KR20080022086A

KR20080022086A - 변형된 활성화 특성을 갖는 응고 인자 ｘ 폴리펩타이드

Info

Publication number: KR20080022086A
Application number: KR1020077028129A
Authority: KR
Inventors: 슈테판 슐테; 한스-페터 하우저; 우베 칼리나; 토마스 바이머
Original assignee: 체에스엘 베링 게엠베하
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2008-03-10
Also published as: US20090053185A1; EP1891091B1; EP1891091A2; KR101273229B1; AU2006254311B2; CA2609226C; CA2609226A1; ES2445394T3; WO2006128668A3; DK1891091T3; EP1728798A1; JP5049271B2; AU2006254311A1; WO2006128668A2; US9249404B2; JP2008541742A

Abstract

본 발명은 개선된 안정성과 변형된 활성화 서열을 갖는 사람 인자 X 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 cDNA 서열, 이러한 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비변형된 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖지만 개선된 안정성을 갖는 재조합 인자 X 폴리펩타이드 및 유도체, 및 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 DNA를 포함하는, 사람의 유전차 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다.

변형된 생물학적 활성 인자 X 변이체, 활성화 펩타이드, 프로테아제 절단 부위, 혈액 응고 질환, 혈우병

Description

변형된 활성화 특성을 갖는 응고 인자 Ｘ 폴리펩타이드{Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties}

본 발명은 활성화를 위한 인자 VIIIa/FIXa 또는 인자 VIIa/TF의 필요성을 우회할 수 있는 인자 X 폴리펩타이드, 특히 사람 인자 X 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 cDNA 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 변형되지 않은 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖지만 변경된 활성화 특성을 갖는 재조합 폴리펩타이드 및 유도체, 및 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람의 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다.

비타민 K 의존적 단백질은 특정 유형의 혈우병을 치료하는데 사용된다. 전형적 혈우병 또는 A형 혈우병은 유전성 출혈 질환이다. 이는 혈액 응고 인자 VIII의 염색체 X-연관된 결함으로 인한 것이며, 10,000명당 한 명 내지 두 명의 발생률로 거의 전적으로 남성에게서 일어난다. X-염색체 결함은 그 자신은 혈우병 환자 가 아닌 여성 보인자에 의해 유전된다. A형 혈우병의 임상소견은 출혈 경향의 증가이다. 인자 VIII 농축물을 사용한 치료가 도입되기 전에, 중증 혈우병에 걸린 사람의 평균 수명은 20년 미만이었다. 혈장 유래의 인자 VIII의 농축물 및 이후의 인자 VIII의 재조합 형태의 농축물의 사용은 혈우병 환자의 평균 수명을 길게 연장시키고 이들 대부분에게 다소간의 정상 생활을 영위할 가능성을 주어, 혈우병 환자의 상황을 크게 개선시켰다. A형 혈우병보다 5배 덜 만연한 혈우병 B는 비기능성 인자 IX 또는 인자 IX의 결여로 인해 유발되며 혈장 유래의 인자 IX 농축물 또는 인자 IX의 재조합 형태로 치료된다. A형 혈우병 및 B형 혈우병 둘다에서, 질환 치료에서의 가장 심각한 의학적 문제는 대체 인자에 대한 알로항체의 발생이다. 모든 A형 혈우병 환자의 최대 30%에서 인자 VIII에 대한 항체가 발생한다. FIX에 대한 항체는 보다 덜한 정도로 발생하지만, 이들 항체가 면역 관용성 유도 치료법에 대해 덜 감수성이기 때문에 보다 심각한 결과를 초래한다.

응고 상태의 현재 모델은 응고의 생리학적 유발인자가, 정상적으로는 맥관계 외부에 위치해 있고 손상이 일어나야지만 접근할 수 있는 조직 인자(TF) 발현 세포의 표면상의 TF와 인자 VIIa(FVIIa) 간의 복합체 형성이라고 기술한다. 인자 VIIa/TF의 복합체는 인자 IX 및 인자 X를 활성화시켜 최종적으로 일부 트롬빈을 생성시킨다. 양성 피드백 루프에서, 트롬빈은 인자 VIII 및 인자 IX를 활성화시키고, 이들은 이어서 혈액 응고 연쇄증폭반응(blood coagulation cascade)의 소위 "내인성" 팔(arm)인 인자 X를 활성시킴으로써 완전한 트롬빈 방출의 발생을 위해 필수적인 인자 Xa의 생성을 증폭시켜 완전한 지혈을 달성한다. 생리학적 농도를 초 과하는 농도의 FVIIa를 투여함으로써 인자 VIIIa 및 인자 IXa의 필요가 우회되는 것으로 나타났다. 인자 VII에 대한 cDNA의 클로닝[참조: 미국 특허 제4,784,950]은 혈장 유래의 응고 인자의 재조합 대체물을 개발할 수 있게 하였다. 이러한 인자 VIIa는 1988년에 FVIII에 대한 고 역가의 억제성 항체를 갖는 환자에게 최초로 성공적으로 투여되었다. 그 이후로 줄곧, 인자 VIIa가 다목적 지혈제일 수 있다는 가능성을 보여주는 인자 VIIa의 증거의 수가 꾸준하게 늘어났다[참조: Erhardtsen, 2002]. 불행하게도, 인자 VIIa는 2시간을 조금 넘는 혈장 반감기를 가지며 따라서 빈번하게 재투여해야만 해서 이러한 치료법은 침습적이고 비용이 매우 많이 들게 된다.

따라서, 특히 지혈성 우회 제제(haemostatic bypassing agent)인 개선된 응고 인자가 계속 요구되어 왔다. 지혈성 우회 제제는 특정 응고 인자가 결여되었거나 비기능적이거나 억제성 항체에 의해 차단된 환자에게 투여되는 경우에 응고를 일으킬 수 있는 물질이다. 응고 연쇄증폭반응에서의 차단을 우회하는 이러한 화합물의 활성(지혈성 우회 활성)은 당업계에 공지된 응고 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 필수적으로, 지혈성 우회 제제는, 결여되었거나 비기능적이거나 차단된 응고 인자의 기질 또는 이러한 결여되었거나 비기능적이거나 차단된 응고 인자의 "하류"에 있는 응고 연쇄증폭반응의 기타 기질을 직접적으로 활성화시키는 능력을 갖고, 이에 따라서 이러한 결여되었거나 비기능적이거나 차단된 응고 인자가 효과적 트롬빈 생성을 위해 더이상 필요하지 않게 한다.

인자 X도 집중적 조사 대상이였다.

인자 X에 대한 cDNA는 특성 규명되었다[참조: Leytus et al. 1984, PNAS, 82: 3699- 3702]. 응고 인자 X는 지모겐으로서 간 세포로부터 혈장으로 분비되는 분자량 58.5 kDa의 비타민-K 의존적 당단백질이다. 초기에 인자 X는 총 488개의 아미노산으로 이루어진 시그날 펩타이드를 갖는 프리프로펩타이드로서 생산된다. 세포질세망으로 수송되는 동안에 시그날 펩티다제에 의해 시그날 펩타이드가 절단되고, 감마 카복실화가 성숙한 N-말단 쇄의 N-말단에 있는 처음 11개 글루탐산 잔기에서 일어난 후에 프로펩타이드 서열이 절단된다. Arg182와 Ser183 사이의 절단에 의해 추가 프로세싱 단계가 일어난다. 이러한 프로세싱 단계는 또한 부수적으로 트리펩타이드 Arg180-Lys181-Arg182의 결실을 야기한다. 생성된 분비성 인자 X 지모겐은 Cys172와 Cys342 사이의 이황화 브릿지를 통해 공유 결합된, 139개 아미노산의 N-말단 경쇄(M_r 16,200)와 306개 아미노산의 C-말단 중쇄(M_r 42,000)로 이루어져 있다. 추가의 해독후 프로세싱 단계는 Asp103의 β-하이드록실화와 N-형 및 O-형 글리코실화를 포함한다.

