KR20070103001A

KR20070103001A - 암치료에서 예후적 및 예견적 마커의 확인 및 용도

Info

Publication number: KR20070103001A
Application number: KR1020077015867A
Authority: KR
Inventors: 순명 백; 정열 김
Original assignee: 엔에스에이비피 파운데이션, 인크.
Priority date: 2004-12-15
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2007-10-22
Also published as: AU2005316534A1; WO2006065940A3; EP1825003A4; US20060127935A1; US20090035311A1; CA2591716A1; EP1825003A2; WO2006065940A9; JP2008524230A; WO2006065940A2

Abstract

본 발명은 임상적 추적 데이타로 주석을 단 다수의 조직샘플을 포함하는 조직은행으로부터 조직 마이크로어레이를 구성하고; 종양원 또는 잠재적인 앰플리콘으로 알려진 암 연관된 유전자에 대해서 특이적인 폴리핵산 프로브를 표지하고; 조직 마이크로어레이에 대해서 형광동소하이브리드화 분석을 수행하고; 형광동소하이브리드화의 결과를 임상적 추적 데이타와 상호 연관시키는 단계를 포함하여, 명시된 암의 효능을 예견하는데 유용한 마커를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유방암이 있는 환자에게서 HTPPA의 발현 수준 또는 증폭을 측정한 다음에, 증가된 수준의 HTPAP 발현 또는 HTPAP 증폭을 갖는 환자에게 HTPAP의 포스파티딘산 포스파타제 활성을 저해하는 1종 이상의 화합물의 치료학적 양을 제공하는 것을 포함하여 유방암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 유방암 환자를 cMYC 유전자의 증폭에 대해서 스크리닝한 다음에, cMYC의 증폭이 있는 환자를 HER2 시그날링을 저해하는 화합물의 치료학적 양으로 치료하는 것을 포함하여 유방암을 치료하는 방법을 포함한다.

암치료, 유방암, 예후적 마커, 발현 수준, 증폭, 포스파티딘산 포스파타제 활성

Description

암치료에서 예후적 및 예견적 마커의 확인 및 용도{IDENTIFICATION AND USE OF PROGNOSTIC AND PREDICTIVE MARKERS IN CANCER TREATMENT}

관련된 출원에 대한 참조

본 출원은 2004년 12월 15일에 출원된 미국 가특허출원 제 60/636,169 호, 2005년 7월 11일에 출원된 출원 제 60/698,112 호 및 2005년 9월 14일에 출원된 출원 제 60/717,485 호 (이들은 모두 본 명세서에 참고로 포함되어 있다)를 우선권으로 주장한다.

유방암은 임상적 거동 및 치료법에 대한 반응에 관하여 이질적인 질병이다. 이러한 가변성은 유방암의 각각의 서브타입 (subtype) 내에서 암세포의 상이한 분자 구성의 결과이다. 그러나, 단지 두개의 분자적 특징만이 현재 치료학적 표적으로서 이용되고 있다. 이들은 각각 항에스트로젠 및 헤르셉틴의 표적인 에스트로젠 수용체 및 HER2이다. 이들 두가지 분자를 표적화하기 위한 노력은 극도로 생산적인 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고, 이들 두가지 표적을 갖지 않는 이들 종양은 일반적으로 증식성 세포를 표적화한 화학요법에 의해서 치료된다. 몇가지 중요한 정상세포도 또한 증식성이기 때문에, 이들도 동시에 화학요법에 의해서 손 상된다. 따라서, 화학요법은 심각한 독성과 연관된다. ER 또는 HER2 이외의 종양에서의 분자 표적의 확인은 새로운 항암요법의 개발에 있어서 중요하다.

cDNA 어레이 (array)를 기본으로 하는 발현 프로파일링 (profiling) 및 비교 지놈 하이브리드화 (comparative genomic hybridization; "CGH")를 사용하는 최근의 연구에서는 유방암의 전사적 프로그램에서 유전자 증폭의 역할을 해명하였다.

폴락 (Pollack) 등의 연구에서는, 6691 개의 지도가 작성된 인간 유전자에 걸친 카피수 변화 및 발현 수준이 44 개의 국소적으로 진행된 유방암 및 10 개의 유방암 세포 라인에서 검사되었다 (Pollack JR, Sorlie T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968). 이 연구로부터의 데이타는 유방암 중에서 유전자 발현에서의 모든 변이의 적어도 12%는 직접적으로 유전자 카피수 (copy numbers)에서의 잠재적 변이에 기인하는 것임을 시사한다. 지놈성 변화 (획득 및 상실)의 총수는 높은 등급 (p=0.008), 음성 ER (P=0.04) 및 p53 돌연변이 (p=0.0006)와 상당한 관련이 있었다. 117 개의 높은 수준의 증폭 (91 개의 상이한 유전자를 나타냄) 중에서 62% (54 개의 유전자를 나타냄)는 적어도 적절히 상승된 mRNA 수준과 연관되는 것으로 확인되었으며, 42% (36 개의 상이한 유전자를 나타냄)는 고도로 상승된 mRNA 수준과 연관되었다. 유사한 노력으로, 하이만 (Hyman) 등은 13,824 개의 유전자의 cDNA 마이크로어레이 (microarray)를 사용하여 14 개의 유방암 세포 라인에서의 카피수 변화와 발현 수준 사이의 상관관계를 시험하였다 (Hyman E, Kauraniemi P, Hautaniemi S et al., Cancer Res 2002; 61(21):6240-6245). 이들은 고도로 증폭된 유전자의 44%가 과발현을 제공하였음을 나타내었으 며, 과발현된 유전자의 10.5%가 증폭되었다.

