KR20070103254A

KR20070103254A - 항암 조성물

Info

Publication number: KR20070103254A
Application number: KR1020060035130A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 진현탁; 연제인; 바지파이 아른
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교; 주식회사 제넥신
Priority date: 2006-04-18
Filing date: 2006-04-18
Publication date: 2007-10-23
Also published as: KR100788930B1; WO2007119895A1

Abstract

본 발명은 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트(genetic construct)를 포함하는 재조합 벡터 및 면역조절인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하거나 하나의 벡터에서 상기의 유전자 컨스트럭터 및 면역 조절 인자 유전자를 동시에 발현하는 재조합 벡터를 포함하는 항암 조성물 및 이를 항암 치료가 필요한 개체에 투여하고 각 유전자를 발현시켜 신체 면역 반응을 증진시키고 종양세포의 증식을 억제시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래의 항암 조성물보다 우수한 항암 효과를 제공한다.

재조합 벡터, 항암 면역 치료제, 항암 유전자 치료제, IL-12, 면역 조절 인자

Description

항암 조성물{Anti-Cancer Compositions}

도 1은 본 발명의 재조합 바이러스 제작에 사용된 면역 증강 유전자 모식도이다.

도 2는 흑색종 세포주 (B16F10)에 의해 유도된 생쥐의 종양결절에 rAd/IL-12M과 rAd/hIL-2 을 포함한 다른 면역 증강제의 병합 처리 후 24 일째 각 그룹의 평균 종양 부피를 나타내는 그림이다.

도 3은 흑색종 세포주(B16F10)에 의해 유도된 생쥐의 종양결절에 rAd/IL-12M과 rAd/hIL-2를 포함한 다른 면역 증강제의 병합투여 후 종양세포의 증식억제에 따른 쥐의 생존 곡선을 나타낸 그림이다.

본 발명은 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트(genetic construct) 및 면역조절인자 유전자를 각각 또는 동시에 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물 및 이를 이용한 유전자 치료에 관한 것이다.

암의 유전자 치료에는 암세포의 사멸을 유도하는 방법, 면역반응 조절인자를 이용한 면역치료법, 암세포 특이 유전자의 발현 조절법 등 다양한 방법이 사용되고 있다. 또한 최근에는 암세포에서만 증식할 수 있는 아데노바이러스를 이용한 유전자치료가 개발되고 있는 실정으로, 다양한 유전자치료에 의한 암의 진행 지연 및 치료에 대한 효과가 입증되고 있으나, 상기한 다양한 치료 유전자들의 암세포로의 전달 효율이 문제점으로 대두되고 있다.

유전자 백신에 의한 항암 면역 치료법은 종양 특이적인 면역 반응을 유도하여 종양 세포를 제거할 수 있는 치료법으로, 기존의 항암 치료법의 한계와 부작용을 극복할 수 있는 새로운 방법으로 대두되고 있으며, 종양 세포에 대한 면역 기억력을 유도하여 암의 재발을 잠재적으로 예방할 수 있는 치료법이다(Smyth MJ et al. Nat Immunol 2001 2; 293, Kaminski JM et al. Cancer Treat Rev 2003 29; 199-209). 특히, 항암 면역 유전자치료법은 사이토카인과 같은 면역 증강 유전자를 직접 주입하여 종양 세포에 대하여 효과적인 세포성 면역 반응을 활성화시켜 암을 치료하고자 하는 방법으로(Colombo MP et al. Cytokine Growth Factor Rev 2002 13; 155-168, Wang L et al. Cancer Gene Ther 2002 9; 819-824), 많은 면역 증강 인자 중에서 IL-12는 CD8⁺ 살상 T 림프구 (Cytotoxic T lymphocyte, CTL), T 헬퍼 1 (Th1), 그리고 NK 세포를 활성화시키고 종양 내의 혈관 형성을 억제함으로써 뛰어난 항암 효과가 있는 사이토카인으로 알려져 있다 (Shurin MR et al. Chem Immunol 1997 68; 153-174, Siders WM et al. J Immunol 1998 68; 5465-5474, Tannenbaum CS et al. J Immunol 1998 161; 927-932).

