KR20080020169A

KR20080020169A - 초임계 유체 추출공정에 의한 항생물질 고함유 추출물제조방법

Info

Publication number: KR20080020169A
Application number: KR1020060083267A
Authority: KR
Inventors: 윤기선; 조준영; 김우진; 주영운; 유연우
Original assignee: 케이엠에이치 주식회사
Priority date: 2006-08-31
Filing date: 2006-08-31
Publication date: 2008-03-05
Also published as: KR100841711B1

Abstract

본 발명은 초임계유체추출법을 이용하여 항생 물질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 초임계 유체 추출공정(Supercritical fluid extraction process)을 이용하여 오레가노, 편백, 육계 및 황금과 같은 항균성 있는 식물 및 허브에서 항생물질 추출 효율 및 활성을 높이는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추출방법은 항생활성을 갖는 식물로부터 항생물질을 높은 함량으로 함유하는 추출물을 수득하는데 이용될 수 있다.

초임계유체추출법, 오레가노, 편백, 육계, 황금, 항균성

Description

초임계 유체 추출공정에 의한 항생물질 고함유 추출물 제조방법{Method for manufacturing extracts with high content of antibiotcs by supercritical fluid extraction technology}

도 1은 초임계유체추출법을 이용하여 본 발명의 초임계추출의 공정도이다.

도 2는 육계 추출물(CK : Control, E : 에탄올 추출물, H : 열수추출물, S : 초임계 추출물)의 살모넬라 엔테리티디스에 대한 항균력을 측정한 사진이다.

도 3은 육계 추출물(CK : Control, E : 에탄올 추출물, H : 열수추출물, S : 초임계 추출물)을 스타필로코코스 아우레우스에 대한 항균력을 측정한 사진이다.

본 발명은 초임계유체추출법을 이용하여 항생 물질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초임계 유체 추출공정(Supercritical fluid extraction process)을 이용하여 오레가노, 편백, 육계 및 황금등과 같은 항균성 있는 식물 및 허브에서 항생물질 추출 효율 및 활성을 높이는 방법에 관한 것이다.

최근 우리나라 식중독 발생은 지난 몇 년간 지속적으로 증가하는 추세이며, 이러한 원인은 살모넬라, 대장균, 장염비브리오균, 황색포도상구균, 바실러스균 및 노로바이러스 등의 세균과 바이러스 같은 미생물에 의해 발생되는 것이 대부분이다.

식품은 수많은 유해 세균이나 곰팡이 등의 미생물에 노출되어 있으며, 현재 식중독 원인 미생물이나 부패 미생물을 제어하여 식품을 안전하고 장기간 저장하기 위한 수단으로 가열, 초고압, 방사선, 광펄스 등 물리적 방법과 알코올, 염소, 과산화수소, 천연물질 등 화학적 방법이 사용되어 왔는데, 이 합성항균제는 인공적으로 약제를 합성해 만들어낸 것으로 편의성과 비용, 세균 감염증에 유용한 효과 때문에 nitrite, sorbic acid, benzoic acid 등이 이용되어 왔으나 내성균이 발생되기 쉬운 단점이 있다.

또한 이들 화학약품은 체내 축적성 등 안전성에 관한 문제들과 이에 대한 소비자들의 기피현상으로 종전의 합성항균제를 천연항균제로 대체하려는 관심이 높아지고 있는 실정이다(Cherry, J.P., Food Technol. 53:54~57, 1999; Cho, S.H., et al., J. Food Hyg. Saf., 10:33~39. 1995; Kim. Y-S., et al., Korea J. Food Sci. Technol 35(2): 159~165, 2003; Cho. M.H., at al., Food Sci. and Ind., 38(2): 36~45, 2005).

이와 같은 경향으로 식품 산업계에서도 인공 합성항균제의 사용을 줄이는 추세이고, 안전성이 확보된 천연항균성 물질을 식품의 보존에 이용하고자 하는 연구 가 집중적으로 이루어지고 있으며, 화장품 및 기타 생활용품에서까지 활용 용도를 높이려는 제품들이 만들어지고 있다.

천연 항균제란 천연 자원이나 미생물자원으로부터 선택성이나 생화학적, 생리학적 차이를 극대화하여 바이러스, 세균, 효모, 곰팡이 등을 선택적으로 제어하나 인체에는 무해하게 또는 독성을 최소화한 항균제를 말한다. 지금까지 천연항균제에 대한 제품을 보면 희노키티올, 메그노놀, DF-100등이 개발되었으나, 그 사용되는 규모는 매우 미미한 실정이다. (주)에프에이뱅크사가 제조한 자몽종자 추출물인 DF-100의 주성분은 나리진과 시트탈이라는 천연성분으로 구성되어있으며, 또한 웰스킨사에서 출시한 아토원에스의 천연항균 성분 중 주요 성분은 히노키티올이 첨가된 사례가 있지만, 추출방법에 있어서 열수추출 또는 유기용매 추출에 기본을 두고 있다.

