KR20080008395A - 알츠하이머병 치료를 위한 포스포이노시타이드 조절 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포내 포스포티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트 (PIP2)를 증가시키는 물질을 사용하여 알츠하이머병을 치료하는 방법, 및 포스포이노시타이드 농도를 조절하는 물질을 동정하여 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있는 분화된 줄기 세포-기초 분석 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 부분적으로, 특히 가족성 알츠하이머병과 관련된 돌연변이 프리세닐린 유전자를 발현하는 세포에서, 신경독성 Aβ42 펩타이드의 농도를 감소시키고, PIP2 파괴를 촉매하는 효소 저해를 통해 PIP2 농도를 증가시키는 물질인 에델포신(edelfosine)의 발견에 기초한다.

Description

알츠하이머병 치료를 위한 포스포이노시타이드 조절 {PHOSPHOINOSITIDE MODULATION FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE}

우선권

본 출원은 미국 가출원 번호 60/736,735 (2005. 11. 14. 출원); 미국 가출원 번호 60/735,311 (2005. 11. 12. 출원), 및 미국 가출원 번호 60/677,133 (2005. 5. 2. 출원)을 우선권으로 하며, 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.

지원 정보

본 출원은 건강 지원 번호 NS4346H로 국립 협회에 의해 적어도 부분적으로 개발되었으므로 미국 정부가 특정 권리를 소유한다.

1. 서설

본 발명은 알츠하이머병 또는 MCI의 치료, 및 기억력 증진을 위해 포스포티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트(PIP2)를 증가시킨 제제의 용도 및 포스포이노시타이드 농도를 확인하여 다양한 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 분화된 줄기 세포-기초 분석 시스템에 관한 것이다.

2. 발명의 배경

2.1 알츠하이머병

알츠하이머병 (AD)은 약 4백만의 미국인과 전세계적으로 약 2-3천만의 사람들이 감염되는, 가장 일반적인 노인 퇴행성 신경변성 질환이다. AD는 인지력과 기능력의 진행성 감퇴를 특징으로 하여, 사망에 이르게 한다. AD의 전형적인 신경병리적 특징은 해마, 편도, 및 측두엽, 전두엽과 두정엽의 연결 피질(association cortice)에서의 치매 (β-아밀로이드-함유) 플라크 및 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle) (4)의 존재를 포함한다. 더욱 잠재적인 변화로는 내비 피질 및 기저 전뇌의 뉴론과 시냅스의 손상과 반응성 성상세포 변화를 포함한다.

2.2 프리세닐린 및 가족성 알츠하이머병

AD 사례의 약 5%가 가족성이며(FAD), APP 및 프리세닐린 (PSl 및 PS2)의 상염색체 우성 돌연변이에 의해 유전된다. 일부 FAD 사례가 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 자체의 돌연변이에 의해 발생되기도 하지만, FAD 사례의 반 이상과 FAD의 가장 공격적인 형태 (일반적으로 40-50세에 발병하지만, 20 또는 30대에서는 거의 발병하지 않음)는 지금까지 확인된 140개 이상의 돌연변이를 동반하는 PS 1 유전자의 미스센스 돌연변이에 원인이 있다 (1-3). 프리세닐린(presenilin)은 혈장막에 존재하는 작은 풀을 가진, 소포체 (ER) 및 다른 세포내 구획에 주로 위치하는 다층 막 관통 단백질이다 (5,6). PS는 잠정적 막 관통 구역 6 및 7과 연결된 세포질 루프 내에서 단백질분해성 절단을 수행하는 42-43 kDa 홀로단백질(holoprotein)로서 최초 합성된다. 이러한 내인성 단백질 분해(endoproteolytic) 과정은, 결합하여 효소적 활성 헤테로다이머를 형성하는 안정한 27-28 kDa N-말단 및 16-17 kDa C-말단 절편을 형성한다 (7-9). 프리세닐린은 PS 막 관통 도메인 6 및 7 내부에 아스파르틸 단백분해효소의 특징인 2개의 보존성 아스파르틸(aspartyl) 잔기를 가지며 (10), 아스파르틸 단백분해효소 전이-상태 유사물질 저해제는 PSl 및 PS2에 직접 결합한다 (11,12). 프리세닐린이, APP를 포함하는, 점차 증가하는 타입-1 막 단백질의 절단을 매개하는 비보편적인 아스파르틸 단백분해효소, 즉, γ-시크리타제(시크리타제) 복합체의 촉매 성분의 역할을 할 수 있음을 보여주는 증거들이 속출하고 있다.

2.3 아밀로이드 형성 ( amyloidogenic ) Aβ42 펩타이드의 생성

APP의 경우, γ-시크리타제가 아밀로이드-β (Aβ) 도메인의 C-말단 절단을 매개하여, α-(ADAMlO 및 TACE) 또는 β-시크리타제 (BACEl)에 의한 엑토도메인 쉐딩(ectodoamin shedding)을 통해 형성되는 막-결합 APP C-말단 절편으로부터 Aβ/p3가 유리되도록 한다. γ-시크리타제 절단으로 2개의 Aβ의 주요 이성체인 Aβ40 및 Aβ42가 생성된다. PSl 및 PS2 유전자의 모든 돌연변이가 γ-시크리타제 활성을 조절하여, 가능하게는 양성 Aβ40 펩타이드를 희생시켜, 고 아밀로이드 형성 및 신경독성 Aβ42 펩타이드의 생성을 증대시킨다는 것이 문헌에 의해 입증되었다 (14,15).

2.4 프리세닐린과 세포내 칼슘

확인되고 시험된 모든 PS 돌연변이는 또한 세포내 Ca^{2 +} 항상성을 파괴한다 (24). 칼슘 신호전달의 교란은 매우 지속적이어서 증상이 시작되기 몇 년 이전에 FAD를 예견하는데 사용될 수 있다 (16). PS 돌연변이의 칼슘 신호전달에 대한 효과의 최초 관찰은 Ito 등 (17)에 의해 10년 이전에 문헌으로 입증되었으며, 그들은 이노시톨 (l,4,5)-트리포스페이트(IP3)-매개 칼슘 방출이 AD 환자 유래의 섬유모세포에서 강력하다는 것을 보여주었다. PSl M146V 돌연변이를 과발현하는 Xenopus 난모세포에서의 기본적 칼슘 방출 현상의 분석에서, 칼슘 ER 농도의 비정상적인 증가를 시사하는 IP3에 대한 감수성 증가가 나타났다 (18). L286V 돌연변이를 과발현하는 PC12 세포에서, 비정상적인 효능제 자극성의 ER 칼슘 방출은 Guo 등 (19)에 의해서도 보고되었다. 또한, 돌연변이 PSl를 과발현하는 형질전환 마우스 유래의 신경에서, 브래디키닌 및 답시가르긴(thapsigargin)-유도 칼슘 반응의 증가가 관찰되었다 (20). 흥미롭게도, PS는 정전기적(capacitative) 칼슘 유입 (CCE)을 조절하여, IP3-매개 ER 칼슘 방출 및 ER 저장소 보충의 결합된 과정을 조절하는 것으로 보고되었다 (21). PSl 과발현 소실로 CCS가 강화되는 반면, FAD PSl 돌연변이는 CCE 및 저장소-작동 전류를 약화시킨다 (21-23).

2.5 포스포이노시타이드 신호전달과 알츠하이머병

포스포이노시타이드 ("PI")는 다양한 배열의 세포 통로에서 신호전달 물질의 역할을 하며 (25-27), 특정 세포 타입에서의 PI 이상 조절이 다양한 인간 질환 상태를 진행시키는 것으로 나타났다 (47). PI 신호는, PH (Pleckstrin Homology), 엡신 N-말단 호몰로지 (ENTH), Fabp/YOTB/Vaclp/EEAl (FYVE), PX (Phox homology), 및 N-WASP 다염기성 모티프 도메인을 포함하는, 다수의 특정 PI-결합 도메인이 결합하고 있는 신호전달 단백질과의 상호작용에 의해 조절된다 (49-54). PI-결합 도메인과 그의 표적 PI 간의 상호작용은 지질 단백질 복합체가 세포내막에 보충되도록 한다.

PI 신호는 다수의 키나제, 포스페이타제 및 포스포리파제에 의해 강력하게 조절된다. 생물학적으로 관련된 PI 간의 전환을 보여주는 모식도를 도 1에 나타내었다. 중추신경계에서, 신경 말단의 PI 농도는 포스포이노시톨 포스페이트 키나제 타입 lγ (PIPklγ)와 같은 시냅스 키나제 및 SYNJl (시냅토자닌 1)와 같은 포스페이타제에 의해 조절된다. 뇌에서의 PIP2 가수분해는 다음 2가지 신호 경로를 통한 다수의 자극에 반응하여 발생한다: a)PLCβ로 매개된 G 단백질 연결 신경전달 수용체(예를 들어 글루타메이트 및 아세틸콜린)의 활성화 및 b)PLCγ로 매개된 성장 인자 및 뉴로트로핀(예를 들어 NGF, BDNF)에 대한 타이로신 키나아제 연결 수용체의 활성화. 상기 반응은 2개의 세포내 전달자, IP3 및 다이아실글리세롤 (DAG)를 생산하고, 이 전달자는 세포내 칼슘 방출 및 단백질 키나아제 C(PKC) 활성화를 개별적으로 매개한다. 더욱이 PIP2가 다양한 채널 및 전송자의 공지된 조절자이기 때 문에 PIP2 자체에서 위치한 세포막의 변화는 중요한 신호가 될 수 있다(30).

대조군과 비교해 볼때, AD 환자의 관자 피질에서 PI 농도의 감소가 Stokes 및 Hawthorne에 의해 보고되었다(63). 대조군 및 AD 뇌에서 특이적인 PLC 아이소자임의 수준과 비교하려는 목적의 정량적 연구는 AD에서의 PLCδl 및 PLCγl의 이상 축적을 보고하였다(31, 32). 검시 인간 대조군 및 AD 뇌 부분에서의 작용체 자극 PIP2 가수분해의 연구에서(33-35) 콜린유발성 및 세로톤유발성 PLC 활성에 반응하여 감소된 PIP2 가수분해를 보여주었다. PI 경로를 통하여 작용하는 다수의 신경전달자는 APP-α 방출을 증가시켜서(64,65), Aβ 생합성을 방지하는 것으로 나타났다.

이노시톨 포스포리피드의 수용체 매개 대사는 세포성장, 세포자멸사(apoptosis), 이온-채널 개이팅(gating) 등의 조절을 수반한 많은 수의 지질 이차 전달자를 생산하는 것으로 공지되어 있다. 따라서 이차 전달자의 파괴 및 상응하는 신호전달 경로의 불활성화의 역할을 하는 효소가 적당한 세포 기능에 필수적이다. PLC 및 PI-3 키나제 신호전달 경로는 하류 대사물을 형성하기 위하여 다양한 이노시톨 포스포리피드로부터 5-포스페이트의 제거 역할을 하는 조절 활성을 가진다. 기질 특이성에 기초하여 이노시톨 5-포스페이타제는 타입 I 또는 타입 II로 특징지워진다. 타입 I 활성은 Ins(l,4,5)P3 및 Ins(l,3,4,5)P4의 가용성 헤드-군으로 작용하고, 이들은 생물학적인 불활성 대사물을 생산하여 이노시톨 폴리포스페이트 축적의 절대적이고 일시적인 한계를 규정짓는다. 대조적으로 타입 II 5-포스페이타제는 하나 이상의 포스포이노시타이드 및 (적어도 일부의) 5-포스페이타제 작용에 대한 활성을 가지며, 예를 들어, PtdIns(4)P 및 PtdIns(3,4)P2는 잠재적인 이차 전달자를 가진다. 공지된 이노시톨 포스페이타제의 명부를 아래 표 1에 나타내었다.