이들 결과들은 함께 유방암에서 유전자 발현의 전사적 조절에 있어서의 유전자 증폭의 심오한 역할을 시사하며, 치료제 및 진단제를 개발하기 위한 바람직한 표적으로서 증폭된 유전자를 추적하기 위한 이론적 근거를 제공한다.

비록 소수의 유전자의 증폭이 어레이 CGH에 의해서 확인되었고, 형광동소하이브리드화 (fluorescence in-situ hybridization; "FISH")에 의해서 검사되었으며, 예후적인 것으로 확인되었지만, 불행하게도 어떤 연구도 증폭된 유전자의 포괄적인 리스트와 상관된 임상결과를 제공하지 않았다. 증폭패턴을 스크리닝하는데 대한 가장 큰 장벽은 비용, 및 어레이 CGH 측정시험을 위한 고품질 DNA의 필요성이다.

다른 한편으로, FISH는 루팅 임상적 셋팅 (routing clinical setting)에서 포르말린 고정된 파라핀 포매된 절편을 사용하여 작업하는 안정한 방법이다. HER2에 대한 FISH 프로브는 헤르셉틴 반응을 위한 예견적 시험으로 FDA 승인되었다. 파라핀 포매된 절편에서의 DNA의 안정성으로 인하여, 이것이 RNA 기본 또는 면역조직화학 기본 임상시험보다 더 신뢰성이 있다. 그러나, 잠재적으로 중요한 증폭된 유전자에 대한 FISH 프로브는 포괄적으로 개발되지 않았다. 실제로, 프로브의 어레이를 공급하는 단지 하나의 공급자 (Vysis, Downers Grove, IL)가 있지만, 이들 프로브는 대부분 이 점에서 예후적 인자로서의 임상적으로 승인되지 않았다. 이들 프로브는 또한, 매우 비싸고 (가격: 케이스 (case) 당 약 $300), 유방암 및 대장암과 같은 고형종양에서 잠재적으로 중요한 앰플리콘 (amplicons)의 레퍼토리를 겨우 긁어낸 제한된 종류의 것이다.

1100 증례의 유방암에서 잠재적으로 추정되는 중요한 앰플리콘에 대한 5 가지의 바이시스 (Vysis) 공급된 시판 FISH 프로브 (HER2, MDM2, MYC, CCND1, EGFR)에 대한 최근의 조사에서, 알-쿠라야 (Al-Kuraya) 등은 5 가지 유전자 증폭의 전부가 아닌 일부가 치료 정보가 없이 불충분하게 정의된 임상적 코호트 (cogort)에서의 생존결과와 상관관계가 있음을 확인하였다 (Al-Kuraya K, Schraml P, Torhorst J et al., Cancer Res 2004; 64(23):8534=8540). 그럼에도 불구하고, 이들은 증례의 60%는 검사된 5 가지 유전자의 어떤 증폭도 제공하지 않았음을 밝혀내었다. 또한, 생존율이 증폭이 없음 > 1 증폭됨 > 2 증폭됨 > 3 증폭됨의 순서라는 유전자 증폭 투약량 효과 (dosage effect)가 밝혀졌다. 이 데이타는 지놈 불안정성의 증가된 수준 및 증폭 발현에 대한 높은 가능성을 갖는 소위 "증폭성" 표현형 ("amplificatory" phenotype)을 뒷받침하며, 따라서 유방암에서 앰플리콘의 포괄적인 임상적 상관관계에 대한 필요성을 뒷받침한다.

유방암의 분자분류학에서의 최근의 진보에도 불구하고, 단지 두가지 분자적 특징이 현재 치료학적 표적으로 이용되고 있다. 이들은 각각 항에스트로젠 (타목시펜 및 아로마타제 억제제) 및 헤르셉틴의 표적인 에스트로젠 수용체 및 HER2이다. 이들 두가지 분자를 표적화하기 위한 노력은 극도로 생산적인 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고, 이들 두가지 표적을 갖지 않는 이들 종양은 일반적으로 증식성 세포를 표적화한 화학요법에 의해서 치료된다. 몇가지 중요한 정상세포도 또한 증식성이기 때문에, 이들도 동시에 화학요법에 의해서 손상된다. 따라서, 화 학요법은 심각한 독성과 연관된다. ER 또는 HER2 이외의 종양에서의 분자 표적의 확인은 새로운 항암요법의 개발에 있어서 중요하다.

