KR20080027275A - 암의 치료를 위한 4-아닐리노-3-퀴놀린카르보니트릴 - Google Patents

암의 치료를 위한 4-아닐리노-3-퀴놀린카르보니트릴 Download PDF

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KR20080027275A
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프랭크 찰스 보스첼리
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와이어쓰
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Abstract

본 발명은 화학식 (I) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 사용하여 암을 예방, 치료 및/또는 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학식 (I) 의 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
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Description

암의 치료를 위한 4-아닐리노-3-퀴놀린카르보니트릴 {4-ANILINO-3-QUINOLINECARBONITRILES FOR THE TREATMENT OF CANCER}
기술분야
본 발명은 암 치료를 위한 화학식 (I) 의 화합물인 4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴 (SKI-606) 및 그를 포함하는 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
배경기술
여러 4-아닐리노-3-퀴놀린카르보니트릴 유도체가 췌장암, 림프암 및 전립선암을 포함하는 여러 암 치료에서 화학치료제로서 유용한 항-종양 활성을 갖는 것으로 나타났다. 미국 특허 제 6,002,008, 6,384,051, 6,432,979 및 6,617,333 호는 항-종양 활성을 지니는 것으로 나타난 특정 4-아닐리노-3-퀴놀린카르보니트릴 유도체를 개시한다.
단백질 타이로신 키나아제는 특이적 타이로신 잔기를 통해 세포 성장, 활성, 분화, 발달 및 형질전환을 조절하는 기능적으로 관련된 수용체 및 비수용체 신호 효소로 이루어진다. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 과 같은 수용체 타이로신 키나아제는 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 트랜스막 도메인 및 세포내 타이로신 키나아제 도메인으로 이루어진다. 비수용체 타이로신 키나아제, 예컨대 Src 및 Abl 은 다중 조절 및 단백질-결합 도메인을 갖는 가용성 세포질성 효소이다.
Src 타이로신 키나아제 패밀리 (family) 는 기능 및 서열 유사성 모두에 의해 정의되는 9 개의 비수용체 타이로신 키나아제의 군이다. 상기 패밀리의 3 개의 일원이 광범위하게 발현된다: Src, Yes, 및 FynB. 기타 6 개의 일원 Lck, Lyn, FynT, Fgr, Hck, 및 Blk 는 주로 조혈 세포에서 발현된다. 비수용체 단백질 타이로신 키나아제의 구조 및 기능 및 인간 암에서의 그의 관련에 대해 광대한 리뷰가 출판되었다.
Src 비수용체 단백질 타이로신 키나아제는 Src 패밀리의 원형이다. Src 는 성장 인자 수용체 및 G-단백질 커플링된 수용체에 의해 매기되는 경로의 중요한 하류 구성요소이며, 이러한 여러 경로로부터 신호를 조정하는 것으로 여겨진다. Src-패밀리 키나아제에 의해 인산화되는 것으로 알려진 세포내 표적 단백질의 목록은 크며 계속 증대하고, 인테그린, 부착 키나아제, 카드헤린, stat3, 코르탁틴, 에즈린, 병소 부착 단백질 (FAK) 등을 포함한다.
Src 는 췌장암, 멜라닌종, 두경부암 및 난소암의 대다수를 포함하는 대부분의 암에서 상향조절된다. Src 는 또한 전립선 종양 세포주에서 활성화된다. Src mRNA 수준은 정상 조직 샘플과 비교하여 인간 귀밑선 종양에서 더욱 높았다. 바렛식도 및 식도 암종 또한 Src 를 과발현한다.
c-Src 타이로신 키나아제가 여러 인간 암에서 악성 세포 반응의 결정자이므로, 겜시타빈에 대한 췌장 선암종 화학민감성 (chemosensitivity) 에 대한, c-Src 발현 억제 효과를 측정하려 하였다.
상기 관찰에 기초하여 Src 를 억제하는 화합물이 상기 및 기타 암을 가진 환자 치료에 유용할 수 있다. 4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴은 상기 기준에 의해 암을 예방, 치료 또는 억제하는데 유용한 것으로 확인되었다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 치료적 유효량의 하기 화학식 (I) 의 화합물인:
Figure 112007092818773-PCT00001
4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 암 예방, 치료 또는 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 치료적 유효량의 화학식 (I) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 겜시타빈 또는 그의 약학적으로 허용되는 염과 조합으로 투여하는 것을 포함하는 췌장암 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 유효량의 화학식 (I) 의 화합물 또는 그의 약학적 으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린 카르보니트릴에 대한 두경부 세포주 HN5 의 반응을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
"암" 이라는 용어는 비정상적 및 비제어된 세포 분할에 의해 초래되는 임의의 악성 성장 또는 종양을 의미한다. 이는 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼진다. 본 출원에 기술된 암 치료 방법의 목적을 위해, 암은 췌장암, 림프암 및 전립선암을 포함한다.
약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 하기와 같은 유기 및 무기산으로부터 유래되는 것이다: 아세트산, 락트산, 카르복실산, 시트르산, 신남산, 타르타르산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 만델산, 말산, 옥살산, 프로피온산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 글리콜산, 피루브산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 살리실산, 벤조산, 및 유사하게 공지된 허용되는 산.