3. 발명의 요약

본 발명은 신경 포스포티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트(PIP2)을 증가시키는 물질을 이용한 알츠하이머병 또는 경도 인식 장애(MCI)를 치료하고/치료하거나 기억력을 개선하기 위한 방법 및 조성물, 및 포스포이노시타이드 농도를 조절하는 물질을 동정하여 다양한 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 분화된 줄기 세포-기초 분석 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 부분적으로, 특히 가족성 알츠하이머병과 관련된 돌연변이 프리세닐린 유전자를 발현하는 세포에서, 신경독성 Aβ42 펩타이드의 농도를 감소시키고, PIP2 파괴를 촉매하는 효소 저해를 통해 PIP2 농도를 증가시키는 물질인 에델포신(edelfosine)의 발견에 기초한다. 또한, AD 모델 시스템에서 수행된 실험 결과들에서, (i) 시험관내 해마 세포내 PIP2의 증가가 Aβ42 증가와 관련된 시냅스 기능장애를 저해하고; (ii) 수조미로(water-maze) 시험에서 입증된 바와 같이, AD 모델 (PSAPP) 마우스에서 PIP2 증가가 마우스의 공간 기억력을 개선시키는 것으로 나타났다.

본 발명은 또한, PLCβ3 및/또는 PLCγl을 활성화하는 물질을 사용하여 알츠하이머병 또는 경도 인식 장애를 치료하고/치료하거나 기억력을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 특정 비제한적 구현예에서, 상기 물질은 Rk1 및/또는 (20S)Rg3를 포함하나 이에 제한되지 않는 진세노사이드와 함께 투여될 수 있다. 이는 적어도 부분적으로 PLCβ3 또는 PLCγl의 선택적 저해가 (20S)Rg3의 Aβ42-강하 효과를 방해한다는 점에 기초한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 β-시크리타제와 같은 PIP2에 의해 조절되는 물질을 표적으로 한 알츠하이머병 또는 경도 인식 장애를 치료하고/치료하거나 기억력을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 β-시크리타제를 저해하는 화합물을 투여하여 알츠하이머병을 치료하는 단계를 포함한다.

5. 발명의 상세한 설명

본 발명의 상세한 설명은 발명을 제한하기 위한 것이 아닌 명확성을 목적으로 다음의 소부분으로 구분된다:

(i) PIP2 농도를 증가시키는 방법;

(ii) 치료 표적으로서 PIP2 조절 시크리타제;

(iii) PIP2 조절자를 동정하기 위한 분석 시스템; 및

(iv) 알츠하이머병 또는 MCI의 치료 및/또는 기억력 개선 방법.

5.1 PIP2 농도를 증가시키는 방법

본 발명은 PI 대사와 관련된 분자를 조절하고 (예, 도 1A-C), 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 5 %, 적어도 약 10 %로 및/또는 후술될 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 PIP2 농도를 증가시키는데 효과적인 물질을 유효량으로 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 세포에서 PIP2 농도를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 물질은 예컨대, PIPK1γ의 활성을 증대시키거나, PLC 활성을 저해하거나, SYNJl 활성을 저해하거나, PI3-K 활성을 저해하거나, PTEN 활성을 증대시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료를 필요로 하는 세포"는 포스포이노시타이드 신호전달 이상 상태의 병원균과 관련된 세포: 예컨대, 췌장 β 세포, 암 세포 (예, 급성 골수성 백혈병 세포), 또는 바람직하게는, 증가된 Aβ42 생성 및/또는 농도, 노인성 플라크, 신경섬유매듭, 및/또는 시냅스 기능장애 (예, 해마 신경세포, 도 5 참조)와 같은 AD의 하나 이상의 특징을 나타내는 신경세포일 수 있다. 치료 세포에 대한 본 발명의 원하는 효과는 PIP2 증가 이외에 Aβ42 감소, 및/또는 장기강화현상(long term potentiation)의 증진을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

제 1 예로, 본 발명은 PLC를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 5 %, 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, 에델포신(edelfosine) 또는 그 유도체의 용도를 제공한다. 특정 비제한적 구현예에서, 에델포신 또는 그 유도체는 치료될 세포 영역에서 약 1 내지 50 μM, 바람직하게는 약 5 내지 20 μM의 국소 농도를 달성하도록 투여될 수 있다. 추가적인 비제한적 구현예에서, 에델포신 또는 그 유도체는 약 15-20 mg/kg/day 양으로 치료될 세포를 포함하는 인간에게 정맥내, 피하, 경막내 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로 투여될 수 있다 (61).

제 2 예로, 본 발명은 PLC를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, 밀테포신(miltefosine), 또는 그 유도체의 용도를 제공한다. 밀테포신은 Zentaris, GmbH로부터 입수 가능하다. 특정 비제한적 구현예에서, 밀테포신 또는 그 유도체는 치료될 세포 영역에서 약 3 내지 25 μM의 국소 농도를 달성하도록 투여될 수 있다. 추가적 비제한적 구현예에서, 밀테포신 또는 그 유도체는 치료될 세포를 포함하는 인간에게 약 2.5 mg/kg/day 양으로 정맥내, 피하, 경막내 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로 투여될 수 있고/있거나 1일 1회 또는 2회 10 mg 또는 50 mg 정제로 투여될 수 있다.

제 3 예로, 본 발명은 PLC를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, 페리포신(perifosine)과 같은 독일 특허 DE 4222910에 개시된 인지질 유도체의 용도를 제공한다.

제 4 예로, 본 발명은 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, 에루실포스포콜린, 또는 그 유도체와 같은 유럽 특허 번호 507337에 개시된 에루실(erucyl), 브라시딜(brassidyl) 또는 네르보닐(nervonyl)-함유 포스포콜린의 용도를 제공한다. 특정 비제한적 실시예에서, 유럽 특허 출원 번호 507337에 개시된 에루실포스포콜린, 또는 관련 화합물은 약 0.5-10 mM의 1일 용량으로 치료될 세포를 포함하는 인간에게 정맥내, 피하, 경막내 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로 투여될 수 있다.

제 5 예로, 본 발명은 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, 미국 특허 번호 4,837,023에 개시된 알킬포스포콜린, 예컨대, 헥사데실포스포콜린, 또는 그 유도체를 포함하나 이에 제한하는 것은 아닌 알킬포스포콜린의 용도를 제공한다. 예를 들어, 상기 알킬포스포콜린은 약 5 내지 2000mg, 바람직하게는 약 5 내지 100 mg의 1일 용량으로, 치료될 세포를 포함하는 인간에게 정맥내, 피하, 경막내 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로 투여될 수 있다.

제 6 예로, 본 발명은 PLC를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, 일모포신(ilmofosine), 또는 그 유도체의 용도를 제공한다. 추가적 비제한적 구현예에서, 일모포신 또는 그 유도체는 1주 1회 약 12-650 mg/m²의 용량으로 치료될 세포를 포함하는 인간에게 정맥내 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로 투여되거나 (55), 또는 바람직하게는 약 10 mg/kg의 용량으로 경구 또는 피하로 (또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로) 투여될 수 있다.

제 7 예로, 본 발명은 PLC를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, BN 52205 (57), 또는 그 유도체의 용도를 제공한다.

제 8 예로, 본 발명은 PLC를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, BN 5221.1 (57), 또는 그 유도체의 용도를 제공한다.

제 9 예로, 본 발명은 PLC를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-메틸프로프-l-일 2'-(트리메틸암모니오) 에틸 포스페이트 (58) 또는 그 유도체의 용도를 제공한다.

제 10 예로, 본 발명은 PI3K를 저해하고, 이에 제한하는 것은 아니나 바람직하게는 적어도 약 10 %로 및/또는 PI-센서를 포함하는 분석 시스템으로 검출가능하도록 세포내 PIP2 농도를 증가시키는, PI3-K 저해제인 LY294002 (59,60)의 용도를 제공한다. 특정 비제한적 구현예에서, LY294002 또는 그 유도체는 치료될 세포 영역에서 약 2 내지 40 μM, 바람직하게는 약 2 내지 20 μM의 국소 용량을 달성하도록 투여될 수 있다.

제 11 예로, 본 발명은 예를 들어 50mM 농도의, 5-포스포이노시타이드 포스페이타제를 저해하는 화합물, 예를 들어, Ro-31-8220 또는 Go-7874 칼비오켐(Calbiochem)/노바비오켐(Novabiochem) (Alexandria, Australia), 또는 이노시톨 헥사키스포스페이트 (InsP₆)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 SYNJl 저해제의 용도를 제공한다.

제 12 예로, 본 발명 PIP 키나제의 작용제 화합물의 용도를 제공한다 (도 4D 및 E 참조).

5.2 치료 표적으로서 PIP2 조절 시크리타제

추가적 구현예에서, 본 발명은 β-시크리타제와 같은 PIP2에 의해 조절되는 물질을 표적으로 한 알츠하이머병 또는 MCI를 치료하고/치료하거나 기억력을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 Kwak, H.M., et al, 2005에 개시된 석류로부터 분리된 화합물을 포함하나 이에 제한하는 것은 아닌, β-시크리타제 저해 화합물을 투여하여 알츠하이머병 또는 MCI의 치료 및/또는 기억력 개선하는 단계를 포함한다. 석류 (Punica granatum) 껍질 유래의 베타-시크리타제 (BACEl) 저해제는 Arch Pharm Res. 28(12):1328- 32를 참조한다.

5.3 PIP2 조절자를 동정하기 위한 분석 시스템

본 발명은 PIP2를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 포스포이노시타이드 조절자를 저해 또는 활성화하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있는 분석 시스템 및 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 검출가능한 포스포이노시타이드 센서를 발현하고, 분화된 세포군의 구별되는 특성을 하나 이상 재현하기 위해 분화하도록 유도된, 줄기 세포를 포함하는, 분화된 세포군에서 포스포이노시타이드 농도를 조절하는 물질을 동정하기 위한 분석 시스템을 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 관심 있는 포스포이노시타이드 농도를 조절하는 물질을 동정하기 위한 방법을 제공한다:

(i) 관심 있는 포스포이노시타이드에 결합하는 검출가능한 포스포이노시타이드 센서 ("PI 센서")를 발현하는 줄기 세포를 제공하며, 상기 줄기 세포가 분화된 세포군의 구별되는 특성을 하나 이상 재현하기 위해 분화하도록 유도되는 단계;

(ii) 상기 분화된 줄기 세포를 시험 물질에 노출시키는 단계; 및

(iii) 상기 시험 물질에 대한 노출이 포스포이노시타이드 센서에 검출가능한 변화를 가져오는지 결정하되, 상기 포스포이노시타이드 센서의 변화가 상기 시험 물질에 의한 포스포이노시타이드 농도 조절을 의미하는 단계.

다른 구현예에서, 후술된 바와 같이, 본 발명은 임의로 PI 센서를 포함하는, 피라미드 신경세포의 구별되는 특성을 하나 이상 재현하기 위해 분화하도록 유도된 줄기 세포를 포함하는, 알츠하이머병 치료용 물질을 동정하기 위한 분석 시스템으로서, 상기 분화된 줄기 세포는 알츠하이머병 진행과 관련된 유전자를 추가로 포함하도록 고안된 분석 시스템을 제공한다.

