KR20070117632A - 영양 보충물의 조절된 방출을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 분리되고 정제된 장쇄 다당류, 및 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 하나 이상의 영양 보충물의 결합에 의한 조절된 방출의 영양 보충물에 관한 것이고, 여기서 보충물은 100 psi 이상의 압력에서 압축된다.
영양 보충물, 항산화제, 장쇄 다당류, 소유성, 친유성

Description

영양 보충물의 조절된 방출을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFIED RELEASE OF NUTRITIONAL SUPPLEMENTS}
본 발명은 일반적으로 영양 보충물의 조절된 방출 분야, 더욱 특히 소화 중의 음식과 매우 유사하게 영양 보충물을 제공하는 조성물, 제형 및 방법에 관한 것이다.
발명의 범주를 제한하지 않으면서, 이의 배경을 항산화제 센서 기술 및 측정 방법과 관련시켜 기재한다.
생물학적 시스템은 라디칼 및 다른 산화 촉진(pro-oxidative) 종의 효과에 대항하는 항산화제 시스템을 발전시켜왔다. 항산화제는 산화가능한 기질에 비해 낮은 농도로 존재할 때 산화가능한 기질의 산화를 현저하게 지연시키거나 예방하는 임의의 물질이다. 과산화물 디스뮤타제 및 카탈라제와 같은 항산화제인 효소가 존재하고, 이는 많은 유기체에 의해 코딩된다. 비타민 C 및 식물 페놀과 같은 물질은 식사를 통해 생물학적 시스템으로 도입되는 항산화제이다. 자연적으로 발생하는 이러한 물질의 수준이 적절하게 신체 내에서 생산되거나 통상의 식사에서 섭취되지 않는다는 것이 제안되어 왔다. 통상의 식사는 과일 및 야채에 부족하고/부족하거나 식사 내의 과일 및 야채에서 이의 항산화제가 현대의 가공에 의해 제거되기 때문에 종종 충분한 항산화제를 제공하지 않는다. 통상의 식사는 개선될 수 있지만, 오늘날의 생활방식 및 서양 음식의 불충분한 조성물은 보충물이 신체가 요구하는 항산화제를 전달하는 가장 실용적인 방법이 되도록 하였다. 통상의 식사를 보충하기 위하여, 보충물에 포함되어 있는 성분의 항산화제 용량을 측정할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 예를 들어, 항산화제, 비타민, 당류, 무기물, 아미노산, 핵산, 이의 혼합물 및 배합물의 영양상 유효량의 조절된 방출을 위한 조성물, 방법 및 제형을 포함하고, 여기서 보충물은 장쇄 다당류의 존재 하에서 100 psi 이상의 압력에서 압축된다. 본 발명은 동일한 조건(캡슐, 중량 등)을 사용하고, 동일한 표준 영양분, 예를 들어 항산화제를 사용하여, 장쇄 다당류와 함께 압축시킬 경우 시간에 따른 영양분의 용해를 허용한다. 영양 보충물 섭생의 일부일 수 있는 장쇄 다당류의 예는, 예를 들어, 2 내지 약 50,000 당류 단량체를 갖는 단량체 단위체를 가질 수 있고, 약 100, 500, 1000, 2000 또는 심지어 10,000 psi 또는 그 이상으로부터 압축될 수 있다. 오늘날 사용되는 즉시 방출되는 영양 보충물의 대부분과는 달리, 본 발명은 하나 이상의 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 당류, 이의 혼합물 및 배합물의 보다 자연적인 방출을 허용한다. 음식 성분과는 달리, 본 발명은 과학적이지만, 또한 더욱 자연적인 방식으로 필수 영양분의 특정 결핍을 보충하는데 사용될 수 있다.
보충물은 캡슐, 식물성 캡슐 또는 경질 젤라틴 캡슐에 넣어질 수 있다. 고압, 예를 들어 5,000 psi 이상에서 압축될 때, 85 % 이상의 영양 보충물이 약 1 내지 약 8시간에서 방출되고 다른 제형의 85 % 이상의 영양 보충물이 약 2 내지 약 6시간에서 방출된다. 장쇄 다당류는 갈락토즈, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코즈, 만노즈, 아세틸화-만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 아라비노즈, 아라비노갈락탄, 갈락투론산, 글루쿠론산, 이듀론산, 자일로즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 선택된 단량체를 포함할 수 있다. 영양 보충물은 롤러 압축(roller compaction)에 의해 약 2,000 내지 10,000; 5,000 내지 10,000; 또는 10,000 psi 이상의 압력에서 압축될 수 있다. 하나 이상의 장쇄 다당류는 약 0.1 내지 약 75 중량 퍼센트의, 예를 들어, 갈락토즈, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코즈, 만노즈, 아세틸화-만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 아라비노즈, 아라비노갈락탄, 갈락투론산, 글루쿠론산, 이듀론산, 자일로즈 및 이의 혼합물 또는 배합물을 가질 수 있다.
보충물은 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈로부터, 예를 들어 분리되고 정제된 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무(beet sugar), 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검(locust bean gum), 실리움(psyllium), 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송(Larch tree) 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄, 락토즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 선택된 하나 이상의 장쇄 다당류를 포함할 수 있다. 한 특정 실시예에서, 장쇄 다당류 및/또는 하나 이상의 당류의 영양상 유효량은 약 1 내지 약 10 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코즈, 만노즈, 아세틸화-만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 아라비노즈, 아라비노갈락탄, 갈락투론산, 글루쿠론산, 이듀론산, 자일로즈 및 이의 혼합물 또는 배합물을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 방출 조절된 식사 보충물은 분리되고 정제된 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무, 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검, 실리움, 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄, 락토즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 선택된 하나 이상의 분리되고 정제된 장쇄 다당류; 및 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 당류, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 하나 이상의 영양 보충물(여기서 장쇄 다당류 및 영양 보충물은 2,000 psi 이상의 압력에서 롤러 압축된다)을 포함한다.
본 발명의 다른 방출 조절된 식사 보충물은 하나 이상의 분리되고 정제된 장쇄 다당류, 하나 이상의 친유성 항산화제 및 하나 이상의 소유성 항산화제의 영양상 유효량을 포함하고, 여기서 보충물은 5,000 psi 이상의 압력에서 롤러 압축된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 장쇄 다당류와, 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 당류, 허브 추출물, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 하나 이상의 영양 보충물의 영양상 유효량을 혼합함으로써 방출 조절된 식사 보충물을 제조하는 방법을 포함하고, 이는 100, 500, 1,000, 2,000, 5,000 또는 10,000 psi 이상의 압력에서 압축된다. 상기 방법은 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무, 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검, 실리움, 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄, 락토즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 분리되고 정제된 하나 이상의 다당류의 영양상 유효량, 및 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 하나 이상의 영양 보충물을 포함하는 방출 조절된 식사 보충물을 제조하는데 사용될 수 있고, 여기서 다당류 및 영양 보충물은 2,000 psi 이상의 압력에서 압축된다.
본 발명은 또한 항산화제 센서, 및 총 샘플 산화 수준 및 총 샘플 산화 상태에 대한 항산화제의 효과를 직접 측정하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 최적의 건강을 위해 개인에게 항산화제의 유효량을 제공하는데 유용한 조성물 및 방법을 포함한다. 본원에 기재된 기구 및 방법은 샘플의 총 산화제 용량을, 동시에, 또한 직접적으로 실시간으로 측정한다. 본 발명자는 기술이 2개의 상호 배타적인 범주의 항산화제(친유성 및 소유성)를 인공적으로 제조하였고 이들을 분리하여 측정하였다는 것을 발견하였다. 더욱이, 기술이 또한 일반적으로 라디칼의 존재를 간접적으로, 즉 측정가능한 보고 분자(reporter molecule)를 사용하여 측정해왔다.
본 발명은 종래 기술의 측정기 및 방법의 한계를 빠르고 저렴한 직접 측정 시스템을 사용하여 극복하였다. 이러한 제한을 설명하기 위하여, 본 발명자는 본원에 기재된 산소 라디칼 흡수 용량-산소(ORAC(o): Oxygen Radical Absorbance Capacity-Oxygen) 기구 및 방법을 개발하였다. ORAC(o) 기구를 사용하여, 본 발명자는 처음으로 동시에 실시간으로, 용존 산소 수준에 대한 친유성 및 소유성 항산화제 모두의 영향을 측정할 수 있었다. ORAC(o) 분석을 사용하여, 발명자는 상승적 항산화제 조성물을 개발하였고, 이는 단독으로 또는 하나 이상의 항산화제 강화제와의 배합물로 사용될 수 있다.
더욱 특히, 본 발명은 친유성 및 소유성 항산화제 모두의 항산화제 활성을 직접 측정하기 위한 기구를 포함하고, 이는 샘플과 유체 전달을 하는 용존 산소 센서 및 용매/물/계면 활성제 혼합물 내의 산소 라디칼 민감성 분자를 포함하고; 여기서 산소 라디칼 민감성 센서는 용매/물/계면 활성제 혼합물의 친유성 및 소유성 항산화제 모두를 동시에 측정한다. 산소 라디칼 민감성 분자는 산소와 반응하는 분자, 예를 들어 접합된 이중 결합을 갖는 분자; 또는 질소 또는 황 함유 화합물일 수 있다. 산소 라디칼 민감성 분자의 예에는 예를 들어, 플루오레세인, β-피코에리트린(β-PE), 글루타티온-S-트랜스페라제, 리놀산 또는 이의 배합물이 있다. 산소 라디칼 수준은 용매/물/계면 활성제 혼합물에 용존 산소 미터 또는 센서를 사용하여 직접 측정한다. 용존 산소 수준을 산소 센서, 예를 들어 전기 화학, 화학 발광, 표면 플라스몬 공명, 적외선, 콘덴서 결합(capacitance coupled), 염료 결합 섬유 광학 또는 초미세 분광(hyperspectral) 산소 센서를 사용하여 측정할 수 있다. 용존 산소 미터 또는 센서를 높은 처리량의 분석을 위해 직렬로 놓을 수 있고, 단일 샘플 측정기일 수 있고/있거나 사무실 또는 심지어 가정용 용도로 개조할 수 있다. 용매는 유기 용매, 예를 들어 아세톤일 수 있다. 계면 활성제는 세정제, 예를 들어 Tween-20과 같은 비이온성 세정제일 수 있다. 용매/물/계면 활성제 혼합물 내의 용매는 일반적으로 용매/물/계면 활성제 혼합물 부피의 약 10 내지 90 % 이상, 예를 들어 33 %이다. 용매/물/계면 활성제 혼합물 내의 물은 일반적으로 용매/물/계면 활성제 혼합물 부피의 적어도 약 10 내지 90 %, 예를 들어 33 내지 67 %이다. 용매/물/계면 활성제 혼합물 내의 계면 활성제(또는 세정제)는 용매/물/계면 활성제 혼합물 부피의 약 0.1 내지 10 %이고 물에 용해되어 저장될 수 있다. 한 특정 실시예에서, 용매/물/계면 활성제 비율은 약 1:1:1이다.
기구는 추가로 하나 이상의 프로세서, 예를 들어 측정기, 캡쳐 데이터, 저장 데이터를 조절하고, 데이터 및/또는 정보의 데이터베이스에 기초하여 계산을 수행하고/계산하거나 데이터를 나타내고, 데이터를 표, 그래프, 차트 등의 형태로 요약할 수 있는 컴퓨터를 포함한다. 프로세서/컴퓨터는 또한 연결될 수 있고 심지어 산소 센서 및 용매/물/세정제 혼합물과 유체 교환을 하는 유체 시스템을 조절할 수 있다. 본 발명은 산화제 용량에 대해 시험되는 샘플의 활성으로부터 생성되는 산소의 소실을 공지된 표준의 활성의 결과로서 관찰되는 산소의 상대적 소실과 연관시킨 곡선 아래의 면적을 측정한다. 본 발명 및 본원에 기재된 방법을 사용하여, 용존 산소의 수준을 친유성 및 소유성 항산화제 모두를 동시에 포함하는 용액에서 직접적으로 측정한다. AUC를 계산하기 위한 식의 예는 다음과 같고:
Figure 112007071165708-PCT00001
여기서 AUCSMP는 샘플의 곡선값 아래 면적이고;
AUCBLNK는 바탕의 곡선값 아래 면적이고;
AUCTRLX는 Trolox ®의 곡선 아래 면적이고;
SMP는 샘플이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 항산화제 및 산소 라디칼 표적의 존재 하에서 용매/물/계면 활성제 혼합물에 용해된 시험 용액 내의 용존 산소 수준을 측정하는 단계를 포함하는 항산화제 활성을 직접 측정하는 방법을 또한 포함하고, 여기서 수용해성 및 지용해성 항산화제 활성을 산소 측정기로 측정한다. 용존 산소 라디칼 수준을 산소 측정기, 예를 들어 전기 화학, 화학 발광, 표면 플라스몬 공명, 콘덴서 결합, 염료 결합 섬유 광학 또는 초미세 분광 산소 센서를 사용하여 측정할 수 있다. 항산화제 활성을 약 37 ℃에서 측정할 수 있다. 라디칼 개시제의 예에는, 예를 들어, 2,2'-아조비스[2-(5-메틸-2-이미다졸린-2-yl)프로판]디하이드로클로라이드, 2,2' 아조비스 (2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(AAPH), 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)[2-(N-스테아릴)아미디노프로판]디하이드로클로라이드(SA-1), 2,2'-아조(2-(2-이미디아졸린-2-일)-프로판)-[2-[2-(4-n-옥틸)이미다졸린-2-일]-프로판]디하이드로클로라이드(C-8), 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸밸러로니트릴)(MeO-AMVN), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸밸러로니트릴)(AMVN), 아조-비스-이소부틸니트릴, 2,2'-아조비스(2-메틸프로프리오네이트)(DAMP) 및 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판), 이의 염, 혼합물 또는 등가물이 포함된다. 탐지기는 심지어 처분할 수 있다.
본 발명은 또한 임의의 분리되고 정제된 소유성 항산화제 및 임의의 분리되고 정제된 친유성 항산화제를 포함하는 식사 보충물을 포함하고, 여기서 결합된 소유성 및 친유성 항산화제는 6,000 μMol Trolox® 등가물(Equivalents)(TE)/g 이상의 용존 산소 값을 갖는다. 당업자는 상기 값을 또한 액체 등가물, 예를 들어 6,000 μMol Trolox® 등가물 (TE)/ml로 나타낼 수 있다고 이해할 것이다. 소유성 및 친유성 항산화제는 지효성(time-released)이고 알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타, 에타, 크사이 1, 크사이 2 및 시그마 토코페롤, 및 알파, 베타, 델타 및 감마 토코트리에놀, 이의 유사체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 비타민 E를 포함할 수 있다. 친유성 항산화제의 예에는 케르세틴, 캄페롤, 미리세틴, 아피게닌 및 이의 유도체, 유사체, 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물이 포함될 수 있다.
임의의 분리되고 정제된 소유성 항산화제 및 임의의 분리되고 정제된 친유성 항산화제를 포함하는 식사 보충물은, 또한 2개 이상의 필수 당류, 예를 들어 갈락토즈, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코즈, 만노즈, 아세틸화-만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및/또는 자일로즈를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 보충물은 또한 비타민 C의 출처, 예를 들어 호주산 관목 종려나무(Australian bush palm)(Terminalia ferdinandiana)와 같은 높은 수준의 천연, 생체 이용성 비타민 C를 갖는 식물 출처를 포함한다. 다른 특정 양태에서, 비타민 C는 야생 호주산 관목 종려나무(Terminalia ferdinandiana)와 같은 비타민 C의 식물 출처로부터의 항산화제 활성 강화제이고, 이는 농장 관목 종려나무보다 높은 비타민 C 퍼센티지를 갖는다. 보충물은 또한 하나 이상의 프로바이오틱, 예를 들어, 락토바실루스(Lactobacillus sp.) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.)을 포함한다. 보충물은 압축되어 일반적인 산소 비침투성 표면, 예를 들어 롤러 압축된 입자, 캡슐, 정제, 미니탭(mini-tab), 캐플릿, 비등성 정제 또는 이의 배합물을 제공할 수 있다.
상기 기재된 ORAC(o) 기구 및 방법과 비교하면, 분리되고 정제된 친유성 및 소유성 항산화제는 7000 μMol Trolox® 등가물(TE)/g 이상의 항산화제 ORAC(fl-lipo) 값을 가질 것이다. 본 발명은 식사 내에 본 발명의 항산화제를 포함하는 항산화제/글리코영양분 혼합물을 섭취하는 각각의 개인에서의 항산화제 수준에서의 변화를 측정하는 개방 연구(open label study)에서 사용되었다. 환자에게 제공된 경우, 소유성 및 친유성 항산화제는 누적 환자 집단의 평균 기준 항산화 수준으로부터 ORAC(β-PE)에 의해 측정시 13 % 이상의 평균 증가를 제공하였다. 본 발명은 또한 많은 조성물을 포함한다. 본원에 기재된 조성물은 최근 입수가능한 식사 보충물이 친유성 및 소유성 항산화제를 개별 성분으로부터 기대되는 활성 이상의 측정가능한 활성으로 혼합할 수 없다는 인식을 기초로 한다. 본원의 기구 및 방법을 사용하여, 본 발명자는 친유성 및 소유성 항산화제의 상승적 배합물을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 항산화제 활성 강화제를 첨가할 수 있었다.
케르세틴과 같은 플라보노이드는 최근 글루타티온 합성, 감마-글루타밀시스테인 합성효소의 무거운 단위체의 전사를 유전자의 항산화제 반응성 성분을 통해 증가시키는 것으로 보여져왔다. 증가된 전사는 후속적으로 조직 배양 세포에서 환원된 (활성) 글루타티온의 증가된 세포내 수준으로 변형된다. 케르세틴은 적포도주, 포도 과피 및 양파의 주요 성분이다. 적포도주, 포도 과피 및 양파로부터의 케르세틴의 연구는 건강상 유익한 효과를 제시한다. 케르세틴은 사람에 의해 잘 흡수되는 것으로 보여져왔다. 한 연구는 모든 소화된 케르세틴이 식사 2시간 후 대사된다는 것을 보여주었다[참조: European Research on Functional Effects of Dietary Antioxidants, September 25-28, 2002, Cambridge, UK]. 적포도주의 중도의 양을 소비하는 대상에서 실질적으로 LDL 산화가 감소된 것을 발견하고, 연구자는 보호 효과가 케르세틴 및 이의 대사물의 활성에 기인하는 것이라고 주장하였다. 케르세틴은 또한 에리트로사이트의 안정성을 향상시키는 것으로 보여져왔다.
본 발명자는 산화성 스트레스에 영향을 주는 다수의 다양한 요소에 의해, 항산화제 보충물이 개인의 필요 및 화학에 맞추어질 필요가 있다고 이해하였다. 추가로, 토코페롤의 배합물이 개인의 상이한 필요를 충족시킬 필요가 있다고 이해하였다. 토코페롤의 배합물은 몇몇 항산화제가 신체에 의해 "선택"되기 때문에 필요하다. 예를 들어, 북미 식사에서의 비타민 E의 주된 형태는 감마 토코페롤이고, 이는 통상적으로 대두 및 옥수수로부터 유래된 생성물뿐 아니라 식물성 오일에서 발견된다. 그러나, 신체는 주로 알파 토코페롤을 보유한다. 알파 토코페롤 전달 단백질에 의존한 특정 방법이 신체 내의 알파 토코페롤 농도를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 종래 기술의 항산화제 조성물과는 달리, 본 발명은 혼합된 토코페롤을 사용하여 신체에 다양한 형태의 비타민 E를 제공하여, 각각의 형태의 최적의 양의 선택, 보유 및 사용을 허용한다. 추가로, 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 상승적 배합물은 신체에 넓은 범위의 항산화제 영양분의 최적의 선택을 제공하고, 이는 개인의 필요에 따라 상이할 수 있다.
본 발명자는 이러한 항산화제의 활성을 강화하는 것을 돕는 화합물을 첨가함으로써 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 상승적 배합물의 활성을 추가로 최대화하려고 하였다. 하나의 이러한 강화제는 비타민 C이다. 비타민 C는 이에 기인한 상당한 항산화제 활성 뿐 아니라 몇몇 비항산화제 영양적 기능을 갖는다. 특히 전이 금속의 존재하에서, 비타민 C에 산화 촉진 특징을 많이 부여한다. 비타민 C의 산화 촉진 특성은 완전히 파괴적이지 않을 수 있다. 그러나, 다른 연구자는 이들이 비타민 C가 비결합 금속의 존재하에서도, 항산화제로 작용한다는 것을 밝혀냈다고 주장하였다. 항산화제 활성의 다른 강화제에는 천연 추출물, 예를 들어 포도 씨 추출물 및 녹차 추출물이 포함된다. 한 연구에서, 녹차는 시험관내에서 강한 항돌연변이 활성을 보였고 래트의 칼시노겐 유발 발암전 병변의 발생을 억제하였다. 녹차는 또한 현저하게 장폴립(intestinal polyps)의 형성을 억제하였다. 따라서, 본 발명자는 케르세틴 및 혼합 토코페롤과 같은 천연 원천으로부터 정제되고 분리된 항산화제의 상승적 배합물 뿐 아니라, 이러한 약제의 측정가능한 항산화제 활성을 증가시키는 강화제를 추가로 첨가하였다.