모든 유방암의 약 15 내지 20%는 그의 세포 표면에서 HER2 단백질의 과발현을 갖는다 (Paik S, Hazan R, Fisher ER et al., J Clin Oncol 1990; 8(1):103-112). 이러한 종양은 HER2 단백질 과발현이 없는 경우보다 더 나쁜 예후를 갖는 것으로 알려졌다 (Paik S, Hazan R, Fisher ER et al., J Clin Oncol 1990; 8(1):103-112). HER2 단백질의 과발현은 거의 예외가 없이 HER2를 코드화하는 유전자의 증폭 또는 증가된 카피수에 기인한다.

그의 표면에서 HER2 단백질의 과발현을 갖는 암세포의 성장을 중지시키기 위한 수단으로 HER2 시그날링 (signaling)을 표적화한 다수의 약물이 개발되었다. 이들 약물 중의 하나는 제넨테크 (Genentech)에 의해서 개발된 트라스투주마브 (Trastuzumab; 헤르셉틴)이다. 헤르셉틴은 최근에, HER2 과발현이 있는 진행된 유방암으로 진단된 환자에게서 생존을 연장시키는데 효과적인 것으로 나타났다 (Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S et al., N Engl J Med 2001; 344(1):783-792). 최근에, 이것은 또한, HER2 단백질 과발현 또는 HER2 유전자 증폭을 갖는 초기 단계 유방암을 갖는 환자에게서 재발 및 사망을 감소시키는 것으로도 나타났다 (Romond EH, Pesez EA, Bryant J et al., N Eng J Med 2005; 353(16); 1673-1684). 재발율에서의 전반적 감소는 아쥬번트 셋팅 (adjuvant setting)에서 화학요법 단독과 비교하는 경우에 헤르셉틴에 의해서 약 50%이다 (Romond EH, Pesez EA, Bryant J et al., N Eng J Med 2005; 353(16); 1673-1684). 모든 환자가 또한 잠재적인 심각한 심장독성을 갖는 이러한 비용이 많이 드는 치료로부터 효과를 얻는 것으로 보이지는 않는다. 헤르셉틴 또는 그 밖의 다른 HER2 표적화 약물로부터 최대한으로 효과를 나타낼 수 있는 환자를 확인하는 방법이 필요하다 (Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S et al., N Engl J Med 2001; 344(1):783-792; Goldman B, J Natl Cancer Inst 2003; 95(23):1744-1746). 다수의 실험실에서는 헤르셉틴에 대한 반응의 지표로서 PTEN과 같은 HER2 시그날링 경로의 성분에서 이상을, 이러한 이상이 HER2 단백질 과발현의 존재 하에서도 종양세포가 헤르셉틴에 대해서 저항성이 되도록 한다는 가설하에서 추적하였다 (Crowder RJ, Lombardi DP, and Ellis MJ., Cancer Cell 2004; 6(2):103-104; Nagata Y, Lan KH, Zhou X et al., Cancer Cell 2004; 6(2):117-127). 이러한 연구는 HER2 시그날링 경로에서 직접적인 역할을 가질 수 있지만, 어떤 것도 임상시험에서 실증되지 않은 분자에 대해서만 집중되었으며, 임상실습에서 헤르세빈에 대한 반응의 예견을 위해서 사용된 마커는 없다.

CGH 연구에 의해서 입증되는 바와 같이, 유방암에서 증폭되는 다수의 유전자가 있다. 전술한 바와 같이, 유방암에서 과발현된 유전자의 약 10%는 유전자 증폭에 기인한다 (Pollack JR, Sorlie T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968). 인간 암에서 빈번하게 증폭된 유전자 중의 하나는 염색체 8 상에 위치하는 cMYC이다. 정상세포에서 cMYC는 G1에서 S 상으로 세포를 구동시키는 고도로 조절된 방식으로 발현된다. 아마도 정상세포 증식에서의 그의 중요한 역할로 인하여 cMYC를 차단하기 위한 노력은 약제학적 산업의 주된 주안점이 되지 않았다. 단지 하나의 회사가 현재 임상시험을 하고 있는 약물을 갖고 있다 (Cylene Pharmaceuticals). 연구에서는 cMYC가 세포사멸 또는 세포증식 프로그램을 통해서 진행하는 세포의 운명을 결정하는 분자 스위치 (molecular switch)로서 중요한 역할을 갖는다는 것을 시사하였다 (Pelengaris S, Khan M, Evan G., Nat Rev Cancer 2002; 2(10):764-776; Pelengaris S, Khan M, Evan GI., Cell 2002; 109(3):321-334). cMYC가 과발현되는 경우에, 세포는 조절되지 않은 세포증식 상태로 되고, 생존 시그날의 부재 하에서 세포사멸 프로그램에 민감하게 된다 (참조: 도 1a). cMYC는 세포사멸 프로그램 경로의 다수의 성분을 조절함으로써 세포소멸을 유도하지만, 주된 효과기 (main effector)는 Bax인 것으로 보인다 (Pelengaris S, Khan M, Evan G., Nat Rev Cancer 2002; 2(10):764-776).