IL-12(Interleukin-12)는 IL-12p70인 이형중합체로서, 공유 결합된 두 개의 소단위체 즉, p35와 p40 소단위체로 구성되어 있다. 이러한 구조적 특징 때문에 유전자 치료를 위해서는 p35 소단위체와 p40 소단위체를 모두 필요로 하는데 (Tahara H et al. Cancer Res 1994 54; 182-189, Rakhmilevich AL et al. PNAS 1996 93; 6291-6296), IL-12의 생물학적 활성형태인 IL-12p70 이형중합체뿐만 아니라 과량의 p40 단일체 (monomer) 또는 동형중합체 (homodimer)가 분비됨으로써(Trinchieri G Adv Immunol 1998 70; 83-243), IL-12의 수용체에 IL-12p70과 경쟁적으로 결합함으로써 IL-12p70의 활성을 강하게 저해하는 것으로 알려져 있다(Gillessen S et al. Eur J Immunol 1995, 25; 200-206, Ling P et al. J Immunol 1995, 154; 116-127). 이러한 성질은 IL-12 유전자를 이용한 효과적인 면역 치료에 있어 장애물로 여겨지고 있다.

이를 극복하기 위하여, 항체 제조 시 일반적으로 이용되는 단백질 링커 (linker)를 코딩하고 있는 DNA 서열을 이용하여 p35와 p40 소단위체를 연결하는 방법이 제시되었다 (Lieschke, GJ et al. Nat Biotechnol 1997 15; 35-40, Lode HN et al. PNAS 1998 95; 2475-2480, Lee YL et al. 1998 Human Gene Ther 1998 9; 457-465). 그러나, 상기 방법을 통해 과량의 IL-12p40에 의해 IL-12p70의 생물학적 활성이 저해되는 것은 막을 수 있었으나, p35와 p40의 두 소단위체를 연결함으로써 유발되는 구조의 변화로 인하여 생성된 IL-12p70의 활성도가 5 내지 100배 이 상 감소하여 충분한 효과를 거두지 못하였다. 따라서 IL-12 유전자를 이용한 암 등에 대한 효율적인 치료를 위해서는 IL-12p40이 분비되지 않으면서 활성도가 유지되는 IL-12p70의 생성을 유도하는 방법이 개발되고 있다. 이에 본 연구자들은 대한민국 공개 특허 제2001-0103577호에서 사람 및 생쥐의 IL-12p40 소단위체의 돌연변이체를 개시 하였고, IL-12p35 소단위체와 IL-12p40 돌연변이 소단위체(쥐 p40-N220L 또는 p40-N220Q, 사람 p40-N222L 또는 p40-N222Q,)를 포함하는 재조합 벡터를 제작하여 생체 및 실험실에서 p40의 발현이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다.

면역조절인자에 의한 항암 치료법의 경우에 면역조절인자를 단독으로 사용하는 경우 종양세포를 완전히 제거할 만한 강력한 항암 효과를 나타내지는 못하는 것으로 알려져 있다. 따라서 종양세포에 사이토카인, 케모카인, 코스티뮬레이토리 팩터(costimulatory factor) 등에서 선택된 2가지 이상의 면역조절 유전자를 함께 발현시켜 항암 면역 활성을 증진하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 그 예로 IL-12와 IL-2를 병합치료하여 함암효과를 확인하는 임상실험이 수행되었으나, 병합치료시 신체독성이 증가되는 것으로 나타났으며(Siders, J Immunol. 160:5465-5474), IL-12와 IL-18을 병합치료시 항암 효과가 나타났으나, 단독 치료시에 비해 뚜렷한 효과를 나타내지는 않았다(대한민국 공개특허 제2004-0060834호).