더욱 특히, 조성물은 2 이상의 필수 당류; 분리되고 정제된 소유성 산소 라디칼 제거제(quencher); 및 분리되고 정제된 친유성 산소 라디칼 제거제의 영양상 유효량을 포함하는 식사 보충물이고, 여기서 혼합된 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제는 6,000 μMol Trolox®등가물 (TE)/g 이상의 산소 라디칼 제거제 값을 갖는다. 한 분석에서, 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제는 환자에게 제공되었을 때 환자 집단의 기준 항산화 수준으로부터 ORAC(fl-lipo)에 의해 측정시 13 % 이상의 평균 증가를 제공한다. 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제는 연장된 방출을 위해 포장되고, 알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타, 에타, 크사이 1, 크사이 2 및 시그마 토코페롤, 및 알파, 베타, 델타 및 감마 토코트리에놀, 이의 유사체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물인 하나 이상의 비타민 E 분자를 포함할 수 있다. 산소 라디칼 제거제에는 하나 이상의 플라보놀, 케르세틴, 캄페롤, 미리세틴, 아피게닌 및 이의 유도체, 유사체, 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물이 포함될 수 있다. 보충물은 추가로 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈, 이의 유도체, 유사체, 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2 이상의 당류를 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점에 대한 보다 완전한 이해를 위해, 하기에 발명의 상세한 설명이 언급되고, 이에 다음과 같은 도면이 수반된다:
도 1는 ORAC(o) 직접 항산화제 기구를 나타내고;
도 2는 본 발명의 ORAC(o) 방법의 흐름도이고;
도 3은 ORAC(o)(산소 퍼센트) 내의 바탕 용액(blank solution)을, 개시제로 AAPH, 표준으로 Trolox®, 및 리놀산 또는 플루오레세인을 각각 산소 라디칼 표적으로 사용한 ORAC(fl) (형광) 측정값과 비교하는 2개의 그래프이고;
도 4는 ORAC(o)(산소 퍼센트) 내의 항산화제 표준 Trolox®를, 개시제로 AAPH, 표준으로 Trolox®, 및 리놀산 또는 플루오레세인을 각각 산소 라디칼 표적으로 사용한 ORAC(fl) (형광) 측정값과 비교하는 2개의 그래프이고;
도 5는 ORAC(o)(산소 퍼센트) 내의 바탕 용액, 표준 및 샘플을, 개시제로 AAPH, 표준으로 Trolox® 및 리놀산 또는 플루오레세인을 각각 산소 라디칼 표적으로 사용한 ORAC(fl) (형광) 측정값과 비교하는 2개의 그래프이고;
도 6은 본 발명의 ORAC(o) 방법에 의해 측정된 5 ㎍/mL의 케르세틴 (Q) 및 5 ㎍/mL의 혼합된 토코페롤 (MT)의 배합물의 항산화제 효과를 10 ㎍/mL 농도에서 각각의 성분의 항산화제 효과와 분리하여 비교하여 나타낸 그래프이고;
도 7은 본 발명의 ORAC(o) 방법에 의해 측정된 5 ㎍/mL의 케르세틴 (Q) 및 혼합된 5 ㎍/mL의 토코페롤 (MT)의 배합물, 및 대조군으로서의 Trolox®의 항산화제 효과를 나타낸 그래프이고;
도 8은 항산화제 용량을 측정하기 위해 ORAC(o) 방법을 사용한 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 적정된 비율로부터의 곡선 아래 면적(AUC) 결과의 그래프이고;
도 9는 항산화제 용량을 측정하기 위해 ORAC(o) 방법을 사용한 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 적정된 비율로부터의 곡선 아래 면적(AUC) 결과의 다른 그래프이고, 이는 예측 결과(선) 및 선 위의 측정된 상승의 정도를 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 적정으로부터의 예측 결과와 비교하여 나타내었고;
도 10은 49.18 % 케르세틴, 32.79 % 혼합된 토코페롤 및 1.64 % 관목 종려나무의 존재하에서의 포도 과피 추출물 및 녹차 추출물의 다양한 비율에 대한 ORAC(o) 분석으로부터의 결과를 보여주는 그래프이다. 포도 과피 추출물 대 녹차 추출물의 최적의 비율은 60/40 내지 80/20이고;
도 11은 5 ㎍/mL의 케르세틴 (Q) 및 5 ㎍/mL의 혼합된 토코페롤 (MT) 배합물의 ORAC(fl) 결과를 10 ㎍/mL 농도에서의 각각의 성분과 분리하여 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 12는 아세톤:물에 용해된 케르세틴 대 α-토코페롤의 적정을 측정한 ORAC(fl) 분석의 그래프이고;
도 13은 용매:물:세정제 혼합물에 용해된 케르세틴:α-토코페롤 비율의 고정된 비율에 대해 측정한 항산화제 활성을 측정하는 ORAC(fl) 분석의 그래프이고;
도 14는 2가지 상이한 정량의 용매:물 내지 세정제 혼합물에 용해된 케르세틴:α-토코페롤 비율의 고정된 비율에 대해 측정한 항산화제 활성을 측정하는 ORAC(fl) 분석의 그래프이고;
도 15는 상이한 비율의 케르세틴 및 혼합된 토코페롤로 수득한 ORAC(o) 값을 나타내는 그래프이고;
도 16은 상이한 정량의 포도씨 추출물 및 녹차 추출물에 대한 ORAC(o) 값을 나타내는 그래프이고;
도 17은 최대 케르세틴:혼합된 토코페롤 및 포도씨 추출물 및 녹차 추출물 비율의 배합물의 ORAC(o) 값을 나타내는 그래프이고;
도 18은 최초 조사를 위해 선택된 3가지 모듈을 나타내고;
도 19 및 20은 HPLC 및 UV/Vis 각각에 의한 케르세틴의 상대적 방출 프로파일을 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
하기에 논의된 본 발명의 다양한 양태를 제조하고 사용하면서, 본 발명이 다양한 종류의 특정 배경에서 구체화될 수 있는 적용가능한 발명의 개념을 제공한다고 이해되어야 한다. 본원에 논의된 특정 양태는 단지 본 발명을 제조하고 사용하 는 특정 방법을 설명한 것이고 발명의 범주를 제한하지 않는다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 다양한 용어가 하기에 정의된다. 본원에 정의된 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 용어 "하나(a, an)" 및 "상기(the)"는 단수를 나타내려고 하는 것이 아니고, 특정 예시가 설명을 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함한다. 본원의 용어는 본 발명의 특정 양태를 기재하기 위해 사용되지만, 이의 용도는 청구항에 약술된 바를 제외하고는 본원을 제한하지 않는다.
본 발명은 부분적으로, 당해 기술이 인공적으로 상호 배타적인 2개의 범주의 항산화제를 제조하였고 이들을 분리하여 측정하였다는 인식을 바탕으로 한다. 추가로, 당해 기술이 또한 일반적으로 라디칼의 존재를 간접적으로, 즉 보고 분자를 사용하여 측정하였다. 본 발명은 샘플의 총 항산화제 용량을 동시에 뿐 아니라, 직접적으로 측정하는 기구 및 방법을 제공한다.
본원의 용어 "필수 당류"는 세포 당단백질의 올리고당 쇄에서 통상적으로 발견되고 식사 또는 신체 내의 생화학적 제조를 통해 쉽게 이용될 수 없는 단당류를 정의하는데 사용된다[참조: 예를 들어, Harper's Biochemistry (Murray et al., 1996)(listing eight) 및 Principles of Biochemistry, Vol II (Zubay, et al., 1995)(listing eleven)]. 200 가지 이상의 단당류가 천연으로 발견되지만, 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 자일로즈, 이듀론산, 아라비노즈 및 글루쿠론산의 11가지가 포유류에서 우수한 건강 상태를 유지하는데 중요한 것으로 여겨진다. 이들 탄수화물의 구조 는 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들어, Stryer's Biochemistry (Stryer, 1995) 및 Merck Index, 12th Edition, 1996].
본원의 용어, "장쇄 당류" 및 "장쇄 다당류"는 쇄 내 수소 결합을 할 수 있는 2 이상의 당류를 갖는 당류 쇄를 설명하는데 사용된다. 예를 들어, 관련된 부분이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,735,935호는 알로에 베라에서 장쇄 다당류를 분리하는 방법을 알려주며, 여기서 침전된, 동결 건조된 장쇄 다당류가 쇄 당 2 내지 약 50,000개의 단량체를 갖는다. 장쇄 다당류는 알려지고 본원에 기재된 바와 같이 다양한 식물 및 동물 원천으로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 장쇄 다당류를 분리하고 정제하고, 심지어 이의 특정 쇄 길이 또는 배합물을 분리하는 것은 예를 들어, 장쇄 다당류의 가수 분해, 특정 길이의 장쇄 다당류의 대량 분리(bulk isolation), 보다 긴 장쇄 다당류의 중합, 보다 짧거나 긴 장쇄 다당류의 배합물의 선택, 예를 들어 전기 천공법, FPLC, HPLC, 크기 배제(size-exclusion), 크기 배제 크로마토그래피, 침전 등에 의한 장쇄 다당류의 분리에 의해 수득할 수 있다.
본원의 용어 "방출 조절된"은 본 발명의 제형을 사용하여 본원에 약 60분 내지 약 2, 4, 6, 8 시간 이상으로 정의된 연장된 기간에 걸쳐 영양분의 영양상 유효량을 전달하는 방출 프로파일을 설명하는데 사용된다. 조절된 방출은 또한 약 60분 및 약 2, 4, 6 또는 심지어 8시간 이후의 영양분의 80 내지 90 % 이상의 방출로 기능적으로 정의될 수 있다. 조절된 방출은 또한 동물에 흡수될 수 없는 몇몇 활성물과 같이, 섭취 여부와 무관하게 환자 또는 대상에게 이용 가능한 영양분을 제조함으로써 평가될 수 있다. 다양한 방출 조절된 투약 형태는 본원에 기재된 바와 같이 당업자에 의해 쉽게 설계되어 코팅 물질 및/또는 코팅 두께의 선택에 따라, 소장 및 대장 모두로, 소장으로만 또는 대장으로만 전달할 수 있다. 장쇄 다당류로 제조될 수 있는 개질의 예에는 예를 들어, 장쇄 다당류 내의 당류의 유형 또는 조성물을 변화시키는 것, 당류의 곁쇄를 화학적으로 개질(유기적으로 또는 화학적으로) 개질시키는 것(예를 들어, 아세틸화), 장쇄 다당류의 가수분해, 장쇄 다당류의 크기 결정(sizing), 보다 긴 장쇄 다당류의 중합, 보다 짧거나 긴 장쇄 다당류의 배합물의 선택, 예를 들어 전기 천공법, FPLC, HPLC, 크기 배제, 크기 배제 크로마토그래피, 침전 등에 의한 장쇄 다당류의 분리가 포함된다. 연장된 방출 제형을 제조하고 전달하여, 조절된 방출이 없었다면 수행될 수 있을 정도보다 보다 말단인 하부 장관의 일반적으로 예측가능한 몇몇 위치에서 방출되도록 할 수 있다.
본 발명은 단독으로 또는 하나 이상의 방법, 기술, 역학적, 화학적 및 다른 개질, 캡슐화, 포장 등과 함께, 예를 들어 캡슐, 겔 캡(gel cap) 또는 심지어 코팅으로 영양분의 방출을 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 캡슐의 예에는 동물성, 식물성, 중합성, 이의 혼합물 및 배합물이 포함된다. 코팅(유형, 두께 등)을 충분한 두께에 적용하여 코팅의 일부 또는 전체가 위장 유체에 약 5 pH 이하에서는 용해되지 않지만, 약 5 pH 이상에서는 용해되도록 한다.
본원의 용어 "영양상 유효량"은 포유류에서 유익한 영양상 효과 또는 반응을 제공하는 양을 정의하도록 사용된다. 예를 들어, 비타민 및 무기물을 함유하는 식사 보충물에 대한 영양상 반응으로서, 비타민 및 무기물의 영양상 유효량은 각각 다양할 것이라고 이해되어야 한다. 마찬가지로, 필수 아미노산, 비타민 C, 철, 요 오드, 비타민, 무기물, 탄수화물, 지질 등의 결핍이 생리학적 기능 및 세포 기능에 영향을 준다고 공지되어 있다. 본원에 기재된 항산화제 및 당류의 영양상 유효량은 예를 들어 이들 영양 보충물을 위한 식사를 유지시키거나 증가시키고자 하는 사람의 식사 내의 이러한 중요한 영양분의 수준을 유지하고/하거나 상승시키도록 작용한다. 따라서, 한 포유류가 한정된 양으로 존재하는 비타민 및 무기물의 특정 프로파일을 요구할 수 있는 반면, 다른 포유류는 상이한 한정된 양으로 존재하는 비타민 및 무기물의 동일한 특정 프로파일을 요구할 수 있다.
본원의 "항산화제"는 산화가능한 표적 분자의 산화를 지연 또는 예방하는 임의의 분자를 나타낸다. 항산화제는 생물학적으로 중요한 반응성 자유 라디칼 또는 다른 반응성 산소 종(예를 들어, O2 -, H2O2, HOCl, 페릴, 퍼옥실, 퍼옥시니트라이트 및 알콕실)을 제거하고; 산소 라디칼 형성을 방지하고; 또는 촉매적으로 자유 라디칼 또는 다른 반응성 산소 종을 덜 반응성인 종으로 전환시킴으로써 작용한다. 항산화제는 일반적으로 (1) 지질(친유성 또는 소수성) 항산화제; 및 (2) 수성(소유성 또는 친수성) 항산화제의 두 부류로 나뉘어진다. 지질 항산화제의 예에는 이에 제한되지는 않지만, 지질 핵심(core) 부분에 위치한 카로티노이드(예를 들어, 루테닌, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 리코펜, α-카로틴 및 β-카로틴), 및 지질 부분의 경계면에 위치한 토코페롤(예를 들어, 비타민 E, α-토코페롤, γ-토코페롤 및 δ-토코페롤), 및 레티노이드(예를 들어, 비타민 A, 레티놀 및 레티닐 팔미테이트) 및 지방 용해성 폴리페놀, 예를 들어, 케르세틴이 포함된다. 수성 항산화제의 예에는 이에 제한되지는 않지만, 아스코르브산 및 이의 산화된 형태, "탈수소아스코르브산", 요산 및 이의 산화된 형태 "알란토인", 빌리루빈, 알부민 및 비타민 C 및 카테킨과 같은 수용성 폴리페놀이 포함되고, 이는 인지질막, 이소플라본 및 프로시아니딘에 높은 친화성을 갖는다.
통상적으로 사용되는 산소 라디칼 및 항산화제 용량의 상대적 수준의 측정 방법은 산소 라디칼 흡수 용량(ORAC) 분석이다. 공지된 ORAC-유형 분석에서, 항산화제 값을, 특정 산소 라디칼에 의한 산화에 대한 우수한 표적이 되거나 될 수 없는 예를 들어, 형광 또는 다른 탐지가능한 분자에 대한 산소 라디칼의 영향을 측정함으로써 간접적으로 측정하였다. 일반적으로, 항산화제가 시험 샘플에 첨가될 때, 과산화물과 같은 자유 라디칼, 또는 과산화 수소와 같은 비-라디칼 반응성 산소 종의 양에서의 탐지가능한 감소를 샘플에서, 항산화제로 처리되지 않은 샘플(예를 들어, 대조 샘플)과 비교하여 발견할 수 있다. 그러나, 이러한 간접적 방법은 중간물에 대한 라디칼의 영향이 산화제 및 항산화제의 상대적 수준을 실제로 반영한다는 가정하에서 측정된 중간물(예를 들어, 플루오레세인, β-피코에리트린(β-PE) 등)을 통한 항산화 상태에서의 변화를 모니터한다. 이러한 분석에 대한 대조군은 공지된 농도의 산소 라디칼 생성자, 및 샘플에 대해 표준으로 측정되고 사용되는 공지된 항산화제이다.
본원의 용어 "자유 라디칼"은 하나 이상의 비공유 전자를 함유하는 분자를 나타낸다. 대부분의 분자는 짝수개의 전자를 함유하고, 이의 공유 결합은 통상적으로 공유 전자쌍을 포함한다. 이러한 결합의 절단은 각각 비공유 전자(임의의 전자 쌍에 추가로)가 있는 2개의 분리된 자유 라디칼을 생성한다. 자유 라디칼은 전자적으로 전하를 띄거나 중성일 수 있고, 반응성이 크거나 대개 수명이 짧다. 자유 라디칼은 서로 또는 비공유 전자를 갖는 원자와 결합한다. 완전한 분자와의 반응에서, 자유 라디칼은 새로운 라디칼을 생성하면서 이들만의 전자 구조를 완성하려고 하고, 이는 연쇄 반응을 생성시키면서 다른 분자와 계속 반응한다. 자유 라디칼 연쇄 반응은 고온에서의 물질 분해 및 중합에서 특히 중요하다. 신체 내에서, 산화된 자유 라디칼은 손상된 조직의 원인이다. 열, 자외선 및 이온화 방사는 모두 자유 라디칼을 생성시킨다. 자유 라디칼은 산화적 대사의 2차 효과로서 생성된다. 자유 라디칼의 초과량은 과산화물 디스뮤타제, 카탈라제 및 과산화효소와 같은 천연 보호 효소를 압도할 수 있다. 과산화 수소(H2O2), 하이드록실 라디칼(HO.), 단일항(singlet) 산소(1O2), 과산화 음이온 라디칼(O. 2 -), 산화 질소 라디칼(NO.), 퍼옥실 라디칼(ROO.), 퍼옥시니트라이트(ONOO-) 와 같은 자유 라디칼은 지질 또는 수성 부분에 존재할 수 있다. 항산화제 영양분(예를 들어, 비타민 C 및 E, 셀레늄, 폴리페놀)은 이러한 효과를 감소시킬 수 있다.
본원의 용어 "지질 부분"은 사이클릭 또는 사이클릭이 아닌 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체, 예를 들어 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드를 나타낸다. 예를 들어, 통상의 지질에는 지방산, 지방, 인지질, 스테로이드, 에이코사노이드, 밀납 및 지방 용해성 비타민이 포함된다. 몇몇 지질은 일반적으로 단일 지질 및 복합 지질, 예를 들어, 트리글리세라이드 또는 지방 및 오일, 글리세롤의 지방산 에스테르, 밀납, 장쇄 알코올의 지방산 에스테르 및 콜레스테롤 및 에르고스테롤과 같은 스테로이드의 2가지 그룹으로 분류될 수 있다. 복합 지질에는 예를 들어, 포스파티드 또는 인지질(인 함유 지질), 당지질(탄수화물 함유 지질), 및 스핑고리피드(스핑고신 함유 지질)이 포함된다.
본원의 용어 "지질"은 지방 또는 지방 유사 물질을 포함한다. 용어는 단백질 또는 탄수화물과 같은 화학적 명칭보다는 설명적이다. 지질에는 순수한 지방(즉, 지방산 에스테르 및 글리세롤), 유지질(예를 들어, 인지질, 세레브로사이드, 밀납) 및 스테롤(즉, 콜레스테롤, 에르고스테롤)이 포함된다. 지질은 자동 산화와 같은 메카니즘을 통한 산화의 표적이 될 수 있다. 본원의 용어 "지방산"은 예를 들어 음성 전하의, 일반적으로 선형 탄수화물 쇄의 그룹을 나타낸다. 지방산의 탄화수소 쇄는 길이 및 산화 상태가 다양하다. 일반적으로 지방산은 음성 전하 부분(예를 들어, 카복실 말단에서) 및 지방산의 수용해성 및 양친매성 특성을 결정하는 "말단" 부분을 갖는다. 예를 들어, 지방산은 세포 내에 에너지를 저장하거나, 혈류내 지방의 운반을 위해 사용되는 지방으로, 생물학적 막을 포함하는 인지질의 성분이다. 본원의 용어 "인지질"은 지방산, 알코올 및 질소성 염기 중 하나 이상의 사이드 그룹(side-group)을 포함하는 인산 에스테르의 임의의 부류를 나타낸다.
본원의 용어 "지방" 또는 "지방들"은 임의의 지방산 글리세릴 에스테르, 예를 들어 지방산의 모노아실글리세롤, 디아실글리세롤 및 트리아실글리세롤 형태를 나타낸다. 트리글리세라이드는 중성 전하이고 전체가 소수성인, 즉 환원된 분자를 나타낸다. 모노아실글리세라이드 및 디아실글리세라이드는 인지질 합성에서의 대사 중간체이고, 이 때 트리글리세라이드는 물이 제거된 밀집된(compact) 상태 내에 화학적 에너지를 저장하기 위해 사용되는 지방 분자를 형성한다. 본원의 용어 "지방 용해성 비타민"은 예를 들어, 비타민 (A) (레티놀), 비타민 D (예를 들어, 비타민 D3 (콜레칼시페롤)), 비타민 E, 비타민 K 등을 포함하는 통상의 지방 용해성 비타민을 나타낸다.
본원의 용어 "지질 항산화제 활성" 또는 지질 항산화제 용량은 호환되어 사용되고 샘플의 지질 부분으로부터 기인한 항산화제 능력의 측정값을 나타낸다. 본원의 용어 "수성 항산화제 활성" 또는 "수성 항산화제 용량"은 호환되어 사용되고 샘플의 수성 부분으로부터 기인한 항산화제 능력의 측정값을 나타낸다. 본원의 용어 "총 항산화제 능력" 또는 "총 항산화제 용량"은 호환되어 사용되고 샘플의 지질 또는 수성 부분 모두로부터 기인한 항산화제 능력의 측정값을 나타낸다.
본원의 용어 "수성 부분"은 지질 부분과 상호 작용하지 않는 유체 샘플 부분을 나타낸다. 수성 부분은 혈액, 혈장, 혈청, 배설물, 뇌 척수액, 양수, 간질액, 림프액 및 윤활액을 포함한다. 예를 들어, 혈청과 같은 유체 샘플의 수성 부분은 혈액이 응고된 후 잔류하고 원심분리되어 혈액 세포 및 응고 성분이 제거되는 액체 부분뿐 아니라, 단백질, 예를 들어 알부민 및 글로불린; 항체; 효소; 아미노산과 글루코즈와 같은 소량의 영양 유기 물질; 나트륨, 염화물, 황산염, 인산염, 칼슘, 칼륨, 중탄산염, 마그네슘, 요오드화물, 아연 및 철과 같은 무기 물질; 요소, 요산, 크산틴, 크레아티닌, 크레아틴, 담즙 색소 및 암모니아와 같은 소량의 노폐물; 및 산소 및 이산화탄소와 같은 기체의 미량을 포함할 수 있다. 유체 샘플은 또한 비생물학적 샘플, 예를 들어 화학적 제형, 합성 조성물 또는 음식 제품 및 화장품일 수 있다.
본원의 용어 "샘플"은 액체 또는 유체인 생물학적 샘플, 또는 자유 라디칼이 자유 라디칼 생성자(예를 들어, 친유성 자유 라디칼 생성자 또는 친수성 자유 라디칼 생성자)를 사용하여 생성될 수 있고 (ORAC(o)) 탐지자 및 본 발명의 방법을 사용하여 측정될 수 있는 고체 생물학적 샘플을 나타낸다. 생물학적 샘플에는 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 양수, 간질액 및 윤활액이 포함된다. 고체 생물 샘플에는 예를 들어, 조직, 세포, 조직 배양, 고정된 세포, 세포 상청액, 또는 심지어 조직 또는 세포 물질의 일부(또는 추출물)가 포함된다. 용어 샘플은 또한 화학 용액, 합성 조성물 및 음식과 같은 비생물학적 샘플을 포함한다. 본원의 용어 "상대적 ORAC(o)" 및 "ORAC(o)"는 동일한 값을 나타내고, 이는 1 g 또는 1 ml 당 Trolox®(μmol)와 등가로 측정된다. ORAC(o) 음수값은 조성물이 항산화제로 작용하기보다는 산화 촉진제, 즉 산화를 촉진시키는 약제라는 것을 나타내는 바탕값으로 수득한 것보다 라디칼 제거 활성이 적다는 것을 반영한다.