인자 VIIIa/인자 IXa 또는 인자 VIIa/TF는 둘다, Arg234에 대한 카복시-말단을 절단하여 Ser183부터 Arg234까지의 52개 아미노산의 이른바 활성화 펩타이드를 방출시킴으로써 활성화된 혈소판상의 인자 X를 활성화시킬 수 있는 생리학적 조건하에 있다.

자가촉매 절단에서, 활성화된 인자 X(인자 Xa)는 Arg464에 대한 카복시 말단에서 이의 중쇄의 C-말단의 작은 단편을 절단하여 인자 Xaβ를 유도한다. 그러나, 인자 Xa의 두 형태 모두가 유사한 촉매 활성을 갖기 때문에 이러한 절단의 생리학 적 관련성은 명확하지 않다.

다음과 같이 인자 X를 변형시키고자 하는 몇가지 시도가 있었다:

울프(Wolf) 등(1991)(JBC. 266. no. 21. PP. 13726-13730)은 인자 X의 활성화 펩타이드를 인자 X의 활성화 펩타이드 영역 내로 2개의 신규 푸린(furin) 절단 컨센서스 부위의 도입을 유도하는 디펩타이드 Arg-Lys로 치환시킴으로써, 인자 X의 활성화 펩타이드를 결실시켰다. 이러한 인자 X 변이체는 세포내 프로세싱 동안 활성화되어 활성화된 인자 X의 분비를 유도한다.

울프 등(1995)(Blood. 86. pp 4153-4157)은 혈장으로 주사된 후에 천천히 탈아실화되어 시간 경과에 따라서 활성화된 인자 X를 생성시키는 인자 Xa의 아실화 불활성 변이체를 제조하였다.

루돌프(Rudolph) 등(1997)(Prot. Express and Puri.. 10: 373-378)은 프로펩타이드 절단 부위의 영역 내에서 인자 X를 변형시켰고, Thr39의 Arg로의 치환이 세포 배양물 내에서 프로펩타이드 프로세싱의 효율을 상당히 개선시켰음을 확인하였다.

카미레(Camire) 등(2000)(Biochemistry. 39 pp.14322-14329)은 인자 X의 프리프로펩타이드를 트롬빈의 프리프로펩타이드로 치환시켜 세포 배양물 중에서 보다 높은 감마 카복실화 정도를 달성하였다. 그러나, 감마 카복실화 속도가 증가되었지만 인자 X의 10 내지 30%는 여전히 카복실화되지 않았다.

루돌프 등(2002)(Thromb Haemost., 88:756-62)은 활성화 펩타이가 결실된 인자 X 변이체를 제조하였다. 이러한 인자 X 변이체는 보조인자 독립적 방식으로 자 가활성화된 것으로 나타났으며, 본 논문은 활성화 펩타이드의 1차적 기능은 FX의 거짓(spurious) 활성화를 방지하는 것이라고 결론짓고 있다.

티에스(Thiec) 등(2003)(JBC. 12. pp 10393-10399)은 인자 X의 Gla 도메인 및 제1 EGF 도메인을 FIX의 상응하는 도메인으로 치환시켜, 이러한 키메라가 TF/FVIIa 복합체와 생산적으로 상호작용하는 능력을 조사하였다.

WO 98/38317 (우선일: 1997년 2월 27일)은 Gly228와 Ile235 사이의 천연 활성화 절단 부위에 변형을 가져서, 천연적으로는 인자 X를 활성화시키지 않는 프로테아제에 의해 절단되고 활성화될 수 있는 인자 X 유사체를 청구한다.

WO 98/38318 (우선일: 1997년 2월 27일)에는 Arg180부터 Arg234까지의 아미노산이 결실되고 Gly173부터 Arg179까지의 아미노산이 변형되어, 천연적으로는 인자 X를 활성화시키지 않는 프로테아제가 변형된 서열을 절단하여 당해 인자 X 유사체를 활성화시킬 수 있는 인자 X 유사체가 교시되어 있다.

WO 01/10896 (우선일: 1999년 8월 10일)에는 Glu226과 Ile235 사이의 아미노산중 하나 이상이 치환된 인자 X 유사체가 기재되어 있다. 상기 공보의 실시예에는 인자 X 변이체를 FXI에 의해 절단될 수 있도록 만드는 FIX 유래의 활성화 절단 부위의 도입이 제시되어 있다.

WO 03/035861 (우선일: 2001년 10월 19일)은 활성화 펩타이드가 제거되어 피브리노펩타이드 A의 아미노산 P₁₀ 내지 P₁에 의해 치환됨으로써 당해 인자 X 변이체가 트롬빈에 의해 활성화될 수 있게 만드는 키메릭 트롬빈 절단 부위를 생성시키는 인자 X의 변이체를 청구한다.

WO 2004/005347 (우선일: 2002년 7월 3일)에는 야생형 인자 X 내에서 Leu-Thr-Arg-lle-Val-Gly 내지 X-Pro-Arg-Ala-Y-Z인 P₃-P₂-P₁-P_1'-P_2'-P_3'을 변형시켜 트롬빈에 의해 활성화될 수 있는 인자 X의 변이체가 교시되어 있다.

볼켈(Volkel) 등(2005)[참조: Mol. Biotechno!.. 29 (1):19-30]은 전립선 특이적 항원이 FX 변이체를 특이적으로 활성화시키도록 하는 FX 활성화 펩타이드 내로의 신규 프로테아제 절단 부위의 도입이 교시한다.

몇몇 저자들이 활성화된 인자 X (FXa)가 지혈성 우회 제제로서 사용될 수 있다고 제시하였지만[참조: Ni et al., 1992 (Thromb. Haemost. 67:264-271); Himmelspach et al., 2002 (Thromb. Haemost. 88:1003-1011)], 이러한 약제학적 제제가 혈전발생성이고 파종성 혈관내 응고(DIC)를 초래할 수 있다는 몇가지 염려가 여전히 남아있다.

비-활성화된 지모겐 인자 X의 치료학적 용도는 훨씬 안전한 접근법인 것으로 보인다. 미국 특허 제4,501,731호(우선일 1983년 6월 27일)는 지혈성 우회 제제로서의 인자 X의 용도만을 제시한다. WO 03/006054 (우선일: 2001년 7월 10일)에서는, 약제학적 조성물 중의 인자 X가 FVIIa와 함께, FVIIa의 지혈 효능을 상승작용에 의해 증진시킬 수 있다는 것이 제시되었다.

그러나, 내인성 응고 경로를 통한 인자 X의 활성화의 효율은 억제제 환자에서 심각하게 약화되는 반면에 외인성 응고 경로는 (조직 인자의 제한된 이용성으로 인해) 응고의 초기 단계로 제한되는 것으로 보이기 때문에, 응고가 요구되고 제한된 이용성 및/또는 활성의 보조인자의 필요성을 우회하는 상황에서 인자 X의 활성 화를 촉진시키도록 인자 X를 변형시키는 것이 유리하다. 변이체 인자 X 지모겐은, 이것이 생산되어 활성화 없이 투여될 수 있지만 응고 활성(예를 들면, 트롬빈 생성)이 요구되는 경우에는 응고의 내인성 및 외인성 경로의 천연 활성화인자의 필요 없이 활성화가 보다 높은 속도로 일어날 수 있도록 안정해야만 한다.