화학식 (I) 의 화합물은 경구, 병소내, 복막내, 근육내 또는 정맥내 주사, 주입, 리포솜-매개 전달, 국소, 코, 항문, 질, 설하, 요관, 경피, 경막내, 안구 또는 귀 전달에 의해 제공될 수 있다. 화학식 (I) 의 화합물을 제공하는데 있어 서 일관성을 수득하기 위해, 화합물이 단위 용량의 형태로 있는 것이 바람직하다. 적합한 단위 용량 형태는 정제, 캡슐 및 작은 봉지의 분말 또는 바이얼의 형태를 포함한다. 상기 단위 용량 형태는 화학식 (I) 의 화합물 0.1 내지 300 mg, 및 바람직하게는 2 내지 100 mg 을 포함할 수 있다. 또한 추가의 바람직한 단위 투여량 형태는 50 내지 150 mg 의 화학식 (I) 을 포함한다. 화학식 (I) 의 화합물은 경구 투여될 수 있다. 이는 1 일 1 내지 6 회, 더욱 일반적으로는 1 일 1 내지 4 회 투여될 수 있다. 상기 유효량은 당업자에게 공지되었을 것이고; 이는 또한 화합물의 형태에 의존할 것이다. 당업자는 일상적으로 실험상의 활성 시험을 수행하여 생물학적검정에서 화합물의 생물활성을 측정하여 이에 따라 투여할 투여량을 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 화학식 (I) 의 화합물인 4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴, 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 담체는 예를 들어 희석제, 에어로졸, 국소 담체, 수용액, 비수성 용액 또는 고체 담체일 수 있다. 담체는 중합체 또는 치약일 수 있다. 본 발명의 담체는 임의의 표준 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수, 아세테이트 완충 염수, 물, 에멀젼 예컨대 유/수 에멀젼 또는 트리글리세리드 에멀젼, 여러 유형의 습윤제, 정제, 코팅 정제 및 캡슐을 포함한다. 화학식 (I) 의 화합물을 포함하는 조성물은 통상적인 부형제, 예컨대 충전재, 붕괘제, 결합제, 윤활제, 향미제 또는 색첨가제로 제형될 수 있다.
경구 또는 국소 제공되는 경우, 상기 화합물은 상이한 담체 중 전달에 의해 대상에 제공될 것이다. 전형적으로, 상기 담체는 부형제 예컨대 전분, 우유, 당, 특정 유형의 점토, 젤라틴, 스테아르산, 탈크, 식물 지방 또는 오일, 검, 또는 글리콜을 포함한다. 특정 담체는 바람직한 전달 방법 (예를 들어, 포스페이트 완충 염 (PBS) 은 정맥내 또는 전신 전달을 위해 사용될 수 있으며, 식물 지방, 크림, 고약, 연고 또는 젤은 국소 전달을 위해 사용될 수 있다) 에 기초하여 선택할 필요가 있다.
화학식 (I) 의 화합물은 신생물의 치료 또는 예방에 유용한 적합한 희석제, 보존제, 가용화제, 에멀젼화제, 애주번트 및/또는 담체와 함께 전달될 수 있다. 상기 조성물은 액체 또는 동결건조되거나, 달리는 건조된 제형이며, 다양한 완충액 내용물 (예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제, 표면으로의 흡수를 방지하기 위한 첨가제 예컨대 알부민 또는 젤라틴, 세제 (예를 들어, 트윈 20, 트윈 80, PLURONIC F68, 담즙산 염), 가용화제 (예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제 (예를 들어 아스코르브산, 소듐 메타비술페이트), 보존제 (예를 들어, 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 팽화 (bulking) 물질 또는 삼투성 개질제 (예를 들어, 락토스, 만니톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 공유 결합, 금속 이온과의 착화, 또는 수화겔 또는 리포솜의 미립자 제제 내 또는 상으로의 화합물의 혼입, 마이크로에멀젼, 마이셀, 단층상 또는 다중층상 소낭, 적혈구허깨비, 또는 스페로블라스트 (spheroblast) 를 포함한다. 상기 조성물은 화합물 또는 조성물의 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출의 속도 및 생체내 제거의 속도에 영향을 미칠 것이다. 조성물의 선택은 신생물을 예방 또는 치료할 수 있는 화합물의 물리적 및 화학적 특성에 의존할 것이다.
화학식 (I) 의 화합물은 시간에 걸쳐 화합물의 서방출을 허용하는 캡슐을 통해 국부적으로 전달될 수 있다. 제어 또는 서방출 조성물은 친지성 저장소 (예를 들어, 지방산, 왁스, 오일) 중의 제형을 포함한다.