본원의 용어 "라디칼 생성자" 또는 "라디칼 개시제"는 호환되어 사용되고 자유 라디칼을 생성시키는 약제, 화합물 또는 분자를 나타낸다. 라디칼 생성자는 측정된 수준, 예를 들어 항산화제 또는 산화 가능한 지시자가 자유 라디칼과 반응하여 측정가능한 또는 측정가능한 결과를 생성할 수 있는 수준에서 자유 라디칼을 생성시킬 수 있다. 라디칼 생성자의 예에는 예를 들어, 아조 라디칼 생성자가 포함되 고, 이는 공지된 속도 상수에서 자유 라디칼의 흐름을 생성시키는 화합물이다. 아조 라디칼 생성자에는 예를 들어, 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸밸러로니트릴)(MeO-AMVN), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸밸러로니트릴)(AMVN), 아조-비스-이소부틸니트릴, 2,2'-아조비스(2-메틸프로프리오네이트)(DAMP), 및 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판), 2,2'-아조비스[2-(5-메틸-2-이미다졸린-2일)프로판]디하이드로클로라이드, 철, 아스코르브산 및 금속 이온이 포함된다.
본원의 "대상"은 임의의 살아있는 유기체를 나타낸다. 용어 대상에는 예를 들어, 어류, 포유류, 파충류, 조류, 곤충류 등이 포함된다. 특정 예에는 사람, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종과 같은 인간이 아닌 영장류; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 가축; 마우스, 래트 및 기니아 피그와 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물 등이 포함된다. 상기 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지는 않는다. 따라서, 태아뿐 아니라 성인 및 신생 대상도 남성 또는 여성을 불문하고 포함하는 것으로 의도된다.
본원의 용어 "자유 라디칼 관련 장애"는 자유 라디칼의 생성 또는 자유라디칼에의 노출로부터의 병리학적 상태를 나타낸다. 본원의 용어 "자유 라디칼 관련 장애"에는 자유 라디칼로부터의 손상이 질환 상태의 병리학에 기여하고, 또는 자유 라디칼 억제제(예를 들어, 데스페리옥사민), 제거제(예를 들어, 토코페롤, 글루타티온) 또는 촉매(예를 들어, SOD, 카탈라제)의 투여가 징후를 감소시키고, 생존을 증가시키고 또는 병리학적 상태를 보호 또는 예방하는데 다른 측정 가능한 임상적 이익을 제공함으로써 측정가능한 이익을 제공하는 것으로 보여지는 병리학적 상태 가 포함된다. 자유 라디칼 장애의 예에는 이에 제한되지는 않지만, 허혈 재관류 손상, 염증성 질환, 전신 홍반루푸스, 심근 경색증, 뇌졸중, 외상성 출혈, 척수 외상, 크론병, 자가면역 질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 당뇨), 백내장 형성, 노인성 황반 변성, 알츠하이머 질환, 포도막염, 폐기종, 위궤양, 산소 독성, 종양 형성(neoplasia), 바람직하지 않은 세포 자멸(undesired cell apoptosis) 및 방사선증(radiation sickness)이 포함된다.
본원의 용어 "산화성 스트레스"는 대상 내의 산소 자유 라디칼에 의해 생성된 손상의 수준을 나타낸다. 손상의 수준은 반응성 산소 종이 얼마나 빨리 생성되고 항산화제에 의해 비활성화되는지에 뿐만 아니라 회복의 장소 및 속도에 의존한다. 본원의 산화 상태 및 산화성 스트레스에 관련된 용어 "편차(deviation)" 또는 "편차치"는 호환되어 사용될 수 있고 샘플의 항산화제 활성에서의 변화를 나타낸다. 산화 상태의 변화는 공지된 통상의 값으로부터의 항산화제 활성의 증가, 감소, 상승 또는 하강일 수 있다. 예를 들어, 샘플의 지질 부분, 샘플의 수성 부분 또는 샘플의 지질 및 수성 부분 모두에서의 항산화제 활성의 증가 또는 감소이다.
본원의 용어인 영양분의 "약제학적으로 허용되는 염"은 합당한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응 등이 없이 사람 및 하등 동물의 조직 내, 조직 상에서 또는 조직과 사용하기 적합하고 합당한 이익/위험 비율에 적합한 염을 설명하는데 사용된다. 약제학적으로 허용되는 염은 기술 분야에 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들어, 관련 부분이 본원에 참조로 인용된 S. M. Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 1977]. 적합한 염은 본 발명 화합물의 최종 분 리 및 정제 동안 또는 자유 염기 작용기를 적합한 유기산과 반응시켜 분리하여 제조할 수 있다. 대표적인 산 부가 염에는 이에 제한되지는 않지만 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠 술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르 술포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 염화수소, 브롬화수소, 요오드화수소, 2-하이드록시에탄술포네이트(이소티오네이트), 락테이트, 말레이트, 메탄 술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌 술포네이트, 옥살레이트, 팔미토에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, p-톨루엔 술포네이트 및 운데카노에이트가 포함된다. 4급화 시약으로 사용되는 질소 함유 그룹의 예에는 저급 알킬 할라이드(메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드); 디알킬 술페이트(디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트); 장쇄 할라이드(디아실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드); 아릴알킬 할라이드(벤질 및 페네틸 브로마이드) 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 산 부가 염을 형성하는데 사용되는 산의 예에는 무기산, 예를 들어 염산, 브롬산, 황산 및 인산, 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산이 포함된다. 염기 부가 염은 또한 본원에 기재된 항산화제 화합물의 최종 분리 및 정제 동안 원위치에서, 약제학적으로 허용되는 금속 양이온의 하이드록사이드, 카보네이트 또는 바이카보네이트와 같은 적합한 염기 또는 암모니아 또는 유기 1급, 2급 또는 3급 아민을 사용하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 이에 제한되지는 않지만, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 및 비독성 4급 암모니아, 및 아민 양이온, 그 중 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸암모늄, 디메틸암모늄, 트리메틸암모늄, 트리에틸암모늄, 디에틸암모늄 및 에틸암모늄을 포함하는 것이 포함된다. 염기 부가 산의 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민에는 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 등이 포함된다.
본원의 용어 "강화제(potentiate)"는 본 발명의 소유성 및/또는 친유성 항산화제의 활성을 직접 또는 간접적으로 증가 또는 향상시키는 작용을 하는 하나 이상의 약제를 나타낸다. 이러한 강화제의 하나는 비타민 C이고, 이는 항산화제를 재활성화 또는 재활용하는 작용을 할 수 있고 그 자체로 상당한 항산화제 활성을 가질 수 있다. 비타민 C의 산화 촉진 특성이 전이 금속의 존재 하에서 관찰되었다. 다른 항산화제 활성의 강화제에는 포도씨 추출물 및 녹차 추출물과 같은 천연 추출물이 포함된다. 한 연구에서, 녹차는 시험관내에서 강력한 항돌연변이 활성을 나타내고 동물 모델에서 칼시노겐 유발 발암전 병변의 발생을 억제하였다. 이와 같이, 강화제는 케르세틴 및 혼합된 토코페롤과 같은 천연 원천으로부터 정제되고 분리된 항산화제를 향상시키거나 심지어 상승작용을 하도록 할 수 있다.
본원의 용어 "글리코영양상" 또는 "글리코영양분"은 천연으로 합성되고 다양한 부류의 전달(communication)의 생화합 합성에 필요한 복합 탄수화물 또는 당류, 및 간질 세포액에 유리되고, 세포간 전달에서 활성이고(즉, 사이토킨, 성장 인자 등), 또는 세포막의 높은 특정 분자 활성의 중심을 포함하는 분자 배열을 구성하는(즉, 수용체 자리, 이온전달 채널, 항원 동정 등) 신호 분자를 나타낸다.
본원의 용어 "식물성 영양성(phytonutritional)" 또는 "식물성 영양분"는 식물에서만 발견되는 식물 세포를 보호하기 위해 생성되는 천연으로 합성된 분자를 나타낸다. 식물성 영양분은 주로 항산화제, 자유 라디칼 제거제 및 필수 미량영양분 활성을 갖는다. 식사 보충물을 통해 공급되는 이러한 분자는 성숙한 식물 조직에서 발견되고, 종피 및 종자 주위의 과실 조직에 가장 농축되어 있다. 포유류 조직에서, 이러한 분자는 식사에 제공될 때 세포 미세 환경 내의 생화학, 면역학 및 생리학을 최적화하는데 활성이다.
본원의 용어 "식물 추출물" 및 "허브 추출물"은 호환되어 사용되어, 식물 조직에서 생성되고 물, 극성 또는 석유 용매에 의해 추출될 수 있고, 어느 정도의 유익한 건강 또는 치료학적 활성을 갖는 식물 화학물질을 나타낸다. 대부분의 허브 약제는 특히 농축된 경우 독성일 수 있지만, 이의 보다 통상적인 방법으로 차 및 습포제(poultices)에서 "질환의 치료 및 우수한 건강을 촉진시키기 위한 민간 의약"으로 사용될 경우 일반적으로 안전하다. 본원의 용어 "허브 신체 조절 약제"는 주름, 쳐짐, 과다 색소 침착 및 미용상 외관 손상의 다른 바람직하지 않은 요소의 역전을 효율적으로 감소 또는 제거하는 피부 긴장도 및 탄성의 회복에 의해 증명된 바와 같이, 노화 또는 햇빛 손상에 의해 야기된 탄성 조직 및 콜라겐 섬유 손상을 감소시키고 역전시키는 것으로 발명자에 의해 관찰된 물질을 나타낸다.
본원의 식사 보충물에 포함된 탄수화물은 관목, 교목(trees), 초목, 효모, 균류, 곰팡이, 고무, 수지, 전분 및 셀룰로즈 유도체 및 천연 뮤신 원천과 같은 다양한 천연 및 합성 원천으로부터 이용가능하다. 특히, 몇몇 천연 원천에는 (a) 아카시아, 카라야, 트라가칸트 또는 가티를 함유하는 관목 또는 초목 삼출물; (b) 한천, 알긴 또는 카라기난을 포함하는 마린 검(marine gum); (c) 구아, 로커스트 빈 또는 실리움을 포함하는 씨드 검; (d) 펙틴 또는 아세틸화 폴리만노즈를 함유하는 식물 추출물; (e) 헤타스타치(hetastarch), 카복시메틸셀룰로즈, 에틸셀룰로즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 산화된 셀룰로즈와 같은 전분 및 셀룰로즈 유도체; 덱스트란, 크산탄을 함유하는 미생물 고무가 포함된다. 그러나, 본원의 조성물은 각각의 탄수화물이 수득되는 원천을 제한하도록 의도되지는 않는다고 이해되어야 한다.
본원의 당류는 단당류, 올리고당 및/또는 다당류로 천연으로 발견될 수 있다. 따라서, 본원의 조성물은 당류를 이의 단량체, 올리고머 및/또는 중합체 형태로 함유할 수 있다. 당류 및 이의 용도를 위한 공지된 천연 원천의 목록을 위해, 본원에 관련 부분이 참조로서 인용된 미국 특허 제US2003072770호를 참조한다.
본원의 용어 "탄수화물"은 "당류", "다당류", "올리고당" 및 "당"과 호환되어 사용되고, 이의 정의는 탄수화물 화학의 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본원의 조성물이 2 이상의 필수 당류를 포함하도록 의도되지만, 당류가 단당류, 올리고당 및/또는 다당류의 형태일 수 있다고 이해되어야 하고, 예를 들어, 검 트라가칸트 및 구아 검을 함유하는 조성물이 갈락투론산, 시알산, 만노즈 및 갈락토즈를 함유하는 것으로 간주될 것이다. 따라서, 주어진 식사 보충물 내의 특정 고무의 양을 조절함으로써, 식사 보충물 내의 각각의 당류의 양을 조절할 수 있다.
본원의 용어 "2 이상의 비타민 E의 형태의 혼합물"은 알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타, 에타, 크사이 1, 크사이 2 및 시그마 토코페롤, 및 알파, 베타, 델타 및 감마 토코페리놀, 이의 배합물 또는 유도체로부터 선택된 2 이상의 형태의 토코페롤 혼합물을 설명하는데 사용된다. 한 양태에서, "2 이상의 비타민 E의 형태의 혼합물"은 알파, 베타, 델타 및 감마 토코페롤로부터 선택된 토코페롤이다. 다른 양태에서, "2 이상의 비타민 E의 형태의 혼합물"은 알파, 베타, 델타 및 감마 토코페롤의 혼합물이다. "2 이상의 비타민 E의 형태의 혼합물"은 예를 들어, VITAECAPS, SA, Spain(Henkel Corporation)로부터; 또는 Cognis Corporation (Kankakee, IL)로부터 수득할 수 있다. COVITOL®F-350M은 Cognis로부터 시판되고 천연 원천 알파 토코페롤과 식용 식물성 오일로부터 수득되는 혼합된 토코페롤을 함유한다. 본 발명의 항산화제 조성물에 포함된 토코페롤의 특정 혼합물은 ORAC(o) 항산화제 측정을 가동시킴으로써 측정한다.
토코페롤의 염 또는 유도체에는 아세테이트, 술페이트, 숙시네이트, 니코티네이트, 알로파네이트, 포스페이트, 퀴논 또는 할로겐화 유도체와 같은 약제학적으로 허용되는 염; 에스테르; 입체이성질체 등이 포함된다. 본 발명은 유도체가 비타민 E의 항산화제 활성을 유지한다는 가정 하에, 6-크로마놀 환 및/또는 측쇄 내에 치환, 첨가 및 다른 변경이 만들어진 비타민 E 유도체의 용도를 포함한다. 예를 들어, 토코페롤 및 이의 유도체는 환 및 측쇄의 알킬 그룹, 이중 결합 및 다른 치환체의 개수 및 위치에 따라 다양하다. "알킬"은 메틸, 부틸 및 옥틸과 같이 탄소와 수소만을 함유하는 사이클릭, 측쇄 또는 직쇄 화학 그룹이다. 알킬 그룹은 비치환되거나 하나 이상의 치환체, 예를 들어 할로겐, 알콕시, 아실옥시, 아미노, 하이드록실, 머캅토, 카복시 또는 벤질로 치환될 수 있다. 알킬 그룹은 포화 또는 하나 또는 몇몇 위치에 불포화될 수 있다. 전형적으로 알킬 그룹은 1 내지 8개의 탄소 원자, 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 추가의 토코페롤이 산소, 질소, 황 및/또는 인을 함유하는 것과 같은 다양한 다른 잔기의 환 구조 또는 측쇄에 접합하여 구성될 수 있다. 토코페롤 유도체는 또한 알파-, 베타-, 델타- 및 감마- 토코페롤과 같은 전형적인 토코페롤에서 발견되는 것으로부터 측쇄의 길이를 개질시켜 제조할 수 있다. 토코페롤은 또한 환 구조 및 측쇄에서 입체 화학 및 결합의 포화에 있어서 다양할 수 있다.
프로드러그를 포함한 추가의 토코페롤 유도체는 당 또는 다른 잔기를 측쇄 또는 환 구조에 접합시켜 제조할 수 있다. 혼합된 토코페롤은 비제한적으로 단일 토코페롤의 입체이성질체의 혼합물(예를 들어, 알파 토코페롤의 + 및 - 입체이성질체; (+/-)는 라세믹 혼합물을 나타낸다) 또는 구조적으로 구별되는 토코페롤의 혼합물(예를 들어, 알파- 플러스 감마-토코페롤)을 포함한다.
본 발명이 상술한 11가지의 필수 당류를 포함하지만, 다른 당류, 영양상 화합물 또는 생물학적 활성 또는 비활성 화합물이 본원의 식사 보충물에 포함될 수 있다. 이러한 다른 영양상 화합물에는 하나 이상의 임의의 식물성 영양분, 디오스코레아 복합체, 식물(plant) 추출물, 허브(herbal) 추출물, 식물 일부, 허브 성분, 비타민 또는 무기물이 포함된다. 이러한 영양상 화합물은 본원의 식사 보충물에 첨 가될 수 있고, 또는 이는 식사 보충물이 투여되는 포유류에 분리되어 제공될 수 있다. 예를 들어, 본원의 글리코영양분 함유 투약 형태를 수용하는 사람은 또한 동일하거나 분리된 투약 형태로 식물성 영양분을 수용할 수 있다. 비활성 화합물에는 향미료, 충전제, 윤활제, 완충제, 겔, 결합제, 부형제, 담체 및/또는 본원의 식사 보충물의 제형화 또는 투여를 용이하게 하는 다른 이러한 화합물이 포함될 수 있다. 본원의 식사 보충물 조성물을 함유하는 모든 글리코영양분, 심지어 추가의 화합물, 약제 또는 다른 물질을 함유하는 것을 Mannatech, Inc. (Coppell, Tex.)로부터 직접 수득할 수 있다.
본 발명은 소수성 및/또는 친수성 항산화제 모두를 포함하는 조성물의 산소 라디칼 흡수 용량(ORAC)을 직접적으로 동시에 측정하는 기구 및 방법을 포함한다. 용어 "ORAC(o)"는 분석이 샘플 내의 산소 함량(ORAC(o))을 직접 측정하는 산소 라디칼 흡수 용량 분석에서 산소의 소멸을 직접 추적함으로써 라디칼을 제거하는 항산화제의 능력을 측정하기 때문에 사용된다. ORAC(fl) 및 ORAC(β-PE)와 같은 최근의 산업 표준 분석이 산소 라디칼에 노출된 형광 물질(플루오레세인 또는 β-피코에리트린)의 형광 방출의 감소를 간접적으로 측정함으로써 항산화제 용량을 측정한다. 이러한 분석은 친수성 항산화제에는 잘 작용하지만, 소수성 항산화제 또는 소수성 및 친수성 항산화제 혼합물을 측정하는데에는 제한된 효율성을 갖는다. 더욱이, ORAC(fl) 및 ORAC(β-PE) 시스템과는 달리, 본원의 ORAC(o)는 처분가능한 센서로서 단순화하고 제조하기에 적합하다. 상기 시스템은 심지어 사무실의 제조 및 심지어 생물학적 샘플로부터 사용자의 즉각적인 산화 용량의 평가를 위한 가정용 시 스템의 제조를 허용할 정도로 충분히 견고하다.
ORAC(o) 기구. 도 1은 ORAC(o) 직접 항산화제 기구(10)의 설명이다. 기구(10)는 설명된 바와 같이 측정기 시스템(12), 유체 시스템(14) 및 데이터 프로세서 시스템(16)의 3개의 기본 성분을 갖고, 이는 상호 연결되어 데이터 캡쳐, 유체 및 샘플 대조군 및 데이터 프로세싱을 제공할 수 있다. 측정기 시스템(12)은 산소 센서(18)를 갖고 이는 하나 이상의 도관(conduit)(20)을 통해 유체 시스템(14)과 유체 전달을 한다. 하나 이상의 도관(20)을 통한 유체 흐름을 하나 이상의 밸브(22)를 사용하여 조절하고, 이는 수동으로 조절되고/조절되거나 데이터 프로세서 시스템(16)의 조절 하에 있다. 작동시, 샘플(24)이 유체 시스템을 통과하여 측정기 (18)로 들어가고, 이후 데이터 캡쳐가 폐기물 저장소(26)로 전달된다. 유체 시스템 (14)은 또한 진공, 또는 예를 들어 가압된 비활성 기체에 의한 압력에 의해 유체 시스템(14)을 통해 통로로 향하는 하나 이상의 용액(28)을 포함할 수 있다. 유체 시스템(14) 내의 용액(28)은 일반적으로 미리 혼합되거나 평형에 이를 것이고, 본 발명에 사용되기 위해 일반적으로 물, 용매, 세정제 또는 물:세정제 혼합물, 산소 라디칼 생성자, 산화 표적 등을 포함할 수 있고, 산소 탐지실(34)로 운반되기 전에 혼합실(30)에서 혼합될 수 있다. 유체 시스템의 선택은 기술 분야의 당업자에게 공지된 바와 같이 요구되거나 선택된 자동화의 정도에 의존할 것이다. 샘플(24)은 산소 센서(18)를 보정하는데 사용되는 동일한 용액과 미리 혼합될 수 있고, 또는 심지어 혼합실(30)에서 미리 혼합될 수 있다.
본 발명에 사용되는 산소 측정기(18)의 예에는 용매, 물 및 세정제의 존재하 에서 용존 산소를 탐지할 수 있는 임의의 용존 산소 센서가 포함될 것이다. 용존 산소 센서의 예에는 예를 들어, 전기 화학, 화학 발광, 표면 플라스몬 공명, 적외선, 콘덴서 결합, 염료 결합 섬유 광학 또는 심지어 초미세 분광 산소 센서가 포함된다. 한 특정 실시예에서, 용존 산소 센서는 YSI 5300A 생물학적 산소 센서(YSI, USA), SPREETA 센서(Texas Instruments), PASCO PS2108 (Pasco, USA) 등이다. 한 실시예에서, 용존 산소 센서는 [범주: 0-20 mg/L; 정확도: 전체 규모의 ±10 %; 해상도: 0.01 mg/L; 최대 샘플 속도: 20 sps; 디폴트 샘플 속도: 2 sps; 반응: 60초 동안 98 %; 온도 범주: 0-50 ℃; 온도 보정: 10-40 ℃; 양극: 백금; 음극: Ag/AgCl; 막: 1 ml 실리콘]과 같은 사양을 갖고, 제조자에 의해 제공된 소프트웨어, 예를 들어, Dissolved Oxygen EZ (Pasco, USA)와 접합하여 사용될 수 있다. 상기 시스템은 또한 유체 시스템과 유체 전달을 하는 pH, ORP, 전도성 또는 탁도 센서를 포함할 수 있다.
작동시, 본원에 기재된 ORAC(o) 시스템은, 사용자가 샘플을 모으고 이를 ORAC(o) 용매 키트(건조 또는 액체) 내부에 또는 키트로 용해시켜서 사용할 수 있다. ORAC(o) 센서, 예를 들어, 소형 표면 플라스몬 공명 산소 센서(참조: 예를 들어, Texas Instruments SPREETA 센서)를 하나 이상의 보정 표준에 노출시키고 이어서 사용자 샘플에 노출시킨다. 산소 센서를 센서상의 측정기 표면으로부터의 결과를 측정하는 프로세서에 연결시키고 사용자가 판독하도록 한다. 판독은 스크린에 표시되고, 인쇄되고/되거나 프로세서, 메모리 등에 전달된다. 사용자 샘플은 소변, 침, 눈물, 점액 분비물, 땀, 혈액(또는 혈액 생성물), 조직, 배설물, 또는 산소 라 디칼을 갖는 것으로 추정되는 다른 생물학적 샘플일 수 있다. 한 실시예에서, 샘플은 마스크(respirator), 예를 들어, 폐쇄 마스크에 모아지는 하나 이상의 호흡(하나 이상의 흡입 및/또는 발산(exhalation))이다. 센서에 의해 측정되는 값은 심지어 사용자의 산화 상태를 평가하기 위한 이후의 참조, 또는 과거 또는 장래의 값과의 비교를 위해 메모리(일시적, 반영구적 또는 영구적)에 저장될 수 있다.
