KR20070106822A

KR20070106822A - (-)카테친을 함유하는 아디포넥틴 발현 증강제

Info

Publication number: KR20070106822A
Application number: KR1020060039138A
Authority: KR
Inventors: 조시영; 박필준; 신현정; 김영경; 신동욱; 신의석; 이형호; 이병곤; 백주현; 이태룡
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2006-05-01
Filing date: 2006-05-01
Publication date: 2007-11-06
Also published as: KR101558231B1; WO2007126293A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 (-)카테친을 함유하는 아디포넥틴 발현 증강제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제제는 녹차의 한 성분인 (-)카테친에 의해 아디포넥틴의 발현을 증가시켜 당뇨병, 동맥경화, 비만 등의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

Description

(-)카테친을 함유하는 아디포넥틴 발현 증강제 {ADIPONECTIN EXPRESSION ENHANCER CONTAINING (-)CATECHIN}

도 1은 15가지 녹차 성분들의 아디포넥틴 발현 증가정도를 비교하여 나타낸 것이고,

도 2는 (-)카테친의 농도에 따른 아디포넥틴 발현증가 정도를 나타낸 것이고,

도 3은 (-)카테친의 농도에 따른 지방세포의 당 흡수 정도를 나타낸 것이며,

도 4는 지방세포에서 (-)카테친 처리에 의한 KLF7의 발현억제를 나타낸 것이다.

본 발명은 녹차의 한 성분인 (-)카테친을 함유하는 아디포넥틴 발현 증강제에 관한 것이다.

녹차는 예전부터 항비만, 항당뇨, 항염증, 항산화 등의 다양한 효능을 가지 고 있다고 알려져 있다. 예컨대, 녹차추출물을 비만이 유도된 쥐에게 주입했을 때 혈액내 당과 인슐린의 농도가 떨어졌으며, 지방세포에서 당대사가 증가되었다는 보고가 있다 (참조: Endocrinology 2000, 141, 980-987; J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 849-852). 또한, 일본에서는 임상 테스트를 통하여 당뇨병 환자에게 하루 5잔 정도의 녹차(480mg의 카테친 함유)를 마시게 한 결과, 혈당이 반으로 떨어지는 것을 확인하였다는 보고가 있다. 그러나, 아직까지 녹차의 어떤 성분이 당뇨병 예방에 효과가 있는지 등에 대한 구체적인 연구결과는 없다.

한편, 아디포넥틴(adiponectin)은 지방세포에서 분비되는 대표적인 아디포카인(adipokine) 중 하나로서, 항비만작용, 항당뇨작용, 항동맥경화작용 및 활성산소생성의 억제작용을 하는 것으로 보고되어 있다 (참조: Clin Nutr. 2004 Oct.; 23(5):963-74, Adiponectin, the missing link in insulin resistance and obesity). 즉, 아디포넥틴은 인슐린 감수성을 증가시켜 혈당을 낮춤으로써 당뇨병을 예방하는 역할을 수행할 뿐만 아니라, 간과 근육에 작용하여 AMP 키나아제의 활성을 높임으로써 지방산 산화를 촉진하고 지방합성을 저해하는 항비만 효능을 나타낸다.

이러한 아디포넥틴은 지방세포가 분화되면서 발현이 증가하는 단백질로서 PPAR(peroxisome proliferator activated receptor)-γ, C/EBP(CCAAT/enhancer binding protein)-α, SREBP(sterol regulatory element binding protein)-1c, 간 수용체(liver receptor) homolog-1, KLF7(Kruppel-like factor 7) 등의 전사인자들에 의해서 조절된다. 특히, KLF7은 징크 핑거 단백질(zinc finger protein)로서 2 형 당뇨병과 매우 밀접한 관련이 있고, 또한, 거의 모든 조직에서 발현되는 것으로서, 지방세포의 분화 및 아디포넥틴 등의 분비를 억제하며, 췌장 세포에서 인슐린 분비를 억제하여 당뇨병을 유발하는 것으로 알려져 있다 (참조: Molecular Endocrinololy 2005. 8).

아디포넥틴의 발현 조절제와 관련하여, 한국 특허공개 제2005-95411호에서는 한국산 조의 단백질 농축물을 유효성분으로 하여 혈중 아디포넥틴의 농도를 상승시키는 제2형 당뇨병 치료용 조성물에 대해 개시한 바 있으며, 한국 특허공개 제2005-115874호에서는 시아니딘 화합물을 유효성분으로 하는 아디포넥틴 발현촉진제에 대해 개시한 바 있으나, 아직까지 녹차의 카테친 성분을 유효성분으로 한 아디포넥틴 발현 촉진제에 대한 연구결과는 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 녹차의 카테친 성분에 대해서 예의 연구한 결과, 여러 가지 녹차 성분 중 (-)카테친이 지방세포에 24시간 처리할 경우 아디포넥틴의 발현을 현저히 증가시키는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병, 동맥경화, 비만 등의 치료 및 예방에 효과적인, (-)카테친-함유 아디포넥틴 발현 증강제를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 1의 (-)카테친을 함유하는 아디포 넥틴 발현 증강제를 제공한다:

