KR20070104596A - 크립테코디늄 속으로 부터의 항산화 추출물의 생산 및 용도 - Google Patents

크립테코디늄 속으로 부터의 항산화 추출물의 생산 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Crypthecodinium으로 부터의 항산화 추출물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 불포화 지방산 및/또는 하나 이상의 불포화 지방산 에스테르와, 본 발명에 따른 하나 이상의 추출물과 Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스의 성분을 포함하는 지방산 조성물 및 상기 지방산 조성물의 제조 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
Crypthecodinium sp., 지방산 조성물, 항산화 추출물

Description

크립테코디늄 속으로 부터의 항산화 추출물의 생산 및 용도{Production and use of an antioxidant extract from Crypthecodinium sp.}
본 발명은 크립테코디늄 속(Crypthecodinium sp.)의 추출물, 그 생산방법 및 용도, 특히 한 개 또는 그 이상의 긴 체인 다중 불포화 지방산 및/또는 한 개 또는 그 이상의 긴 체인 다중불포화 지방산 에스테르를 포함하는 지방산 조성물의 항산화성 안정화를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
긴 체인 다중 불포화 지방산(PUFAs)은 인간의 대사작용에 필수적인 지방산이다. PUFAs는 리놀레인산에서부터 형성되는 ω-6 PUFAs 그룹과, 알파 리노레익산에서부터 만들어지는 ω-3 PUFAs의 두 그룹으로 크게 나뉜다.
PUFAs는 세포막, 망막, 뇌척수막 및 중요한 호르몬(예를 들어, 프로스타글란딘, 트롬복산 및 류코트리긴)의 전구체의 중요한 빌딩블록이다.
빌딩블록으로서의 기능 외에, 최근의 추이는 PUFAs가 인간 유기체 또는 질병에 직접적으로 다양한 유익한 효과를 갖는 것이 점점 더 발견되고 있다. 의학적 연구의 다수에서 PUFAs가 예를 들면, 암, 류머티즘 관절염, 고혈압 및 신경성 피부염과 많은 질병의 치료 또는 경감에 중요한 기여를 할 수 있는 것으로 알려졌다. 이들 연구에서는 도코사헥사노익산(DHC; all-cis-4,7,10,13,16,19- docosahexanoic acid)과 그 유도체, 특히 DHA 에스테르가 특히 유익하게 자주 사용되는데, 이는 그러한 에스테르(특히 에틸에스테르와 트리글리세라이드)가 좋은 맛과 소화기관에 쉽게 흡수되는 성질을 갖기 때문이다. 이런 결과는 국제기구와 정부에서 PUFAs의 일일 섭취량을 조절하는 권장 사항을 전달하는 사실의 원인이 되었다.
PUFAs는 인체 내에서 새로 합성되지 못하는데, 이는 >C9위치의 탄소체인으로의 이중 결합을 도입시킬 수 있는 효소 시스템이 부족하기 때문이다(△ 12-desaturase의 부족). 인간은 오직 식이 섭취를 통한 전구체 지방산(예를 들면, 알파-리놀레익산)의 제공을 통해 다중 불포화 지방산을 생산할 수 있다. 그러나, 이 양이 다중 불포화 지방산의 요구량에 충분한지에 대해 논쟁이 되고 있다.
필수 지방산의 대부분이 섭취를 통해 얻어진다. 특히 식물성 유지에는ω-6 지방산이 풍부하나(예를 들면, 달맞이꽃 기름은 감마 리놀레익산(GLA)를 포함한다) 오직 C18의 체인 길이 까지를 가지며, 어유와 미생물성 유지에는 ω-3 지방산 (예를 들어, 에이코사펜타네오산(EPA)과 도코사헥사노익산(DHA; all-cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid)이 함유된 연어유)이 풍부하다.
원래, 어유와 미생물에서 얻어진 유지가 다중 불포화 지방산의 유일한 상업적 출처이다. 그러나 일반적으로, 원하는 PUFAs의 양은 너무 적고, 혼합물로서 존재하여 반대의 기능을 하는 PUFAs가 존재 할 수 있다. 때문에 PUFAs의 일일 투여량을 소비하기 위해서는 많은 양의 기름을 섭취하여야 한다. 특히, 이는 많은 양의 PUFA를 복용하여야 하는 환자에게 적용된다(예를 들어, 낭포성 섬유증과 같은 경우). 가능한 목적하는 바대로 개개의 PUFAs의 효능을 얻기 위해서는 고농도 또는 고순도의 PUFAs가 사용되어야 한다. 따라서, 선행 기술에서는 고순도의 PUFAs에 대한 큰 요구가 있었다.
많은 방법들이 다양한 자연 출처로부터 특정 지방산과 다양한 그들의 유도체를 분리 (또는 적어도 농축)하고 회수하기 위해 개별적으로 또는 조합하여 사용되어왔다. 이러한 방법으로는 낮은 온도에서의 분별 결정화, 분자 증류, 우레아(urea) 부가물 결정화, 금속염 용액을 사용한 추출, 역류 컬럼을 사용한 초임계 액체 분획법 및 HPLC법이 있다.
산화에 대한 민감성 때문에, PUFAs는 일반적으로 적합한 항산화제를 추가하며 안정화 시켜야만 한다. 상업적으로는, 이러한 목적을 위해, 천연 토코페롤, 특히, 콩유에서 추출한 α-, β-, γ-, δ- 토코페롤 및/또는 토코트리에놀의 혼합물을 사용한다. 또한, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트와 같은 일부 화합물이 상승적으로 작용할 수 있다고 알려져있다. 따라서 이들을 토코페롤에 추가하여 사용한다.