전술한 구현예에서, 상기 줄기 세포는 바람직하게는 관심 있는 세포 타입을 분화하도록 유도된다. 예를 들어, 신경변성 질환을 치료하는데 사용되는 물질을 동정하기 위한 분석 시스템의 경우, 줄기 세포는 신경세포 표현형을 재현하기 위해 분화하도록 유도될 수 있다 (본 명세서에서 "재현(recapitulate)"은 분화된 세포가 관심 있는 세포의 모든 표현형 특성이 아닌, 하나 이상의 특성을 공유하는 것을 의미한다).

분석 시스템이 알츠하이머병 치료제의 확인에 사용되는 경우, 줄기 세포는 바람직하게는 피라미드 신경세포의 표현형을 재현하기 위해 분화하도록 유도된다. 유사하게, 파킨슨병 치료에 사용될 수 있는 물질을 확인하기 위해서, 줄기 세포는 바람직하게는 흑색질 세포의 표현형을 재현하기 위해 분화하도록 유도될 수 있고; 근위축성 측삭 경화증 치료에 사용될 수 있는 물질을 확인하기 위해서, 줄기 세포는 바람직하게는 자율신경세포 등의 표현형을 재현하기 위해 분화하도록 유도될 수 있다. 그러나, 본 발명의 분석 시스템은 신경세포계에 제한되는 것은 아니다. 포스포이노시타이드는 다양한 질병과 관련되어 있기 때문에, 본 발명은 당뇨병을 치료하는 물질의 동정에 사용될 수 있는 분석 시스템을 제공하기 위한 섬세포; 암을 치료하는 물질의 동정에 사용될 수 있는 분석 시스템을 제공하기 위한 암 세포; 심부전을 치료하는 물질의 동정에 사용될 수 있는 분석 시스템을 제공하기 위한 심장 세포; 골수형성이상 증후군 (MDS) 또는 급성 골수성 백혈병 (AML)과 같은 다른 이상증을 가진 형질전환 또는 조혈 세포를 치료하는 물질의 동정을 위한 조혈 줄기 세포; 두개내 동맥류의 형성 및 치료 기전을 확인하기 위한 신경세포 또는 성상세포 줄기 세포; 천식 또는 COPD (만성 폐쇄성 폐질환)을 치료하는 물질의 동정을 위한 폐 줄기 세포; 또는 X-연관 근세관성 근증 (XLMTM) 등과 같은 질환을 치료하는 물질의 동정을 위한 근육 줄기 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는 관심 있는 질환과 관련된 세포의 표현형을 재현하기 위해 분화하도록 유도된 줄기 세포를 포함하는 분석 시스템을 포함한다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 줄기세포원(source)은 마우스 (Evans and Kaufman, Nature. 1981, 292(5819):154-156; Martin, Proc Natl Acad Sci U S A. 1981, 78(12):7634-8.), 인간 (Thomson et al., Science. 1998, 282(5391): 1145-1147; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 95:13726- 13731), 원숭이, 소, 고양이, 개, 말, 양, 염소 또는 돼지 종 및 닭을 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 비인간 포유류 동물을 포함한다 (Pain et al., 1996, Development 122, 2339-2348). 본 발명에 따라 사용되는 줄기 세포는 배아 세포, 태아 세포 또는 성인 줄기 세포를 포함하는 다양한 출처 또는 성장 단계로부터 유래될 수 있다. 본 발명은 제대혈 유래 줄기 세포; 배아, 태아 또는 성인 신경세포의 줄기 세포; 배아, 태아 또는 성인의 조혈 줄기 세포; 태아 또는 성인의 골수 줄기 세포; 및 췌관, 장 또는 간 세포 유래의 줄기 세포를 포함하나 이에 제한하는 것은 아니다. 본 발명은 또한 비제한적 구현예에서 골수 또는 다른 조직 유래의 태아 또는 성인 중간엽 줄기 세포; 지방 조직 유래 줄기 세포; 모낭 유래 줄기 세포를 포함한다. 본 발명에 사용되는 줄기 세포는 1차 세포 또는 무한증식 세포주일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ES 세포는 인간 PSl의 델타 E9 및 L286V 돌연변이 변이체를 안정하게 과발현하는 마우스 ES 세포주를 포함하나 이에 제한하는 것은 아니다. 다른 비제한적인 예는 TUJ-I, CamKIIα, p75 및 TrkB를 포함하는, 다양한 신경세포 마커를 발현하는 ES-유래 피라미드-유사 세포를 포함한다. 인간 APP (hAPPsw)의 스웨덴 변이체를 발현하는 ES 세포주가 Aβ42 발생 표현형을 재현하기 위해 사용될 수 있다.

줄기 세포는 당해 분야에서 공지된 방법으로 분화하도록 유도될 수 있다. 세포주의 유지 또는 분화에 사용하기 위한 줄기 세포를 배양하는 비제한적인 예는 다음과 같다. 인간 줄기 세포 (hSC)는 마우스 배아 섬유모세포 층 (CFl 균주) 위의 젤라틴화 조직 배양 디쉬 (0.1% 젤라틴 코팅) 상에서 성장되고, MEF 배지에서 배양되며, 10μg/ml 미토마이신 C 처리 또는 8000 rad의 γ-방사선 조사에 의해 분열이 불활성화되고, 젤라틴-코팅된 6-웰 디쉬에 웰당 2.5 ml 중 0.75 x 10⁵ cell/ml의 세포 밀도로 평판 배양될 수 있다. 상기 hSC를 계대하기 위해, 세포는 PBS로 1회 또는 2회 세정하고, 10 내지 30분간 DMEM/F12 중 필터-멸균된 lmg/ml 콜라게나제 IV로 배양할 수 있다. 평판은 콜로니가 분리되기 시작할 때까지 10분마다 흔들어줄 수 있다. 평판을 부드럽게 손가락으로 두드려 콜로니가 분리되면, 콜로니를 수집하고 웰을 hSC 배지로 세정하여 평판 및 웰에 잔존한 hSC를 수집하였다. hSC의 목적으로 하는 분화는 필요로 하는 계통의 타입에 따라 수행될 수 있다. 원하는 계통은 특정 계통으로 분화하는 공지된 능력에 따라 적절한 hSC 선택을 필요로 할 수도 있다.

비분화된 신경세포의 전구 줄기 세포를 분화하기 위한 비제한적 방법은 다음과 같다. 신경 전구 세포는 레티노산 (RA) (0.5 μM)으로 배양하여 도파민성 신경세포로 전환될 수 있다. 분화 정도는, 신경세포 마커인 미세관-관련 단백질 (MAP)-2ab에 대한 양성 면역활성, 타이로신 하이드록실라제 (TH)에 대한 양성 면역활성, 및 도파민성 신경세포 표현형의 존재를 지시하는 도파민 (DA)과 그의 대사물인 3,4-디하이드록시페닐아세트산 (DOPAC)의 농도 증가를 보이는 배양된 세포수를 측정하여 결정될 수 있다. 도파민 (10 μM) 및 폴스콜린(forskolin; Fsk) (10 μM)의 존재 하에 도파민성 표현형으로의 신경 전구 세포 분화를 촉진하기 위하여, 배양 배지 중에 BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) (50 ng/ml), GDNF (glial-derived neurotrophic factor) (10 ng/ml) 및 인터루킨-1 베타 (IL-I 베타) (10 ng/ml)가 사용될 수 있다. 전구 세포가 다른 신경전달물질 표현형 계통으로 트랜스-분화(trans-differentiation) 증강이 줄기 세포의 분화 능력에 따라 달성될 수 있다. 예컨대, 세로토닌 (Ser) (75 μM), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF) (10 ng/ml), BDNF (50 ng/ml) 및 폴스콜린 (10 μM)과 같은 적절한 칵테일 물질은, 배양 매질로 분비되는, 5-HT 및 그 대사물의 합성, 및 트립토판 하이드록실라제 (TPH) 양성 면역활성에 대한 시험에 의해 결정되는 세로토닌성 세포 계통 경로 아래로 특정 인간 줄기 세포를 이끌 수 있다. 하기 실시예 7에 피라미드 신경세포의 표현형을 재현하기 위한 뮤린 ES 세포의 표적이 되는 분화가 기재되어 있다.

전술한 방법을 적절히 변형하여 재현되는 세포 타입의 예는 신경세포, 아교세포, 각질세포, 수지상 세포, 심근세포, 조혈 세포, 연골세포, 췌장 β-세포, 지방세포, 골모세포, 적혈구, 혈관세포, 골격근 세포, 간세포, 폐세포, 및 생식세포를 포함하나 이에 제한하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 PI 센서는, 센서를 포함하는 분화된 세포를 시험 물질에 노출시킴으로서 형성되는 PI 수준의 변화를 검출하는데 사용된다. 검출은 바람직하게는 센서의 세포적 위치 변화를 기초로 하나 (하기 참조), 예를 들어, 형광 신호의 강도 또는 빈도, 반응 산물의 생성, 에피토프-특이적 항체에 대한 결합능 등의 다른 형태의 신호 변화에 기초할 수도 있다. 따라서, 비제한적 구현예에서, PI 센서를 포함하는 살아 있거나 고정된 줄기 세포에서의 직접적인 시험을 통하여 검출과 정량이 달성될 수 있다. 필름, 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 포스포이미저(Phosphorlmager) 방법론과 같은 당해 분야에 공지된 이미징 기술이 PI 센서를 검출하고 측정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, PI 센서의 양을 측정하는데 줄기 세포의 추출물 제조를 포함하는 간접적인 수단이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 줄기 세포로부터 추출 후, 특정 검출 시약 또는 시스템을 이용하여 PI 센서를 검출 또는 정량할 수 있다. PI 센서가 태그되거나 적절히 라벨링된 경우에는 추출 후 직접적으로 PI 센서를 측정할 수 있다. 대안적으로, 표지된 대응 경쟁자에 대한 경쟁을 통하여 PI 센서를 간접적으로 측정할 수 있다. 비제한적 구현예에서, PI 센서의 직접적인 측정이든지 또는 표지된 경쟁자를 통한 측정이든지 간에 검출 시스템은 HA-, Myc- 또는 FLAG-표지 등과 같은 펩티드, 당근 과산화효소(horseradish peroxidase), 비오틴을 포함하나 이에 제한되지 않는 결합 단백질, 특정 에피토프, 방사성 동위원소 또는 형광 표지일 수 있다. 특정 비제한적 구현예에서, PI 센서는 단백질 대 막 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 이용한 평형 결합 측정으로 검출되고 정량될 수 있다. 이 시스템에 의해, 혈장막 내엽 조성물에 근접한 생리적 지질 혼합물을 이용하는 막-결합 PIP 지질에 결합되어(docking) 있는 도메인이 검출된다 (Corbin et al. Biochemistry. 2004, 43(51):16161-16173).

따라서, 본 발명의 PI 센서는 일반적으로 (i) 포스포이노시타이드에 결합하고 (ii) 신호를 생성할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 PI 센서는 PH-GFP이다. 예를 들어, (62)를 참조한다. PH 도메인은 PIP2에 대해 높은 친화성을 가지며 포유류 세포 내 PIP2의 공지된 분포와 일치되도록 혈장막에 국소적으로 배치된다. PLC 활성과 PIP2 가수분해가 PH-GFP를 혈장막에서 사이토졸로 재분포시키기 때문에, PH-GFP 융합 단백질은 PIP2의 동적 측정을 제공한다. 반대로, PH-GFP PI 센서 존재 하에 PIP2가 증가하면 세포막으로 PH-GFP가 이동하여 축적되며, 이는 예를 들어, 형광 현미경을 이용하여 시각화될 수 있다. 따라서, PH-GFP PI 센서를 포함하는 본 발명의 분석 시스템은 세포막에서의 형광(PH-GFP) 국소화로 PIP2의 증가를 지시하며, 그 결과 세포는 선명하게 윤곽이 그려질 수 있다.