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 아디포넥틴 발현 증강제의 유효성분인 (-)카테친은 IUPAC 화학명이 (2R,3R)-2-(3,4-다이하이드록시페닐)크로만-3,5,7-트라이올이며, 녹차(Camellia sinensis), 큰등골짚신나무(Agrimonia eupatolia L.) 등으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, (-)카테친은 녹차를 100% 아세토나이트릴 용액중에 침지한 후, 100℃에서 2시간 동안 가열하여 분류시키는 추출 공정을 통해 얻을 수 있다.

(-)카테친은 포유류에 투여시에 아디포넥틴의 발현 및 당 흡수를 촉진시킨다. 예컨대, (-)카테친을 유효한 농도로 쥐의 지방세포주인 3T3-L1에 24시간 동안 처리할 경우, 처리하지 않은 세포에 비해 아디포넥틴의 발현은 약 2배, 당 흡수는 약 4배 정도 증가한다.

이러한 (-)카테친에 의한 아디포넥틴의 발현 촉진은 당뇨병 감수성과 관계가 깊은 KLF7이라는 전사인자의 억제에 의한 것이다. 즉, KLF7은 췌장에서 인슐린의 합성을 저해하고, 지방세포의 분화를 억제함으로서 당뇨병을 유발한다고 알려져 있는데, 녹차의 (-)카테친 성분이 아디포넥틴 발현의 억제인자로 작용하는 KLF7의 발현을 억제함으로써 아디포넥틴의 발현을 증가시켜 인슐린 감수성을 증가시키는 것 이다.

따라서, (-)카테친을 함유하는 본 발명의 아디포넥틴 발현 증강제는 아디포넥틴의 발현과 관련된 당뇨병, 동맥경화, 비만 등의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 (-)카테친-함유 아디포넥틴 발현 증강제를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병, 동맥경화, 비만 등의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 (-)카테친을 조성물의 총중량을 기준으로 0.01 내지 30 중량%, 바람직하게는 1 내지 15 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 다양한 경로를 통해 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있으며, 담체, 희석제 또는 부형제 등 약학적으로 허용가능한 첨가제를 함께 사용하여 제형화될 수 있다. 이때, 사용가능한 적합한 담체, 희석제 또는 부형제의 실례로는 전분, 당, 및 마니톨과 같은 부형제; 칼슘 포스페이트 및 규산 유도체와 같은 충전제 및 증량제; 카르복시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제; 활석, 스테아린산 칼슘 또는 마그네슘, 수소화 피마자유, 및 고상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제; 포비돈, 나트륨 크로스카멜로스, 및 크로스포비돈과 같은 붕해제; 폴리소르베이트, 세틸 (cetyl) 알코올, 및 글리세롤 모노스테아레이트 등과 같은 계면활성제 등을 들 수 있다.

유효성분으로서의 (-)카테친은 사람을 포함하는 포유동물에 대해, 하루에 0.1 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 20 ㎎/㎏ 체중의 양으로 1회 또는 분할하여 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참조예 1: 녹차로부터 (-)카테친의 분리

녹차잎 20g을 100% 아세토나이트릴 용액 400㎖중에 침지시키고, 100℃에서 2시간 동안 가열 및 분류에 의해 (-)카테친을 추출한 후, 정제 및 감압 농축 과정을 거쳐 (-)카테친 추출액을 수득하였다.

실시예 1: 지방세포에서 (-)카테친 처리에 의한 아디포넥틴의 발현 증가

단계 1 : 지방세포의 세포 분화

쥐의 미분화지방세포 3T3-L1 (ATCC: CL173)을 10% 우혈청이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038) 배지에서 이틀에 한번씩 배지를 교환하면서 70% 융합할 때까지 10% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이어서, 상기 세포를 10% 우태아 혈청, 0.5mM 3-아이소부틸-1-메틸잔틴(Sigma), 1μM 덱사메타손(Sigma), 및 167 nM 인슐린 (Novo-Nordisk)을 포함한 배지에서 48시간 배양한 후, 그 배지를 10% 우태아 혈청 및 167 nM 인슐린을 포함한 DMEM 배지로 교환하여 다시 48시간 배양하였다. 마지막으로, 10% 우태아 혈청만을 포함한 배지에서 48시간을 더 배양하여 분화된 지방세포를 수득하였다.