본 발명의 항산화제 활성에 대한 ORAC(o) 분석의 기본 요소는 현존하는 ORAC 유사 방법의 이점을 취하고, 따라서 필요하더라도 대규모의 연습은 필요없이 실험실에서 쉽게 개질하여 사용할 수 있다. 간략하게는, ORAC(o)는 산소 센서, 예를 들어 혈액 혈장 산소 센서 또는 용해가능한 산소 센서를 사용하여 예를 들어, 샘플 용액 내의 하나 이상의 산소 라디칼 생성 분자 및 표준으로서의 산화성 제거제(항산화제)의 상대적 활성을 직접 측정함으로써 산화 촉진 활성을 측정한다. 특정 약제, 예를 들어 환원 또는 휘발성 약제가 라디칼 원천, 예를 들어 AAPH의 부재하에서 용액 내 산소의 흡수 또는 생성을 일으켜 용액 내 산소량에 영향을 줄 수 있다는 것을 주의해야 한다. 본 발명을 사용하여 숙련된 기술자는 예를 들어, 자유 라디칼 개시제의 첨가 전 샘플의 작용을 평가함으로써 샘플의 라디칼 제거과 비라디칼 제거 활성을 구별할 수 있다. 샘플의 라디칼 제거과 비라디칼 제거 활성 모두를 본 발명을 사용하여 측정한 바와 같이 산화 상태에 대해 시험하였다는 점을 주의해야 한다. 산소 라디칼 생성자 및 산소 라디칼 제거제의 상대적 활성을 ORAC(fl), ORAC(fl-lipo), ORAC(β-PE) 등과 같은 간접 방법을 사용한 것과 같이 시간에 따라 적정 및/또는 측정할 수 있다.
도 2는 본 발명의 기본적 단계를 요약한 흐름도 50이다. 단계 52에서, 용해가능한 산소 탐침은 용매:물:세정제 혼합물의 존재 하에서 평형 및/또는 보정되고 기준값을 측정한다. 한 실시예에서 용매:물:세정제는 1:1:1 비율의 아세톤:물: Tween 20 혼합물이다. 단계 54에서, 항산화제 활성의 기준값 측정은 예를 들어, Trolox®를 항산화제로 사용한 항산화제 활성의 비교를 위한 양성 대조군 및 기준값으로 작용한다. Trolox® 및 관련 분자의 하나의 장점은 이러한 비타민 E 유도체가 구획에서 구획으로 더욱 안정하고, 구획에 따른 변화가 적고 합성가능하여 항산화제 활성의 확실한 농도를 제공한다는 것이다. 단계 54의 혼합물이 단계 56에서, 단계 58의 산소 라디칼 생성자의 첨가 전에 산소 라디칼 표적, 예를 들어 리놀산과 혼합된다. 상기 분석이 작동되도록 하고, 단계 60에서, 곡선 아래 면적(AUC)를 시간에 따른 용존 산소의 소멸을 측정함으로써 계산하고, 샘플에 대한 값을 저장한다. 연속적으로 또는 동시에, 샘플을 용매:물:세정제 혼합물(단계 66)에 용해시키고 단계 68에서 산소 라디칼 표적을 첨가한다. 일반적으로, 단계 56 및 68에서 동일한 유형의 산소 라디칼, 단계 58 및 70에서 동일한 유형의 산소 라디칼을 사용하는 것이 통상적이다. 단계 72에서, 샘플의 AUC를 측정하고, 샘플에 대한 값을 저장하였다. 표준 및 샘플 AUC가 측정되었기 때문에, 바탕값에 대한 AUC를 빼서 상기 값을 표준화한다. 이어서 표준화된 표준 및 샘플 AUC값을 사용하여 샘플 내의 항산화제 활성 수준을 비교하고 계산하였다.
다음의 논의는 본 발명을 설명하는 것을 돕지만, 이의 범주를 제한하는데 사 용되어서는 안된다. 세정제 Tween 20은 리놀산의 분산을 도울 수 있다. 리놀산은 산소가 사이에 흡수될 수 있는 이중 결합을 제공한다. Trolox®는 내부 표준으로 사용되는 합성 항산화제이다. 모든 샘플로부터 수득한 값을 Trolox®의 값으로 다시 연관시킨다. 산소 라디칼 생성 분자: 2,2' 아조비스 (2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(AAPH)는 산소와 반응하여 탄소 중심 라디칼을 생성한다. AAPH에 의해 생성된 라디칼은 리놀산의 산화를 일으킨다. 리놀산의 산화의 결과로, 리놀산의 이중 결합이 탄소 중심 라디칼에서 산소 분자와 결합하는 케톤이 된다. 산소 탐침은 산소가 리놀산의 산화에 의해 반응실로부터 제거되는 속도를 측정한다. 아조 라디칼은 리놀산과 직접 반응하여 리놀산 라디칼을 생성시킬 수 있다. 리놀산 라디칼은 이후 반응실에 존재하는 산소와 반응하여 케톤을 형성한다. 제안된 메카니즘 중 어느 하나에 따라, 산소가 리놀산의 산화에 의해 소모된다. 항산화제는 리놀산의 산화를 막음으로써 반응에서 산소의 소모를 늦춘다. 시간에 따른 용존 산소 곡선의 곡선 아래 면적을 계산하여 리놀산의 산화를 늦추는 능력에 의해 증명되는 바와 같은 샘플의 항산화제 용량을 측정한다.
산소 라디칼 생성자. 아조 라디칼 생성자가 공지된 농도로 본 발명의 ORAC(o) 분석에 공지된 농도로 존재하여 항산화제 활성의 측정을 위해 라디칼을 생성한다. 아조 개시제에는 예를 들어 2,2'-아조비스[2-(5-메틸-2-이미다졸린-2-yl)프로판]디하이드로클로라이드, 2,2'아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(AAPH), 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)[2-(N-스테아릴)아미디노프로판]디하이드로클로라이드(SA-1), 2,2'-아조(2-(2-이미디아졸린-2-일)-프로판)-[2-[2-(4-n-옥 틸)이미다졸린-2-일]-프로판]디하이드로클로라이드(C-8), 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸밸러로니트릴)(MeO-AMVN), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸밸러로니트릴)(AMVN), 아조-비스-이소부틸니트릴, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트)(DAMP) 및 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판)이 포함된다.
예를 들어, 라디칼 생성자 2,2' 아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(AAPH)는 질소 분자 및 2개의 탄소 라디칼로 분해된다. 탄소 라디칼이 결합하여 안정한 생성물을 생성하거나 산소 분자와 반응하여 퍼옥실 라디칼을 생성시킨다. AAPH의 반감기는 약 175 시간이다(37 ℃, 중성 pH 37 ℃). 따라서, 자유 라디칼 생성 속도는 용액 내에서 최초 몇 시간 동안 필수적으로 일정하다. AAPH는 종종 지방산의 수성 분산액에서 지질 과산화에 사용되고, 이 때 이는 단독으로 또는 친유성 및/또는 소유성 라디칼 생성자와의 배합물로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 용매 시스템은 샘플 내의 총 산소를 측정하는 기구로서 친유성 및/또는 소유성 라디칼 생성자 중 어느 하나 또는 모두의 사용이 가능하도록 한다
용매 시스템. ORAC(o)에 대한 용매 시스템은 용매, 수성상 및 세정제를 포함하는 3 부분 시스템이다. 예를 들어, 용매는 알코올, 아민, 에스테르, 글리콜 에테르, 글리콜, 테르펜 및/또는 이의 혼합물로부터 선택된 유기 용매일 수 있다. 용매 시스템은 용매 성분의 약 50 % 이하, 약 30 내지 33 %, 20 % 이하 및 몇몇 경우 10 % 이하로 제형화된다.
한 양태에서, 용매는 아세톤이고, 이는 ORAC(o) 용매 시스템의 약 10 내지 90 % vol/vol이고, ORAC(o) 용매 시스템의 약 10 내지 90 % vol/vol는 수성 부분이 고, 용매 시스템의 0.001 내지 90 %는 세정제일 수 있다. 예를 들어, ORAC(o) 용매 시스템은 3분의 1이 물, 3분의 1이 세정제("3분의 1" 용매)이고, 샘플의 농도는 예를 들어, 1 mg/mL일 수 있다. 이어서 동일한 용매를 사용하여 희석한다. 세정제는 TWEEN®(즉, TWEEN®20), BRIJ® 또는 TRITON®과 같은 비이온성 세정제; CHAPS® 와 같은 양쪽성 세정제; 양이온성 세정제; 콜레이트, 디옥시콜레이트, 나트륨 도데실술페이트 또는 TWEEN®-80과 같은 음이온성 세정제; 또는 계면활성제일 수 있다. 물 대 아세톤 대 세정제의 비율은 각각 약 5 % 내지 90 % 내지 90 % 내지 5 %일 수 있다. 2분의 1의 아세톤 및 2분의 1의 물을 사용하는 2 성분 시스템을 사용하는 ORAC(fl)와는 달리, ORAC(o) 용매 시스템의 세정제는 총 샘플로부터 산소를 직접적으로 측정하도록 한다. 한 변형은 무작위로 메틸화된 β-사이클로덱스트린을 사용하는 ORAC(fl-lipo)이다.
ORAC(o) 분석의 용도: ORAC(o) 분석은 본 발명의 영양 보충물의 성분을 측정하고 심지어 본 발명의 경쟁자 및/또는 최종 식사 보충물을 시험하고 측정하기 위해, 생물학적 샘플의 총 항산화제 활성을 측정하는데 사용할 수 있다. 생물학적 샘플의 측정에서 사용하기 위해, 이는 예를 들어, 혈청, 지용성 혈청 분류(fraction), 수용성 혈청 분류, 소변, 지용성 소변 분류, 수용성 소변 분류, LDL 분류, 조직 균질 현탁액(homogenates), 항산화제 보충물, 음식 제품 또는 방부제의 품질 조절, 신규의 항산화제 보충물의 개발, 신규의 음식 제품, 신규의 방부제 또는 신규의 항산화제 치료의 개발, 음식 제조 및 가공의 품질 조절, 식물의 항산화 제 활성의 평가 또는 화장품의 항산화제 활성을 모니터하는 것일 수 있다.
실시예 1: ORAC(fl) 및 ORAC(o) 분석을 사용한 항산화제 활성의 비교.
형광을 측정하는 종래 기술인 산소 라디칼 흡수 용량 방법(ORAC(fl))을 사용하고, 용존 산소를 측정하는 본 발명의 방법(ORAC(o))을 사용하여 항산화제 조성물의 성분의 항산화제 활성을 분석하였다. 생성물의 항산화제 활성은 퍼옥실 라디칼에 의해 야기된 손상으로부터 시스템을 보호하는 능력이다.
비교를 위한 종래 기술인 항산화제 활성 측정 방법. ORAC(fl) 분석을 위해서, Ou 등의 방법[참조: Ou , B., Hampsch-Woodill, M. and Prior, R.L., J. Agric. Food Chem . 2001, 49, 4619-4626]을 따랐다. 기재된 Ou 공정과의 차이점에는 오비탈 쉐이커의 속도(Ou, 400 rpm; 본원, 280 rpm), 및 원심 분리 속도(Ou, 14,000 rpm, 15 분 본원, 3200 rpm, 15 분) 및 분석의 길이 (Ou, 30 분; 본원, 100 분)가 포함된다. 플루오레세인, 나트륨 염을 Aldrich (Milwaukee, WI)로부터 수득하였다. Ou 방법에서, 시험하는 항산화제 생성물에 플루오레세인의 표준량을 첨가하고, 초기 형광 수준을 측정하였다. 자유 라디칼 개시제를 첨가하고, 형광 소멸의 시간 및 정도를 측정하였다. Trolox®인, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산은 강력한 항산화제 특성을 갖는 비타민 E의 세포 투과성, 수용성 유도체이다. Trolox®는 래트 흉선 세포에서의 퍼옥시니트라이트 매개 산화성 스트레스 및 세포 자멸을 예방하고 이는 구획간에서 일정한 합성 항산화제이고, 표준으로 사용되어 각각의 샘플과 비교하기 위해 사용한다. 각각의 샘플에 대한 ORAC(o) 값의 계산에 사용되는 바탕값(대조군)은 각각이 실행에 포함될 수 있다. 형광 대 시간으 로 플롯시켰다. 바탕값(대조군)을 모든 곡선으로부터 뺀다. 항산화제의 곡선 아래 순면적을 Trolox®의 곡선 아래 순면적과 비교한다. 곡선 아래 순면적이 클수록, 샘플 내 분자의 항산화제 용량이 크다. 모든 ORAC(fl) 분석을 COBAS FARA II 원심분리 분석기(Roche Diagnostic System Inc., Branchburg, NJ; 여기(excitation) 파장 = 493 nm 및 방출 필터 = 515 nm)에서 수행하였다. 결과는 샘플 1 g 당 Trolox®등가물(μmol)로 주어진다.
항산화제 활성의 측정 방법. 작동시, 본 발명의 ORAC(o) 분석을 사용하여 표적 분자(리놀산)에 대한 용액의 항산화제 조성물, 배합물 등을 대기와 평형인 산소의 존재 하에서 평가하였다. 자유 라디칼 개시제를 첨가하고 산소가 소멸되는데 걸린 시간을 측정하여 소멸 속도를 수득하였다. Trolox®를 표준으로 사용하고, 바탕값은 대조군으로 작용하였다. 용존 산소 대 시간을 곡선 아래 순면적의 직접 비교에 따라 플롯시켰다. 상세한 방법은 다음과 같다: 완충액(K2HPO4 (F.W. 174.2), NaH2PO4 (FW 120.0))을 Sigma(St. Louis, MO)로부터 수득하였다. 리놀산 99 %, Trolox®(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산) 97 %, TWEEN®20, 및 2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)디하이드로클로라이드 97 %(AAPH)를 Aldrich(Milwaukee, WI)로부터 수득하였다. HPLC 등급 아세톤을 Fisher(Hampton, NH)로부터 수득하였다. YSI 5300A 생물학적 산소 미터를 YSI(Yellow Springs, Ohio)로부터 수득하고 제조자의 설명에 따라 사용하였다.
ORAC(o) 방법. 다음의 저장 용액을 사용하였다. 인산염 완충액(75 mM, pH 7.4)의 제조; 750 mM K2HPO4(F.W. 174.2); 65.33 g을 무게를 달아 500 mL의 부피 플라스크에 넣고, dH20를 표시점까지 첨가한다. 농도는 750 mM이다. 눈금 온도계가 장착된 냉장고(2 내지 8 ℃) 내에 750 mM K2HPO4 저장 용액을 저장한다. 표적 온도는 4 ℃이다. 750mM NaH2PO4(FW 120.0); 45.00 g을 무게를 달아 500 mL의 부피 플라스크에 넣고, dH20를 표시점까지 첨가한다. 농도는 750 mM이다. 눈금 온도계가 장착된 냉장고(2 내지 8 ℃) 내에 750 mM NaH2PO4 저장 용액을 저장한다. 표적 온도는 4 ℃이다. 40 ml의 750 mM K2HPO4 저장 용액 및 l0 ml의 750mM NaH2PO4 저장 용액을 혼합한다(4 대 1 비율). 이는 50 mL의 ORAC 저장 용액 완충액을 생성한다. 저장 용액을 눈금 온도계가 장착된 냉장고(2 내지 8 ℃) 내에 저장한다. 표적 온도는 4 ℃이다. 혼합물을 dH20(1:9)로 희석시켜 ORAC 완충액의 작용 용액을 제조하고, pH를 측정한다. 이는 7.4이어야 한다. 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 밀폐시켜 보관한다.
Tween 제조. 10 g의 Tween 20의 무게를 달고, 90 g의 탈이온화된 물을 첨가한다. 밀폐시키고 혼합물을 밤새 교반한다. Tween 저장 용액을 일주일 동안 보관한다. 카운터탑(countertop)에 보관한다.
용매 제조. 25 mL의 아세톤, 25 mL의 탈이온화된 물 및 25 mL의 Tween 20을 혼합한다. 상기 용액을 샘플을 제조하는데 사용한다. 실행하기 전 탐침의 손상을 특히 막에 주의하여 검사하고 필요한 경우 대체한다. 탐침을 탈이온화된 물에서 팁과 함께 저장해야 한다. 당해 분석에 하나의 탐침 및 하나의 반응실만을 사용해야 한다. 바탕값 및 Trolox®(10 ㎍/ml 또는 0.03995 μmol/ml에서)에 대해 8시간 마다 수행한다. 10 ㎍/ml의 샘플 농도에서 수행한다. 샘플 농도 및 Trolox® 농도가 동일해야 한다.
희석액을 1 mg 의 샘플의 무게를 달고, 1 ml의 용매를 첨가하여 제조하고 초기 이온 추출을 수행하도록 한다. 1시간 동안 진탕시키고, 0.5 ml의 초기 추출물 용액을 유리 섬광 바이알에 넣고, 4.5 ml의 용매를 첨가하여, 첫번째 희석을 한다. 첫번째 희석액을 30초 동안 와동시킨다. 이의 농도는 0.1 mg/ml 또는 100 ppm이다. 0.5 ml의 첫번째 희석액을 취해서, 이를 다른 유리 섬광 바이알에 넣은 후, 4.5 ml의 용매를 첨가하고, 30초 동안 와동시켜 0.01 mg/ml 또는 10 ppm의 농도를 수득한다. 0.5 ml의 바이알 샘플을 취하여 이를 다른 유리 섬광 바이알에 넣은 후, 4.5 ml의 용매를 첨가하고, 30초 동안 와동시켜 0.01 mg/ml 또는 10 ppm의 농도를 수득한다. 바이알을 4 ℃ 냉장고에 둔다. 37 ℃ 수조에서 리놀산이 녹도록 하고, 0.18 mL Tween 저장 용액, 0.18 mL 완충액 및 0.44 mL 탈이온화된 물을 70.8 mg 리놀산에 첨가하여 리놀산 용액을 제조한다(최소의 빛이 존재). 용액 튜브를 호일로 싸서 보관한다. 리놀산 용액을 매 8시간 마다 새로 만든다. 산소 라디칼 생성자를 제조하기 위하여, 67.8 mg의 AAPH의 무게를 달고, 0.9 mL 완충액에 용해시킨다. AAPH를 냉장 보관하고, 이를 8시간까지 사용할 수 있다. 1시간 동안 진탕시킨다. Trolox® 용액을 항상 냉장 보관해야 한다. 항산화제 활성의 측정을 시작하기 위해, 1.86 mL의 완충액을 각각의 반응 용기에 첨가하고, 2.36 mL의 물을 37 ℃에서 섬광 바이알에 첨가하고, 반응 매트릭스가 당해 온도에 도달하는 동안 3분 동안 교반한다. 0.284 mL의 샘플을 첨가하고, 탐침 팁을 반응 용액에 닿지 않게 용기에 넣고, 1분 동안 교반한다. 완전 차광 환경에서 측정이 가장 잘 이루어진다.
데이터 캡쳐에 따라, 챔버에서 탐침을 제거하고, 각각의 리놀산 용액 0.357 mL를 첨가하고, 탐침의 끝을 챔버에 즉시 놓는다. 0.357 ml의 AAPH 용액을 첨가하고, 탐침을 용액 튜브에 조심스럽지만 빠르게 넣어 반응 자리에 거품이 남지 않도록 하고, 용액이 탐침 케이스의 과다 유출 릿지(overflow ridge)에 있지 않도록 한다. 이후, 탐침을 용액에 넣고 기록을 읽는다. 데이터를 캡쳐하고 항산화제 활성을 계산한다.
샘플을 "3분의 1 용매"(또한 ORAC(o) 용매 시스템으로도 나타낸다) 내의 1 mg/mL의 농도로 제조한다. "3분의 1" 용매는 물, 아세톤, 및 물로 1:9로 희석된 TWEEN®20 용액이 동일한 부분이다. 샘플을 280 rpm에서 오비탈 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 진탕하였다. 샘플 용액은 "3분의 1" 용매로 추가의 희석(일반적으로 10 ㎍/mL로)한 후 분석할 준비가 되었다. "3분의 1" 용매는 또한 바탕값으로 사용되었다.
ORAC(o) 분석을 YSI 5300A 생물학적 산소 미터를 사용하여 수행하였다. 0.18 mL의 75 mM 인산염 완충액(pH 7.4), 0.18 mL의 10 중량 % TWEEN®20 저장 용액 및 0.44 mL의 탈이온화된 물을 70.8 mg 리놀산에 첨가하여 리놀산을 제조하였다. 0.9 mL의 완충액을 67.8 mg의 AAPH에 첨가하여 AAPH를 제조하였다. 최종 반응 부피에서(5.218 mL), 리놀산(21.59 mM)을 자유 라디칼 공격의 표적으로 사용하였고, AAPH(19.00 mM)를 퍼옥실 라디칼 생성자로 사용하였다. Trolox®(10 ㎍/mL)를 표준 으로 사용하였다. 기록을 0이 관찰될 때까지 매 초 취하였다.
ORAC(o) 값(산소 라디칼 흡수 용량 산소 특이 전극)을 계산하는 식은 다음과 같다:
Figure 112007071165708-PCT00002
또한, ORAC(o)는 액체 형태를 측정할 때 밀리리터로 계산될 수 있다. 이러한 계산은 샘플 1 g 당 Trolox®등가물(μmol)로 공지된 양을 산출한다. ORAC(o) 음수값은 조성물이 항산화제로 작용하기보다는 산화 촉진제, 즉 산화를 촉진시키는 약제라는 것을 나타내는 바탕값으로 수득한 것보다 라디칼 제거 활성이 적다는 것을 반영한다. ORAC(o) 분석은 산소가 샘플에 의해 흡수되거나 방출되지 않지만, 샘플의 산소 수준에서의 임의의 효과가 측정되고, 계산된 항산화제 값으로 보정될 수 있다는 것을 가정한다.
ORAC(o) 및 ORAC(fl) 분석 파라미터의 비교. ORAC(fl)와 비교한 ORAC(o)의 장점은 항산화제 잠재력의 직접 대 간접 측정에서 측정되었다. ORAC(fl)는 측정되는 유일한 형광 성분이 플루오레세인(표적 분자)이라는 가정에 의존하기 때문에 간접적 산소 라디칼 탐지 방법이다. 그러나, 많은 항산화제 화합물은 자연적으로 형광을 내고(예를 들어, 블루베리); 라디칼-라디칼 반응으로부터의 이러한 화합물의 배합물 또한 형광을 낸다. 따라서, 샘플로부터의 형광은 형광에 기초한 분석의 결과를 왜곡한다. 반면, ORAC(o) 방법은 산소 흡수의 직접적 측정, 즉 산소가 자유 라디칼로 소멸되는 것을 직접적으로 측정한다. 항산화제 용량 측정의 이러한 방법은 산소가 수용성 또는 지용성 성분에 결합되었는지 여부에 의존하지 않는다. 표 1에 ORAC(fl) 및 ORAC(o) 방법의 분석 파라미터를 비교하였다.