천연항균제의 시장은 세계적으로 증가하는 추세로 미국의 식품 첨가물 시장 중 천연항균제의 시장에 대해 발표한 자료에 의하면 2000년도에는 약 5억달러, 2003년 약 6억달러의 시장을 차지하며, 향후 2010년에는 약 10억달러로 지속적으로 증가할 것으로 전망하였다(참조 : U.S. Market for Food Additives by Types and Materials, through 2006). 이러한 천연항균제의 시장은 앞으로 고부가가치를 창출할 수 있는 시장이지만 기존의 추출 방식으로 진행이 된다면 천연항균제의 수요를 따라가지 못 할뿐만 아니라 안전에 대한 많은 문제점이 발생할 것이다.

통상 동, 식물로부터 유효성분을 추출하는 통상적인 방법은 물이나 메탄올, 에탄올, 헥산 등의 유기용매를 이용하는 것인데 유기용매에 의한 추출 방식은 적용 이 용이한 반면 적절한 용매의 선택, 유기용매의 잔존, 용매제거의 어려움, 환경오염, 추출 수율이 낮고, 또한 통상적으로 약 24~48시간의 장시간의 추출시간을 필요로 하는 등의 문제점을 내포하고 있다. 그러나 상업적 이용을 위해서는 용매에 대한 안정성과 추출시간을 단축하고 환경적 오염 및 추출하고자 하는 성분을 최대한 습득하고 활성을 가져야 하나 현재까지 이에 대한 뚜렷한 방법이 없었다.

초임계 유체 추출기술(Supercritical Fluid Extraction Technology)은 임계온도 및 임계 압력 이상의 유체를 사용하는 기술로 임계온도 및 압력이란 기체상에서 액체상으로 상전이가 이루어지는 온도 및 압력점으로, 온도· 압력· 부피를 변화시키며 기체의 액화, 액체의 기화 등의 변화가 일어날 때, 어느 점부터는 변화가 일어나지 않게 되는 상태의 온도 및 압력을 말한다. 예를 들면 암모니아는 132℃, 이산화탄소는 31℃, 산소는 －119℃가 임계온도로 알려져 있으며, 이보다 높은 온도에서는 압력을 아무리 크게 해도 기체는 액화하지 않는다.

초임계 유체 후보는 그 종류가 매우 다양한데, 그 중 이산화탄소는 자연에 무한량 존재할 뿐만 아니라 제철산업이나 석유화학산업에서 다량 발생하는 물질이고 무색, 무취, 인체에 무해하며 또한 화학적으로 매우 안정한 물질이다. 무엇보다도 그 어떤 유체보다 낮은 임계 온도(31.1℃)와 임계 압력 (7.4 MPa)을 나타내 쉽게 초임계 조건으로 조정이 가능하여 에너지 효율도 높다. 이 뿐 아니라 기존의 공정에서 발생하는 문제점, 즉 최종 산물 내에 잔류하는 유기용매에 의한 인체독성을 해결할 수 있다.

초임계 추출법은 상기와 같은 이유로 의약품, 식품가공 및 석유화학물질 정 제 등의 추출, 정제관련 분야에서 기존의 공정을 대체할 수 있는 새로운 환경 친화적 청정기술로 주목 받고 있다(C. D. Bevan and P. S. Marshall., Nat. Prod. Rep. 11, 451-576, 1994; W. K. Modey, D. A. Mullholl et al., Phytochem. Anal. 7, 1-15, 1996).

초기 초임계 유체 기술이 천연물 추출 정제에 주로 적용된 분야는 향신료, 화장품, 지방 등과 같이 비극성 물질, 저가의 식품이나 향료 성분에 국한되었으나 최근 들어 이 기술에 관련된 여러 현상학적 특성 및 부가적 기술의 발전으로 극성, 소량, 고가의 천연의약품 추출 정제에 응용되기에 이르렀다.

한편, 오레가노(Origanum vulgare L)는 허브의 일종으로 지중해연안, 특히 그리스, 이탈리아, 스페인의 양지바르고 비탈진 구릉이 원산으로 민트과의 다년생식물로 곧은 가지, 붉은 줄기, 맞쌍잎을 가지며 자주색꽃들이 맨 윗부분에서 핀다. 세균, 바이러스, 진균 감염에 효과가 있으며, 면역체계를 강화한다. 여드름, 알레르기, 동물에 물린데, 관절염, 천식이뇨관 장애, 상처를 치료하는데 쓰인다.

편백(Chamaecyparis obtusa)은 소나무과의 상록교목으로 일본이 원산지이며, 노송나무라고도 한다. 높이 40m, 지름 2m까지 자라며, 가지가 수평으로 퍼진다. 잎은 마주나며 뒷면에는 흰색의 Y자형 모양이 들어가는 특징이 있다.

편백에서 추출되는 정유(essential oil)는 다른 수종의 나무들에 비해 피톤치드(Phytoncide)를 발산하는 것으로 알려져 있고, 약리 작용으로는 중추신경을 억제하여 진정, 진통, 해열 작용을 하며, 혈관을 확장하여 발한(發汗)을 촉진함으로써 피하, 점막의 부종을 완화한다.

