KR20080011232A

KR20080011232A - 수컷의 성 기능 부전을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20080011232A
Application number: KR1020077029747A
Authority: KR
Inventors: 앨러스데어 마크 네일러; 레이첼 제인 러쎌; 스티븐 데릭 알버트 스트리트; 킴-와 탱; 데르 그라프 피터 헤이드위즌 반; 크리스토퍼 피터 웨이맨
Original assignee: 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2008-01-31
Also published as: TW200302732A; CN100500658C; HK1073109A1; ZA200405208B; JP2005525321A; NZ546408A; WO2003064402A1; CN1625553A; JP2013151511A; CA2474590A1; BR0307337A; GB0202282D0; AU2003201471B2; KR20040079958A; MXPA04007434A; IL162822A; IL162822A0; EP1470115A1; PL371415A1; JP2010209075A

Abstract

약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의적으로 혼합되는 선택적인 옥시토신 길항제를 포함하는, 수컷의 사정 장애를 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물.

Description

수컷의 성 기능 부전을 치료하는 방법{TREATMENT OF MALE SEXUAL DYSFUNCTION}

본 발명은 수컷의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 치료 및/또는 예방하는데 유용한 화합물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 수컷의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 수컷의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 치료하는데 유용한 화합물을 선별하기 위한 분석법에 관한 것이다.

남성의 성 기능 부전

성 기능 부전(SD)은 남성 및 여성 둘 다에 영향을 끼칠 수 있는 심각한 임상적 문제이다. SD의 원인은 생물학적인 것일 수도 심리학적일 것일 수도 있다. SD의 생물학적인 면은 전형적으로 고혈압 또는 진성 당뇨병에 수반되는 것과 같은 하부의 혈관 질환에 의해, 처방된 투약에 의해 및/또는 우울증 같은 정신 질환에 의 해 야기된다. 심리학적인 인자는 공포, 수행 불안 및 대인 갈등을 포함한다. SD는 성 기능을 손상시키고 자존심을 감소시키며 인간관계를 붕괴시킴으로써, 개인의 고충을 야기시킨다. 병원에서, SD 장애는 여성 성 기능 부전(FSD) 장애와 남성 성 기능 부전(MSD) 장애로 나뉘어져 있다(멜맨(Melman) 등, 1999, J. Urology, 161, 5-11). FSD는 여성이 성적 표현에서 만족감을 느끼기 어렵거나 느낄 수 없는 상태로서 가장 잘 정의된다. 남성 성 기능 부전(MSD)은 통상 남성 발기 기능 장애(MED)로도 알려져 있는 발기 부전 및/또는 조루 같은 사정 장애, 불감증(오르가슴에 도달하지 못함) 또는 성욕 감소 장애(성에 대한 관심의 결여) 같은 성욕 장애와 관련되어 있다.

조루(PE)

PE는 남성에게서 비교적 통상적인 성 기능 부전이다. 이는 몇 가지 상이한 방식으로 정의되어 왔으나, 가장 널리 받아들여지는 것은 "PE는 삽입하기 전, 삽입할 때 또는 삽입한 직후, 및 환자가 사정을 원하기 전에, 최소한의 성적 자극에 의한, 일생동안 지속되거나 재발되는 사정이다. 의사는 흥분 상태를 지속시키는데 영향을 끼치는 인자(예: 연령, 성행위 상대방 또는 자극이 새로운 것인지의 여부, 및 성행위의 빈도)를 고려해야 한다. 이 장애는 대인관계에 현저한 고충을 야기시킨다"라고 한 문헌[Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders IV]의 내용이다.

국제 질환 분류 기준 10에는 다음과 같이 정의되어 있다:

"성교를 즐기기에 충분히 사정을 지연시킬 수 없으며, 다음과 같은 증상으로 나타 난다: (1) 삽입 개시 전 또는 삽입 개시 직후(시간 한도가 필요하다면, 삽입 개시 전 또는 삽입 후 15초 이내) 사정이 이루어짐; (2) 삽입이 가능할 정도로 충분히 발기되지 않은 상태에서 사정이 일어남. 이 문제는 장기간동안 성행위를 절제한 결과 발생되는 것은 아니다."

이용되는 다른 정의는 다음 기준에 기초한 분류를 포함한다:

·상대방의 오르가슴과의 관련

·삽입과 사정 사이의 지속시간

·피스톤 운동의 횟수 및 자발적인 제어 능력

심리적인 인자가 PE에 관련될 수 있는데, 성 불구 이전의 관계 장애, 불안증, 우울증은 모두 일정 역할을 한다.

추정되는 PE 유병률은 남성 인구의 약 22 내지 38%이다. 남성 발기 부전(MED)과는 달리, PE는 연령과 명확한 상관관계가 없다. 평균 유병률을 30%로 잡을 때, 미국에서 대략 2400만명이 고통을 받고 있는 것이다(1995년에 18 내지 65세의 남성은 8000만명이었다). 중증도에 기초한 유병률 데이터는 거의 없다. PE의 적용가능한 정의는 남성의 5 내지 10%에 적용될 수 있으나, 0.2% 미만이 치료를 받고 있는 것으로 추정된다. 효과적인 경구 요법을 이용할 수 있다면 이러한 상황을 바꿀 수 있을 것이다.

비뇨기과 전문의사는 현재 PE를 치료하는 의사의 대부분(59%)을 구성한다. GP는 이 질병을 치료하는 의사의 33%를 구성한다. 성 치료 전문가, 행동 치료 전문가 및 카운셀러도 PE 환자를 치료한다. 전문가들은 참가자의 50%가 상대방과의 관계에 대해 이 질병이 갖는 충격 때문에 그렇게 하는 것으로 추정한다. 스트레스, 관계의 어려움 및/또는 생활의 질에 대한 효과가, 환자가 PE를 치료하고자 하는 주요한 원인이 된다.

사정은 교감 신경계 및 부교감 신경계에 의존한다. 교감 신경계를 통한 수정관 및 부고환으로의 날신경 충동은 평활근 수축을 일으키고 정자를 후배부 요도로 이동시킨다. 정낭, 전립선 및 망울요도선의 유사한 수축으로 인해 정액의 부피 및 유체 함량이 증가한다. 척수의 오너프 핵(nucleus of Onuf)으로부터 시작되어 부교감 신경계를 통과하고 망울해면체, 좌골해면체 및 골반 저부 근육의 주기적인 수축을 야기하는 날신경 충동에 의해 정액의 배출이 매개된다. 인간에 있어서 사정의 피질 제어는 여전히 논쟁중이다. 래트에서는, 안구앞 안쪽 구역 및 시상하부의 뇌실곁핵이 사정에 관련된 것으로 보인다.

현재 PE를 치료하는데 이용될 수 있는 인가된 약제는 없다. 가장 통상적인 오프-라벨(off-label) 처방되는 약제는 항우울제(예: 클로미프라민) 및 선택적인 세로토닌 재흡수 억제제(예: 파록세틴 및 서트랄린)이다. 환자들이 이들 약제를 항우울제로 생각하기 때문에, 종종 이들 약제를 잘 받아들이지 않는다. 이들 약제는 '오프-라벨'로 사용되며, 필요할 때(즉, 'prn') 사용되면 효과적이기는 하지만, 긴 약동학적 T_max(약제를 경구 투여한 후 혈장중 최대 약제 농도에 도달하는데 걸리는 시간)로 인해 작용이 서서히 개시될 수 있다. 장기적으로 사용할 경우 이 부류의 약제에 통상적인 부작용이 나타날 수 있다. 행동 요법은 다른 처리 수단이지만 매우 효능이 있는 것은 아니며, 높은 탈락률 및 재발률을 갖는다. 더욱 효율적인 신규 요법이 필요하다.

따라서, 남성의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 치료하는 신규 방법을 찾아내는 것이 바람직하다.

본 발명은 목적은 수컷의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 치료 및/또는 예방하는데 유용한 화합물 및 약학 조성물, 수컷의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법, 및 수컷의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 치료하는데 유용한 화합물을 선별하기 위한 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 장래성 있는 발견은 선택적인 옥시토신 길항제를 투여함으로써 사정 잠재기를 증가시킬 수 있다는 것이다. 따라서, 선택적인 옥시토신 길항제를 사용함으로써, 사정 장애, 특히 조루를 치료할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 사정 잠재기를 증가시킴으로써, 바람직하게는 사정 잠재기를 거의 정상적인 수준으로 회복시킴으로써, 이를 달성할 수 있다.

구체적으로, 선택적인 옥시토신 길항제를 사용하면 발기 메카니즘, 특히 음경 발기를 유지하면서 사정 장애, 특히 조루를 치료할 수 있다.

선택적인 옥시토신 길항제로 사정 장애, 특히 조루를 치료하면, 환자의 성적 욕구(sexual drive)를 유지시키면서 이를 치료할 수 있게 된다. 본원에 사용되는 용어 "성적 욕구"는 리비도 또는 성욕을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 공지의 비-선택적인 옥시토신 길항제와 비교할 때 바람직하게는 발기 메카니즘(특히, 음경 발기) 및/또는 성적 욕구를 유지시키는 예기치 못한 이점을 갖는다.

성적 행동에서의 옥시토신의 역할

사정은 두 가지 별도의 구성요소, 즉 누정(emission) 및 사출을 포함한다. 누정은 정액과 정자가 원위 부고환, 수정관, 정낭 및 전립선으로부터 전립선 요도로 몰리는 것이다. 이렇게 몰린 다음에는 요도구멍으로부터 정액 내용물을 강력하게 압박 방출시킨다. 사정은 순전히 대뇌에서의 사건인 오르가슴과는 다르다. 종종 이 두과정이 동시에 일어나기도 한다.

말초 혈액에서의 옥시토신 박동은 포유동물에서 사정과 동시에 일어난다. 남성의 경우, 사정시 또는 사정할 즈음에 혈장중 옥시토신의 농도는 크게 증가하나, 바소프레신의 경우에는 그렇지 않다. 옥시토신은 사정 자체를 유도하지는 않는다. 이 과정은 100% 척수의 허리 영역에서 시작되는 α1-아드레날린 수용체/교감 신경을 통한 신경 제어하에 있다. 옥시토신의 전신 박동은 말초 사정 반응에 직접적인 역할을 할 수 있다. 이는 남성의 생식관 전체에 걸친 관 및 선 소엽의 수축을 조정하여, 예컨대 상이한 사정 성분의 유체 부피에 영향을 끼치는 역할을 할 수 있다. 뇌를 향해 중추신경계로 방출되는 옥시토신은 성적 행동, 흥분(오르 가슴)의 주관적 인지 및 후속 사정의 잠재기에 영향을 끼칠 수 있다. 남성에서 사정이 일어나는 것은 엄격하게 바깥 생식기관의 촉각 자극에 의존한다.

순환되는 옥시토신의 수준이 남성 및 여성 모두에서 성적 자극 및 흥분시 증가하고 오르가슴동안 최고조인 것은 잘 보고되어 있다. 머피(Murphy) 등(Acta. Anat. Basel 128: 76-79 [1987])은 성적 흥분 및 사정동안 남성의 혈장 옥시토신 및 아르기닌 바소프레신(AVP) 농도를 측정한 결과, 성적 흥분시 혈장 AVP가 상당히 증가한 반면 옥시토신은 그렇지 않음을 발견하였다. 그러나, 사정시에는, 평균 혈장 옥시토신이 약 5배 증가하였고 30분 내에 기본 농도로 돌아온데 반해, AVP는 사정시 이미 기본 수준으로 돌아와서 그 후 안정된 상태를 유지하였다.

김플(Gimpl) 및 파렌홀즈(Fahrenholz)의 문헌(Physiological Reviews Vol. 81: No. 2. 2001년 4월 pp. 629-683)에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 옥시토신은 래트, 토끼 및 원숭이에서 음경 발기를 유도하는 가장 강력한 약물중 하나인 것으로 밝혀졌다. 또한, 옥시토신의 중추 투여는 사정되기까지의 잠재기를 감소시키고 사정후 중간기를 단축시킨다고 주장되고 있다. 마찬가지로, 메스턴(Meston) 등(Arch. Gen Psychiatry, Vol. 57, 2000년 11월)은, 동물 수컷에서 옥시토신이 뇌의 특정 구역(즉, 시상하부의 뇌실주위 핵) 내로 주사되는 경우에는 음경 발기를 용이하게 하고, 중추 또는 말초 주사되는 경우에는 사정 잠재기 및 사정후 중간기를 단축시킨다고 기재하고 있다.

당해 분야에는, 옥시토신 수용제 작용제인 바소토신을 투여하면 비접촉 음경 발기를 상당히 감소시킨다는 내용이 잘 보고되어 있다(예를 들어, 멜리스(Melis) 등, Neuroscience Letters 265 (1999) 171-174 참조). 또한, 아기올라스(Argiolas) 등(European Journal of Pharmacology 149 (1988) 389-392)은, 옥시토신 길항제인 바소토신을 뇌실내(ICV) 주사한 결과, 수용성인(receptive) 암컷의 존재하에 경험이 있는 수컷 래트에서 사정이 이루어지지 않는(아마도 감소된 삽입 빈도에 의해) 등 성 기능이 손상됨을 보여주었다. 삽입 빈도의 감소는, 옥시토신 길항제가 음경 발기를 방지하는 것으로 밝혀진 바, 음경을 발기시키는 동물의 능력이 감소되었음을 반영하는 것으로 생각되었다.

김플 및 파렌홀즈, 및 메스턴 등의 상기 문헌에서는 옥시토신이 사정하기까지의 잠재기를 감소시킴을 시사하였지만, 다른 연구에서는 옥시토신이 사정 잠재기에 아무런 효과도 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 스톤햄(Stoneham) 등(J. Endocrinology 107:97-106, 1985)은, 래트에 옥시토신을 정맥내 주입하면 사정 전에 이루어지는 삽입 횟수를 의존적으로 감소시키지만 사정 잠재기에는 아무런 효과를 나타내지 않음을 보여주었다. 또한, 옥시토신을 제 3 뇌실 내로 주입하면 첫번째로 올라타서 삽입하기까지의 잠재기가 증가되고 사정후 불응기가 연장되지만, 사정 잠재기에는 아무런 효과가 없었다(스톤햄 등의 상기 문헌).

뿐만 아니라, 여러 연구들에서, 사정시 옥시토신이 증가되지 않으면 흥분 또는 오르가슴에 도달하는 시간에 아무런 차이가 생기지 않았음을 보여주었다. 머피 등의 문헌(J. of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 71, No. 4 (1990) p 1056-1058)에서는, 사정시 전형적으로 관찰되는 혈청 옥시토신 박동이 없는 경우에도, 오피오이드 길항제인 날록손이 인간 지원자들의 사정에 아무런 효과를 갖지 않음을 보여주었다. 액커맨(Ackerman) 등의 문헌(Physiol Behav 63:49-53 [1997])에서는, 큰세포 뉴런은 완전한 상태로 남겨두면서 파보세포 PVN 뉴런을 파괴하는 N-메틸-D-아스파르트산 장애가 요추(L5-L6)의 옥시토신-면역반응 섬유를 감소시켰다. 이러한 감소는 사정시 누정의 상당한 감소와 관련되었지만, 올라타기, 삽입 및 사정 잠재기는 영향을 받지 않았다.

한 양태에서, 본 발명은 남성의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 선택적인 옥시토신 길항제 화합물을 포함하는 조성물 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물에서, 선택적인 옥시토신 길항제는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의적으로 혼합된다. 이 때, 조성물(본원에 언급되는 다른 임의의 조성물과 마찬가지로)은 후에 남성의 사정 장애, 특히 조루를 치료하는데 사용하기 위해 포장될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 발기 메카니즘(특히, 음경 발기) 및/또는 성적 욕구를 유지시키면서 남성의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 선택적인 옥시토신 길항제 화합물을 포함하며, 임의적으로 약학적으로 허용가능한 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되는 조성물 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 남성의 사정 장애, 특히 조루를 치료하는데 사용하기 위한 약제(예컨대, 약학 조성물)을 제조함에 있어서의 선택적인 옥시토신 길항제의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 발기 메카니즘(특히 음경 발기) 및/또는 성적 욕 구를 유지시키면서 남성의 사정 장애, 특히 조루를 치료하는데 사용하기 위한 약제(예컨대, 약학 조성물)을 제조함에 있어서의 선택적인 옥시토신 길항제의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 남성의 사정 장애, 특히 조루를 치료하는데 사용하기 위한 약제(예컨대, 약학 조성물)을 제조함에 있어서의 선택적인 옥시토신 길항제의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 발기 메카니즘(특히, 음경 발기) 및/또는 성적 욕구를 유지시키면서 남성의 사정 장애, 특히 조루를 치료하는데 사용하기 위한 약제(예컨대, 약학 조성물)을 제조함에 있어서의 선택적인 옥시토신 길항제의 용도에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 효과량의 선택적인 옥시토신 길항제(이는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의적으로 혼합됨)를 개체에 투여함을 포함하는, 인간 또는 동물에서 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 효과량의 선택적인 옥시토신 길항제(이는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의적으로 혼합됨)를 개체에 투여함을 포함하는, 인간 또는 동물에서 발기 메카니즘(특히, 음경 발기) 및/또는 성적 욕구를 유지시키면서 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

하나 이상의 구획이 하나 이상의 선택적인 옥시토신 길항제를 포함하는, 하 나 이상의 구획을 포함하는 약학 팩(pharmaceutical pack)이 또한 제공된다.

본 발명은 또한 하나 이상의 선택적인 옥시토신 길항제를 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 혼합함을 포함하는, 본 발명에 따른 약학 조성물을 제조하는 방법도 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 시험 약물이 내인성 사정 과정을 직접 지연시킬 수 있는지의 여부를 결정함을 포함하는, 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있는 약물(이후, 선택적인 옥시토신 길항제라고 함)를 확인하는 분석 방법에 관한 것으로, 이 때 상기 지연은 본원에 정의된 시험 약물의 존재하에서 사정 잠재기(즉, 최초 삽입에서 사정까지 걸리는 시간)의 증가 및/또는 사정 잠재기의 회복으로서 정의되며, 시험 약물에 의한 이러한 효력 증가는 시험 약물이 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하는데 유용할 수 있는지의 지표이고, 상기 시험 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다. 바람직하게는, 약물은 음경 발기에 아무런 효과가 없거나 또는 실질적으로 아무런 효과가 없다. 즉, 바람직하게는, 약물은 음경 발기에 역효과를 내지 않으면서 내인성 음경 발기를 향상시킬 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 분석 방법을 수행하는 단계; (b) 사정 잠재기를 증가 및/또는 회복시킬 수 있는 하나 이상의 약물을 확인하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 확인된 약물을 다량 제조하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 이 때 상기 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다. 이 양태에서는, 단계 (b)에서 확인된 약물을 예컨대 활성을 최대화시키도록 개질시킨 후에 단 계 (a)를 반복시킬 수 있다. 목적하는 활성 또는 약동학적 프로파일이 얻어질 때까지 이들 단계를 반복할 수 있다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 (a1) 본 발명에 따른 분석을 수행하는 단계; (b1) 직접적으로 사정 잠재기를 증가 및/또는 회복시킬 수 있는 하나 이상의 약물을 확인하는 단계; (b2) 상기 확인된 하나 이상의 약물을 개질시키는 단계; (a2) 임의적으로 단계 (a1)을 반복하는 단계; 및 (c) 확인된 하나 이상의 약물(즉, 개질된 약물)를 다량 제조하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 본 발명에 따른 분석 방법을 수행하는 단계; (ii) 사정 잠재기를 증가 및/또는 회복시킬 수 있는 하나 이상의 약물을 확인하는 단계; (iii) 마취된 설치류 같은 시험 동물에서, 확인된 약물의 음경 발기에 대해 시험하는 단계; (iv) 음경 발기에 아무런 영향이 없거나 실질적으로 아무 영향이 없는 약물을 선택하는 단계; 및 (v) 하나 이상의 선택된 약물을 다량 제조하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것으로, 이 때 상기 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다. 이 양태에서, 단계 (ii)에서 확인된 약물을 예컨대 활성을 최대화시키도록 개질시킨 다음, 단계 (i)을 반복할 수 있다. 목적하는 활성 또는 약동학적 프로파일이 달성될 때까지 이들 단계를 반복할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 성적 자극을 개시한 후 15초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분 및 5분의 연속적인 시간간격에서 성적 자극동안 수컷으로부터 하나 이상의 샘플을 단리하는 단계; 샘플(들)이 수컷의 사정 장애, 바람직하게는 조루를 야기시키는 시간에 그러한 양으로 존재하는 특정 물질을 함유하는지의 여부를 결정하 는 단계를 포함하는 진단 방법에 관한 것이며, 이 때 상기 특정 물질은 약물의 사용에 의해 유리한 효과를 달성하도록, 구체적으로는 특정 물질이 나타나고/나타나거나 최대 농도로 될 때까지 걸리는 시간이 지연될 수 있도록 개질될 수 있으며, 상기 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다. 바람직하게는, 상기 특정 물질은 옥시토신이다. 예를 들어 음경 진동 자극 장치(퍼티케어(FertiCare), 덴마크 홀숌 소재)에 의해 성적 자극을 유발시켰다.

다른 양태에서, 본 발명은 수컷의 성적 자극동안 성적 자극을 개시한 후 15초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분 및 5분의 연속적인 시간간격에서 채취한 하나 이상의 단리된 수컷 샘플에서 특정 물질을 검출하기 위한 수단을 포함하는 진단 조성물 또는 키트에 관한 것이며, 이 때, 상기 수단은 샘플(들)이 수컷의 사정 장애, 바람직하게는 조루를 야기하는 시간에 그러한 양의 상기 특정 물질을 함유하는지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있고, 상기 특정 물질은 약물을 사용함으로써 유리한 효과를 얻도록, 구체적으로는 상기 특정 물질이 나타나고/나타나거나 최대 농도로 될 때까지 걸리는 시간이 지연될 수 있도록 조정될 수 있고, 상기 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다. 바람직하게는, 상기 특정 물질은 옥시토신이다. 예를 들어 음경 진동 자극 장치(퍼티케어, 덴마크 홀숌 소재)에 의해 성적 자극을 유발할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 수용적인 암컷을 도입한 후 수컷의 사정 잠재기(즉, 최초 삽입으로부터 사정까지 걸리는 시간)를 측정하는 수단을 갖는 동물 수컷을 포함하는, 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방할 수 있는 약물을 확인하는데 사용되는 동물 모델에 관한 것으로, 상기 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다.

동물 모델은 음경 발기의 변화를 측정하는 수단을 갖는 추가의 동물 모델을 포함하거나 또는 상기 추가의 동물 모델과 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 추가 모델은 음경 신경의 자극 후 상기 동물의 해면체내 압력 및/또는 해면체 혈류의 변화를 측정하는 수단을 갖는 마취된 동물 수컷을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다.

다른 양태에서, 본 발명은 약물을 본 발명의 동물 모델에게 투여하는 단계; 및 수용적인 암컷을 도입시킨 후 상기 동물의 사정 잠재기(즉, 최초 삽입으로부터 사정까지 걸리는 시간)를 측정하는 단계를 포함하는, 사정 장애, 특히 조루를 치료 또는 예방하기 위해 내인성 사정 과정을 직접 향상시킬 수 있는 약물을 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것으로, 이 때 상기 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약물을 본 발명의 동물 모델에게 투여하는 단계; 내인성 사정 과정의 변화를 측정하는 단계; 및 동물 모델의 음경 발기 및/또는 성적 욕구를 측정하여 이들에 아무런 변화가 없거나 실질적으로 아무 변화가 없음을 확인하는 단계를 포함하는, 사정 장애, 특히 조루를 치료 또는 예방하기 위하여 음경 발기 및/또는 성적 욕구에 영향을 끼치지 않으면서 내인성 사정 과정을 직접적으로 향상시킬 수 있는 약물을 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이며, 이 때 상기 내인성 사정 과정의 변화는 수용적인 암컷을 도입한 후 상기 동물의 사정 잠재기(즉, 최초 삽입으로부터 사정까지 걸리는 시간)로서 정의되고, 상기 약물은 선 택적인 옥시토신 길항제이다.