표 1: ORAC(fl) 및 ORAC(o)의 분석 파라미터의 비교.
분석 중 분석 파라미터 ORAC(fl) ORAC(o)
온도 37 ℃ 37 ℃
AAPH 농도 1.28 x 10-2 M, 인산염 완충액 내 19.00 mM, 인산염 완충액 내
표적 분자 농도 플루오레세인, 43.8 nM, 인산염 완충액 내 21.59 mM 리놀산, 10 % TWEEN®20, 완충액 및 물의 혼합물 내 (.18 mL, .18 mL, .44 mL)
샘플 농도 초기에 20 mL 내에 500 mg, 완충액으로 10 ㎍/mL로 희석된 상청액 초기에 1 mg/mL, 10 ㎍/mL로 희석
샘플 용매 아세톤/물, 50/50 v/v 인산염 완충액 내 희석액 물/아세톤/10 중량% TWEEN®20, v/v/v ("3분의 1" 용매) "3분의 1" 용매 내 희석액
분석용 완충액, 농도 75 mM 인산염, pH 7.4 75 mM 인산염, pH 7.4
최종 분석 부피 400 μl 5.218 mL
바탕값(대조군) 완충액 "3분의 1" 용매
표준 62.5 μM Trolox®, 완충액 내 10 ㎍/mL 의 Trolox®(38.755 μM), "3분의 1" 용매 내
샘플의 항산화제 용량 측정 방법 플루오레세인이 라디칼에 의해 산화될 때 형광을 감소시키고, 항산화제는 감소를 보호 및 지연시킨다. 산소가 라디칼 개시제 및 리놀산 탄소 라디칼에 의해 흡수되고; 항산화제는 산화 흡수를 보호 및 감소시킨다.
본 발명의 명백한 장점의 하나는 사용자가 본원의 기구 및 방법을 실험실 환경에 도입시킬 때 사용자가 신규의 기술을 배우거나 신규의 기구를 구매할 필요가 없다는 것이다. 예를 들어, 샘플 포화를 측정할 때, 본 발명은 예를 들어, Ou 등에 의해 개발된 잘 성립된 간접적 측정 시스템과 동일한 완충액, 조건, 추출 및/또는 분리 단계의 많은 부분을 사용한다. Ou 등은 20 mL 내의 500 mg 농도로 아세톤/물(50:50, v/v) 내에서 샘플을 제조하고, 이를 1시간 동안 400 rpm으로 로터리 쉐이커에서 회전시키고, 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리시키고, 75 mM 인산 칼륨 완충액으로 pH 7.4에서 희석시켰다[참조: Ou, et al., Development and Validation of Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay for Lipophilic Antioxidant Using Randomly Methylated-β-Cyclodextrin as the Solubility Enhancer, J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 1815-1821]. 본 발명자는 많은 시험 샘플이 Ou 조건(ORAC(fl) 조건) 하에서는 용액으로 들어가지 않고, 보다 용해성인 성분이 덜 용해성인 성분을 대체한다는 것을 밝혀냈다. 따라서, ORAC(fl) 조건 하에서 용해되는 샘플의 부분만 ORAC(fl) 샘플 및 측정에 포함되었다. 따라서, 분석을 위해ORAC(fl) 방법에 따라 제조된 상청액 용액은 실제 샘플의 총 항산화제 활성을 대표할 수 없을 것이다. ORAC(fl) 완충액 내의 샘플의 용액이 항상 샘플의 함량을 반영하지는 않으므로, 결과는 ORAC(fl)를 사용하여 왜곡될 수 있다.
샘플 용해의 문제를 인식하였고, 이 ORAC(fl)를 사용한 경우 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 혼합물에 수행된 항산화제 측정에 대한 혼합된 토코페롤의 기여가 결핍된 것을 관찰하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, ORAC(o) 시스템을 사용하여, 5 mg/mL의 케르세틴 및 5 mg/mL의 혼합된 토코페롤 배합물의 항산화제 효과를 10 mg/mL의 각각의 성분과 비교하여 밝혀내었다. 대조적으로, 간접 ORAC(fl) 시스템은 동일한 배합물로부터 케르세틴 단독에 대한 값 이상의 추가의 효과를 나타내지 않는다(도 11 참조). 샘플의 농도가 더욱 묽고 샘플에 대한 용매가 아세톤, 물 및 샘플의 모든 성분을 용해시키기 위한 세정제를 포함하기 때문에, 이러한 혼합된 토코페롤과의 배합물로부터의 활성의 결핍 및 포화 문제가 ORAC(o) 방법에는 존재하지 않는다. 샘플의 용매 내의 TWEEN®20의 존재는 혼합된 토코페롤로부터의 활성 측정 의 원인이 된다. Trolox®활성에 대한 대조군으로서, 도 7은 5 ㎍/mL의 케르세틴 및 5 ㎍/mL의 혼합된 토코페롤 배합물을 10 ㎍/mL의 각각의 분리된 성분과 비교하여 보여주고, 또한 Trolox®대조군을 포함하고 시간에 걸쳐 샘플에 잔류하는 산소 라디칼의 수준을 측정하는 ORAC(o)의 능력을 증명한다.
ORAC(o)는 보다 비싼 ORAC(fl)(자동화: 약 $250,000; 비자동화: 약 $50,000)와 비교하여 상당한 절약을 하도록 한다. 대조적으로, 본원에 기재된 ORAC(o) 기구는 쉽게 소형화 및/또는 자동화되어 병원 및 심지어 대형 형광계 측정 시스템에 대한 비용의 일부로 가정에서 사용되도록 개발될 수 있는 규격형(off-the-shelf) 산소 센서 시스템의 장점을 갖는다. 단일 실험실 검증에 대한 Association of Official Analytical Chemists(AOAC) 가이드라인에 의해 수행된 검증이 표 2, 3 및 4의 결과를 제공하였다.
표 2. 정확성을 위한 5일간의 실험(반복)
곡선 아래 면적 (AUC)
1일 202.655447939563
2일 212.901122995373
3일 187.01466464995
4일 202.856617129109
5일 (2번째 분석) 213.124092629655
5일간 평균 203.710389068730
표준 편차 10.649840914564
상대 표준 편차 5.23 %
HORRAT 1.981060606061
각각의 날에 대한 값은 10 ㎍/mL 농도의 케르세틴 샘플에 대한 3회 실행의 평균이다. HORRAT 값은 측정된 RSDR 값 및 당업자에게 공지된, Horwitz 식에 의해 예측되는 RSDR 값 사이의 비율로 이는 정확성과 관련하여 방법의 허용성을 나타내는 것으로 간주된다. 단일 실험실 수행 연구에서, 0.5 내지 2.0의 일련의 HORRAT 비율 이 방법의 허용되는 정확도를 나타낸다. 5일간의 실험에서의 HORRAT 값은 1.98이다. 선형 범주로서의 분석 범주의 측정이 표 3에 제공된다.
표 3. 분석 범주의 측정
샘플 (㎍/ml) 곡선 아래 면적
1 124.567114093960
10 209.388111888112
100 693.611111111111
500 2327.96518987343
1000 2870.09540636041
y = 2.8335x + 332.16; R2 = 0.9231, 1-1000 플롯에 대해
y = 4.3353x + 176.66; R2 = 0.9967, 0-500 플롯에 대해
선형 적분(Linear integrity)은 샘플 농도가 약 1000 ㎍/mL일 때 감소하는 것으로 보인다. 선형 범주로서의 분석 범주의 측정으로, 500 ㎍/mL까지의 다양한 농도의 곡선 아래 면적 값을 측정한다. 표 4는 일일 결과의 정확성의 결과를 제공한다.
표 4. 정확성을 위한 일일 실험(반복)
곡선 아래 면적
실행 1 207.369402985075
실행 2 198.18118466899
실행 3 205.035211267606
실행 4 201.586572438162
실행 5 202.110714285714
5회 실행의 평균 202.856617129109
표준 편차 3.505016471434
상대 표준 편차 1.73 %
HORRAT 0.654480870834
일일 정확성 실험은 10 ㎍/mL 농도 케르세틴 샘플의 5회의 분리된 수행을 포함한다. ORAC (o) 방법에 대한 표 4의 HORRAT 값은 0.65448이다. ORAC(o) 분석은 상기 실시예 2에 주어진 항산화제 조성물의 성분의 비율을 최적화하는데 사용하였 다. 조성물의 한 양태는 케르세틴, 49.18 %; 혼합된 토코페롤, 32.79 %; 포도 과피 추출물, 9.84 %; 녹차 추출물, 6.56 %; 및 관목 종려나무, 1.64 %의 중량비를 갖고, 1 g 당 17,254 μmol의 Trolox®등가물의 ORAC(o)를 사용하여 항산화제 값을 부여하였다. 동일한 조성물이 1 g 당 5,281 μmol의 Trolox®등가물의 ORAC(fl)를 사용하여 항산화제 값을 부여하였다. 이러한 데이터는 항산화제 활성을 측정하는 ORAC(o) 및 ORAC(fl) 방법이 간접 ORAC(fl) 방법의 한계에 기인하여 수득된 결과에서 상이하다는 것을 증명한다.
실시예 2: 상승적 항산화제 조성물.
본 발명의 식사 보충물에 따라, 5가지 성분을 항산화제 조성물로 결합하였고, 각각은 전 세계에서 장수인의 식단에 현저한 것이다. 본 발명자는 장수로 알려진 지역의 식사의 종합적인 연구에 기초하여 성분을 선택하였다. 본 발명자는 이러한 지역의 식사는 플라보놀 및 토코페롤이 풍부하다는 것을 인식하였다. 추가로 발명자는 특정 천연 화합물은 이의 항산화제 활성을 재활성화시키는 분자, 예를 들어, 비타민 C와 유리하게 상호 작용한다는 것을 인식하였다. 사실, 광범위한 연구는 예를 들어, α-토코페롤의 재생성에서의 비타민 C의 역할을 지지한다[참조: Pizzorno and Murray, Textbook of Natural Medicine, 1999, 2nd Ed. New York, Churchill Livingston].
이러한 연구에 기초하여, 발명자는 천연 및 다른 원천에서 분리되고 정제된, 다양한 지역의 장수인으로부터의 생물학적으로 이용가능한 화합물을 높은 퍼센티지로 포함하는 추출물을 혼합하였다. 본 발명의 한 실시예에서, 다음의 기초 성분을 선택하였다: 플라보놀, 혼합된 토코페롤, 포도 과피 추출물, 녹차 추출물 또는 관목 종려나무가 예를 들어, 문헌[참조: Leaf A., Launois J. "A Scientist Visits Some of the World's Oldest People, National Geographic. 1973 January]에 인용된 바와 같이 Ecuador 내 Vilcabamba의 Andean 빌리지, Kashmir 내 Karakoram Range의 Huza 랜드, 또는 이전의 USSR의 Georgian State 내 Abkhazia; Sardinia의 Italian 아일랜드[참조: Koenig R. "Sardinia's Mysterious Male Methuselahs", Science. 2001, March 16], 및 호주 사람들의 식사에 현저하다.
본 발명의 조성물은 상승적 항산화제 활성을 증명하였다. 이론에 얽매이지는 않으면, 항산화제 조성물의 다양한 성분은 세포내 시토졸, 세포막 및 세포외 유체 보호를 위한 활성을 가져 신체가 모두 보호된다. 관목 종려나무 성분은 예를 들어, 천연 비타민 C 함량이 높고, 이는 세포 내로 들어갈 수 있고, 친수성이고, 시토졸을 보호하는데 이용가능하고; 포도 과피 추출물 및 녹차 추출물은 친수성이고, 세포를 통과할 수 없고 세포외 유체를 보호하는데 이용가능하고; 혼합된 토코페롤은 친유성이고, 플라보놀(예를 들어, 케르세틴)과 함께, 친수성 및 친유성 둘 다 이고, 막을 보호한다. 더욱이, 식단에, 또는 심지어 식사 보충물 자체 내에 포함된 임의의 섬유가 제거를 위한 적절한 비이클을 제공할 수 있다.
상승적 항산화제 조성물의 성분. 본 발명의 ORAC(o) 기구 및 방법을 사용하여, 본 발명자는 친유성 및 소유성 항산화제 모두의 배합물 및 약제의 항산화제 활성을 강화시키는 것을 도와주는 다른 약제, 예를 들어, 비타민-C 등의 총 항산화제 활성을 측정할 수 있었다. ORAC(o) 시스템을 사용하여, 상승적 활성을 갖는 항산화 제 조성물을 개발하였고 플라보노이드, 예를 들어, 케르세틴, 비타민 E의 2 이상의 형태의 혼합물, 및 임의로, 포도 과피 추출물, 녹차 추출물 및 호주산 관목 종려나무를 포함하도록 하였다. 상승 작용은 특히 케르세틴 대 비타민 E 형태의 혼합물의 중량비 40/60 내지 90/10 %로 관찰된다. 조성물의 한 양태는 다음의 중량비를 포함한다: 케르세틴, 49.18 %; 혼합된 토코페롤, 32.79 %; 포도 과피 추출물, 9.84%; 녹차 추출물, 6.56 %; 및 관목 종려나무, 1.64 %.
도 6은 케르세틴, 혼합된 토코페롤, 및 토코페롤과 케르세틴의 혼합물 및 합성 항산화제 표준인 Trolox®(Hoffman-La Roche)를 비교하는 ORAC(o) 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
케르세틴과 같은 플라보노이드. 조성물의 플라보노이드는 플라본, 플라보놀, 이소플라본, 이소플라보놀, 이의 유사체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이의 혼합물일 수 있다. 플라보놀의 예에는 케르세틴, 캄페롤 및 미리세틴이 포함된다. 조성물에 포함된 특정 플라보노이드 또는 플라보노이드 유사체 또는 염은ORAC(o) 항산화제 측정을 실행하여 측정한다. 케르세틴 활성의 80 % 이내의 활성은 유사체를 제공하도록 의도된다. 플라보노이드에 대한 참조로, 특히 케르세틴이 또한 아글리콘, 또는 당이 예를 들어 아라비노즈, 람노즈, 갈락토즈 또는 글루코즈인 이의 글리코사이드를 나타내도록 의도된다. 케르세틴의 람노즈 글리코사이드는 루틴 또는 케르세틴으로 공지되어 있고, 미리세틴의 람노즈 글리코사이드는 미리시트린으로 공지되어 있다. 케르세틴의 유사체에는 3, 5, 7, 3' 및 4' 위치 중 하나 이상에서 -OH 그룹 이외의 치환 그룹을 포함하는 화합물이 포함된다. 다른 치환 그룹 에는 탄소수 5 이하의 알킬, 아세틸, 술필 또는 말로닐이 포함된다. 케르세틴의 유사체에 대해, 1 또는 2개의 위치만 -OH 그룹 이외의 임의의 그룹에 의해 치환된다.
케르세틴과 같은 플라보노이드는 시험관내에서 즉시 합성된다. 그러나, 플라보노이드(케르세틴을 포함)가 존재하고 예를 들어, 천연으로 존재하는 음식물, 특히 과일 및 야채, 예를 들어 사과, 배, 포도, 양파, 적포도주, 피망, 적색 커런트(red currants), 흑색 커런트, 레몬, 체리, 크랜베리, 구스베리, 토마토, 올리브, 무, 콜라비(kohlrabi), 양고추냉이(horseradish), 감자 및 아스파라거스로부터 분리되고 정제될 수 있다. 케르세틴은 Pharmline(Florida, NY)으로부터 수득할 수 있다.
관목 종려나무: 호주산 관목 종려나무(Terminalia ferdinandiana)는 약 5 % 비타민 C 및 크로마토그램(데이터는 나타내지 않음)에 의해 증명된 다양한 성분을 함유한다. 이러한 성분은 플라본 및 플라보노이드를 포함하는 것으로 여겨진다. HPLC 크로마토그램은 0.1 % 트리플루오로아세트산 및 100 % 메탄올의 계단식 기울기를 사용한 역상 C18 컬럼으로부터, 1 mL/min의 유속으로 메탄올 및 물 추출된 관목 종려나무 분말 샘플을 사용하여 수득한다. 상기 조건은 플라보노이드가 분리되고 비타민 C가 분리되도록 개발되었다. 245 nm에서 흡수를 측정하였다.
관목 종려나무의 과육 및 과피를 과일의 종자로부터 제거하고 물 중 현탁물로 제조하였다. 현탁물을 냉동 건조하고 분쇄하였다. 본원의 항산화제 조성물을 위해, 냉동 건조된 물질을 요구되는 양으로 무게를 달았다. 관목 종려나무는 0 중량% 내지 87.9 중량%, 또는 다른 양태에서, 약 2 중량%의 양으로 본 발명의 조성물에 존재한다.
포도 과피 추출물. 포도 과피 추출물을 포도 과피로부터 제조하고, 이는 30-82 % 폴리페놀을 함유하고, Polyphenolics, Madera, CA; Hunan Kinglong, Bio-Resource Co. Ltd, Changsha Economic Development Zone, China; 또는 Pharmline, Florida, NY으로부터 수득할 수 있다.
녹차 추출물. 녹차 추출물은 Camellia sinensis 잎으로부터의 추출물이고, 35-95 % 폴리페놀을 함유하고, Amax NutraSource Inc., Eugene, OR; Blue California, Rancho Santa Margarita, CA; 또는 PL Thomas & Co., Morristown, N.J로부터 수득할 수 있다.
다른 성분. 본 발명의 항산화제 조성물은 하나 이상의 비독성, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 락토즈, 전분, 수크로즈, 글루코즈, 메틸 셀룰로즈, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 술페이트, 만니톤, 소르비톨, 사이클로덱스트린, 사이클로덱스트린 유도체 등을 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 담체를 사용하여 캡슐 또는 정제를 쉽제 제형화할 수 있고 삼키거나 씹기 쉽게 제조할 수 있다. 정제는 담체, 결합제, 윤활제, 희석제, 붕해제, 착색제, 향료, 흐름 유도제(flow-inducing agents) 또는 용해제(melting agent)를 함유할 수 있다. 정제는 임의로 하나 이상의 추가적 성분과 함께, 압축 또는 주조(molding)에 의해 제조할 수 있다. 압축된 정제를 자유 흐름 형태(예를 들어, 분말, 미립)로 결합제(예를 들어, 젤라틴, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈), 윤활제, 비활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들어, 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교 결합된 카복시메틸 셀룰로 즈) 표면 활성 또는 분산제와 임의로 혼합하여 활성 성분을 압축하여 제조할 수 있다. 적합한 결합제에는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예를 들어 글루코즈 또는 베타-락토즈, 옥수수 감미료, 천연 및 합성 고무, 예를 들어 아카시아, 트라가칸트, 또는 알긴산 나트륨, 카복시메틸셀룰로즈, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납 등이 포함된다. 이러한 투약 형태에 사용되는 윤활제에는 올레산 나트륨, 스테아르산 나트륨, 스테아르산 마그네슘, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨 등이 포함된다. 붕해제에는 예를 들어, 전분, 메틸 셀룰로즈, 한천, 벤토나이트, 크산탄 검 등이 포함된다. 주조된 정제는 적합한 기계에서 비활성 액체 희석제로 습윤시킨 분말 활성 성분의 혼합물을 주조하여 제조할 수 있다.
캡슐 또는 정제는 임의로 피복 또는 기록(scored)될 수 있고 제형화되어 항산화제 조성물의 느린 또는 조절된 방출을 제공할 수 있다. 조절된 방출의 약제의 지효성 조성물은 일반적으로 선택된 시간 기간 동안 장 붕괴(degradation) 또는 분해(disintegration)에 내성을 갖는 물질과 혼합되거나 피복된 약제 입자를 함유한다. 약제의 방출은 빨아먹기(leeching), 부식, 파열, 확산 또는 유사한 작용에 의해 일어날 수 있다.
담체는 지효성을 제공할 뿐 아리나 항산화제 안정성을 촉진시킬 수 있다. AMBROTOSE®Phyto Formula로 명명된 식물성 탄수화물의 혼합물을 항산화제 조성물과 혼합할 수 있다. 이러한 배합물은 항산화제 조성물의 저장 수명을 연장하고 지효성 형태를 제공한다. AMBROTOSE®Phyto Formula는 약 30/30/20/19/1의 중량/중량 비율 로, 검 아라빅(아카시아), 크산탄 검, 검 트라가칸트, 검 가티(TicGum로부터 수득가능) 및 알로에 베라 겔 추출물(예를 들어, 내엽 겔, Carrington Labs, Irving, TX, MANAPOL®분말 또는 유사 생성물)을 함유한다. AMBROTOSE®Phyto Formula를 본 발명의 항산화제 조성물과 2:1 내지 1:2의 중량비로 혼합한다. 다른 양태에서, AMBROTOSE®Phyto Formula를 항산화제 조성물과 2:1의 중량비로 혼합한다.
캡슐 또는 정제는 특정 제형에 의존하여 약 0.1 중량% 내지 90 중량% 이하로 추가의 식물성 성분을 함유할 수 있다. 담체의 경우, 담체 자체는 일반적으로 조성물의 영양상 중요성에 영향을 주지 않지만, 이러한 담체는 본 발명의 영양상 유효량의 방출 시간, 장소, 및 프로파일에는 중요성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 항산화제는 하나 이상의 큰 환약(bolus)으로 방출되어 예를 들어 혈액 또는 소변에서 일련의 방출에서 측정된 항산화제 수준을 급격히 증가(spike)시킬 수 있다. 다른 양태에서, 항산화제가 어느 정도 고르게 방출될 수 있고, 또는 심지어 혈액 또는 소변 수준에서 급격한 상승(spike)이 있는 기울기를 제공할 수 있다. 사실, 본 발명은 심지어 소화 중 상이한 시간 및/또는 장소에서 소유성 및 친유성 항산화제의 방출을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 항산화제를 즉각적 방출을 위한 비등성 담체로 제공할 수 있고, 반면 상이한 항산화제를 예를 들어 위산에 의해 또는 장관에서 방출되도록 제공할 수 있다.