육계(Cinnamomum loureirii Nees)는 녹나무과의 늘푸른큰키나무 육계나무의 껍질이다. 줄기와 뿌리의 껍질은 맵고 향기가 있으므로 약용하거나 과자의 향료로 사용한다. 계피는 시나몬(cinnamon)이라고 하며, 스리랑카와 인도차이나에서 자라는 종류에서 채취한다. 초기 감기에 피부의 땀구멍을 열어 땀을 내며, 어깨와 등의 통증, 사지관절의 동통을 완화시켜 주며 기혈의 순환을 촉진 시키고 양기부족을 치료한다. 약리작용은 대장균, 고초간균, 황색포도상구균, 폐렴상구균 등의 발육을 억제하고 유행성감기바이러스를 억제하며 이뇨작용 등이 보고되었다.

황금(Scutellaria baicalensis)은 꿀풀과에 속하며, 동아시아대륙 중국 북부지방 원산으로, 우리나라 각처의 산지에 나고, 지리적으로는 동시베리아, 몽고, 중국, 만주에 분포한다. 약용식물로 들여와 각처의 약초농가에서 재배하는 귀화식물이며 흔히 밭에 재배한다. 생약(生藥)에서 황금은 뿌리를 말린 것으로, 봄 또는 가을에 뿌리를 캐서 겉껍질과 썩은속을 긁어 버리고 물에 씻어 햇볕에 말려 약재로 사용한다.

이에, 본 발명자들은 항균성이 있는 것으로 알려진 식물체인 오레가노, 편백, 육계 및 황금 등과 같이 식물이나 허브가 가지고 있는 천연항균제 성분을 유효추출개발에 대한 연구를 진행하던 중, 초임계유체추출법을 이용하여 얻어진 추출물이 기존의 유기용매 추출법에 의해 추출된 추출물보다 더 항균 효과가 더 높다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항균성을 지닌 식물체로부터 통상적인 유기용매 대신 초임계유체추출법을 통하여 항균성을 띠는 유용성분을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 초임계유체추출법을 이용한 항생물질 고함유 추출물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 오레가노, 편백, 육계 또는 황금 등과 같은 식물이나 허브로부터 초임계 유체 추출물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 초임계 유체 추출물로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 항균 또는 항진균성 식물 또는 허브를 파쇄하는 전처리 단계;

2) 단계 1에서 파쇄된 분말을 초임계 유체 추출기에 충진하는 단계;

3) 단계 2에서 원료분말이 충진된 추출기에 열교환기를 통하여 초임계 유체를 투입하여 추출물을 추출하는 단계;

3) 감압분리기에서 초임계 유체와 추출물 혼합물을 감압밸브를 경유하여 감압시켜 분리하는 단계; 및

4) 단계 3에서 분리된 초임계 유체는 저장조를 순환한 후 외부에서 보충되는 초임계 유체와 함께 펌프에 의해 감압하여 재순환시키고 분리된 추출물을 수거하는 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 초임계유체추출법을 이용한 항생물질 고함유 추출물 제조방법을 제공한다.

항균 또는 항진균성을 가지는 다양한 식물체로부터 기존의 유기용매 추출법에 의해 실시하게 되면 용매의 선택, 유기용매의 잔존, 용매제거의 어려움, 환경오염, 추출 수율이 낮고, 또한 통상적으로 약 24~48시간의 장시간의 추출시간 등의 다양한 문제점을 가지게 된다. 반면, 초임계유체추출법을 이용하여 추출하게 되면 유기용매 추출법에 의해 발생되는 문제점을 제거할 수 있으며, 고순도의 제품을 얻을 수 있다.

상기 방법 중 단계 1에서 직경 2mm 이하의 미세입자로 파쇄하고 단계 3의 초임계 유체는 바람직하게는 이산화탄소이며, 초임계 유체의 온도는 35 내지 80℃, 압력은 100 내지 500bar이 바람직하다. 단계 2의 추출기에 보조용매로서 에탄올, 메탄올, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드를 추가로 투입할 수 있고 이때, 보조용매의 농도는 0 내지 50% 이다.

또한, 본 발명은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 오레가노, 편백, 육계 또는 황금 등과 같은 식물이나 허브로부터 초임계 유체 추출물을 및 상기 초임계 유체 추출물로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 오레가노, 편백, 육계 및 황금을 다양한 유기용매를 이용하여 수득한 추출물 및 이로부터 분리된 항균물질이 다양한 미생물에 항균 효과가 있다고 보고된 바 있어(Lee. C.K et al., J. Korea Soc. Food Sci. Nutr., 34(10):1606~1610, 2005; F. Sahin., et al., Food Control., 15:549~557, 2004; Shang-Tzen C., et al., J. Pham., 77:123~127, 2001), 이를 근거로 오레가노, 편백, 육계 및 황금을 재료로 선택하여 열수, 유기용매 및 초임계 추출물을 제조하였다. 디스크 측정법을 이용한 생육활성 저해환 크기 및 탁도 측정법을 이용한 추출물의 최소억제농도와 IC₅₀'을 측정하여 각 추출물의 항균 및 항진균 활성을 알아본 결과, 오레가노, 편백, 육계 및 황금 초임계 추출물이 열수 추출물이나 유기용매 추출물에 비해 항균 및 항진균 활성이 월등히 높음을 확인하였다(표 3 내지 표 11).