결국, cMYC 과발현이 있는 세포는 국소적으로 이용할 수 있는 생존인자의 소모로 인하여 집단자살하게 될 것이다. 동시에, cMYC 과발현은 지놈 불안정성을 야기하는 것으로 나타났다. 이것은 HER2와 같은 다른 종양원의 증폭을 야기할 수 있다 (Fest T, Mougey V, Dalstein V et al., Oncogene 2002; 21(19):2981-2990). 다른 유전자의 증폭은 항-세포소멸 시그날을 생성시킬 수 있으며, 따라서 세포소멸 경로의 억제를 야기할 수 있다. 예를 들어, HER2 증폭의 경우에, 연구에서는 HER2가 Bax를 억제하는 항-세포소멸 단백질인 Bcl-2를 유도하는 것으로 입증되었다 (Milella M, Trisciuoglio D, Bruno T et al., Clin Cancer Res 2004; 10(22):7747-7756).

그럼에도 불구하고, 치료효능의 예후적 지표를 제공하는 마커/유전자를 확인 할 필요성이 여전히 남아있다. 상기에서 및 이에 대한 부록에서 인용된 문헌들은 마치 본 명세서에 충분히 기술된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.

발명의 요약

본 발명은 증폭되는 경우에 독소루비신, 사이클로포스파마이드 및 파클리탁셀을 함유하는 표준 화학요법에 의한 치료 후에도 유방암에서의 열등한 예후를 부여하는 새로운 예후적 및 치료학적 표적 HTPAP 유전자를 기술하고 있다. HTPAP 증폭은 종양 크기, 치료, 양성 액와림프절의 수, 연령 및 호르몬 수용체 상태, HER2 증폭 및 cMYC 증폭의 독립적인 예언자 (prognosticator)이다. 또한, cMYC는 HER2 증폭/과발현과 함께 cMYC 증폭이 있는 환자의 경우에는 cMYC 증폭이 없는 환자에 대해서 재발율이 단지 45% 감소하는데 비해서 헤르셉틴이 화학요법으로 첨가되면 암 재발율이 75% 감소하도록 하는 방식으로 헤르셉틴에 대한 반응의 예보자 (predictor)이다. cMYC는 HER2 증폭 또는 과발현이 있는 유방암 환자의 약 30%에서 증폭된다. 트라스투주마브에 의한 HER2 시그날링의 억제는 명백하게 cMYC 역할을 증식 스위치로부터 전-세포소멸성 스위치로 변화시킨다. 본 발명은 다음의 임상적 적용성을 갖는다: 환자를 선택하고, 트라스투주마브 및 HER2 시그날링 경로를 표적화한 다른 약물을 사용한 치료를 결정하는 방법의 최적화; 트라스투주마브 또는 HER2 표적화된 치료법 이후에도 높은 재발의 위험이 있는 환자를 확인함으로써 혈관형성을 표적화하는 베바시주마브 (Bevacizumab; Avastin)과 같은 다른 약물 또는 표적화된 치료법의 부가를 시험하는 미래의 임상시험을 위해 환자를 선택하는 방법의 최적화; 유방암 환자에게서 반응의 예측 및 예견을 위한 단일튜브시험 (single tube assay)에서 HER2 및 cMYC 둘 다의 유전자 증폭상태를 검출할 수 있는 PCR-기본 시험; 및 다른 활성화된 종양원으로부터의 항-세포소멸 시그날을 억제함으로써, 그의 전-세포소멸 활성의 간접적인 변조를 통해서 cMYC 표적화된 치료법의 합리적인 개발.

도면의 간단한 설명

도 1a는 전-세포소멸 스위치로서의 cMYC의 개념도 (schematic)를 나타낸 것이다.

도 1b는 증식 스위치로서의 cMYC의 개념도를 나타낸 것이다.

도 1c는 HER2로부터의 항-세포소멸 시그날의 개념도를 나타낸 것이다.

도 2는 치료학적 표적을 확인하는 방법을 설명하는 흐름도 (flow chart)를 나타낸 것이다.

도 3은 클러스터링 (clustering) 시험의 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 증폭에 의한 재발의 그래프를 나타낸 것이다.

도 5는 APPBP2에 대한 카플란 마이어 플롯 (Kaplan Meier plot)을 나타낸 것이다.