그러나, 천연 항산화제의 효과는 농도를 증가시킴에 따라 비 제한적으로 증가하지는 않는다. 예를 들어, α-토코페롤의 경우, 활성은 100ppm 정도에서 역전되며, 산화 촉진이 일어난다. 이것은 과잉 투여가 반대의 결과를 가질 수도 있음을 보여준다.
대안적으로, 특허 WO03092628은 순한 조건 하에서 점점 나아지는 기름의 사용을 제시하였다. 이 경우 상기 조제물은 다중 불포화 지방산을 함유하는 바이오 메스를 먼저 효소와 반응시킨 후 지질을 분리하는 방법을 통해 제조되어야 한다. 비록 본 방법을 통해 얻게 되는 유지는 보기에는 크게 산화되지 않을 것처럼 보이지만, 그럼에도 불구하고 다중 불포화 지방산의 산화성에 민감성을 보인다.
이런 현실에서, 본 발명은 지방산 조성물의 증진된 항산화 안정화에 대한 가능성을 나타내기 위한 것이다. 이런 경우 항산화 활성의 증가는 조건 없이 식품분야에 지방산 조성물을 적용할 수 있도록 건강에 위해한 물질의 첨가 없이 가능한 한 많이 이루어져야 한다.
더 나아가, 본 발명은 대량으로 저렴하게 가능한 한 간단한 방법으로 생산할 수 있는 지방산 조성물의 생산 방법을 특정하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 지방산 조성물의 적용이 특히 유용한 분야를 나타내었다. 비록 명쾌하게 언급되진 않았지만, 여기 기술된 내용 및 이로부터의 결과로부터 명백한 이들 및 다른 목적들은 Crypthecodinium sp.로 부터의 항산화 추출물에 의해 달성된다.
본 발명에 따른 추출물의 적절한 변형은 청구항 1에 따른 종속항들에 설명되어 있다. 청구항 11 내지 19는 보호 범위아래에서 항산화 안정화된 지방산 조성물에 대한 것이다. 방법 청구항은 본 발명에 따른 지방산 조성물 생산의 적합한 방법을 보호하며, 용도 청구항은 본 발명에 따른 지방산 조성물의 유용한 적용 범위를 기술한다.
Crypthecodinium sp.의 항산화 추출물을 제공함으로써, 쉽게 예측할 수 없는 방법으로 특히 고 항산화능을 갖는 추출물을 성공적으로 얻을 수 있는데, 상기 추출물은 지방산 조성물, 특히, 적어도 하나의 불포화 지방산 및/또는 적어도 하나의 불포화 지방산 에스테르를 포함하는 지방산 조성물의 안정화에 적합하다. 이 경우, 본 발명에 따라 건강에 위해를 주는 물질을 첨가하지 않고 항산화능의 증가를 달성할 수 있는 바, 이는 본 발명에 따른 지방산 조성물을 걱정없이 식품 분야에 사용할 수 있음을 의미하는 것이다. 예를 들어, Crypthecodinium cohnii 기름은 이미 유아 급식에 사용되고 있으며, 미국에서는 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되어 있다.
본 발명에 따른 지방산 조성물은 저렴한 비용으로 대량 생산이 가능하며 간단한 방법을 통해 생산이 될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 지방산 조성물은 Crypthecodinium sp., 바람직하게는 Crypthecodinium cohnii로 부터의 항산화 추출물을 적어도 한가지 이상 포함한다.
본 발명에서 "지방산 조성물"은 자유 지방산을 포함하는 조성물뿐 아니라 지방산 유도체 조성물, 바람직하게는 지방산 에스테르, 특히 지방산 트리글리세라이드를 포함하는 조성물도 포함하며, 이 때 상기 지방산 라디칼은 기본적으로 동일하거나 다를 수 있다.
본 발명에 따른 지방산은 지방족 카복실산을 나타내며, 이는 포화되거나 단순 불포화 또는 다중 불포화 될 수 있으며, 적절하게는 6개에서 30개의 탄소원자를 갖는 것이다.
Crypthecodinium sp.에서 얻을 수 있는 추출물은 그 자체로 알려져 있다. 본 발명에 따라 Crypthecodinium sp. 야생주의 추출물 뿐 아니라 변이 또는 재조합 Crypthecodinium sp. 균주의 추출물도 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "Crythecodinium sp. 에서의 추출물"은 Crypthecodinium sp.의 바이오메스(biomass), 바람직하게는 유지를 용매, 바람직하게는 유기 및/또는 초임계 용매, 특히 유기용매를 이용하여 추출함으로써 얻을 수 있다. 혼합 용매 또한 사용 가능하다.
본 발명에 따른 추출물은 추출물을 얻을 수 있는 바이오메스보다 큰 항산화능을 갖는다. 따라서, 바람직하게 그것은 원래 사용되던 것, 바람직하게 금방 분리되어 그로부터 추출물을 얻을 수 있는 바이오메스보다 작은 과산화물 값을 가지며, 바람직하게는 추출물을 얻을 수 있는 바이오메스의 과산화물 값의 최대 50.0%, 더 바람직하게는 25.0%, 적절하게는 최대 10.0%, 특히 최대 1%의 값을 갖는다. 이 경우 과산화물 값은 바람직하게 AOCS Official Method Cd-3d 63(American Oil chemists Society)에서 특정된 바에 따라, 적절하게는 2주간의 오픈스토리지(open storage) 후에 결정된다.