몇몇 저자들은 천연적으로는 FX를 절단 및 활성화시키지 않는 프로테아제에 의해 활성화될 수 있는 인자 X 변이체를 제조하고자 시도했었다는 것이 기재되어 있다. 이들 인자 X 변이체는 활성화 펩타이드의 결실 및/또는 Arg234의 절단 부위앞에서 일어나는 활성화 펩타이드의 서열의 변형(이는 임의로 Ile235의 변형도 가능케한다)으로 이루어졌다. 인자 X의 활성화 펩타이드의 1차적 효과가 FXa로의 자가활성화를 방지하는 것이라는 것도 제시되었기 때문에[참조: Rudolph et al., 2002 (Thromb Haemost., 88:756-62)], 활성화 펩타이드의 결실 및 변형을 갖는 인자 X 변이체는 조기 활성화에 민감하다. 따라서, 이러한 FX 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 혈전발생성 위험을 내포하고 있다.

본 발명에서 제기된 한가지 과제는 지혈성 우회 제제를 동정하는 것이다. 특히, 고 역가의 인자 VIII 억제제를 갖는 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 지혈성 우회 제제가 요구된다.

본 발명에서, 놀랍게도, 증강된 지혈성 우회 활성을 갖는 생물학적 활성 인자 X 변이체는 추가의 프로테아제 절단 부위를 Ile235에 대한 C-말단에서 인자 X의 중쇄 내로 삽입함으로써 수득될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 추가의 프로테아제 절단 부위는 사람 뿐만 아니라 다른 포유동물 단백질로부터 유래될 수 있 다.

본 발명의 한 측면은 하나의 변형이 프로테아제에 대한 추가의 절단 부위의 삽입으로 이루어지고 상기 추가의 절단 부위가 Ile235에 대한 C-말단에서 인자 X의 중쇄 내로 삽입되는 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체이다. 프로테아에 의해 상기 추가의 절단 부위가 절단됨으로써, 천연 절단 부위의 절단을 통한 잠재적 활성화에 추가하여 인자 X 변이체의 활성화가 일어난다. 본 발명의 인자 X 변이체는 특히, 인자 X 서열의 다른 영역내에 추가의 변형을 가질 수 있다. 따라서, 인자 X의 중쇄 내로의 삽입은 서열번호 2에 나타낸 야생형 서열과 비교하여 당해 아미노산 서열에 대한 몇가지 변형중 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체 내의 천연 인자 X 활성화 펩타이드는 천연적으로는 인자 X를 활성화시키는 프로테아제가 더이상 상기 인자 X 변이체를 절단하고 활성화시킬 수 없도록 변형된다. 이는 인자 X의 활성화 펩타이드 서열내로 돌연변이를 도입시켜 달성할 수 있다. 돌연변이는 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 천연적으로는 인자 X를 활성화시키는 프로테아제가 더이상 상기 인자 X 변이체를 절단하고 활성화시킬 수 없게하여 활성화가 오로지 추가의 절단 부위를 통해서만 일어나도록 하는, 활성화 펩타이드 내의 결실 및/또는 치환이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 상기 변형된 인자 X 변이체 내의 신규 프로테아제 절단 부위는 세린 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 보다 바람직하게는, 세린 프로테아제는 인자 IIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIa, 인자 XIIa, 활 성화된 단백질 C, 엘라스타제 또는 칼리크레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이들 세린 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있다[참조: "Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice", Fourth Edition, Colman et al. 2001 factor Ha: p34-35, p176, factor IXa: p40-41 , factor Xa: p34-35, factor XIa p128-129, factor XIIa: p194, aPC: p34-35, p159, kallikrein: p103-104 or elastase (O'Reilly et al., 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science, 285,1926-1928].

인자 X의 중쇄 내로의 삽입은 절단을 위해 필수적이지 않은 하나 이상의 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 이들 추가 아미노산은 삽입체의 N-말단 및/또는 C-말단에 존재할 수 있다. 따라서, 중쇄내로의 삽입체는 다음 식으로 나타낼 수 있다.

-R¹-P-R²-,

상기 식에서,

P는 절단 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 서열(즉, 절단 부위)를 나타내고,

R¹은 화학적 결합 또는 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산)을 나타내고,

R²는 화학적 결합 또는 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 1 내지 5개의 아미 노산)을 나타낸다.

P의 길이는 3개 아미노산 이상, 바람직하게는 20개 아미노산 이하이다. 바람직하게는, R¹은 화학적 결합이거나 1 내지 3개의 아미노산으로 이루어진다. R²가 화학적 결합이거나 1 또는 2개의 아미노산으로 이루어지는 것이 보다 바람직하다. 새로이 도입된 프로테아제 절단 부위가 절단될 때에 절단되는 화학적 결합에 대한 C-말단의 아미노산이 이소류신인 것이 가장 바람직하다. 상기 이소류신 대신에 발린인 것도 바람직하다. 상기 이소류신 대신에 다른 바람직한 C-말단 아미노산은 알라닌, 세린 또는 트레오닌이다.

중쇄 내로 삽입될 수 있는 적합한 아미노산 서열은 하기 표 1에 기재한 바와 같은 세린 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

삽입된 아미노산 서열(-R¹-P-R²-)은 3개 이상의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 절단 부위를 포함하는 아미노산 삽입체는 3 내지 50개, 보다 바람직하게는 4 내지 30개, 보다 바람직하게는 4 내지 20개, 가장 바람직하게는 5 내지 15개로 이루어진다. 게다가, 인자 IX로부터의 프로테아제 절단 부위의 일련의 결실 돌연변이체(표 1의 서열번호 22 내지 서열번호 31)에서 예시한 바와 같은 프로테아제 절단 부위의 단편도, 이러한 단편화된 프로테아제 절단 부위를 포함하는 FX 변이체가 여전히 절단에 민감하고 상기 FX 변이체가 여전히 생물학적 활성은 갖는 한, 본 발명에 의해 포함된다.

하나의 바람직한 양태에서, 추가의 절단 부위는 인자 X 서열의 Ile235와 Val236 사이에 삽입된다. 또는, 추가의 절단 부위는 인자 X 서열의 C-말단에 더욱 인접해 있는 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 예를 들면, 추가의 절단 부위는 인자 X 서열의 Val236와 Gly237 사이 또는 Gly237과 Gly238 사이에 삽입될 수 있다.

본 발명의 인자 X 변이체는 생물학적 활성을 갖는다. 본원에서 사용된 "생물학적 활성"이란 용어는 인자 X 활성을 의미한다. 인자 X 활성을 갖는 단백질이란, 지모겐 형태의 단백질이 프로테아제에 의한 절단을 통해서 활성화될 수 있고 이의 활성화된 형태에서 인자 Xa 활성을 가질 수 있음을 의미한다. 인자 X 활성은 시험관내에서 응고 검정으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 인자 X 활성은 실시예 4에 기술된 바와 같은, 외인성 응고 경로의 활성을 측정하는 프로트롬빈(PT) 검정으로 측정될 수 있다. 샘플 중에서 응고 활성으로서 발현된 인자 X 활성은 mU/ml로서 기재한다.

이렇게 측정된 인자 X 활성은 샘플 중에 존재하여 변이체의 "특이적 활성"을 산출하는 인자 X의 항원의 양으로서 언급될 수 있고, 예를 들면 U/단백질 mg 또는 mU/단백질 ㎍으로 표현된다. 본 발명의 변이체의 특이적 활성은 바람직하게는 서열번호 2에 나타낸 야생형 서열을 갖는 재조합 인자 X 분자의 인자 X 활성의 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상이다.