도 6은 BMP7에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 7은 bm_009에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 8은 CACNB1에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 9는 chk에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 10은 c_myc에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 11은 cyclindl에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 12는 decr1에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 13은 FLJ 10783에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 14는 GRO1에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 15는 GRB2에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 16은 HBS1L에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 17은 HER2에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 18은 MAL2에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 19는 HTPAP에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 20은 MLN64에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 21은 MRPS7에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 22는 PPM1D에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 23은 NCO43에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 24는 RPS6KB1에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 25는 SEB4D에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 26은 stk6에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 27은 SIP_28에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 28은 TPD52에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 29는 TRAF4에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 30은 ZNF217에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 31은 ZHX1에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 32는 임의의 앰플리콘에 대한 카플란 마이어 플롯을 나타낸 것이다.

도 33은 HTPAP 유전자의 도해를 나타낸 것이다.

도 34는 재발이 없는 생존을 나타낸 것이다.

상업적으로 이용가능한 FISH 프로브가 고비용인 한가지 이유는 이 프로브를 나타내는 박테리아성 인공 클론 (bacterial artificial clones; BAC)을 직접적으로 형광표지하는 비용 및 곤란성이다. 본 발명은 10 년 이상 동안 보관된 파라핀 포매된 조직에 대해 일련의 전체 지놈 증폭방법 및 효율적인 FISH 방법을 조합함으로써 효율적으로 공지된 앰플리콘을 나타내는 BAC 클론을 형광적으로 표지하는 방법을 제공한다 (참조: 도 2의 개요). 이러한 표지 및 FISH 방법은 시판품으로 이용할 수 있는 프로브에 비해서 로그 등급 (log order)으로 덜 비싸다. 모두 임상적 추적정보 및 제공된 치료에 대해 주석을 단 30,000 증례의 유방암 및 대장암에 대한 파라핀 블럭 조직샘플을 사용하는 것은 임상적 상관관계가 있는 과학적 시험을 위한 독특한 공급원을 제공하였다. FISH 방법을 조직 마이크로어레이 (micro array) (TMA)와 조합시키는 것은 단일 현미경적 절편을 사용한 100 증례 이상의 스크리닝을 허용하여 몇천의 증례에서 다수의 앰플리콘의 스크리닝을 실현할 수 있도록 한다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 본 기술분야에서 잘 알려진 어떤 수의 방법을 사용하여서도 FISH 적용을 위한 프로브를 표지할 수 있음을 쉽게 인식할 수 있을 것이다. 또한, FISH는 증폭을 측정하기 위해서 사용되기 때문에, 항체 기본 측정시험 (예를 들어, ELISA (효소-결합된 면역흡착시험)) 및 qt PCR을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 그 밖의 다른 다수의 정량적 또는 반-정량적 방법이 사용될 수 있다.

파일롯 프로젝트 ( pilot project ):

파일롯 실증 프로젝트에서는 "NSABP" (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project) 실험 B-28로부터의 987 이상의 증례를 4 사이클의 아드리아마이신 사이클로포스파마이드 대비 동일 약물에 이은 4 사이클의 파클리탁셀을 비교함으로써 스크리닝하였다. 이 시험에서는, 조직 마이크로어레이를 구성하고, FISH 시험은 어레이 CGH 데이타를 기본으로 하여 10 개의 상이한 자체 (in-housed) 개발된 프로브에 대해서 수행하였다 (두개의 셋트는 서로 매우 유사하다, 즉 HER2 및 MLN64, APPBP2 및 PPMID). 앰플리콘 및 이들의 염색체 위치는 다음과 같이 표시된다:

SEB4D 20q13.32

ZNF217 20q13.2

APPBP2 17q23.2

TPD52 8q21

MLN64 17q11-q12

PPM1D 17q23.2

HER2 17q21.1

CYCLIND1 11q13

MAL2 8q23

C-MYC 8q24.12-q24.13

개개 프로브의 하이브리드화 후에, 증례들은 증폭되거나 (핵당 3 카피보다 많은 시그날의 경우) 증폭되지 않은 (2 카피 또는 그 미만) 것으로 스코어를 매켰다. 이들 10 개의 앰플리콘의 증폭패턴의 자연적 부류를 찾기 위해서, 비-지도 계층적 클러스터링 (non-supervised Hierarchical clustering)을 수행하였다. 파일롯 시험의 결과는 도 3에 나타내었다. 결과에서 주목할 만한 것은 그들의 염색체 위치에서의 매우 근접한 인접성을 기본으로 하여 예상되는 바와 같은 PPM1D와 APPBP2, 및 HER2와 MLN6의 증폭상태의 밀접한 상관관계이다. 이 데이타는 청구된 바와 같은 BAC 라벨링을 위한 본 발명의 방법이 고도로 재현성이 있는 결과를 제공한다는 것을 입증한다.