본 발명에 따른 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인, 경구적으로 생체이용가능한 비-펩타이드성 선택적인 옥시토신 수용체 길항제는 수컷의 성 기능 부전, 특히 조루 같은 사정 장애를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

보다 용이하게 참조하도록 하기 위해, 본 발명의 이들 양태 및 다른 양태를 적절한 단락 제목하에 논의한다. 그러나, 각 단락의 교시내용이 각 특정 단락으로 반드시 한정되는 것은 아니다.

용어 "선택적인 옥시토신 길항제" 및 "선택적인 옥시토신 수용체 길항제"는 상호 호환성 있으며, 바소프레신, 특히 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 선택적인 옥시토신 수용체 길항제를 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "사정 잠재기"는 최초 삽입으로부터 사정까지 걸리는 시간을 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "사정 잠재기의 회복"은 최초 삽입으로부터 사정까지 걸리는 시간이 변경(바람직하게는 증가)됨을 의미한다. 바람직하게는, 삽입으로부터 사정까지 걸리는 시간은 거의 정상적인 수준까지 변경된다(바람직하게는 증가된다). 전형적으로, 조루 환자는 성교 개시(즉, 최초 삽입) 후 30초 내에, 종종 성교 개시(즉, 최초 삽입) 후 15초 내에 사정한다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 사정 잠재기가 30초 이상, 바람직하게는 60초 이상, 더욱 바람직하게는 2분 이상, 더더욱 바람직하게는 5분 이상, 더욱 더 바람직하게는 10분 이상으로 증가된다. 적합하게는, 사정 잠재기는 삽입으로부터 사정까지 걸리는 시간이 상대방을 만족시킬 정도로 충분히 지연되도록 회복될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "성적 욕구"는 리비도 또는 성욕을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "삽입"은 음경에 의한 질 관통을 의미한다.

바람직한 양태

한 실시태양에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약물은 바람직하게는 경구 투여용이다.

다른 실시태양에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약물은 국부 투여 또는 비강내 투여용일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 약물은 조루를 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다.

바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제는 바소프레신 수용체, 특히 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적이다.

바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제는 바소프레신 수용체, 특히 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 30배 이상 선택적이다.

바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제는 바소프레신 수용체, 특히 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 50배 이상 선택적이다.

바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제는 바소프레신 수용체, 특히 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 100배 이상 선택적이다.

바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제는 바소프레신 수용체, 특히 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 200배 이상 선택적이다.

바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제는 바소프레신 수용체, 특히 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 250배 이상 선택적이다.

본 발명은 또한 성적 흥분/자극 전에 및/또는 성적 흥분/자극 동안 본 발명의 약물을 투여함을 포함한다.

따라서, 본 발명의 몇몇 양태에서는, 성적 흥분/자극 단계가 있는 것이 매우 바람직하다.

여기에서, "성적 흥분/자극"은 시각적인 흥분/자극, 신체적인 흥분/자극, 청각적인 흥분/자극 또는 상상에 의한 흥분/자극중 하나 이상일 수 있다.

따라서, 바람직하게는 본 발명의 약물이 특히 경구 전달용인 경우, 이들 약물은 성적 흥분/자극 전에 또는 성적 흥분/자극 동안 전달된다.

발탁된 양태

본 발명은 하기 (번호가 매겨진) 발탁된 양태를 제공한다:

1. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의적으로 혼합되는 선택적인 옥시토신 길항제를 포함하는, 수컷의 사정 장애를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물.

2. 제 1 양태에 있어서, 수컷의 사정 장애가 조루인 조성물.

3. 제 1 양태 또는 제 2 양태에 있어서, 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 조성물.

4. 제 3 양태에 있어서, 바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 조성물.

5. 수컷의 사정 장애를 치료하는데 사용하기 위한 약제를 제조함에 있어서의 선택적인 옥시토신 길항제의 용도.

6. 제 5 양태에 있어서, 수컷의 사정 장애가 조루인 용도.

7. 제 5 양태 또는 제 6 양태에 있어서, 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 용도.

8. 제 7 양태에 있어서, 바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 용도.

9. 제 5 양태 내지 제 8 양태중 어느 하나에 있어서, 상기 선택적인 옥시토신 길항제가 성적 흥분 전에 및/또는 성적 흥분 동안 투여되는 용도.

10. 제 5 양태 내지 제 9 양태중 어느 하나에 있어서, 상기 선택적인 옥시토신 길항제가 입을 통해 투여되는 용도.

11. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의적으로 혼합되는 선택적인 옥시토신 길항제 효과량을 개체에 투여함을 포함하는, 남성의 사정 장애 또는 동물 수컷의 사정 장애를 치료 또는 예방하는 방법.

12. 제 11 양태에 있어서, 수컷 사정 장애가 조루인 방법.

13. 제 11 양태 또는 제 12 양태에 있어서, 상기 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 방법.

14. 제 13 양태에 있어서, 바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 방법.

15. 제 11 양태 내지 제 14 양태중 어느 하나에 있어서, 상기 선택적인 옥시토신 길항제를 성적 흥분 전에 및/또는 성적 흥분 동안 투여하는 방법.

16. 제 11 양태 내지 제 15 양태중 어느 하나에 있어서, 입을 통해 약제를 투여하는 방법.

17. 하나 이상의 구획이 하나 이상의 선택적인 옥시토신 길항제를 포함하는, 하나 이상의 구획을 포함하는 약학 팩.

18. 제 17 양태에 있어서, 상기 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 약학 팩.

19. 제 18 양태에 있어서, 상기 바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 약학 팩.

20. 하나 이상의 선택적인 옥시토신 길항제를 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 혼합함을 포함하는, 약학 조성물의 제조 방법.

21. 제 20 양태에 있어서, 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 방법.

22. 제 21 양태에 있어서, 바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 방법.

23. 시험 약물이 내인성 사정 과정을 직접적으로 향상시킬 수 있는지의 여부를 결정함을 포함하는, 수컷의 사정 장애를 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있는 약물을 확인하기 위한 분석 방법으로서, 이 때 상기 향상이 본원에 정의된 바와 같은 시험 약물의 존재하에서의 사정 잠재기의 증가 및/또는 회복으로서 정의되고, 시험 약물에 의한 효력 증가가 시험 약물이 수컷의 사정 장애를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있는지에 대한 지표이며, 상기 시험 약물이 선택적인 옥시토신 길항제인 분석 방법.

24. 제 23 양태에 있어서, 상기 수컷의 사정 장애가 조루인 분석 방법.

25. 제 23 양태 또는 제 24 양태에 있어서, 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 분석 방법.

26. 제 25 양태에 있어서, 바소프레인 수용체가 V1a 수용체인 분석 방법.

27. 제 23 양태 내지 제 26 양태중 어느 하나에 따른 분석 방법에 의해 확인된 약물.

28. 제 27 양태에 있어서, 수컷의 사정 장애를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약물.

29. 제 28 양태에 있어서,

상기 수컷의 사정 장애가 조루인 약물.

30. 제 27 양태에 따른 약물을 포함하는, 수컷의 사정 장애를 치료하기 위한 경구 투여용 약제.

31. 제 30 양태에 있어서, 상기 수컷의 사정 장애가 조루인 약제.

32. 제 30 양태 또는 제 31 양태에 있어서, 성적 흥분 전에 및/또는 성적 흥분 동안에 투여되는 약제.

33. 제 30 양태 내지 제 32 양태중 어느 하나에 있어서, 입을 통해 투여되는 약제.

34. (a) 제 23 양태 내지 제 26 양태중 어느 하나에 따른 분석 방법을 수행하는 단계; (b) 사정 잠재기를 증가 및/또는 회복시킬 수 있는 하나 이상의 약물을 확인하는 단계; 및 (c) 이들 하나 이상의 확인된 약물을 다량 제조하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 약물이 선택적인 옥시토신 길항제인 방법.

35. 제 34 양태에 있어서, 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 방법.

36. 제 35 양태에 있어서, 바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 방법.

37. 수용적인 암컷을 도입한 후 동물 수컷의 사정 잠재기를 측정하는 수단을 갖는 수컷 동물을 포함하며, 이 때 상기 약물이 선택적인 옥시토신 길항제인, 수컷의 사정 장애를 치료 또는 예방할 수 있는 약물을 확인하기 위한 동물 모델.

38. 제 37 양태에 있어서, 상기 수컷의 사정 장애가 조루인 동물 모델.

39. 제 37 양태 또는 제 38 양태에 있어서, 선택적인 옥시토신 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인 동물 모델.

40. 제 39 양태에 있어서, 바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 동물 모델.

41. 제 37 양태 내지 제 40 양태중 어느 하나의 동물 모델에게 약물을 투여하는 단계; 및 수용적인 암컷을 도입한 후 상기 동물의 사정 잠재기를 측정하는 단계를 포함하되, 상기 약물이 선택적인 옥시토신 길항제인, 사정 장애를 치료 또는 예방하기 위해 내인성 사정 과정을 직접적으로 향상시킬 수 있는 약물을 확인하기 위한 분석 방법.

42. 수컷의 사정 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조/조제함에 있어서의, 하나 이상의 선택적인 옥시토신 길항제와 하나 이상의 하기 보조 활성제로 이루어진 조합의 용도:

i) 개별적인 효소에 대해 바람직하게 100nM 미만의 IC50을 갖는 PDE 저해제, 더욱 구체적으로는 PDE 5 저해제;

ii) 세로토닌 수용체 작용제 또는 조정제, 더욱 구체적으로는 5HT2C, 5HT1B 및/또는 5HT1D 수용체에 대한 작용제 또는 조정제(암피톨린 포함);

iii) 세로토닌 수용체 길항제 또는 조정제, 더욱 구체적으로는 5HT1A에 대한 길항제 또는 조정제(NAD-299(로발조탄) 및 WAY-100635 포함), 및/또는 더욱 구체적으로는 5HT3 수용체에 대한 길항제 또는 조정제(바타노피르드, 그라니세트론, 온단세트론, 트로피스트론 및 MDL-73147EF 포함);

iv) 항우울제, 구체적으로는 i) 서트랄린, 플루옥세틴, 플루복사민, 파록세틴, 시탈로프람, 벤라팍신, 미르타자핀, 네파조돈 및 트라조돈을 포함하는 선택적인 세로토닌 재흡수 억제제(SSRi); ii) 클로미프라민, 데시프라민, 이미프라민, 아미트립틸린, 독세핀, 아목사핀, 마프로틸린, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 트리미프라민 및 부프로프리온을 포함하는 삼환상 항우울제(TCA); 및 iii) 모노아민 옥시다제 저해제;

v) α-아드레날린 수용체 길항제(α-아드레날린 차단제, α-차단제 또는 α-수용체 차단제라고도 알려져 있음); 적합한 α1-아드레날린 수용체 길항제는 펜톨라민, 프라조신, 펜톨라민 메실레이트, 트라조돈, 알푸조신, 인도라민, 나프토피딜, 탐설로신, 페녹시벤즈아민, 라우월파 알칼로이드, 레코다티(Recordati) 15/2739, SNAP 1069, SNAP 5089, RS 17053, SL 89.0591, 독사조신, 테라조신 및 아바노퀼을 포함함; 적합한 α2-아드레날린 수용체 길항제는 다이벤아민, 톨라졸린, 트리마조신, 에파록산, 요힘빈, 이다족산 클로니딘 및 다이벤아민을 포함함; 적합한 비선택적인 α-아드레날린 수용체 길항제는 다피프라졸을 포함함; 다른 α-아드레날린 수용체 길항제는 WO 99/30697 호, US 4,188,390 호, US 4,026,894 호, US 3,511,836 호, US 4,315,007 호, US 3,527,761 호, US 3,997,666 호, US 2,503,059 호, US 4,703,063 호, US 3,381,009 호, US 4,252,721 호 및 US 2,599,000 호에 기재되어 있음;

vi) 신속 개시 선택적인 세로토닌 재흡수 억제제.

43. 수컷의 사정 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조/조제함에 있어서의, 하나 이상의 선택적인 옥시토신 길항제와 하나 이상의 PDE 저해제(PDEi)로 이루어진 조합의 용도.

44. 제 42 양태 또는 제 43 양태에 있어서, 상기 수컷의 사정 장애가 조루인 용도.

45. 제 43 양태 또는 제 44 양태에 있어서, 상기 PDEi가 PDE 5 저해제(PDE5i)인 용도.

46. 제 42 양태 내지 제 45 양태중 어느 하나에 있어서, 약제가 입을 통해 투여되는 용도.

47. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의적으로 혼합된, 하나 이상의 선택적인 옥시토신 길항제와 하나 이상의 PDEi로 이루어진 약학 조성물.

48. 제 47 양태에 있어서, 상기 PDEi가 PDE5i인 약학 조성물.

49. 제 47 양태 또는 제 48 양태에 있어서, 입을 통해 투여되는 약학 조성물.

50. 사정 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조함에 있어서의, 제 47 양태 내지 제 49 양태중 어느 하나에 따른 약학 조성물의 용도.

놀랍고 예기치 못한 발견

본 발명은 하기 놀랍고 예기치 못한 발견을 설명한다:

(a) 선택적인 옥시토신 길항제를 투여하면 사정 잠재기가 증가한다. 바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제의 투여는 사정 잠재기를 바람직하게는 거의 정상적인 수준으로 회복시킨다.

(b) 선택적인 옥시토신 길항제의 투여는 예기치 못하게도 발기 메카니즘, 특히 음경 발기를 실질적으로 억제하지 않고/않거나 음경 발기에 유해하게 영향을 끼치지 않으면서 사정 잠재기를 증가시킨다. 바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제의 투여는 발기 메카니즘, 특히 음경 발기를 실질적으로 억제하지 않고/않거나 음경 발기에 유해한 영향을 끼치지 않으면서 사정 잠재기를 바람직하게는 거의 정상적인 수준까지 회복시킨다.

(c) 선택적인 옥시토신 길항제의 투여는 성적 욕구를 실질적으로 억제하지 않고/않거나 성적 욕구에 유해하게 영향을 끼치지 않으면서 사정 잠재기를 증가시킨다. 바람직하게는, 선택적인 옥시토신 길항제의 투여는 성적 욕구를 실질적으로 억제하지 않고/않거나 성적 욕구에 유해한 영향을 끼치지 않으면서 사정 잠재기를 바람직하게는 거의 정상적인 수준까지 회복시킨다.

이점

본 발명은 아래와 같은 이유 때문에 유리하다:

(a) 선택적인 옥시토신 길항제를 사용하여 옥시토신 수용체를 선택적으로 저해함으로써 조루를 치료함;

(b) 선택적인 옥시토신 길항제를 사용하여 옥시토신 수용체를 선택적으로 저해함으로써 예기치 못하게도 발기 메카니즘, 특히 음경 발기를 실질적으로 억제하지 않고/않거나 음경 발기에 유해하게 영향을 끼치지 않으면서 조루를 치료함;

(c) 선택적인 옥시토신 길항제를 사용하여 옥시토신 수용체를 선택적으로 저해함으로써 예기치 못하게도 성적 욕구를 실질적으로 억제하지 않고/않거나 성적 욕구에 유해하게 영향을 끼치지 않으면서 조루를 치료함.

환자 군

사정 장애, 특히 조루 환자는 선택적인 옥시토신 길항제로 치료함으로써 혜택을 받아야 한다.

초기 연구는 하기 언급된 사정 장애, 특히 조루 환자 군이 선택적인 옥시토신 길항제(또는 이후에 기재되는 선택적인 옥시토신 길항제를 포함하는 조합)로 치료함으로써 혜택을 받아야 한다고 제안한다. 이들 환자 군은 하기 질환중 하나 이상을 앓는 환자를 포함한다: 신경계 장애, 생리적 장애, 정신 성기능 기술 결핍, 신체적 질병, 신체적 손상, 약리학적 부작용, 정신적 고충 및 관계 곤란.

옥시토신 수용체

상기 나타낸 바와 같이, 약물은 선택적인 옥시토신 길항제로서 작용할 수 있는 임의의 적합한 약물일 수 있다.

옥시토신 수용체에 대한 배경은 맥커식(Victor A. McKusick) 등에 의해 교시되었다(http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm). 상기로부터 옥시토신 수용체에 관한 아래 내용을 뽑아냈다:

"기무라(Kimura) 등(1992: Nature 356: 526-529)은 발현 클로닝에 의해 단리된 인간 옥시토신 수용체 cDNA의 구조 및 발현을 보고하였다. 코딩된 수용체는 G 단백질-결합된 수용체에 전형적인 7개의 막횡단 도메인을 갖는 388개 아미노산의 폴리펩타이드였다. 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 발현된 옥시토신 수용체는 옥시토신에 특이적으로 반응하고, 내향 막 전류를 유도하였다. 수용체의 메신저 RNA는 크기가 두 가지였는데, 가슴에서는 3.6kb였고 난소, 자궁내막 및 자궁 근육층에서는 4.4kb였다. 자궁 근육층의 mRNA 수준은 경계에서 매우 높았다. 이노우에(Inoue) 등(1994, Biol. Chem. 269: 32451-32456)은 써던 블롯에 의해 OXTR 유전자가 인간 게놈에 단카피로 존재함을 보여주었다. 동일 반응계내 형광 하이브리드 형성에 의해, 이들은 유전자가 3p26.2에 위치함을 입증하였다. 유전자는 약 17kb에 이르고, 3개의 인트론 및 4개의 엑손을 함유한다. 엑손 1 및 2는 5-프라임 비코딩 영역에 상응하며, 이의 뒤에는 수용체의 아미노산을 코딩하는 엑손 3 및 4가 있다. 12kb로 가장 큰 인트론 3은 막을 횡단하여 6회 걸치는 것으로 추정되는 도메인 바로 뒤에서 코딩 영역을 분리시킨다. 프라이머 확장 분석에 의해 입증되는 전사 출발 부위는 메티오닌 개시 코돈의 618 및 621bp 상류에 놓인다. 체세포 하이브리드의 PCR 분석 및 동일 반응계내 형광 하이브리드 형성에 의해, 시몬스(Simmons) 등(1995, Genomics 26:623-625)은 3p25에 OXTR 유전자를 부여하였다."

김플 및 파렌홀즈의 문헌(Physiological reviews Vol. 81, No. 2, 2001년 4월)에는 수용체 구조에 대한 상세한 개설이 제공되어 있다. 상기 문헌에는, 현재까지, 인간의 옥시토신 수용체(기무라 등의 상기 문헌 참조)를 코딩하는 cDNA의 단 리 및 확인에 덧붙여, 돼지(고불레브(Gorbulev) 등, Eur. J. Biochem. 215, 1-7, 1993), 래트(로즌(Rozen) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 200-204 1995), 양(릴리(Riley) 등, J. Biol. Chem. 266: 21428-21433, 1991), 소(배쓰게이트(Bathgate) 등, DNA Cell Biol. 14: 1037-1048, 1995), 마우스(구보타(Kubota) 등, Mol. Cell Endocrinol 124: 25-32, 1996) 및 붉은 털 원숭이(살바토레(Salvatore) 등, J. Receipt Signal Transduct Res. 18: 15-24, 1998)로부터의 옥시토신 수용체를 코딩하는 서열도 확인하였다고 기재되어 있다.

옥시토신 수용체 서열 데이터

인간의 옥시토신 수용체에 대한 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 문헌에서 얻을 수 있다. 예로서, 인간의 옥시토신 수용체의 아미노산 서열이 서열 번호: 1에 제공되어 있다.

선택적인 옥시토신 길항제

옥시토신 길항제를 확인 및/또는 연구하는 적합한 분석 시스템의 세부사항은 이후 "옥시토신 길항제 분석법"으로 표제가 붙은 단락에 제공된다.

적합한 옥시토신 길항제의 예가 아래에 표시되어 있다:

L-368,899

L-368,899의 합성은 윌리암스(Williams) 등의 문헌(1994, J. Med. Chem. 37, 565-571)에 교시되어 있다.

L-368,899는 선택적인 옥시토신 길항제이다. L-368,899는 바소프레신, 특히 V1a 수용체보다 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적이다. 바람직하게는, 선택성은 결합 선택성 및 기능 선택성 둘 다이다.

예를 들어 바소토신 같은 특정의 공지되어 있는 옥시토신 길항제는 종종 "선택적인 옥시토신 길항제"로 일컬어진다. 그러나, d(CH₂)₅Tyr(Me)-Orn⁸-바소토신(이후, "바소토신"이라고 함)은 바소프레신, 특히 V1a 수용체보다 옥시토신 수용체에 대해 2 내지 3배만 더 선택적이다. 이와 같이, 바소토신은 실질적으로 비선택적인 옥시토신/바소프레신 길항제이고, 본 발명에 따른 용어 "선택적인 옥시토신 길항제"의 영역에 들어가지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 선택적인 옥시토신 길항제는 바소프레신, 특히 V1a 수용체보다 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적이다.

옥시토신 길항제 결합 분석법 및 바소프레신 V1a 결합 분석법

A. 옥시토신 수용체 리간드 결합 IC50 분석법

i) 완충액

ii) 화합물 희석(분석법에서 10μM의 최종 농도)

a) 100% DMSO중 4mM의 HTA 원료(stock) 화합물

b) dH₂O중에서 200μM까지 화합물을 희석시킴

c) 100mM Tris-HCl, pH 7.8, 20mM MgCl₂중에서 100μM까지 화합물을 추가로 희석시킴. 이로써, 2.5% DMSO, 50mM Tris-HCl, pH 7.8, 10mM MgCl₂의 최종 농도가 생성된다.

d) 희석된 원료를 사용하여, TECAN Genesis를 이용하여 10개 지점 이상에서 50mM Tris-HCl, pH 7.8, 10mM MgCl₂, 2.5% DMSO 중에 1:2 희석액을 제조함.

e) 표준 (arg⁸)-바소토신 IC50을 위한 공간을 남기고 ECADA에 의해 분석하는데 필요한 플레이트 배치에 따라 384개 웰 Optiplate 내로 화합물 10㎕를 분배함. 이들 플레이트를 4℃에서 저장할 수 있다.

f) 분석하는 날, + 웰에 Max. 10㎕를 첨가하고 - 웰에 Min. 10㎕를 첨가하며, 10개 지점 이상에서 100nM의 최대 농도(최종 20nM)로 이중의 (arg⁸)-바소토신중에 1:2로 연속 희석시킴.

iii) 옥시토신 수용체-CHO 세포의 유지

·세포주를 225cm² 플라스크에서 생육 배지 50ml중에 연속 배양액으로서 일상적으로 유지시킨다.

·분자막으로부터 배지를 제거하고, PBS로 세척한 다음 세포가 해리 징후를 보일 때까지 트립신과 함께 배양함으로써, 세포를 계대 배양시킨다. 플라스크의 바닥으로부터 세포를 녹킹(knocking)시킨 후, 세포를 생육 배지에 재현탁시키고 8×10⁵세포/플라스크의 농도로 225cm² 플라스크에 접종한다.

iv) 롤러 병에서의 세포의 생육

·세포를 6×10⁶세포/병의 밀도로 10개의 850cm² 롤러 병에 접종하고 거의 한켜의 세포로 덮이게 한다.