본 발명은 추가로 암 예방, 치료 및/또는 억제를 위한 활성 치료 성분으로서 화학식 (I) 의 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 본원에서 수득되고 제시된 결과에 기초하여, SKI-606 은 악성 세포 증식 억제에 의해 암을 예방, 치료 또는 억제하는데 유용하다. SKI-606 은 세포 증식과 관련된 세포내 단백질의 Src 촉매화 인산화를 억제한다. 따라서, 치료적 유효량의 SKI-606 을 인간에 투약함은 증식 억제에 의해 암의 제형을 예방 또는 억제할 수 있거나, 종양의 추가적인 성장 방지 또는 억제 및/또는 종양의 크기 감소 또는 박멸을 초래하여 이미 암을 앓고 있는 인간을 치료할 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, "억제" 라는 용어는 Src 에 의해 촉매화되는 인산화를 아마 차단 또는 억제하여 악성 세포 증식을 지연, 억제 또는 중단함을 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서, "예방" 이란 용어는 예방적 치료에 의해 악성 또는 종양성 성장의 발달을 피하거나 앞섬, 또는 질병의 추가적인 진행을 지연, 억제 또는 중단함을 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서, "치료" 라는 용어는 암의 발달을 예방적으로 방지하거나, 암, 또는 악성 또는 종양성 성장의 진행을 억제 또는 중단하거나, 암, 또는 악성 또는 종양성 성장의 진행을 역행시키거나, 암, 또는 악성 또는 종양성 성장을 제거하기 위해 SKI-660 의 치료적 유효량을, 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 의미한다.
본 발명은 인간에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이는 감염된 개인에게 유효량의 4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴, 그의 약학적으로 허용되는 염, 또는 그를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 환자에게 제공된 용량은 투여되는 것, 투여의 목적, 투여 방식 등에 따라 변화할 것이다. "치료적 유효량" 은 암의 증상을 개선하거나 치료하기에 충분한 양이다.
화학식 (I) 의 화합물은 단독으로, 또는 암 치료에 사용되는 다른 화합물과 조합으로 전달될 수 있다. 상기 화합물은 이마티니브 메실레이트 (GLEEVEC), 히드로우레아, IFN-α, 세포독성제, 화학치료제, NSAIDS, 겜시타빈, EGFR 억제제, MEK 억제제, 파르네실트랜스퍼라제, 겜시타빈, 아바스틴 또는 워트만닌, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예는 치료적 유효량의 화학식 (I) 의 화합물을 치료적 유효량의 겜시타빈 또는 아바스틴과 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 화학식 (I) 의 화합물을 겜시타빈과 조합으로 투여된다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예는 치료적 유효량의 화학식 (I) 의 화합물을 치료적 유효량의 겜시타빈 및 아바스틴과 조합으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예는 췌장암을 치료하기 위해, 화학식 (I) 의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 겜시타빈 및 아바스틴 또 는 그의 약학적으로 허용되는 염과 조합으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물에서의 사용 및/또는 방법을 실행하기 위해 바람직한 화합물은 4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴 및 그의 약학적으로 허용되는 염이다.
화학식 (I) 의 화합물은 미국 특허 제 6,002,008 호의 방법에 따라 제조되고, 이러한 방법은 본원에 참조로서 포함된다.
반응은 사용된 시약 및 물질에 적당하고 달성되는 형질전환에 적합한 용매 중 수행된다. 유기 합성의 당업자는 분자 상에 존재하는 여러 관능기가 제안되는 화학적 형질전환과 일치해야함을 이해한다. 명시되지 않은 경우, 합성 단계 순서, 보호기의 선택 및 탈보호 조건은 당업자가 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 또한, 일부 경우, 출발 물질에 대한 치환체는 특정 반응 조건과 맞지 않을 수 있다. 주어진 치환체에 관련된 제한은 당업자에게 명백할 것이다. 적절한 경우, 반응은 불활성 대기 하에서 수행하였다.
화학식 (I) 의 화합물은 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르와 같은 용매 중의 또는 순수한 소듐 요오다이드의 존재 하에서 N-메틸피페라진으로의 7-(3-클로로프로폭시)-4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-3-퀴놀린카르보니트릴의 처리에 의해 쉽게 수득된다. 상기 화합물의 제조는 본원에 참조로서 포함된 문헌 [Boschelli, D. H., et. al., J. Med. Chem., 44, 3965 (2001)] 에 보고되었다.
도면의 상세한 설명
도 1. 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴에 대한 두경부 종양 세포주 HN5 의 반응. 혈청-기아 HN5 세포를 화합물로 4 시간 동안 처리 후, 10 분 동안 EGF 를 50 ng/ml 으로 첨가하였다. 용해물을 Stat3 Y705, c-Cbl Y731 및 Y774 및 카베올린 Y14 인산화에 대해 분석하였다. 상기 결과는 카베올린 Y14, c-Cbl Y731, 및 Stat3 의 Y705 의 인산화가 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴에 의해 감소되었음을 나타낸다.
효소 검정
화학식 (I) 의 화합물은 표적 펩티드의 Src 촉매화 인산화를 억제한다. 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴은 균질의 효소 검정 (FRET/Lance 형식) 에서 3.5 nM 의 IC50 로 Src 촉매화 인산화를 억제한다. 여러 효소에 대한 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴 활성의 비교는 표 1 에 제공된다.