본 발명에 따른 추출물의 항산화력은 바람직하게는 15000 Trolox 당량 이상이어야 하며, 좀 더 바람직하게는 20000 Trolox 당량 이상이며, 특히 바람직하게는 30000 Trolox 당량, 더욱 특히 35000 Trolox 당량(ul/ml) 이상이다. Troloxⓡ는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카복시산의 상품명으로 일반적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 "생물체의 바이오메스"는 생물체의 전체 세포뿐 아니라 생물체의 개개의 세포의 성분들을 포함한다.
Crypthecodinium sp.의 추출물은 미생물을 배양하고, 배양물로부터 바이오메스를 수확하며, 그것을 분해하고 추출물을 분리하여 적절히 얻어진다.
추출물의 분리를 위해, 헥산과 같은 유기용제 또는 초임계 액체를 이용한 추출 방법을 이용한다. 유기용제를 사용한 추출법은 특히 이 경우에 적합하다.
일반적으로, 추출물은 헥산을 이용한 건조 바이오메스의 여과를 통해 바이오메스로부터 추출된다. 이와 같은 유기용제를 사용한 추출은 WO 9737032, WO 9743362 및 EP 515460에서 설명되었다. 특히, 광범위한 설명은 "Biotechnological Processes for the Production of PUFAs"에서 잘 설명되어있다(Journal of Dispersion Science and Technology, 10l, 561-569, 1989).
대안으로, 추출은 용매가 없이도 진행될 수 있다. 이에 대한 특히 적절한 방법이 EP-A-1178118에 기술되어 있다. 이 방법에서는 바이오메스의 수성 현탁액을 제조하고, 원심 분리를 통해 물층으로 부터 오일층을 분리하는 것을 통해 용매의 사용을 피했다.
본 발명의 특히 적절한 변형에 따르면, 추출물은 Crypthecodinium sp.으로부터의 바이오메스의 순수기계 압축과, 이어지는 적어도 하나의 유기용제 또는 적어도 하나의 초임계 용매, 바람직하게는 유기용제, 더욱 바람직하게는 헥산을 이용한 추출물에 의해 얻었다.
본 발명의 또다른 적절한 변형에서는, 증류를 통해 추출물을 얻었다.
본 발명에서는 또한 바람직하게, 1~12개의 탄소원자, 바람직하게 1~6개의 탄소원자, 특히, 1~4개의 탄소원자를 갖는 지방족 알코올로 바이오메스를 에스테르 교환함이 특히 유리함을 증명하였다. 이 경우 메탄올과 에탄올, 특히 에탄올의 사용이 증명되었다. 에스테르교환 반응은 바람직하게 산촉매 작용하에서 진행되며, 특히, 황산 및/또는 염산을 사용한다. 보다 특히 바람직한 변형예에서는, 에스테르 교환반응은 효소적으로 이루어진다.
에스테르 교환된 바이오메스는 이후 1개 이상의 유기용제나 초임계 용매, 적절하게는 유기용제, 특히, 헥산으로 추출된다. 반응물의 부피(첨가된 물을 포함하여)에 대한 용매의 총 부피 비율은 넓은 범위에서 변할 수 있지만, 특히 바람직하게는 1:3 내지 4:3 이다.
특히 바람직한 양태에 따라, 혼합물은 마지막에 결합되는 대부분의 용매로 추출된다.
본 양태에서는, 위에서 설명된 것과 같이 에스테르 교환된 바이오메스와 같은 Crypthecodinium sp. 바이오메스의 헥산 추출물의 용도가 제공된다.
이 과정은 항산화 추출물의 농축과 정제에 사용된다. 일반적으로, 본 방법에 의해 농축되고 정제된 추출물은 그의 중량에 기초하여, 중량의 20.0% 이하, 바람직하게는 중량의 10.0%이하, 특히 중량의 5.0% 이하의 6~30개의 탄소원자를 갖는 지방산 및 6~30개의 탄소원자를 갖는 지방산 알킬 래디칼을 포함하는 지방산 에스테르를 함유한다.
추출 조성물은 광범위하게 변형될 수 있다. 본 발명의 첫 양태에서 Crypthecodinium sp.의 추출물은
ⅰ) Crypthecodinium sp.의 바이오메스를 비누화하고, 그리고
ⅱ) 25℃에서 물 1g당 0.1g 이하의 수용성을 가진 용매를 사용하여 비누화된 바이오메스를 추출함으로써 얻어진다.
바람직하게, 이 경우 DGF 방법 F-Ⅱ1(75)의 과정은 아래와 같다.
바이오메스는 원래 알려진 방법으로 비누화 될 수 있다. 이것은 알코올성 용액, 바람직하게는 메탄올성 및/또는 에탄올성 용액에서 적어도 하나 이상의 알칼리 금속 하이드록사이드, 바람직하게는 NaOH 및/또는 KOH, 특히 KOH와 바이오메스를 반응시키는 것이 증명된다.
비누화를 위한 특히 적합한 반응 온도는 25℃~100℃ 범위이다.
비누화된 생성 혼합물의 추출물은 광범위하게 변화가 가능하다. 적절한 변형에 따르면, 물이 혼합물에 가해지고 수용성이 물 1g당 0.1g 이하인 용매를 사용하여 25℃ 조건에서 추출이 이루어진다. 반응 물질의 부피(첨가되는 물을 포함하여)에 대한 용매의 부피 비율은 넓은 범위에서 변할 수 있으며, 특히 바람직하게는 1:3 내지 4:3이다.