이에 본 발명자들은 항암 효과가 우수한 면역 조성물에 대하여 연구를 하던 중 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트와 면역조절인자 유전자를 병합 사용하는 경우에 항암 효과가 우수함을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트(genetic construct)를 포함하는 재조합 벡터 및 면역조절인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 하나의 벡터에서 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트 및 면역조절인자 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 항암 치료가 필요한 개체에 상기의 항암 조성물을 투여하고 개체 내에서 각 유전자를 발현시켜 신체 면역 반응을 증진시키는 방법 및 종양세포의 증식을 억제시키는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트(genetic construct)를 포함하는 재조합 벡터 및 면역조절인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하나의 벡터에서 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트 및 면역조절인자 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, "IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트"는 IL-12p35 소단위체와, p40 소단위체에서 당쇄화가 일어나지 않도록 당쇄화 부위의 아스파라긴이 다른 아미노산으로 치환된 IL-12p40 소단위체를 발현하는 핵산서열을 말한다. 본 발명의 IL-12M을 구성하는 p35는 야생형의 p35 또는 야생형의 p35와 실질적으로 동일한 생리활성을 나타내는 폴리펩타이드일 수 있다.

야생형 IL-12는 p35와 p40 소단위로 구성되어 있으며, 생체 내(in vivo)에서 발현 시 IL-12p40 단량체, IL-12p40 동형중합체 및 IL-12p70 이형중합체의 형태로 분비되지만, IL-12p70 이형중합체만이 면역활성에 관여하고 있다. 특히, IL-12 발현시 IL-12p70보다 IL-12p40이 5 내지 90배 이상 분비되어 IL-12의 수용체에 IL-12p70과 경쟁적으로 결합함으로써 IL-12에 의한 면역반응 활성을 강하게 저해하는데, IL-12에서 p40의 분비를 감소시키고 상대적으로 p70의 발현량을 증가시키는데 관여하는 당쇄화 부위를 변형시킨 돌연변이 IL-12(이하, 'IL-12M'이라 한다)에 대해 본 발명자의 대한민국 등록특허 제0399728호에 개시되어 있다. 상기 "당쇄화"는 아스파라긴 곁사슬에 소당류가 N-글리코시드 결합을 하는 것을 말한다. 이들 당쇄화는 IL-12의 분비에 필수적인 역할을 하는 것으로, 이 당쇄화 부위에서 당쇄화가 일어나지 않도록 돌연변이시킴으로써 IL-12의 분비를 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 p40 소단위체는 바람직하게 사람 p40의 서열 127번째, 서열 141번째, 서열 222번째 및 서열 303번째와 생쥐의 p40의 서열 220번째에서 당쇄화가 일어나지 않도록 돌연변이된 소단위체이며, 보다 바람직하게는 사람 야생형 p40의 Asn-222(222번째 아스파라긴)와 쥐 야생형 p40의 Asn-220(220번째 아스파라긴)에서 당쇄화가 일어나지 않도록 돌연변이된 소단위체이다. 상기 부위의 돌연변이는, 사람 Asn-222을 지정하는 코돈 ACA 및 생쥐 Asn-220을 지정하는 코돈 AAC를 돌연변이시켜 아스파라긴을 다른 아미노산으로 치환하는 것이고, 바람직하게는 아스파라긴을 루이신, 글루타민, 이소루이신으로 치환하는 것이며, 보다 바람직하게는 아스파라긴을 루이신, 글루타민으로 치환하는 것이다. 야생형 p35 소단위체와 p40 소단위체에서 당쇄화가 일어나지 않도록 다른 아미노산으로 돌연변이된 소단위체를 포함하는 유전자 컨스트럭트의 구체적인 예로서, 쥐 IL-12p40의 소단위체의 220번째 아미노산인 아스파라긴을 루이신으로 변이시킨 IL-12N220L(서열번호 1), 쥐 IL-12p40의 소단위체의 220번째 아미노산인 아스파라긴을 글루타민으로 변이시킨 IL-12N220Q(서열번호 2), 사람 IL-12p40의 소단위체의 222번째 아미노산인 아스파라긴을 루이신으로 변이시킨 IL-12N222L(서열번호 3) 및 IL-12p40의 소단위체의 222번째 아미노산인 아스파라긴을 글루타민으로 변이시킨 IL-12N222Q(서열번호 4)가 있다.