Src 및 Abl 키나아제 Lance 검정: 재조합 인간 Src 효소를 PanVera (P3044) 로부터 수득하였다. Cdk1 의 잔기 6-20 에 상응하는 바이오티닐화 펩티드는 src 효소 검정에서 기질로 사용되었다 (바이오틴-KVEKIGEGTYGVVYK-COOH). 야생형 c-Abl 및 v-Abl 은 Panvera (P3049) 및 Calbiochem (#102555) 으로부터 각각 구입하였다. Abl 검정을 위한 바이오티닐화 펩티드는 Synpep 으로부터 수득하였다 (바이오틴-NH-KEEEAIYAAPFAKKK-COOH). Src 및 Abl 키나아제 검정 모두에서, 유로퓸/APC 검출 형식 (LANCE, Perkin Elmer) 을 사용하여 균질 형광 공명 에너지 이동 키나아제 검정을 수행하였다. Src 효소 (10 ng) 또는 Abl 효소 (2.5 ng c-Abl, 2.5 ng v-Abl) 를 바이오티닐화 펩티드 (기질 펩티드 둘 다에 대해 2 μL 최종 농도), 50 mM Hepes (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 20 μg/ml BSA, 및 0.001% Brij-35 (Sigma) 와 혼합하였다. 화합물을 1% 의 최종 DMSO 농도로 첨가하였고, Abl 검정을 위해 27℃ 에서, 및 Src 검정을 위해 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 키나아제 반응은 100 μM 의 최종 농도로 ATP 의 첨가에 의해 개시하였고, Src 에 대해 37℃ 에서 70 분, Abl 에 대해 27℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 반응은 EDTA 로 30 mM EDTA/25 mM Hepes (pH 7.5)/10 μg/ml BSA 의 최종 농도에서 중지시켰다. 혼합물은 50 mM Hepes (pH 7.5)/ 20 μg/ml BSA 중 Eu-표지된 포스포타이로신 항체 PT66 (Perkin Elmer, AD0068) 및 스트렙트아비딘 Surelight-APC (Perkin Elmer, CR130-100) 와 혼합하고, 제조사의 설명에 따라 30 분 동안 인큐베이션하였다. 반응은 340 nm 에서의 여기 및 665 nm 에서의 방출로 Wallac Victor 상에서 모니터하였다. 데이터는 Excel (Microsoft) 에 대한 LSW 데이터 분석 플러그-인으로 분석하였다.
PKA, PKC, S6 키나아제, CAMKII 및 p38 키나아제 검정.
신티플레이트 (Scintiplate) 검정을 PKA (Upstate #14-114), PKC (Upstate #14-232) 및 S6K (Upstate #14-333) 로의 키나아제 검정에 사용하였다. ELISA 형식을 CAMK-II (Upstate # 14-217) 및 p38 (사내 제조 및 정제한 재조합 단백질) 에 대해 사용하였다.
신티플레이트 검정
96 웰 SA Cov 신티플레이트 (#1450-551) 플레이트를 키나아제 검정 전에 PBS (0.1% Triton XlOO) 에 4 회 세척하였다.
- 60 μl 혼합물* (하기 표 참조)
- 20 μl 화합물 (10% DMSO 중)
20 분 사전인큐베이션
-20 μl 기질 1 μM (하기 표 참조)
하기 표에 나타난 부피는 96 웰 플레이트에 대한 것이다.
키나아제 PKA PKC S6K
# 웰 96.0 96.0 96.0
# 반응 110.0 110.0 110.0
총 부피 6600.0 6600.0 6600.0
H2O 5452.5 5321.0 5343
10 X 완충액 1100.0 1100.0 1100.0
DTT 1 M 30.0 30.0 30.8
ATP 1 mM 11.0 11.0 11.0
ATP 33P 6.0 6.0 6.0
키나아제 0.55 22 110
μl/반응 0.005 0.2 1
액체 활성제 110
기질 (1 μM) 1463 1463 1464
반응 시간 20' 30' 80'
펩티드 1323 (LSP16Bio: Bio-RTPKLARQASIELPSM: LSP-I aa 243-258. Ser 252 는 인산화 부위이다)
펩티드 1463 (PKA 기질: Bio-GRTGRRNSI)
펩티드 1464 (S6K 기질: Bio-RRRLSSLRA)
기질이 첨가될 때 반응이 시작된다.
1 - 표에 나타난 시간에 따라 0.5 M EDTA 20 μl 로 반응 중지. 플레이트를 반응 개시 후 1 시간, 또는 S6K 의 경우 80 분까지 인큐베이션함.
2 - 세척 (PBS + 0.1% Triton XlOO) 6 회의 세척 (250 λ/웰)
3 - 계수 (Wallac Trilux 계수기)
II ELISA
하기는 ELISA 에서 사용된 키나아제에 대한 검정 조건이다. p38 은 MKK6 의 우성 활성 돌연변이로 활성화시켰다.