특히 적절한 양태에서, 혼합물은 마지막에 조합되는 많은 용매부분에 의해 추출된다. 본 발명에 따라 특히 적합한 용매는 유기용제, 즉 디클로로메탄, 디에틸에테르, 메틸에틸케톤, 에틸아세테이트, 페트롤륨에테르, 펜탄 및 헥산과, 또한 초임계 용매 프로판, 부탄 및 유기용제, 특히, 디에틸에테르와 헥산, 특히, 디에틸에테르를 포함하는 이산화탄소를 포함한다.
남겨진 물은 추출 용매층으로부터, 예를 들어, 브라인(포화 염 용액)을 사용한 상기 층의 세척, 분자 여과기 및/또는 무수염(예를 들면, 황산나트륨이나 황산마그네슘)을 사용한 건조를 통해 제거될 수 있다.
추출 후에, 추출물은 바람직하게 용매를 부분적으로 또는 완전 증발시키는 것을 통해 농축된다.
본 발명의 적절한 양태에서, Crypthecodinium sp.로부터의 추출물은 Crypthecodinium sp.의 바이오메스에서 1~12개, 바람직하게는 1~6개, 특히 1~4개의 탄소원자를 가지는 알코올 및/또는 3~6개, 바람직하게는 3~4개의 탄소원자를 갖는 케톤을 사용하여 추출할 수 있다. 이 경우 알코올을 이용한 추출이 케톤을 이용한 추출보다 바람직하다. 특히 본 목적에 적합하며 경우에 따라 단독 또는 혼합물로 사용되는 알코올은 메탄올 및 에탄올이다.
특히 적절한 케톤은 아세톤 및/또는 메틸에틸케톤, 특히 아세톤을 포함한다.
본 양태에서는, 이후 알코올 및/또는 케톤을 사용한 반추출(counterextracted)로 추출될 바이오메스로서 Crypthecodinium sp.의 바이오메스의 헥산 추출물을 제공한다.
이 과정은 항산화제 추출물의 정제와 농축에 대한 것이다. 적절하게, 이 방법으로 추출되고 정제된다. 추출물은 그의 중량에 기초하여, 중량의 20%이하, 바람직하게는 중량의 10%이하, 특히, 중량의 5%이하의 6~30개의 탄소원자를 갖는 지방산 및 6~30개의 탄소원자를 갖는 지방산 알킬 라디칼을 포함하는 지방산 에스테르를 함유한다.
바이오메스의 부피에 대한 알코올 또는 케톤의 총 부피의 비율은 넓은 범위에서 다양하게 변화가 가능하지만 적절하게는 3:1 내지 3:4이다. 적절한 양태에 따라, 혼합물은 마지막에 조합되는 알코올 또는 케톤의 대부분에 의해 추출된다.
추출 이후, 추출물은 용매의 전체 혹은 부분 증발을 통해 바람직하게 농축된다.
본 방법을 통해 얻을 수 있는 추출물은 3~6개의 탄소원자를 갖는 케톤, 바람직하게는 아세톤 및/또는 메틸에틸케톤, 특히, 아세톤을 사용하여 다시 추출된다. 첫 번째 추출물의 부피에 대한 케톤의 총 부피비는 넓은 범위에서 변할 수 있지만 바람직하게는 3:1 내지 3:4이다. 특히 바람직한 양태에 따라, 첫번째 추출물은 마지막에 합해지는 케톤의 대부분을 사용하여 추출된다.
추출 후의 2번째 결과 추출물은 적절하게 전체 또는 부분적으로 용매를 증발시킴으로써 농축된다.
본 발명의 양태에서, 지방산 조성물은 또한 Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스 성분, 바람직하게는 Thraustochytiales의 바이오메스, 특히 Ulkenia sp.의 바이오메스를 더 포함한다. Crypthecodinium sp.와 상이한 바이오메스들은 그 자체로 알려져 있었다. 본 발명에 따라, 야생주의 바이오메스뿐 아니라 DHA(all-cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid) 및/또는 DPA(all-cis-4,7,10,13,19-docosapentaenoic acid)를 효율적으로 생산하는 변이 또는 재조합주의 바이오메스도 사용할 수 있다. 이러한 변이 또는 재조합주는 원래 야생주의 퍼센트와 비교하여 같은 기질을 사용하고 지방에 보다 높은 DHA 및/또는 DPA의 비율을 갖는 미생물, 및/또는 원래 야생주에 의한 생산량과 비교하여 같은 기질을 사용하고, 보다 높은 지질 총량을 함유하는 미생물을 포함한다.
본 발명의 양태에 따라, 본 발명에 따른 지방산 조성물은 Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스의 추출물을 포함한다. 이 경우 추출물은 일반적으로 그 미생물을 배양하고, 배양액에서 바이오메스를 수확하며, 그것을 분해하고 추출물을 분리하여 얻어진다. 본 맥락에서 특히 적절한 방법은 WO 03/033631 A1에 설명되어 있으며, 거기 기술된 사항은 참고문헌으로서 명백하게 본 명세서에 통합된다.
추출물을 분리하기 위해, 유기용매, 특히 헥산, 또는 초임계 액체를 사용한 추출 방법이 이용된다. 편의상, 추출물은 건조된 바이오메스를 헥산으로 여과하여 바이오메스로 부터 추출된다. 유기용제에 의한 이와 같은 추출은 WO 9743362와 EP 515460, 특히, WO 9737032에 설명되어있다. 특히, 광범위한 설명은 "Biotechnological Processes for the Production of PUFAs"에 잘 기술되어 있다(Journal of Dispersion Science and Technology, 10l, 561-569, 1989).
대안으로, 추출은 용매가 없이도 진행될 수 있다. 이에 대한 특히 적합한 방법이 EP-A-1178118에 설명되어 있다. 이 방법에서는 바이오메스의 수성 현탁액을 제조하고 원심 분리를 통해 물층에서 오일층을 분리하는 것을 통해 용매의 사용을 피했다.