본 발명의 인자 X 변이체는 추가로 지혈성 우회 활성을 갖는다. 이러한 활성은 실시예 4에 기술된 바와 같이, FVIII- 또는 FIX-고갈된 혈장을 사용하여 응고 활성(aPPT)를 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 검정에서의 응고 활성은 바람직하게는 야생형 서열을 갖는 재조합 인자 X의 활성보다 70배 이상, 보다 바람직하게는 100배 증가되고, 가장 바람직하게는 500배 이상이다.

본 발명에 따르는 바람직한, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체는 천연 발생 인자 X 활성화 절단 펩타이드의 서열 내에 변형을 갖는 인자 X 변이체와 비교해 증강된 지혈성 우회 활성을 갖는 인자 X 변이체이고, 여기서 상기 변형은 프로테아제의 절단 부위로서, 당해 프로테아제는 천연적으로는 인자 X 서열의 당해 부위를 절단하지 않고 상기 추가의 절단 부위의 절단시에 인자 X 변이체를 활성화시키게 된다.

본 발명의 또 다른 측면은 프로테아제 절단 부위를 인자 X 아미노산 서열의 중쇄내로 삽입시킴을 포함하는, 지혈성 우회 제제의 생산 방법이다. 바람직하게는, 절단 부위는 Ile235에 대한 C-말단에 삽입된다. 당해 방법의 바람직한 양태는 본원에 기술한 인자 X 변이체의 바람직한 양태에 상응한다.

추가로, 본 발명은 본원에 기술된 변형된 사람 인자 X를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. "폴리뉴클레오타이드(들)"란 용어는 일반적으로, 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA, 또는 일본쇄 또는 이본쇄 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드(들)"란 용어는 또한 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 비통상적 염기, 예를 들면 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 당업자에게 공지된 다수의 유용한 목적을 제공하는 각종 변형이 DNA 및 RNA에 가해질 수 있음이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"은 폴리뉴클레오타이드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라, 바이러스 및 예를 들면 단순 및 복합 세포를 포함하는 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포괄한다.

당업자는, 유전 암호의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 소정의 폴리펩타이드가 상이한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다고 이해할 것이다. 이들 "변이체"는 본 발명에 포함된다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 분리된 폴리뉴클레오타이드이다. 용어 "분리된" 폴리뉴클레오타이드는 다른 핵산 서열, 예를 들면, 제한없이, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA 등이 실질적으로 부재하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 공지된 통상의 핵산 정제 방법을 사용하여 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 상기 용어는 또한 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게는, 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 양태에서, 벡터는 사람 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 일부인, 사람 인자 X의 변형된 동족체를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 당해 방법은,

(a) 사람 인자 X의 변형된 동족체가 발현되는 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 임의로, 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 사람 인자 X의 변형된 동족체를 회수하는 단계를 포함한다.

글리코실화 또는 기타 해독후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 특성에 따라 달라질 수 있다. 특정 아미노산 서열을 언급할 때, 이러한 서열의 해독후 변형은 본 출원에 포함된다.

본원에서 사용된 "인자 X"는 비-활성화된 형태(인자 X)로 이루어진 생성물을 의미한다. 상기 정의 내에서 "인자 X"는 천연 사람 인자 X의 아미노산 서열을 가진 단백질을 포함한다. 이는 또한 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들면 N-말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단을 가진 단백질이 인자 Xa의 활성을 실질적으로 보유하는 한, 이들 단백질을 포함한다. 상기 정의 내에서 "인자 X"는 또한, 개체에 따라 존재하고 발생할 수 있는 천연 대립형질 변이를 포함한다. 상기 정의 내에서 "인자 X"는 FX의 변이체를 추가로 포함한다. 이러한 변이체는 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기에서 상이하다. 이러한 차이의 예로는 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산 잔기)의 N- 및/또는 C-말단의 절두(truncation), 또는 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 잔기의 부가, 예를 들면 N-말단에서 메티오닌 잔기의 부가뿐만 아니라, 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 특징을 가진 아미노산, 예를 들면 (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산, (6) 방향족 아미노산 및 (7) 극성 아미노산의 그룹 내에서 수행된 치환이 포함된다. 이러한 보존적 치환의 예는 하기 표 2에 제시된다.

보존적 치환의 예
(1)	알라닌, 글리신
(2)	아스파르트산, 글루탐산
(3a)	아스파라긴, 글루타민
(3b)	세린 트레오닌
(4)	아르기닌, 히스티딘, 리신
(5)	이소류신, 류신, 메티오닌, 발린
(6)	페닐알라닌, 티로신, 트립토판

"재조합"이란 용어는 예를 들면, 변이체가 유전공학 기술에 의해 숙주 유기체에서 생산되었음을 의미한다.

제안된 돌연변이체의 발현

적당한 숙주 세포에서 재조합 돌연변이체 단백질을 고 수준으로 생산하는 것은, 당업자에게 공지된 방법에 따라서 다양한 발현 시스템에서 증식시킬 수 있는 재조합 발현 벡터 내의 적합한 조절 요소와 함께, 효율적인 전사 단위체로서 상기 언급한 변형된 cDNA를 조립하는 것을 요구한다. 효율적인 전사 조절 요소는 동물 세포가 이들의 천연 숙주가 되는 바이러스로부터 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스, 또는 라우스(Rous) 육종 바이러스의 장말단 반복체로부터 유래된 프로모터-인핸서 조합체, 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같이 동물 세포에서 강력하게 구성적으로(constitutively) 전사되는 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합체가 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 안정한 고 수준의 mRNA를 수득하기 위하여, 전사 단위는 이의 3'-근접부에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야 한다. 바람직하게는, 이 서열은 시미안 바이러스 40 조기(early) 전사 영역, 토끼 베타 글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성화인자 유전자로부터 유래된다.

이어서, cDNA는 인자 X 단백질의 발현을 위해 적합한 숙주 세포주의 게놈내로 삽입된다. 바람직하게는, 상기 세포주는, 정확한 폴딩, 이황화 결합 형성, 아스파라긴-연결된 글리코실화 및 배양 배지로의 분비 뿐만 아니라 기타 해독후 변형을 보장하기 위하여, 척추동물 기원의 동물 세포주이어야 한다. 다른 해독후 변형의 예로는 발생기 폴리펩타이드 쇄의 하이드록실화 및 단백질분해성 프로세싱이 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예로는 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포, 및 바람직하게는 햄스터 CHO-세포가 있다.

상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 몇가지 상이한 방법으로 동물 세포주내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스에 기초하는 벡터로부터 제조될 수 있다. 이들의 예로는 바큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 및 바람직하게는 소 파필로마 바이러스에 기초하는 벡터이다.

또한, 상응하는 DNA를 암호화하는 전사 단위를 동물 세포에서 우성 선별성 마커로서 작용할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 이들 동물 세포내로 삽입시켜, 재조합 DNA가 게놈내에 삽입되어진 특정 세포 클론의 분리를 용이하게 할 수 있다. 이러한 유형의 우성 선별성 마커 유전자의 예로는 제네티신(geneticin) (G418)에 대한 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대해 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 푸로마이신에 대해 내성을 부여하는 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제가 있다. 이러한 선별 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는, 목적하는 단백질의 cDNA를 암호화하는 것과 동일한 벡터 상에 존재하거나, 또는 숙주 세포의 게놈으로 동시에 도입 및 삽입된 별개의 벡터 상에 암호화될 수 있으며, 종종 상이한 전사 단위 사이의 견고한 물리적 연결을 생성시킨다.