·상기 기재된 바와 같이 트립신을 사용하여 병으로부터 세포를 제거하고, 세포를 100개의 롤러 병에 접종한다(즉, 1:10 분할비).

·다시 거의 한켜의 세포로 덮이도록 한 다음, 생육 배지를 제거하고, 40ml PBS/병을 첨가한 후 셀메이트(CellMate)를 사용하여 긁어냄으로써 수확한다. 이어, 세포 현탁액을 2000rpm으로 원심분리시키고 PBS 중에서 세척한 다음 다시 원심분리시키고, 펠렛을 -80℃에서 분취량으로 동결시킨다.

v) 막 준비

·냉동기로부터 세포 펠렛을 꺼내고 얼음상에서 해동시킨 다음, 포장된 세포 부피 1ml당 3ml의 막 준비 완충액으로 재현탁시킨다.

·기계적 균질화기를 사용하여 얼음 상에서 5초간 수회 격발시켜 현탁액을 균질화시킨 다음, 25,000×g에서 30분간 원심분리시킨다.

·원래의 포장된 세포 부피 1ml당 1ml의 동결 완충액 중에 펠렛을 재현탁시킨 다음, 현탁액을 간단히 균질화시켜 작은 덩어리를 제거한다. 단백질 농도를 측정하고, 막 현탁액을 -80℃에서 최소 5mg/ml의 분취량으로 최종 동결시킨다.

vi) 분석법

·막을 얼음상에서 해동시킨 다음 분석 완충액중에 1mg/ml로 희석시킨다. SPA 비이드를 분석 완충액중에 50mg/ml로 재현탁시킨다. 이들 농축액으로부터, 4℃에서 2시간동안 상부-대-하부 쉐이커에서 비이드 1mg당 단백질 30μg을 배양함으로써, 비이드를 막과 예비 결합시킨다. 비이드/막을 2000rpm에서 10분간 원심분리시키고, 펠렛을 3mg/ml로 재현탁시킨다.

·시그마코트(SigmaCote)로 실레인화된 팁(tip)을 사용하여 ¹²⁵I-OVTA의 모든 조작을 수행한다. 병 및 관도 모두 실레인화시킨다. 동결건조된 리간드 50μCi당 1ml의 분석 완충액에 ¹²⁵I-OVTA를 희석시킨다. 액체 섬광 계수(Wallac Counter의 프로토콜 61)를 이용하여 5㎕ 샘플을 이중으로 계수하고, 리간드의 농도를 계산한다(하기 예 참조). 이는 점착성으로 인한 리간드의 손실을 극복하기 위한 것이다. 측정된 농도를 사용하여, ¹²⁵I-OVTA를 분석 완충액 중에서 0.3nM로 희석시킨다.

예:

5㎕가 500000dpm을 나타내고 리간드의 비활성이 2200Ci/밀리몰인 경우:

농도=500000/(2.2×2200×5)nM

·멀티-드랍(Multi-drop)을 사용하여, 비이드/막 제제 20㎕를 준비된 옵티플레이트(Optiplate)에 첨가한다. 교반되는 플라스크를 사용하여 비이드/막 제제를 현탁액중에 유지시킨다. 이어, 멀티-드랍사용하여 ¹²⁵I-OVTA 20㎕를 옵티플레이트의 각 웰에 첨가한다. 실온에서 4시간동안 배양한 후, 탑카운트(TopCount) NXT를 이용하여 각 웰당 30초동안 플레이트를 계수한다.

B. 바소프레신 V1A 수용체 결합 분석법

i) 물질

·CHO 세포에 클로닝된 인간의 바소프레신 V1a 수용체: 프로테인/셀 싸이언스(Protein/cell science)

·HEPES: 시그마(H7523)

·염화마그네슘(MgCl₂): 시그마(M2670)

·소의 혈청 알부민(BSA): 시그마(A6003)

·글라이세롤: 시그마(G5150)

·프로테아제 저해제 칵테일 테이블: 로슈(Roche)(1697498)

·피어스(Pierce) BCA 단백질 분석 시약: 피어스(Pierce)(23225)

·8-Arg[페닐알라닐-3,4,5-³H]-바소프레신(³H-AVP): 넨(NEN)(NET800)

·d(CH2)5Tyr(Me)AVP[β-머캅토-β,β-사이클로펜타메틸렌 프로피온일,O-Me-Tyr²,Arg⁸]-바소프레신(βMCPVP): 시그마(V2255)

·다이메틸설폭사이드: 스토어즈(Stores)(W34)

·96개 웰이 있는 폴리프로필렌 블록: 스토어즈(D8281)

·폴리에텔린이민(PEI): 시그마(P3143)

·96개 웰이 있는 유니필터(Unifilter) 플레이트 GF/C: 패커드(Packard)(6005174)

·탑실(Topseal) A: 패커드(6005185)

·마이크로신트(Microscint)-O: 패커드(6013611)

·SR49059(UK222,633): 컴파운드 컨트롤(Compound Control)

기기: 패커드 유니필터 단위장치, 탑카운터/NXT 계수기

ii) 방법

작업 용액:

막 조제 완충액: 25mM HEPES(pH 7.4), 5mM MgCl₂, 프로테아제 저해제(50ml당 정제 1개)

동결 완충액: 25mM HEPES(pH 7.4), 5mM MgCl₂, 20% 글라이세롤

분석 완충액: 25mM HEPES(pH 7.4), 5mM MgCl₂, 0.05% BSA

세척 완충액: 25mM HEPES(pH 7.4), 5mM MgCl₂

³H-AVP: 분석 완충액중 5nM 용액(최종 분석 농도 0.5nM).

총계: ddH₂O중 25% DMSO.

NSB: 25% DMSO/ddH₂O중 10μM βMCPVP(최종 분석 농도 1μM).

STD: 1μM의 최대 농도(100nM의 최종 분석 농도)로 시작하여 30pM(3pM의 최종 분석 농도)까지 0.5 로그 단계로 계속 감소시킴으로써, 25% DMSO/ddH₂O중에 SR49059(UK222,633)를 희석시킴.

화합물: 100% DMSO중 4mM의 화합물 50㎕. 이를 dH₂O에 4배 희석시켜 25% DMSO 중 1mM의 최대농도를 만든다. 18% DMSO(희석 후 25% DMSO) 중에서 이루어지는 최초 희석(1mM 내지 300μM)을 제외하고는 25% DMSO 중에 화합물을 0.5 로그 단계로 추가로 희석시킨다. 손으로 또는 Tecan 및 프로토콜 파일 Kin28IC50dilution2.gem을 사용하여 희석시킨다. 화합물에 따라 필요한 경우 보다 낮은 농도에서 10pt IC50 곡선을 출발시키지만, 모든 약제는 100μM에서 최초로 출발하여 선별된다.

0.5% PEI: 증류된 H₂O중에서 제조된 50% PEI를 dH₂O 중에서 0.5%로 희석시킨다.

iii) 막 준비

·냉동된 세포 펠렛을 냉동기로부터 꺼내어 얼음 위에서 서서히 해동시킨다.

·원래의 포장된 세포 부피 1ml당 3ml의 막 조제 완충액을 첨가하고, 잘 분산될 때까지 얼음 상에서 5초간 수회 격발시키면서 현탁액을 폴리트론으로 균질화시킨 다음, 1000rpm에서 10분간 원심분리시킨다.

·상청액을 제거하고 얼음 위에 저장한다. 원래의 포장된 세포 부피 1ml당 추가로 3ml의 막 조제 완충액을 펠렛에 첨가하고, 얼음 위에서 균질화시킨 후, 1000rpm에서 10분간 원심분리시킨다.

·상청액을 제거하고 앞서 제거된 부피의 상청액에 첨가한 후, 25,000×g 및 4℃에서 30분간 원심분리시킨다.

·원래의 포장된 세포 부피 1ml당 동결 완충액 1ml 중에서 균질화시킴으로써, 25,000×g 펠렛을 재현탁시키고, 단백질 농도를 결정한다.

iv) 단백질 농도의 결정

·BSA를 증류된 H₂O 중에서 하기 농도로 준비한다: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 및 31.25μg/ml.

·각 BSA 용액 10㎕를 투명한 96개 웰 플레이트에 삼중으로 첨가하고(첨부 서류의 플레이트 맵 참조), 증류된 H₂O 10㎕를 3개의 블랭크 웰에 첨가한다.

·막 제제 10㎕를 막 제제의 1/3, 1/10, 1/30 및 1/100 희석액으로서 플레이트에 삼중으로 첨가한다.

·피어스 단백질 시약(50 A:1 B) 200㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분간 배양한 다음, 570nm의 흡광도 셋팅에서 안토스(Anthos) 분광 분석기에서 판독한다.

·BSA 표준 곡선으로부터, 막 제제중 단백질의 농도를 결정한다(표준 곡선의 중심에 놓인 막 제제의 희석액을 사용한다).

·막 제제를 동결 완충액 중에서 5mg/ml의 단백질 농도로 희석시킨 후, -80℃에서 200㎕ 분취량으로 동결시킨다.

v) 분석 프로토콜

·분석 시약을 제조한다(³H-AVP, βMCPVP(NSB 화합물) 및 시험 화합물-상기 작업 용액 참조). 임의의 펩타이드 용액을 얼음 위에 유지시킨다.

·플레이트 포맷은 플레이트의 별도의 이중 열에 대해 10pt IC50-4 화합물이다. 하기 시약을 96개 웰의 폴리프로필렌 블록의 적절한 웰에 첨가하고 와동시킨다.

각각의 전체 웰(T)(A1, B1, C1, D1, E12, F12, G12 & H12)에: 25㎕ ³H-AVP, 25㎕ 비히클

각각의 NSB 웰(N)(A12, B12, C12, D12, E1, F1, G1 & H1)에: 25㎕ ³H-AVP, 25㎕ βMCPVP

각각의 분석 웰에: 25㎕ ³H-AVP, 25㎕ 시험 화합물

A&B 열=STD

C&D 열=화합물 1

E&F 열=화합물 2

G&H 열=화합물 3

·막 단백질을 얼음 상에서 서서히 해동시키고 분석하기에 최적인 단백질 농도로 희석시킨다(단백질 1차방정식 결정을 위한 첨부 문서 참조)(약 100μg/ml).

·막 단백질 200㎕를 각 웰에 첨가하여 반응을 개시시키고, 블록을 실온에서 60분간 온화하게 진탕하면서 배양한다.

·0.5% PEI에 미리 담가둔 유니필터 GF/C 필터를 통해 여과하고 빙냉 세척 완충액 1ml로 3회 세척함으로써, 반응을 종결시킨다.

·필터를 55℃의 오븐에서 2시간동안 건조시키거나 또는 벤치 위에 하룻밤(∼16시간)동안 둔다.

·필터를 바닥에 밀봉시키고, 각 웰에 마이크로신트-O 30㎕를 넣는다. 이어 필터 를 탑실 A로 밀봉하고 [³H] 96개 웰의 유니필터 프로토콜 11을 이용하여 패커드 탑카운트(Bld 503/G7A)에서 계수한다.

C. 데이터 분석

ECADA에 의해 수행되는 데이터 분석

비결합을 아래와 같이 계산한다:

비결합=평균 총 cpm - 평균 NSB cpm

시험 화합물에 있어서, 수용체에 결합된 리간드의 양을 아래와 같이 표시한다:

결합률(%)=(샘플 cpm-평균 NSB cpm)/비결합 cpm×100

리간드 결합의 저해율은 아래와 같이 계산된 저해율(%)로 보고된다:

저해율(%)=100-결합률(%)

옥시토신 길항 기능 분석법 및 바소프레신 V1a 길항 기능 분석법

인간, 인간이 아닌 영장류 및 설치류로부터의 자궁 근육층의 자발적인 수축은 시험관 내에서 선택적인 옥시토신 수용체 길항작용에 민감하다(윌슨(Wilson) 등, BJOG 2001년 9월; 108(9):960-6).

인간 및 동물로부터의 자궁 근육층의 자발적인 수축의 시험관내 약리학. 인간의 자궁 근육층의 샘플을 제왕절개 부분에서 수득하였다. 등척 힘 기록을 위해 조직 스트립을 기관 욕에 현탁시켰다. 선택적인 옥시토신 수용체 길항제 및 혼합된 옥시토신/바소프레신 V1a 수용체 길항제에 대한 누적 농도 효과 곡선을 수득할 수 있다. 시험관내에서의 자발적인 자궁 근육층 수축의 저해가 관찰된다.

조합

더욱 상세하게, 본 발명은 하나 이상의 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)와, 본원에 개괄적으로 기재된 바와 같이 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 조합을 추가로 포함한다.

본 발명은 본원에 개괄적으로 기재된 바와 같이 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조함에 있어서의, 본질적으로 본 발명에 따른 선택적인 옥시토신 길항제 및 2가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)로 이루어진 조합의 용도를 추가로 포함한다.

본 발명은 본원에 개괄적으로 기재된 바와 같이 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조함에 있어서의, 본 발명에 따른 선택적인 옥시토신 길항제 및 2가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)로 이루어진 조합의 용도를 추가로 포함한다.

본 발명은 본원에 개괄적으로 기재된 바와 같이 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조함에 있어서의, 본질적으로 본 발명에 따른 선택적인 옥시토신 길항제 및 1가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)로 이루어진 조합의 용도를 추가로 포함한다.

본 발명은 본원에 개괄적으로 기재된 바와 같이 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조함에 있어서의, 본 발명에 따른 선택적인 옥시토신 길항제 및 1가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조) 로 이루어진 조합의 용도를 추가로 포함한다.

따라서, 본 발명의 다른 조합 양태는 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)를 포함하는 약학 조합(동시, 별도 또는 연속 투여됨)을 제공한다.

본 발명의 또 다른 조합 양태는 본질적으로 선택적인 옥시토신 길항제 및 2가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)로 이루어진 약학 조성물(동시, 별도 또는 연속 투여됨)을 제공한다.

본 발명의 다른 조합 양태는 선택적인 옥시토신 길항제 및 2가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)로 이루어진 약학 조성물(동시, 별도 또는 연속 투여됨)을 제공한다.

본 발명의 또 다른 조합 양태는 본질적으로 선택적인 옥시토신 길항제 및 1가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)로 이루어진 약학 조성물(동시, 별도 또는 연속 투여됨)을 제공한다.

본 발명의 또 다른 조합 양태는 선택적인 옥시토신 길항제 및 1가지 보조 활성제(적합한 예에 대한 이후의 논의 참조)로 이루어진 약학 조성물(동시, 별도 또는 연속 투여됨)을 제공한다.

보조 활성제

본 발명의 조합에 사용하기 적합한 보조 활성제는 다음과 같은 것을 포함한다:

1) PDE 저해제, 더욱 구체적으로는 PDE 5 저해제(이후 참조), 이 저해제는 바람직 하게는 개별적인 효소에 대해 100nM 미만의 IC50을 가짐;

2) 세로토닌 수용체 작용제 또는 조정제, 더욱 구체적으로는 5HT2C, 5HT1B 및/또는 5HT1D 수용체에 대한 작용제 또는 조정제(암피톨린 포함);

3) 세로토닌 수용체 길항제 또는 조정제, 더욱 구체적으로는 5HT1A에 대한 길항제 또는 조정제(NAD-299(로발조탄) 및 WAY-100635 포함) 및/또는 더욱 구체적으로는 5HT3 수용체에 대한 길항제 또는 조정제(바타노피르드, 그라니세트론, 온단세트론, 트로피스트론 및 MDL-73147EF 포함);

4) 항우울제, 구체적으로는 i) 서트랄린, 플루옥세틴, 플루복사민, 파록세틴, 시탈로프람, 벤라팍신, 미르타자핀, 네파조돈 및 트라조돈을 비롯한, 선택적인 세로토닌 재흡수 억제제(SSRi); ii) 클로미프라민, 데시프라민, 이미프라민, 아미트립틸린, 독세핀, 아목사핀, 마프로틸린, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 트리미프라민 및 부프로프리온을 비롯한, 삼환상 항우울제(TCA); 및 iii) 모노아민 옥시다제 저해제;

5) α-아드레날린 수용체 길항제(α-아드레날린 차단제, α-차단제 또는 α-수용체 차단제로도 알려져 있음); 적합한 α1-아드레날린 수용체 길항제는 펜톨라민, 프라조신, 펜톨라민 메실레이트, 트라조돈, 알푸조신, 인도라민, 나프토피딜, 탐설로신, 페녹시벤즈아민, 라우월파 알칼로이드, 레코다티 15/2739, SNAP 1069, SNAP 5089, RS 17053, SL 89.0591, 독사조신, 테라조신 및 아바노퀼을 포함하고; 적합한 α2-아드레날린 수용체 길항제는 다이벤아민, 톨라졸린, 트리마조신, 에파록산, 요힘빈, 이다족산 클로니딘 및 다이벤아민을 포함하며; 적합한 비선택적인 α-아드레 날린 수용체 길항제는 다피프라졸을 포함하고; 다른 α-아드레날린 수용체 길항제는 WO 99/30697 호, US 4,188,390 호, US 4,026,894 호, US 3,511,836 호, US 4,315,007 호, US 3,527,761 호, US 3,997,666 호, US 2,053,059 호, US 4,703,063 호, US 3,381,009 호, US 4,252,721 호 및 US 2,599,000 호에 기재되어 있다(상기 특허는 각각 본원에 참고로 인용되어 있다);

6) 예컨대 3-[(다이메틸아미노)메틸]-4-[4-(메틸설판일)페녹시]벤젠설폰아마이드(WO 01/72687 호의 실시예 28에 개시되어 있음) 같은 신속 개시 선택적인 세로토닌 재흡수 억제제(신속 개시 SSRI).

본 발명에 따라 사용될 수 있는 상기 특허 및 특허원에 포함된 화합물에 대한 본원에서의 교차 참조에 의해, 본 발명자들은 청구의 범위(구체적으로는 청구항 1)에 정의된 바와 같은 치료 활성 화합물 및 특정 예(이들은 모두 본원에 참고로 인용됨)를 나타낸다.

활성제의 조합이 투여되는 경우, 이들은 동시에, 별도로 또는 연속해서 투여될 수 있다.

보조 활성제- PDE 5 저해제

본 발명에 따라 사용하기 적합한 cGMP PDE5 저해제는 아래 화합물을 포함한다:

EP-A-0463756 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-0526004 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; 국제 특허 공개 WO 93/06104 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; 국제 특허 공개 WO 93/07149 호에 개시된 이성질체 피라졸로 [3,4-d]피리미딘-4-온; 국제 특허 공개 WO 93/12095 호에 개시된 퀴나졸린-4-온; 국제 특허 공개 WO 94/05661 호에 개시되어 있는 피리도 [3,2-d]피리미딘-4-온; 국제 특허 공개 WO 94/00453 호에 개시된 퓨린-6-온; 국제 특허 공개 WO 98/49166 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; 국제 특허 공개 WO 99/54333 호에 개시되어 있는 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-0995751 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-4-온; 국제 특허 공개 WO 00/24745 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-0995750 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-4-온; 국제 특허 공개 WO 95/19978 호에 개시된 화합물; 국제 특허 공개 WO 99/24433 호에 개시되어 있는 화합물; 및 국제 특허 공개 WO 93/07124 호에 개시된 화합물.

국제 특허 공개 WO 01/27112 호에 개시되어 있는 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; 국제 특허 공개 WO 01/27113 호에 개시된 피라졸로 [4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-1092718 호에 개시된 화합물; 및 EP-A-1092719 호에 개시된 화합물.

본 발명에 따라 사용하기 바람직한 유형 V 포스포다이에스터라제 저해제(=포스포다이에스터라제 5 (PDE) 저해제; PDE5i)는 다음 화합물을 포함한다:

1-[[3-(6,7-다이하이드로-1-메틸-7-옥소-3-프로필-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)-4-에톡시페닐]설폰일]-4-메틸피페라진으로도 알려져 있는 5-[2-에톡시-5-(4-메틸-1-피페라진일설폰일)페닐]-1-메틸-3-n-프로필-1,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(실데나필)(EP-A-0463756 호 참조);

5-(2-에톡시-5-모폴리노아세틸페닐)-1-메틸-3-n-프로필-1,6-다이하이드로-7H-피라 졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(EP-A-0526004 호 참조);

3-에틸-5-[5-(4-에틸피페라진-1-일설폰일)-2-n-프로폭시페닐]-2-(피리딘-2-일)메틸-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 98/49166 호 참조);

3-에틸-5-[5-(4-에틸피페라진-1-일설폰일)-2-(2-메톡시에톡시)피리딘-3-일]-2-(피리딘-2-일)메틸-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 99/54333 호 참조);

3-에틸-5-{5-[4-에틸피페라진-1-일설폰일]-2-([(1R)-2-메톡시-1-메틸에틸]옥시)피리딘-3-일}-2-메틸-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온으로도 알려져 있는 (+)-3-에틸-5-[5-(4-에틸피페라진-1-일설폰일)-2-(2-메톡시-1(R)-메틸에톡시)피리딘-3-일]-2-메틸-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 99/54333 호 참조);

1-{6-에톡시-5-[3-에틸-6,7-다이하이드로-2-(2-메톡시에틸)-7-옥소-2H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일]-3-피리딜설폰일}-4-에틸피페라진으로도 알려져 있는 5-[2-에톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설폰일)피리딘-3-일]-3-에틸-2-[2-메톡시에틸]-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 01/27113 호, 실시예 8 참조);

5-[2-아이소-뷰톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설폰일)피리딘-3-일]-3-에틸-2-(1-메틸피페리딘-4-일)-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 01/27113 호, 실시예 15 참조);

5-[2-에톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설폰일)피리딘-3-일]-3-에틸-2-페닐-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 01/27113 호, 실시예 66 참조);

5-(5-아세틸-2-프로폭시-3-피리딘일)-3-에틸-2-(1-아이소프로필-3-아제티딘일)-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 01/27112 호, 실시예 124 참조);

5-(5-아세틸-2-뷰톡시-3-피리딘일)-3-에틸-2-(1-에틸-3-아제티딘일)-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(WO 01/27112 호, 실시예 132 참조);

(6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-헥사하이드로-2-메틸-6-(3,4-메틸렌다이옥시페닐)-피라지노[2',1':6,1]피리도[3,4-b]인돌-1,4-다이온(IC-351), 즉 국제 특허 공개 WO 95/19978 호의 실시예 78 및 95의 화합물, 및 실시예 1, 3, 7 및 8의 화합물;

1-[[3-(3,4-다이하이드로-5-메틸-4-옥소-7-프로필이미다조[5,1-f]-아스-트라이아진-2-일)-4-에톡시페닐]설폰일]-4-에틸피페라진으로도 알려져 있는 2-[2-에톡시-5-(4-에틸-피페라진-1-일-1-설폰일)-페닐]-5-메틸-7-프로필-3H-이미다조[5,1-f][1,2,4]트라이아진-4-온(바데나필), 즉 국제 특허 공개 WO 99/24433 호의 실시예 20, 19, 337 및 336의 화합물; 및

국제 특허 공개 WO 93/07124 호의 실시예 11의 화합물(EISAI); 및

로텔라(Rotella D P)의 문헌[J. Med. Chem., 2000, 43, 1257]으로부터의 화합물 3 및 14.