본 발명의 적절한 변형에 따라, Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스의 순수 기계 압축과, 연이은 적어도 하나의 유기용제 또는 적어도 하나의 초임계 용매, 바람직하게는 유기용제, 더욱 바람직하게는 헥산을 이용한 추출에 의해 추출물을 얻었다.
본 발명에서, 바람직하게는 1~12개의 탄소원자, 바람직하게는 1~6개의 탄소원자, 특히, 1~4개의 탄소원자를 갖는 지방족 알콜로 바이오메스를 에스테르 교환함이 유리함을 증명하였다. 이 경우 메탄올과 에탄올, 특히 에탄올의 사용을 증명하였다. 에스테르 교환 반응은 바람직하게 산촉매, 특히, 황산 및/또는 염산 하에 진행된다. 에스테르 교환된 바이오메스는 이후 유기용제, 특히, 헥산으로 추출한다. 반응물(추가된 물 포함)의 부피에 대한 용매의 총 부피 비율은 넓은 범위 내에서 변화가 가능하지만, 특히 바람직하게는 1:3 내지 4:3 이다. 바람직한 양태에 따르면, 혼합물은 마지막에 결합되는 대부분의 용매로 추출된다.
바이오메스 조성물은 넓은 범위 내에서 다양화 될 수 있다. 바람직하게, Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스는 적어도 하나의 다중 불포화 지방산 및/또는 적어도 하나의 지방산 에스테르, 일반적으로는 지방산 알킬 에스테르, 바람직하게는 글리세라이드, 더욱 바람직하게는 트리글리세라이드를 가지며, 이는 바람직하게 6~30개의 탄소원자를 갖는 적어도 하나의 다중 불포화 지방산 라디칼을 포함한다. 특히 바람직한 양태에 따라, 바이오메스 내의 지방산 및/또는 지방산 라디칼의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 특히 바람직하게, 적어도 30%가 DHA 또는 DHA 라디칼이다.
본 발명에서 "글리세라이드"는, 글리세롤과도 적어도 하나의 지방산의 에스테르이며, 한개 또는 그 이상의 지방산 라디칼에 의해 글리세르의 1~3의 하이드록실 그룹이 에스테르화 되었다. 다수의 지방산 라디칼이 존재할 때, 지방산 라디칼은 같거나 다를 수 있다.
많은 적절한 개시물질에서, 글리세라이드의 대부분은 트리글리세라이드이며, 이것은 3개의 지방산 라디칼 및 글리세롤의 에스테르를 지칭한다. 이 경우 각 지방산 라디칼은 포화되거나(탄소 원자 사이의 모든 결합이 단일결합) 또는 불포화(적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합이 존재함을 의미함) 될 수 있다. 불포화 지방산 라디칼의 형태가 종종 ω로써 지정된다. 이 번호는 첫번째 이중결합의 위치에 번호를 부여하는데, 지방산 또는 지방산 라디칼의 말단 메틸그룹에서 부터 번호를 부여한다.
본 발명에 따른 지방산 조성물의 개별 성분들의 각각의 분획은 원칙적으로 자유롭게 선택하고 각각의 용도에 맞출 수 있다. 그러나 본 발명의 맥락에서, 각 상황에서 전체 중량을 기초로, 지방산 조성물 중량의 0.1~50.0%, 바람직하게는 중량의 0.1~25.0%, 더욱 바람직하게는 중량의 0.2~10.0%, 특히 바람직하게는, 중량의 0.5~5.0%의 Crypthecodinium sp.에서의 항산화 추출물을 포함하는 지방산 조성물과, 중량의 50.0~99.0%, 바람직하게는 중량의 75.0~99.0%, 더욱 바람직하게는 중량의 90.0~99.8%, 특히 바람직하게는, 중량의 95.0~99.5%의 Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스의 성분을 포함하는 지방산 조성물이 특히 바람직한 것을 발견하였으며, 이때 위에 언급된 상대 분획은 바람직하게 합해서 100.0 중량%가 되는 것이다.
본 발명에 따른 지방산 조성물은 상대적으로 높은 다중 불포화지방의 분획을 가지는데, 각 경우 그것의 총 중량에 기초하여, 바람직하게 적어도 10.0 중량%, 더 바람직하게는 25.0 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 50.0 중량%, 특히 바람직하게, 70 중량%의 도코사헥사노익산(all-cis-4.7.10.13,16,19-docosahexaenoic acid) 및/또는 도코사헥사노익산 알킬 에스테르(all-cis-1,7,10,13,16,19-도코사헥사노익산 및 알킬 에스테르), 바람직하게는 도코사헥사노익산, 도코사헥사노익산 메틸 에스테르 및/또는 도코사헥사노익산 에틸 에스테르를 포함한다.
본 발명에 따른 지방산 조성물은 종래의 안정화된 지방산 조성물과 비교하여 산화에 대한 높은 안정성에 의해 구분된다. 따라서, 이미 알려진 항산화제들, 예를 들면, α-, β-, γ- 및/또는 δ-토코페롤의 추가가 반드시 필요하지는 않다. 따라서 본 발명에 따른 지방산 조성물은 첫번째 양태에 따라, 추가의 항산화제를 포함하지 않는다.