목적하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 선별 마커 유전자의 다른 유형은 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위에 기초한다. 이러한 유형의 유전자를 내인성 dhfr-활성이 결여된 세포, 바람직하게는 CHO-세포(DUKX-B11 , DG-44) 내로 도입시킨 후, 이들을 뉴클레오시드가 결핍된 배지에서 성장시키는 것이 가능할 것이다. 이러한 배지의 예로는 하이포크산틴, 티미딘 및 글리신을 함유하지 않는 Ham's F12가 있다. 이들 dhfr- 유전자는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터상에서 연결된 응고 인자 cDNA 전사 단위와 함께 상기 유형의 CHO-세포 내로 도입되어, 재조합 단백질을 생산하는 dhfr-양성 세포주를 생성시킬 수 있다.

상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에 성장하는 경우에, 메토트렉세이트에 대해 내성인 새로운 세포주가 출현할 것이다. 이들 세포주는, 연결된 dhfr 및 목적하는 단백질의 전사 단위의 증폭된 수로 인하여, 재조합 단백질을 증가된 비율로 생산할 수 있다. 메토트렉세이트의 농도를 증가시키면서(1 내지 10000nM) 이들 세포주를 증식시키면, 목적하는 단백질을 매우 높은 비율로 생산하는 새로운 세포주가 수득될 수 있다.

목적하는 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁 배양물 중에서 또는 다양한 고형 지지체 상에서 대규모로 성장시킬 수 있다. 이들 지지체의 예로는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스에 기초하는 미립담체, 또는 중공 섬유 또는 각종 세라믹 물질 형태의 고형 지지체가 있다. 세포 현탁 배양물 중에서 또는 미립담체 상에서 성장시킬 때, 상기 세포주의 배양은 장기간에 걸쳐 조건화된(conditioned) 배지를 계속적으로 생산하면서, 바쓰 배양(bath culture)으로 또는 관류 배양(perfusion culture)으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 상기 세포주는 목적하는 재조합 단백질의 제조를 위한 공업적 방법의 개발에 특히 적합하다.

배지 중에 축적되는, 상기 유형의 세포가 분비하는 재조합 돌연변이 단백질은, 각종 생화학적 및 크로마토그래피 방법, 예를 들면 세포 배양 배지 중의 목적하는 단백질과 다른 물질 사이의 크기, 전하, 소수성, 용해도, 특이적 친화성 등의 차이를 이용하는 방법으로 농축 및 정제할 수 있다.

이러한 정제의 예로는 고형 지지체 상에 고정된 모노클로날 항체에 대한 재조합 돌연변이 단백질의 흡착이 있다. 탈착 후, 당해 단백질은 상기 특성을 이용하는 각종 크로마토그래피 기술로 추가로 정제할 수 있다.

본 발명의 변형된 생물학적 활성 인자 X 변이체를 ≥80% 순도, 보다 바람직하게는 ≥95% 순도로 정제하는 것이 바람직하며, 특히 바람직한 것은 오염성 고분자, 특히 다른 단백질 및 핵산에 대하여 99.9% 초과의 순도이고, 감염성 및 발열성 제제가 부재한 약제학적으로 순수한 상태이다. 바람직하게는, 분리된 또는 정제된, 본 발명의 변형된 생물학적 활성 인자 X 변이체는 다른 폴리펩타이드가 실질적으로 부재하다.

본 발명에 기재된 재조합 단백질은 치료용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질을 임의로 약제학적 부형제가 부가될 수 있는 생리학적으로 적합한 통상의 완충 수용액에 용해시켜 약제학적 제제를 제공할 수 있다.

이러한 약제학적 담체 및 부형제뿐만 아니라 적합한 약제학적 제형은 당업계에 익히 공지되어 있다 [참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)]. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조된 형태 또는 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 사용 전에 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 예를 들면 주사용 멸균수 또는 멸균 생리학적 염 용액을 첨가하여 재구성한다.

조성물의 제형은 약제학적으로 적합한 임의의 투여 수단에 의해 개체에게 전달된다. 다양한 전달 시스템이 공지되었으며, 임의의 편리한 경로에 의해 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전신으로 투여된다. 전신 용도를 위해, 본 발명의 FX 변이체는, 통상의 방법에 따른 비경구 (예: 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비내 또는 경피) 또는 장내(예: 경구, 질 또는 직장) 전달을 위해 제형화된다. 가장 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다. 제형은 주입 또는 일시 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방 시스템을 포함한다.

본 발명의 변형된 생물학적 활성 FX 변이체는 허용되지 않는 부작용을 일으키는 용량에 도달하지 않으면서, 치료 중인 상태 또는 징후의 중증도 또는 확산을 예방하거나 경감시키고, 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 용량을 의미하는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다. 정확한 용량은 예를 들면 징후, 제형, 투여방식과 같은 다수의 인자에 의존하며, 각각의 징후에 대해 임상전 및 임상 시험에서 결정되어야 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이들 제제는 동일한 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 혈액 응고 질환의 치료 또는 예방용 의약을 제조하는데 있어서, 본원에 기재된 사람 인자 X의 동족체, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 플라스미드 또는 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포의 용도이다. 혈액 응고 질환에는 A형 혈우병, B형 혈우병 또는 FVII/FVIIa 결핍증이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 이들 질환은 각각의 응고 인자에 대한 자가면역 항체에 의해 유발되거나 선천 형태는 각각의 응고 인자에 대한 자가면역 항체에 의해 악화된다. 구체적 양태에서, 치료될 환자는 인자 VIII에 대한 억제제 항체를 갖는다. 바람직하게는, 치료는 사람 유전자 치료법을 포함한다.

또한, 본 발명은 A형 혈우병, B형 혈우병 또는 FVII/FVIIa 결핍증과 같은 혈액 응고 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이고, 바람직하게는 이들 질환은 개개의 응고 인자에 대한 자가면역 항체에 의해 유발되거나, 선천 형태는 개개의 응고 인자에 대한 자가면역 항체에 의해 악화된다. 당해 방법은 본원에 기재된 바와 같은 사람 인자 X의 변형된 동족체의 유효량을 상기 개체에게 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터의 유효량을 개체에게 투여함을 포함한다. 또는, 본 방법은 본원에 기재된 본 발명의 숙주 세포의 유효량을 개체에게 투여함을 포함할 수 있다.

도 1:

실시예 1에 기술한 작제물 pFX 619에 의해 암호화되는 FX 변이체의 삽입된 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 핵산 서열의 개략적 도식.

도 2:

FX 야생형, 및 새로이 도입된 프로테아제 절단 부위를 갖는 FX 변이체의 개략적 도식. 숫자는 서열번호 2의 아미노산 번호매김을 의미하고, 활성화 펩타이드는 Arg182과 Ile235 사이의 아미노산 서열로서 정의된다.

인자 IX로부터 유래된 외래 활성화 서열은 볼드체로 표시한다. 밑줄이 그어진 아미노산은, 개별적 인자 X 분자를 각각 테나제(tenase) 복합체 및 인자 VIIa/조직 인자에 의해 활성화될 수 없게 만드는 점 돌연변이를 나타낸다. 작제물 "pFX-532"는 인자 X 야생형 서열에 상응한다.

도 3(도 3A 내지 3C):

야생형 인자 X의 뉴클레오타이드 서열 및 단백질 서열.