본 발명과 함께 사용될 수 있는 다른 유형의 cGMP PDE5 저해제는 다음과 같은 화합물을 포함한다: 4-브로모-5-(피리딜메틸아미노)-6-[3-(4-클로로페닐)-프로폭시]-3(2H)피리다진온; 1-[4-[(1,3-벤조다이옥솔-5-일메틸)아미노]-6-클로로-2-퀴노졸린일]-4-피페리딘-카복실산, 일나트륨염; (+)-시스-5,6a,7,9,9,9a-헥사하이드 로-2-[4-(트라이플루오로메틸)-페닐메틸-5-메틸-사이클로펜트-4,5]이미다조[2,1-b]퓨린-4(3H)온; 푸라즐로실린; 시스-2-헥실-5-메틸-3,4,5,6a,7,8,9,9a-옥타하이드로사이클로펜트[4,5]-이미다조[2,1-b]퓨린-4-온; 3-아세틸-1-(2-클로로벤질)-2-프로필인돌-6-카복실레이트; 3-아세틸-1-(2-클로로벤질)-2-프로필인돌-6-카복실레이트; 4-브로모-5-(3-피리딜메틸아미노)-6-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)-3-(2H)피리다진온; 1-메틸-5-(5-모폴리노아세틸-2-n-프로폭시페닐)-3-n-프로필-1,6-다이하이드로-7H-피라졸로(4,3-d)피리미딘-7-온; 1-[4-[(1,3-벤조다이옥솔-5-일메틸)아미노]-6-클로로-2-퀴나졸린일]-4-피페리딘카복실산, 일나트륨염; 파마프로젝츠(Pharmaprojects) 4516번(글락소 웰컴(Glaxo Wellcome)); 파마프로젝츠 5051번(바이엘(Bayer)); 파마프로젝츠 5064번(교와 하코(Kyowa Hakko); WO 96/26940 호 참조); 파마프로젝츠 5069번(쉐링 플라우(Schering Plough)); GF-196960(글락소 웰컴); E-8010 및 E-4010(에이사이(Eisai)); Bay-38-3045 & 38-9456(바이엘) 및 Sch-51866.

문헌에 기재된 방법을 이용하여 임의의 특정 cGMP PDE5 저해제의 효능 및 선택성을 평가한 다음, 표준 약학 관행에 따라 그의 독성, 흡수율, 대사, 약동학 등을 평가함으로써, 상기 cGMP PDE5 저해제의 적합성을 용이하게 결정할 수 있다.

바람직하게는, cGMP PDE5 저해제는 100nM 미만, 더욱 바람직하게는 50nM 미만, 더더욱 바람직하게는 10nM 미만의 IC₅₀을 갖는다.

cGMP PDE5 저해제의 IC50 값은 아래 시험 방법 단락의 PDE5 분석법을 이용하 여 결정될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 약학 조합에 사용되는 cGMP PDE5 저해제는 PDE5 효소에 대해 선택적이다. 바람직하게는, 이들은 PDE3보다 100 이상, 더욱 바람직하게는 300 이상 더 큰 PDE5의 선택성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, PDE5는 PDE3 및 PDE4보다 100 이상, 더욱 바람직하게는 300 이상 더 큰 선택성을 갖는다.

선택성 비는 당해 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

상기 공개된 특허원의 내용, 특히 그에 기재된 일반식 및 예시된 화합물이 본원에 참고로 인용됨을 알아야 한다.

해면체

본원에 사용되는 용어 "해면체"는 그 자체로 음경에서 발견되는 조직의 덩어리를 일컫는다. 이와 관련하여, 음경 몸체는 3개의 원통형 조직 덩어리로 구성되어 있으며, 이들 각각은 백색막이라고 불리는 섬유상 조직으로 둘러싸여 있다. 쌍을 이룬 뒤쪽 주변 덩어리는 해면체 음경(corpora=주요 몸체; cavernosa=속이 빈)으로 불리고; 보다 작은 중심부 덩어리인 요도 해면체 음경은 해면 요도를 함유하고 사정시 해면 요도를 개방된 상태로 유지시키는 기능을 한다. 이들 세 덩어리 모두 근막 및 피부로 둘러싸여 있고, 혈액 공동에 의해 침투되는 발기 조직으로 구성된다. 해면체는 평활근 세포를 포함한다.

사정

사정은 2가지 별도의 구성요소, 즉 누정 및 사출을 포함한다. 누정은 정액과 정자가 원위 부고환, 수정관, 정낭 및 전립선으로부터 전립선 요도로 몰리는 것 이다. 이렇게 몰린 다음에는 요도구멍으로부터 정액 내용물을 강력하게 압박 방출시킨다. 사정은 순전히 대뇌에서의 사건인 오르가슴과는 다르다. 종종 이 두 과정이 동시에 일어나기도 한다.

음경 발기

본원에 사용되는 용어 "음경 발기"는 시각적, 촉각적, 청각적, 후각적일 수 있거나 상상에 의한 것일 수 있는 자극을 받을 때, 음경으로 공급되는 동맥이 확장되고 다량의 혈액이 혈액 공동으로 들어가는 상태를 일컫는다. 이들 공간의 확장은 음경에서 나가는 정맥을 압축하게 되고, 따라서 혈액 유출이 느려진다. 부교감 반사에 기인한 이러한 혈관 변화가 발기를 일으킨다. 동맥이 수축되고 정맥의 혈압이 경감될 때 음경은 이완 상태로 돌아간다.

평활근

본원에 사용되는 용어 "평활근"은 중공 내부 기관의 벽에 위치하고 자율 운동 신경 세포에 의해 지배되는 평활근 섬유(세포)로 이루어진, 수축에 특수한 조직을 일컫는다. 용어 "평활근"은 무늬가 없어서 매끈한 외관을 나타내는 근육을 의미한다. 이는 또한 불수의 근육이라고도 불린다. 평활근 세포질의 Ca² ⁺의 농도가 증가되면 횡문근에서와 같이 수축이 시작된다. 그러나, 평활근에는 근육세포질 세망(횡문근의 Ca² ⁺의 저장용기)이 부족하다. 칼슘 이온은 세포외 유체 및 근육세포질 세망으로부터 평활근 세포질 내로 유입되지만, 평활근 섬유에는 가로 세관이 없기 때문에, Ca² ⁺가 섬유 중심의 필라멘트에 도달하여 수축 과정을 촉발시키는데 더 욱 긴 시간이 걸린다. 이는 부분적으로 느리게 시작되고 장시간 지속되는 평활근의 수축의 이유가 된다.

수축 및 이완

몇몇 메카니즘이 평활근 세포의 수축 및 이완을 조절한다. 한 메카니즘에서는, 칼모덜린으로 불리는 조절 단백질이 세포질의 Ca² ⁺와 결합한다. 칼슘 이온은 평활근 섬유에 서서히 들어갈 뿐만 아니라 흥분이 감소될 때 근육 섬유로부터 서서히 빠져나오기 때문에, 이완을 지연시킨다. 세포질 내에 Ca² ⁺가 장시간 존재하면 평활근 긴장, 즉 지속적인 부분 수축 상태를 제공하게 된다. 평활근 조직은 혈관, 폐로 향하는 기도, 위장, 담낭관, 방광, 음경의 해면체 및 음핵 같은 중공 내부 기관의 벽에 위치한다.

치료

본원에서 치료를 언급하면 이는 하나 이상의 치료, 경감 및 예방 처치를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

성적 자극

본 발명은 또한 성적 자극 전에 및/또는 성적 자극 동안 선택적인 옥시토신 길항제(및 적용가능한 경우 보조 활성제)를 투여함을 통한 상기 정의된 용도를 포괄한다. 여기에서, 용어 "성적 자극"은 "성적 흥분"과 같은 의미일 수 있다. 본 발명의 이 양태는 전신(생리적) 선택성을 제공하기 때문에 유리하다.

따라서, 본 발명에 따르면, 몇몇 단계에서는 성적 자극 단계가 존재하는 것 이 매우 바람직하다. 여기에서, "성적 자극"은 시각적인 자극, 육체적인 자극, 청각적인 자극 또는 상상에 의한 자극중 하나 이상일 수 있다.

약물

본 발명에 따라 수컷의 사정 장애, 특히 조루를 치료하는데 사용하기 위한 약물은 선택적인 옥시토신 길항제 및 적절한 경우 선택적인 옥시토신 길항제와 이전에 상세하게 기재한 보조 활성제의 조합으로서 작용할 수 있는 임의의 적합한 약물일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "약물"는 옥시토신 수용체를 선택적으로 저해할 수 있는 임의의 물질을 포함한다.

이러한 약물(즉, 상기 정의된 바와 같은 약물)는 유기 화합물 또는 다른 화학물질일 수 있다. 이 물질은 아미노산 서열 또는 그의 화학적 유도체일 수도 있다. 약물은 센스 서열 또는 안티-센스 서열일 수 있는 뉴클레오타이드 서열일 수도 있다. 약물은 항체일 수도 있다.

따라서, 용어 "약물"는 천연이든 아니든 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있거나 생성될 수 있는 화합물을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.

약물은 디자인될 수 있거나, 또는 펩타이드 및 다른 화합물(예: 납 화합물 같은 작은 유기 분자)을 포함할 수 있는 화합물의 라이브러리로부터 수득할 수 있다.

예로서, 약물은 천연 물질, 생물학적 거대분자, 또는 세균, 진균 또는 동물(특히 포유동물) 세포 또는 조직 같은 생물체로부터 제조된 추출물, 유기 또는 무기 분자, 합성 약물, 반합성 약물, 구조적 또는 기능적 유사체, 펩타이드, 펩타이 드 유사체, 유도화된 약물, 전 단백질로부터 분할된 펩타이드 또는 합성 방법에 의해(예컨대, 펩타이드 합성기를 사용하여 또는 재조합 기법에 의해, 또는 이들의 조합에 의해) 합성된 펩타이드, 재조합 약물, 항체, 천연 또는 비-천연 약물, 융합 단백질 또는 그의 등가물, 이들의 돌연변이체, 유도체 또는 조합일 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "약물"는 단일 물질일 수 있거나 또는 약물의 조합일수 있다.

약물이 유기 화합물인 경우, 몇몇 용도에서는 유기 화합물이 전형적으로 둘 이상의 연결된 하이드로카빌기를 포함할 수 있다. 몇몇 용도에서, 바람직하게는 이 약물은 둘 이상의 환상 기(임의적으로는, 이들 환상기 중 하나가 융합된 환상 고리 구조일 수 있다)를 포함한다. 몇몇 용도에서는, 환상 기중 하나 이상이 헤테로환상 기이다. 일부 용도에서는, 바람직하게는 헤테로환상 기가 고리에 하나 이상의 N을 포함한다. 이러한 화합물의 예가 본원에 기재되어 있다.

약물은 비-분지쇄 또는 분지쇄일 수 있는 하나 이상의 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킬렌 및 알켄일렌기를 함유할 수 있다.

치환

불확실함을 피하기 위하여, 달리 표시되지 않는 한, 용어 치환된은 하나 이상의 정의된 기로 치환됨을 의미한다. 기가 다수의 다른 기로부터 선택될 수 있는 경우, 선택된 기는 동일하거나 상이할 수 있다. 불확실함을 피하기 위하여, 용어 독립적으로는 하나보다 많은 치환기가 다수의 가능한 치환기로부터 선택될 때, 이들 치환기가 동일하거나 상이할 수 있음을 의미한다.

약학적으로 허용가능한 염

약물은 산부가염 또는 염기 염 같은 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 수화물을 비롯한 용매화물의 형태일 수 있고/있거나 이러한 형태로 투여될 수 있다. 적합한 염에 대해 살펴보기 위해서는, 버지(Berge) 등의 문헌(J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19)을 참조한다.

전형적으로, 약학적으로 허용가능한 염은 적절한 경우 목적하는 산 또는 염기를 사용함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 염은 용액으로부터 침전되어 여과에 의해 수거될 수 있거나, 또는 용매의 증발에 의해 회수될 수 있다.

적합한 산부가염은 비독성 염을 형성하는 산으로부터 제조되며, 예로는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 설페이트, 비설페이트, 나이트레이트, 포스페이트, 하이드로젠 포스페이트, 아세테이트, 말리에이트, 퓨마레이트, 락테이트, 타르트레이트, 시트레이트, 글루코네이트, 석시네이트, 사카레이트, 벤조에이트, 메테인설포네이트, 에테인설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트 염이 있다.

적합한 염기 염은 비독성 염을 생성시키는 염기로부터 형성되며, 예로는 나트륨, 칼륨, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연 및 다이에탄올아민염이 있다.

다형체 (들)/비대칭 탄소(들)

약물은 다형체로 존재할 수 있다.

약물은 하나 이상의 비대칭 탄소원자를 함유할 수 있고, 따라서 둘 이상의 입체 이성질체 형태로 존재한다. 약물이 알켄일 또는 알켄일렌기를 함유하는 경우 에는, 시스(E) 및 트랜스(Z) 이성질체가 발생될 수 있다. 본 발명은 약물의 개별적인 입체 이성질체, 및 적절한 경우 이들의 개별적인 호변이성질체 형태를 이들의 혼합물과 함께 포함한다.

통상적인 기법에 의해, 예를 들어 약물 또는 그의 적합한 염 또는 유도체의 입체 이성질체 혼합물의 분별 결정화, 크로마토그래피 또는 H.P.L.C.에 의해, 부분입체 이성질체 또는 시스 이성질체와 트랜스 이성질체를 분리할 수 있다. 약물의 개별적인 거울상 이성질체는 상응하는 광학적으로 순수한 중간체로부터, 또는 적합한 키랄 지지체를 사용하여 상응하는 라세미체를 H.P.L.C.하는 것과 같은 분할에 의해, 또는 상응하는 라세미체와 적합한 광학 활성 산 또는 염기의 반응에 의해 형성되는 부분입체 이성질체 염의 분별 결정화에 의해 제조될 수 있다.

동위원소에 의한 변화

본 발명은 또한 약물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 적합한 동위원소 변형체를 모두 포함한다. 본 발명의 약물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 동위원소 변형체는 하나 이상의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만 천연에서 통상적으로 발견되는 원자 질량과는 상이한 원자 질량을 갖는 원자로 대체된 것으로서 정의된다. 약물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염 내로 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F 및 ³⁶Cl 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오르 및 염소의 동위원소를 포함한다. 약물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 특정 동위원소 변형체, 예를 들어 ³H 또는 ¹⁴C 같은 방사성 동위원소가 혼입된 것은 약제 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 삼중수소(즉, ³H) 및 탄소-14(즉, ¹⁴C) 동위원소가 제조 및 검출의 용이성 때문에 특히 바람직하다. 또한, 중수소(즉, ²H) 같은 동위원소로 치환되면, 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여 요구량에 기인한 특정 치료 이점을 제공할 수 있으며, 따라서 일부 상황에서는 바람직할 수 있다. 약물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 동위원소 변형체는 적합한 시약의 적절한 동위원소 변형체를 사용하는 기존의 절차에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.

전구약제

당해 분야의 숙련자는 약물이 전구약제로부터 유도될 수 있음을 알게 될 것이다. 전구약제의 예는 특정의 보호된 기(들)를 갖고 그 자체로는 약리학적 활성을 갖지 않지만 특정 상황에서는 투여(예컨대, 경구 또는 비경구)된 후 체내에서 대사되어 약리학적 활성 약물을 형성할 수 있는 물질을 포함한다.

전구-잔기( pro - moiety )

예를 들어 분드가드(Bundgaard)의 문헌("Design of Prodrugs", Elsevier, 1985)(이의 내용은 본원에 참고로 인용됨)에 기재된 바와 같은 "전구-잔기"로 알려진 특정 잔기가 약물의 적절한 작용기에 위치할 수 있음을 또한 알게 될 것이다. 이러한 전구약제도 본 발명의 영역 내에 포함된다.

저해제/길항제

선택적인 옥시토신 길항제와 관련하여 본원에 사용되는 용어 길항제는 용어 저해제와 상호 호환적인 것으로 간주되어야 한다. 마찬가지로, 예로서 이전에 기재된 보조 활성제(적용가능한 경우, PDEi 또는 PDE5i 화합물 같은)와 관련하여 본원에 사용되는 용어 저해제는 용어 길항제와 상호 호환적인 것으로 간주되어야 한다.

본원에 사용되는 용어 "길항제"는 다른 약물 또는 표적의 작용을 감소시키는 임의의 약물을 의미한다. 길항 작용은 길항되는 성분의 결합(화학적 길항 작용) 또는 상이한 표적을 통한 반대 효과의 생성(기능적 길항 작용 또는 생리적 길항 작용) 또는 관찰되는 효과로의 표적 활성화와 연관된 결합 부위에 대한 경쟁(간접적인 길항 작용)으로부터 야기될 수 있다.

약학 조성물

본 발명은 또한 치료 효과량의 본 발명의 약물 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제(이들의 조합을 포함함)를 포함하는 약학 조성물도 제공한다.

약학 조성물은 인간용 약제 및 수의학적 약제에서의 인간 또는 동물 용도를 위한 것일 수 있으며, 전형적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료 용도에 허용가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro 편집, 1985))에 기재되어 있다. 약학 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도되는 투여 경로 및 표준 약학 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서, 또는 담 체, 부형제 또는 희석제에 덧붙여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다.

보존제, 안정화제, 염료 및 향미제를 약학 조성물에 제공할 수 있다. 보존제의 예는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스터를 포함한다. 산화방지제 및 현탁제도 사용될 수 있다.

상이한 전달 시스템에 따라 상이한 조성/배합 조건이 있을 수 있다. 예로서, 본 발명의 약학 조성물은 미니-펌프를 사용하여, 또는 예컨대 비강 스프레이 또는 흡입을 위한 에어로졸 또는 섭취가능한 용액으로서 점막 경로에 의해, 또는 예를 들어 조성물이 정맥내, 근육내 또는 피하 경로에 의해 전달되는 주사가능한 형태로 배합되는 비경구 경로에 의해 전달되도록 배합될 수 있다. 다르게는, 배합물은 두 경로 모두에 의해 전달되도록 디자인될 수 있다.

약물이 위장관 점막을 통해 점막 전달되는 경우, 이는 위장관을 통해 운송되는 동안 안정한 상태를 유지할 수 있어야 한다. 예를 들어, 약물은 단백질 분해에 의한 열화에 저항성이어야 하고, 산성 pH에서 안정해야 하며, 담즙의 세제 효과에 저항성이어야 한다.

적절한 경우, 약학 조성물은 흡입에 의해, 좌약 또는 페서리(pessary)의 형태로, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말의 형태로 국부적으로, 피부 패치를 사용하여, 전분 또는 락토즈 같은 부형제를 함유하는 정제 형태 또는 활성제 단독 또는 부형제와 혼합되어 캡슐 또는 오뷸(ovule)로, 또는 향미제 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있거나, 또는 이들은 비경 구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 주사될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 조성물은 다른 성분, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성으로 만들기에 충분한 염 또는 모노사카라이드를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 설측 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지의 형태로 투여될 수 있다.

몇몇 실시태양의 경우, 본 발명의 약물은 또한 사이클로덱스트린과 함께 사용될 수 있다. 사이클로덱스트린은 약제 분자와 포함 및 비-포함 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 약제-사이클로덱스트린 복합체의 형성은 약제 분자의 용해도, 용해 속도, 생체 이용률 및/또는 안정성을 변경시킬 수 있다. 약제-사이클로덱스트린 복합체는 통상 대부분의 투여형 및 투여 경로에 유용하다. 약제과의 직접적인 복합체 형성에 대한 대안으로서, 사이클로덱스트린은 보조 첨가제, 예를 들어 담체, 희석제 또는 가용화제로서 사용될 수 있다. 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린이 가장 통상적으로 사용되며, 적합한 예는 WO-A-91/11172 호, WO-A-94/02518 호 및 WO-A-98/55148 호에 기재되어 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 약물은 전신(예: 경구, 협측, 설하) 전달되며, 더욱 바람직하게는 경구 전달된다.

따라서, 바람직하게는 약물은 경구 전달에 적합한 형태이다.

투여

용어 "투여"는 바이러스 기법 또는 비-바이러스 기법에 의한 전달을 포함한다. 바이러스 전달 메카니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스-연계 바이러 스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바쿨로바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 비-바이러스 전달 메카니즘은 지질 매개되는 형질 감염, 리포좀, 면역 리포좀, 리포펙틴, 양이온성 안면 친양쪽성 화합물(CFA) 및 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 약물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로는 예컨대 약물이 의도되는 투여 경로 및 표준 약학 관행과 관련하여 선택되는 적합한 약학 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합될 때 약학 조성물로서 투여된다.

예를 들어, 약물은 즉시-방출, 지연-방출, 변형-방출, 지속-방출, 펄스-방출 또는 조절-방출 용도를 위한, 향미제 또는 착색제를 함유할 수 있는 정제, 캡슐, 오뷸, 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다(예컨대 경구 또는 국부).

정제는 미정질 셀룰로즈, 락토즈, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 이염기성 인산칼슘 및 글라이신 같은 부형제; 전분(바람직하게는 옥수수 전분, 감자 전분 또는 타피오카 전분), 소듐 전분 글라이콜레이트, 크로스카멜로즈 소듐 및 특정 복합 실리케이트 같은 붕해제; 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈(HPMC), 하이드록시프로필셀룰로즈(HPC), 슈크로즈, 젤라틴 및 아라비아 검 같은 과립화 결합제를 함유할 수 있다. 또한, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글라이세릴 베헤네이트 및 활석 같은 윤활제가 포함될 수 있다.

유사한 유형의 고체 조성물이 젤라틴 캡슐의 충전제로서 사용될 수도 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제는 락토즈, 전분, 셀룰로즈, 유당 또는 고분자량 폴 리에틸렌 글라이콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르의 경우에는, 약물을 다양한 감미제 또는 향미제, 착색제 또는 염료, 유화제, 현탁제, 및 물, 에탄올, 프로필렌 글라이콜 및 글라이세린 같은 희석제, 및 이들의 조합과 혼합할 수 있다.

투여(전달) 경로는 경구(예컨대, 정제, 캡슐 또는 섭취가능한 용액으로서), 국부, 점막(예를 들어, 비강 스프레이 또는 흡입용 에어로졸로서), 비강, 비경구(예컨대, 주사가능한 형에 의해), 위장관, 척수내, 복강내, 근육내, 정맥내, 자궁내, 안내, 진피내, 두개내, 기관내, 질내, 뇌실내, 뇌내, 피하, 눈(유리체내 또는 전방내), 경피, 직장, 협측, 음경, 질, 경막외, 설하중 하나 이상을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

모든 약물이 동일한 경로에 의해 투여되어야 할 필요는 없음을 알아야 한다. 마찬가지로, 조성물이 하나보다 많은 활성성분을 포함하는 경우, 이들 성분은 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약물이 비경구 투여되는 경우, 이러한 투여의 예는 약물을 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 뇌실내, 요도내, 복장내, 두개내, 근육내 또는 피하 투여하고/하거나 주입 기법을 이용하는 것중 하나 이상을 포함한다.

비경구 투여의 경우, 다른 성분, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성으로 만들기에 충분한 염 또는 글루코즈를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 약물이 가장 잘 사용된다. 수용액은 필요한 경우 적합하게 완충되어야(바람직하게는 pH 3 내지 9까지) 한다. 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 표준 약학 기법에 의해 멸균 조건 하에서 적합한 비경구 배합물을 용이하게 제조한다.