그러나, 본 발명에 따른 지방산 조성물의 항산화제 활성이 항산화제의 추가적 첨가에 의해 증가되기 때문에, 본 발명의 특히 적절한 양태에 따른 지방산 조성물은 적어도 하나, 바람직하게는, 상승작용을 하는 항산화제, 바람직하게 적어도 하나의 토코페롤, α-, β-, γ- 및/또는 δ-토코페롤, 적절하게 α-, β-, γ- 및/또는 δ-토코페롤, 특히 α-, β-, γ- 및/또는 δ-토코페롤과 아스코르빌 팔미테이트를 포함하며, 이 성분의 상대적 비율은 각각의 경우 지방산 조성물의 총 중량에 기초하여, 중량의 0.01~5.0%, 특히 중량의 0.05~0.5%의 범위로 포함한다.
본 발명에 따른 지방산 조성물은 바람직하게는 상응하는 성분들의 혼합에 의한 그 자체로 공지인 방법으로 생산된다. 이런 경우, 바람직하게는 석유에테르, 헥산, 펜탄, 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 메틸에틸케톤, 디에틸에테르 및/또는 에틸아세테이트, 더 바람직하게는 헥산 및/또는 디에틸에테르, 특히 디에틸에테르인 용매에서 Cyrpthecodinium sp.에서의 항산화 추출물과 Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스의 성분을 각각 별도로 용해한 다음 서로 섞은 후, 바람직하게는 증발로 용매를 제거하는 방법이 특히 유리함을 증명한다.
본 발명의 또 하나의 적합한 양태에 따르면, 성분들은 용매를 첨가하지 않고 혼합하는데, 이 경우 적절하다면, 상승온도, 바람직하게 25~80℃, 특히 25~60℃에서 혼합될 수 있다.
본 발명에 따른 지방산 조성물의 적용 범위는 당 업계의 전문가에 잘 알려져 있다. 특히, 이들은 PUFAs와 PUFA 에스테르를 위해 지정된 모든 적용 범위에 적당하다. 이 경우 본 발명에 따른 지방산 조성물은 보통 직접적으로 사용될 수 있다. 그러나, 이런 적용을 위해서는, 미리 지방산 에스테르를 액체상에서 비누화 하는 것이 필요하다. 이것은 예를 들면, 에탄올에서 KOH와 반응시키고, 이어 무기 또는 유기산으로 산화시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 실시예에 의해 아래에서 좀 더 상세하게 설명되었으며, 본 발명의 범위가 이에 제한되지 않는다.
아래 지방산 조성물의 유도시간, 과산화물가 및/또는 항산화 활성을 결정하였다:
대조군 1
Yokochi et al. Appl. Microb. Biotechnol.,(1998),49, pp.72-76에서 기술된 바에 따라 생산된 "DHA 함유 유지"를 사용하였다. 이를 일반적으로 알려진 방법의 순서에 따라 정제를 완성하였다. 이 유지는 이하 "DHA 함유 유지"로 생략하여 나타낸다.
대조군 2-17
"DHA 포함 유지" + 아스코르빌 팔미테이트 및/또는 토코페롤 혼합물(0.14%ⓡ Coviox T70: 천연 토코페롤 혼합물)의 양을 표 1에 나타내었다.
실시예 1
추출물은 DGF 방법 F-Ⅱ1(75)에 따라서 얻었다.
5.02g의 Crypthecodinium cohnii 원유(핵산 추출물)를 250ml의 둥근 바닥 플라스크에 넣은 후, 피로갈롤 20mg, 메탄올 40ml, 60% 농도의 수산화칼륨 용액(g/v) 10ml와 3개의 끓임쪽을 혼합하였다. 80℃의 항온 수조에서, 시료를 역류 및 질소 증기 하에서 20분간 비누화를 하였다. 냉각 후, 비누용액을 500ml의 분별 깔때기 내로 40ml의 증류수로 두 번, 50ml 디에틸에테르로 두 번씩 세정하여 넣었다.
첫 번째 추출은 디에틸에테르를 조심스럽게 섞는 것으로 진행된다. 수성층은 600ml 유리비커 내로 흘러나왔다. 디에틸에테르층은 증류수 40ml로 두 번 세척하고, 물은 수성층으로 빠지게 된다. 디에틸에테르층은 1000ml 둥근 바닥 플라스크로 빠지게 한다. 수성층은 설명된 것처럼(디에틸에테르 첨가, 추출 등) 무색이 될 때까지 4번 반복하여 처리되었다. 모아진 디에틸 층을 회전 증발기 상에서 농축하고, 오일펌프를 사용하여 건조한 후 무게를 잰다. 추출물은 921mg이 생산되었다.
이를 4g의 "DHA 함유 유지"와 혼합하고(대조군 5: 0.1%의 토코페롤 함유) 10ml의 디에틸에테르를 첨가하여 잘 섞었다. 디에틸에테르를 버린 후 오렌지색 오일을 얻었다.
실시예 2
41.9g의 Crypthecodinium cohnii의 원유를 500ml 둥근바닥 플라스크에 넣고, 메탄올 120ml와 자기 교반 막대를 넣어 혼합하였다. 배치를 자기 교반기에서 3시간 동안 강하게 교반한다. 상층의 메탄올층을 250ml 둥근바닥 플라스크로 따라냈다. 유지 배치에 다시 100ml 메탄올을 가하여 1시간동안 세척한다. 유지-메탄올 혼합물을 분별 깔때기에 넣어 메탄올 층을 이전 것에 옮긴다. 이를 회전 증발기 상에서 농축시키고 오일펌프에 의해 건조시켰다. 760mg의 추출물이 생산되었다. "DHA 함유 유지"(대조군 5; 0.1% 토코페롤 함유)를 추출물 중량의 2%와 혼합하고 잘 섞었다.
실시예 3
"DHA 함유 유지"(대조군 1)를 추출물 중량의 4%와 혼합하고 잘 섞는 것을 제외하고는 실시예 2와 같은 방법으로 지방산 조성물을 얻었다.