또한, 10 개의 앰플리콘 중의 어떤 것도 증폭하지 않은 증례도 있다. 이러한 증례의 비율은 더 많은 앰플리콘이 스크리닝됨에 따라서 감소할 것이지만, 증폭에 대해서 비교적 저항성인 이러한 서브그룹이 존재할 것 같다.

처리에 따른 B-28에서의 비-증폭 대 증폭의 예후적 값이 검사되었다. 10 개의 앰플리콘 중의 어떤 것도 증폭하지 않은 이들 환자의 재발이 없는 생존은 유전자 중의 어떤 것이라도 증폭이 있는 경우보다 상당히 더 우수하였지만 (도 4), 이 파일롯에서 10 개의 선택된 앰플리콘에서의 유전자의 성질로부터 예상되는 바와 같이, 이 포르토콜에서는 일반적으로 증폭 표현형을 기본으로 한 AC에 대해 탁솔을 첨가하는 것으로부터의 이점과는 상호작용이 없었다.

과발현과 연관된 27 개의 후보 앰플리콘을 체계적으로 스크리닝한 결과 (표 1에 나타낸 바와 같음)로서, 다른 예후적 변수를 포함한 다변수 분석으로 시험한 경우에 표준 화학요법으로 치료된 결절 (node) 양성 유방암에서 독립적으로 예후적인 3 개의 앰플리콘 (HER2: cMYC, 및 또한 PPAPDCIB로도 알려져 있는 HTPAP)이 확인되었다. 이들 세가지 앰플리콘은 다음의 BACs를 사용하여 확인되었다: 바이시스 (Vysis)로부터의 HER2-패스바이존 (PathVysion) HER2 시험; 바이시스로부터의 cMYC-LSI C-MYC; HTPAP-RP11-513D5. 그럼에도 불구하고, 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 동일한 유전자를 위한 다수의 다른 프로브 공급원이 본 발명과 함께 이용될 수 있음을 쉽게 인식할 수 있을 것이다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 동일한 유전자에 대한 어떤 프로브 공급원이라도 표지하는 다수의 다른 방법이 본 발명에 의해서 이용될 수 있음을 쉽게 인식할 수 있을 것이다. 이들에는 형광원성 (fluorogenic) 및 색소원성 (chromogenic) 프로브 표지방법 둘 다가 포함할 수 있다.

이들 27 개의 앰플리콘은 NSABP 실험 B-28로부터 제작된 TMA 상에서 FISH에 의해서 스크리닝되었으며, 여기에서는 보조결절 양성 유방암 환자를 4 사이클의 아리마이신 (독소루비신) + 사이클로포스파마이드 (AC), 또는 동일한 레지멘에 이어서 탁솔을 투여받도록 무작위적으로 배정하였다 (N=1901). 이것은 약 51,327 회의 FISH 시험이 수행되었음을 의미한다 (27×1901). 27 개의 앰플리콘의 선택은 다음의 판단기준을 근거로 하였다: 1) 선택된 앰플리콘은 모두 폴락 (Pollack) 등 및 하이만 (Hyman) 등에 의해서 수행된 시험 둘 다에서 유방암 종양 또는 세포 라인에서 증폭되는 경우에 코드화된 유전자의 중등도 내지 고도의 수준의 유전자 발현과 연관되는 것으로 나타났다 (Pollack JR, Sorlie T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968; Hyman E, Kauraniemi P, Hautaniemi S et al., Cancer Res 2002l 62(21):6240-6245); 2) 공공 지놈서열 지도 (public genome sequence map)를 검사하고, 선택된 앰플리콘과 가장 잘 상응하는 FISH 인증된 BAC 클론을 선택하였다; 및 3) HER2에 매우 근접하게 위치하는 MLN64와 같은 일부의 앰플리콘이 시험의 재현성 및 타당성에 대한 내부 대조물로서 포함되었다 (즉, HER2 및 MLN64 증폭은 염색체 위치에 대한 그들의 근접성으로 인하여 매우 정확하게 서로 연관되는 것으로 예상되었다).

증폭상태는 증폭되거나 증폭되지 않은 것으로 분류되었으며, 여기에서 유전자 증폭은 동소하이브리드화로부터 4 개의 시그날 (단일 종양세포 핵 당 4 개의 도트) 이상을 갖는 것으로 정의된다. 단일변수 콕스 비례적 재해모델 (univariate Cox proportional hazard model)을 사용한 임상적 결과와의 상관관계는 HER2, MLN64 (이것은 HER2와 매우 근접하며, 고도로 서로 관련된다), cMYC, HTPAP, TPD52, MAL2 및 ZNF217이 B-28 실험에 도입된 환자의 임상적 결과와 상당히 서로 관련됨을 나타내었다 (표 1). 또한, 어떤 증폭의 존재 및 증폭의 수는 또한, 결과와 상당한 상관관계를 나타내었다. 스크리닝된 27 개의 앰플리콘 각각에 대한 카플란 마이어 플롯은 도 5 내지 31에 되시되어 있다. 증폭이 없는 증례 대 증폭이 있는 증례를 비교한 카플란 마이어 플롯은 도 32에 도시하였다.