제형화 방법. 롤러 압축 항산화제 조성물을 제형화하는 방법은 AMBROTOSE ®Phyto Formula를 상술한 항산화제 조성물과 혼합시키는 것을 포함한다. 생성된 혼 합물을 롤러 압축기로 운반하고 롤러 사이에서 압축시켜 압축물을 형성한다. 혼합물에 가해진 압력은 성분들간의 물리적 접착을 향상시킨다. 압축물을 후속적으로 밀링하여 미립을 형성한다. 미립은 이후에 캡슐 또는 정제와 같은 목적하는 투약 형태로 형성시킨다. 한 실시예에서, Fitzpatrick Chilsonator Model 4LX10D 롤러 압축기를 면 사이에 회전과 수직으로 눈금이 새겨져 있고, 10 톤의 고정력을 갖고, 약 0.093의 Fitzmill 스크린을 갖는 롤러와 함께 사용할 수 있다. 롤러 압축 장치는 다양한 회전 속도, 힘 적용 및 틈 넓이 특성(capabilitiy), 예를 들어 Gerteis Polygran 건조 롤러 압축기 시스템(Gerteis, Germany)를 가질 수 있다. 롤러 압축기는 2개의 반대방향 회전하는 롤러 사이에 혼합물을 통과하게 하여 혼합물에 균일하게 압력을 적용함으로써 작용한다. 롤러에 의해 혼합물에 가해진 압력은 혼합물을 예를 들어 종이 또는 리본과 같은 압축물로 압축하고, 이는 전형적으로 밀링되어 미립을 생성한다. 또는, 미립화는 요구될 수 있는 바와 같이 슬러깅(slugging), 밀링 또는 체질에 의해 수행할 수 있다. #20-80 메쉬를 갖는 미립을 선택한다.
AMBROTOSE®Phyto Formula를 갖는 롤러 압축된 항산화제 조성물의 배합물의 보다 긴 저장 수명은 산소에 노출된 항산화제 조성물의 표면 면적의 감소에 기인하는 것으로 여겨진다. 롤러 압축된 배합물은 또한 캡슐 또는 정제 제조 과정에서 부형제 충전제의 필요성을 없앤다. 본원에 기재된 AMBROTOSE®Phyto Formula와 항산화제 조성물의 배합물의 추가적인 이점에는, 소화관(gut)에서 비공유 전자에 대한 싱크(sink)로 작용할 수 있는 불용성 섬유를 제공하고, 자유 라디칼에 의해 손상된 세포의 회복에서 세포 매개 전달의 원인이 되는 세포 글리코폼(glycoform)의 정확한 구조를 위한 단당류를 제공하는 것이 포함된다.
투약. 본 발명 조성물의 투약을 위한 유용한 투약 형태에는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 mg의 항산화제 조성물의 캡슐 또는 정제가 포함된다. 한 양태에서, 충전제, 담체 또는 안정화제가 조성물에 첨가되지 않는다. 다른 양태에서, AMBROTOSE®Phyto Formula를 본 발명의 항산화제 조성물과 2:1, 1:1 또는 1:2의 중량비로 혼합한다. 다른 양태에서, AMBROTOSE®Phyto Formula를 항산화제 조성물과 2:1의 중량비로 혼합한다. 다른 양태에서, 캡슐 또는 정제는 AMBROTOSE®Phyto Formula와 혼합된 500 mg의 항산화제 조성물을 제공한다. 이러한 양태에서, 2개의 정제 또는 캡슐을 하루에 섭취할 수 있다. 적절한 피복을 가하여 맛을 향상시키고 흡수를 지연시킬 수 있다.
도 8 및 도 9는 항산화제 용량을 측정하는 ORAC(o) 방법을 사용한 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 다양한 비율에 대한 곡선 아래 순 면적(AUC) 결과를 나타낸다. 각각의 분석된 퍼센티지에 대해 샘플(Q + MT)의 총 농도는 10 ㎍/mL이다. 예를 들어, 0 % 케르세틴에서, 혼합된 토코페롤의 농도는 10 ㎍/mL이고, 샘플 내에 케르세틴이 존재하지 않는다. 10 % 케르세틴에서, 샘플은 1 ㎍/mL의 케르세틴 및 9 ㎍/mL의 혼합된 토코페롤을 갖는다. 20 % 케르세틴에서, 샘플은 2 ㎍/mL의 케르세틴 및 8 ㎍/mL의 혼합된 토코페롤을 갖는다. 상승 효과는 40 내지 100 % 케르세틴에서 쉽게 관찰되고, 40 내지 90 % 케르세틴에서 가장 쉽게 관찰된다. 직선은 추가적인 효과를 나타내고, 즉 10 % 케르세틴에서, 직선은 혼합된 토코페롤 단독의 활성의 90 % 및 케르세틴 단독의 활성의 10 %의 합을 나타낸다. 상승적 효과가 선 위에서 나타난다.
본 발명의 조성물의 1차 항산화제 성분(케르세틴으로 나타나는 플라보노이드, 및 비타민 E의 2 이상의 형태의 혼합물)은 5가지 성분의 12.1 중량% 내지 100 중량%, 30 중량% 내지 85 중량%, 또는 다른 양태에서, 약 82 중량%를 포함한다. 한 양태에서, 케르세틴의 양은 5가지 성분의 총 중량의 49.18 %이고, 비타민 E 형태의 양은 32.79 %이다.
본 발명의 조성물의 2차 성분(또는 강화제)(포도 과피 추출물, 녹차 추출물 및 관목 종려나무)는 5가지 성분의 0 중량% 내지 87.9 중량%, 15 중량% 내지 70 중량%, 또는 약 18 중량%를 포함한다. 도 10에 나타난 바와 같이, 포도 과피 추출물 및 녹차 추출물의 최적의 비율을 49.18 % 케르세틴, 32.79 % 혼합된 토코페롤 및 1.64 % 관목 종려나무의 존재 하에서 측정하였다. 포도 과피 추출물 대 녹차 추출물의 최적의 비율은 60/40 내지 80/20이다. 한 양태에서, 포도 과피 추출물은 항산화제 조성물의 총 중량의 9.84 %이고 녹차 추출물은 6.56 %이다. 관목 종려나무 (Terminalia ferdinandiana)를 약 0 % 내지 87.9 %, 또는 다른 양태에서 약 2 %의 양으로 조성물의 성분으로 제공한다. 도 10의 양태에서, 관목 종려나무는 조성물의 1.64 %이다.
ORAC(o) 분석은 항산화제 혼합물이 다음의 중량비를 갖는다는 것을 나타낸다: 케르세틴, 49.18 %; 혼합된 토코페롤, 32.79 %; 포도 과피 추출물, 9.84 %; 녹 차 추출물, 6.56%; 및 관목 종려나무,　1.64%가 1 g 당 Trolox®등가물 17,254 μmol의 항산화제 활성을 갖는다.
AMBROTOSE AO®의 안정성. AMBROTOSE AO®, AMBROTOSE®(Mannatech, USA) 및 본 발명의 항산화제 제형의 2:1 중량비의 혼합물이 촉진된 안정성 조건(40 ℃, 75 % 상대 습도)에서 이의 활성을 대략 6개월의 저장 수명으로 유지하는 것으로 나타났다.
ORAC(fl) 분석과 비교한 ORAC(o) 분석의 검증. 도 11은 케르세틴과 상이한 비율로 혼합된 경우 α-토코페롤에 의한 AO 활성에의 기여가 없다는 것을 나타내는 ORAC(fl) 결과의 그래프이다. 상기 그래프는 표준 아세톤:물 용액 내의 ORAC(fl) 분석에서의 케르세틴 농도의 증가에 직접 비례하는 AUC의 선형 증가를 나타낸다. AO 활성에의 기여의 결핍은 α-토코페롤이 아세톤:물에 용해되지 못하는 것에 기인할 수 있다.
도 12A 및 12B는 혼합-토코페롤을 사용한 ORAC(fl-lipo) 결과 및 용매/물/세정제 용액을 사용하여 샘플을 용해시켜 친유성 및 소유성 항산화제 용량 모두를 측정한 상대적 AUC 결과의 그래프이다. 상기 도 11에서 친유성 AO의 AO 기여를 측정하는 표준 ORAC(fl) 방법을 사용하여 α-토코페롤에 대해 통계적으로 유의적인 활성을 측정할 수 없다는 것이 나타났다. 도 12A에 나타난 바와 같이, α-토코페롤에 대한 ORAC(fl-lipo) AUC를 기재된 ORAC(fl-lipo) 방법(아세톤:물)과 아세톤:물:Tween-20에서 비교하였고, ORAC(fl-lipo)분석에서의 AUC의 큰 증가를 측정하였다. 도 12B는 케르세틴과 혼합된-토코페롤을 혼합한 경우 공지된 ORAC(fl-lipo) 방 법을 사용하여 상승적 효과가 탐지되지 않는다는 것을 증명하고, 이에 따라 횡좌표를 따라 직선인 결과가 나오며, 이는 이러한 분석을 사용하여 상승 효과가 없다는 것을 나타낸다.
공지된 분석으로 이러한 결과를 얻는 것은 문헌 및 이에 권장된 방법의 연구에 기초하여 놀라운 것이 아니다. 소위 "High-ORAC Foods"(참조: 예를 들어, www.ars.usda.gov)의 평가에 대한 최근의 표준이, 표준은 소유성 항산화제와 별개로 분리되어 친유성 항산화제 잠재력을 측정하는 것이라고 나타낸다. 본 발명은 이러한 이분법에 대한 필요를 제거하고, 이분법은 시험관 내 ORAC 값을 혈청 ORAC 값의 영향과 관련시킬 때 분리된 연구자들이 관찰할 수 있는 단절을 생성시킬 수 있다. ORAC(fl) 평가와 비교하여 혈청 내의 항산화제 효과를 측정할 때, USDA의 Agricultural Research Service는 예를 들어, 시험관 ORAC 분석에서 시금치가 딸기보다 스코어가 낮았지만, 시금치가 딸기보다 혈청 ORAC 값에 보다 많은 영향을 주었다는 것을 밝혀내었다. 본 발명 및 본원의 조성물을 사용하여, 본 발명자는 다양한 용해도를 갖는 항산화제 사이의 상호 작용을 허용하는 시스템을 개발하여 상기 단절을 개선하였고, 이는 사람 신체 내에서의 항산화제 활성을 보다 잘 반영한다. 간접 ORAC(fl) 및/또는 ORAC(fl-lipo) 방법은 총 항산화제 활성을 측정할 수 없고 특정 음식의 상승적 효과를 측정할 수 없다.
도 13은 AUC 측정에 대한 영향을 나타내기 위해 사용되는 다양한 양의 세정제와 α-토코페롤을 사용한 ORAC(fl) AUC 결과의 그래프이다. 이러한 분석에서, 3분의 1 용매를 이의 전체 3분의 1로, Tween-20의 소량이 있는 혼합물로 사용하였 다. 도 14는 2가지 상이한 정량의 용매:물 대 세정제 혼합물의 정량으로 용해된 고정된 비율의 케르세틴:α-토코페롤 비율에 대해 측정된 항산화제 활성을 측정하는 ORAC(fl) 분석의 그래프이다. 도 13 및 도 14의 결과는, 세정제(Tween-20)가 AUC의 증가를 설명하지 못함을 나타내고, 따라서 ORAC(fl) 활성의 측정이 표준 아세톤:물 혼합물과 비교하여 증가함을 나타낸다.
실시예 3. 항산화제 상승 작용 및 잠재력의 ORAC(o) 측정
ORAC(o) 분석이 친유성 및 소유성 항산화제 활성 모두를 측정할 수 있다는 것을 나타내기 위하여, 일련의 연구를 수행하여 친유성 및 소유성 항산화제의 공지된 농도의 특정 배합물의 효과, 및 예를 들어, 포도씨 추출물 및 녹차 추출물 단독과 비교하여 포도씨 추출물 및 녹차 추출물이 첨가된 동일물의 잠재력을 나타내었다. 도 15는 상이한 비율의 케르세틴 및 혼합된 토코페롤로부터 수득한 ORAC(o) 값을 나타내는 그래프이다. 도 16은 상이한 정량의 포도씨 추출물(GES) 및 녹차 추출물(GTE)에 대한 ORAC(o) 값을 나타내는 그래프이다. GSE 및 GTE에 대한 항산화제 활성의 최대 비율을 측정한 후, 2가지를 케르세틴 및 혼합된 토코페롤의 최적화된 비율로 결합하였다. 도 17은 최대 케르세틴:혼합된 토코페롤 및 포도씨 추출물 및 녹차 추출물 비율의 배합물의 ORAC(o) 값을 나타내는 그래프이다. 결합된 케르세틴 및 혼합된 토코페롤, GSE 및 GTE가 보충물의 항산화제 잠재력을 최대화한다는 것이 밝혀졌다.
실시예 4: 소수의 건강한 개인에서의, 위약 효과가 없이 통제된, 개방 연구에서의 AMBROTOSE AO®의 항산화제 효과
항산화제는 생물학적 기질의 산화를 지연 또는 예방할 수 있는 임의의 물질로 정의한다. 항산화제를 함유하는 과일 및 야체가 풍부한 식사는 산화성 스트레스로부터 생성되는 것으로 생각되는 병리학적 상태의 발생이 감소되는 것과 관련되어 왔다. 그러나, 분리된 항산화제 화합물이 있는 보충물은 종종 건강을 개선시키는데 효과적이지 않고, 몇몇 경우 다른 이들에게는 위험하다는 것이 입증되었다.1,3,4 과일 및 야채의 많은 섭취의 항산화제 이익이 단일 항산화제로부터 배타적으로 생성될 수 있는 것이 아니고, 오히려 이러한 음식에 존재하는 상이한 항산화제 배합물의 협동 작용으로부터 생성된다는 것이 제안되어 왔다. 5,6 단일 항산화제에 대한 이러한 초점이 영양 보충물을 사용한 항산화제가 풍부한 식사의 보호 효과를 아직 되풀이하지 못하고 있는 이유를 설명할 수 있다.7
최근의 연구는 세포 전달 및 면역 기능을 지원하는 당을 공급하는 영양 보충물인 글리코영양분(GN) 보충물이 시험관내 및 생체내 모두에서 항산화제 특성을 갖는다는 것을 제안해왔다. GN 보충물을 함유하는 배지에서 자란 래트의 간 세포는 대조군에 비해 높은 수준의 환원된 글루타티온을 나타냈고, 이에 따라 증가된 항산화제 보호를 증명하였다.8
파일럿 임상 연구는 GN 보충물을 소비하는 사람들에서 산화성 스트레스의 생체 지표의 감소 및 산화성 방어의 생체지표의 증가를 증명하였다. 총 철-결합 용량 및 엽산의 상당한 증가가 관찰되었고, 통상의 식사에 2 gr GN 보충물의 일일 첨가 에 따른 76일 내의 구리/세룰로플라스민(ceruloplasmin)에서 상당한 감소가 관찰되었다. 혈청 알케날, 호모시스테인, 8-하이드록시디옥시구아노신(8-OHdG) 및 총 콜레스테롤의 감소, 및 산소 라디칼 흡수 용량(ORACβ- PE)의 감소를 제시하는 경향이 또한 관찰되었다.9
최근의 연구는 광범위한 영양분(몇몇은 공지되고, 다른 것은 아직 식별되지 않음)이 과일 및 야채의 항산화제 활성의 원인이 된다는 것을 증명하였다.10,11,12,13,14 몇몇 공지된 유익한 항산화제에는 폴리페놀, 및 비타민 C 및 E가 포함된다.6 포도(및 적포도주), 녹차, 및 호주산 관목 종려나무(Terminalia ferdinandiana)를 포함하는 특정 음식 및 음료는 상대적으로 높은 수준의 이러한 항산화제를 함유한다.6,15,16 이러한 연구는 GN 보충물을 녹차, 포도, 혼합된 토코페롤, 케르세틴 및 호주산 관목 종려나무로부터 유래된 혼합물과 결합시키는 신규의 영양 보충물에 의해 제공된 항산화제 보호를 측정하였다.
방법: 혈액 샘플을 [Cover-Tek, Inc., Dallas, TX]에 의해 모았다. 모든 혈액 및 소변 샘플을 [Genox Corporation, Baltimore, MD]에 의해 분석하고, 모든 통계적 분석을 [Decision Analyst, Arlington, TX]에 의해 수행하였다.
샘플의 항산화제 잠재력을 시험하는 많은 방법이 발행되었다.17 이러한 연구에 사용되는 시험은 전체 혈청 ORACβ- PE을 측정하는 것이었다. 이러한 방법은 형광 탐침인 β-피코에리트린을 사용하여, 공지된 표준인 Trolox®와 비교할 때, 특히 퍼옥실 라디칼에 대한, 혈청 샘플의 항산화제 제거 용량을 측정한다. 결과를 1 g 당 Trolox®등가물 (TE)(μmol)로 나타내었다.18 연구에 사용된 다른 표준화된 기술은 지질에 대한 자유 라디칼 손상의 양에 간접적으로 관련된 소변의 지질 과산화물(lipid hydroperoxide) 및 알케날, 및 DNA 손상에 간접적으로 관련된 소변 8-OHdG을 측정하는 것이었다 .19,20,21
본 연구에 사용되는 항산화제 영양 보충물인, Ambrotose AO®를 성분(케르세틴, 혼합된 토코페롤, 포도 추출물, 녹차 추출물, 호주산 플럼)의 시험관내 평가를 사용하여 개발하였다. 각각의 성분의 시험관내 항산화제 값을 표준 ORACfl 방법(상이한 형광 탐침, 플루오레세인을 사용)을 사용하여 측정하였다. 성분 혼합물의 항산화제 값을 용존 산소를 간접적으로 측정하는 새로 개발된 방법, ORACo을 사용하여 측정하였다. 지용성 및 수용성 항산화제가 생체내에서 협동하여 작용하므로, 지용성 및 수용성 화합물의 기여 및 상호 작용을 동시에 측정하는 ORACo는 형광-기초 방법(ORACfl, ORACfl - lipo 및 ORACβ- PE)에 비해 개선된 것이다. 이러한 방법은 기껏해야, 지용성 및 수용성 화합물 단독의 활성을 측정한다. 따라서 ORACo는 수용성 및 지용성 성분의 혼합물의 시험관내 총 항산화제 활성을 보다 정확한 측정하도록 한다. 수용성 및 지용성 성분을 화합하고 ORACo로 평가하여 혼합물의 최대 상승 효과 및 최적의 시험관내 ORACo 값을 결정하였다.
후속적인 혼합물을 1:2의 비율로 Ambrotose®복합체와 롤러 압축하여 Ambrotose AO®를 생성하였다. Ambrotose®내의 많은 천연 고무를 지속된 전달을 제공하는 화합물의 방출을 조절하는데 사용하였다. 이러한 연구는 혈청 ORACβ- PE 에 의해 직접적으로, 소변 지질 과산화물, 알케날 및 8-OHdG 분석에 의해 간접적으로 측정된 상이한 양의 Ambrotose AO®의 생체내 항산화제 활성을 표준화된 시험을 사용하여 측정하도록 설계하였다. 공지 기술 및 Cao는 신부전과 같은 몇몇 병리학적 상태가 산화성 스트레스와 상당히 무관한 임의의 시험을 변화시킬 수 있기 때문에, 단일 시험보다는 다수의 시험이 필요하다고 최근 제안하였다.22
모든 참가자에게 정보를 알리고 동의를 구하였다. 연구를 방해할 수 있는 영양 보충물이나 임의의 약물을 섭취하지 않은 12명의 건강한 남성 및 여성 성인 지원자를 등록하였다. 연령 22-61의 4명의 남성 및 8명의 여성인 연구 대상이 항산화제 보충물의 증가하는 양을 소비하였다. 시간에 다른 ORACβ- PE 다양성을 측정하고 실험실 결과의 재생성을 시험하기 위하여, 보충물을 섭취하지 않은 추가의 대상으로부터 혈액 및 소변 샘플을 모았다. 연구 중, 참가자는 이들의 통상적인 연구 전 일상 생활 및 식사를 계속하였다. 표 5는 연구 대상에 대한 정보를 제공한다.
표 5. 사람 지원자의 특성
대상 성별 연령 흡연자
1 F 33 해당
2 M 41 해당되지 않음
3 F 34 해당되지 않음
4 F 61 해당
5 F 44 해당
6 M 22 해당되지 않음
7 F 36 해당되지 않음
8 M 23 해당되지 않음
9 F 38 해당
10 F 56 해당되지 않음
11 F 53 해당되지 않음
12 M 31 해당
보충물이 없는 2주의 초기 제거 기간(wash-out period) 및 항산화제 보충물의 양을 증가시킨 2주의 마지막 이후, 12명의 연구 대상에 대해 아침 단식 혈청 ORACβ- PE 및 소변 분석을 수행하였다. 사용된 양은 보충물을 사용한 첫 번째 14일(기간 1) 동안 매일 500 mg (1 캡슐), 두 번째 14일 기간(기간 2)동안 매일 1.0 g (2 캡슐), 및 세번째 14일 기간(기간 3) 동안 매일 1.5 g(3 캡슐)이었다. 추가로, 보충물을 소비하지 않는 개인으로부터의 혈액 및 소변 샘플을 세 번 분석하여 분석의 정확성을 시험하였다. 혈액 및 소변 샘플을 독립적인 사혈 전문 의사에 의해 모아, 즉시 드라이 아이스에 포장하고 제조를 위해 지역의 병원 연구실로 보냈다. 이어서, 제조된 혈청 및 소변 샘플을 Genox 프로토콜 당 독립적인 분석을 위하여 드라이 아이스에 밤새 Genox로 선적하였다.23 이후 모든 샘플을 Genox에서 드라이 아이스에 저장하고, ORACβ- PE 및 소변 측정을 모두 연구 결말에 동시에 하여 분석 시약의 변화성을 최소화하였다.
결과: ORAC 값 및 기준 데이터로부터의 퍼센트 변화. Ambrotose AO®를 섭취 하는 12명의 참가자에 대한 ORACβ- PE 값 및 기준 데이터로부터의 퍼센트 변화가 표 6에 주어져 있다. 기준은 2주의 제거 이후, 기간 1은 500 mg을 사용한 2주 이후, 기간 2는 1.0 g을 사용한 2주 이후이고 기간 3은 1.5 g을 사용한 2주 이후이다. 몇몇 기간 2 샘플의 혈청 바이알 라벨을 Genox에 선적하는 동안 떼어냈다. ORACβ- PE 값은 이 기간의 연구 참가자 특정 3명에게만 할당할 수 있고 나머지 연구 참가자 또는 추가의 연구 대상이 아닌 개인에게는 할당하지 않았다.
표 6. ORACβ- PE 값 및 기준으로부터의 퍼센트 변화
ORAC 기준으로부터의 변화(%)
대상 기준 기간 1 기간 2* 기간 3 기간 1 기간 2 기간 3
1 3300.3 5709.4 3117.8 73.0% -5.5%
2 3754.5 4618.6 6731.8 6189.0 23.0% 79.3% 64.8%
3 3695.0 3867.9 3995.7 4.7% 8.1%
4 3954.3 3199.1 2703.8 -19.1% -31.6%
5 3107.3 3295.2 4476.2 6.0% 44.1%
6 3313.0 5073.8 3156.6 53.1% -4.7%
7 3785.5 5069.9 4390.4 33.9% 16.0%
8 3341.2 4207.7 4003.2 25.9% 19.8%
9 7568.9 6053.2 8977.6 7734.1 -20.0% 18.6% 2.2%
10 4271.8 6132.5 6765.0 43.6% 58.4%
11 5619.2 6527.0 6420.0 6844.3 16.2% 14.3% 21.8%
12 5642.9 5025.4 4398.7 -10.9% -22.0%
원 ORAC 데이터의 통계적 분석. 반복된 측정인 ANOVA를 수행하여 기준, 기간 1, 기간 2 및 기간 3 원 ORAC 데이터 사이에 차이점이 있는지 측정하였다. 전체 기간 동안 상당한 차이가 있었다(F(3,24) = 4.02, p = .020). 사후 분석은 기간 2가 기준과 상당히 상이하다는 것을 나타내었다(t(24) = -3.47, p = .002). 기간 1은 기간 2와 상당히 상이하였다(t(24) = -2.77, p = .011). 기간 2는 기간 3과 상당히 상이했다(t(24) = 2.87, p = .009). 각각의 기간에 대한 평균을 표 7에 나타내었다.