단계 2 : 녹차 성분들의 처리에 의한 아디포넥틴의 발현 증가

단계 1에서 얻은 분화된 지방세포를 5% 무지방산 우혈청이 포함된 배지에서 16시간 배양하고, 다음날 PBS로 3회 세척한 후, 15가지의 녹차 성분들을 100μM 농도로 각각 처리하였다. 이때, 녹차 성분들은 DMSO에 녹여서 항상 배지의 1/1000 (V/V) 농도가 되도록 하였다. 24시간 동안 반응시킨 후, 배지를 수거하여 10,000배 희석하고, 마우스 아디포넥틴 퀀티킨 킷(mouse adiponectin quantikine kit: R&D system)를 이용하여 발현된 아디포넥틴의 양을 측정하였다. 대조군으로서 (-)카테친 처리없이 동일한 양의 DMSO만을 처리한 세포를 사용하였으며, 이의 아디포넥틴 발현량을 1로 하였을때, (-)카테친 및 비교성분으로서 기존의 제2형 당뇨병 치료제인 피오글리타존(시그마)을 처리한 세포의 상대적인 아디포넥틴 발현량을 산출하여 도 1에 나타내었다.

도 1로부터, 녹차의 여러가지 성분 중에서 유일하게 (-)카테친 성분이 피오글리타존과 균등한 수준의 아디포넥틴 발현정도를 나타낸 반면에, 다른 카테친류 성분들((-)에피갈로카테친 갈레이트(EGCG), (-)에피갈로카테친(EGC), (+)에피카테친(EC), (-)갈로카테친 갈레이트(GCG), (-)갈로카테친(GC), (-)카테친 갈레이트(CG) 및 (+)카테친(C)) 및 기타 성분들(쿼테친, 갈릭산, 테오브로민, 테오필린 및 테아닌)은 아디포넥틴을 발현시키지 못했음을 알 수 있다.

실시예 2: 지방세포에서 (-)카테친 처리에 의한 아디포넥틴의 발현 증가

상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 공정으로 얻은 분화된 지방세포를 5% 무지방산 우혈청이 포함된 배지에서 16시간 배양하고, 다음날 PBS로 3회 세척한 후, 10, 100 및 1000μM 농도의 (-)카테친으로 각각 처리하였다. 이때, (-)카테친은 DMSO에 녹여서 항상 배지의 1/1000 (V/V) 농도가 되도록 하였다. 24시간 동안 반응시킨 후, 배지를 수거하여 10,000배 희석하고, 마우스 아디포넥틴 퀀티킨 킷(mouse adiponectin quantikine kit: R&D system)를 이용하여 발현된 아디포넥틴의 양을 측정하였다. 대조군으로서 (-)카테친 처리없이 동일한 양의 DMSO만을 처리한 세포를 사용하였으며, 이의 아디포넥틴 발현량을 1로 하였을때, (-)카테친 및 비교성분으로서 기존의 제2형 당뇨병 치료제인 피오글리타존(시그마)을 처리한 세포의 상대적인 아디포넥틴 발현량을 산출하여 도 1에 나타내었다.

도 2로부터, (-)카테친을 처리한 세포에서 대조군에 비해 아디포넥틴의 발현이 증가하였음을 알 수 있으며, 특히 (-)카테친의 농도가 50μM 및 100μM인 경우에는 약 2배 정도 증가하였다. 한편, 1000μM의 (-)카테친 농도에서는 아디포넥틴의 발현 정도가 감소하였는데, 이는 (-)카테친의 경우 500μM 이상의 농도에서는 자체 독성이 증가함에 따른 결과인 것으로 고려된다.

실시예 3: 지방세포에서 (-)카테친 처리에 의한 당 흡수 증진

상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 공정으로 얻은 분화된 지방세포를 0.5% 무 지방산 우혈청이 포함된 배지에서 16시간 배양하고, 다음날 PBS로 3회 세척한 후, HEPES 완충액 (20mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM KCl, 2.5mM MgCl₂, 1mM CaCl₂)(pH 7.4)중에서 5, 10, 50, 100 및 1000μM 농도의 (-)카테친으로 각각 처리하여 24시간 동안 반응시켰다. 이때, (-)카테친은 DMSO에 녹여서 항상 배지의 1/1000 (V/V) 농도가 되도록 하였다. 다음날, 배지를 버리고, 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 2μCi/ml의 10μM 2-데옥시-D-[¹⁴C] 글루코스를 넣고 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 빙냉 PBS로 3회 세척하고, 10% SDS로 용해시킨 후, 흡수된 당의 양을 액체 섬광 계수기로 측정하였다. 대조군으로서 (-)카테친을 처리하지 않은 세포를 사용하였으며, 이의 당 흡수량을 1로 하였을 때 (-)카테친을 처리한 세포의 상대적인 당 흡수량을 산출하여 도 3에 나타내었다.