표시된 바와 같이, 본 발명의 약물은 비강내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있으며, 건조 분말 흡입기, 또는 적합한 추진제, 예를 들어 다이클로로다이플루오로메테인, 트라이클로로플루오로메테인, 다이클로로테트라플루오로에테인, 하이드로플루오로알케인(예: 1,1,1,2-테트라플루오로에테인(HFA 134A; 등록상표) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로페인(HFA 227EA; 등록상표)), 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하는 가압된 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 칭량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 투여 단위가 결정될 수 있다. 가압된 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기는 예컨대 용매로서 에탄올과 추진제의 혼합물을 사용하는 활성 화합물의 용액 또는 현탁액(이는 윤활제, 예를 들어 솔비탄 트라이올리에이트를 추가로 함유할 수 있음)을 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예컨대 젤라틴으로 제조됨)는 약물과 적합한 분말 기제(예: 락토즈 또는 전분)의 분말 혼합물을 함유하도록 배합될 수 있다.

다르게는, 본 발명의 약물은 좌약 또는 페서리의 형태로 투여될 수 있거나, 또는 이는 겔, 하이드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말의 형태로 국부 투여될 수 있다. 본 발명의 약물은 또한 예컨대 피부 패치를 사용함으로써 진피 또는 경피 투여될 수 있다. 이들은 또한 폐 또는 직장 경로에 의해 투여될 수도 있다. 이들은 또한 눈 경로에 의해 투여될 수도 있다. 눈 용도의 경우, 화합물을 임의적으로는 벤질알코늄 클로라이드 같은 보존제와 함께 등장성의 pH 조정된 멸균 염수중의 미분된 현탁액으로서, 또는 바람직하게는 등장성의 pH 조정된 멸균 염수중의 용액으로서 배합할 수 있다. 다르게는, 이들은 바셀린 같은 연고로 배합될 수 있다.

피부에 국부 투여하는 경우, 본 발명의 약물은 예컨대 광유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글라이콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물중 하나 이상과의 혼합물에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유하는 적합한 연고로서 배합될 수 있다. 다르게는, 이는 예를 들어 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글라이콜, 액체 파라핀, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스터 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜 및 물중 하나 이상의 혼합물에 현탁 또는 용해된 적합한 로션 또는 크림으로서 배합될 수 있다.

본 발명의 조성물은 직접 주사에 의해 투여될 수 있다.

몇몇 용도에서, 바람직하게는 약물은 경구 투여된다.

몇몇 용도에서, 바람직하게는 약물은 국부 투여된다.

투여 수준

전형적으로, 의사는 개별 환자에게 가장 적합한 실제 투여량을 결정한다. 임의의 특정 개체에 대해 특이적인 투여 수준 및 투여 빈도는 변화될 수 있고, 사용되는 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 그 화합물의 작용 시간, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이, 투여 방식, 투여 시간, 분비 속도, 약제 조합, 특정 질환의 중증도 및 개별적으로 진행되는 요법을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다. 본 발명의 약물 및/또는 약학 조성물은 1일에 1회 내지 10회(예: 1일에 1회 또는 2회)의 투약 계획에 따라 투여될 수 있다.

인간에게 경구 및 비경구 투여하는 경우, 약물의 1일 투여 수준은 단일 투여 또는 분할 투여일 수 있다.

필요에 따라, 약물을 0.01 내지 30mg/kg 체중, 예컨대 0.1 내지 10mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1mg/kg 체중의 투여량으로 투여할 수 있다. 당연히, 본원에 언급된 투여량은 평균적인 경우의 예이다. 물론, 보다 더 높은 투여량 또는 보다 더 낮은 투여량이 유리한 개별적인 경우가 있을 수 있다.

전형적으로, 1일 경구 투여량은 예컨대 20 내지 1000mg, 바람직하게는 50 내지 300mg일 수 있다.

제형화

본 발명의 약물은 당해 분야에 공지되어 있는 기법을 이용하여 하나 이상의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제중 하나 이상과 혼합함으로써 약학 조성물로 제형화될 수 있다.

아래에는 제형의 몇몇 비제한적인 예가 기재되어 있다.

제형 1: 하기 구성성분을 사용하여 정제를 제조한다.

성분들을 블렌딩하고 압축시켜, 각각 중량이 665mg인 정제를 형성한다.

제형 2: 정맥내 배합물을 아래와 같이 제조할 수 있다:

개체

본원에서 사용되는 용어 "개체"는 척추동물, 특히 포유동물의 일원을 일컫는다. 이 용어는 가축, 경주용 동물, 영장류 및 인간을 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다.

생체 이용률

바람직하게는, 본 발명의 화합물(및 조합)은 경구 투여되어 생체내에서 이용된다. 경구 투여된 후의 생체 이용률은 전신 순환되는 경구 투여된 약제의 비율을 말한다. 약제의 경구 투여된 후의 생체 이용률을 결정짓는 인자는 용해도, 막 투과율 및 대사 안정성이다. 전형적으로는, 먼저 시험관 내 기법, 이어 생체내 기법을 이용하는 일련의 선별법을 이용하여 경구 투여된 후의 생체 이용률을 결정한다.

위장관(GIT)의 수성 내용물에 의한 약제의 용해, 가용화는 GIT를 모방하는 적절한 pH에서 수행되는 시험관내 용해도 실험으로부터 예측될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 50mg/ml의 최소 용해도를 갖는다. 문헌(Adv. Drug Deliv. Rev. 23, 3-25, 1997)에 기재되어 있는 것과 같이 당해 분야에 공지되어 있는 표준 절차에 의해 용해도를 결정할 수 있다.

막 투과율은 GIT의 세포를 통한 화합물의 통과를 일컫는다. 친유성은 이를 예측하는데 핵심적인 특성이고, 유기 용매 및 완충액을 사용한 시험관내 Log D₇ _.4 측정치로서 정의된다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 -2 내지 +4, 더욱 바람직하게는 -1 내지 +2의 Log D₇ _.4를 갖는다. 문헌(J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42:144)에 기재되어 있는 것과 같은, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 절차에 의해 log D를 결정할 수 있다.

CaCO₂ 같은 세포 분자막 분석은 p-당단백질 같은 유출 수송체의 존재하에 바람직한 막 투과율, 소위 caco-2 플럭스를 예측하는데 실질적으로 도움이 된다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 2×10^-6cms^-1보다 크고, 더욱 바람직하게는 5×10^-6cms^-1보다 큰 caco-2 플럭스를 갖는다. caco 플럭스 값은 문헌(J. Pharm. Sci. 1990, 79, 595-600)에 기재되어 있는 것과 같은, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 절차에 의해 결정될 수 있다.

대사 안정성은 흡수 과정동안 화합물을 대사시킬 수 있는 GIT 또는 간의 능력을 다룬다: 약제 첫번째 통과 효과. 미세소체, 간세포 등과 같은 분석 시스템은 대사 책임량을 예측한다. 바람직하게는, 실시예의 화합물은 0.5 미만의 간 추출치가 적당한 분석 시스템에서 대사 안정성을 나타낸다. 분석 시스템 및 데이터 조작의 예는 문헌(Curr. Opin. Drug Disc. Devel., 201, 4, 36-44, Drug Met. Disp., 2000, 28, 1518-1523)에 기재되어 있다.

상기 과정들의 상호작용 때문에, 동물에서의 생체내 실험에 의해 약제가 인 간에게 경구 투여된 후 생체내에서 효율적이라는 추가의 증거를 얻어낼 수 있다. 화합물을 별도로 또는 혼합하여 경구 경로에 의해 투여함으로써, 이들 연구에서 절대 생체 이용률을 결정한다. 절대 결정치(흡수 %)를 얻기 위해서 정맥내 경로도 이용된다. 동물에서 경구 투여된 후의 생체 이용률을 평가하는 방법의 예는 문헌(Drug Met. Disp., 2001, 29, 82-87; J. Med Chem., 1997, 40, 827-829; Drug Met. Disp., 1999, 27, 221-226)에서 찾아볼 수 있다.

화학적 합성 방법

전형적으로는, 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 선택적인 옥시토신 길항제(및/또는 적용가능한 경우 PDEi/PDE5i)는 화학적 합성 기법에 의해 제조된다.

약제 또는 표적, 또는 그의 변형체, 동족체, 유도체, 분절 또는 유사체는 약물을 합성하는 화학적 방법을 전체적으로 또는 부분적으로 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 고상 기법에 의해 합성되고, 수지로부터 분할되며, 예비 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다(예를 들어, 크레이턴(Creighton), (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co., 뉴욕주 뉴욕). 합성 펩타이드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열 결정에 의해 확인될 수 있다(예컨대, Edman degradation procedure; 크레이턴, 상기 문헌).

다양한 고상 기법(로버지(Roberge JY) 등, (1995) Science 269: 202-204)을 이용하여 약물, 또는 그의 변형체, 동족체, 유도체, 분절 또는 유사체를 직접 합성할 수 있고, 예컨대 제조업체에서 제공하는 지시서에 따라 ABI 43 1 A 펩타이드 합 성기(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 자동화된 합성을 달성할 수 있다. 또한, 약물 또는 그의 임의의 일부를 포함하는 아미노산 서열은 직접 합성 동안 변화될 수 있고/있거나 화학적 방법을 이용하여 다른 서브유닛으로부터의 서열 또는 그의 임의의 일부와 결합됨으로써, 변형 약물 또는 표적, 예를 들어 변형 옥시토신 수용체를 생성시킬 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에서는, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 화학적 방법(카러써즈(Caruthers MH) 등, (1980), Nuc Acids Res Symp Ser 214-23; 호른(Horn T) 등, (1980), Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)을 이용하여 약물 표적 또는 그의 변형체, 동족체, 유도체, 분절 또는 유사체의 코딩 서열을 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다.

유사체

본원에 사용되는 용어 "유사체"는 표적(즉, 옥시토신 수용체)에 대한 관련 약물(즉, 선택적인 옥시토신 길항제)와 동일한 활성 또는 효과를 갖는 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 다른 유기 화합물을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 임의의 화학 물질에 관한 것이다. 다시 말해, 유사체는 공지 약물과 기능상 동일할 수 있다.

화학적 유도체

본원에 사용되는 용어 "유도체" 또는 "유도된"은 약물의 화학적 개질을 포함한다. 이러한 화학적 변형의 예는 수소를 할로기, 알킬기, 아실기 또는 아미노기로 대체하는 것일 수 있다.

화학적 개질

본 발명의 한 실시태양에서, 약물은 화학적으로 개질된 약물일 수 있다.

약물의 화학적 개질은 약물과 표적 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스(Van Der Waals) 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을 향상시키거나 감소시킬 수 있다.

한 양태에서, 확인된 약물은 다른 화합물을 개발함에 있어서 모델(예컨대, 주형)로서 작용할 수 있다.

표적

본 발명의 한 양태에서는, 옥시토신 수용체를 억제할 수 있는 약물을 밝혀내기 위한 선별시 표적으로서 옥시토신 수용체를 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 표적은 서열 번호: 1에 도시된 아미노산 서열, 또는 재조합 수단 및/또는 합성 수단에 의해 제조된 그의 변형체, 동족체, 유도체 또는 분절, 또는 이들을 포함하는 발현체를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서는, 옥시토신 수용체를 선택적으로 억제할 수 있는 약물을 밝혀내기 위한 선별시 표적으로서 옥시토신 수용체 및 바소프레신(특히, V1a) 수용체를 둘 다 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 옥시토신 수용체 표적은 서열 번호: 1에 도시된 아미노산 서열, 또는 재조합 수단 및/또는 합성 수단에 의해 제조된 그의 변형체, 동족체, 유도체 또는 분절, 또는 이들을 포함하는 발현체를 포함할 수 있고, 바소프레신 수용체 표적은 서열 번호: 2에 도시된 아미노산 서열, 또는 재조합 수단 및/또는 합성 수단에 의해 제조된 그의 변형체, 동족체, 유도체 또는 분절, 또는 이들을 포함하는 발현체를 포함할 수 있다.

다르게는, 옥시토신 수용체의 선택적인 저해를 통해 사정 잠재기 증가를 매개할 수 있는 약물을 밝혀내기 위한 표적으로서 옥시토신 수용체 및/또는 바소프레신 수용체(바람직하게는, V1a 수용체)를 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 표적은 적합한 조직 추출물일 수 있다.

표적은 심지어 이러한 조직 및/또는 재조합 표적의 조합일 수도 있다.

재조합 방법

본 발명의 약물 및/또는 표적은 재조합 DNA 기법에 의해 제조될 수 있다.

한 실시태양에서, 바람직하게 약물은 선택적인 옥시토신 길항제이다. 재조합 DNA 기법에 의해 옥시토신 길항제를 제조할 수 있다.

아미노산 서열

본원에 사용되는 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩타이드" 및/또는 용어 "단백질"과 같은 뜻이다. 일부 경우에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩타이드"와 같은 뜻이다. 몇몇 경우에서, 용어"아미노산 서열"은 "단백질"과 같은 의미이다.

아미노산 서열은 적합한 공급원으로부터 단리되어 제조될 수 있거나, 또는 이는 합성될 수 있거나, 또는 이는 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 약물 및/또는 이들의 유도체를 확인하기 위한 분석법에서 표적(즉, 옥시토신 수용체 또는 바소프레신(바람직하게는 V1a) 수용체)으로서 작용할 수 있는 아미노산 서열을 제공한다.

제 2 양태에서, 본 발명은 옥시토신 수용체를 선택적으로 저해할 수 있는 약물인 아미노산 서열을 제공한다.

바람직하게는, 표적은 옥시토신 수용체이다.

바람직하게는, 옥시토신 수용체 및/또는 바소프레신(바람직하게는, V1a) 수용체는 단리된 수용체이고/이거나 정제되고/되거나 천연적으로 발생된 것이 아니다.

본 발명의 옥시토신 수용체 또는 바소프레신(바람직하게는 V1a) 수용체는 실질적으로 단리된 형태일 수 있다. 옥시토신 수용체 또는 바소프레신 수용체를, 수용체 및/또는 약물의 의도된 목적을 방해하지 않고 마찬가지로 실질적으로 단리된 것으로 간주되는 담체 또는 희석제와 혼합할 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 옥시토신 수용체 또는 바소프레신 수용체는 실질적으로 순수한 형태일 수 있으며, 이 경우 이는 일반적으로 제제 중의 옥시토신 수용체 또는 바소프레신 수용체의 90% 이상, 예컨대 95%, 98% 또는 99%가 각각 서열 번호: 1에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 변형체, 동족체, 유도체 또는 분절, 또는 서열 번호: 2에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 변형체, 동족체, 유도체 또는 분절을 갖는 펩타이드인 제제중에 옥시토신 수용체 또는 바소프레신 수용체를 포함한다.

뉴클레오타이드 서열

본원에 사용되는 용어 "뉴클레오타이드 서열"은 용어 "폴리뉴클레오타이드"와 같은 의미이다.

뉴클레오타이드 서열은 게놈성, 합성 또는 재조합 공급원의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 이들의 조합을 나타내는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.

몇몇 용도에서, 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 DNA이다.

몇몇 용도에서, 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA 기법을 사용함으로써 제조된다(예컨대, 재조합 DNA).

일부 용도에서는, 바람직하게 뉴클레오타이드 서열은 cDNA이다.

몇몇 용도에서, 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 천연 발생되는 것과 동일할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 약물 및/또는 그의 유도체를 확인하기 위한 분석법에서 표적으로서 작용할 수 있는 성분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명의 한 양태에서, 뉴클레오타이드 서열은 옥시토신 수용체를 코딩한다.

본 발명의 다른 양태에서, 뉴클레오타이드 서열은 바소프레신 수용체, 바람직하게는 V1a 수용체를 코딩한다.

본 발명의 한 양태에서, 뉴클레오타이드 서열은 옥시토신 수용체를 선택적으로 저해할 수 있는 약물을 코딩한다.

당해 분야의 숙련자는 다수의 상이한 뉴클레오타이드 서열이 유전 암호의 축퇴로 인해 동일한 표적(즉, 옥시토신 수용체, 예를 들어 서열 번호: 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 옥시토신 수용체, 또는 바소프레신 수용체, 예컨대 서열 번호: 2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 바소프레신 수용체)을 코딩할 수 있음을 알 것이다. 또한, 당해 분야의 숙련자가 일상적인 기법을 이용하여, 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 활성에 실질적으로 영향을 끼치지 않아, 표적이 발현되어야 하는 임의의 특정 숙주 생물의 코돈 사용을 반영하는 뉴클레오타이드 치환체를 제조할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열과 관련된 용어 "변형체", "동족체" 또는 "유도체"는 서열로부터 또는 서열로 하나(이상)의 핵산을 임의적으로 치환, 변형, 변경, 대체, 결실 또는 첨가하여, 생성된 뉴클레오타이드 서열이 본 발명에 따른 기능성 표적(즉, 옥시토신 수용체)(또는 심지어는 상기 약물이 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 본 발명에 따른 약물까지도)을 코딩하도록 함을 포함한다.

변형체 /동족체/유도체

본원에 언급된 특정 아미노산 서열에 덧붙여, 본 발명은 또한 그의 변형체, 동족체 및 유도체의 사용을 포괄한다. 여기에서, 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.

이와 관련하여, 동족 서열은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2에 도시된 아미노산 서열과 75, 85 또는 90% 이상, 바람직하게는 95 또는 98% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하도록 취해진다. 특히, 상동성은 전형적으로 활성에 필수적인 것으로 알려진 서열의 영역과 관련하여 생각되어야 한다. 상동성은 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)의 관점에서 생각되어야 하지만, 본 발명과 관련하여서는 서열 동일성의 관점에서 상동성을 표현하는 것이 바 람직하다.

상동성 비교는 육안으로 수행할 수 있거나, 더욱 통상적으로는, 쉽게 구입가능한 서열 비교 프로그램을 사용하여 상동성 비교를 수행할 수 있다. 이들 시판중인 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 사이의 상동성 %을 계산할 수 있다.

상동성 %는 연속적인 서열에서 계산될 수 있다. 즉, 한 서열을 다른 서열과 정렬시킨 후 한 서열의 각 아미노산을 다른 서열의 상응하는 아미노산과 직접 비교한다(한 번에 하나의 잔기). 이를 "갭이 없는(ungapped)" 정렬이라고 한다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 비교적 적은 수의 잔기에서만 수행된다.

이는 매우 간단하고 일관성 있는 방법이지만, 예를 들어 다른 점에서는 동일한 서열 쌍에서, 하나의 삽입 또는 결실에 의해 뒤이은 아미노산 잔기가 정렬되지 않게 되어, 전체적으로 정렬시킬 때 상동성(%)이 크게 감소될 가능성이 있음을 고려하지 못하고 있다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체적인 상동성 성적을 과도하게 손상시키지 않으면서 가능한 삽입 및 결실을 고려하여 최적으로 정렬시키도록 디자인된다. 국부적인 상동적을 최적화시키고자 서열 정렬에 "갭"을 넣음으로써 이를 달성한다.

그러나, 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬시 발생되는 각 갭에 "갭 페널티(gap penalty)"를 부여하여, 동일한 수의 동일한 아미노산의 경우, 가능한한 적은 갭을 갖는 서열 정렬(비교되는 두 서열 사이의 보다 높은 관련성을 반영함)이 많은 갭을 갖는 것보다 높은 성적을 달성하게 된다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 손실을 부담시키고 갭내의 후속 잔기 각각에 대해 보다 작은 페널티를 지우는 "관련 갭 손 실"을 전형적으로 이용한다. 이는 가장 통상적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 보다 적은 갭을 갖도록 최적 정렬시킬 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티를 조정할 수 있도록 되어 있다. 그러나, 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 사용할 때에는 디폴트(default) 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG 위스콘신 베스트핏(Wisconsin Bestfit) 패키지(아래 참조)를 사용할 때에는, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티가 갭에 대해 -12이고, 각각의 연장부에 대해 -4이다.

따라서, 최대 상동성 %의 계산에는 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적으로 정렬시키는 것이 필요하다. 이렇게 정렬시키는데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏 패키지(유니버시티 오브 위스콘신, 유에스에이; 데브룩스(Devereux) 등, 1984, Nucleic Acids Research 12:387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 블라스트(BLAST) 패키지(오스벨(Ausubel) 등, 1999 동일한 문헌 18장 참조), 파스타(FASTA)(애츠철(Atschul) 등, 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 비교 수단의 진웍스(GENEWORKS) 스위트(suite)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 블라스트 및 파스타는 오프라인 및 온라인 검색에 이용가능하다(오스벨 등, 1999, 동일한 문헌, 페이지 7-58 내지 7-60 참조). 그러나, GCG 베스트핏 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. 블라스트 2 시퀀시즈(Sequences)라고 불리는 새로운 수단도 단백질 및 뉴틀레오타이드 서열을 비교하는데 이용될 수 있다(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).

최종 상동성 %는 동일성의 관점에서 측정될 수 있지만, 정렬 과정 자체는 전형적으로 전부가 아니면 모두 포기하는(all-or-nothing) 쌍 비교에 기초하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화 거리에 기초한 각 쌍 비교에 점수를 부여하는, 등급이 있는 유사성 점수 매트릭스를 일반적으로 사용한다. 통상적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스-프로그램의 블라스트 스위트에 대한 디폴트 매트릭스-이다. GCG 위스콘신 프로그램은 통상적으로 공개적인 디폴트 값 또는 공급된다면 관습 부호 비교 테이블을 이용한다(더 이상의 세부사항에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조). GCG 패키지에 대해 공개적인 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.

소프트웨어가 최적 정렬을 생성시키고 나면, 상동성 %, 바람직하게는 서열 동일성 %를 계산할 수 있다. 소프트웨어는 전형적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하며, 수치 결과를 만들어낸다.

서열은 침묵 변화를 발생시키고 기능면에서는 동일한 물질을 생성시키는 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 물질의 부수적인 결합 활성이 유지되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 친양쪽성의 유사성에 기초하여 신중한 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전되는 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전되는 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 선단(head)기를 갖는 아미노산은 류신, 아이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.

예컨대 아래 표에 따라 보수적인 치환이 이루어질 수 있다. 두번째 칼럼의 동일한 블록 및 바람직하게는 세번째 칼럼의 동일한 줄에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:

본 발명은 또한 염기성에 대해 염기성, 산성에 대해 산성, 극성에 대해 극성 등과 같이 유사한 것끼리 치환되는 동족 치환(본원에서 치환 및 대체는 존재하는 아미노산 잔기가 다른 잔기로 상호교환됨을 의미함)을 포괄한다. 한 부류의 잔기가 다른 부류의 잔기로 치환되거나, 또는 오르니틴(이후 Z로 일컬어짐), 다이아미노뷰티르산 오르니틴(이후, B로 일컬어짐), 노류신 오르니틴(이후, O라고 함), 피리일알라닌, 티엔일알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신 같은 비-천연 아미노산이 포함되는 비-동족 치환도 이루어질 수 있다.

알파^* 및 알파-이치환된^* 아미노산, N-알킬 아미노산^*, 락트산^*, 트라이플루오로티로신^* 같은 천연 아미노산의 할라이드 유도체, p-Cl-페닐알라닌^*, p-Br-페닐알라닌^*, p-I-페닐알라닌^*, L-알릴-글리신^*, β-알라닌^*, L-α-아미노뷰티르산^*, L- γ-아미노 뷰티르산^*, L-α-아미노 아이소뷰티르산^*, L-ε-아미노 카프로산^#, 7-아미노 헵탄산^*, L-메티오닌 설폰^#*, L-노류신^*, L-노발린^*, p-나이트로-L-페닐알라닌^*, L-하이드록시프롤린^#, L-티오프롤린^*, 4-메틸-Phe^* 같은 페닐알라닌(Phe)의 메틸 유도체, 펜타메틸-Phe^*, L-Phe(4-아미노)^#, L-Tyr(메틸)^*, L-Phe(4-아이소프로필)^*, L-Tic(1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카복실산)^*, L-다이아미노프로피온산^# 및 L-Phe(4-벤질)^*을 포함하는 비-천연 아미노산에 의해 대체될 수도 있다. * 표시는 유도체의 소수성을 표시하기 위해 상기 논의(동족 또는 비-동족 치환에 대한)에 사용되었고, 반면 #는 유도체의 친수성을 나타내기 위해 사용되었으며, #*는 양쪽성을 나타낸다.

