BMP-7, novamente quase intei-ramente notado entre a análise de 14 e 21 dias; 4) somenteaumentos moderados em ou BMP-2 ou BMP-7 foram vistos com re-lação ao sinal "B"; 5) esse estudo fornece a primeira evi-dência que a expressão BMP-7 é promovido pela estimulaçãoPEMF e 6) embora a avaliação de proliferação foi qualitati-va, a natureza mitogênica de deposição de BMP está de acordocom trabalho previamente publicado. Trabalho avaliando PEMFem uma linha de célula transformada por curtos periodos detempo sugere que nem BMP-3 nem BMP-6 seja estimulado (Yaji-ma, 1996). Nós não avaliamos nosso modelo com relação a es-ses fatores de crescimento.

Conclusão

Dado o corpo de trabalho que mostrou BMP-2 comotendo propriedades morfogenéticas e mitogênicas, a prolife-ração das células em resposta ao sinal "A" não é surpreen-dente. As duas configurações de sinal que produziram efeitosmuito diferentes são potencialmente explicáveis por uma aná-Iise SNR que sugere a dose de sinal "B" pode ser IOx maiordo que o sinal "A" com a hipótese de uma passagem de trans-dução Ca/CaM. Talvez mais inesperados foram os niveis deBMP-2 e BMP-7 normalizados ao invés da deposição de matrizexagerada permitido pelo sinal "B". A formação de osso éprecisamente dependente de um equilíbrio de fator de cresci-mento e microtopografia da superfície, de fato, a presençade uma superfície suave sobrepõe a resposta de célula a BMP-2 e acentua mineralização distrófica. Dado o alto grau deorganização de matriz e deposição vista em resposta ao sinal"B", a transdução de BMP nela e dela mesma parece insufici-ente para formação produtiva de osso e pode ocorrer por ummecanismo alvo separado.

Exemplo 5Estudo de Caso: Tratamento de Osteoporose com Es-timulação PEMF

Um indivíduo osteoporótico (fêmea, 50 anos, T = -3,092 no início) usou estimulação elétrica usando o Sinal B(200/30) por 4-5 dias na semana por 3-5 horas a cada dia. 0paciente permaneceu nos mesmos medicamentos, suplementos eatividade para um período de um dia. Seguindo a varredura dedensidade de osso em 6 meses e 12 meses, revelou um aumentode 16% e 29% em densidade de massa óssea.

Claims (29)

1. Método para modular desenvolvimento ou reparode ossos, cartilagens ou outros tecidos conjuntivos que com-preendem células progenitoras, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende estimular o desenvolvimento ou regeneração detecido com um sinal elétrico, onde o sinal elétrico compre-ende um sinal do tipo A, do tipo B, do tipo C e do tipo Dpor um periodo de tempo suficiente para modular o desenvol-vimento ou reparo do tecido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende es-timular o desenvolvimento com um segundo sinal elétrico, on-de o segundo sinal elétrico compreende um sinal do tipo A,do tipo B, do tipo C ou do tipo D.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo A compreendeum componente longo com um comprimento P e um componentecurto com um comprimento a.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo A compreendeum componente longo de aproximadamente 60 jiseg de duração eum componente curto de aproximadamente 28 |a.seg de duração.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo B compreendeum componente longo com um comprimento y e um componentecurto com um comprimento a.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo B compreendeum componente longo de aproximadamente 200 |nseg de duração eum componente curto de aproximadamente 28 ^iseg de duração.

7. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que os dois sinais elétricos sãoadministrados simultaneamente ou seqüencialmente para promo-ver proliferação, diferenciação, ou produção de matriz decélulas no tecido.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que as células progenitoras sãoselecionadas a partir de células-tronco, células progenito-ras não comprometidas, células progenitoras comprometidas,células progenitoras multipotentes, ou células progenitoraspluripotentes.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a estimulação elétrica aumen-ta a produção de BMP-2 ou BMP-7.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a estimulação elétrica modulaa produção de óxido nitrico.

11. Método para produzir ou reparar ossos, carti-lagens, ou tecidos conjuntivos que compreendem células pro-genitoras, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende estimu-lar o tecido com um primeiro sinal elétrico para estimular aproliferação, diferenciação ou produção de matriz de célulasde formação de tecido seguido por estimular o desenvolvimen-to de tecido com um segundo sinal elétrico para estimular aproliferação, diferenciação ou produção de matriz/mineraldas células de formação de tecido.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro sinal elétricocompreende um sinal do tipo Aeo segundo sinal elétricocompreende um sinal do tipo B.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo A compreendeum componente longo com um comprimento P e um componentecurto com um comprimento a.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo A compreendeum componente longo de aproximadamente 60 |j,seg de duração eum componente curto de aproximadamente 28 fiseg de duração.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo B compreendeum componente longo com um comprimento y e um componentecurto com um comprimento a.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo B compreendeum componente longo de aproximadamente 200 p,seg de duração eum componente curto de aproximadamente 28 jo,seg de duração.

17. Eletrodo em ponte acoplado de forma capaciti-va, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um eletrodofeito de metal anodizado.

18. Eletrodo, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que o metal anodizado é nióbio,tântalo, titânio, zircônio, molibdênio, tungstênio, vanádio,aluminio ou aço inoxidável.

19. Sistema, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende células e um estimulador elétrico liberando um sinaldo tipo A ou um sinal do tipo B às células, onde as célulassão selecionadas a partir de células-tronco, células proge-nitoras não comprometidas, células progenitoras comprometi-das, células progenitoras multipotentes, ou células progeni-toras pluripotentes ou células em outros estágios de dife-renciação.

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreendedispositivos para carga mecânica das células.

21. Sistema, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo A compreendeum componente longo entre aproximadamente 20 fxseg e 100 fxsegde duração e um componente curto entre aproximadamente 5(J,seg e 95 fj,seg de duração.

22. Sistema, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo A compreendeum componente longo de aproximadamente 60 jo,seg de duração eum componente curto de aproximadamente 28 jj.seg de duração.

23. Sistema, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo B compreendeum componente longo entre aproximadamente 100 useg e 1000useg de duração e um componente curto entre aproximadamente 5 useg e 7 5 p,seg de duração.

24. Sistema, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal do tipo B compreendeum componente longo de aproximadamente 200 |j,seg de duração eum componente curto de aproximadamente 28 |j,seg de duração.

25. Sistema de cultura, de acordo com a reivindi-cação 19, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que com-preende um eletrodo em ponte acoplado de forma capacitivafeito de metal anodizado.

26. Kit para preparar um tecido adequado paratransplante, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de quecompreende:células;um estimulador elétrico que fornece uma forma deonda de estimulo elétrico, onde a forma de onda de estimuloelétrico compreende um sinal do tipo A, do tipo B, do tipoC, ou do tipo D; eum andaime biodegradável e bioestável;onde a forma de onda promove proliferação, dife-renciação, ou produção de matriz das células em um tecidoadequado para transplante.

27. Kit, de acordo com a reivindicação 26,CARACTERIZADO pelo fato de que o andaime é feito de um mate-rial selecionado a partir de polímeros naturais ou sintéticos.

28. Kit, de acordo com a reivindicação 26,CARACTERIZADO pelo fato de que o andaime está em associaçãocom moléculas de promoção de crescimento e de promoção deaderência.

29. Kit, de acordo com a reivindicação 26,CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreendedispositivos para carga mecânica das células.