본 발명의 "IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트"는 p35 소단위체를 코딩하는 유전자 및 당쇄화가 일어나지 않도록 돌연변이 시킨 p40 소단위체를 코딩하는 유전자 외에 상기 유전자들을 연결하거나 또는 발현을 조절하는 조절자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조절자는 목적하는 유전자의 발현에 관여하는 핵산 서열로서, IL-12p35 유전자 및 돌연변이된 IL-12p40 유전자의 발현시 p35 소단위체 및 p40 소단위체의 발현을 동시에 조절하기 위한 것을 말한다. 상기 조절자는 IRES(Internal ribosomal entry site), linker 등을 포함하고, 보다 바람직하게는 IRES를 포함한다. 상기 IRES는 이에 한정되는 것은 아니나 EMCV (encephalomyocarditis) 유래의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조절자, 특히 IRES를 포함하는 유전자 컨스트럭트는 p35 소단위체를 코딩하는 유전자, IRES 및 돌연변이 시킨 p40 소단위체를 코딩하는 유전자 순으로 배열되거나, 또는 p40 소단위체를 코딩하는 유전자, IRES 및 p35 소단위체를 코딩하는 유전자 순으로 배열될 수 있으며, 바람직하게는 p35 소단위체를 코딩하는 유전자, IRES 및 돌연변이 시킨 p40 소단위체를 코딩하는 유전자 순으로 배열한다.

본 발명에서, '면역조절인자'는 면역 반응에 관계하는 세포(예로, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 리간드, 사이토카인, 세포성 인자, 펩타이드 등의 물질로서, IL-12 및 IL-12M을 제외한 물질을 말한다. 상기 면역조절인자는 예를 들면, IL-2, IL-15, IL-23, CD40 리간드, Flt3(FMS-like tyrosine kinase 3) 리간드, HSP70(heat shock protein 70), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 등이 있다. IL-2는 활성화된 T 세포에서 분비되어 T 세포 및 NK 세포의 증식을 유도하고 TNF-α와 IL-1과 같은 사이토카인 분비를 유도한다. CD40 리간드(CD40L)는 활성화된 CD4 T 보조 세포에서 발현하여 CD40과 상호작용을 통해 체액성 면역과 세포성 면역 반응 유도에 중요한 역할을 한다. GM-CSF는 수지상세포를 활성 및 성숙시키고 NK 세포와 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 형성에 관여한다. HSP70은 수지상 세포의 성숙과 대식 작용을 촉진하 여 NK 세포와 CTL의 활성을 유도하며, Flt3 리간드(Flt3L)은 조혈모세포의 성장 인자로 B 세포, NK 세포, 그리고 수지상 세포의 증식을 유도한다. IL-23은 기억 T 세포의 활성을 유도하며, IL-15는 NK 세포와 CTL 의 활성을 유도하여 암을 억제시키는 역할을 한다. 본 발명에서는 상기 면역조절인자를 하나 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 IL-2, CD40 리간드 및 GM-CSF를 병합하여 사용하거나, IL-2, CD40 리간드 또는 GM-CSF를 각각 병합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트 및/또는 면역조절인자 유전자는 유전자의 발현율을 높이기 위해 개체에 최적화된 코돈으로 변형할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "개체에 최적화된 코돈으로 변형할" 이란 숙주세포 내에서 DNA가 단백질로 전사(transcription) 및 번역(translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다. "개체"란 인간, 원숭이, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터는 숙주세포에 도입되어 상기 IL-12M 및 면역조절인자를 발현하는데 적합하게 재조합되었다. 일반적으로 벡터는, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하 기 위하여 알칼리 포스파타제 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 또한 본 발명의 재조합 벡터는 발현을 위한 조절자로서 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호, TPL등의 조절 요소 또는 특정 숙주세포에서만 목적하는 유전자의 발현을 지시하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 벡터(vector)는 발현을 위해서 적당한 숙주로 형질전환되어 게놈과 무관하게 혹은 게놈 그 자체에 통합되어 복제하고 기능할 수 있는 파지 입자, RNA 또는 DNA 바이러스이거나, 또는 미생물 숙주 내에서 대량 배양을 위해 미생물에서 기원한 플라스미드, 파지 입자 등이거나, 또는 상기 두 가지 기능을 다 포함하는 셔틀벡터일 수도 있다. 바람직한 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 벡터 등이고, 보다 바람직하게는 아데노바이러스를 선택할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