부피 (마이크로리터) p38 CAMKII
# 웰 96.0 96
# 반응 110.0 110.0
총 부피 6600.0 6600.0
H2O 5357.3 5464.5
10x 완충액 1100.0 1100.0
DTT 1M 30.0 30.0
100 mM ATP 2.8 3.3
키나아제 (부피 또는 최종 농도) 60 nM 2
μl/반응 0.02
칼모둘린 (1mg/ml) 44
CaCl2 (1M) 11
1738 1323
반응 시간 30' 30'
펩티드 1738 (MK2 T334: Bio-QSTKVPQTPLHTSRVL)
펩티드 1895 (가스트린 1-17: Bio-KKEGPWLEEEEEAYGWMD)
키나아제 검정을 신티플레이트 검정과 동일한 방식으로 수행하였다: 상기 단 계 1 내지 3 참조. 검출 플레이트는 100 μl/웰로 2 시간 동안 PBS 중 Amersham 염소 항-GST 항체 1:400 으로 사전코팅된 Nunc MaxiSorb 이다. 반응 플레이트는 200 μl/웰로 2 시간 동안 0.1% 젤라틴의 블로킹 완충액으로 사전블로킹된 Costar 폴리스테렌 플레이트이다.
ERK/ADB 혼합물을 하기와 같이 제조한다:
ml 의 ADB 당 10 μl GST-ERK2
60 μl 의 ERK/ADB 혼합물을 음성 대조군 웰 (줄 12) 에 넣음
활성 MEK1 을 첨가하여 MEK/ERK/ADB 혼합물 (MEA) 을 제조함
MEA 60 μl/웰을 검정 플레이트에 넣음
20 μl cmpd 10% DMSO 를 첨가함
500 μM ATP 를 ADB 에 첨가하여 5x ATP/ADB 를 제조함.
반응을 시작하기 위해 각 웰에 20 μl ATP/ADB. 30℃ 에서 1 시간 인큐베이션함.
각 웰에 20 μl 0.5M EDTA 를 첨가하여 반응을 중지함.
4 - 포스포 펩티드 검출:
항체: 인산화 펩티드의 검출을 위해, 친화도 정제된 다중클론 포스포-특이적 항체 60521 및 64273 를 각각 1323 및 1738 에 대해 사용한다.
- 인산화 1323 및 1738 의 검출을 위해, 각각, 정제된 60521 (0.46 mg/ml) 1:20000 및 항-토끼-Eu (PE #AD0105) 1:4000 또는 정제된 64273 1:4000 및 항-토끼-Eu 1:2000 와 1% BSA 로 보충된 블로킹 완충액 100 μl 을 첨가함.
- 인산화 1895 의 검출을 위해, 항-포스포 타이로신 PT100 (Cell Signaling #9411) 1:1000 및 항-마우스-Eu (PE # AD0124) 와 함께 1% BSA 로 보충된 블로킹 완충액 100 μl 을 첨가함.
RT 로 1 시간 인큐베이션 함 (진탕기)
6 x 250 μl PBS 0.1% 트윈 20 으로 세척함
100 μl 향상 용액 (Enhancement Solution; Wallac Cat# 1244-105) 을 첨가함
RT 로 10 분간 인큐베이션 함 (진탕기)
Victor II (본사의 판독기 상의 HTS 유로퓸 프로토콜) 로 판독함
완충액
키나아제 완충액 10X:
200 mM Hepes pH 7.5, 100 mM MgCl2
ADB 1X:
20 mM MOPS 7.2, 25 mM β-글리세로포스페이트, 5 mM EGTA, 1 mM Na 오르소바나데이트, 20 mM MgCl2, 1 mM DTT
블로킹 완충액:
10 mM MOPS 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20, 0.1% 젤라틴, 0.02% NaN3
Raf/MEK 키나아제 ELISA
시약: 전장 6his-태깅된 재조합 인간 c-Raf 를 포함하는 Sf9 곤충 세포. (고유 활성: ~200U/ml). 인간 비활성 Mek-1-GST 및 인간 GST-MAP 키나아제 (E.coli 에서 제조된 재조합 단백질).
Raf1 키나아제 케스케이드 검정 방법:
Raf-1 (c-Raf) 를 사용하여 비활성 GST-MEK1 을 인산화 및 활성화시키고, 이후 이는 비활성 p42 GST-MAPK 를 인산화 및 활성화시킬 수 있고, 이는 이후 Sigma (cat. # 77439219041) 로부터의 포스포-특정 항체에 의해 TEY 서열 (aa's 202-204) 의 인산화를 측정한다.
키나아제 검정 프로토콜
스탁 용액:
Raf 검정
1. 검정 희석 완충액 (ADB): 2OmM MOPS, pH 7.2, 25mM β-글리세롤 포스페이트, 5mM EGTA, 1mM 소듐 오르소바나데이트, 1mM 디티오트레이톨.
2. 마그네슘/ATP 칵테일: 500 μM 냉각 ATP 및 ADB 중 75 mM 마그네슘 클로리드.
3. 활성 키나아제: 인간 활성 c-Raf: 검정 지점 당 0.4U 사용함.
4. 비활성 GST-MEK1: 검정 지점 당 0.1 μg 사용함.
5. 비활성 GST-p42 MAP 키나아제: 검정 지점 당 1.0 μg 사용함.