본 발명의 비제한적 구현예에서, PH-GFP 분자는 인간 또는 비인간 동물로부터 유도된 PI 농도에 반응하는 임의의 적절한 PH-도메인 서열을 포함할 수 있다. PH-도메인의 비제한적 예는 적절한 GFP 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 N-말단 또는 C-말단이 융합된, 인간 DAPPl (아미노산 167-257), 인간 GRPl (아미노산 267-399), 마우스 Btk PH 도메인 (아미노산 6 내지 217), Shc-PTB 도메인 (아미노산 17-207) 등을 포함한다. 추가적 구현예에서, 본 발명은 FYVE (Fab1-YOYP-Vacl-EEAI) 도메인, ENTH (epsin amino-terminal homology) 도메인, PX (PLD2-Phox homology) 도메인, 신경 위스콧 알드리치 증후군 (Wiskott Aldrich Syndrome) 단백질 (N-WASP) 도메인 또는 당해 분야에 공지된 다른 적절한 PI 결합 도메인을 포함하나 이에 제한하지 않는 대안적인 PI-결합 분자와 융합된 GFP-형광 표지를 포함하는 PI 센서 단백질 융합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 전술된 하나 이상의 PI-결합 분자를 기초로 하는 PI 센서는 코돈-최적화 변이체, 예를 들어, 레드-, 블루- 또는 옐로우-형광 단백질 및 그의 변이체를 포함하는 다양한 범위의 형광 방출 스펙트럼을 가지는 변이체 및 증강(enhanced) 변이체를 포함하나, 이에 제한하지 않는 GFP 관련 형광 단백질에 융합될 수 있다. PI 센서에 기초하고, 센서를 포함하는 분화된 세포를 시험 물질에 노출시킴으로서 형성되는 PI 수준의 변화를 검출하는데 사용되는 본 발명의 분석 방법은 PI와의 상호작용 특성이나 특이적인 동질성에 의존하지는 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 줄기 세포는 전술된 바와 같이 적절히 표지되거나 형광 단백질과 융합된, PH, FYVE, ENTH, PX 또는 N-WASP 도메인에 기초한 PI 센서를 포함할 수 있다.

PI 센서의 검출 및 정량은 전술한 하나 이상의 검출 또는 분석 시스템에 의한다. 추가적으로, PI 센서는 입체 형태 변화, 세포내 위치 변화 또는 PI와 PI 센서 간 상호작용 특성에 의존한 반응을 포함하는 PI와의 모든 공지된 상호작용 기전을 포함한다.

본 발명의 PI 센서는 표적이 되는 분화 이전 또는 이후에 줄기 세포에 삽입될 수 있다. PI 센서를 코딩하는 핵산은 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있고, 임의로 프로모터/인헨서 요소, 전사와 번역의 개시 및 종료 요소, 인트론 서열, 미니젠(minigen) 서열 및/또는 선별 마커를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 세포 내 PI 센서 발현에 필요하거나 바람직한 하나 이상의 요소와 함께, 벡터 (후술함) 내에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 본 발명에 사용되는 프로모터/인헨서 요소는 분화-특이적 분석 시스템을 제공할 목적으로 조직 특이적, 세포 특이적 또는 발달 단계 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 선별 마커는 비제한적 구현예로 네오마이신, 푸로마이신, 블라스티시딘, 하이그로마이신 또는 제오신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 선별 마커는 PI 센서 (바이시스트론성(bicistronic) 입체형태)와 동일한 전사 요소를 사용하여 발현되거나, 독립적인 발현 요소군을 통하여 발현될 수 있다.

본 발명의 PI 센서를 코딩하는 핵산은 전술한 발현 요소를 포함하는, 플라스미드, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터 내에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 말단이 분화된 신경세포 (배양 7일)가 렌티바이러스 벡터를 이용하여 본 발명의 PI 센서를 발현하도록 일시적으로 형질 도입될 수 있다.

본 발명은 PI 센서를 줄기 세포에 송달하는 방법을 추가로 포함한다. 송달 방법의 비제한적인 예로 물리적 수단 또는 생물학적 방법을 포함한다. 따라서, 임의로 벡터에 포함된, PI 센서를 코딩하는 핵산은 전기천공되거나, 미세주입되거나, 당해 분야에 공지된 형질전환의 다양한 변형을 포함하는 형질전환에 의해 도입되거나, 바이러스 벡터를 이용한 바이러스 형질도입에 의해 도입될 수 있다. 본 발명의 벡터는 통합 또는 에피솜 벡터일 수 있다. 본 발명의 벡터는 추가로 복제 또는 비복제 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 대안적으로, PI 센서 단백질은 예를 들어, 리포솜 기술 또는 세포에 단백질 흡수를 촉진하는 다른 공지된 수단을 이용하여 도입될 수 있다.

PI 센서를 발현하는 줄기 세포는, 또한, 시험 물질의 투여 결과로서 동물에서 포스포이노시타이드 농도 변화를 모니터하기 위하여 동물 생체내에 이식될 수 있다. 특정 구현예에서, 형질전환 PI 센서를 발현하는 줄기 세포는 가임신 암컷 마우스에 이식되어 모든 세포에서 PI 센서를 포함하는 형질전환 동물을 생산할 수 있다. 그 후, 상기 동물은 추가적 분석을 위해 추정 줄기 세포 집단에서 새로운 집단을 분리해내는데 사용될 수 있다. 추가적 구현예에서, 적절한 프로모터가 특정 조직, 세포 계통 또는 발달 단계에서 PI 센서를 발현하는데 사용될 수 있다. 또한, PI 센서를 발현하는 이종유래 줄기 세포가 다른 종의 면역억제 동물계에 도입될 수 있다. 본 발명은, 센서를 포함하는 분화된 세포를 시험 물질에 노출시킴으로서 형성되는 PI 수준의 변화를 검출하기 위한 상기 임의의 동물계의 사용을 포함하나 이에 제한하는 것은 아니다. 하나 이상의 세포 또는 조직 내에 또는 이종이식에 의해, 통합된 GFP-함유 PI 센서를 포함하는 형질전환 동물은 시험 물질 투여 후, 예컨대, 살아있는 동물에서 GFP 형광을 모니터하는 것과 같은 (Hansen et al In Vivo. 2002 16(3): 167- 174) 적절한 수단을 이용하여 생체내에서 시험될 수 있으며, 대안적으로 사후에 그러한 동물로부터 유래된 조직을 분석할 수 있다. 특정 구현예에서, PI 센서 형질전환 마우스는 3xTg-AD 마우스와 같은 알츠하이머병 마우스 모델 (Billings et al 2005 신경세포. 45(5):675-88) 또는 인간 신경변성 질환의 다른 마우스 모델 (Bloom et al, 2005 Arch Neurol. 62(2): 185-187)과 교차교배시킬 수 있다.

각 표적 질환에 직접 대응되는 포스포이노시타이드 효과기의 소분자 조절자를 동정하는데 본 발명의 분석 시스템으로서 보편적인 포스포이노시타이드 스크리닝 플랫폼을 사용할 수 있다. 그러한 기술은 약물 발견을 위한 고 생리적 세포 시스템을 제공한다.

추가적 구현예에서, 전술된 분화된 줄기 세포는, 프리세닐린 1, 프리세닐린 2, 또는 β-아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 돌연변이 형태가 PI 센서를 수반하거나 수반하지 않도록 고안될 수 있고, AD용 모델 시스템으로서, 또한, 시험 물질의 AD에 대한 치료적 효능을 스크리닝하는 분석 시스템에 사용할 목적으로 사용될 수 있다. 프리세닐린, APP, 또는 AD 병인과 관련된 다른 분자의 돌연변이 형태의 유전자를 코딩하는 핵산이, 표적으로 하는 분화 이전에, 동시에, 또는 이후에, 예를 들어, 전기천공 또는 바이러스 벡터(예, 렌티바이러스 또는 아데노-관련 바이러스)를 통한 형질전환에 의해 상기 세포에 도입될 수 있다. 관련 구현예에서, 배세포주 Ml46V 또는 다른 프리세닐린 "녹-인(knock-in)" 돌연변이를 결합시키는, 예컨대, 돌연변이 ES 세포와 같은 줄기 세포가 제조될 수 있다. 하기 실시예 7에, APP의 스웨덴 돌연변이와 프리세닐린 돌연변이인 PS1-ΔE9을 포함하는 레티바이러스 벡터로 형질전환된 뮤린 ES 세포로부터 제조된, 말단이 분화된 신경세포의 제조가 기재되어 있고; 본 발명은 상기 렌티바이러스 벡터 및 당해 분야에서 공지된 비-레티바이러스 벡터를 이용하여 제조된 모델 세포를 제공한다.

추가적 구현예에서, 신경세포, 특히 피라미드 세포 신경세포의 표현형을 재현하는 분화된 줄기 세포가 AD용 모델 시스템에 사용되고, 그에 따라 Aβ42 또는 Aβ 용해성 올리고머가 상기 세포에 투여된 후, (i) 예를 들어, FM 염료, 칼슘 이미징 또는 전기생리학에 의해 측정되는 신경세포성 기능장애를 평가하고/평가하거나 (ii) 시험 물질을 AD의 잠재적 치료제로서 선별하는데 사용될 수 있다. 상기 Aβ42-노출 분화된 줄기 세포는 전술한 바와 같이 PI 센서를 추가로 포함하도록 고안될 수 있다.

5.4 알츠하이머병 치료 및/또는 기억력 개선 방법

본 발명은 신경세포에서 (i) 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트 (PIP2)의 양을 증가시키고/증가시키거나 (ii) 베타-시크리타제를 저해하는 물질을 신경세포에 투여하는 단계를 포함하는, 신경세포에서(예를 들어, 치료를 필요로 하는 인간에서) Aβ42 생성을 감소시키는 방법을 제공한다. PIP2 농도를 증가시키는데 사용될 수 있는 특정 물질의 예는 전술한 섹션 5.1에 기재되어 있고, 사용된 물질을 추가로 동정하는 분석 시스템은 전술한 섹션 5.3에 기재되어 있다.

본 발명은 AD 또는 경도 인식 장애인 "MCI" (및 장기간 강화된 질환 및/또는 아밀로이드 베타 42 축적과 관련된 다른 신경변성 질환)의 발병을 치료, 예방 또는 지연시키는 방법 및/또는 기억력을 개선시키는 방법으로서, 상기 질환이 진행되고/진행되거나 기억력이 손상될 위험이 있는 개체에 PIP2의 신경세포 내 농도를 증가시키는 물질을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. AD 진행의 위험이 있는 사람은 FAD 가족력이 있는 사람, 경도 인식 장애를 앓고 있는 사람, 또는 노인성 인식 장애의 다른 초기 증상을 나타내기 시작한 사람을 포함한다.

본 명세서에서 정의된 "치료"는 임상적 이익을 부여하는 것을 의미하며, 반드시 인지능 개선을 포함하지는 않는다. 예를 들어, "치료"는 인지능 감퇴율을 지연시키거나 안정 상태에 이르게 하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 정의된 "기억력 개선"은 기억력의 주관적 개선 및/또는 표준 기억력 시험(예, 이중 기억력 시험(Double Memory Test) (Buschke et al., 1997, Neurology 48:4989-4997), 기억력 장애 스크린(Memory Impairment Screen) (Buschke et al., 1999, Neurology 52:231) 등)에서 객관적으로 개선된 성과를 포함한다.