IL-12M은 항암 치료 효과가 높은 우수한 면역 물질로 알려져 있다. 그러나 본 발명의 IL-12M과 면역조절인자의 병합 요법은 IL-12M을 단독으로 사용하는 경우보다 면역 반응을 촉진시키고 종양의 전이 및 신생혈관 형성을 억제하여 우수한 종양증식억제 및 치료효과가 있다. 또한 본 발명의 항암 면역 조성물의 발현을 종양 부위에서만 유도할 수 있어 재조합 단백질의 전신 투여 시 나타날 수 있는 독성을 낮출 수 있어 안전성을 보다 향상시킬 수 있다. 상기의 "병합 요법"이란 IL-12M 또는 면역조절인자를 동시에 따로 발현시켜 신체 면역반응을 증진시키는 방법 및 이에 의해 종양세포의 증식을 억제시키는 방법을 의미한다. 구체적인 실시에서, IL-12M을 발현하는 재조합 벡터와 IL-2, IL-23, CD40 리간드, Flt3 리간드, HSP70 또는 GM-CSF를 발현하는 재조합 벡터를 병합 치료했을 때, IL-12M을 단독 처리한 경우보다 종양 증식 억제 능력과 쥐의 생존율이 향상되어 더 강한 항암 효과를 나타내었다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항암 치료가 필요한 개체에 본 발명의 항암 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 각 유전자를 발현시켜 신체 면역 반응을 증진시키는 방법 및 종양세포의 증식을 억제시키는 방법에 관한 것이다.

구체적인 양태에서, 재조합 벡터의 병합 치료에 의한 항암효과는 종양을 유도한 생쥐, 쥐, 개 등의 종양조직에 주사하여 확인할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서, 흑색종을 주사하여 종양을 유발시킨 생쥐에 상기 재조합 아데노바이러스를 투여하고, 각각의 재조합 바이러스 주입에 의한 효과를 암의 크기 및 쥐의 생존율로 조사하였다.

본 발명에서, "개체"란 인간, 원숭이, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 허용 가능한 약리학적 조성물을 부가적으로 포함할 수 있다. 약리학적 조성물은 부형제 또는 희석제를 함유할 수 있다. 예를 들어 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 등으로 이루어진 군으로 1종 이상 선택될 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 또한 재조합 벡터가 종양 세포로 보다 안전하게 전달될 뿐 아니라 체내 부작용을 줄이기 위해 적당한 약물전달 시스템을 사용할 수도 있다. 이러한 용도로 예를 들어 하이드로젤, 콜라겐, PEG, PTD (protein transduction domain) 등이 사용될 수 있으며, 재조합 벡터의 구조 유전자를 변형시켜 종양 부위에 전달 효율을 증진시킬 수도 있다.