ELISA
1. TBST - 트리스 (50 mM, pH 7.5), NaCl (150 mM), 트윈-20 (0.05 %)
2. 수퍼블록 (Pierce)
3. 항-GST Ab (Pharmacia)
4. 항-포스포 MAPK (Sigma)
5. 항-마우스 Ab / 유로퓸 공액체 (Wallac)
검정 방법:
제 1 단계: GST-MEK 및 GST-MAPK 의 c-Raf 의존성 활성
1. 검정 당 (즉, 96 웰 플레이트의 웰 당) ADB 20 ml 첨가함.
2. 10 ml 의 0.5 mM 냉각 ATP 및 ADB 중 75 mM 마그네슘 클로리드를 첨가함.
3. 1.6ml 비활성 MEKl (0.4 mg/검정) 와 함께 2 ml 의 c-Raf (0.4U/검정) 를 첨가함.
4. 4 ml 의 비활성 GST-p42 MAP 키나아제를 첨가함 (1.0 mg/검정).
5. 진탕 인큐베이터 중 30℃ 에서 60 분간 인큐베이션함.
6. 상기 혼합물을 항-GST Ab 코팅된 96 웰 플레이트 (α-GST 로 o/n 코팅 후, Pierce Superblock 으로 블로킹된 Nunc Immunosorb 플레이트) 로 이동함.
7. 진탕 인큐베이터 중 30℃ 에서 60 분간 인큐베이션함.
8. TBST 로 3X 세척, 항-포스포 MAPK (Sigma) (1:3000) 를 첨가함.
9. 진탕 인큐베이터 중 30℃ 에서 60 분간 인큐베이션함.
10. TBST 로 3X 세척, 항-마우스 Ab / 유로퓸 공액체 (Wallac) (1:500) 를 첨가함.
11. 진탕 인큐베이터 중 30℃ 에서 60 분간 인큐베이션함.
12. TBST 로 3X 세척, Wallac Victor 모델 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독함.
KDR 키나아제 검정.
재료:
1) Nunc MaxiSorb 96F ELISA VWR 62409-024
2) 펩티드 기질: 폴리(Glu4-Tyr), Sigma (P-0275): 물 중 5 mg/ml 스톡을 제조함.
3) TBS: BupH TBS Pierce (#28376); 25 mM Tris pH 7.2, 150 mM NaCl 최종
4) TBST: 세척 완충액 = TBS + 0.05% 트윈-20: 500 ml 에 대해: TBS (상기) + 2.5 ml 의 10% 트윈 (TBS 중 제조됨).
5) 화합물: DMSO 중 제조됨. 화합물을 -80℃ 에서 보관함.
6) 5X KDR 키나아제 완충액:
5X 1X 50 ml 의 5X
20 mM HEPES pH 7.4 4 mM HEPES 1 ml 의 1 M HEPES
5 mM MnCl2 1 mM MnCl2 1.25 ml 의 200 mM MnCl2
100 μM Na3VO4 20 μM Na3VO4 0.1 ml 의 50 mM Na3 VO4
7) 효소 희석제: 4 mM HEPES 중 0.1% BSA, pH 7.4
8) 2.5X ATP [10 μM 최종]/ HEPES 중 MgCl2 용액:
2.5X 농도 rxn 중 1X 10 ml 의 2.5 X
25 μM ATP 1O μM ATP 0.25 ml 의 1 mM ATP
25 mM MgCl2 10 mM MgCl2 1 ml 의 250 mM MgCl2
10 mM HEPES 4 mM HEPES 0.1 ml 의 1 M HEPES
8.65 물
9) HEPES 중 2.5X / MgCl2 용액 (ATP 없음):
2.5X 농도 rxn 중 1X 5 ml 의 2.5 X
25 mM MgCl2 10 mM MgCl2 0.5 ml 의 250 mM MgCl2
10 mM HEPES 4 mM HEPES 0.05 ml 의 1 M HEPES
4.45 ml 물
10) ATP (FW 551): AmershamPharmacia #27-2056-01 (25 μmol): 100 mM 스탁
11); 250 mM MgCl2: Sigma M-8266, 무수, FW 95.21; 1.19 g/ 50 ml 물
12) 검정 완충액: PerkinElmer 1244-106
13) Eu-항-PY (PT66): PerkinElmer AD0040 (50 μg, Sigma clone PT66, 항- 포스포타이로신 항체).
14) 향상 용액: PerkinElmer 1244-105
방법:
1. Nunc MaxiSorb 플레이트에 TBS 중 25 μg/ml 로 100 μl 폴리(Glu4-Tyr) 펩티드를 첨가한다. RT 에서 1-4 hr 인큐베이션한다. [대안: 최종 폴리(Glu4-Tyr) 펩티드 농도를 ~1 - 50 μg/ml 에서 변화시킴; 또는 폴리(Glu6-Ala3-Tyr) 펩티드를 사용함]
2. 펩티드-포함 웰을 200 μl 의 TBS 로 3 회 세척한다.