본 발명에 따른 초임계유체추출법에 의해 추출된 추출물은 항균 및 항진균성 물질을 유효성분으로 포함하는 것으로 병원성 세균, 효모 및 곰팡이에 대하여 우수한 항균 활성을 나타낸다. 병원성 세균의 예로는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 비브리오 파라해몰라이쿠스(Vibrio paragaemolyticus), 이스체리아 콜라이0157(Ecaherichia coli 0157:H7), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 효모인 칸디다 알 비칸스(Candida albicans), 곰팡이인 아스퍼질러스 니저(Aspergillus niger)가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 초임계유체추출법을 이용한 결과, 상기와 같이 유용성분들을 손실이 없고 추출효율이 높으며 항균성이 기존 추출 방법에 의한 것보다 높은 추출물을 수득하였다. 상기 추출물은 병원성 세균, 효모 및 곰팡이에 대해 항균 및 항진균 활성을 나타내므로 초임계 유체 추출물을 함유하는 조성물은 상기 미생물에 의하여 야기되는 질병을 예방 및 치료하기 위한 용도로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 조성물 내 추출물의 일일 투여량은 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 1 내지 50 ㎎/㎏이다. 이것을 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 효과적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.

<실시예 1> 항균성 식물 추출물 제조

오레가노, 편백, 육계 및 황금을 다양한 유기 용매을 이용하여 수득한 추출물 및 이로부터 분리된 항균물질이 다양한 미생물에 항균 효과가 있다고 보고된 바 있어(Lee. C.K et al., J. Korea Soc. Food Sci. Nutr., 34(10):1606~1610, 2005; F. Sahin., et al., Food Control., 15:549~557, 2004; Shang-Tzen C., et al., J. Pham., 77:123~127, 2001), 이를 근거로 오레가노, 편백, 육계 및 황금을 재료로 선택하여 추출물을 재조하였다.

<1-1> 열수 추출방법

오레가노(월드스파이스, 한국), 편백(나폴리 농원 농부가, 한국), 육계(경동시장, 한국) 및 황금(경동시장, 한국)을 건조하여 분쇄기로 잘게 분쇄한 후 열탕에서 가열하여 식물 추출물을 얻었다. 이때 식물체의 시료를 각각 100 g에 대하여 증류수 약 2 ℓ를 첨가한 후 100℃의 열탕에서 3시간 동안 가열하여 추출하였고, 일정한 온도(90℃)를 유지하고 이 추출물을 감압 여과하여 얻은 여과액을 회전진공농축기(EYELA, N-series, Japan)로 농축하였다.

<1-2> 유기용매 추출방법

용매 추출물을 제조하기 위하여 오레가노, 편백, 육계 및 황금을 건조하여 분쇄기로 잘게 분쇄한 후 알코올에 24시간 침지하였다. 원심분리 후 상등액만 분리하여 필터 페이퍼(Filter paper Whatman NO. 4, USA)로 감압여과 하였다. 유기용매 추출액은 40℃에서 회전진공농축기(EYELA, N-series, Japan)로 감압 농축하여 시료를 제조하였다.

<1-3> 항균성 식물의 초임계 추출물 제조

오레가노, 편백, 육계 및 황금을 건조하여 파쇄한 시료 1 kg과 보조용매 에탄올(99.5%) 500~700 ㎖를 초임계 유체 추출 반응기(Natex, Autstria)에 넣고 반응기 내의 온도가 65℃, 압력이 450 bar, S/F ratio(supercritical fluid ㎏/Feed ㎏) 35가 되는 조건하에서 추출하였다.

<실시예 2> 오레가노 추출물의 항균 효과 확인

실시예 1로부터 추출된 추출물 중, 오레가노 추출물을 다양한 미생물에 대해 항균효과를 확인하고자 다음과 같은 실험을 실시하였다.

<2-1> 항균력 시험용 균주배양

초임계유체를 이용하여 추출된 추출물에 대한 항균력을 확인하기 위한 방법으로 한천배지 확산법(Disc-agar plate diffusion method)을 이용하였다. 주요 유해세균인 그람양성균인 스타필로코커스 아우레이스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스터리아 모노사이토제네시스(Listeria monocytogenes)와 그람음성균인 비브리오 파라해몰라이쿠스(Vibrio paragaemolyticus), 이스체리아 콜라이0157(Ecaherichia coli 0157:H7), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 효모인 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 곰팡이인 아스퍼질러스 니저(Aspergillus niger)를 한국미생물보존센타(Korea Culture Center of Microorganism, KCCM)에서 분양을 받았으며, 초임계 추출물의 항균 활성 검정을 위한 균주로 사용하였다. 각각의 균주 및 배양조건은 아래 표 1과 같고, 각 균주에 따라 사용한 배지와, 배지 조성물 등은 아래 표 2와 같다.