표 7. 각각의 기간에 대한 평균 ORAC베타-PE 값
기간 대상수 평균 ORAC 스코어
기준 12 4279.5 847.9
기간 1 12 4898.3 699.1
기간 2 3 7376.5 3466.6
기간 3 12 4814.6 1053.1
기준 ORAC 데이터로부터의 퍼센트 변화의 통계적 분석. 상기 기록된(표 6) 분석에 사용된 원 데이터와 대조적으로, 당해 분석은 기준으로부터의 퍼센트 변화로 표현된 기간 간의 차이를 검토하였다. 반복된 측정인 ANOVA를 수행하여 기간 1, 기간 2, 및 기간 3 ORAC 데이터의 기준으로부터의 퍼센트 변화 사이에 차이점이 있는지 평가하였다. 총괄적 시험은 전체적으로 유의값을 산출하지 않았다(F(2,13) = 0.71, p = 0.510). 추가적으로, 사후 분석은 기간 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 각각의 기간에 대한 평균을 표 8에 나타내었다.
표 8. 기간에 따른 기준으로부터의 ORAC베타-PE 퍼센트 변화
기간 대상수 ORAC 퍼센트 변화의 평균 ±
기간 1 12 19.1% 18.1%
기간 2 3 37.4% 90.3%
기간 3 12 14.3% 19.0%
평균 지질 과산화물, 총 알케날 및 8-OHdG 값을 표 9에 요약하였다. 이를 동일한 샘플에서 동시에 측정된 소변 크레아티닌 값으로 나누어 소변 농도 변화성에 대해 수정하였다.
표 9. 각각의 2주 기간동안의 평균 소변 생체 지표
기간 대상수 과산화물/크레아티닌 μM/(mg/dl) 알케날/크레아티닌 μM/(mg/dl) 8-OHdG/크레아티닌 (mg/ml)/(mg/dl)
기준 12 0.0920 0.0761 0.0724
기간 1 12 0.0808 0.0808 0.0861
기간 2 12 0.0782 0.0835 0.0740
기간 3 12 0.0764 0.0806 0.1025
대기 품질. 대기 품질은 산화성 스트레스의 수준에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 오존 및 이산화질소와 같은 통상의 오염 물질 농도의 증가가 대기 품 질을 감소시킨다. 이는 ROS 생성에 대한 더 큰 잠재력을 유발시킨다.24 ,25 대상이 거주하는 Dallas/Fort Worth(DFW) 지역 내의 각각의 2주 기간 동안의 평균 U.S. Environmental Protection Agency(EPA) 대기 품질 인덱스의 요약이 표 6에 주어진다. 지역 대기 품질 도표를 위해 EPA는 색깔 코드를 사용한다: 녹색: "우수함" (0 - 79 ppb(parts per billion) 오존), 황색: "중도" (80 - 99 ppb), 주황색: "민감한s그룹의 건강에 해로움" (100 - 124 ppb), 적색: "해로움"(125 - 149 ppb), 보라색: "매우 해로움" (150 ppb 이상). 연구 지역의 각각의 일일 EPA 도표의 수치를 색깔에 숫자를 부여하여 계산하고(녹색: 1, 황색: 2, 주황색: 3, 적색: 4, 보라색: 5) 발행된 EPA 도표의 각각의 색깔의 지역에 기초하여 일일 평균 수치를 추정하였다. 이어서 일일 수치의 연구 각각의 2주 기간에 대한 평균을 내었다(표 10).
표 10. 각각의 기간의 평균 DFW EPA 대기 품질 지표
기간 평균 EPA 대기 품질 지표
기준 1.0 (범주 1.0-1.0)
기간 1 1.0 (범주 1.0-1.1)
기간 2 1.4 (범주 1.0-2.5)
기간 3 1.8 (범주 1.0-2.5)
상술한 바와 같은 기간 2의 연구 참자들에서의 불확실성을 허용하면서, 12명의 연구 참자가에 대한 가능한 최저 평균 ORACβ- PE를 계산하였다. 라벨을 인식할 수 없는 혈청 샘플로부터의 최저 9개의 수치가 참자자에게 속한다고 가정하고 이를 3개의 공지된 값과 합하여 가능한 최저 평균을 산출하고, 이에 따라 기준으로부터의 변화의 가장 타당한 추정을 산출한다. 9개의 최저 ORACβ- PE 값은, 4727.9, 5233.9, 5104.3, 4599.9, 5699.9, 5364.8, 3987.3, 4179.7 및 4584.9이다. 표 5로부터의 3 개의 공지된 기간 2의 값을 합하면, 기간 2의 12명의 연구 참가자에 대한 평균 ORACβ- PE 값인 5467.70를 수득한다. 이는 기준 평균인 4279.49의 27.8 % 이상이다.
논의. 연구는 과일 및 야채가 풍부한 식사의 소비가 산화성 스트레스를 방어한다는 것을 나타내었다.7 ,26 ,27 식사 지침을 2-4회 식사의 과일 및 3-5회 식사의 야채의 일일 소비를 지지한다.28 상기 지식 및 이러한 권장에도 불구하고, 권장된 일일량을 소비하는 사람은 미국에 거의 없다. U.S. Department of Agriculture(USDA)가 지원한 연구에서, 연구자는 특히 하루에 통상의 5 내지 실험시의 10회의 식사에서의 과일 및 야채의 증가된 소비가 2주 후에 약 13 %까지로 혈청 ORACβ- PE 값을 현저히 증가시켰다는 것을 밝혀내었다.7 최근의 연구에서, 각각 양의 보충물을 사용하여 증가된 평균 혈청 ORACβ- PE 값은 500 mg로 19.1 %, 1.0 g으로 37.4 %, 및 1.5 g으로 14.3% 이었다. 이러한 데이터는 건강한 사람에서 기준에 대해 혈청 ORACβ- PE를 가장 크게 상승시키는 최적의 양이 1.0 g이라는 것을 제시한다. 1.0 g Ambrotose AO®로 27. 8 % 증가한다는 타당한 추정값은 추가적인 과일 및 야채를 일일 5회 소비하는 개인이 13 %라는 문헌 기록의 2배 이상이다.
소변 지질 과산화물/크레아티닌 값은 보충물의 사용이 증가할수록 감소하였다. 각각의 양에 대한 감소는 500 mg의 경우 12.1 %, 1.0 g의 경우 15.0 %이고 1.5 g의 경우 17.0 %이었고, 이는 연구한 범주에 걸쳐 보충물의 양이 증가할 수록 지질 손상으로부터의 보호가 증가됨을 암시한다. 지질 과산화물 데이터가 ORACβ-PE 값과 정확하게 서로 관련되지 않는 이유는 명확하지 않다. 혈청 ORACβ- PE는 측정시 자유 라디칼을 제거하는 능력에 대한 혈액의 항산화제 보호의 측정이다. 소변 지질 과산화물은 과거에 동시에 일어난 지질 산화성 손상의 지표이다. 급성 지질 손상 및 소변 내의 지질 과산화물의 생성 간의 일시적 관계는 잘 정의되어 있지 않다. 이러한 일시적인 차이는 부분적으로 이러한 변화의 원인이 된다고 해도 무방하다. 소변 지질 과산화물 이외에, 소변 8-OHdG 및 알케날을 또한 각각의 기간에서 측정하였다. 유의적인 차이 또는 경향이 관측되지 않았다. 이는 또한 급성 지질 및 DNA 손상 및 소변 내의 생체 지표의 출연 간의 일시적인 관계에 관한 것일 수 있다.
연구의 참여자는 DFW 지역에 거주한다. DFW에 대한 간행된 EPA 일일 대기 품질 평가를 각각의 2주 기간에 대해 평균을 내었다. 대기 품질은 연구 과정에 걸쳐 더욱 악화되었다. 이는 ROS의 증가 및 이에 따른 지질 과산화물과 같은 산화성 손상의 생체 지표의 증가에 의해, 산화성 스트레스를 증가시키는 것으로 통상적으로 기대된다.29 반면, 증가된 혈청 ORAC 값에 의해 측정된 바와 같이 보호의 증가가 명백하다. 추가로, 소변 지질 과산화물 값 및 소변 8-OHdG 및 알케날의 안정성의 감소 경향이 산화성 손상의 감소의 증거를 제공한다. 이들 데이터는 함께 보충물에 의해 제공된 항산화제 효과가 실제로 측정된 효과보다 클 수 있었다는 것을 제시한다.
결론. 개인이 간행된 지침에 따라 과일 및 야채를 소비할 것이 권장되지만, 대다수가 이에 따르지 않는 것이 현실이다. 이러한 예비적인 데이터는 완성된 생성물 내의 항산화제 활성을 보존하는 최적의 항산화제 성분을 함유하는 영양 보충물이 혈청 ORACβ PE에 의해 측정된 바와 같은 건강한 개인에서의 항산화제 보호를 증가시키고, 소변 지질 과산화물에 의해 측정된 바와 같은 지질 산화성 손상을 감소시킨다고 제시한다. 건강한 사람에서의 보호는 2주 후 기준에 비해 증가된 혈청 ORACβ- PE 에 의해 증명된 바와 같이, 500 mg, 1.0 g 및 1.5 g의 Ambrotose AO®를 사용한 것이 2주 동안 식사에 과일 및 야채 5회를 첨가한 간행된 데이터에 기재된 것보다 크다(19.1 %, 37.4 % 및 14.3 % 대 13 %).
본원에 나타난 바와 같이, 항산화제 보충물을 건강한 사람의 산화성 스트레스의 4회의 측정값을 사용하여 검토하였고 혈청 ORACβ- PE의 증가가 밝혀졌다. ORACβ-PE 값에 의해 제시된 건강한 대상 사이의 최적의 범주가 1일 1 g인 반면, 연구에서는 낮은 혈청 ORAC 값의 개인이 고용량의 항산화제 보충물로부터 이익을 얻는다고 나타났다.30 따라서, 산화성 스트레스의 증가로 고통받거나 다르게 스트레스를 받는 개인은 보다 고용량으로부터 이익을 얻을 수 있다.
ORACo가 항산화제 혼합물 제형에서 사용되는 반면, 독립적 실험실은 수립된 방법인 ORACβ- PE를 사용하여 사람 임상 실험 혈장 샘플을 분석한다. Ambrotose AO®생성물의 항산화제 효율성의 생체내 평가는 ORACo 방법의 사용에 의존하지 않는다. 이러한 데이터는 본원의 항산화제 보충물이 혈청 ORAC(β-PE)에 의해 측정된 바와 같이 소비자에서의 항산화제 보호를 증가시키고 소변 지질 과산화물에 의해 측정된 바와 같이 지질 산화성 손상을 감소시킨다는 것을 증명한다.
실시예 5. 10,000 psi 이상으로 롤러 압축이 수행될 때의 생체활성 분자에 대한 지효성 약제로서의 다당류 물질. 본 발명자는 예를 들어, Ambrotose AO®를 사용하는 이의 제형의 분해를 연구하기 위해 개발된 특정 제형 및 방법은 기대된 바와 같이 방출하지 못한다는 것, 즉 성분, 예를 들어 항산화제 케르세틴의 즉각적인 방출을 하지 못한다는 것을 인식하였다. 본원의 모든 실시예를 진행하기 위해 사용되는 공지된 정식 분석 기술을 사용하여 연구를 시작하였다. 초기에 완전히 정량적으로 설계되었기 때문에 상기 방법은 세부적인 2가지 수준을 포함하며, 항산화제 케르세틴을 분석물로 측정하였다. 초기에 케르세틴 이외의 성분의 가시적인 해석은 예측되지 않은 방출 프로파일, 즉 비교된 용해 조건이 동일하지만 실제로 결과는 동일하지 않은 것을 나타낸다.
도 18은 초기 연구를 위해 선택된 3가지 분자를 나타낸다. 4개의 분리된 샘플을 3 단계에서 케르세틴, 포도 과피 및 2가지 다른 생성물(항산화제 화학식 A 및 항산화제 화학식 B)에 대해 시험하였다. "조절된 용해" 단계는 모든 실시예에서 동일하다는 것을 주의한다. 간략하게, Ambrotose AO®조절된 방출 입증에 대한 용해 기초 방법은 케르세틴을 지표로 사용한 HPLC 및 UV-Vis를 포함하였다. 추가로, 제형의 가시적인 관찰은 HPLC 및 UV/Vis 관찰과 일치하였다.
여러 나라에서의 식사 보충물 방출 능력에 대한 최근의 사양에는 소화관의 물리적 상태를 개략적으로 재연하는 기구 내에서 정제 또는 캡슐 생성물 형태의 완 전한 분해를 제공하는 것이 포함된다. 이러한 조건을 United States Pharmacopoeia(USP) 및 British Pharmacopoeia(BP)에 기초한 사양 모두에 적용한다. 분해 시험은 보충물 물질의 물리적 이용가능성을 재연하여 소화 시스템과 상호 작용하게 하는 것으로 가장 잘 설명된다. 한 성분이 신체로 도입되는 조건은 이의 이용가능성의 속도 및 효율성에 영향을 준다. 영양분 이용가능성의 속도 및 효율성은 "이용가능성 곡선"으로 나타낼 수 있다. 좁고 급격한 곡선이 예를 들어 정맥 주사에서 대표적인 반면, 이용가능해지기 전 소화되어야 하는 음식물에서 발견되는 것과 같은 섬유 결합 영양분이 보다 점차적인 방출에 의해 보다 넓은 곡선을 갖는다. 목적하는 반응에 따라, 분포 모델을 지효성 담체 매질뿐 아니라 신속히 작용하는 담체 매질을 사용하여 개발할 수 있다.
본 발명의 지속된 방출 액체 제형 내의 활성 약제의 용해 프로파일을 예를 들어, 표준 저 pH 또는 물 용해 프로파일 분석을 사용하여 시험하였다. 간략하게, 롤러 압축된 Ambrotose®를 1분당 150 회전(RPMs)으로 샘플을 혼합하는 패들로 5.0 g의 염화 칼륨이 용해된 1 L의 탈이온화된 물 내의 37 ℃ 수조 내에 용해시켜 방출 퍼센트를 시험하였다. 순수한 또는 적정된 액체 제형의 5 mL 시험 샘플을 시린지(물/KCl 혼합물에서 세척될 수 있다)를 사용하여 배쓰에 첨가하였다. 2 ml의 앨리쿼트를 예를 들어, 0.5, 1, 3 및 8 시간에서 샘플화하였다. 또는, USF Apparatus II(패들)로 구성된 Distek Model 2100B 용해 배쓰를 사용하여 투약 형태를 용해시켜 용해 프로파일을 시험할 수 있다. 패들 회전을 50 rpm으로 설정하였다. 용해 매질은 예를 들어, 37 ℃의 900 ml의 pH 6.8 인산염 완충액일 수 있다.
불행히, 30분 이내의 전체 가시적 분해의 USP 및 BP 지침의 사양을 따르는, 최근 허용된 분해 시험은 소화관에 도달하는데 오래 걸리는 보다 완만한 곡선을 갖는 보충물의 이용 가능성을 정확하게 평가하기에 불충분하다. Ambrotose AO®캡슐을 특히 지속된 방출 및 점차적인 이용가능성을 위해 설계했고, 30분의 기간 이내에 완전히 분해시키지 않았다. 이것을 Ambrotose AO®가 할당된 가동시간 내에 이용가능하게 되지 못하는 것으로 보아서는 안되고, 오히려 빠르게 작용하는 성분에 대한 본 방법의 성향으로 보아야 한다. USP 및 BP 분해 요건은 간접적으로 상대적으로 좁은 이용가능성을 강요한다. 몇몇 분야에서 이는 포함된 성분에 따라 바람직하지 않거나 잠재적으로 독성이다. 용해, UV-Vis 및 HPLC 기술을 사용하여 요구되는 Ambrotose AO®의 연장된 방출 활성을 나타내는 간단한 방법이 제공된다. 주요 목적은 이러한 활성을 측정하는 것이 단지 UV-Vis 실행과 관련시키기 위해 사용되는 보다 복잡한 HPLC 방법과 함께, UV-Vis 단독으로 충분하도록 하는 것이다.
방법. 377 nm에서의 높은 UV-Vis 활성, Ambrotose AO®에서의 상대적으로 높은 조성물 퍼센티지 및 크로마토그래피에 적합한 특성에 기인하여, 본 방법에서 케르세틴을 분석물로 선택하였다. Ambrotose AO®의 제형에서 사용되는 동일한 케르세틴 저장액 표준 물질을 사용하여 용해 시험에서 기대되는 농도 범주 이내의 참조 곡선을 제공하였다. 초기 부담으로서 본 연구에 Mannatech Ambrotose AO®의 호주산 구획을 사용하는 것은 BP 당 TGA 투여된 분해 시험에 맞지 않는 제형을 조절하기 위한 것이라는 점을 주목해야 한다. 유사한 분석을 위하여 USP 및 BP 둘 다에 따라 용해 조건을 설계하였다. 한 예외는 계속 정상적인 결과를 유지하면서 분석 시간을 타당하게 유지하기 위해 용해 기구에 대한 평균 이상의 회전 속도를 선택하였다는 것이다. 실제로 단일 방법이 선택될 수 있어도 이중 측정 기술을 사용하여 결과를 상호 연관시키고, 보다 단순한 UV-Vis 방법만을 사용하는 것이 이상적일 것이다. 실패한 30분 분해 시험의 관찰을 시험 샘플에 대해 수행하였다. 다음으로, Ambrotose AO®의 이용가능성 곡선을 특정 용해 조건에서 케르세틴 지표를 기초로 하여 0.5, 1, 2, 3, 4 및 8 시간에 걸쳐 플롯시켰다. 이러한 간단한 상응하는 방법을 임의의 적절하게 장비를 갖춘 실험실에서 반복할 수 있고, 필요한 경우 방출 시험에 대한 품질이 보장된 환경으로 옮길 수 있다.
장비. 용해 시스템: Hanson 용해 시스템 SR8-Plus를 당해 방법에 사용하였다. 주어진 사양에 따라 조정된 패들 깊이를 갖는 USP 기구 유형 II(패들) 구성을 사용하여 작동하였다. 유사한 분석에 기초하여, 용해 매질은 배스킷 당 800 ml의 탈이온화된(d.i.) 물(18+ Mohm)이고, 배쓰 온도는 37 ℃이고, 패들 속도는 200 rpm이었다. 샘플링을 위해 1 ml 피펫이 12 x 75 mm 유리 시험 튜브(또는 등가물)와 함께 필요하고, 기구 내의 분석의 준비에서의 희석을 위한 메탄올이 필요하다. 상기 과정에 명시된 샘플의 희석으로 UV-Vis 및 HPLC 모두의 분석에 대한 최적의 범주 내의 시험 배쓰 내에 케르세틴 농도가 최대가 되도록 하였다.
UV-Vis 분광계: 석영 유리 큐벳이 있는 UV-Vis 분광계(Cary 50 Bio, Varian)를 측정에 사용하였다. 단일 파장 기록을 377 nm에서 취하였다. 모든 기록에 대해 동일한 석영 큐벳을 사용하고, 기구를 용해 시험 배쓰 각각으로부터의 초기 T0 샘플을 사용하여 각각 0점으로 맞추었다. UV-Vis 기록의 준비에서, 요구되는 377 nm에 서의 기록 뿐 아니라 0점을 유지하는 능력을 확인하였다.
HPLC 시스템. Shimadzu LC-VP 바이너리 펌프 HPLC 시스템을 측정에 사용하였다. 사용된 측정기는 6.25 Hz 스캐닝 속도로 377 nm에서 모니터한 Shimadzu PDA SPD-M10A였다. 사용된 컬럼은 Phenomenex Hydro RP(4.6 mm x 150 mm, 5 um 입자 크기)였다. 컬럼 및 PDA 플로우 셀(flow cell)을 30 ℃의 온도로 유지하였다. 모든 샘플 및 표준에 20ul를 주입하였다. HPLC에 주입하기 전 모든 샘플 및 표준을 0.20uM CA 필터(Whatman)에 통과시켰다. 지속적인 피크 생성을 위해 적분을 자동화시켰다. Shimadzu VP 7.2 버전 소프트웨어 패키지를 사용하여 적분뿐 아니라 HPLC를 조절하였다. 이어서 분석에 기울기 프로그램(gradient program)을 사용하였다. 용매 A는 탈이온화된(d.i.) 물 내의 0.1 % 포름산이고, 용매 B는 메탄올 내의 0.1 % 포름산이었다. 시스템 평형 전에 모든 용매에서 기체를 제거하였고, 분석 작동 시간은 30분이었다. 이러한 조건 하에서 케르세틴 피크는 약 14.8분에서 용리되는 것으로 예측할 수 있다.
표 11. 케르세틴 HPLC 시스템에 대한 기울기 프로그램
분 농도 B(%)
0.00 50
5.00 50
20.00 70
20.01 85
22.00 85
22.01 50
30.00 50
표준 및 샘플. UV-Vis 및 HPLC 모두에 대한 표준의 범주를 Pharmline 케르세틴 HD (구획# 152560)의 일련의 희석액을 사용하여 생성하였다. 표준에는 800 ml 부피의 d.i. 물 (~0-100 ppm) 내의 단일 용해된 Ambrotose AO®캡슐과 관련된 농도 범주가 주어졌다. 모든 샘플을 AUS Ambrotose AO®(구획# N04081226)의 동일한 병으로부터 수득하였고, 이는 허용되는 시험 구획을 제공하면서 방출하도록 허용된다. 표준 및 시험 샘플 모두를 먼저 d.i.물에 용해시키고, 상기 과정에 기재된 바와 같이 샘플화하고 각각의 기구에서의 분석 전에 메탄올로 1:3으로 희석시키는 동일한 방법으로 진행하였다.