변형 아미노산 서열은 아미노산 스페이서(예: 글리신 또는 β-알라닌 잔기)에 덧붙여 서열의 임의의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기(메틸, 에틸 또는 프로필기 같은 알킬기 포함)를 포함할 수 있다. 변형의 다른 유형은 펩토이드(peptoid) 형태의 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하고, 당해 분야의 숙련자가 잘 알고 있다. 불확실성을 피하기 위하여, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환기가 α-탄소보다는 잔기의 질소원자 상에 있는 변형 아미노산 잔기를 지칭하는데 사용된다. 펩토이드 형의 펩타이드를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, 사이먼(Simon RJ)등, PNAS (1992) 89(20), 9367- 9371; 및 하월(Horwell DC), Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134).

하이브리드 형성

본원에 사용되는 용어 "하이브리드 형성"은 "염기 짝짓기를 통해 핵산 가닥이 상보적인 가닥과 결합되는 과정" 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기법으로 수행되는 증폭 과정을 포함한다.

본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들의 상보 서열과 선택적으로 하이브리드 형성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 통상 20개 이상, 바람직하게는 25개 이상 또는 30개 이상, 예컨대 40개 이상, 60개 이상 또는 100개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 본원에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 상응하는 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 대해 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 또는 98% 이상 상동성이다.

용어 "선택적으로 하이브리드 형성할 수 있는"이란, 프로브로서 사용되는 뉴클레오타이드 서열이, 표적 뉴클레오타이드 서열이 배경 수준보다 상당히 더 높은 수준으로 프로브와 하이브리드 형성하는 것으로 밝혀진 조건하에서 사용됨을 의미한다. 배경 하이브리드 형성은 예컨대 검색되는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에 존재하는 다른 뉴클레오타이드 서열 때문에 발생될 수 있다. 이 경우, 배경은 표적 DNA에서 관찰되는 특이적인 상호작용에 비해 10배, 바람직하게는 100배 덜 강력한, 라이브러리의 비-특이적 DNA 구성원과 프로브 사이의 상호작용에 의해 발생되 는 신호 수준을 나타낸다. 상호작용의 세기는 예컨대 프로브를 예를 들어 ³²P로 방사성 라벨링시킴으로써 측정할 수 있다.

버저(Berger) 및 킴멜(Kimmel)의 문헌(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, 캘리포니아주 샌 디에고)에 교시된 바와 같이, 하이브리드 형성 조건은 핵산 결합 복합체의 융점(Tm)에 기초하고, 아래 설명되는 엄격성(stringency)을 부여한다.

최대 엄격성은 전형적으로 약 Tm-5℃(프로브의 Tm보다 5℃ 낮은 온도)에서 발생되며; 높은 엄격성은 Tm보다 약 5℃ 내지 10℃ 낮은 온도에서; 중간 엄격성은 Tm보다 약 10℃ 내지 20℃ 더 낮은 온도에서; 낮은 엄격성은 Tm보다 약 20℃ 내지 25℃ 더 낮은 온도에서 발생된다. 당해 분야의 숙련자가 알게 되는 바와 같이, 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인 또는 검출하는 데에는 최대 엄격성의 하이브리드 형성을 이용할 수 있는 한편, 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인 또는 검출하는 데에는 중간(또는 낮은) 엄격성의 하이브리드 형성을 이용할 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 엄격한 조건(예를 들어, 65℃ 및 0.1×SSC{1×SSC=0.15}M NaCl, 0.015M Na₃ 시트레이트, pH 7.0) 하에서 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드 형성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 이중-가닥인 경우, 이중 가닥의 각 가닥은 둘 다 개별적으로 또는 함께 본 발명에 포함된다. 뉴클레오타이드 서열이 단일-가닥인 경우, 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 서열도 본 발명의 영역 내에 포함된다.

본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 100% 상동이지는 않지만 본 발명의 영역 내에 속하는 뉴클레오타이드 서열은 다수의 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어 다수의 공급원으로부터 제조된 DNA 라이브러리를 엄밀히 탐사함으로써 본원에 기재된 서열의 다른 변형체를 수득할 수 있다. 또한, 다른 바이러스/세균 또는 세포 동족체, 특히 포유동물 세포(예를 들어, 래트, 마우스, 소 및 영장류 세포)에서 발견되는 세포 동족체를 수득할 수 있으며, 이들 동족체 및 이들의 분절은 일반적으로 본원의 서열 목록에 도시된 서열과 선택적으로 하이브리드 형성할 수 있다. 다른 동물 종으로부터 제조된 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리를 엄밀히 탐사함으로써, 또한 중간 내지 높은 엄격성의 조건하에서 본원에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 프로브로 상기 라이브러리를 탐사함으로써, 이들 서열을 수득할 수 있다. 본 발명의 아미노산 및/또는 뉴클레오타이드 서열의 동족체 및 대립유전자 변형체를 수득하는 데에도 유사한 고려사항이 적용된다.

본 발명의 서열 내에 보존된 아미노산 서열을 코딩하는 변형체 및 동족체 내에 서열을 표적화시키도록 디자인된 프라이머를 사용하는 축퇴성 PCR을 이용하여, 변형체 및 균주/종 동족체도 수득할 수 있다. 보존된 서열은 예컨대 수개의 변형체/동족체로부터의 아미노산 서열을 정렬시킴으로써 예측될 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 서열을 정렬시킬 수 있다. 예를 들 어, GCG 위스콘신 파일업(PileUp) 프로그램이 널리 사용된다. 축퇴성 PCR에 사용되는 프라이머는 하나 이상의 축퇴 위치를 함유하고, 공지 서열에 대해 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하는데 사용되는 것보다 낮은 엄격성 조건에서 사용된다.

다르게는, 이러한 뉴클레오타이드 서열은 예컨대 서열 번호: 1에 도시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 같은 특징이 결정된 서열의 부위 유도된 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 이는, 예컨대 뉴클레오타이드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대한 코돈 우선권을 최적화하기 위해 서열에 침묵 코돈 변화가 요구되는 경우 유용할 수 있다. 제한 효소 인지 부위를 도입하거나 또는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 변화시키기 위하여 다른 서열 변화가 필요할 수 있다.

본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 프라이머, 예컨대 PCR 프라이머, 다른 증폭 반응용 프라이머, 예를 들어 방사성 또는 비-방사성 라벨을 사용하는 통상적인 수단에 의한 노출 라벨로 라벨링된 프로브를 생성시킬 수 있거나, 또는 뉴클레오타이드 서열을 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 분절은 길이가 뉴클레오타이드 15개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 예컨대 25개 이상, 30개 이상 또는 40개 이상이며, 본원에 사용되는 용어 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 포함된다.

본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오타이드 및 프로브 같은 뉴클레오타이드 서열은 재조합 방법에 의해, 합성에 의해, 또는 당해 분야의 숙련자가 이용할 수 있는 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 이들은 또한 표준 기법에 의해 클로닝될 수도 있다.

일반적으로, 프라이머는 목적하는 핵산 서열의 단계적 제조(하나의 뉴클레오타이드를 한 번에)를 포함하는 합성 수단에 의해 제조된다. 자동화된 기법을 사용하여 이를 달성하는 기술도 당해 분야에서 쉽게 이용할 수 있다.

일반적으로 재조합 수단을 이용하여, 예를 들어 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 클로닝 기법을 이용하여 보다 긴 뉴클레오타이드 서열을 생성시킨다. 이는 클로닝되어야 하는 표적화 서열의 영역을 인접시키는 한 쌍의 프라이머(예컨대 약 15 내지 30개의 뉴클레오타이드)를 제조하고, 이 프라이머를 동물 세포 또는 인간 세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시킨 다음, 목적하는 영역을 증폭시키는 조건하에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행하고, 증폭된 분절을 단리시키며(예를 들어 반응 혼합물을 아가로즈 겔 상에서 정제시킴으로써), 증폭된 DNA를 회수함을 포함한다. 프라이머는 적합한 제한 효소 인지 부위를 함유하여 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 디자인될 수 있다.

유전 암호의 내재된 축퇴로 인해, 실질적으로 동일하거나 기능 면에서 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 DNA 서열을 사용하여, 표적 서열을 클로닝 및 발현시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련자가 알게 되는 바와 같이, 특정 발현 시스템에 있어서는, 비-천연 발생 코돈으로 표적 서열을 생성시키는 것이 이로울 수 있다. 특정 원핵세포 숙주 또는 진핵세포 숙주에 의해 선호되는 코돈(머레이(Murray E) 등, (1989) Nuc Acids Res 17:477-508)을 선택하여, 예컨대 표적 발현 속도를 증가시키거나 천연 발생 서열로부터 생성되는 전사물보다 더욱 긴 반감기 같은 바 람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사물을 생성시킬 수 있다.

벡터

본 발명의 한 실시태양에서는, 약물(즉, 선택적인 옥시토신 길항제)를 개체에 직접 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에서는, 본 발명의 약물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 개체에 투여한다.

바람직하게는, 유전자 벡터를 사용하여 재조합 약물을 제조하고/하거나 표적 부위로 전달한다.

당해 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 벡터는 한 물질의 하나의 환경에서 다른 환경으로의 전달을 가능케 하거나 용이하게 하는 도구이다. 본 발명에 따라, 또한 예로서, 제조합 DNA 기법에 사용되는 몇몇 벡터는 DNA의 분절(이종 cDNA 분절 같은 이종 DNA 분절) 같은 물질을, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 복제하고/하거나 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 본 발명의 단백질을 발현시키기 위하여, 숙주 및/또는 표적 세포 내로 전달할 수 있다. 재조합 DNA 기법에 사용되는 벡터의 예는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 또는 바이러스를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.

용어 "벡터"는 발현 벡터 및/또는 형질전환 벡터를 포함한다.

용어 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내/생체외 발현이 가능한 구조물을 의미한다.

용어 "형질전환 벡터"는 한 종으로부터 다른 종으로 전달될 수 있는 구조물 을 의미한다.

노출( naked ) DNA

사정 장애, 특히 조루를 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 약물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를, 바람직하게는 숙주 세포 게놈과 상동성인 인접 서열을 추가로 포함하는 "노출 핵산 구조물"로서 직접 투여할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "노출 DNA"는 본 발명의 약물 제조를 제어하기 위한 짧은 프로모터 영역과 함께 본 발명의 약물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 일컫는다. 플라스미드가 임의의 운반 비히클로 운반되지 않기 때문에 이를 "노출" DNA라고 부른다. 이러한 DNA 플라스미드가 진핵 세포 같은 숙주 세포 내로 들어갈 때, 이것이 코딩하는 단백질(예: 본 발명의 약물)이 세포 내에서 전사 및 번역된다.

비-바이러스 운반

다르게는, 본 발명의 아미노산 또는 본 발명의 약물(즉, 선택적인 옥시토신 길항제) 또는 본 발명의 표적(즉, 옥시토신 수용체)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를, 형질감염, 형질전환, 전기영동 및 바이올리스틱(biolistic) 형질전환 같은 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 비-바이러스 기법을 이용하여, 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "형질감염"은 유전자를 표적 포유동물 세포로 운반하는데 비-바이러스 벡터를 사용하는 방법을 일컫는다.

전형적인 형질감염 방법은 전기영동, DNA biolistics, 지질-매개되는 형질감 염, 압축된 DNA-매개되는 형질감염, 리포좀, 면역 리포좀, 리포펙틴, 양이온성 약물-매개, 양이온성 안면 친양쪽성 물질(CFA)(Nature Biotechnology 1996 14; 556), 스퍼민(spermine) 같은 다가 양이온, 양이온성 지질 또는 폴리리신, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트라이메틸암모니오)프로페인(DOTAP)-콜레스테롤 복합체(볼프(Wolff) 및 트루베츠코이(Trubetskoy), 1998, Nature Biotechnology, 16: 421) 및 이들의 조합을 포함한다.

포유동물 세포에 의한 노출 핵산 구조물의 흡수는 몇가지 공지되어 있는 형질감염 기법, 예컨대 형질감염제의 사용을 포함하는 기법에 의해 향상된다. 이러한 형질감염제의 예는 양이온 제제(예컨대, 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙턴트(예를 들어, 리포펙탐(상표명) 및 트랜스펙탐(상표명))를 포함한다. 전형적으로는, 핵산 구조물을 형질감염제와 혼합하여 조성물을 제조한다.

바이러스 벡터

다르게는, 본 발명의 약물 또는 표적, 또는 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를, 예컨대 재조합 바이러스 벡터(예: 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 아데노바이러스)로 감염시키는 것과 같은 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 바이러스 기법을 이용하여, 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.

바람직하게는, 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 적합한 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스-바이러스 벡터, 레토르바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터, 폭스 바이 러스 벡터 또는 파보바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다(케슬러(Kestler) 등, 1999, Human Gene Ther 10(10):1619-32 참조). 바이러스 벡터의 경우, 본 발명의 약물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 운반은 표적 세포의 바이러스 감염에 의해 매개된다.

표적화된 벡터

용어 "표적화된 벡터"는 세포를 감염/형질감염/변환시키는 능력 또는 숙주 및/또는 표적 세포에 발현되는 능력이 숙주 생물 내의 특정 세포 유형, 통상적으로는 공통적이거나 유사한 표현형을 갖는 세포로 제한되는 벡터를 말한다.

복제 벡터

본 발명의 약물(즉, 선택적인 옥시토신 길항제, 또는 적용가능한 경우 PDEi 또는 PDE5i) 또는 표적(예컨대, 옥시토신 수용체)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 복제가능한 재조합 벡터 내로 혼입할 수 있다. 벡터를 사용하여 적합한(compatible) 숙주 세포 내에서 뉴클레오타이드 서열을 복제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 복제가능한 벡터 내로 도입하고, 이 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입하고, 벡터가 복제되도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 생육시킴으로써, 본 발명의 표적을 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙제 세포로부터 회수될 수 있다.

발현 벡터

바람직하게는, 벡터 내로 삽입된 본 발명의 약물 또는 본 발명의 아미노산 또는 본 발명의 표적을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을, 숙주 세포에 의해 본 발 명의 옥시토신 수용체의 코딩 서열 같은 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 즉, 벡터는 발현 벡터이다. 숙주 재조합 세포에 의해 생성된 본 발명의 약물 또는 표적은 서열 및/또는 사용되는 벡터에 따라 분비되거나 세포 내에 함유될 수 있다. 당해 분야의 숙련자가 알게 되는 바와 같이, 본 발명의 약물 또는 표적 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터는, 특정 원핵 세포 막 또는 진핵 세포 막을 통해 본 발명의 약물 또는 표적 코딩 서열의 분비를 유도하는 신호 서열을 갖도록 디자인될 수 있다.

시험관내 발현

본 발명의 벡터는 아래 기재된 적합한 숙주 세포 및/또는 표적 세포 내로 형질전환 또는 형질감염되어, 본 발명의 약물 또는 표적이 발현되도록 할 수 있다. 이 방법은 본 발명의 약물 또는 표적을 코딩하는 코딩 서열이 벡터에 의해 발현될 수 있는 조건하에서 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및/또는 표적 세포를 배양하고, 임의적으로는 본 발명의 발현된 약물 또는 표적을 회수함을 포함할 수 있다. 벡터는 예컨대 복제의 원천, 임의적으로는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위한 프로모터 및 임의적으로는 프로모터의 조절자가 제공된 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예를 들어 세균 플라스미드의 경우 암피실린 내성 유전자, 또는 포유동물 벡터의 경우 네오마이신 내성 유전자를 함유할 수 있다. 본 발명의 약물 또는 본 발명의 표적의 발현은, 이들이 연속적으로 생성되도록 본질적(constitutive)일 수 있거나, 또는 발현을 개시시키는 자극을 필요로 하는 유도성일 수 있다. 유도성 발현의 경우, 예컨대 유도 제 성분이 배지(예컨대, 덱사메타손 또는 IPTG)에 첨가됨으로써 요구될 때 본 발명의 약물 또는 표적의 생성이 개시될 수 있다.

융합 단백질

본 발명의 옥시토신 수용체 또는 바소프레신 수용체 또는 약물(즉, 선택적인 옥시토신 길항제)는 본 발명의 약물 또는 수용체 표적의 추출 및 정제 및/또는 개체로의 운반을 돕기 위하여 및/또는 약물의 선별을 용이하게 하기 위하여 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성화 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 융합 단백질 파트너와 관심있는 단백질 서열 사이에 단백질 분해 절단 부위를 포함시켜 융합 단백질 서열이 제거되도록 하는 것이 편리할 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 표적의 활성을 방해하지 않는다.

융합 단백질은 본 발명의 성분에 융합된 항원 또는 항원 결정소를 포함할 수 있다. 이 실시태양에서, 융합 단백질은 면역 시스템에 보편화된 자극을 제공한다는 점에서 보조제로 작용할 수 있는 성분을 포함하는 비-천연 발생 융합 단백질일 수 있다. 항원 또는 항원 결정소는 성분의 아미노 말단 또는 카복시 말단중 하나에 결합할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 아미노산 서열은 이종 서열에 연결되어 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 성분의 활성에 영향을 끼칠 수 있는 약물에 대한 펩타이드 라이브러리의 검색시, 시판되는 항원에 의해 인지되는 이종 항원 결정기를 발현시키는 키메라 성분을 코딩하는 것이 유용할 수 있다.

숙주 세포

본 발명의 약물(예컨대, 본 발명의 선택적인 옥시토신 길항제) 또는 본 발명의 옥시토신 또는 바소프레신 수용체 표적을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는데 광범위한 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이들 세포는 원핵 숙주 세포 및 진핵 숙주 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 같은 세균, 효모, 섬유상 진균, 곤충 세포, 전형적으로는 영구적인 포유동물 세포, 예를 들어 마우스, CHO, 인간 및 원숭이 세포주 및 이들의 유도체를 포함한다.

본 발명의 영역 내에서 적합한 발현 숙주의 예는 아스퍼질러스(Aspergillus) 종(예컨대, EP-A-0184438 호 및 EP-A-0284603 호에 기재된 것) 및 트리코데르마(Trichoderma) 종 같은 진균; 바실러스(Bacillus) 종(예를 들어, EP-A-0134048 호 및 EP-A-0253455 호에 기재된 것), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종 같은 세균; 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 종(예컨대, EP-A-0096430 호 및 EP-A-0301670 호에 기재된 것) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 종 같은 효모이다. 예로서, 전형적인 발현 숙주는 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니게르 변종 투비게니스(Aspergillus niger var . tubigenis), 아스퍼질러스 니게르 변종 아와모리(Aspergillus niger var. awamori), 아스퍼질러스 아쿨레아티스(Aspergillus aculeatis), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 오르브자에(Aspergillus orvzae), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리 쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 선택될 수 있다.

적합한 숙주 세포(예컨대, 효모, 진균 및 식물 숙주 세포)를 사용하면, 본 발명의 재조합 발현 생성물에 최적의 생물학적 활성을 부여하는데 필요할 수 있는 바와 같이 번역후 개질(예컨대, 미리스토일화, 당화, 절단, 라피데이션(lapidation) 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 포스포릴화)될 수 있다.

바람직한 숙주 세포는 발현 생성물이 적절한 성숙 폴리펩타이드를 생성시키도록 처리할 수 있다. 처리의 예는 당화, 유비퀴틴화, 다이설파이드 결합 형성 및 일반적인 번역후 개질을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.

항체

본 발명의 한 실시태양에서는 약물이 항체일 수 있다. 또한, 다른 실시태양에서는 표적이 항체일 수 있다.

표준 기법에 의해, 예컨대 본 발명의 성분으로 면역화시킴으로써, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용함으로써, 항체를 제조할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "항체"는 달리 특정되지 않는 한 다클론, 단클론, 키메라, 단쇄, Fab 분절, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 분절, 및 이들의 유사체를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 이러한 분절은 표적 성분에 대한 결합 활성을 보유하는 전 항체의 분절, 즉 Fv, F(ab') 및 F(ab')₂ 분절, 및 단쇄 항 체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 다른 합성 단백질을 포함한다. 또한, 항체 및 그의 분절은 인간의 항체일 수 있다. 중화 항체, 즉 성분 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 억제하는 항체가 진단 및 치료에 특히 바람직하다.

다클론 항체가 바람직한 경우에는, 확인된 약물 및/또는 본 발명의 성분으로부터 수득할 수 있는 항원 결정기(들)를 갖는 면역원성 폴리펩타이드로, 선택된 포유동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)을 면역화시킨다. 숙주의 종에 따라, 다양한 보조제를 사용하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 보조제는 수산화알루미늄 같은 프로인트(Freund's) 미네랄 겔, 및 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 유화액, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모사이아닌 및 다이나이트로페놀 같은 표면 활성제를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. BCG(바실리 칼메트-구에린(Bacilli Calmette - Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)은, 전신 방어를 자극하기 위하여 면역이 떨어진 개체에 정제된 성분 폴리펩타이드가 투여되는 경우에 사용될 수 있는, 인간에 사용될 수 있는 보조제이다.

면역화된 동물로부터의 혈청을 모으고 공지 절차에 따라 처리한다. 본 발명의 확인된 약물 및/또는 성분으로부터 수득될 수 있는 항원 결정기에 대한 다클론 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유하는 경우에는, 면역 친화력 크로마토그래피에 의해 다클론 항체를 정제할 수 있다. 다클론 항혈청을 생성 및 처리하는 기법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 항체를 제조하기 위하여, 본 발명은 또한 동물 또는 인간에서 면역원으로서 사용하기 위해 다른 폴리펩타이드에 부착된 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 분절을 제공한다.

본 발명의 확인된 약물 및/또는 성분으로부터 수득될 수 있는 항원 결정기에 대해 유도된 단클론 항체도 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단클론 항체를 제조하는 일반적인 방법은 잘 공지되어 있다. 세포 융합에 의해, 또한 발암 DNA에 의한 B 림프구의 직접적인 형질전환 또는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스에 의한 형질감염 같은 다른 기법에 의해서, 영구적인 항체-생성 세포주를 생성시킬 수 있다. 안와(orbit) 항원 결정기에 대해 생성된 일단의 단클론 항체를 다양한 특성, 즉 아이소형 및 항원 결정기 친화력에 대해 선별할 수 있다.

배양액중의 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생성시키는 임의의 기법을 이용하여, 성분 및/또는 확인된 약물에 대한 단클론 항체를 제조할 수 있다. 이들은 쾨흘러(Koehler) 및 밀스타인(Milstein)(1975, Nature 256:495-497)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 기법, 인간의 B-세포 하이드리도마 기법(코스보(Kosbor) 등 (1983) Immunol Today 4:72; 코트(Cote) 등 (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기법(콜(Cole) 등 (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp 77-96)을 포함하지만, 이들로 국한되지는 않는다. 또한, "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기법, 즉 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱하여 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 수득하는 기법을 이용할 수 있다(모리슨(Morrison) 등 (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; 뉴버저(Neuberger) 등 (1984) Nature 312:604-608; 다케다(Takeda) 등 (1985) Nature 314:452-454). 다르게는, 단쇄 항체를 제조하기 위해 기재된 기법(미국 특허 제 4,946,779 호)을 채택하여 성분 특이성 단쇄 항체를 제조할 수 있다.