도 3으로부터, (-)카테친을 처리한 세포가 대조군에 비해 당 흡수율이 증가하였음을 알 수 있으며, 특히 (-)카테친의 농도가 100μM인 경우에는 약 4배 정도 증가하였다. 한편, 1000μM의 (-)카테친 농도에서는 당 흡수율이 감소하였는데, 이는 (-)카테친의 경우 500μM 이상의 농도에서는 자체 독성이 증가함에 따른 결과인 것으로 고려된다.

실시예 4: 지방세포에의 (-)카테친 처리에 의한 KLF7 발현 억제 평가

상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 공정으로 얻은 분화된 지방세포를 5% 무지방산 우혈청이 포함된 배지에서 16시간 배양한 다음, 다음날 PBS로 3회 세척한 후, 50μM 농도의 (-)카테친으로 각각 처리하였다. 이때, (-)카테친은 DMSO에 녹여서 항상 배지에 대해 1/1000 (V/V)의 농도가 되도록 하였다. 24시간 후, 상기 세포를 PBS로 세척하고, 8M 우레아, 2% CHAPS(3-[(3-chloramidopropyl) dimethylammonio]-1-propane-sulfonate), 50mM DTT(dithiothreitol), 2M 티오우레아, 2mM PMSF(phenyl methane sulfonyl fluoride), 100㎍/㎕ 류펩틴(leupeptine)을 포함하는 단백질 추출 완충용액 200㎕로 처리한 후, 10분 동안 상온에서 방치하였다. 그 후, 4℃에서 10분 동안 15,000g의 중력가속도로 원심분리를 수행하여, 상층액을 수거한 후, 바이오-래드 단백질 염료 시약(BIO-Rad Protein Dye Reagent^TM)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 100g의 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리하고, 50V로 12시간 동안 PDF(BioRad)막에 블로팅하였다. 이러한 블롯을 5% 탈지 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹시킨 후, 일차 항체로서 안티-PPAR-γ(Upstate), 안티-C/EBP-α(Cell signaling), 안티-KLF7 (Abnova Corporation)와 안티-β-액틴(actin)을 사용하였고, 이차 항체로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase)가 결합된 항체(애머샴바이오사이언스)를 반응시킨 다음, ECL(enhanced chemiluminescence) 키트(애머샴바이오사이언스)를 이용하여 발색시켰다.

반응시킨 블롯을 X선 후지 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 필름 상의 밴드를 파워룩(PowerLook) 2100 XL (Umax)으로 스캐닝한 후, 이미지마스터(ImageMaster) 2D 엘라이트(Elite) (Amersham Bioscience) 이미지 분석프로그램을 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 한편, 비 교군으로서 (-)카테친 대신 기존의 제2형 당뇨병 치료제인 피오글리타존(아디포넥틴의 발현을 증가시킨다고 알려져 있음)을 이용하여 동일한 공정을 수행하였다.

도 4로부터, (-)카테친을 처리한 세포(3)는 비처리 세포(1)와 비교하여, PPAR-γ 및 C/EBP-α의 발현은 차이가 없으나, KLF7의 경우 발현정도가 현저히 감소함을 알 수 있다. 한편, 피오글리타존 처리 세포(2)는 비처리 세포(1)에 비해 PPAR-γ의 발현이 증가하였다. 즉, 아디포넥틴의 발현에 있어서, (-)카테친의 경우 KLF7의 발현 감소에 의한 것인 반면, 피오글리타존은 PPAR-γ의 발현 증가에 의한 것임을 나타내는 것이다.

제조예 1: (-)카테친을 포함하는 약학적 제제의 제조

상기 참조예 1에서 얻은 (-) 카테친 추출액 120mg, 미정질 셀룰로오스 33mg, 인산일수소칼슘 33mg, 나트륨 전분글리콜레이트 12mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 이 혼합물을 통상적인 정제 제조기를 사용하여 타정함으로써 (-)카테친 함유 정제를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 (-)카테친-함유 아디포넥틴 발현 증강제는 지방세포에서 아디포넥틴의 발현을 증가시키므로 당뇨병, 동맥경화, 비만 등의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 (-)카테친을 함유하는 아디포넥틴 발현 증강제:

화학식 1
제1항에 있어서,

지방세포의 당 흡수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 아디포넥틴 발현 증강제.
제1항에 있어서,

지방세포에서 KLF7(Kruppel-like factor 7) 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 아디포넥틴 발현 증강제.
하기 화학식 1의 (-)카테친을 함유하는 KLF7(Kruppel-like factor 7) 단백질 발현 억제제:

화학식 1
제4항에 있어서,

지방세포의 당 흡수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, KLF7 단백질 발현 억제제.
제1항의 아디포넥틴 발현 증강제를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병, 동맥경화 또는 비만의 치료 또는 예방용 조성물.