본 발명에 따라 AD 또는 MCI의 치료 및/또는 기억력 개선을 위해 사용될 수 있는 물질은 (i) 예컨대, 약 1-25 mg/kg/day, 바람직하게는 약 5-20 mg/kg/day의 1일 용량, 또는 뇌에서 1 내지 50 μM, 바람직하게는 5 내지 20 μM의 국소 농도를 달성하는 양의 에델포신, 또는 그 유도체; (ii) 예컨대, 약 2.5 mg/kg/day 및/또는 1일 1회 또는 2회 경구 투여되는 10 mg 또는 50 mg 정제 용량의 밀테포신, 또는 그 유도체; (iii) 페리포신과 같은 독일 특허 4222910에 개시된 인지질 유도체; (iv) 예컨대, 약 0.5-10 mM의 1일 용량의 에루실포스포콜린, 또는 그 유도체와 같은 유럽 특허 번호 507337에 개시된 에루실, 브라시딜 또는 네르보닐-함유 포스포콜린; (v) 예컨대, 약 5 내지 2000mg, 바람직하게는 약 5 내지 100 mg의 1일 용량의 헥사데실포스포콜린과 같은 미국 특허 번호 4,837,023에 개시된 알킬포스포콜린; (vi) 예컨대, 12-650 mg/m²/week 또는 10/mg/kg/day 용량의 일모포신, 또는 그 유도체; (vii) BN 52205 또는 그 유도체; (viii) BN 5221.1 또는 그 유도체; (ix) 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-메틸프로프-1-일 2'-(트리메틸암모니오)에틸 포스페이트 또는 그 유도체; 및 (x) 2-40 μM의 국소 농도를 제공하는 용량의 LY294002 또는 그 유도체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전술한 용량은 일예로서 제공된 것이며, 기재된 화합물의 유효량으로서 본 발명을 제한하지 않는다.

다른 비제한적 구현예에서, 본 발명은 PLCγl의 활성제를 유효량으로 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, AD 또는 MCI의 치료 또는 예방 및/또는 기억력 개선 방법을 제공한다. 비제한적 구현예에서, 상기 PLCγl의 활성제는 유효량의 Rk1, (20S)Rg3 및 Rg5 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질, 바람직하게는 (20S)Rg3와 함께 (순차적으로 또는 동시에) 투여될 수 있다. 이러한 관계에서, 각 성분의 "유효량"은 객관적이거나 주관적인 치료적 이익을 얻는데 함께 작용하는 다양한 성분과의 관계에서 고려된다. PLCγl을 활성화하는 물질의 비제한적 예는 발현량을 증가시키거나 단일 물질의 활성을 증가시키는 물질을 포함한다.

특히, 비제한적 구현예에서, 본 발명은 PLCβ3 활성제를 유효량으로 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, AD 또는 MCI의 치료 또는 예방 및/또는 기억력 개선 방법을 제공한다. 비제한적 구현예에서, PLCβ3 활성제는 유효량의 Rk1, (20S)Rg3 및 Rg5 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질, 바람직하게는 (20S)Rg3와 함께 (순차적으로 또는 동시에) 투여될 수 있다. 이러한 관계에서, 각 성분의 "유효량"은 객관적이거나 주관적인 치료적 이익을 얻는데 함께 작용하는 다양한 성분과의 관계에서 고려된다. PLCβ3를 활성화하는 물질의 비제한적 예는 발현량을 증가시키거나 단일 물질의 활성을 증가시키는 물질을 포함한다.

본 발명은 β-시크리타제 활성 농도를 조절하는 물질을 기억력 장애 및/또는 AD 또는 MCI를 앓거나, AD 또는 MCI 발병의 위험이 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, AD (또는 경도 인식 장애인 "MCI") 발병을 치료, 예방 또는 지연하고/하거나 기억력을 개선하는 방법을 제공한다. 비제한적 구현예에서, β-시크리타제 활성을 조절하는 물질은 β-시크리타제 (sAPPβ)에 의해 생성되는 용해성 APP 엑토도메인의 농도를 증가 또는 감소시키는 능력에 의해 동정될 수 있다.

다른 비제한적 구현예에서, 본 발명은 Aβ42 올리고머-유도 시냅스 기능장애의 발병을 예방, 치료 또는 지연시키고/지연시키거나 장기강화현상(long term potentiation)을 촉진시키는 물질을 유효량으로 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 AD 또는 MCI의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. Aβ 올리고머는 장기강화현상을 저해하고, 신경독성을 나타내어 AD와 관련된 병인이 되는 시냅스 기능장애를 일으킨다. Aβ42 올리고머-유도 시냅스 기능장애의 발병을 예방, 치료 또는 지연시키는 물질은 신경세포에서 장기강화현상(LTP)의 증진에 영향을 미치기 때문에 AD 또는 MCI와 관련된 시냅스 기능장애의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다 (도 5). 장기강화현상은 동일한 출처로부터 반복되는 자극에 노출되고 장기간 기억력 형성에 중요한 역할을 하는 해마 신경세포의 활동전위 증가를 의미한다. AD는 대개 해마 신경세포 내 LTP 장애와 관련이 있으며, 일부 경우에서, Aβ42 올리고머는 LTP 장애로 인한 시냅스 기능장애를 유도하여, 장기간 기억력 형성 능력을 손상시킬 수 있다. Aβ42 올리고머-유도 시냅스 기능장애의 발병을 예방, 치료 또는 지연시키는 물질은, 예를 들어, fEPSP 슬로프 변화에 의해 측정된 장기강화현상(LTP)을 증진시키는 능력에 따라 동정될 수 있다. 비제한적 구현예에서, 상기 물질 또는 Aβ42로 치료되지 않는 대조군 신경세포와 비교하여, 강화 물질은 Aβ42 존재 하에 신경세포내 LTP를 유지 또는 증진시킬 것이다. Aβ42 올리고머-유도 시냅스 기능장애의 발병을 예방, 치료 또는 지연시키는 물질의 비제한적인 예는 20(S)Rg3을 포함한다.

다른 비제한적 구현예에서, 본 발명은 5-포스포이노시타이드 포스페이타제 저해제를 유효량으로 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 AD 또는 MCI를 예방 또는 치료하고/치료하거나 기억력을 개선시키는 방법을 제공한다. 5-포스포이노시타이드 포스페이타제의 저해는 Aβ42 형성을 감소시켜 AD 또는 MCI의 치료 또는 예방에 유용하다는 것이 발견되었다. 5-포스포이노시타이드 포스페이타제의 비제한적인 예는 SynJl, SynJ2, INPP5P, OCRL, SHIPl, SHIP2, SKIP, PIPP, Pharbin/INPP5E, PTEN, MINPP1 , INPP1 , SAC1 , Sac2, 및 Sac3를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 20(S)Rg3, Rk1, 또는 Rg5와 같은 진세노사이드와 함께 투여될 수 있는, 포스포리파제 C의 이성형인 PLCβ3 및/또는 PLCγl를 선택적으로 활성화하는 물질(상기 정의됨)을 동정하는 것을 포함하는, AD 및/또는 MCI 치료에 치료적 유용성을 가지는 물질을 동정하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 적절한 약제학적 담체 내에 유효량의 전술한 화합물을 개별적으로 또는 조합하여 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 전술한 물질/화합물은 화합물의 화학적 특성에 따라 적절하게, 경구, 정맥내, 피하, 근육내, 비내, 경막내 또는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다.

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다양한 문헌이 본 명세서에서 인용되었으며, 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.

4. 도면의 간략한 설명

도 1A-C. 포스포이노시타이드의 상호전환(A)

포스포이노시톨 4-포스페이트 (PI(4)P, 또는 "PIP")는 포스포이노시톨 포스페이트 키나제 타입 lγ (PIPKlγ)에 의하여 포스포티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트 (PI(4,5)P2, 즉 "PIP2")로 전환된다. PIP2는 포스포리파아제 C(PI-PLC, 즉 "PLC")에 의하여 가수분해되어 이노시톨 트리포스페이트(IP3) 및 다이아실글리세롤 (DAG)을 형성할 수 있거나, 포스포이노시타이드 키나제 3(PI3-K)에 의하여 포스포이노시톨 (3,4,5) 트리포스페이트 (PI(3,4,5)P3, 즉 "PIP3")로 전환될 수 있다. PIP3는 포스페이타제인 "포스페이타제 및 염색체 Ten상에서 제거된 텐신 상동체(PTEN)"에 의하여 PIP2로 전환될 수 있고, PIP2는 포스파타아제 시냅토자닌 1(SYNJ1)에 의하여 PIP로 전환될 수 있다. (B) PIPKlγ 및 SYJNl은 뇌에서 주요한 PtdIns(4,5)P2-대사 효소이다. TLC 분석에서 리포좀이 (Folch fraction) 지정된 야생형 타입 (WT) 및 녹아웃(knock-out) (KO) 동물로부터 [γ32P] ATP 및 뇌 사이토졸의 존재하에서 배양하였다. (C)(B)에서 나타난 인산이미지 정량적 자료를 보여준다.

도 2A-E. PIP2 수준의 변화가 Aβ42 생합성과 서로 연관된다. PLC 저해제 에델포신(EDEL) 또는 이의 활성 아날로그 밀테포신(MILT) 중 하나로 처리한 인간 APPsw를 과량 발현하는 힐라(HeLa) 세포에서의 PIP2 수준 (A) 및 Aβ42 생합성(D)을 나타낸다. PLC 활성자 m-3m3FBS (M3M)로 처리한 인간 APPsw를 과량발현하고 있 는 힐라 세포의 PIP2 수준 (B) 및 Aβ42 생합성(E)을 나타낸다. (C) 전장 길이의 APP 및 총 Aβ 생합성은 처리된 세포에서 영향을 받지 않는다.

도 3A-F. PIP2 농도가 2개의 기작을 통하여 Aβ 생합성을 조절한다. PIP2 수준은 가용성 APP 엑토도메인을 배지로 방출시키는 것을 조절한다. APPsw를 안정적으로 발현하고 있는 힐라 세포는 PLC 저해제(EDEL, MILT) 또는 PLC 활성화제(M3M) 중 하나로 처리되었다. 조건화된 세포 배지는 α- (sAPPα)(A) 및 β-시크리타제 (sAPPβ)(B) 절단에 의해서 생성되어 배출된 APP 엑토도메인을 위해 분석되었다. PIP2 수준 조절자, EDEL의 존재하에서 직접적인 γ-시크리타제 기질로서 작용하는 APP의 C-말단 스터브(stub), C99로 일시적으로 형질전환된 HEK293 세포에서 Aβ42 (D) 및 총 Aβ 생합성(C)을 보여준다. PIP2 수준 조절자, M3M의 존재하에서 직접적인 γ-시크리타제 기질로서 작용하는 APP의 C-말단 스터브, C99로 일시적으로 형질전환된 HEK293 세포에서 Aβ42 (F) 및 총 Aβ 생합성(E)을 보여준다.