확인된 약물 및/또는 성분으로부터 수득될 수 있는 항원 결정기에 대해 유도되는 단클론 및 다클론 항체가 진단에 특히 유용하고, 중화 단클론 및 다클론 항체가 수동 면역요법에 유용하다. 특히, 단클론 항체를 사용하여 항-개체특이형 항체를 생성시킬 수 있다. 항-개체특이형 항체는 보호가 필요한 성분 및/또는 약물의 "내부 이미지"를 운반하는 면역 글로불린이다. 항-개체특이형 항체를 생성시키는 기법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이들 항-개체특이형 항체도 치료에 유용할 수 있다.

림프구 개체군의 생체내 생성을 유도함으로써, 또는 재조합 면역 글로불린 라이브러리 또는 올랜디(Orlandi) 등의 문헌(1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) 및 윈터(Winter G) 및 밀스타인의 문헌(1991; Nature 349:293-299)에 개시된 바와 같은 일단의 고도 특이성 결합 시약을 검색함으로써 항체를 제조할 수도 있다.

성분에 대해 특이적인 결합 부위를 함유하는 항체 분절을 또한 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 분절은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 분절 및 F(ab')₂ 분절의 다이설파이드 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있 는 Fab 분절을 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 다르게는, 목적하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 분절을 신속하고도 용이하게 확인할 수 있도록 Fab 발현 라이브러리를 구축할 수 있다(휴즈(Huse WD) 등, (1989) Science 256:1275-1281).

리포터

본 발명의 분석 방법(및 선별 방법)에 다양한 리포터를 사용할 수 있으며, 바람직한 리포터는 편리하게 검출될 수 있는 신호(예컨대, 분광분석법에 의해)를 제공한다. 예로서, 리포터 유전자는 흡광도를 변화시키는 반응을 촉진시키는 효소를 코딩할 수 있다.

리포터 분자의 예는 β-갈락토시다제, 인버타제, 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제, 클로르암페니콜, 아세틸트랜스퍼라제, β-글루쿠로니다제, 엑소-글루카나제 및 글루코아밀라제를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다르게는, 방사성 라벨링되거나 형광 택(tag)-라벨링된 뉴클레오타이드를 신생 전사물 내로 혼입시키면, 올리고뉴클레오타이드 프로브에 결합될 때 확인할 수 있다.

한 바람직한 실시태양에서, 리포터 분자의 생성은 리포터 유전자 생성물(예: β-갈락토시다제)의 효소 활성에 의해 측정된다.

단백질에 대해 특이적인 다클론 또는 단클론 항체중 하나를 사용하는 것과 같은, 표적의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당해 분야에 공지되어 있다. 예는 효소-결합된 면역흡착제 분석법(ELISA), 방사성 면역 분석법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류법을 포함한다. 폴리펩타이드상의 두 비-간섭 항원 결정기에 반응성인 단클론 항체를 사용하는 2-부위 단클론계 면역 분석법이 바람직하지만, 경쟁식 결합 분석법을 이용할 수도 있다. 이들 분석법 및 다른 분석법은 특히 햄톤(Hampton R) 등의 문헌(1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, 미네소타주 세인트폴) 및 매독스(Maddox DE) 등의 문헌(1983, J Exp Med 15 8:121 1)에 기재되어 있다.

광범위한 라벨 및 공액 기법이 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 다양한 핵산 및 아미노산 분석법에 이용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위해 라벨링된 하이브리드 형성 또는 PCR 프로브를 제조하는 수단은 올리고 라벨링, 틈 번역, 말단-라벨링 또는 라벨링된 뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭을 포함한다. 다르게는, 코딩 서열 또는 그의 임의의 일부를, mRNA 프로브를 제조하기 위한 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다. 이러한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 시판되고 있으며, T7, T3 또는 SP6 같은 적절한 RNA 폴리머라제 및 라벨링된 뉴클레오타이드를 첨가함으로써 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용될 수 있다.

파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)(뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가(Promega)(위스콘신주 매디슨 소재) 및 유에스 바이오케미칼 코포레이션(US Biochemical Corp)(오하이오주 클리블런드 소재) 같은 다수의 회사에서 이러한 절차를 위한 시판용 키트 및 프로토콜을 공급하고 있다. 적합한 리포터 분자 또는 라벨은 방사성 뉴클라이드, 효소, 형광제, 화학적 발광제 또는 발색제 및 기재, 보조인자, 저해제, 자기 입자 등을 포함한다. 이러한 라벨의 사용을 교시하는 특허는 US-A-3817837 호; US-A-3850752 호; US-A-3939350 호; US-A-3996345 호; US-A- 4277437 호; US-A-4275149 호; 및 US-A-4366241 호를 포함한다. 또한, US-A-4816567 호에서 나타낸 바와 같이 재조합 면역 글로불린을 제조할 수 있다.

특정 분자의 발현을 정량하는 다른 방법은 뉴클레오타이드의 방사성 라벨링(멜비(Melby PC) 등, 1993, J Immunol Methods 159:235-44) 또는 바이오티닐화(더플라(Duplaa C) 등, 1993, Anal Biochem 229-36), 조절 핵산의 동시 증폭 및 실험 결과가 기입되는 표준 곡선을 포함한다. 여러 샘플의 정량화는 ELISA 포맷(관심있는 올리고머가 다양한 희석액으로 제공되고, 분광분석 반응 또는 열계량 반응에 의해 신속하게 정량함)으로 분석법을 수행함으로써 가속화될 수 있다.

마커 유전자 발현의 존재/부재가 관심있는 유전자도 존재함을 암시하지만, 그의 존재 및 발현은 확인되어야 한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입되는 경우, 마커 유전자 기능의 부재에 의해 이를 함유하는 재조합 세포를 확인할 수 있다. 다르게는, 마커 유전자는 단일 프로모터의 제어하에 표적 코딩 서열과 직렬로 위치할 수 있다. 유도 또는 선택에 대응하는 마커 유전자의 발현은 통상 표적의 발현도 나타낸다.

다르게는, 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 다양한 절차에 의해, 표적에 대한 코딩 서열을 함유하고 표적 코딩 영역을 발현시키는 숙주 세포를 확인할 수 있다. 이들 절차는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 형성 및 단백질 생체 분석 또는 면역 분석 기법(핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 위한 막, 용액 또는 칩에 기초한 기법 포함)을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

선별

임의의 다양한 약제 선별 기법에서 약물, 예를 들어 선택적인 옥시토신 수용체 길항제를 확인하기 위하여, 임의의 하나 이상의 적절한 표적(예컨대, 옥시토신 수용체 및/또는 바소프레신, 바람직하게는 V1a 수용체)을 사용할 수 있다. 이러한 시험에 사용되는 표적은 용액 중에서 유리되거나, 고체 지지체에 고정되거나, 세포 표면에 생성되거나 또는 세포 내에 위치될 수 있다. 표적은 심지어 동물 모델 내에 있을 수도 있으며, 이 때 상기 표적은 외인성 표적 또는 도입된 표적일 수 있다. 동물 모델은 인간이 아닌 동물 모델이다. 표적 활성의 제거, 또는 표적과 시험되는 약물 사이의 결합 복합체의 생성을 측정할 수 있다.

약제 선별 기법은 기센(Geysen)의 유럽 특허 공개 제 84/03564 호(1984년 9월 13일 공개)에 기재되어 있는 방법에 기초를 둔다. 요약하자면, 다수의 상이한 작은 펩타이드 시험 화합물을 고체 기재(예: 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면) 상에서 합성한다. 펩타이드 시험 화합물을 적합한 표적 또는 그의 분절과 반응시킨 후 세척한다. 결합된 물질을 예컨대 당해 분야에 널리 공지되어 있는 적절하게 채택된 방법에 의해 검출한다. 약제 선별 기법에 사용하기 위하여, 정제된 표적을 플레이트 상으로 직접 코팅시킬 수도 있다. 다르게는, 비-중화 항체를 사용하여 펩타이드를 포획하고 이를 고체 지지체 상에 고정시킬 수 있다.

본 발명에서는 또한 표적과 결합할 수 있는 중화 항체가 표적과 결합하기 위하여 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁식 약제 선별 분석법의 사용도 고려된다.

다른 선별 기법은 성분에 대해 적합한 결합 친화력을 갖는 약물의 고 처리량 선별(high throughput screening; HTS)을 제공하고, 이는 WO 84/03564 호에 상세히 기재되어 있는 방법에 기초한다.

본 발명의 분석 방법은 시험 화합물의 소규모 및 대규모 선별 및 정량 분석에 적합할 것으로 예상된다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 선별은 적어도 하기 단계를 포함한다(이와 동일하게 연속되는 순서일 필요는 없음): (a) 시험관내 선별을 수행하여, 후보 약물이 관련 활성(예컨대, 옥시토신 수용체의 조정)을 갖는지의 여부를 결정하는 단계; (b) 예컨대 본원에 기재된 분석 프로토콜을 이용함으로써 1회 이상의 선택성 선별을 수행하여, 상기 후보 약물의 선택성을 결정하는 단계(예를 들어, 상기 약물이 바소프레신, 특히 V1a 수용체 저해제인지의 여부를 알아보기 위하여); 및 c) 상기 후보 약물을 사용하여 생체내 선별을 수행하는 단계(예를 들어, 기능성 동물 모델을 사용하여, 바소프레신, 특히 V1a 수용체에 대한 약물의 효과를 결정함으로써 약물의 선택성을 결정함을 포함함). 전형적으로는, 상기 후보 약물이 선별 (a) 및 선별 (b)를 통과하면, 이어서 선별 (c)를 수행한다.

진단 방법/조성물/ 키트

본 발명은 또한 조루에 대한 성향을 검출하기 위한 진단 방법, 조성물 또는 키트를 제공한다. 이와 관련하여, 상기 방법, 조성물 또는 키트는 시험 샘플, 바람직하게는 성적으로 흥분된 수컷으로부터 채취한 혈액 샘플 중의 물질, 바람직하게는 옥시토신을 검출하기 위한 수단을 포함하게 된다.

조루 진단의 기초를 제공하기 위하여, 물질의 정상 값 또는 표준 값을 확립 해야 한다. 이는 성적으로 흥분한지 다양한 시간 후에 동물이든 인간이든 정상적인 개체로부터 채취한 체액을, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 복합체 형성에 적합한 조건하에서, 물질에 대한 항원과 혼합함으로써 달성될 수 있다. 표준 복합체 형성의 양은 이를 공지량의 항체를 공지 농도의 정제된 표적과 혼합한 양성 대조용의 일련의 희석액과 비교함으로써 정량화될 수 있다. 이어, 정상적인 샘플로부터 수득된 표준 값을 조루에 걸릴 가능성이 있는 개체의 샘플로부터 수득된 값과 비교할 수 있다. 표준 값과 개체 값 사이의 편차가 질환 상태의 존재를 입증한다.

물질 자체, 또는 그의 임의의 일부는 진단 및/또는 치료 화합물의 기초를 제공할 수 있다. 진단을 위해, 표적 뉴클레오타이드 서열을 사용하여, 조루가 관련될 수 있는 질병, 장애 또는 질환에서의 유전자 발현을 검출 및 정량할 수 있다.

표적의 발현으로부터 발생되는 조루의 진단에, 표적을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 생검 또는 부검으로부터의 조직 또는 생물의 체액의 하이브리드 형성 또는 PCR 분석에 사용하여 물질의 발현을 검출할 수 있다. 이러한 정성 또는 정량 방법의 형태는 써던 분석 또는 노던 분석, 점 블롯 또는 막에 기초한 다른 기법; PCR 기법; 계량봉, 핀 또는 칩 기법; 및 ELISA 또는 다른 다중 샘플 형식 기법을 포함할 수 있다. 이들 기법은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 실제로 다수의 시판중인 진단 키트의 기초이다.

이러한 분석법은 특정한 치료용 처방 계획의 효율을 평가하도록 맞추어질 수 있으며, 동물 연구, 임상 실험 또는 개체 치료 모니터링에 이용될 수 있다. 질환 이 입증되면, 존재하는 치료제를 투여하고, 치료 프로파일 또는 치료값을 수득할 수 있다. 마지막으로, 공인 기준으로 분석법을 반복함으로써 값이 정상 또는 표준 패턴을 향해 진행되는지, 정상 또는 표준 패턴으로 돌아오는지의 여부를 평가할 수 있다. 연속적인 치료 프로파일을 이용하여 수일 또는 수개월에 걸친 치료의 효율을 나타낼 수 있다.

분석 방법

본 발명에 따른 분석 방법은 아래와 같은 것을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 기법중 하나 이상을 이용할 수 있다: 경쟁식 또는 비-경쟁식 분석법, 방사성 면역 분석법, 생체 발광 및 화학 발광 분석법, 형광 측정 분석법, 샌드위치 분석법, 면역 방사성 측정 분석법, 점 블롯, ELISA를 포함하는 효소 연결 분석법, 미소적정 플레이트, 뇨 또는 혈액의 신속한 모니터링을 위한 항체 코팅된 스트립 또는 계량봉, 면역 조직 화학 및 면역 세포 화학.

프로브

본 발명의 다른 양태는 옥시토신 수용체 또는 밀접하게 관련된 분자(예: 대립 유전자)를 코딩하는 영역 같은 표적 코딩 영역을 코딩하는 게놈 서열을 비롯한 폴리뉴클레오타이드 서열을 검출할 수 있는 핵산 하이브리드 형성 또는 PCR 브로브(특히, 선택적으로 선택할 수 있는 것)를 제공하는 것이다. 프로브의 특이성, 즉 이것이 고도로 보존된 영역 또는 도메인, 보존된 영역 또는 도메인 또는 보존되지 않은 영역 또는 도메인으로부터 유도되는지의 여부, 및 하이브리드 형성 또는 증폭의 엄격성(높음, 중간 또는 낮음)은 프로브가 천연 발생 표적 코딩 서열만 확 인하는지 또는 관련 서열을 확인하는지를 결정한다. 관련 핵산 서열을 검출하기 위한 프로브는 표적 패밀리 멤버의 보존되거나 고도로 보존된 뉴클레오타이드 영역으로부터 선택되고, 이러한 프로브는 축퇴 프로브의 풀에 사용될 수 있다. 동일한 핵산 서열의 검출을 위해, 또는 최대 특이성이 필요한 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드의 보존되지 않은 뉴클레오타이드 영역 또는 특이적인 영역으로부터 핵산 프로브를 선택한다. 본원에 사용되는 용어 "보존되지 않은 뉴클레오타이드 영역"은 본원에 개시된 표적 코딩 서열에 특이적이고 관련된 패밀리 멤버에서는 발생되지 않는 뉴클레오타이드 영역을 일컫는다.

US-A-4683195 호, US-A-4800195 호 및 US-A-4965188 호에 기재되어 있는 PCR은 표적 서열에 기초한 올리고뉴클레오타이드에 추가적인 용도를 제공한다. 이러한 올리고머는 통상 화학적으로 합성되지만, 이들은 효소에 의해 생성될 수도 있거나 또는 재조합 근원으로부터 생성될 수도 있다. 올리고머는 통상 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 하나는 센스 배향(5'→3')을 갖고 다른 하나는 안티센스 배향(3'←5')을 가지며, 이들은 특정 유전자 또는 조건을 확인하기 위해 최적화된 조건하에서 사용된다. 밀접하게 관련된 DNA 또는 RNA 서열의 검출 및/또는 정량을 위하여, 덜 엄격한 조건하에서 동일한 두 올리고머, 올리고머의 짝을 이룬 셋트(nested set) 또는 올리고머의 축퇴 풀을 사용할 수 있다.

약물 또는 표적의 핵산 서열을 사용하여. 내인성 게놈 서열을 맵핑(mapping)하기 위한 이전에 기재된 하이브리드 형성 프로브를 제조할 수 있다. 널리 공지된 기법을 이용하여, 특정 염색체 또는 염색체의 특정 영역에 서열을 맵핑할 수 있다. 이들은 염색체 스프레드, 유동-분류된 염색체 제제 또는 인공 염색제 구조물(예: YAC), 세균성 인공 염색체(BAC), 세균 PI 구조물 또는 단일 염색체 cDNA 라이브러리와의 동일 반응계내 하이브리드 형성을 포함한다(베르마(Verma) 등 (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, 뉴욕시).

염색체 제제의 동일 반응계내 하이브리드 형성 및 물리적 맵핑 기법(예: 입증된 염색체 마커를 사용하는 결합 분석)은 유전자 지도를 확장하는데 매우 중요하다. 유전자 지도의 예는 문헌(Science 1995; 270:41 및 1994; 265:1981f)에서 찾아볼 수 있다. 종종 다른 포유동물 종의 염색체 상에 유전자를 위치시키면, 특정한 인간 염색체의 암(arm) 수가 알려져 있지 않더라도 관련된 마커를 나타낼 수 있다. 물리적 맵핑에 의해 신규 서열을 염색체 암 또는 그의 일부에 부여할 수 있다. 이는 위치 클로닝 또는 다른 유전자 발견 기법을 사용하여 질환 유전자를 탐색하는 연구자들에게 중요한 정보를 제공한다. 유전자 결합에 의해 대략적으로나마 질환 또는 증후군이 유래된 특정 게놈 영역을 밝혀내게 되면, 이 구역에 대한 임의의 서열 맵핑은 그 이후의 연구를 위해 관련 또는 조절 유전자를 나타낼 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 이용하여, 정상적인 개체, 담체 또는 질환에 걸린 개체 사이의, 전위 또는 반전 등에 기인한 염색체 위치의 차이를 검출할 수 있다.

생물

본 발명과 관련된 "생물"이라는 용어는 표적 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함할 수 있는 임의의 생물을 포함한다. 생물의 예는 포유동물, 진균, 효모 또는 식물을 포함할 수 있다.

본 발명과 관련된 용어 "유전자 이전 생물"이란 표적 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함하는 임의의 생물을 포함한다.

숙주 세포/숙주 생물의 형질전환

앞서 나타낸 바와 같이, 숙주 생물은 진핵세포 또는 원핵세포 생물일 수 있다. 적합한 원핵세포 숙주의 예는 이. 콜라이(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한다. 원핵세포 숙주의 형질전환에 대한 교시내용은 당해 분야의 문서, 예컨대 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 오스벨 등의 문헌(Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.)에 잘 기재되어 있다.

원핵세포 숙주가 이용되는 경우에는, 형질 전환 전에 뉴클레오타이드 서열을 적합하게 개질시킬(예컨대 인트론의 제거) 필요가 있을 수 있다.

다른 실시태양에서, 유전자 이전 생물은 효모일 수 있다. 이와 관련하여, 효모는 이종 유전자 발현의 비히클로서 널리 사용되어 왔다.

사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 이종 유전자 발현을 위한 그의 용도를 비롯하여, 오랜 기간동안 공업적으로 사용되어 왔다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 이종 유전자의 발현은 구디(Goodey) 등(1987, Yeast Biotechnology, D R Berry 등 편집, pp 401-429, Allen and Unwin, 런던) 및 킹(King) 등(1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton 편집, pp 107-133, Blackie, 글래스고우)에 의해 재검토되었다.

몇가지 이유 때문에, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 이종 유전자 발현에 적합하다. 첫째로, 이는 인간에게 비-병원성이고, 특정 내독소를 생성시킬 수 없다. 둘째로, 이는 다양한 목적을 위한 수세기에 걸친 상업적 개발에 따라 안전한 사용의 역사가 길다. 이로 인해 공공에게 광범위하게 받아들여졌다. 셋째로, 생물에 대해 이루어진 광범위한 상업적 사용 및 연구로 인해 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)의 유전학 및 생리학, 및 대규모 발효 특징에 대한 지식이 풍부해졌다.

사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 이종 유전자 발현 원리의 재검토는 힌치클리프(E Hinchcliffe E Kenny)의 문헌(1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose 및 J Stuart Harrison 편집, 제 2 판, Academic Press Ltd.)에 기재되어 있다.

유지를 위해 숙주 게놈과의 재조합을 필요로 하는 통합 벡터 및 자율적으로 복제되는 플라스미드 벡터를 비롯하여 몇가지 유형의 효모 벡터가 이용가능하다.

유전자 이전 사카로마이세스(Saccharomyces)를 제조하기 위하여, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 효모에서 발현하도록 디자인된 구조물 내로 삽입함으로써 발현 구조물을 제조한다. 이종 발현에 사용되는 몇 가지 유형의 구조물이 개발되었다. 구조물은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 융합된 효모에 활성인 프로모터 를 함유하고, 통상적으로는 효모로부터 발생된 프로모터(예: GAL1 프로모터)를 사용한다. 통상, SUC 2 신호 펩타이드를 코딩하는 서열 같은 효모로부터 발생된 신호 서열을 사용한다. 효모에서 활성인 종료자가 발현 시스템을 종결시킨다.

효모의 형질 전환을 위해, 몇가지 형질 전환 프로토콜이 개발되었다. 예를 들어, 힌넨(Hinnen) 등(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); 베그즈(Beggs, J D)(1978, Nature, London, 275, 104); 및 이토(Ito, H) 등(1983, J Bacteriology 153, 163-168)의 교시에 따름으로써, 본 발명에 따른 유전자 이전 사카로마이세스(Saccharomyces)를 제조할 수 있다.

다양한 선택적인 마커를 사용하여 형질전환된 효모 세포를 선택한다. 형질전환에 사용되는 마커 중에는 LEU2, HIS4 및 TRP1 같은 영양요구성 마커, 및 아미노글리코사이드 항생제 마커, 예컨대 G418 같은 유력한 항생제 내성 마커 등 다수가 있다.

다른 숙주 생물은 식물이다. 유전자 변형된 식물의 구성의 기본 원리는 식물 게놈에 유전 정보를 삽입하여 삽입된 유전 물질을 안정하게 유지시키는 것이다. 유전 정보를 삽입하는 데에는 몇가지 기법이 존재하는데, 두 가지 주요 원리는 유전 정보의 직접 도입 및 벡터 시스템의 사용에 의한 유전 정보의 도입이다. 일반적인 기법에 대한 개설은 포트리쿠스(Potrykus)의 논문(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 크리스토우(Christou)의 논문(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994년 3월/4월 17-27)에서 찾아볼 수 있다. 식물 형질전환에 대한 추가의 교시는 EP-A-0449375 호에서 찾아볼 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 표적이 되거나 표적을 발현시키는 뉴클레오타이드 서열로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법을 제공한다. 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포를, 세포 배양액으로부터 코딩된 단백질을 발현 및 회수하는데 적합한 조건하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 서열 및/또는 사용된 벡터에 따라 분비되거나 또는 세포내에 함유될 수 있다. 당해 분야의 숙련자가 잘 아는 바와 같이, 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터는 특정 진핵세포 막 또는 원핵세포 막을 통해 코딩 서열의 직접 분비를 유도하는 신호 서열을 갖도록 디자인될 수 있다. 다른 재조합 구조물은 가용성 단백질의 정제를 용이하게 하는 폴리펩타이드 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 코딩 서열을 결합시킬 수 있다(크롤(Kroll DJ) 등 (1993) DNA Cell Biol 12:441-53).

PDE 저해제-시험 방법

본원에서 언급하는 PDE 작용 효능값은 하기 분석법에 의해 결정된다:

포스포다이에스터라제 ( PDE ) 저해 활성

본 발명에 따라 사용하기 적합한 바람직한 PDE 화합물은 강력하고 선택적인 cGMP PDE5 저해제이다. 환상 구아노신 3',5'-모노포스페이트(cGMP) 및 환상 아데노신 3',5'-모노포스페이트(cAMP) 포스포다이에스터라제에 대한 시험관내 PDE 저해 활성은 IC₅₀ 값(효소 활성을 50% 저해하는데 필요한 화합물의 농도)을 측정함으로써 결정될 수 있다.