실시예 4
Crythecodinium cohnii의 건조 바이오메스를 메탄올로 직접 추출하였는데, 이때 많은 양의 인지질이 함께 추출되었으며, 이는 매우 점성인 생성물이 되게 하였다.
"DHA 함유 유지"(대조군 1)를 추출물 중량의 4%와 혼합하고 잘 섞었다.
실시예 5
Crythecodinium cohnii의 건조 바이오메스를 메탄올에 의해 직접 추출하였는데, 이때 매우 점성의 생성물이 되게 하는 인지질이 대량으로 함께 추출되었다. 이들 화합물을 제거하기 위해 아세톤으로 다시 세척하였으며, 아세톤-용해 성분은 Crythecodinium cohnii 아세톤 추출물을 형성하였다.
"DHA 함유 유지"(대조군 1)를 아세톤 추출물 중량의 4%와 혼합하고 잘 섞었다.
실시예 6
"DHA 함유 유지"(대조군 5)를 추출물 중량의 4%와 혼합하고 잘 섞는 것을 제외하고는 실시예 2와 유사한 방법으로 지방산 조성물을 얻었다.
Rancimat 확인법
기계: 743 Rancimat
제조자: Metrohm
기계 조절:
방법: (AOCS 방법 Cd12b-92와 유사)
온도: 80℃
가스 흐름: 20L/h
종료 조건: 종료점
측정과정 및 원리
측정할 유지(3g)의 무게를 측정하여 반응 용기에 넣고, 가열블럭 내에 두고 정해진 온도와 공기 흐름에 노출시켰다. 포름산과 같은 휘발성 산화생성물이 생성되어, 이를 공기튜브를 통해 측정용기로 옮겼는데, 여기서 전도 전극을 사용하여 증류수 내에서 전도율을 측정하였다. 전도율을 종료점까지 시간에 따라 기록하였다. 이 곡선에서, 이차 유도체가 자동적으로 형성되었으며, 이는 안장점에서 최대값을 갖는다. 안장점까지의 시간을 유도시간라고 한다.
샘플의 안정성이 높을수록 유도시간도 높다. 따라서, 측정된 유도시간을 비교함으로써 샘플의 항-/산화 상태에 대한 결론을 유도할 수 있고 또한 항산화제의 활성을 서로 효과적으로 비교 가능하다.
상기 나열된 물질들에 대해, 표 1에 특정된 유도시간을 요약하였다.
Rancimat 테스트에 의한 유도시간
시료 첨가물 유도시간(h)
대조군 1 ___ 1.1
대조군 2 0.01 중량% Toc 1.9
대조군 3 0.025 중량% Toc 3.7
대조군 4 0.05 중량% Toc 5.5
대조군 5 0.1 중량% Toc 5.7
대조군 6 0.15 중량% Toc 6.8
대조군 7 0.2 중량% Toc 7.7
대조군 8 0.5 중량% Toc 7.0
대조군 9 1.0 중량% Toc 7.5
대조군 10 2.0 중량% Toc 6.6
대조군 11 0.025 중량% Toc + 0.025 중량 AP 4.3
대조군 12 0.1 중량% Toc + 0.025 중량 AP 9.0
대조군 13 0.1 중량% Toc + 0.5 중량 AP 8.5
대조군 14 0.1 중량% Toc + 0.1 중량 AP 7.4
대조군 15 0.2 중량% Toc + 0.05 중량 AP 11.6
대조군 16 0.2 중량% Toc + 0.1 중량 AP 10.6
대조군 17 0.2 중량% Toc + 0.2 중량 AP 7.0
실시예 1 18.7 중량% UVA + 0.1 중량 Toc 17.9
실시예 2 2.0 중량% MeOH-exr. + 0.1 중량 Toc 14.3
실시예 6 4.0 중량% MeOH-exr. + 0.1 중량 Toc 17.6
실시예 5 4 중량% Ace-extr. 41.5
AP: 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate)
Toc: 토코페롤 혼합물
uvA: 비누화 될 수 없는 분획 (위 참조)
MeOH-extr: MeOH 추출물 (위 참조)
Ace-extr: 아세톤 추출물(위 참조)
과산화물가의 측정
상기의 물질들을 어둡고 상온인 곳에서 100ml 개방된 삼각 플라스크에서 예정된 시간동안 저장하고, 그 후 그들의 과산화물가를 분석하였다. 과산화물가는 AOCS official Method Cd30d 63(American Oil Chemist Society)에서 정의된 바와 같이 측정하였다. 얻어진 결과를 표 2에 요약하였다. 상기 표는 메탄올 추출물 (실시예 3)을 사용함으로써 항산화 활성이 추가적인 안정제(대조군 1) 또는 기존의 안정화된 "DHA 함유 유지"(대조군 2) 없이 "DHA 함유 유지"와 비교하여 현저히 증가될 수 있음을 보인다. 이러한 상황에서 항산화 안정성은 추가적인 토코페롤의 첨가를 통해 좀 더 증가될 수 있다.
Figure 112007058297473-PCT00001
항산화 활성의 측정
대조군 1과 5, 그리고 실시예 5의 항산화 활성을 아래와 같이 측정하였다.