도 4. SYNJl 및 PIPKlγ에 의한 Aβ42 생합성 조절. (A) SYNJl의 과량발현이 Aβ42을 배출시킨다. 안정적인 CHO-APP 세포가 벡터 (pcDNA3) 또는 인간 시냅토자닌l의 HA 표지된 5 포스포이노시톨 포스페이타제 도메인(hSJl-IPP) 중 하나로 일시적으로 형질전환되었다. 상위 패널: hS Jl-IPP의 발현은 웨스턴 블롯팅으로 평가되었다(HA). (B) Aβ42 수준 (정상화된 APP). (C) 총 배출된 Aβ. (D, E) PIPKlγ-90 및 -87 아이소폼이 배출된 Aβ42 및 배출된 총 Aβ의 농도를 감소시킨다. 인간 야생형 타입 (PIPKIγ-90WT 및 PIPKIγ-87WT) 및 돌연변이(PIPKIγ-90KD) PIPKlγ으로 일시적으로 형질전환시킨 안정된 CHO-APP 세포를 보여 준다. Aβ42 값(D) 및 이에 상응하는 총 Aβ 블롯(E)이 나타난다.

도 5. SMT-3, PIP2 조절자가 Aβ42 올리고머-유도 시냅스 기능장애를 차단한다. Aβ42 (Aβ), 즉 Aβ42 및 20(S)Rg3로 처리되지 않거나 처리된 해마 분절에서의 흥분 시냅스 후전위장 기울기(fEPSP slope)가 시간에 따라 측정되었다. fEPSP 기울기의 변화는 대조군 해마 분절 또는 Aβ42 또는 Aβ42 및 20(S)Rg3의 조합중 하나로 처리된 해마 분절의 장기강화(LTP) 발현에서 차이로 나타난다.

도 6. PIP2 조절은 공간 작용 기억 장애를 향상시킨다. 3달된 PSAPP 마우스에 대해 방사형 수조-미로(radial-arm water-maze)(그룹당 N=3) 시험을 수행하였다. 3달된 야생형 타입 마우스는 획득 수행(1-A4) 및 기억 유지(R)에서 우수한 성과를 보여주었다. 대조적으로, PSAPP 마우스는 작용 기억 장애를 보여주었다. 에델포신으로 처리 시 (EDEL; 경구 lmg/kg) PSAPP 마우스의 기억 유지를 향상시켰다.

도 7A-B. HPLC로 측정된 바와 같이, 야생형 타입 (WT) 및 이중 녹아웃 (KO) PS 1/2 마우스의 뇌에서의 다양한 인지질의 농도를 보여준다. (A) PI, DPG, PS 및 PA; (B) PIP 및 PIP2. DPG = 다이포스포글리세레이트, PS = 포스파티딜 세린, PA = 포스파타이드산.

도 8A-B. PIP2 전환이 (A) PSl 및 (B) PS2 FAD-연관 돌연변이 존재하에서 감소된다. 지질 키나제의 인산이미지 정량분석 및 세포막 TLC 분석은 야생형 타입 (WT) 또는 FAD 돌연변이 (ΔE9, L286 V) PS 1 (왼쪽 패널) 및 야생형 타입 (WT) 또는 FAD 돌연변이 (N141I) PS2로 안정적으로 형질도입된 HEK293 세포로부터 준비되었다. PI(4,5)P2는 FAD 발현 대 WT-발현 세포에서 26-40% 만큼 감소하였다.

도 9. γ-시크리타제를 제외한 PLC의 저해가 PIP2 전환에서의 FAD-연관 감소를 뒤바꾼다. 야생형 타입 (WT) 또는 FAD 돌연변이 (ΔE9, L286V) PSl중 1개를 안정적으로 발현하고 있는 HEK293 세포는 지질 키나제/TLC 분석이전에 6시간 동안 DMSO, 에델포신 (EDEL) 또는 γ-시크리타제 저해제(CpdE) 중 하나로 사전 처리되었다.

도 10 A-G. 마우스 배아 줄기 (ES) 세포의 피라미드 신경세포로 직접적인 분화를 보여준다. (A) 분화 5일에서의 ES-유래 신경세포의 위상차 이미지이다. 세포 형태학에서 제한된 다양성은 매우 균일한 세포군을 시사한다. (B) 분화 8일에서의 ES-유래 신경세포의 면역세포화학적 분석(왼쪽 패널)이다. 90%의 세포는 DAPI 및 신경 β-튜불린 (TUJ-I)으로 함께 염색되는 것에 유의한다. (C) 분화의 상이한 단계에서 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석이다. 분화의 개시로 인해 세포는 다양한 신경 마커, 예를 들어 TUJ-I 및 시냅토피신뿐만 아니라, 피라미드 신경세포-특이적 마커, 예를 들면 TrkB 및 CamKII에서 점진적인 증가를 나타낸다. (D) ES-유래 신경세포는 20일째 FM 1-43 재흡수 분석에서 지시하는 바와 같이, 기능적인 시냅스를 형성한다. 90 mM KCl을 로딩한 (D)의 (E) 세포; 90 mM KCl을 로딩하지 않은 (D)의 (F) 세포를 보여준다. (G) ES-유래 신경세포는 전-세포 전압 클램 기록에서 측정된 바와 같이, 어린 해마 신경세포의 탈분극 발생 활성 특징을 나타낸다.

도 11A-E. PSl의 인간 FAD 변이체를 발현하는 마우스 ES 세포의 생성을 보여준다. (A) 마우스 ES 세포는 전기천공법 및 순차적인 항생제 분별에 의하여 플라즈미드를 함유하는 공(벡터) 또는 FAD-PSl (PS1ΔE9, PS1L286V, PS1M146V)로 안정 적으로 형질전환되었다. (B-E) 클론은 항-인간 및 항-마우스 PSl 항체를 사용한 인간 PSl FAD 발현에 대하여 분석되었다.

도 12. 인간 APP (hAPPsw)의 스웨덴 변이체를 운반하는 렌티바이러스로 감염된 ES-유래 신경세포상의 APP의 발현을 보여준다. (A) hAPPsw-운반 렌티바이러스 벡터의 개요도이다. (B) 전장 APP (APP FL)뿐만 아니라, 가용성 절편 (sAPP) 및 총량 Aβ가 쉽게 세포 용해물 및 조건 배지에서 개별적으로 검출되었다. 대조군 = 비형질전환.

도 13. ES-유래 신경세포를 발현하는 PSl-FAD는 Aβ42 FAD-연관 표현형을 재현한다. 대조군 (벡터) 또는 PS 1 ΔE9-발현 ES-유래 신경세포는 hAPPsw을 운반하는 렌티바이러스로 형질전환되었다. 감염후 48시간후에 조건 배지를 샌드위치 ELISA를 사용한 Aβ42에 대하여 분석하였다. PSlΔE9-발현 ES-유래 신경세포는 대조군 신경세포에 비하여 배출된 Aβ42의 수준에서 ~ 10배 증가를 보였다.

도 14A-C. (A) Aβ40와 비교하여 진세노사이드 Rk1는 선별적으로 Aβ42를 감소시킨다. (B)Aβ40와 비교하여 진세노사이드 (20S)Rg3는 또한 선별적으로 Aβ42를 감소시킨다. (C) 보다 적은 정도로, 진세노사이드 Rg5은 Aβ40와 비교하여 Aβ42 를 감소시킨다.

도 15A-B. (A) Rk1 및 (20S)Rg3은 Ad-모델 Tg2576 마우스로부터 배양된 해마 1차 신경세포에서 Aβ42을 감소시킨다. (B) (20S)Rg3은 Tg2576 마우스 뇌에서 Aβ42 대 Aβ40의 비율을 감소시킨다.

도 16A-B. CCE는 Ca^{2 +}-자유 배지 함유 탭시가진(Thapsigargin)중의 돌연변이 세니린, PS1ΔE9을 안정적으로 발현하고 있는 293 세포에서 유도되었다. (A) F₃₄₀/F₃₈₀ 비율상의 Rk1 농도를 증가시키는 효과. (B)F₃₄₀/F₃₈₀ 비율상의 (20S)Rg3, (R)Rg3, Rk1, Rg5, Re 및 Rb2의 효과.

도 17A-B. (A) γ-시크리타제 저해제는 F₃₄₀/F₃₈₀ 비율상의 실체적인 효과를 가지지 않는다. (B) 시험된 Aβ42를 낮추는 NSAID은 F₃₄₀/F₃₈₀ 비율상의 실체적인 효과를 가지지 않는다.

도 18A-E. 진세노사이드의 Aβ42를 낮추는 활성에서의 PLCγl의 역할을 보여준다. (A) PLCβ3, PLCγl 및 PLCγ2에 대하여 특이적인 siRNA으로 형질전환된 힐라-APPsw 세포가 6시간 동안 DMSO 또는 15 μM Rg3으로 처리되었다. PLCβ3, PLCγl 및 PLCγ의 억제 조절은 아이소폼 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 확인되었다. (B)Rg3 처리하에 PLC 아이소폼의 RNAi-매개 억제조절의 효과를 나타낸다. Aβ42 수준은 ELISA에 의한 조건 배지에서 측정되었다. Aβ 값은 대조군 siRNA의 퍼센트로 나타나며 3번의 독립적인 실험으로부터 평균 ±s.d.로 나타난다.(던넷 시험(Dunnett's test)에 따른 ANOVA를 사용한 *P<0.001, **P<0.01). (77, 78)

6. 실시예: 아밀로이드- 베타42 생산에 관한 PIP2 농도 조절의 효과

PIP2 농도의 조절은 Aβ42 생합성과 서로 관련이 있다. 인간 APP의 스웨덴 변이체를 안정적으로 과량발현하고 있는 힐라 세포를 대조군 (DMSO), PLC 저해제 에델포신 (EDEL) 또는 이의 활성 유사 밀테포신 (MILT) 중 하나로 처리하였다. 정상 상태 PIP2 농도를 HPLC로 측정하였다. 도 2A에서와 같이, 에델포신 처리로 Aβ42 농도의 상응하는 37.3% 감소(도 2D)와 함께 PIP2의 정상 상태 농도가 ~10% 증가되었다. PLC 활성자 m-3m3FBS (M3M)로 처리한 경우에 Aβ42의 상응하는 37.2% 증가(도 2E)와 함께 PIP2의 정상 상태 농도가 ~11% 감소되었다(도 2B). 웨스턴 블롯 분석으로 측정된 바와 같이, 전장 APP (FL-APP)의 정상 상태 농도상에서 이러한 처리의 어떠한 현저한 효과를 관찰할 수 없었다(도 2C).

PIP2 농도가 두개의 다른 기작을 통하여 Aβ 생합성을 조절한다.

IP3 및 DAG을 포함하는 PIP2의 대사물을 APP 처리 경로에서 수반시켰다. (69, 70, 71). 정상 조건하에, PIP2 가수분해는 (IP3 및 DAG을 생성하기 위하여) α-시크리타제-생성 배출 APP 엑토도메인(sAPPα)의 생성을 선호한다. 이전 연구로부터 예측한 바와 같이, 에델포신(EDEL) 또는 밀테포신(MILT)으로 처리한 경우 배출에서 상응하는 감소와 함께 (도 3B) sAPPα 생성의 증가를 초래하였다(도 3A). 흥미롭게도, m-3m3FBS (M3M) 처리가 sAPPα의 상호연관된 감소와 함께 가용성 APP의 β-시크리타제-매개 유리(sAPPβ)에서 극적인 증가를 초래하였다. γ-시크리타제 활성을 조절하는데 PIP2의 역할을 보다 명백하게 규정짓기 위하여(e.g. Aβ42), APP-C99 구조물, 이질적인 세포에서의 β- 시크리타제-생성, 막 연관 APP 스텁과 유사한 이소성 γ-시크리타제 기질을 발현시켰다. C99-형질전환된 세포에서, 에델포신의 Aβ42-감소 활성 및 m-3m3FBS의 Aβ42-촉진 활성이 여전히 관찰되었고(도 3C-F), 이는 Aβ42의 PI(4,5)P2-매개 조절이 프리세닐린/γ-시크리타제 조절 수준에서 발생하는 것을 의미한다.