표 1: 균주 및 배양조건

균주	KCCM No.	배양온도(℃)	그람(+/-)	카테고리	배지
바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)	11315	30	+	세균	영양 한천 (Nutrient Agar)
바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)	40935	30	+	세균	영양 한천 (Nutrient Agar)
스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)	11764	37	+	세균	영양 한천 (Nutrient Agar)
리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)	40307	37	+	세균	트립틱 소이 한천 (Tryptic Soy Agar)
대장균 (Escherichia coli)		37	-	세균	루리아 베타니 한천 Luria-Bertani Agar
살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis)	12021	37	-	세균	영양 한천 (Nutrient Agar)
살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium)	11863	37	-	세균	영양 한천 (Nutrient Agar)
비브리오 파라해몰라이쿠스 (Vibrio paragaemolyticus)	11965	37	-	세균	영양 한천 (Nutrient Agar+3% NaCl)
칸디다 알비칸스 (Candida albicans)		30		효모	YM 한천 (YM Agar)
아스퍼질러스 니저 (Aspergillus niger)	11241	25		곰팡이	감자 영양 한천 (Potato Dextrose Agar)

표 2: 배지의 조성

배지	구성물	양(g)/증류수1 ℓ
영양 한천 배지 (Nutrient Agar)	Beef extract	3 g
	Peptone	5 g
	Agar	15 g
트립틱 소이 한천 (Tryptic Soy Agar)	Tryptone	5 g
	Beef extract	3 g
	Dextrose	1 g
	Agar	15 g
루리아 베타니 한천 (Luria-Bertani Agar)	Tryptone	10 g
	Yeast extract	5 g
	NaCl	5 g
영양 한천 (Nutrient Agar+3% NaCl)	Beef extract	3 g
	Peptone	5 g
	NaCl	30 g
	Agar	15 g
YM 한천 (YM Agar)	Yeast extract	3 g
	Malt extract	3 g
	Peptone	5 g
	Dextrose	10 g
	Agar	20 g
감자 영양 한천 (Potato Dextrose Agar)	Potato extract	4 g
	Dextrose	20 g
	Agar	15 g

<2-2> 디스크 확산법(Disc-diffusion method)에 의한 항균활성 확인

전 배양된 상기의 주요 유해 세균을 디스크 확산법 측정용 평판배지(세균 : Nutrient agar, Tryptic Soy Agar, Luria-Bertani Agar, 효모 : YM agar, 이상 Difco, USA)에 100㎕씩 분주하여 도말하였다. 멸균된 페이퍼 디스크(Paper disc : 직경 8 mm)를 주요 유해 세균이 도말된 평판배지에 붙인 후, 실시예 1에서 수득된 추출물을 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide)에 용해시켜 멸균된 페이퍼 디스크(Paper disc)에 1 ㎎/disc의 농도로 시료를 점적한 후 배지 위에 올려놓았다. 이 평판배지를 각 균주에 따른 적정온도에서 24시간 동안 배양한 후 생육 저지환(Clean Zone)의 크기를 측정하였다.

균주	단위 : mm
	오레가노
	SFE	SE	HWE
Bacillus subtilis	12	12	-
Bacillus cereus	10	11	-
Staphylococcus aureus	13	11	-
Listeria monocytogenes	12	10	-
Escherichia coli	10	9	-
Salmonella enteritidis	-	-	-
Salmonella typhimurium	17.5	-	-
Vibrio paragaemolyticus	10	10	-
Candida albicans	10	9	-
SFE : Supercritical Fluid extraction, SE : Solvent extraction HWE : Hot Water extraction

그 결과 표 3에 나타난 바와 같이, 열수추출물은 항균활성을 가지지 않았으며, 유기용매 추출물 보다 초임계 추출물이 항균효과가 더 뛰어났다. 특히 S. typhimurium 균에 대해서는 유기용매 추출물에서는 활성이 없는 반면 초임계 추출물에서 강한 항균 효과를 나타내었다.

<2-3> 최소억제농도 측정

탁도 측정법을 적용하여 상기 그람 양성균 4종, 그람 음성균 4종 및 효모 1종에 대한 4가지 초임계　추출물, 유기용매 추출물 및 열수 추출물의 료의 최소억제농도(Minimum Inhibition Concentration : 이하 ‘MIC')와 시료 무처리구에 대비하여 50%의 생육억제를 나타내는 시료의 농도(이하 'IC₅₀')를 결정하였다(Zgoda, J. R., Porter, J. R., Pharmaceutical Biology, 39, 221-225, 2001). 탁도 측정법은 세균의 경우 증가하면 탁도가 증가하는 것을 이용한 방법으로, 탁도 측정법에 의한 세균 생육 억제율 계산은 아래 식에 의한다.