방법:
시료를 Photochem 방법으로 측정하였다. Photochemⓡ은 광화학 발광(Photochemoluminescence)(PCL) 방법에 따라 실행된다. 광 감각제를 사용하여 화화학발광성 물질(hemolmonoginic substance)(예를 들어, 루미놀)과의 반응 및 결과되는 빛의 측정을 통해 검출되는 음이온 라디칼이 생성된다. 더 많은 자유 라디칼 트랩(항산화제)이 시료에 존재할수록 더 강하게 광화학 발광의 강도는 농도 의존적 방식으로 약화된다. 결과는 같은 Trolox 농도 단위로 기록되었다. 실험은 개개의 항산화제와 활성산소 제거효소의 총체적 항산화 활성을 측정하기 위한 표준 키트를 사용하여 실행된다.
Trolox 당량을 측정하기 위해, 샘플을 n-헥산으로 희석하고 측정에 바로 사용하였다.
그 결과는 표 3에 요약하였다.
Figure 112007058297473-PCT00002
본 발명에 따른 실시예는 비교적 높은 항산화 활성을 갖는다. 본 연구에서 추가된 추출물의 양은 혼합물에서의 항산화적 활성량과 같지 않은 것을 유념해야 한다. 이를테면 정제가 더 가능하고 훨씬 더 항산화적으로 활성인 추출물을 유도한다. 물론, 보호의 범위는 훨씬 고순도의 농축물로부터 항산화적으로 활성인 화합물까지 적용된다.
본 발명에 따른 지방산 조성물은 특히 약제학적 조성물에서의 활성 요소 또는 성분, 화장품 제조 성분, 식품 첨가물, 식품 요소, 기능성 식품의 성분 및 에스테르 및 산과 같은 고농축 PUFA 이차 생성물의 생산을 위한 성분 등으로 사용될 수 있다.

Claims (24)

  1. 크립테코디늄 속(Crypthecodinium sp.)으로부터의 항산화 추출물.
  2. 제 1항에 있어서, 25000 Trolox 당량 이상의 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 추출물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 추출물은
    ⅰ) Crypthecodinium sp.의 바이오메스를 비누화하고, 그리고
    ⅱ) 25℃에서 물 1g당 0.1g 이하의 수용해도를 갖는 용매에 의해 상기 비누화된 바이오메스를 추출함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 추출물은 헥산, 펜탄, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 디메틸에틸케톤 및/또는 초임계 이산화 탄소로 Crypthecodinium sp.로 부터의 비누화된 바에오메스를 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 추출물은 1~12개의 탄소원자를 갖는 알코올 및/또는 3~6개의 탄소원자를 갖는 케톤으로 Crypthecodinium sp.의 바이오메스를 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올, 이소프로판올, 아세톤 및/또는 에탄올로 Crypthecodinium sp.의 바이오메스를 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
  7. 제 5항 또는 6항에 있어서, 상기 추출물은 1~12개의 탄소원자를 가지는 알코올과, 연이어 케톤으로 Crypthecodinium sp.의 바이오메스를 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
  8. 상기 청구항 중 적어도 하나에서, 상기 추출물이 Crypthecodinium cohnii의 추출물인 것을 특징으로 하는 추출물.
  9. 상기 청구항 중 적어도 하나에서, 상기 추출물이 Crythecodinium sp의 바이오메스가 에스테르 교환되는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
  10. 상기 청구항 중 적어도 하나에서, 상기 추출물이 Crythecodinium sp.의 바이오메스가 기계적인 추출방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
  11. 적어도 하나의 불포화 지방산을 함유하는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물이 상기 청구항 중 적어도 하나에서 청구한 것과 같은 하나 이상의 추출물과 Crythecodinium sp.와는 다른 바이오메스의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, Thraustochytiales의 바이오메스 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, Ulkenia sp.의 바이오메스 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 적어도 한 항에 있어서, Crypthecodinium sp와는 다른 바이오메스의 성분을 Crypthecodinium sp와는 다른 바이오메스의 성분을 에스테르 교환 방법에 의해 얻는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  15. 제 11항 내지 제 14항 중 적어도 한 항에 있어서, 각각의 경우 지방산 조성물의 총 중량을 기본으로 하여, 제 1 항 내지 제10항 중 적어도 한 항에서 청구한, 적어도 하나의 추출물 0.1~50.0 중량%와, Crypthecodinium sp.와는 다른 바이오메스의 성분 50.0~99.9 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  16. 상기 제11항 내지 제 15항 중 적어도 한 항에 있어서, 총 중량을 기본으로 하여, 적어도 중량의 25.0%를 도코사헥시노익산 및/또는 도코사헥사노익산 알킬 에 스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  17. 제 11항 내지 제 16항 중 적어도 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항산화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, α-, β-, γ- 및/또는 δ-토코페롤 및/또는 적어도 하나의 토코트리에놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 추가적으로 아스코르빌 팔미테이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  20. 상기 제 11항 내지 제 19항 중 적어도 한 항에 있어서, 제 1항 내지 제 10항 중 적어도 한 항에서 청구한 적어도 하나의 추출물과 Crypthecodinium sp.와는 다른 적어도 하나의 바이오메스의 성분을 서로 혼합하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물의 생산방법.
  21. 상기 제 11항 내지 제 19항 중 적어도 한 항에서 청구한 지방산 조성물을 약제학적 조성물의 활성 요소 또는 성분으로 사용하는 방법.
  22. 상기 제 11항 내지 제 19항 중 적어도 한 항에서 청구한 지방산 조성물을 화 장품 제제의 성분으로 사용하는 방법.
  23. 상기 제 11항 내지 제 19항 중 적어도 한 항에서 청구한 지방산 조성물을 식품 첨가물 및/또는 식품요소로 사용하는 방법.
  24. 상기 제 11항 내지 제 19항 중 적어도 한 항에서 청구한 지방산 조성물을 동물 사료 성분으로 사용하는 방법.
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