실시예 1 : 발현 플라스미드의 작제

인자 X 암호화 서열을 프라이머 We1292 및 We1293(서열번호 3 및 4)을 사용하여 사람 간 cDNA 라이브러리(Ambion)로부터 PCR로 증폭시켰다. 프라이머 We1354 및 We1355(서열번호 5 및 6)을 사용한 2번째 PCR에서, 제한 엔도뉴클레아제Nhel에 대한 절단 부위를 단편의 5-말단에 도입시키고, 제한 엔도뉴클레아제 Notl에 대한 절단 부위를 단편의 3'-말단에 도입시켰다. 이어서, PCR 단편을 plRESpuro3(BD Biosciences)의 Nhel/Notl 부위 내로 삽입시켰다. 수득된 플라스미드를 pFX-445라 명명하였다.

프로펩타이드의 프로세싱을 개선시키기 위해, 위치 39(서열번호 2)의 아미노산 트레오닌을 아르기닌으로 대체시켜 절단 부위를 개선시켰다[참조: Rudolph et al., 1997 (Protein Expression and Purification 10:373-378)]. 이를 위해, 올리고뉴클레오타이드 We1482 및 We1483(서열번호 7 및 8)를 표준방법(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)에 따라 사용하여 pFX-445를 부위 특이적 돌연변이유발시켰다. 수득된 플라스미드를 pFX-532라 명명하였다.

하기에 기술되는 모든 돌연변이는 시판되는 돌연변이유발 키트(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)를 사용하여 실시하였다. pFX-532에 기초하여, 인자 XIa 절단 부위를 갖는 작제물을 제조하였다. 올리고뉴클레오타이드 We1444 및 We1445(서열번호 9 및 10)를 사용한 치환 돌연변이유발에 의해, 인자 X 활성화 영역의 8개 아미노산(서열번호 2의 아미노산 225번 내지 233번)이 FIX의 활성화 영역으로부터의 8개 아미노산으로 치환된 플라스미드 pFX-535를 수득하였다(도 3).

올리고뉴클레오타이드 We1561a 및 We 1562a(서열번호 11 및 12)를 사용한 삽입 돌연변이유발에 의해, 인자 X 아미노산 위치 235번 및 236번(서열번호 2) 사이에 FIX 활성화 영역의 10개 아미노산이 삽입되어진 플라스미드 pFX-619를 수득하였다.

pFX-532에 대해 올리고뉴클레오타이드 We1567 및 We1568(서열번호 13 및 14)를 사용한 부위 특이적 돌연변이유발을 사용하여 플라스미드 pFX-641을 제조하였 다. 이는 인자 X 활성화 펩타이드 내에 2개의 돌연변이, Leu232Asp와 Thr233Asp를 함유함으로써, 활성화될 수 없는 인자 X 분자를 생성시켰다. 유사하게, 프라이머 We1587 및 We1588(서열번호 15 및 16)를 플라스미드 pFX-619상에 적용함으로써 플라스미드 pFX-635를 생성시켰다(도 2).

실시예 2: 변형된 인자 X 분자의 형질감염 및 발현

플라스미드를 이. 콜라이(E.coli) TOP10 (Invitrogen) 내에서 성장시키고 표준 프로토콜(Qiagen)을 사용하여 정제하였다. HEK 293 세포를 리포펙타민 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 형질감염시키고, 50 ng/ml 비타민 K 및 4 ㎍/ml 푸로마이신의 존재하에 혈청-비함유 배지(Invitrogen 293 Express)에서 성장시켰다. 형질감염한지 약 4주 후에, 생화학적 특성 규명을 위해 상청액을 수거하였다.

실시예 3: 재조합 인자 X 변이체의 특성 규명

인자 X 변이체의 발현을 인자 X에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 정량적 ELISA로 조절하였다. 이어서, 재조합 단백질의 온전성을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 샘플을 환원성 및 비환원성 조건하에 분석하였다. 혈장의 인자 X는 음성 분자량 대조군으로서 사용하였고, 인자 Xa는 자가활성화 경우의 임의의 활성화된 재조합 인자 X 변이체를 검출하고 비교하기 위해 사용하였다. 웨스턴 블롯으로 가시화된 바와 같이, 모든 재조합 인자 X 변이체는 약 58 kDa의 정확한 분자량으로 발현되었고, 혈장의 인자 X와 유사한 위치에서 이동하였다. 환원되 는 경우, 재조합 인자 X 변이체는 대략 40 kDa의 중쇄(HC)와 대략 20 kDa의 경쇄로 분해되었다. 58 kDa 밴드는 프로세싱되지 않은 1-쇄(OC) 인자 X를 나타냈다. 웨스턴 블롯에서 인자 Xa 뿐만 아니라 인자 X의 어떠한 응집체도 검출되지 않았다.

실시예 4: 사람 인자 X-, 인자 VIII- 및 인자 IX 결핍 혈장 및 사람 억제제 혈장 중의 재조합 인자 X 변이체의 시험관내 활성 조사

인자 X 활성은 외인성 응고 경로의 활성을 측정하는 프로트롬빈 시간(PT) 검정으로 측정하였다. 인자 X 결핍 혈장 100㎕를 인자 X 변이체 세포 배양물 상청액 또는 정제된 단백질 100㎕와 혼합하였다. 37℃에서 60초 동안 항온처리한 후, 사람 혈장 유래의 트롬보플라틴, CaCl₂ 및 인지질을 함유하는 트롬보렐(Dade Behring) 200㎕를 상기 혼합물에 부가하고, 응고 시간(초 단위)을 Schnittger & Gross 응고 타이머를 사용하여 측정하였다. 인자 X 활성의 측정을 위해, 혈장의 인자 X 표준물을 사용하여 검정을 보정하였다. 돌연변이된 인자 X pFX-641의 세포 배양물 상청액은 당해 검정을 위한 음성 대조군으로서 사용할 수 있다. 이 돌연변이체는 pFX635 내의 것과 같은 야생형 인자 X 활성화 펩타이드 내에 무능화된 절단 부위를 보유하고 있다. 예상한대로, 이 돌연변이체를 216.4 U/ml 인자 X와 동등한 항원 수준에서 시험하였을 때, 응고 활성은 단지 0.5 mU/ml에 이르렀다.

pFX532로부터 유래된 재조합 야생형 인자 X, 및 pFX535, pFX619 및 pFX635로부터 유래된 인자 X 변이체를 정제하고, 2.8 내지 4.3 U/ml 범위의, 인자 X 항원 농도에 대해 특이적인 항체를 사용하여 ELISA로 항원을 측정하였다. 인자 Xa에 의 해 인자 X의 측정이 방해되는 것을 배제하기 위해, 발색성 검정(DADE Behring)으로 인자 Xa를 측정하였다. 모든 정제된 인자 X 변이체는 오직 인자 X 측정치를 유의적으로 간섭하지 않는 수준인 0.028 내지 0.051 mU/ml의 인자 Xa 수준만을 함유하였다(표 3).

발현된 인자 X 변이체를 서로 비교하기 위해, 인자 X 응고 활성들을 측정하고 약 1.5 mU/ml로 조정하였다. 시험된 모든 변이체는 기능적으로 활성이여서 응고 활성은 1.48 내지 1.72 mU/ml였다(표 3).