통상적인 예후적 마커 (종양 크기, 양성 결절의 수, 호르몬 수용체 상태 및 연령)를 포함한 다변수 분석이 수행되었다. 세가지 앰플리콘은 여전히 유의적이었다: HER2; cMYC; 및 HTPAP (표 2에 나타낸 바와 같음).

HTPAP :

HER2 및 cMYC는 둘 다 이전에, 유방암에서 예후적인 것으로 나타났다. HER2는 헤르셉틴에 대한 치료학적 표적이다. 그러나, 화학요법 치료된 환자에서의 그들의 예후적 역할은 명백하게 입증되지 않았다. 다른 한편으로, HTPAP는 포스파티딘산 포스파타제 상동성 영역 및 5' 경막 영역 (transmembrane domain)뿐만 아니라 단백질 생성물이 분비되는 것을 시사하는 시그날 펩타이드를 갖는 단백질로 번역하는 신규한 유전자이다 (도 33). HTPAP에 대한 FISH 프로브의 생성을 위해서 사용된 박테리아성 인공 염색체 클론 (클론 RP11-513D5)은 그 안에 단지 세개의 유전자를 갖는다: HTPAP; WHSC1L1; 및 DDHD2. 이들 중에서, 유방암 세포 라인에서 유전자 증폭과 발현을 서로 연관시키는 그 밖의 다른 시험은 HTPAP가 이 부위가 증폭되는 경우에 과발현되는 것임을 나타내었다 (Pollack JR, Sorlie T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968; Hyman E, Kauraniemi P, Hautaniemi S et al., Cancer Res 2002; 62(21):6240-6245; Ray ME, Yang ZQ, Albertson D et al., Cancer Res 2004; 64(1):40-47). 유방암에서 유전자 발현의 마이크로어레이 분석으로부터의 데이타를 검토하여 보면, 젠센 (Jensen) 등은 HTPAP 과발현이 94 개의 다른 유전자와 함께 유방암이 있는 환자의 불량한 예후와 연관된다고 보고하였다 (Jenssen TK, Kuo WP, Stokke T, Hovig E. Associations between gene expression in breast cancer and patient survival. Hum Genet 2002; 111(4-5):411-420). 이들 결과는 HTPAP 유전자의 증폭이 표준 화학요법에 의한 치료 후에도 유방암에 대한 독립적인 예언자임을 입증한다.

HER2 및 cMYC는 둘 다 이전에 유방암에서 예후적인 것으로 밝혀졌다. HER2는 헤르셉틴에 대한 치료학적 표적이다. 다른 한편으로, HTPAP는 포스파티딘산 포스파타제 상동성 영역 및 5' 경막 영역뿐만 아니라 단백질 생성물이 분비되는 것을 시사하는 시그날 펩타이드를 갖는 단백질로 해독하는 신규한 유전자이다 (도 33).

8p11-12 증폭이 있는 제한된 수의 유방암에서 HTPAP의 증폭 및 과발현은 다른 연구자들에 의해서 이전에 기술되었지만, 이들 연구는 이들 증폭에서 주 된 구동 유전자 (main driver gene)로서 HTPAP를 특정하지 않았는데, 이는 증폭의 부분으로부터 과발현되는 다른 유전자가 있기 때문이다. HTPAP가 유일한 과발현 유전자인 단지 세개의 유전자를 함유하는 비교적 작은 FISH 프로브의 사용, 및 단일의 예상되는 임상실험으로부터 소정의 처리에 의한 다수의 증례의 스크리닝을 이용함으로써, 본 발명은 유방암에서 다른 예견자와는 무관한 예후적 인자로서의 그의 역할을 처음으로 입증한 것이다. 이것은 증폭되어 표준 화학요법 후에도 불량한 예후와 상관관계가 있기 때문에, HTPAP는 또한 유방암에 대한 중요한 치료학적 표적이다.

HTPAP의 이하의 특징은 이것을 유방암에서 이상적인 치료학적 및 진단적 표적으로 만든다: 1) HTPAP를 증폭시키고, FISH 또는 PCR을 사용한 안정한 임상적 진단시험을 사용하여 증폭상태를 검출할 수 있으며; 2) 이것은 심하게 치료된 환자에서 독립적인 예후적 인자이고; 3) 이것은 효소활성을 갖는 경막 단백질이며; 4) 이것은 또한 분비된다.

열등한 예후와 고도의 상관관계가 있는 이 유전자의 증폭은 이들 활성의 차단이 유익한 치료학적 효과를 가질 것임을 시사한다 (증폭되는 것과 유사한 특징을 갖는 HER2 유전자, 예후적 인자, 및 세포표면 수용체로 예시됨).