3. 각 웰에 하기를 첨가한다: 29 μl 의 KDR 키나아제 마스터 믹스 [= KDR-IC + 5X KDR 키나아제 완충액 + 물 (1:1:0.9 혼합)]. 10 μl 의 정제된 KDR-IC 제조물 (0.1% BSA / 4 mM HEPES 중 희석됨 (즉, 제조물에 따라 1:5 내지 1:20)) + 10 μl 의 5X KDR 키나아제 완충액 + 반응 웰 당 9 μl 의 물을 혼합한다. 보다 많거나 적은 화합물 부피를 사용하면 물 부피를 적절히 조절한다. 상기 첨가는 매트릭스 멀티-피펫터로 달성될 수 있다.
4. 각 웰 (TV = 이 지점에서 30 μl) 에 1 μl 의 화합물 (목적되는 최종 화 합물 농도에 따라 DMSO 중 50X 스탁) 을 첨가한다.
5. 효소로의 화합물의 결합을 허용하기 위해 RT 에서 ~15 분간 인큐베이션한다.
4. 20 μl 의 2.5X ATP/MgCl2/HEPES 용액을 샘플 웰에 첨가한다. KDR 에 대해, 반응의 선형 범위는 ~1 - 100 nM 이므로 10 μM 이 전형적으로 사용된다. [대안: 최종 농도를 변화시킬 수 있다; 일부 반응에 대해 ATP 가 없는 2.5X MgCl2/HEPES 의 사용은 임의의 효소 제조를 위한 가능한 하한 범위의 측정을 허용한다].
5. 실온에서 40 분 인큐베이션함. [대안: 30 내지 60 분 검정 반응; 또는 37℃ 반응 온도, 그러나 이들은 현재 배치의 KDR 로 최소의 차이를 만든다].
6. 200 μl 의 TBST 로 플레이트를 3X 세척한다.
7. 검정 완충액 중 75 μl 의 Eu-PY 를 1:2000 로 첨가한다.
8. RT 에서 46 - 60 분간 인큐베이션한다.
9. 200 μl 의 TBST 로 플레이트를 3X 세척한다.
10. 100 μl 의 향상 용액 (RT 에서 평형화함) 을 첨가한다.
11. 플레이트를 VICTOR TR-형광 플레이트 판독기 상에서 판독한다.
원래의 유로퓸 (형광) 계수를 Excel 템플레이트를 사용하여 % 억제 및/또는 미처리된 (화합물 없음) 대조군 웰에 기초한 IC50 으로 전환하였다.
표 1.
여러 키나아제에 대한 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7- [3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴의 활성
IC50 (μM)
p38 0.95
CAMKII 6.25
PKA 5.03
PKC-a 1.47
P70S6K 6.09
KDR 7.00
raf/mek 0.50
Src 0.003.5
c-Abl 0.001
IC50 = 50% 억제가 있는 농도
세포 증식 데이터
화학식 (I) 의 화합물은 Src 키나아제 패밀리 키나아제 및 Abl 키나아제의 선택적인 억제제이다. 세포-기초 검정을 또한 사용하여 [4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴의 선택도를 조사하였다. Src 의 종양발생 형태를 과발현하는 Rat 섬유모세포 (여기서 융합 v-Src/인간 c-Src 단백질을 생성하기 위해 인간 c-Src 의 촉매 도메인이 v-Src 촉매 도메인 대신 삽입되었다). FynB, Lck, Lyn, 및 Hck, 기타 Src 패밀리 일원으로 유사한 치환을 하였다. 또한, 종양발생 형태의 v-Abl, 인슐린형 성장 인자-I 수용체, 섬유모세포 성장 인자 수용체, 혈소판 성장 인자 수용체 및 Her2 를 발현하는 동일한 세포 유형을 또한 구축하였다. 상기 세포에서의 화합물 활성은 종양발생 단백질을 발현하는 섬유모세포에 의한 비부착의 습득에 기초하여, 비부착 성장 검정을 사용하여 측정하였다. 상기 조건 하에서의 성장은 키나아제 활성에 의존하며, 키나아제 활성의 억제는 세포성 표적 단백질 의 인산화의 언제를 반영하는 방식으로 세포 성장을 차단할 것이다. 표 2 는 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴에 대해 수득된 증식 데이터를 나타낸다.
표 2.
키나아제-의존성 세포-기초 검정
IC50 (μM)
Src 0.1
Lck 0.02
Fyn 0.4
Lyn 0.15
Hck 0.8
v-Abl 0.1
Her2 2
IC50 = 50% 억제가 있는 농도
두경부 종양 세포주
화학식 (I) 의 화합물은 Src 를 과발현하는 두경부 세포주에서의 종양 세포 증식의 강력한 억제제이다. HN5 와의 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-5-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카르보니트릴의 대표적인 증식 프로파일은 하류 표적 단백질의 인산화의 억제에 대한 증거와 함께 도 1 에 나타나 있다.
생물학적 시험 방법의 설명
표준 성장 조건:
표 3 에 기술된 실험에 대해, 1000 개의 세포를 각 세포주에 대한 표준 성장 배지 중 제 0 일에 96 웰 세포 배양 디쉬의 각 웰에 플레이팅하였다. 화합물을 제 1 일에 첨가하였다. 상대 세포수를 제 4 일에 측정하였다.