세균 생육억제율(%)

= (무처리구의 흡광도-처리구의 흡광도)/무처리구의 흡광도 X 100

시료 균주	단위 : ㎍/㎖
	오레가노
	초임계추출(SFE)		유기용매추출(SE)		열수추출(HWE)
	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀
Bacillus subtilis	250	176.1	>500	275.4	-	-
Bacillus cereus	>500	371.9	>500	ND	-	-
Staphylococcus aureus	250	119	500	178	-	-
Listeria monocytogenes	500	290	>500	564.2	-	-
Escherichia coli	>500	488.7	>500	1851	-	-
Salmonella enteritidis	>500	831	>500	840	-	-
Salmonella typhimurium	500	232.1	>500	760	-	-
Vibrio paragaemolyticus	500	97.7	500	160.4	-	-
Candida albicans	>500	271.9	>500	857.6	-	-
SFE : Supercritical Fluid Extraction, SE : Solvent Extraction HWE : Hot Water Extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 4에 나타난 바와 같이, 오레가노 초임계 추출물은 그람 양성균에 대해서 최소억제농도가 약 500 ㎍/㎖ 이하인 반면, 유기용매 추출물은 500 ㎍/㎖이상이었다. 또한 바실러스균 및 포도상구균에 대해서는 250 ㎍/㎖의 농도에서 완전히 억제하였다.

<실시예 3> 편백 추출물의 항균 효과 확인

실시예 1로부터 추출된 편백 추출물을 항균효과를 확인하고자 실시예3에 의거하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

<3-1> 디스크 확산법에 의한 항균 활성 확인

균주	단위 : mm
	편백
	SFE	SE	HWE
Bacillus subtilis	12	12	-
Bacillus cereus	10	11	-
Staphylococcus aureus	13	11	-
Listeria monocytogenes	12	10	-
Escherichia coli	10	9	-
Salmonella enteritidis	-	-	-
Salmonella typhimurium	16.5	-	-
Vibrio paragaemolyticus	10	10	-
Candida albicans	9	8	-
SFE : Supercritical Fluid extraction, SE : Solvent extraction HWE : Hot Water extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 5에 나타난 바와 같이, 편백 초임계 추출물이 열수 추출물과 유기용매 추출물보다 우수한 항균효과를 보여주었다. 특히 살모넬라균과 포도상구균에 대해서 높은 항균효과를 나타내었다.

<3-2> 최소억제농도 측정

시료 균주	단위 : ㎍/㎖
	편백
	초임계추출(SFE)		유기용매추출(SE)		열수추출(HWE)
	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀
Bacillus subtilis	125	8.17	62.5	ND	-	-
Bacillus cereus	125	31.56	62.5	ND	-	-
Staphylococcus aureus	125	39.9	62.5	6.4	-	-
Listeria monocytogenes	>500	244.8	<31.25	ND	-	-
Escherichia coli	>500	ND	>500	ND	-	-
Salmonella enteritidis	-	-	-	-	-	-
Salmonella typhimurium	500	320.3	-	-	-	-
Vibrio paragaemolyticus	125	85.8	31.25	ND	-	-
Candida albicans	>500	442.8	>500	1121.9	-	-
SFE : Supercritical Fluid Extraction, SE : Solvent Extraction HWE : Hot Water Extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 6에 나타난 바와 같이, 편백 초임계 추출물의 최소억제농도는 바실러스균, 포도상구균 및 비브리오균에 대해서 125 ㎍/㎖의 농도를 보여주었으며, 50% 억제 농도는 8 ~ 85 ㎍/㎖ 의 농도를 보여 강한 항균활성을 지닌 것으로 확인되었다. 반면, 유기용매 추출물 또한 각 균주에 대해서 높은 항균효과를 확인하였다.

<실시예 4> 다양한 육계 추출물의 항균 효과 확인

실시예 1로부터 추출된 육계 추출물을 항균효과를 확인 하고자 실시예3에 의거하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

<4-1> 디스크 확산법에 의한 항균 활성 확인

균주	단위 : mm
	육계
	SFE	SE	HWE
Bacillus subtilis	21	10	-
Bacillus subtilis	20	9	-
Staphylococcus aureus	11	8.7	-
Listeria monocytogenes	23.7	12.2	-
Escherichia coli	17	-	-
Salmonella enteritidis	15.5	-	-
Salmonella typhimurium	26	-	-
Vibrio paragaemolyticus	22	-	-
Candida albicans	21	9	-
SFE : Supercritical Fluid extraction, SE : Solvent extraction HWE : Hot Water extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 7에 나타난 바와 같이, 육계의 초임계 추출물이 유기용매 추출물에 비해 월등히 높은 것을 알 수 있다[그람 양성균인 B. subtilis, B. subtilis L. monocytogenes과 그람음성균인 S. typhimurium, V. paragaemolyticus 에 대해서 클리어존의 직경이 20 mm 이다. 또한 효모인 C. albicans에 대해서도 초임계 추출물이 유기용매 추출물보다 우수하다는 것을 알 수 있었다.