Aβ42 생성에 관한 PIP2 의 다른 조절자의 효과.

시냅토자닌 1 (SYNJl) 및 PIP 키나제 타입 1-γ (PIPKlγ)은 뇌에서 주요한 PI(4,5)P2-대사 효소를 대표한다(도 IA 및 B). SYNJl 발현은 세포의 PIP2의 농도를 감소시킨다는 것을 이전에 보여 주었다(72). 대조적으로, 세포의 PIPKlγ 과량 발현은 세포의 PIP2 농도를 상승시키는 것으로 공지되어 있다 (73). 따라서 Aβ42 생합성에 관한 SYNJl 또는 PIPKlγ의 효과가 결정되었다(도 4A-E). SYNJl 구조물의 발현(막을 목표로 하는 신호를 함유하는)이 Aβ42의 증가된 생성을 초래하였다(도 4B). 한편, 야생형 타입 PIPKlγ 발현(γ90 및 γ87 형태)은 Aβ42 생성의 실체적인 감소를 이끌었다 (도 4D). 대조적으로, PIPKlγ의 키나제-사멸 돌연변이는 어떠한 Aβ42-감소 활성을 주지 못하며, PIPKlγ-매개 Aβ42 감소는 완전한 지질 키나제 활성을 필요로 한다는 것을 제시한다. 따라서, PIP2의 증대를 선호하도록 (상응하는 Aβ42 감소) PIPKlγ 또는 SYNJl에 의한 PIP2 및 Aβ42을 조절하면 AD-감염 뇌를 치료하기 위하여 신규한 치료 기회를 제공할 수 있다. 이러한 결과는 또한 PIP2 농도가 Aβ42 생합성의 중요한 결정인자라는 것을 제시하고, 이는 PI(4,5)P2 합성을 선호하게 하는 효소 반응이 감소된 Aβ42을 초래하기 때문이다. 유사하게, PI(4,5)P2 분해를 선호하는 효소적 반응은 증가된 Aβ42을 이끈다.

PIP2 조절이 AB 올리고머 -유도 시냅스 기능장애를 구한다.

뇌에서 가용성 Aβ 농도가 인식 기능장애 (74) 및 시냅스 손실 (75)과 보다 강한 상호관련성을 가지는 것을 보여줌에 따라서, 가용성 Aβ 올리고머가 최근에 노인성 플라크의 형성이전에 인식 기능장애를 수반하는 것으로 나타났다. 더욱이, Aβ 올리고머는 장기간 효력을 저해할 수 있고 신경독성을 보여줄 수 있다(76). 도 5는 PIP2 농도를 조절하고 Aβ42 생합성을 감소시키는 것으로 나타난 (20S)Rg3 (SMT-3) 처리가 장기간 효과의 아베타 올리고머-유도 저해를 차단하는 것을 보여준다. 도 5에서, fEPSP 기울기의 감소로 나타나는 바와 같이, Aβ42로 처리하지 않은 해마 단편물보다 Aβ42로 처리한 해마 단편물에서 LTP 발현 감소가 나타났다. Aβ42 존재하에 20(S)Rg3를 첨가한 경우, 처리되지 않은 해마 절편물에 비해 LTP 발현이 증가하였다.

PIP2 조절이 공간적인 작용 기억 손상을 향상시킨다.

아밀로이드 전구체 단백질 및 PSl FAD 변이의 스웨덴 변이체 (PSAPP) 및 야생형 타입을 과량발현하는 한배새끼 3달된 이중 형질전환 마우스를 대상으로 방사형 수조-미로(그룹당 N=3) 시험을 수행하였다. 도 6에서 도시하는 바와 같이, 3달된 야생형 타입 마우스는 획득 수행(A1-A4) 및 기억 유지(R)에서 우수한 성과를 보여주었다. 대조적으로, PSAPP 마우스는 작용 기억 장애를 보여주었다. 에델포신으로 처리 시(SMT-I) PSAPP 마우스의 기억 유지를 향상시켰다(화살표).

프리세닐린 결핍은 뇌에서 PIP2 의 농도를 조절한다. 추가로, 생체내 PIP2 수준에 대한 프리세닐린 결핍 효과를 측정하기 위하여, 다양한 인지질의 농도를 야생형 타입 및 이중 녹아웃 PS1/PS2 마우스의 뇌에서 HPLC로 측정하였다. 도 7A-B에서 도시하는 바와 같이, PIP2 농도가 대조군과 비교해 볼때 녹아웃 뇌 조직에서 20 %만큼(통계적으로 유의한) 증가하였다(p<0.04). 따라서, 프리세닐린 결핍 (주로 신경세포에서)은 뇌에서 PIP2의 현저한 증가를 가져온다.

FAD 돌연변이 PSl 및 PS2 아이소폼의 발현이 비정상 PIP2 대사를 가져왔다. 방사성 표지 지질 키나제/TLC 분석에 의하여 측정된 바와같이, 대조군 (WT PS1/PS2) 발현 세포와 비교해 볼 때, PSl (ΔE9, L286V) 및 PS2 (N141I) FAD 발현 세포에서 PIP2 전환이 감소되는 것으로 관찰됨에 따라, PIP2 대사에서 프리세닐린의 역할이 추가로 확인되었다. 3번의 독립된 실험의 인산이미지 정량분석에 의해, 방사성 표지된 포스포이노시타이드의 PI(4,5)P2로의 전환이 야생형 세포와 비교해 볼 때, 선택적으로 FAD 세포에서 감소(26-40% 감소)되는 것으로 나타났다(도 8 A-B). 이러한 결과는 프리세닐린 FAD 돌연변이가 PI(4,5)P2의 감소된 합성 또는 상승된 분해를 유발한다는것을 지시한다. γ-시크리타제가 아닌 PLC의 저해가 PIP2 전환에서의 FAD-연관 감소를 반대로 바꾸었다.

검토.

포스포이노시타이드는 다양한 열의 세포 경로에서 신호 분자로 이용되고, 특정 세포형에서의 포스포이노시타이드의 비정상적인 조절이 다양한 인간의 질병 상태를 이끌 수 있다(47). 지질 포스페이타제 저해제 (당뇨병 용), 지질 키나제 저해제, 리소포스포리파아제 D 저해제, 지질 인식 도메인 길항제 (암) 및 LPA 수용체 길항제 (전이용)를 포함하여, PI 경로에서의 많은 수의 약물가능 목표 분자가 제안되었다. 그 결과 포스포이노시타이드의 조절은 결정적으로 알츠하이머병의 발병과 연관되어 있다는 것이 증명되었다.

에델포신 (ET-IS-OCH₃)은 리스포포티딜콜린의 합성 유사체(에더포스포지질)로 세포내 신호전달로 공지되어 있고 연구되고/되거나 암 및 감염 질병을 치료하는데 사용된다(66). 본원에서 설명된 실험에서, 에델포신으로 처리한 다양한 세포주는 FAD 세포에서 관찰된 Aβ42의 감소를 가져오는 것으로 밝혀졌다. 밀테포신은 유사한 효과를 가지는 것으로 보여주었다. 따라서, 에델포신, 다른 에테르포스포리피드 유사체 및 이들의 화학적 유도체가 알츠하이머병 및 다른 신경퇴행성 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

7. 실시예: PIP2 조절자를 동정하기 위한 분석 시스템에서 사용하기 위한 세포의 제조

야생형 마우스 배아 줄기 세포의 목표로 하는 분화를 다음의 수정조건에서 Bibel 방법으로 수행되었다(42): 첨가된 뉴클레오사이드와 함께, FCS보다는 15% FBS가(Specialty Media로부터 구매된 사전혼합된 10Ox 용액(카타로그 번호 ES-008-D)) ES 배지로 사용하였다. 추가로, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 및 B27 보충제 (Invitrogen)을 가지는 신경기초 배지를 최종 분화 배지로 사용한 반면, Bibel 등은 Brewer 등이 설명한 "B 18 배지"의 수정된 것을 사용하였다(48). 이러한 방법이 피라미드 세포 특성을 가지는 신경세포를 생산하였다(도 1 OA-D).

도 10A는 분화 5일에서의 ES-유래 신경세포를 도시한다. 세포 형태학에서 제한된 다양성은 사용된 분화 프로토콜이 매우 균일한 세포군을 생산했다는 것을 시 사한다. 면역형광 연구 (도 10B) 및 세포 용해물 분석 (도 10C)은, 이러한 세포가 다양한 신경세포 마커 (예를 들어, TUJ-I 및 시넵토피신)뿐만 아니라, 피라미디형신경세포-특이적 마커, 예를 들어 TrkB 및 CamKII를 디스플레이하는 것을 보여준다. ES-유래 신경세포는, FM 1-43 재흡수 분석에서 지시하는 바와 같이, 기능적인 시냅스를 형성하고(도 10D-F), 어린 해마 신경세포의 전기생리학적 특징을 나타낸다(도 10G)

FAD 연관 돌연변이 인간 프리세닐린 유전자를 전기천공법 (the AMAXA Nucleofector system 이용 (Amaxa Gmbh, Cologne, Germany))을 사용하여 ES 세포에 도입하였다(도 11A). 다양한 프리세닐린 돌연변이의 발현을 PS1-ΔE9의 보다 많은 발현과 함께 달성하였다(도 11B-E). PS1-ΔE9 프리세닐린의 발현이 분화된 ES 세포 형태 또는 신경세포/피라미드형 세포 특이적 단백질의 발현에 효과를 가지는 것 같지는 않았다.

추가로, Aβ42 생성 표현형을 재현하기 위하여, 인간 APP의 스웨덴 변이체를(hAPPsw) 렌티바이러스 벡터를 사용하여 TUJ-I, CamKIIα, p75 및 TrkB (7일 배양)을 발현하는 말단에서 분화된 ES-유래 피라미드 유사 세포에서 일시적으로 발현시켰다(도 12A). 인간 특이적인 항-APP 항체(6E10, Sygnet)를 사용하여, 이러한 세포에서의 hAPPsw의 발현 및 단백질분해 과정을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다(도 12B 참조). 형질전환되지 않은 ES-유래 신경세포를 대조군으로서 사용하였다.

PS1-ΔE9 존재하 또는 부재하에서 렌티-APPsw 벡터로 형질전환된 분화된 ES-유래 신경세포의 Aβ42 농도를 비교하였다(도13). Aβ42 농도가 PS1-ΔE9을 동시 에 발현하는 분화된 ES-유래 신경세포에서 증가되는 것을 알게 되었다. 이러한 자료는 돌연변이 프리세닐린 및 인간 APP를 동시에 발현하는 분화된 ES 세포가 FAD-연관 표현형, 특히 Aβ42 생성을 재현한다는 것을 제시한다. 이러한 세포는 또한 감소된 생존력을 나타내는 것을 알게 되었다.

8. 실시예: 열처리된 인삼으로부터 유래된 천연 화합물이 FAD -연결된 프리세 닐린 돌연변이와 연관된 분자의 표현형을 반대로 바꾼다.