CellTiter-Glo 방법
CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 검정 (Promega # G7573) 을 사용하였으며, 여기서 세포는 CellTiter Glo 시약으로 용해시키고, 잠시 교반하고, 실온에서 30 분간 방치한 후, 발광 판독이 갖춰진 Wallac 플레이트 판독기 상에서 분석하였다.
MTS 검정.
일부 검정은 CellTiter 96 검정 (Promega # G3580) 에 의해 모니터하였다. 상기 검정에 있어서, 제 4 일에, 검출 시약을 96 웰 플레이트에 첨가하고 490 nM 에서의 흡광도를 측정하였다.
SRB 검정.
술포로다민 B (SRB) 검정을 특정 멜라닌종 세포주에 대해 사용하였다. 상기 검정에서, 성장 배지 중 혈청 농도는 5% 였고 배양 배지 부피는 0.2 ml 이었다. 제 4 일에, 0.05 ml의 50% 트리클로로아세트산을 배지에 첨가하였고, 플레이트를 1 시간 동안 실온에 방치하였다. 배지를 붓고 플레이트를 물로 3 회 세척하였다. 세척된 플레이트를 건조한 후, 0.08 ml 의 SRB 시약 (SRB 는 Sigma 로부터 수득하였다; 1% 아세트산 중 0.4% SRB) 을 첨가하였다. 실온에서 10 분 후, 용액에 유리 적색이 남지않을 때까지 1% 아세트산으로 플레이트를 세척하였다. 결합된 SRB 시약을 0.15 ml 10 mM Tris (산 무첨가) 로 가용화시켰다. 진탕기에서 5 분간 교반 후, 흡광도를 540 nM 에서 판독하였다.
생체내 시험
모든 동물 시험은 승인된 [Institutional Animal Care and Use Committee] 프로토콜 하에서 수행하였다. 종양 세포를 50,000,000 세포/ml 로 현탁시켰으며, 0.2 ml 의 세포 현탁액을 생후 6-7 주 암컷 누드 마우스 (Charles River, Wilmington, MA) 의 옆구리에 피하 주사하였다. 1 주 후 200 mm3 초과의 종양을 가진 마우스에 비히클 또는 화합물을, 0.5% 메틸셀룰로오스 및 0.4% 폴리소르베이트 80 (트윈 80) 을 포함하는 0.2 ml 의 비히클 중 제시된 용량으로 복막내 주사에 의해 투여하였다.
표 3 은 또한 T-세포 백혈병, 전립선, 췌장, 멜라닌종 및 두경부 종양 세포주를 4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴로 처리시 수득되는 증식 검정 결과를 요약한다. 또한, 누드 마우스에서 A375 멜라닌종 피하 종양 이종이식의 성장을 지연시키는 4-(2,4-디클로로-5-메톡시-페닐아미노)-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-프로폭시]-퀴놀린-3-카르보니트릴 투여의 능력이 나타나 있다.
표 3.
IC50 (μM) 방법
T-세포 백혈병 HSB-2 Molt-4 전립선 DU145 LnCap 췌장 MiaPaca BxPC3 Capan 멜라닌종 A375 A375 RPMI-7951 HS-294-T 두경부 HN5 생체내 시험 A375 멜라닌종 9일 0.014 8.2 1.6 3.5 1.3 3.9 5.9 1.2 0.9 1.2 0.6 0.3 용량 30 mg/kg MTS MTS 세포-glo 세포-glo 세포-glo 세포-glo 세포-glo 세포-glo SRB SRB SRB 세포-glo T/C 39%, 제 12 일 J 4 Bid ip

Claims (13)

  1. 치료적 유효량의 하기 화학식 (I) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는 암 예방, 치료 또는 억제 방법:
    Figure 112007092818773-PCT00002
    .
  2. 제 1 항에 있어서, 예방, 치료 또는 억제되는 암이 췌장암인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 예방, 치료 또는 억제되는 암이 림프암인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 예방, 치료 또는 억제되는 암이 전립선암인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 예방, 치료 또는 억제되는 암이 두경부암인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 예방, 치료 또는 억제되는 암이 멜라닌종인 방법.
  7. 치료적 유효량의 하기 화학식 (I) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물:
    Figure 112007092818773-PCT00003
    .
  8. 제 1 항에 있어서, 화합물을 단독으로, 또는 암 치료에 사용되는 하나 이상의 기타 화합물과 조합으로 전달하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 기타 화합물이 이마티니브 메실레이트, 히드록시우레아, IFN-α, 세포독성제, 겐피타니브, 겜시타빈, 아바스틴 및 워트만닌, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 기타 화합물이 겜시타빈인 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 기타 화합물이 겜시타빈 및 아바스틴인 방법.
  12. 치료적 유효량의 하기 화학식 (I) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 겜시타빈 또는 그의 약학적으로 허용되는 염과 조합으로 투여하는 것을 포함하는 췌장암 치료 방법:
    Figure 112007092818773-PCT00004
    .
  13. 제 12 항에 있어서, 아바스틴 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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