<4-2> 최소억제농도 측정

시료 균주	단위 : ㎍/㎖
	육계
	초임계추출(SFE)		유기용매추출(SE)		열수추출(HWE)
	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀
Bacillus subtilis	250	96.1	>500	208.8	-	-
Bacillus cereus	500	78.63	>500	ND	-	-
Staphylococcus aureus	250	144.7	>500	756.8	-	-
Listeria monocytogenes	250	125.2	>500	657	-	-
Escherichia coli	>500	386.7	>500	ND	-	-
Salmonella enteritidis	500	315	>500	828.7	-	-
Salmonella typhimurium	250	130.5	>500	670.2	-	-
Vibrio paragaemolyticus	250	55.8	>500	688.5	-	-
Candida albicans	>500	151.7	>500	3584.9	-	-
SFE : Supercritical Fluid Extraction, SE : Solvent Extraction HWE : Hot Water Extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 8에 나타난 바와 같이, 최소억제농도에서 초임계추출물이 250 ~ 500 ㎍/㎖의 농도로 강한 항균효과를 보였고, 유기용매 추출물은 최소억제농도가 500 ㎍/㎖이상으로 나타났다.

<실시예 5> 다양한 황금 추출물의 항균 효과 확인

실시예 1로부터 추출된 황금 추출물을 항균효과를 확인 하고자 실시예3에 의거하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

<5-1> 디스크 확산법에 의한 항균 활성

균주	단위 : mm
	황금
	SFE	SE	HWE
Bacillus subtilis	18	17	-
Bacillus cereus	12	11	-
Staphylococcus aureus	13	12	-
Listeria monocytogenes	23.7	12	-
Escherichia coli	10	9	-
Salmonella enteritidis	-	-	-
Salmonella typhimurium	-	-	-
Vibrio paragaemolyticus	10	10	-
Candida albicans	14	11	-
SFE : Supercritical Fluid extraction, SE : Solvent extraction HWE : Hot Water extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 9에 나타난 바와 같이, 황금의 초임계 추출물이 항균 활성을 나타내었으며, 특히

<5-2> 최소억제농도 측정

시료 균주	단위 : ㎍/㎖
	황금
	초임계추출(SFE)		유기용매추출(SE)		열수추출(HWE)
	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀	MIC	IC₅₀
Bacillus subtilis	250	45.4	500	96.6	-	-
Bacillus cereus	500	50.67	500	154.5	-	-
Staphylococcus aureus	250	153	500	330	-	-
Listeria monocytogenes	>500	258.9	>500	ND	-	-
Escherichia coli	>500	896.7	>500	ND	-	-
Salmonella enteritidis	>500	ND	>500	ND	-	-
Salmonella typhimurium	>500	ND	>500	ND	-	-
Vibrio paragaemolyticus	500	45.5	500	123.8	-	-
Candida albicans	>500	156.9	>500	288.5	-	-
SFE : Supercritical Fluid Extraction, SE : Solvent Extraction HWE : Hot Water Extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 10에 나타난 바와 같이, 그람 양성균에 대해서는 황금 초임계 추출물이 유기용매 추출물보다 약 2배가량 높은 활성을 보여주었다.

<실시예 6> 항진균 활성(paper disc-diffusion method) 확인

항진균 활성은 곰팡이에 대한 항진균력을 측정하기 위하여 통상 시행되고 있는 시험 방법인 페이퍼 디스크 확산법으로 수행하였다.

<6-1> 페이퍼 디스크 확산법

PDA 배지를 멸균하여 페트리 디쉬에 약 15내지 20 ㎖씩 부어서 기층배지를 제작한 후, 한국미생물보존센타(Korea Culture Center of Microorganism, KCCM)에서 분양받은 곰팡이 균주 Aspergillus niger를 접종하여 25℃에서 2~3일간 배양하여 실험용 곰팡이 균주를 준비하였다. 곰팡이가 배양된 페트리 디쉬에 멸균된 증류수를 일정량 넣어 곰팡이를 부유 및 현탁시켜 포자를 수득하였다. PDA 배지를 멸균한 후 배지의 온도가 40℃ 정도되었을 때 PDA 배지에 상기 곰팡이 현탁액을 1%를 넣어 혼합한 다음 페트리 디쉬에 적정량을 분주하여 굳혔다. 실시예 1에서 수득한 추출물을 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 멸균된 페이퍼 디스크(직경 8mm)에 1㎎/disc의 농도로 시료를 점적한 후 배지 위에 올려놓고, 25℃에서 3일간 배양하여 생육저지환의 직경을 측정하였다. 본 실험은 3회 반복하였다.