열처리된 인삼으로부터 유래한 여러 천연화합물(다마란 트리테르페노이드)은 Rk1 및 (20S)Rg3을 포함하여, 세포주 및 1차 신경세포에서 Aβ42 생성의 γ-시크리타제 절단 단계에 영향을 미쳐서 부수적인 Aβ37 및 Aβ38에서의 증가와 함께 Aβ42의 생산을 우선적으로 낮춘다는 것으로 보여주었다(도 14A-C 및 2005년 11월 3일에 김씨 및 정씨에 의해 발간된 미국 특허 출원 번호 제 20050245465호, 시리얼 번호 10/ 834773 참조). Aβ42-낮추는 진세노사이드 Rg3를 투여한 경우에, 배양된 신경세포 및 AD의 Tg2576 형질전환 마우스 모델의 뇌에서 감소된 Aβ42/Aβ40 비율을 가져왔다(도 15A-B). 세포-자유 검출에서, 이러한 화합물은 Aβ생성을 저해하는 반면에 APP, Notch 및 p75 뉴로트로핀 수용체 세포내 도메인의 γ-시크리타제-매개 생성을 보존시켰다. 더욱이, 이러한 Aβ42-낮추는 천연 화합물은 프리세닐린 FAD 돌연변이 PS1ΔE9와 연관된 세포의 양이온 유입 (CCE) 결핍을 역행시킬 수 있어서(도 16A-B), 이러한 화합물이 직접 FAD 돌연변이 프리세닐린과 연관된 수취 작용(gain-of-function)을 길항작용한다는 것을 시사한다. 기록중에, γ-시크리타제 저해제 및 비 스테로이드 항-염증 약물은 이러한 CCE 결핍을 역행시킬 수 있는 것으로 알려지지 않았다(도 17A-B). 따라서, (20S)Rg3와 같은 진세노사이드는 다른 Aβ42- 낮추는 제제와 다르게 또한 AD와 연관된 CCE에서의 결핍을 개선할 수도 있다. 다음의 자료는 CCE을 조절하는 공통적인 상류 목표로서 뿐만 아니라 Aβ42 수준으로서의 PLCγl의 역할을 뒷받침한다.

스웨덴 FAD 돌연변이 APP를 안정적으로 발현하고 있는 힐라 세포(Hela- APPsw 세포)를 다양한 PLCβ (βl-4) 및 PLCγ (γl, 2) 아이소폼에 대해 선별된 작은 간섭 RNA(siRNA)로 처리하였다. 힐라-APPsw 세포에서, RT-PCR 분석은 PLCβ3, PLCγl, 및 PLCγ2이 주요한 PLC 종인 반면에, 다른 아이소폼은 검출은 되나 매우 낮은 농도가었음을 보여주었다. 아이소폼-특이적인 siRNA 제제로 세포를 처리하는 경우에, 웨스턴 블롯 분석으로 증명된 바와 같이 PLCβ3, PLCγl, 및 PLCγ2를 포함하는 PLC 아이소폼이 개별적으로 유효한 저해를 가져왔다(도 18A). 세포를Rg3로 처리한 경우에, PLCβ3 및 PLCγl 발현의 저해가 거의 Rg3-매개 Aβ42-낮추는 효과를 파괴하였다(도 18B). 추가적인 투여량-반응 실험에서, PLCγl 농도가 억압된 경우에, Rg3가 Aβ42 생성을 감소시키는데 덜 효과적이고, PLCγl가 진세노사이드의 Aβ42-낮추는 작용에 필요한 것은 일관적이라는 것이 밝혀졌 다.

Claims (62)

1. 신경세포 내 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트의 양을 증가시키는 물질을 신경세포에 투여하는 것을 포함하는, 신경세포에서 Aβ42 생성을 감소시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 에델포신(edelfosine)인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 밀테포신(miltefosine)인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 페리포신(perifosine)인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 에루실(erucyl)-함유 포스포콜린인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 브라시딜(brassidyl)-함유 포스포콜린인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 네르보닐(nervonyl)-함유 포스포콜린인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 에루실포스포콜린(erucylphosphocholine)인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 일모포신(ilmofosine)인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 BN 52205인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 BN 5221.1인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-메틸프로프-1-일 2'-(트리메틸암모니오) 에틸 포스페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 LY294002인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 분화된 세포군에서 포스포이노시타이드 농도를 조절하는 물질을 동정하기 위한 분석 시스템으로서,

    검출가능한 포스포이노시타이드 센서를 발현하는 줄기 세포를 포함하고,

    상기 줄기 세포는 분화된 세포군의 구별되는 특성을 하나 이상 재현하기 위해 분화하도록 유도되는 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
15. 제 14항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드는 포스포티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트인 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
16. 제 14항에 있어서, 상기 분화된 세포군은 피라미드 신경세포인 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
17. 제 16항에 있어서, 상기 구별되는 특성은 노인성 플라크, 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle), 및 Aβ42 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
18. 제 14항, 15항, 16항 또는 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드 센서는 PH-GFP인 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
19. 관심 있는 포스포이노시타이드 농도를 조절하는 물질을 동정하기 위한 방법으로서,

    (i) 관심 있는 포스포이노시타이드에 결합하는 검출가능한 포스포이노시타이 드 센서를 발현하는 줄기 세포를 제공하며, 상기 줄기 세포가 분화된 세포군의 구별되는 특성을 하나 이상 재현하기 위해 분화하도록 유도되는 단계;

    (ii) 상기 분화된 줄기 세포를 시험 물질에 노출시키는 단계; 및

    (iii) 상기 시험 물질에 대한 노출이 포스포이노시타이드 센서에 검출가능한 변화를 가져오는지 결정하되, 상기 포스포이노시타이드 센서의 변화가 상기 시험 물질에 의한 포스포이노시타이드 농도 조절을 의미하는 단계

    를 포함하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드는 포스포티딜이노시톨 4,5- 바이포스페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19항에 있어서, 상기 분화된 세포군은 피라미드 신경세포인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21항에 있어서, 상기 구별되는 특성은 노인성 플라크, 신경섬유매듭, 및 Aβ42 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 19항, 20항, 21항 또는 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드 센서는 PH-GFP인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 알츠하이머병 치료용 물질을 동정하기 위한 분석 시스템으로서,

    피라미드 신경세포의 구별되는 특성을 하나 이상 재현하기 위해 분화하도록 유도된 줄기 세포를 포함하고,

    상기 분화된 줄기 세포는 알츠하이머병 진행과 관련된 유전자를 추가로 포함하도록 고안된 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
25. 제 24항에 있어서, 상기 알츠하이머병 진행과 관련된 유전자는, 프리세닐린 1 돌연변이 유전자, 프리세닐린 2 돌연변이 유전자, 및 아밀로이드 전구체 단백질의 돌연변이 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
26. 제 24항에 있어서, 인간 프리세닐린 1 돌연변이 유전자 및 인간 아밀로이드 전구체 단백질 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
27. 제 24항에 있어서, 인간 프리세닐린 2 돌연변이 유전자 및 인간 아밀로이드 전구체 단백질 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
28. 제 26항 또는 27항에 있어서, 상기 인간 아밀로이드 전구체 단백질 유전자는 돌연변이 유전자인 것을 특징으로 하는 분석 시스템.
29. 유효량의, 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트의 신경세포내 농도를 증가시키는 물질을 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 치료 방법.
30. 제 29항에 있어서, 상기 물질은 에델포신(edelfosine), 밀테포신(miltefosine), 페리포신(perifosine), 에루실포스포콜린, 헥사데실포스포콜린, 일모포신(ilmofosine), BN 52205, BN 5221.1, 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-2메틸프로프-l-일 2'-(트리메틸암모니오) 에틸포스페이트, LY294002, 또는 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 유효량의, β-시크리타제 활성을 조절하는 물질을 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 치료 방법.
32. 유효량의, γ-시크리타제 활성을 조절하는 물질을 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 치료 방법.
33. 유효량의, 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트를 조절하는 물질을 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하며,

    장기강화현상(long-term potentiation)을 안정화시키는 능력이 유지되고 Aβ42 올리고머-유도 시냅스 기능장애가 감소되는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 치료 방법.
34. 제 33항에 있어서, 상기 물질은 SMT-3인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 유효량의, 5-포스포이노시타이드 포스페이타제를 저해하는 물질을 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 치료 방법.
36. 제 35항에 있어서, 상기 5-포스포이노시타이드 포스페이타제는 SynJl, SynJ2, INPP5P, OCRL, SHIPl, SHIP2, SKIP, PIPP, Pharbin/INPP5E, PTEN, MINPPl, INPPl, SACl, Sac2, 및 Sac3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 유효량의, PLCγl 활성제 및 진세노사이드를 포함하는 조성물을 유효량으로 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 치료 방법.
38. 유효량의, PLCβ3 활성제 및 진세노사이드를 포함하는 조성물을 유효량으로 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 치료 방법
39. 신경세포 내 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트의 양을 증가시키는 물질을 신경세포에 투여하는 것을 포함하는, 장기강화현상(long-term potentiation)을 촉 진하는 방법.
40. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 에델포신인 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 밀테포신인 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 페리포신인 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 에루실-함유 포스포콜린인 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 브라시딜-함유 포스포콜린인 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 네르보닐-함유 포스포콜린인 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 에루실 포스포콜린인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 일모포신인 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 BN 52205인 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 BN 5221.1인 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-메틸프로프-1-일 2'-(트리메틸암모니오) 에틸 포스페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 39항에 있어서, 상기 물질은 LY294002인 것을 특징으로 하는 방법.
52. 베타-시크리타제를 저해하는 물질을, 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 기억력 개선 방법.
53. 5-포스포이노시타이드 포스페이타제를 저해하는 물질을, 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 기억력 개선 방법.
54. 제 53항에 있어서, 상기 5-포스포이노시타이드 포스페이타제는 시냅토자닌-1(synaptojanin-1)인 것을 특징으로 하는 방법.
55. 유효량의, 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트의 신경세포 내 농도를 증가시키는 물질을 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 기억력 개선 방법.
56. 제 55항에 있어서, 상기 물질은 에델포신, 밀테포신, 페리포신, 에루실포스포콜린, 헥사데실포스포콜린, 일모포신, BN 52205, BN 5221.1, 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-2메틸프로프-1-일 2'-(트리메틸암모니오) 에틸포스페이트, LY294002, 또는 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
57. 기억력을 개선하고/개선하거나 알츠하이머병 또는 경도 인식 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하는데 사용되는, 신경세포 내 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트의 양을 증가시키는 약제.
58. 제 57항에 있어서, 에델포신, 밀테포신, 페리포신, 에루실포스포콜린, 헥사데실포스포콜린, 일모포신, BN 52205, BN 5221.1, 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-2메틸프로프-l-일 2'-(트리메틸암모니오) 에틸포스페이트, LY294002, 또는 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.
59. 신경세포 내 포스포이노시톨 4,5 바이포스페이트의 양을 증가시키는 물질을 대상체에 투여 시 기억력 개선 및/또는 알츠하이머병 또는 경도 인식 장애 치료에 유효한 양으로 포함하는, 약제학적 조성물.
60. 제 59항에 있어서, 상기 물질은 에델포신, 밀테포신, 페리포신, 에루실포스포콜린, 헥사데실포스포콜린, 일모포신, BN 52205, BN 5221.1, 2-플루오로-3-헥사데실록시-2-2메틸프로프-1-일 2'-(트리메틸암모니오) 에틸포스페이트, LY294002, 또는 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
61. PLCγl 활성제 및 진세노사이드를 함께 알츠하이머병 또는 경도 인식 장애의 치료 및/또는 기억력 개선에 유효한 양으로 포함하는, 약제학적 조성물.
62. PLCβ3 활성제 및 진세노사이드를 함께 알츠하이머병 또는 경도 인식 장애의 치료 및/또는 기억력 개선에 유효한 양으로 포함하는, 약제학적 조성물.

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