본 발명의 조성물은 전신 투여 및 국소 투여될 수 있다. 국소 투여의 경우 예를 들어 종양부위에 종양세포 내 주사 (intratumoral injection)로 투여 할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 사용량은 재조합 벡터를 이용한 종양의 유전자 치료에 통상적으로 사용되는 함량으로, 예를 들어 아데노바이러스 벡터를 사용하는 경우 최대 1×10¹² 내지 1×10¹³개의 재조합 바이러스 입자를 주사할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 정확한 용량은 환자의 상태, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 흑색종을 포함한 피부암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 대장암 등과 같은 일반적인 고형암의 치료에 적용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

세포주의 배양

쥐의 흑색종 세포주인 B16F10, 아데노바이러스 생산 세포주인 293, 그리고 발현확인을 위해 사용된 원숭이 신장 섬유아 세포인 COS-7 세포는 각각 ATCC (Manassas, VA20110-2209, USA)에서 구입하여 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 배지를 이용하여 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다.

실시예 1 : 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조

DNA의 제한효소 (New England Biolabs, Inc. USA)의 처리, 아가로즈 젤 전기영동, 젤 적출 키트, DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질 전환, 플라스미드 DNA 순수 정제, 중합연쇄반응 등과 같은 분자 생물학에서 일반적으로 사용되어지는 방법들은 샘브룩(Sambrook) 공저의 분자 클로닝(Molecular Cloning; 2nd edition)에 소개된 방법들을 최소한의 변형을 가하여 실시하였다.

mIL-12M(서열번호 1, Ha SJ et al. Nat Biotechnol 2002 20; 831) 유전자는 제한효소 Xho I 및 Xba I으로 자르고, mIL-23M(서열번호 5, Ha SJ et al. J Immunol 2004 172; 525) 유전자는 제한효소 Sal I 및 Not I으로 자르고, mGM- CSF(서열번호 7, in HT et al. Human Gene Ther 2005 16; 328) 유전자는 Not I 및 Xho I으로 잘라서 준비하여 두고, 이를 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle 벡터의 Xho I/Xba I, Sal I/Not I, Not I/Xho I 사이트에 각각 삽입시켰다. hIL-2(서열번호 6)와 hIL-15(서열번호 11)는 Jurkat 세포에서, mCD40L(서열번호 8)은 EL4 세포에서 얻어진 mRNA를 이용하여 RT-PCR에 의해 유전자를 확보한 다음 이를 pShuttle 벡터의 Kpn I/Not I 사이트에 각각 삽입하였고, HSP70(서열번호 9)과 hFlt3L(서열번호 10)은 화학적으로 합성하여 pShuttle 벡터의 Not I/Hind III 사이트에 삽입한 후 적격세포(competent cell)에 형질전환 시켰다. 클로닝된 각 pShuttle DNA를 제한효소 Pme I 으로 절단한 후 복제 불가능한 pAd/Easy 벡터와 BJ5183 competent cell에서 상동 재조합(homologous recombination) 반응을 수행하였다. 이후 카나마이신(Kanamycin) 항생제를 이용하여 원하는 유전자 발현 카세트가 내재된 재조합 아데노바이러스(rAd)를 포함하는 균주를 선별한 후, 해당 재조합 아데노바이러스를 분리 정제하고, Pac I 으로 절단하여, 35 + 4.5 kb 의 DNA 밴드를 확인하였다. 그리고 각 재조합 아데노바이러스 DNA를 293 세포주에 형질 전환시켜 10일 후 원하는 유전자를 발현하는 바이러스 벡터를 확보하였다(도 1).