FVIII- 및 FIX 결핍 혈장 중의 재조합 인자 X 변이체의 기능성을 내인성 응고 연쇄증폭반응의 활성을 측정하는 활성화된 부분 프로트롬빈 시간(aPPT)으로 시험하였다. FVIII- 또는 FIX-고갈된 혈장 100㎕를 인자 X 변이체 세포 배양물 상청액 또는 정제된 단백질 100㎕와 혼합하였다. 37℃에서 6분 동안 항온처리한 후, SiO₂, 인지질 및 40mM NaCl을 함유하는 파트롬프틴(Dade Behring) 100㎕를 부가하여 응고 반응을 개시하였다. 응고 시간(초 단위)을 Schnittger & Gross 응고 타이머를 사용하여 측정하였다. 활성을 표준 사람 혈장과 비교한 각각의 응고 FX 등량으로서 표현하였다.

재조합 야생형 인자 X는 예상한대로, 인자 VIII 고갈된 혈장 중에서는 오직 6.6 mU/ml의 응고 활성에 이르렀고, FIX 고갈된 혈장 중에서는 오직 5.8 mU/ml의 응고 활성에 이르렀다. 이와 달리, 인자 X 변이체는 인자 VIII 고갈된 혈장 중에서는 423.7 내지 8545.8 mU/ml 범위의 응고 활성에 이르렀고, FIX 고갈된 혈장 중에서는 272.3mlU/ml 내지 4620.2mlU/ml의 혈액응고 활성에 이르렀다. 이는 FX를 혈액응고 활성인 지혈성 우회 제제로 변화시키는 삽입된 인자 XIa 절단 부위의 기능성을 입증한다(표 3).

놀랍게도, 그리고 모든 재조합 인자 X 변이체가 인자 X 응고 활성으로 조정되었음에도 불구하고, pFX-619 및 pFX635로부터 유래된 인자 X 변이체들은 각각 8545.8 및 2692.0 mU/ml의 강력한 응고 활성을 나타낸 반면, pFX535로부터 유래된 인자 X 변이체는 FVIII 고갈된 혈장 중에서 오직 423.7mU/ml에 이르렀다(표 2). pFX619 및 pFX635로부터 유래된 변이체는, pFX-619 및 pFX-635 내에서 새로운 인자 IX 활성화 서열이 인자 X의 완전한 활성화 펩타이드 서열을 유지하면서 Ile235의 C-말단에서 중쇄의 아미노산 말단에 삽입되었다는 점에서 pFX535와 상이하다. pFX535로부터 유래된 인자 X 변이체는 새로운 인자 IX 활성화 서열이 Ile235에 대해 N-말단에서 야생형 FX 활성화 펩타이드의 영역내에 삽입되어진 WO 01/10896에 기재된 인자 X 변이체에 해당되는 반면, pFX619 및 pFX635는 본 발명의 인자 X 변이체이다. 흥미롭게도, pFX619 및 pFX635에 의해 암호화된 인자 X 변이체는 FIX 고갈된 혈장 중에서 각각 4620.2 및 1644.8 mU/ml의 강력한 혈액응고 활성을 나타낸 반면, pFX535로부터 유래된 인자 X 변이체는 오직 272.3mU/ml에 이르렀으며, 이는 각각 FVIII 또는 FIX가 고갈된 혈장에 기초하는 FVIII 또는 FIX 응고 검정에서 수득된 결과를 확인시켜준다(표 2).

A형 혈우병 환자로부터의 FVIII-억제제 함유 혈장을 사용하여 기능적 활성을 측정을 추가로 수행하였다. 상기 환자의 혈장은 ml당 약 300 베데스다 단위(Bethesda Units)의 FVIII 억제제를 함유하였다. 혈액응고를 aPPT로 측정하고, 샘플을 상기한 바와 같은 인자 X 혈액응고 활성으로 조정하였다.

표준물의 희석을 위해 사용된 샘플 완충액 대조군 및 시험 샘플은 156.5초의 응고 시간에 이르렀으며, 재조합 야생형 인자 X는 111.4초의 응고 시간에 이르렀다. FVIII 또는 FIX가 고갈된 혈장에 기초하는 FVIII 또는 FIX 응고 검정에서의 놀라운 결과를 확인시키며, FVIII 억제성 항체를 함유하는 혈장에 기초하는 FEIBA 검정에서 pFX619 및 pFX635로부터 유래된 인자 X 변이체는 인자 X 변이체 pFX535를 사용하였을 때 51.1초로 수득된 각각의 응고 시간보다 현저하게 짧은 33.7 및 38.4초의 응고 시간에 이르렀다.

종합하면, 인자 X 변이체는 지혈성 우회 제제로서 기능적으로 활성이고, 이들 인자 X 변이체는 인자 VIII에 대한 억제제를 함유하는 A형 혈우병 환자의 혈장 중에서 혈액응고 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, pFX619 및 pFX635에 의해 암호화된 인자 X 변이체는 동일한 인자 X 혈액응고 등량으로 조정한 경우에 pFX535에 의해 암호화된 인자 X 변이체와 비교하여 인자 VIII 및 인자 IX 고갈된 혈장 중에서 훨씬 강력한 혈액응고 활성을 나타냈다.

실시예 5: 모노클로날 항체 친화성 크로마토그래피에 의한 재조합 인자 X 변이체의 정제

재조합 인자 X 변이체 pFX635의 정제는 정제된 모든 인자 X 변이체에 대한 한 예가 된다. 인자 X에 대해 특이적인 모노클로날 항체 FX-13(ZLB Behring)을 CNBr-활성화된 세파로스에 커플링시켰다. 수득된 친화성 수지를 Pharmacia XK 16 크로마토그래피 컬럼에 부어서 직경이 1.6cm이고 높이가 1.8cm인 친화성 매트릭스를 형성시켜, 3.6ml의 겔을 수득하였다. 상기 친화성 매트릭스를 2.5M NaCl, 1OmM 인산수소이나트륨 중에서 저장하였다. 사용 전에, 겔을 10 겔-용적의 2OmM 시트르산 삼나트륨, pH 7.0의 0.15M NaCl-HCl으로 평형화시켰다.

100mlU/ml 초과의 인자 X-항원을 함유하는 세포 배양물 상청액을 평형화 완충액 2 내지 4ℓ중에서 4 내지 8℃에서 VISKING 튜빙 타입 32/36을 사용하여 투석하였다.

친화성-겔에 70ml의 투석된 상청액을 1ml/분의 유속으로 부하하였다. 겔을 10용적의 평형화 완충액으로 세척한 다음, 0.1M 글리신, pH 2.5-HCl로 용출시켰다. 용출된 물질을 NaOH로 중화시키고 1.0M NaCl 및 0.1mg/ml 나트륨 카프릴레이트로 안정화시켰다.

통류 분획물 및 용출된 물질로부터, 인자 X 변이체 pFX635의 세포 배양물 상청액으로부터의 샘플을 SDS-PAGE에 이어서 은 염색으로 분석하였다. 58kDa 단백질 밴드를 상기한 방법으로 정제하였다. 항-인자 X 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯팅으로 확인한 바에 따르면 58kDa 밴드는 인자 X 변이체 635와 유사하다.