시료 균주

오레가노

편백

육계

황금

Aspergillus niger

SFE

SE

HWE

SFE

SE

HWE

SFE

SE

HWE

SFE

SE

HWE

-

21

-

SFE : Supercritical Fluid Extraction, SE : Solvent Extraction HWE : Hot Water Extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

단위 : mm

그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 항진균 효과에서는 육계 초임계 추출물만 활성을 나타내었다.

<6-2> 최소억제농도 측정

다양한 추출물에 대한 항진균효과를 확인하기 위한 곰팡이인 아스퍼질러스 니저(Aspergillus niger)에 대한 항진균효과를 측정하였다. 구체적으로 아스퍼질러스 니저(Aspergillus niger, 한국미생물보존센타(Korea Culture Center of Microorganism, KCCM)는 멸균증류수를 이용하여 포자현탁액을 만들어 측정하였다. 5 ㎖ 테스트 튜브에 전 배양된 아스퍼질러스 니저(Aspergillus niger)를 50 ㎕씩 분주하였다. 아스퍼질러스 니저(Aspergillus niger)가 50 ㎕씩 분주된 5 ㎖ 테스트 튜브에 각 농도별로 희석한 추출물(500, 250, 125, 62.5, 31.5 ㎍/㎖)을 50 ㎕와 멸균한 배지 4.9 ㎖을 분주하였다. 이 테스트 튜브를 25℃에서 3일 동안 배양하여 흡광도 측정과 육안으로 균의 성장 유무를 관찰하여 최소억제농도와 50% 억제농도를 측정하였다. 본 실험은 3회 반복하였다.

시료 균주 : Aspergillus niger			단위 : ㎍/㎖
오레가노	SFE	MIC	>500
	SFE	IC₅₀	376.4
	SE	MIC	>500
	SE	IC₅₀	889
	HWE	MIC	-
	HWE	IC₅₀	-
편백	SFE	MIC	>500
	SFE	IC₅₀	474.6
	SE	MIC	-
	SE	IC₅₀	-
	HWE	MIC	-
	HWE	IC₅₀	-
육계	SFE	MIC	125
	SFE	IC₅₀	76.4
	SE	MIC	-
	SE	IC₅₀	-
	HWE	MIC	-
	HWE	IC₅₀	-
황금	SFE	MIC	>500
	SFE	IC₅₀	143.4
	SE	MIC	>500
	SE	IC₅₀	728.8
	HWE	MIC	-
	HWE	IC₅₀	-
SFE : Supercritical Fluid Extraction, SE : Solvent Extraction HWE : Hot Water Extraction - : Not Inhibition, ND : Not detection

그 결과 표 12에 나타난 바와 같이, 열수 추출물은 항진균 효과가 전혀 나타나지 않았으며, 유기 용매 추출물도 약간의 억제만 보여주었다. 하지만 육계 초임계 추출물은 125 ㎍/㎖에서도 완벽하게 억제하는 것을 보여주었고, 황금 초임계 추출물도 143.4 ㎍/㎖의 농도에서 50%이상 억제하는 것을 나타내었다.

상기와 같이 초임계유체추출법을 적용하면 잔류 유기용매가 없으며, 짧은 추 출 시간내에 오레가노, 편백, 육계, 황금 등과 같은 식물이나 허브로부터 유래 항균성 물질을 효율적으로 추출할 수 있으며, 식중독, 식품 부패 및 피부 점막 병변을 일으키는 미생물을 억제할 수 있는 항균성 물질을 추출하여 천연 방부제 등으로서의 식품, 의약품 및 화장품 등 다양한 산업분야에 활용될 수 있다.

Claims

4) 단계 3에서 분리된 초임계 유체는 저장조를 순환한 후 외부에서 보충되는 초임계 유체와 함께 펌프에 의해 감압하여 재순환시키고 분리된 추출물을 수거하는 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 초임계유체추출에 의한 항생물질 고함유 추출물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 1의 항균 또는 항진균성 식물 또는 허브는 오레가노, 편백, 육계 또는 황금인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 1에서 직경 2mm 이하의 미세입자로 파쇄하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 3의 초임계 유체는 이산화탄소인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 3에서 초임계 유체의 온도는 35 내지 80℃, 압력은 100 내지 500bar인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 2의 추출기에 보조용매로서 에탄올, 메탄올, 아세톤, 헥산, 에칠아세테이트 또는 메틸렌클로라이드를 추가로 투입하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 6항에 있어서, 상기 보조용매의 농도는 0 내지 50% 임을 특징으로 하는 제조방법.

항균 또는 항진균 활성을 갖는 식물 또는 허브를 이용한 초임계 유체 추출 물.

제 8항에 있어서, 식물 또는 허브는 오레가노, 편백, 육계 또는 황금인 것을 특징으로 하는 추출물.

제 8항에 있어서, 제 1항의 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 추출물.

항균 또는 항진균 활성을 갖는 식물 또는 허브의 초임계 유체 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 항균 및 항진균용 조성물.

제 11항에 있어서, 식물 또는 허브는 오레가노, 편백, 육계 또는 황금인 것을 특징으로 하는 조성물.