재조합 아데노바이러스의 단백질의 발현 확인은 COS-7 세포주에서 수행하였다. 배양접시에 약 80% 정도 배양한 COS-7 세포에 각 재조합 아데노바이러스를 200 MOI로 2시간 동안 감염시키고, 배지를 교체한 후 48시간 동안 배양하여 단백질이 충분히 발현되도록 하였다. IL-12, IL-15, IL-2, GM-CSF, IL-23 발현은 ELISA에 의해 확인하였으며, 그에 대한 항체로써 anti-IL-12(R&D System, Minneapolis, MN), anti-IL-15(R&D System, Minneapolis, MN), anti-IL-2, anti-GM-CSF(BD Pharmingen, Sandiego, CA), anti-IL-23(eBioscience, Sandiego, CA)을 사용하였다. CD40L, Flt3L, HSP70의 발현은 anti-CD40L, anti-Flt3L(Santa Cruz Biotechnology, California, USA), anti-HSP70(StressGene Biotechnologies Corp. Victoria, BC, Canada)을 이용하여 웨스턴 블롯 (Western Blot)으로 확인하였다.

실시예 2 : 재조합 바이러스의 병합 투여에 의한 종양 억제 효과

재조합 바이러스의 병합 치료에 의한 항암 효과를 알아보기 위하여 흑색종을 유발 시킨 생쥐에 상기 실시예 1의 재조합 바이러스를 각각 투여하여 암의 크기를 조사하였다.

배양한 흑색종 세포주 B16F10는 세포수를 측정하고, 살아있는 세포가 전체의 80% 이상일 경우 1×PBS로 세척한 다음 5×10⁶ 세포/ml 가 되도록 1×PBS에 현탁한 후, C57BL/6 쥐 한 마리당 100μl (5×10⁵ 개의 세포 수)씩 피하 주사하고, 7 내지 9 일 동안 종양 결절을 형성시켰다.

종양 결절이 형성된 쥐를 9군(한 군당 12마리)으로 나누고, 종양 결절의 직경이 6 내지 8 mm 되었을 때, 상기 실시예 1의 재조합 바이러스를 1×PBS 완충용액으로 희석한 1×10⁸ pfu/100μl의 양으로 이틀 간격으로 세 번에 걸쳐 종양 결절 내로 주사하고 시간에 따른 종양 크기 변화를 관찰하였다. 첫 번째 주사한 날을 day 0으로 표시하고, 종양의 크기는 장축×단축× 높이/2로 계산한 부피 (mm³)의 평균값을 취하였다. 도 2는 종양 결절이 형성된 쥐 9군에 각 재조합 바이러스를 주사한 후 24일째 각 그룹의 평균 종양 크기를 그래프로 나타낸 것이다. 대조군으로는 아무것도 발현하지 않은 재조합 바이러스, rAd/Mock을 사용하였으며 실험을 실시한 후 15 일 정도에 모든 쥐가 죽어 그래프상에는 포함되어 있지 않다. rAd/IL-12M를 단독으로 주사한 경우에도 대조군과 비교했을 때 종양치료 효과가 우수함을 입증하였고, 다른 면역 증강 요인을 병합주사 시 rAd/IL-12M만으로 치료한 군(G2)에 비해 전반적으로 종양의 크기가 크게 감소한 결과를 얻었다. 특히, rAd/hIL-2, rAd/mGM-CSF, rAd/mCD40L과 병합 치료 했을 때 rAd/IL-12M만으로 치료한 군의 평균적인 종양의 크기인 약 350mm³에비해 종양의 평균 크기가 각각 34mm³, 52mm³, 44mm³ 로서 10배, 7배, 8배 뛰어난 종양 증식 억제 효과를 보여주었다(도 2).

실시예 3 : 재조합 바이러스의 병합 투여에 의한 흑색종 쥐의 생존율 조사

재조합 바이러스의 종양 증식 억제 효과뿐만 아니라 상기 바이러스에 의한 항암효과를 확인하기 위하여, 쥐의 생존율을 조사하였다.

실험은 상기 실시예 2의 방법에 따라 각 9군의 흑색종 쥐에 각 재조합 바이러스를 주사 후 각 쥐의 생존기간을 50일 이상 관찰한 것으로, 실시예 2를 연장 실험하였다(표 1 및 도 3).