<110> CSL BEHRING GMBH <120> Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties <130> 2005_M003_A95 <150> EP 05011773.8 <151> 2005-06-01 <150> US 60/688,704 <151> 2005-06-09 <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1467 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> DNA <222> (1)..(1467) <400> 1 atggggcgcc cactgcacct cgtcctgctc agtgcctccc tggctggcct cctgctgctc 60 ggggaaagtc tgttcatccg cagggagcag gccaacaaca tcctggcgag ggtcacgagg 120 gccaattcct ttcttgaaga gatgaagaaa ggacacctcg aaagagagtg catggaagag 180 acctgctcat acgaagaggc ccgcgaggtc tttgaggaca gcgacaagac gaatgaattc 240 tggaataaat acaaagatgg cgaccagtgt gagaccagtc cttgccagaa ccagggcaaa 300 tgtaaagacg gcctcgggga atacacctgc acctgtttag aaggattcga aggcaaaaac 360 tgtgaattat tcacacggaa gctctgcagc ctggacaacg gggactgtga ccagttctgc 420 cacgaggaac agaactctgt ggtgtgctcc tgcgcccgcg ggtacaccct ggctgacaac 480 ggcaaggcct gcattcccac agggccctac ccctgtggga aacagaccct ggaacgcagg 540 aagaggtcag tggcccaggc caccagcagc agcggggagg cccctgacag catcacatgg 600 aagccatatg atgcagccga cctggacccc accgagaacc ccttcgacct gcttgacttc 660 aaccagacgc agcctgagag gggcgacaac aacctcacca ggatcgtggg aggccaggaa 720 tgcaaggacg gggagtgtcc ctggcaggcc ctgctcatca atgaggaaaa cgagggtttc 780 tgtggtggaa ccattctgag cgagttctac atcctaacgg cagcccactg tctctaccaa 840 gccaagagat tcaaggtgag ggtaggggac cggaacacgg agcaggagga gggcggtgag 900 gcggtgcacg aggtggaggt ggtcatcaag cacaaccggt tcacaaagga gacctatgac 960 ttcgacatcg ccgtgctccg gctcaagacc cccatcacct tccgcatgaa cgtggcgcct 1020 gcctgcctcc ccgagcgtga ctgggccgag tccacgctga tgacgcagaa gacggggatt 1080 gtgagcggct tcgggcgcac ccacgagaag ggccggcagt ccaccaggct caagatgctg 1140 gaggtgccct acgtggaccg caacagctgc aagctgtcca gcagcttcat catcacccag 1200 aacatgttct gtgccggcta cgacaccaag caggaggatg cctgccaggg ggacagcggg 1260 ggcccgcacg tcacccgctt caaggacacc tacttcgtga caggcatcgt cagctgggga 1320 gagggctgtg cccgtaaggg gaagtacggg atctacacca aggtcaccgc cttcctcaag 1380 tggatcgaca ggtccatgaa aaccaggggc ttgcccaagg ccaagagcca tgccccggag 1440 gtcataacgt cctctccatt aaagtga 1467 <210> 2 <211> 488 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(488) <400> 2 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln 385 390 395 400 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430 Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445 Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 460 Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(20) <400> 3 cagggacaca gtactcggcc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(22) <400> 4 gagtgggatc tcactttaat gg 22 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(28) <400> 5 gcggctagca tggggcgccc actgcacc 28 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(36) <400> 6 gcggcggccg ctcactttaa tggagaggac gttatg 36 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(27) <400> 7 cctggcgagg gtcaggaggg ccaattc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(27) <400> 8 gaattggccc tcctgaccct cgccagg 27 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(50) <400> 9 cagacgcagc ctacccaatc atttaatgac ttcactcgga tcgtgggagg 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(50) <400> 10 cctcccacga tccgagtgaa gtcattaaat gattgggtag gctgcgtctg 50 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(55) <400> 11 caacctcacc aggatcaccc agagcttcaa cgacttcacc cgcattgtgg gaggc 55 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> Primer <222> (1)..(55) <400> 12 gcctcccaca 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(13) <400> 19 Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(9) <400> 20 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Val 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(11) <400> 21 Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Val 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(13) <400> 22 Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(10) <400> 23 Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val 1 5 10 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(8) <400> 24 Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(6) <400> 25 Asn Asp Phe Thr Arg Val 1 5 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(4) <400> 26 Phe Thr Arg Val 1 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(13) <400> 27 Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Ile 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(10) <400> 28 Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Ile 1 5 10 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(8) <400> 29 Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Ile 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(6) <400> 30 Asn Asp Phe Thr Arg Ile 1 5 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(4) <400> 31 Phe Thr Arg Ile 1 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(10) <400> 32 Asn Gln Ser Phe Asp Glu Phe Ser Arg Ile 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(10) <400> 33 Thr Gln Pro Leu Asn Asp Phe Thr Arg Ile 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(10) <400> 34 Ser Glu Ser Leu Asn Asp Phe Thr Arg Ile 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(10) <400> 35 Ser Gln Ser Ser Asp Asp Phe Thr Arg Ile 1 5 10 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(16) <400> 36 Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ile 1 5 10 15 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(17) <400> 37 Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser 1 5 10 15 Ile <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Site <220> <221> Site <222> (1)..(16) <400> 38 Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Val 1 5 10 15

Claims

하나의 변형이 프로테아제에 대한 추가의 절단 부위의 삽입으로 이루어지고, 상기 추가의 절단 부위가 Ile235에 대한 C-말단에서 인자 X의 중쇄내로 삽입되는, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항에 있어서, 프로테아제에 의해 추가의 절단 부위가 절단될 때에 활성화되는, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프로테아제가 천연적으로는 인자 X를 활성화시키지 않는, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 천연의 인자 X 활성화 펩타이드가, 천연적으로는 인자 X를 활성화시키는 프로테아제가 더이상 당해 인자 X 변이체를 절단하고 활성화시킬 수 없도록 변형되는, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 삽입된 프로테아제 절단 부위가, 당해 변형된 인자 X 변이체가 세린 프로테아제에 의해 활성화될 수 있도록 하는, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 삽입된 프로테아제 절단 서열이, 당해 변형된 인자 X 변이체가 인자 IIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIa, 인자 XIIa, 활성화된 단백질 C, 엘라스타제 또는 칼리크레인에 의해 활성화될 수 있도록 하는, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 삽입된 절단 부위가 3개 이상의 아미노산을 포함하는, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체가 천연 발생 인자 X 활성화 절단 펩타이드의 서열 내에 변형을 갖는 인자 X 변이체와 비교해 지혈성 우회 활성(haemostatic bypassing activity)이 증강되고, 여기서 상기 변형이 프로테아제의 프로세싱 부위를 나타내고 당해 프로테아제는 천연적으로는 인자 X 서열의 상기 부위를 절단하지 않고 추가의 절단 부위의 절단시에 인자 X 변이체를 활성화시키는 것인, 변형된 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제9항에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터.
제10항에 있어서, 발현 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
제10항에 있어서, 사람 유전자 치료법에 사용하기 위한 전달 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제13항에 따른 숙주 세포를 변형된 재조합 인자 X 변이체가 발현되는 조건하에 배양하는 단계; 및

임의로, 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 변형된 재조합 인자 X 변이체를 회수하는 단계

를 포함하여, 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체를 생산하는 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체, 제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
혈액 응고 질환의 치료 또는 예방용 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체, 제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터 또는 제13항에 따른 숙주 세포의 용도.
제16항에 있어서, 혈액 응고 질환이 A형 혈우병인 용도.
제17항에 있어서, A형 혈우병이 FVIII에 대한 자가항체에 의해 유발되거나 악화되는 용도.
제16항에 있어서, 혈액 응고 질환이 B형 혈우병인 용도.
제19항에 있어서, B형 혈우병이 FIX에 대한 자가항체에 의해 유발되거나 악화되는 용도.
제16항에 있어서, 혈액 응고 질환이 FVII 및/또는 FVIIa 결핍증인 용도.
제21항에 있어서, FVII 및/또는 FVIIa 결핍증이 FVII 및/또는 FVIIa에 대한 자가항체에 의해 유발되거나 악화되는 용도.
제16항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료가 사람 유전자 치료법을 포함하는 용도.
응고촉진 특성을 갖는 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 재조합 인자 X 변이체, 제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터 또는 제13항에 따른 숙주 세포의 용도.