용해 시스템의 조건을 정립한 후, Ambrotose AO®캡슐을 배쓰마다 첨가하였다. 용해 활성을 정확하게 나타내기 위해 최소 3개의 배쓰를 작동시키는 것이 제안된다. 캡슐이 배쓰에 도입되는 순간이 시간 T0가 되고 케르세틴 이용가능성 곡선에 대한 모든 기록을 초기 T0 기록에 대해 측정하였다. 이후 샘플을 30분 간격으로 1 ml의 부피로 취하였다. 추가로 샘플링 후 1 ml 부피의 d.i. 물을 배쓰 내에서 조정된 부피를 유지하기 위해 대체하였다. 캡슐이 배쓰로 도입되자마자 초기의 샘플을 T0에 대해 취하였다. 이어서 캡슐의 용해가 완료되는 것이 명백해질 때까지 샘플을 T0로부터 4-6 시간까지 계속하여 취하였다. 일단 모든 샘플을 취한 후 메탄올로 1:3으로 희석시키고 이의 튜브에서 진탕시켜 분석될 준비가 되도록 하였다. 케르세틴 표준을 위해 100 ppm 용액을 d.i.물에서 제조하고, 당해 저장액으로부터 일련의 희석액을 생성시켰다. 이어서 표준 희석액을 1 ml 부피로 샘플화하고 메탄올로 1:3으로 희석시키고 샘플과 동일한 방식으로 진탕하여 분석을 위한 준비가 되도록 하였다. 표준으로 케르세틴 농도의 예상 범주에 걸쳐 최소 5개의 일련의 희석 지점을 취하였다.
표준 곡선 측정의 경우 T0에서 측정되는 샘플 배쓰, 또는 d.i. 물 내의 75 % 메탄올로부터 채워진 석영 큐벳(모든 기록에 대해 동일물을 사용)을 사용하여 광도계를 0점으로 맞추었다. 석영 큐벳을 다량의 d.i. 물로 세척하여 기록들 간의 임의의 잔류 케르세틴을 제거하였다. 용해의 종료점을 샘플의 UV-Vis 활성의 증가가 2회의 연속적인 기록(1시간) 이후 더 이상 탐지되지 않는 시간의 지점으로 정의한다. 이러한 "평탄역(plateau)"는 캡슐로부터 케르세틴이 완전히 용해된 지점을 표지한다. UV-Vis 기록 동안 광원 경로 등을 차단하는 입자에 기인한 로그(rogue) 값이 있는 경우, Q 테스트를 사용하여 기록을 버리고, 이를 다시 취하였다. 이는 기록이 통상적으로, 오히려 일정하게 지속될 때 일어난다는 것이 명백하다. 3개 기록의 최소값을 샘플마다 취하여 허용되는 평균을 수득하였다. UV-Vis 측정 후, 샘플을 여과하고 각각 비교를 위해 주어진 HPLC 조건에서 작동시켰다. 이어서 기구 둘 다로부터의 데이터를 표준 곡선으로부터의 반응과 연관시켜 Ambrotose AO® 샘플로부터의 점차적으로 증가하는 반응을 나타내었다.
결과. 기구 사용이 상이할 수 있지만, 당해 연구로부터 생성된 데이터의 요약이 참조로 포함된다. 이는 주어진 실험 조건 하에서의 Ambrotose AO®용해의 예상되는 반응을 이해하는 것을 돕는다. 케르세틴 표준 희석액에 대한 UV-Vis 흡수 반응 및 표준화된 HPLC 곡선 아래 면적 대 시간의 관계를 요약한 표 및 그래프가 하기에 있다. 나타낸 범주는 Ambrotose AO®으로부터의 예상 케르세틴 활성의 0-200 %이다. 실험의 3회의 분리된 실행의 평균이 주어져있고, 이러한 실행은 동일한 날에 수행하였다.
표 12. 표준의 UV-Vis 및 HPLC 연관 표
표준 Pharmline 케르세틴 2수화물 HD 로서의 AO 저장액 케르세틴(84 % 케르세틴)의 UV/Vis - HPLC 연관
AO 케르세틴 최대값의 농도(%) 실제 ppm UV-Vis (abs) 377 nm HPLC (auc) 377 nm abs에 맞추기 위해 표준화된 auc(auc/ 1700000)
12.50% 3.13 ppm 0.0819 139412 0.0820
25.00% 6.25 ppm 0.1628 284334 0.1673
50.00% 12.50 ppm 0.3924 673170 0.3960
100.00% 25.00 ppm 0.8283 1393657 0.8198
200.00% 50.00 ppm 1.6170 2775937 1.6329
표준으로부터의 값의 연관은 두 기구 사이에서 보여진 적은 변화에 기초하여 유망한 것으로 입증되었다. 추가로 케르세틴 반응은 Ambrotose AO®용해 시험으로부터 예측되는 가능한 농도의 전체 범주에 걸쳐 선형으로 밝혀졌다. 표 13은 각각의 샘플에 대한 UV-Vis 흡수 및 표준화 HPLC 곡선 아래 면적 대 시간 사이의 곡선의 연관이 주어진 유사한 비교를 나타낸다. 보여지는 바와 같이, 유사하게 낮은 편차가 두 기구 사이에서 발견된다. 보다 단순한 UV-Vis 방법이 Ambrotose AO®캡슐로부터의 총 케르세틴 시간 방출을 측정하기 위한 정량적 도구로서 독립적으로 실행될 수 있다는 것을 확실히 제시한다.
Figure 112007071165708-PCT00003
샘플의 곡선은 케르세틴 용해와 연관된 반응의 점차적이고 지속적인 증가를 나타낸다. 이러한 반응은 두 기구 모두에 대해 임의의 주요 편차가 없이 동등하게 나타날 수 있다. 반복된 실험에서 이러한 증가가 용해 조건이 주어졌을 때 평균에서 4시간으로 연장되는 것으로 나타났다. 상이한 많은 샘플로 추가로 반복하여 수행하여 더 많은 연관을 생성시킬 수 있다. 표 12 및 13에 나타난 결과를 각각 도 19 및 20에 나타난 그래프에 플롯시켰다. 펠렛을 막자 사발 및 막자로 재분쇄하기 전 적어도 120초 동안 10,000 psi에서 유지하고 용해 시험을 위해 다시 캡슐화하였다.
논의. 시간에 대한 흡수 곡선에 의해 측정된 용해 연구 동안, Ambrotose AO®는 초기 기록에 비해 활성을 240분까지 증가시켰다. Ambrotose AO®캡슐의 용액으로의 점차적이고 지속적인 분해가 나타났고, 이는 소화관에서의 점차적인 이용가능성으로 해석될 수 있다. 또한 압축 정제 또는 캡슐 형태로부터의 가시적인 분해만은 총 용해 완료 지점이 아니라는 것을 주의해야 한다. 몇몇 마이크로캡슐 물질이 결과적으로 아직 이를 쉽게 이용가능하지 않게 하는 케르세틴과 결합하여 용액 내에 여전히 분산될 수 있다.
연구의 가시적 분석은 약 T60에서 캡슐 물질의 우수한 부분이 큰 캡슐로부터 분리되지만, 이용가능성 반응 곡선은 계속적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 이러한 방법은 캡슐에 의한 실패한 USP 및 BP 분해 방법의 정당화 및 식사 보충물의 조절된 방출을 측정하는 수단으로 사용될 수 있다. 특히 이러한 결과는 Ambrotose AO®(호주)의 방출 조절된 클레임의 뒷받침하에 생성되었고, 다른 식사 보충물 정제 또는 캡슐 조절된 방출로 연장될 잠재력을 갖는다. 상기 방법은 또한 단순한 UV-Vis 측정이 보다 복잡한 HPLC와 유사한 결과를 전달하는 측정이라는 것을 확인 하도록 한다. 품질 조절 사양을 특정 시간 간격에서 측정된 주어진 최대값에 대한 최소의 케르세틴 반응에 기초한 이러한 사실에 근거하여 만들 수 있다. 이러한 유형의 결과에 대한 샘플링 속도를 일단 충분한 실시예가 결과를 계속 지지할 경우 감소시킬 수 있다.
표 14. 케르세틴 용해 시험
시간 AO 케르세틴* 실리카 케르세틴** AO 케르세틴 정제***
0 분 ++++ - -
60 분 ++++ ++++ +
*Ambrotose®와 1:2로 혼합된 순수한 케르세틴.
**실리카겔과 1:2로 혼합되고 캡슐화(식물성)된 순수한 케르세틴.
***10,000 psi로 압축되고, 재분쇄되고, 캡슐화(식물성)된 Ambrotose-케르세틴 혼합물.
표 15. 포도 과피
시간 AO 포도씨* 실리카 포도씨** AO 포도씨 정제***
0 분 ++++ - -
60 분 ++++ ++++ -/+
*Ambrotose®와 1:2로 혼합된 순수한 포도 과피 추출물.
**실리카겔과 1:2로 혼합되고 캡슐화(식물성)된 순수한 포도 과피 추출물.
***10,000 psi로 압축되고, 재분쇄되고, 캡슐화(식물성)된 Ambrotose-포도 과피 추출물 혼합물.
표 16. 항산화제 화학식 A
시간 AO 및 화학식 A* 실리카 화학식 A** AO 화학식 A 정제***
0 분 ++++ - -
60 분 ++++ ++++ ++
*Ambrotose®와 1:2로 혼합된 순수한 화학식 A.
**실리카겔과 1:2로 혼합되고 캡슐화(식물성)된 순수한 화학식 A.
***10,000 psi로 압축되고, 재분쇄되고 캡슐화(식물성)된 Ambrotose-화학식 A 혼합물.
표 17. 항산화제 화학식 B
분 AO 및 화학식 B* 실리카 화학식 B** AO 화학식 B 정제***
0 분 ++++ - -
60 분 ++++ ++++ ++
*Ambrotose®와 1:2로 혼합된 순수한 화학식 B.
**실리카겔과 1:2로 혼합되고 캡슐화(식물성)된 순수한 화학식 B.
***10,000 psi로 압축되고, 재분쇄되고 캡슐화(식물성)된 Ambrotose-화학식 B 혼합물.
따라서, 동일한 조건(캡술, 중량 등)을 사용하여, 롤러 압축되지 않았다는 점을 제외하고 동일한 조성물을 갖는 캡슐을 갖는, 비워지고 재충전된(캡슐 압축물이 모든 샘플에 대해 동일하도록 하기 위하여) Ambrotose AO®캡슐에 대해 케르세틴 용해도를 시간에 따라 시험하였다. 롤러 압축된 Ambrotose AO®는 Qmax(최대 케 르세틴 용해)에 이르는 시간 내에 4배 - 8배 증가하였다. 느슨한 형태 내의 Ambrotose®가 즉시 방출되었다. 가시적인 비교는 롤러 압축되지 않은 형태의 붕괴 지점을 훨씬 지나서 롤러 압축된 캡슐이 이의 형태를 유지한다는 것을 나타낸다. 이론에 얽매이지는 않으며, Ambrotose®의 장쇄 중합체가 사슬처럼 작용할 수 있고 케르세틴(또는 상기 물질에 대한 임의의 다른 활성 생분자)을 조절된 속도로 "걸러낼 수 있다". 이와 같이, 장쇄 다당류, 예를 들어, 2 내지 약 50,000개 당류 단량체의 사슬을 약 100, 500, 1000, 2000 또는 심지어 10,000 psi 사이에서 하나 이상의 영양상 유효량의 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 당류, 이의 혼합물 및 배합물과 함께 압축할 수 있다.
본원에 기재된 특정 양태가 발명의 제한이 아닌 예시로서 보여졌다는 것을 이해해야 한다. 본원의 주요 특징은 발명의 범주를 넘어서지 않으면서 다양한 양태에서 사용될 수 있다. 당업자는 단지 하나 이상의 통상의 실험인 본원에 기재된 특정 방법에 대한 많은 등가물을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본원의 범주 내이고 청구항에 포함되는 것으로 간주된다.
명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 본 발명이 관련된 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 문헌 및 특허 출원은 각각의 문헌 또는 특허 출원이 특정하게 및 개별적으로 참조에 의해 인용되는 것과 같은 정도로 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 기재되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법을 본 명세서에 비추어 부적합한 실험 없이 제조하고 실행할 수 있다. 본원의 조성물 및 방법이 바람직한 양 태의 용어로 기재되고, 본원의 개념, 의도 및 범주를 벗어나지 않고 본원에 기재된 방법의 단계 또는 일련의 단계에서 변화가 조성물 및/또는 방법에 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 특히, 화학적 및 물리적으로 모두 관련된 특정 약제가 본원에 기재된 약제를 대신하여 동일하거나 유사한 결과가 얻어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환체 및 개질이 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 의도, 범주 및 개념 이내로 간주된다.
참조
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Claims (56)

  1. 하나 이상의 분리되고 정제된 장쇄 다당류, 및 항산화제, 비타민, 당류, 무기물, 아미노산, 핵산, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 하나 이상의 영양 보충물을 포함하고, 보충물이 100 psi 이상의 압력에서 압축되는 방출 조절된 식사 보충물.
  2. 제1항에 있어서, 캡슐, 식물성 캡슐 또는 경질 젤라틴 캡슐에 넣어지는 보충물.
  3. 제1항에 있어서, 약 85 %의 영양 보충물이 약 1 내지 약 8시간에서 방출되는 보충물.
  4. 제1항에 있어서, 약 85 %의 영양 보충물이 약 2 내지 약 6시간에서 방출되는 보충물.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 부형제를 포함하는 보충물.
  6. 제1항에 있어서, 장쇄 다당류가 갈락토즈, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코즈, 만노즈, 아세틸화-만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N- 아세틸글루코사민, 아라비노즈, 아라비노갈락탄, 갈락투론산, 글루쿠론산, 이듀론산, 자일로즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 선택된 단량체를 포함하는 보충물.
  7. 제1항에 있어서, 약 2,000 내지 10,000 psi의 압력에서 롤러 압축에 의해 압축되는 보충물.
  8. 제1항에 있어서, 약 5,000 내지 10,000 psi의 압력에서 압축되는 보충물.
  9. 제1항에 있어서, 10,000 psi 이상의 압력에서 압축되는 보충물.
  10. 제1항에 있어서, 하나 이상의 장쇄 다당류가 약 0.1 내지 약 75 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 보충물.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 장쇄 다당류가 분리되고 정제된 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무, 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검, 실리움, 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드 로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄, 락토즈 및 이의 혼합물 또는 배합물인 보충물.
  12. 제1항에 있어서, 하나 이상의 장쇄 다당류가 약 1 내지 약 10 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 보충물.
  13. 제1항에 있어서, 항산화제가 분리되고 정제된 소유성 산소 라디칼 제거제 및 분리되고 정제된 친유성 산소 라디칼 제거제를 포함하고, 여기서 결합된 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제는 6,000 μMol Trolox 등가물 (TE)/g 이상의 산소 라디칼 제거제 값을 갖는 보충물.
  14. 제13항에 있어서, 소유성 산소 라디칼 제거제가 알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타, 에타, 크사이 1, 크사이 2 및 시그마 토코페롤, 및 알파, 베타, 델타 및 감마 토코트리에놀, 이의 유사체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 비타민 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보충물.
  15. 제13항에 있어서, 친유성 산소 라디칼 제거제가 플라보놀, 케르세틴, 캄페롤, 미리세틴, 아피게닌 및 이의 유도체, 유사체, 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보충물.
  16. 분리되고 정제된 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무, 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검, 실리움, 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄, 락토즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 선택된 하나 이상의 분리되고 정제된 장쇄 다당류; 및
    항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 당류, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 하나 이상의 영양 보충물을 포함하고, 장쇄 다당류 및 영양 보충물이 2,000 psi 이상의 압력에서 롤러 압축되는 방출 조절된 식사 보충물.
  17. 제16항에 있어서, 캡슐, 식물성 캡슐 또는 경질 젤라틴 캡슐에 넣어지는 보충물.
  18. 제16항에 있어서, 약 85 %의 영양 보충물이 약 1 내지 약 8시간에서 방출되는 보충물.
  19. 제16항에 있어서, 약 85 %의 영양 보충물이 약 2 내지 약 6시간에서 방출되는 보충물.
  20. 제16항에 있어서, 하나 이상의 부형제를 포함하는 보충물.
  21. 제16항에 있어서, 영양 보충물이 갈락토즈, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코즈, 만노즈, 아세틸화-만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 아라비노즈, 아라비노갈락탄, 갈락투론산, 글루쿠론산, 이듀론산, 자일로즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 선택된 2 이상의 당류의 영양상 유효량을 추가로 포함하는 보충물.
  22. 제16항에 있어서, 약 2,000 내지 10,000 psi의 압력에서 압축되는 보충물.
  23. 제16항에 있어서, 약 5,000 내지 10,000 psi의 압력에서 압축되는 보충물.
  24. 제16항에 있어서, 10,000 psi 이상의 압력에서 압축되는 보충물.
  25. 제16항에 있어서, 하나 이상의 영양 보충물이 약 0.1 내지 약 75 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 보충물.
  26. 제16항에 있어서, 하나 이상의 영양 보충물이 갈락토즈, 만노즈, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 보충물.
  27. 제16항에 있어서, 하나 이상의 영양 보충물이 약 1 내지 약 10 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 보충물.
  28. 제16항에 있어서, 항산화제가 분리되고 정제된 소유성 산소 라디칼 제거제 및 분리되고 정제된 친유성 산소 라디칼 제거제를 포함하고, 결합된 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제가 6,000 μMol Trolox 등가물 (TE)/g 이상의 산소 라디칼 제거제 값을 갖는 보충물.
  29. 제28항에 있어서, 소유성 산소 라디칼 제거제가 알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타, 에타, 크사이 1, 크사이 2 및 시그마 토코페롤, 및 알파, 베타, 델타 및 감마 토코트리에놀, 이의 유사체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 비타민 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보충물.
  30. 제28항에 있어서, 친유성 산소 라디칼 제거제가 플라보놀, 케르세틴, 캄페롤, 미리세틴, 아피게닌 및 이의 유도체, 유사체, 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보충물.
  31. 제16항에 있어서, 장쇄 다당류가 약 2 내지 50,000개의 단량체를 포함하는 보충물.
  32. 제16항에 있어서, 장쇄 다당류가 약 200 내지 50,000개의 단량체를 포함하는 보충물.
  33. 제16항에 있어서, 장쇄 다당류가 약 2,000 내지 50,000개의 단량체를 포함하는 보충물.
  34. 제28항에 있어서, 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제가 환자에게 제공된 경우 ORAC(β-PE)에 의해 측정시 환자의 기준 항산화제 수준으로부터 13 % 이상의 증가를 제공하는 보충물.
  35. 제28항에 있어서, 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제가 보충물의 약 1 내지 30 중량 퍼센트를 차지하는 보충물.
  36. 영양상 유효량의 하나 이상의 분리되고 정제된 장쇄 다당류, 하나 이상의 친 유성 항산화제 및 하나 이상의 소유성 항산화제를 포함하고, 5,000 psi 이상의 압력에서 롤러 압축되는 방출 조절된 식사 보충물.
  37. 제36항에 있어서, 결합된 소유성 및 친유성 항산화제가 6,000 μMol Trolox 등가물 (TE)/g 이상의 용존 산소 값을 갖는 보충물.
  38. 제36항에 있어서, 장쇄 다당류가 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무, 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검, 실리움, 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄, 락토즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터 선택되는 하나 이상의 그룹으로부터 선택되는 보충물.
  39. 제36항에 있어서, 장쇄 다당류가 약 1 내지 약 10 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 보충물.
  40. 하나 이상의 장쇄 다당류, 및 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 당류, 허브 추출물, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 영양상 유효량의 하나 이상의 영양 보충물을 혼합하고, 보충물을 2,000 psi 이상의 압력에서 압축하는 단계를 포함하는, 방출 조절된 식사 보충물의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 보충물을 외용 캡슐, 식물성 캡슐 또는 경질 젤라틴 캡슐에 넣는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 약 85 %의 영양 보충물이 약 1 내지 약 8시간에서 방출되는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 약 85 %의 영양 보충물이 약 2 내지 약 6시간에서 방출되는 방법.
  44. 제40항에 있어서, 보충물이 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제40항에 있어서, 장쇄 다당류가 갈락토즈, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코즈, 만노즈, 아세틸화-만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈 또는 이의 배합물로부터 선택되는 방법.
  46. 제40항에 있어서, 보충물이 약 2,000 내지 10,000 psi의 압력에서 압축되는 방법.
  47. 제40항에 있어서, 보충물이 약 5,000 내지 10,000 psi의 압력에서 압축되는 방법.
  48. 제40항에 있어서, 보충물이 10,000 psi 이상의 압력에서 압축되는 방법.
  49. 제40항에 있어서, 압축이 롤러 압축에 의한 방법.
  50. 제40항에 있어서, 하나 이상의 장쇄 다당류가 약 0.1 내지 약 75 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 방법.
  51. 제40항에 있어서, 하나 이상의 장쇄 다당류가 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무, 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검, 실리움, 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄 락토즈, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택되는 방법.
  52. 제40항에 있어서, 하나 이상의 장쇄 다당류가 약 1 내지 약 10 중량 퍼센트의 각각의 분리되고 정제된 갈락토즈, 글루코즈, 만노즈, N-아세틸뉴라민산, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및 자일로즈를 포함하는 방법.
  53. 제40항에 있어서, 항산화제가 분리되고 정제된 소유성 산소 라디칼 제거제 및 분리되고 정제된 친유성 산소 라디칼 제거제를 포함하고, 결합된 소유성 및 친유성 산소 라디칼 제거제가 6,000 μMol Trolox 등가물 (TE)/g 이상의 산소 라디칼 제거제 값을 갖는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 소유성 산소 라디칼 제거제가 알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타, 에타, 크사이 1, 크사이 2 및 시그마 토코페롤, 및 알파, 베타, 델타 및 감마 토코트리에놀, 이의 유사체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 비타민 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  55. 제53항에 있어서, 친유성 산소 라디칼 제거제가 플라보놀, 케르세틴, 캄페롤, 미리세틴, 아피게닌 및 이의 유도체, 유사체, 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  56. 영양상 유효량의 검 트라가칸트, 구아 검, 곡물 가루, 쌀 가루, 사탕수수, 사탕무, 감자, 밀크, 한천, 알긴, 로커스트 빈 검, 실리움, 카라야 검, 씨드 검, 낙엽송 추출물, 알로에 베라 추출물, 검 가티, 전분, 셀룰로즈, 분해된 셀룰로즈, 과당, 고과당 옥수수 시럽, 펙틴, 키틴, 아카시아, 검 아라빅, 알긴산, 카라기난, 덱스트란, 크산탄 검, 콘드로이틴 술페이트, 수크로즈, 아세틸화 폴리만노즈, 말토즈, 글루칸, 렌티난, 만난, 레반, 헤미셀룰로즈, 이눌린, 프럭탄, 락토즈 및 이의 혼합물 또는 배합물로부터의 하나 이상의 분리되고 정제된 다당류; 및 항산화제, 비타민, 무기물, 아미노산, 핵산, 이의 혼합물 및 배합물로부터 선택된 하나 이상의 영양 보충물을 포함하고, 다당류 및 영양 보충물이 2,000 psi 이상의 압력에서 롤러 압축되는 방출 조절된 식사 보충물.
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