	생존율(%)
	day 24	day 45
rAd/Mock	0	0
rAd/mIL-12M	66.4	0
rAd/mIL-12M + rAd/hIL-2	82.5	66.4
rAd/mIL-12M + rAd/mIL-23M	82.5	0
rAd/mIL-12M + rAd/mGM-CSF	82.5	33.3
rAd/mIL-12M + rAd/mCD40L	82.5	49.8
rAd/mIL-12M + rAd/HSP70	66.4	16.6
rAd/mIL-12M + rAd/hFlt3L	82.5	16.6
rAd/mIL-12M + rAd/hIL-15	82.5	0

전반적으로, 흑색종을 유발시킨 쥐의 24일째 생존율에서, 아무것도 발현하지 않은 대조군 rAd/Mock에 비해 rAd/IL-12M을 단독 혹은 다른 면역조절인자와 병합치료한 치료군에서 훨씬 생존율이 높았다. 게다가, 45일째 생존율에서는 rAd/mIL-12M 단독으로 처리한(0%) 군에 비해 rAd/mIL-12M과 다른 면역 증강 요인을 병합주사한 군에서 전반적으로 생존율이 우수한 결과를 관찰할 수 있었다. 특히, rAd/IL-2, rAd/CD40L, rAd/GM-CSF, rAd/HSP70, rAd/hFlt3L과 병합치료 한 군은 각각 66.4%, 49.8%, 33.3%, 16.6%, 16.6%의 높은 생존율을 보여 순서대로 병합 치료에 의한 항암 증가 효과가 뛰어남 확인 할 수 있었다(표 1 및 도 3).

따라서, IL-12M를 단독으로 처리하였을 때 보다 IL-2, CD40L, GM-CSF, HSP70, hFlt3L, IL-23M, IL-15 등의 다른 면역조절인자와 병합치료 시 종양 세포의 성장 억제 효과가 있었으며, 종양 유도 쥐의 생존율을 향상시켰다.

본 발명의 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터와 면역조절인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물, 및 하나의 벡터에서 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트와 면역조절인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물은 종양 증식 및 억제 효과가 우수하여 우수한 항암 치료제로서 사용할 수 있다.

<110> POSTECH FOUNDATION Genexine Inc. <120> Anti-Cancer Compositions <130> PA9603-193/KR <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-12N220L <400> 1 atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60 ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 120 ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 180 actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 240 tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 300 acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt 360 ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt tccaggccat caacgcagca 420 cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat 480 gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga 540 gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc 600 cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct ccgcctgaga attccccctc 660 tccctccccc 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Claims

IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터와 면역조절인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물.
하나의 벡터에서 IL-12M을 코딩하는 유전자 컨스트럭트와 면역조절인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 포함된 항암 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 컨스트럭트가 IRES(International ribosomal entry site)를 포함하는 항암 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 컨스트럭터가 서열 번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4 중의 어느 하나인 항암 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 면역조절인자 유전자가 IL-2, GM-CSF, CD40 리간드, Flt3 리간드 또는 HSP70 중의 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 것인 항 암 조성물.
제1항 또는 2항에 있어서, 유전자가 발현율을 높이기 위해 포유류에 최적화된 코돈으로 변형된 것인 항암 조성물.
제1항 또는 2항에 있어서, 재조합 벡터가 바이러스인 항암 조성물.
제6항 있어서, 바이러스가 아데노바이러스인 항암 조성물.
항암 치료가 필요한 개체에 제1항 또는 제2항의 항암 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 각 유전자를 발현시켜 신체 면역 반응을 증진시키는 방법.
항암 치료가 필요한 개체에 제1항 또는 제2항의 항암 조성물을 투여하고 상기 개체 내에서 각 유전자를 발현시켜 종양세포의 증식을 억제시키는 방법.