요구되는 PDE 효소는 본질적으로 톰슨(W.J. Thompson) 및 애플맨(M.M. Appleman)(Biochem., 1971, 10, 311)의 방법에 의해 인간의 해면체, 인간과 토끼의 혈소판, 인간의 심실, 인간의 골격근 및 소의 망막을 비롯한 다양한 출처로부터 단리될 수 있다. 구체적으로는, 인간의 해면체 조직으로부터 cGMP-특이성 PDE(PDE5) 및 cGMP-저해되는 cAMP PDE(PDE3)를 수득할 수 있고, 인간의 골격근으로부터 cAMP-특이성 PDE(PDE4)를 수득할 수 있다. 포스포다이에스터라제 7 내지 11은 SF9 세포 내로 형질감염되는 전체 길이의 인간 재조합 클론으로부터 제조할 수 있다.

톰슨 등(Biochem., 1979, 18, 5228)의 "회분식" 방법의 변형을 이용하여, 또는 애머샴 피엘씨(Amersham plc)에서 상품명 TRKQ7090/7100으로 기재하고 있는 프로토콜의 변형을 사용하는 AMP/GMP의 직접 검출을 위한 섬광 근접 분석법을 이용하여, 분석을 수행할 수 있다. 간단히, IC₅₀이 K_i와 유사하도록 변화하는 저해제 농도 및 낮은 기재 농도(농도 ∼1/3k_m에서 라벨링되지 않음 대 [³H]-라벨링됨의 비 3:1의 cGMP 또는 cAMP)의 존재하에 고정된 양의 효소를 분석함으로써 PDE 저해제의 효과를 조사하였다. 최종 분석 부피를 분석 완충액[20mM Tris-HCl pH 7.4, 5mM MgCl₂, 1mg/ml 소의 혈청 알부민]으로 100㎕로 만들었다. 효소를 사용하여 반응을 개시시키고, 30℃에서 30 내지 60분간 배양하여 30% 이하의 기재 전환율을 제공하고, 50㎕ 이트륨 실리케이트 SPA 비이드(PDE 9 및 PDE 11에 대해 각각의 라벨링되지 않은 환상 뉴클레오타이드 3mM 함유)로 종결시켰다. 플레이트를 재밀봉시키고 20분간 진탕시킨 다음, 비이드를 암소에서 30분간 침강시키고, 탑카운트 플레이트 판독기(패커드, 코넥티컷주 메리덴 소재)에서 계수하였다. 방사능 단위를 저해되 지 않은 대조용(100%)의 활성에 대한 %로 전환하고, 저해제 농도에 대해 플롯팅한 다음, '핏 커브(Fit Curve)' 마이크로소프트 엑셀 확장판을 사용하여 저해제 IC₅₀ 값을 수득하였다.

기능 활성

발라드(S.A. Ballard) 등의 문헌(Brit. J. Pharmacol., 1996, 118(보충판), 초록 153P)에 기재되어 있는 바와 같이, 미리 수축시킨 토끼의 해면체 조직 스트립의 소듐 나이트로프러사이드-유도된 이완을 향상시키는 본 발명 화합물의 능력을 결정함으로써, 이를 시험관내에서 평가할 수 있다.

1.0 방법

1.1. 동물 시험 방법

1.1.1. 마취된 래트에서의 음경 발기 및 사정 시험 방법

음경 발기 및 사정을 연구하기 위하여 이용된 방법은 요네자와(Yonezawa) 등의 문헌((2000) Life Sciences 67, 3031-3039)에 교시된 방법에 기초하였다. 참조를 용이하게 하기 위해, 이 방법을 아래에 인용한다:

체중 350 내지 450g의 위스타-에스티(Wistar-ST) 종 래트 수컷을 이용한다. 실험하기 전에, 12시간 조명-암흑 싸이클(07:00에 조명을 켬), 일정한 온도(23±1℃) 및 습도(55±5%)로 조절하면서 동물을 무리를 지어(우리당 래트 2마리) 가둔 다. 이들은 표준 식품 펠렛 및 물에 자유로이 접근할 수 있다.

래트를 소듐 펜토바비탈(50mg/kg, 복강내)로 마취시키고 반듯이 드러누운 자세로 둔다. 음경을 표피로부터 돌출시키고 음경의 아랫부분에 위치시킨 목재 어플리케이터에 의해 부드럽게 잡는다. 표피가 뒤로 당겨지기 직전에 시험 화합물을 복강내 투여하고, 음경 발기, 적화 및 음경 몸체의 확장, 귀두 발기, 귀두 및 함몰부(cup)의 충혈 및 약간의 발적, 강하게 발적되는 귀두 발기를 비롯한 음경 반응을 기록한다. 시험 화합물의 투여로부터 최초 음경 반응 및 사정까지의 잠재기도 측정하였다.

30분동안 모인 사정액의 중량을 측정함으로써 PCA 유도된 사정에 대한 시험 화합물의 효과를 평가한다. 의식이 있는 래트를 사용하는 적합한 방법은 레니(Renyi)의 문헌((1985) Neuropharmacology, Vol. 24, No. 8, pp 697-704)에 기재되어 있다.

소듐 펜토바비톨(50mg/kg, 복강내)로 마취시킨 래트에서 또한 해면체내 압력도 측정한다. 필요한 경우 실험 기간 동안 내내 소량(5mg)을 추가로 주사할 수 있다. 음경을 표피로부터 돌출시키고, 해면체 내로 스테인레스 강 바늘(23-게이지)을 삽입함으로써 해면체내 압력(ICP)을 측정하였다. 헤파린 처리된 염수(10U/ml)가 충전된 테플론 관에 바늘을 부착하고 압력 변환기(NEC-San-Ei 7500)에 연결한다.

1.1.2 수컷의 성적 행동 모델:

모든 성적 행동 시험에서는, 수컷 래트를 관찰장(직경 50 내지 60cm)에 넣고 5시간의 암흑 싸이클부터 시작하여 적색 조명 아래에서 관찰하였다. 수컷을 관찰장에 넣은지 3 내지 4분 후에, 수용적인 암컷(난소절제됨, 행동 연구를 개시하기 48시간 전에 오에스트라디올 벤조에이트/프로게스테론을 주사함)을 관찰장 내로 도입하고 아래 변수에 주목한다:

i) 사정 잠재기(EJL; 수용적인 암컷을 관찰장 내로 넣고 나서 사정하기까지 걸리는 시간);

ii) 교미 효율(CE; 사정 잠재기/삽입하여 사정한 횟수, 즉 삽입 사이의 초 간격);

iii) 삽입 빈도(IF; 삽입하여 사정한 횟수);

iv) 올라탄 빈도(MF; 올라타서 사정한 횟수);

v) 사정후 중간기(PEI; 사정한 다음 교미 행동을 개시하기까지 걸리는 시간).

2.0 선택적인 옥시토신 수용체 길항제

하기 실시예에 사용된 화합물은 다음과 같았다:

선택적인 옥시토신 수용체 길항제 L-368,899. 이 화합물에 관한 추가의 세부사항은 상기에 제공되어 있다. L-368,899는 V1a 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 더 선택적이다[6.3nM OT:148nM V1a].

실시예 1. 선택적인 옥시토신 수용체 길항제(L-368,899)의 존재하에서 사정의 지연

옥시토신 수용체 길항제 L-368,899는 마취된 래트에서 선택적인 옥시토신 투여량(0.1 내지 10mg/kg, 피하)에서 p-클로로암페타민(PCA)-유도된 사정을 상당히 지연시켰다. 유리 혈장 농도 5.4±1.5nM(0.9×Ki OT, 도 1 참조)에서 사정을 140%(거의 최대 효과) 지연시켰으며, 이 투여량에서 옥시토신 수용체의 길항작용으 로부터 임의의 활성이 발생되는 것으로 추정되었다.

발기를 유발시키는 메카니즘은 옥시토신 수용체 폐색에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 즉, 음경 함몰부 및 확대부의 수는 대조용 및 옥시토신 길항제 연구에서 유사하였다(아래 표 1 참조). L-368,899의 1mg/kg 피하 투여 후(실질적으로 사정을 지연시키는 투여량), 음경 함몰부에서 일어난 PCA-유도된 발기 95%는 비히클 대조용 군의 94%에 필적하며, 음경 확대부에서 일어난 PCA-유도된 발기 61%는 비히클 대조용 군의 63%에 필적한다.

L-368,899는 매우 불량한 CNS 침투를 가지며, 그 자체로 이 연구는 옥시토신이 PCA-유도된 사정에서 말초신경 작용 부위를 가짐을 보여준다. PCA는 음경 발기를 일으키고 사정을 제어하는 교감신경 통로를 만드는 비-아드레날린성 비-콜린성 신경을 활성화시키는 5HT 방출제이다. 이들 성교전 효과는 5HT1B 및 5HT2C 수용체에서 작용하는 척수 5HT의 방출을 통해 매개되는 것으로 생각된다. PCA는 또한 가능하게는 뇌하수체 전엽 또는 척수 중심으로부터의 옥시토신의 분비를 유도한다. 이는 옥시토신을 증가시키고, 남성에서와 같이 사정 과정에 관련된다(이들 연구에서 옥시토신 수용체의 길항작용이 사정에 도달하는데 걸리는 시간에 대해 상당하 효과를 갖기 때문에).

인간의 사정 생리 기능을 반영하는 사정의 설치류 모델을 사용하여, 본 발명자들은 말초신경 옥시토신 수용체가 사정 메카니즘에 관련되어 있음을 밝혀내었다. 이러한 효과는 직접적일 수 있거나, 또는 내부 생식 기관의 교감신경 분포의 조정에 의할 수 있다. 본 발명자들은 중추신경의 옥시토신 수용체에 대한 역할을 고려하지 않을 수 없다. 뿐만 아니라, 본 연구에서는 옥시토신 길항제가 사정을 지연시킴으로써 조루를 치료하는데 유용함을 보여준다.

실시예 2. 마취된 래트에서 정낭 압력에 대한 선택적인 옥시토신 길항제(L-368,899)의 효과

L-368,899는 마취된 래트에서 정낭 압력의 내장 신경-자극되는 증가를 상당히 감소시켰다(1 내지 3mg/kg, 정맥내). 정낭 수축은 누정에 필수적이고, 전립선 요도 내로 운반된 정액은 사정을 촉발시키는 것으로 생각된다. 옥시토신은 포유동물의 정낭에 직접적인 수축 효과를 가지며, 추가로 사정 동안 교감 신경 분포에 영향을 끼치는 신경 조절제 역할을 가질 수 있다. 이 연구에서는, 1mg/kg의 약덩이 주사 후 정낭 수축이 41%까지 감소되었다(아래 도 2 참조). 예비 연구는 1.0mg/kg 정맥내 주사 후 달성된 L-368,899의 유리 혈장 농도가 문헌 PK 및 단백질 혈장 결합에 기초하여 약 60nM임을 보여준다.

데이터는 내장 신경 자극 동안 옥시토신이 방출되고, 펩타이드가 정낭내 압력의 발생 및 사정 전 누정 과정에서 생리학적인 기능을 담당함을 나타낸다. 이 연구는 말초신경 사정 반응에 영향을 끼치는 전신 옥시토신의 역할을 뒷받침하며, 이러한 효과는 직접적이거나, 또는 정낭의 교감신경 분포의 조정에 의할 수도 있다. 옥시토신은 수컷의 생식관 전체에 걸쳐 관 및 선 소엽의 수축을 조정하여, 상이한 사정액 성분의 유체 부피에 영향을 끼칠 수 있다. 사정액 부피의 증가는 삽입으로부터 사정까지의 시간을 단축시키는 것으로 생각되며, 따라서, 옥시토신 길항제는 지연된 누정에 의해 조루를 치료하는데 유용할 수 있다.

실시예 3. 래트에서 교미 행동에 대한 선택적인 옥시토신 길항제(L-368,899)의 효과

L-368,899는 10mg/kg(피하) 이하의 투여량에서는 성적으로 경험이 있는 래트에서 교미 행동에 아무런 효과를 나타내지 않는다. 설치류의 교미 행동은 질 내에 삽입하거나 삽입하지 않는(올라타기의 50 내지 80%에서 삽입(질 침투)이 이루어짐) 일련의 올라타기를 특징으로 하고, 사정은 6 내지 12회 삽입한 후에 이루어진다. 각 삽입은 초 단위로 지속되어, 삽입 길이(즉, 질내 잠재기)를 정량화할 수 없다. L-368,899의 효과는 다수의 교미 매개변수(상기 참조)에 대해 평가되었다. 본 발명자들은 질 침투를 개괄하는 척도로서의 교미 효율에 촛점을 맞추었다.

시험된 어떤 투여량에서도(0.05 내지 10mg/kg, 피하, 아래 표 2 참조) L-368,899는 교미 효율에 대해 효과를 나타내지 않았다. 예비 약동학 연구는 1mg/kg(피하) 및 10mg/kg(피하)을 주사한지 30분 후에야 각각 4.5nM 및 40nM의 유리 혈장 농도가 기대됨을 나타낸다.

L-368,899를 또한 뇌실내(icv) 투여하였다. L-368,899는 50ng/래트(뇌실내)로 투여될 때 성적으로 경험이 있는 래트의 교미 효율에 큰 효과를 갖지 않는다.

실시예 4. 교미 행동에 대한 비-선택적인 옥시토신 길항제( 바소토신 )의 효과

펩타이드성 비-선택적인 옥시토신 길항제인 d(CH₂)₅Tyr(Me)-Orn⁸-바소토신의 교미 행동에 대한 효과를 연구하는 기존의 연구는, 25ng/래트(뇌실내) 이하의 투여시, 사정 잠재기에 대해 아무런 효과가 없음을 보여주었다. 5ng/래트 뇌실내 투여한 후, 교미 효율에 (상당한) 감소가 있었다(45초/삽입 대 비히클 대조용 동물의 25초/삽입). 이 효과는 아마도 옥시토신 및/또는 바소프레신 수용체에 의해 매개된다. 50ng/래트 뇌실내 투여 후, 교미 행동이 없어졌다(멜리스(Melis) 등, Neuroscience Letters 265 (1999) 171-174). 이는 100ng/래트 뇌실내 투여시 비-접촉 발기 횟수가 감소되었고, 100ng/래트 뇌실내 투여시 약제-유도된 발기가 완전히 없어졌음을 보여주었다. 이들 데이터는, 선택적인 옥시토신 수용체 길항제(L-368,899)를 사용한 연구와는 대조적으로, 중추 옥시토신 및 바소프레신 수용체의 길항작용이 발기 메카니즘 및 흥분가능성을 비롯한 성적 행동에 유해할 수 있음을 나타낼 수 있다.

약어

PE: 조루

OT: 옥시토신

cAMP: 환상 아데노신-3',5'-모노포스페이트

cGMP: 환상 구아노신-3',5'-모노포스페이트

PDE: 포스포다이에스터라제

PDE_cGMP: cGMP 가수분해 PDE

PDEi: PDE의 저해제(I:PDE로도 알려져 있음)

PDE5: 포스포다이에스터라제 유형 5

PDE5i: PDE5의 저해제

kDa: 킬로달톤

bp: 염기쌍

kb: 킬로염기쌍

서열의 목록(상세한 설명의 일부임)

서열 번호: 1

서열 번호: 2

도 1은 마취된 래트에서 p-클로로암페타민(PCA)-유도된 사정에 대한 옥시토신 수용체 길항제 L-368,899의 효과를 도시하는 그래프이다.

도 2는 마취된 래트에서 정낭 압력에 대한 선택적인 옥시토신 길항제(L-368,899)의 효과를 도시하는 그래프이다.

서열 목록

서열 번호: 1은 인간의 옥시토신 수용체의 아미노산 서열을 도시한다.

서열 번호: 2는 인간의 바소프레신 V1A 수용체의 아미노산 서열을 도시한다.

SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Limited (EP (GB) and GB only) Pfizer Inc. (All other States) <120> Treatment of Male Sexual Dysfunction <130> PC22047A <150> GB 0202282.0 <151> 2002-01-31 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 389 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Trp Ser Ala Glu Ala Ala Asn Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ala Pro Pro Gly Ala Glu Gly Asn Arg Thr Ala Gly Pro Pro 20 25 30 Arg Arg Asn Glu Ala Leu Ala Arg Val Glu Val Ala Val Leu Cys Leu 35 40 45 Ile Leu Leu Leu Ala Leu Ser Gly Asn Ala Cys Val Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Arg Thr Thr Arg Gln Lys His Ser Arg Leu Phe Phe Phe Met Lys His 65 70 75 80 Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Phe Gln Val Leu Pro Gln 85 90 95 Leu Leu Trp Asp Ile Thr Phe Arg Phe Tyr Gly Pro Asp Leu Leu Cys 100 105 110 Arg Leu Val Lys Tyr Leu Gln Val Val Gly Met Phe Ala Ser Thr Tyr 115 120 125 Leu Leu Leu Leu Met Ser Leu Asp Arg Cys Leu Ala Ile Cys Gln Pro 130 135 140 Leu Arg Ser Leu Arg Arg Arg Thr Asp Arg Leu Ala Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Trp Leu Gly Cys Leu Val Ala Ser Ala Pro Gln Val His Ile Phe Ser 165 170 175 Leu Arg Glu Val Ala Asp Gly Val Phe Asp Cys Trp Ala Val Phe Ile 180 185 190 Gln Pro Trp Gly Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Trp Ile Thr Leu Ala Val 195 200 205 Tyr Ile Val Pro Val Ile Val Leu Ala Thr Cys Tyr Gly Leu Ile Ser 210 215 220 Phe Lys Ile Trp Gln Asn Leu Arg Leu Lys Thr Ala Ala Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Glu Ala Pro Glu Gly Ala Ala Ala Gly Asp Gly Gly Arg Val Ala 245 250 255 Leu Ala Arg Val Ser Ser Val Lys Leu Ile Ser Lys Ala Lys Ile Arg 260 265 270 Thr Val Lys Met Thr Phe Ile Ile Val Leu Ala Phe Ile Val Cys Trp 275 280 285 Thr Pro Phe Phe Phe Val Gln Met Trp Ser Val Trp Asp Ala Asn Ala 290 295 300 Pro Lys Glu Ala Ser Ala Phe Ile Ile Val Met Leu Leu Ala Ser Leu 305 310 315 320 Asn Ser Cys Cys Asn Pro Trp Ile Tyr Met Leu Phe Thr Gly His Leu 325 330 335 Phe His Glu Leu Val Gln Arg Phe Leu Cys Cys Ser Ala Ser Tyr Leu 340 345 350 Lys Gly Arg Arg Leu Gly Glu Thr Ser Ala Ser Lys Lys Ser Asn Ser 355 360 365 Ser Ser Phe Val Leu Ser His Arg Ser Ser Ser Gln Arg Ser Cys Ser 370 375 380 Gln Pro Ser Thr Ala 385 <210> 2 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Ser Ala Gly Pro Asp Ala Gly Pro Ser Gly Asn Ser Ser 1 5 10 15 Pro Trp Trp Pro Leu Ala Thr Gly Ala Gly Asn Thr Ser Arg Glu Ala 20 25 30 Glu Ala Leu Gly Glu Gly Asn Gly Pro Pro Arg Asp Val Arg Asn Glu 35 40 45 Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ile Ala Val Leu Ala Val Thr Phe Ala Val 50 55 60 Ala Val Leu Gly Asn Ser Ser Val Leu Leu Ala Leu His Arg Thr Pro 65 70 75 80 Arg Lys Thr Ser Arg Met His Leu Phe Ile Arg His Leu Ser Leu Ala 85 90 95 Asp Leu Ala Val Ala Phe Phe Gln Val Leu Pro Gln Met Cys Trp Asp 100 105 110 Ile Thr Tyr Arg Phe Arg Gly Pro Asp Trp Leu Cys Arg Val Val Lys 115 120 125 His Leu Gln Val Phe Gly Met Phe Ala Ser Ala Tyr Met Leu Val Val 130 135 140 Met Thr Ala Asp Arg Tyr Ile Ala Val Cys His Pro Leu Lys Thr Leu 145 150 155 160 Gln Gln Pro Ala Arg Arg Ser Arg Leu Met Ile Ala Ala Ala Trp Val 165 170 175 Leu Ser Phe Val Leu Ser Thr Pro Gln Tyr Phe Val Phe Ser Met Ile 180 185 190 Glu Val Asn Asn Val Thr Lys Ala Arg Asp Cys Trp Ala Thr Phe Ile 195 200 205 Gln Pro Trp Gly Ser Arg Ala Tyr Val Thr Trp Met Thr Gly Gly Ile 210 215 220 Phe Val Ala Pro Val Val Ile Leu Gly Thr Cys Tyr Gly Phe Ile Cys 225 230 235 240 Tyr Asn Ile Trp Cys Asn Val Arg Gly Lys Thr Ala Ser Arg Gln Ser 245 250 255 Lys Gly Ala Glu Gln Ala Gly Val Ala Phe Gln Lys Gly Phe Leu Leu 260 265 270 Ala Pro Cys Val Ser Ser Val Lys Ser Ile Ser Arg Ala Lys Ile Arg 275 280 285 Thr Val Lys Met Thr Phe Val Ile Val Thr Ala Tyr Ile Val Cys Trp 290 295 300 Ala Pro Phe Phe Ile Ile Gln Met Trp Ser Val Trp Asp Pro Met Ser 305 310 315 320 Val Trp Thr Glu Ser Glu Asn Pro Thr Ile Thr Ile Thr Ala Leu Leu 325 330 335 Gly Ser Leu Asn Ser Cys Cys Asn Pro Trp Ile Tyr Met Phe Phe Ser 340 345 350 Gly His Leu Leu Gln Asp Cys Val Gln Ser Phe Pro Cys Cys Gln Asn 355 360 365 Met Lys Glu Lys Phe Asn Lys Glu Asp Thr Asp Ser Met Ser Arg Arg 370 375 380 Gln Thr Phe Tyr Ser Asn Asn Arg Ser Pro Thr Asn Ser Thr Gly Met 385 390 395 400 Trp Lys Asp Ser Pro Lys Ser Ser Lys Ser Ile Lys Phe Ile Pro Val 405 410 415 Ser Thr

Claims

약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되거나 혼합되지 않은, 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인, 경구적으로 생체이용가능한 비-펩타이드성 선택적인 옥시토신 수용체 길항제를 포함하는 구획을 포함하는,

인간 또는 동물의 조루를 치료 또는 예방하기 위한 약학 팩(pharmaceutical pack).
제 1 항에 있어서,

선택적인 옥시토신 수용체 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 30배 이상 선택적인 약학 팩.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 약학 팩.
약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되거나 혼합되지 않은, 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 20배 이상 선택적인, 경구적으로 생체이용가능한 비-펩타이드성 선택적인 옥시토신 수용체 길항제; 및 포스포다이에스터라제 저해제(PDEi)로 이루어진,

사정 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,

선택적인 옥시토신 수용체 길항제가 바소프레신 수용체와 비교하여 옥시토신 수용체에 대해 30배 이상 선택적인 약학 조성물.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,

바소프레신 수용체가 V1a 수용체인 약학 조성물.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,

포스포다이에스터라제 저해제가 포스포다이에스터라제 5 저해제(PDE5i)인 약학 조성물.