본 발명의 특정한 구체예에는 모노클로날 항체, 또는 HTPAP 단백질의 세포외 영역에 대해서 특이성을 갖는 일련의 모노클로날 항체가 포함된다. 이들 항체는 단독으로, 또는 다른 표적에 대한 항체 또는 화학요법용 약물과 함께 사용될 수 있다. 이러한 항체의 생성은 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 모노클로날 생산을 위한 어떤 수의 방법에 의해서도 수행될 수 있다.

본 발명의 특정한 구체예에서는, 이들 안티-HTPAP 항체를 사용하여 혈청 또는 혈장 또는 체액 (예를 들어, 환자로부터의 유두 흡인액 (nipple aspirate)) 내에 분비된 HTPAP 단백질을 검출하고, 치료 중에 질병을 진단 또는 모니터할 때에 정상 수준과 비교한다. 검출은 방사성면역측정법, 유동세포분석법, ELISA 또는 그 밖의 다른 비색측정법을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 본 기술분야에서 잘 알려진 어떤 수의 방법에 의해서도 수행될 수 있다.

포스파티딘산 포스파타제 영역은 일반적으로 암세포에서 중요한 시그날링 분자로서 작용한다. 본 발명의 특정한 구체예에는 HTPAP 유전자의 이들 영역을 이러한 활성을 저해하거나 변조시키는 소분자의 개발을 표적화하는데 사용하는 것을 포함한다. 더구나, HTPAP에 대한 항체의 사용은 HTPAP에 대한 하류 시그날링 분자를 확인하기 위해서 사용되고, 이어서 소분자 치료제에 의해서 표적화될 수 있다.

그 밖의 다른 특정한 구체예에는 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 리보자임 방법를 사용한 HTPAP 유전자 활성의 차단이 포함된다.

AC 또는 ACT 치료된 결절 양성 유방암의 시험 코호트에서 한계적 예후능 (marginal prognostic power)를 갖는 것으로 확인된 다른 유전자는 처리되지 않거나 결절 음성인 환자에게서 상당한 예후능을 가질 수 있다 - 이들에는 TPD52, MAL2, ZNF217, NCOA3, ZHX1, BM_009, BMP7 및 STK6이 포함되며, 이들은 또한 치료학적 개발을 위한 매력적인 표적을 제공할 수 있다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 세가지의 증폭된 예후적 유전자 HER2, cMYC 및 HTPAP는 유방암 환자에 대한 치료결정을 내리도록 유도하기 위한 예후지수 (prognostic index)를 만들어내기 위하여 이용될 수 있다. 그 밖의 다른 특정의 구체예는 치료결정을 내리도록 유도하기 위한 예후지수를 생성시키기 위하여 임상적 변수와 함께 동일한 세가지 유전자를 포함한다.

cMYC 예보자:

cMYC 증폭에 의한 악성 변형을 위해서 자극된 세포는 HER2 증폭의 도움을 받아서 세포소멸의 운명을 벗어날 수 있는 것으로 보이지만, 이것은 또한 이들을 생존에 대한 HER2 시그날링에 의존적이도록 만드는 것으로 믿어진다 (도 2b). 따라서, 트라스투주마브에 의한 HER2 시그날의 억제는 이러한 암세포에서 cMYC의 전-세포소멸성 기능을 유발할 수 있다 (도 2c). 이것은 HER2 과발현성 종양으로 진단된 환자가 화학요법 또는 화학요법+헤르셉틴을 공급받도록 무작위화되는 NSABP 실험 B-31의 일부분으로 수집된 종양 시험편의 소급분석 (retrospective analysis)에서 입증되었다. 이 분석의 결과는 HER2 및 cMYC 유전자 둘 다의 공동-증폭이 있는 종양이 트라스투주마브에 대해서 민감함을 명백히 입증하였다.

유방암에서 임상적으로 중요한 유전자 증폭을 확인하기 위한 노력으로, FISH를 사용하여 유방암에서 공통적으로 증폭된 27 개의 상이한 유전자를 스크리닝하였다. 이미 언급한 바와 같이, 27 개의 다양한 유전자/유전자좌의 유전자 증폭상태와 1900 명의 환자의 임상적 결과를 서로 연관시키는 미공개된 시험에서 HER2, cMYC 및 HTPAP는 표준 병용 탁산-함유 아쥬번트 화학요법 후에 조차도 더 나쁜 예후를 부여하는 세개의 독립적인 증폭된 유전자로 확인되었다. 또한, HER2와 cMYC의 공동-증폭이 있는 증례는 어느 하나의 우전자의 증폭이 있는 증례보다 훨씬 더 나쁜 예후를 가졌다.

NSABP B-31 실험에 참여한 1344 명의 환자에서 cMYC의 상태는 HER2 증폭/과발현이 있는 초기 단계 유방암으로 진단된 환자의 치료시에 화학요법에 대한 트라스투주마브의 첨가의 잠재적인 이점을 시험하기 위하여 조사하였다. FISH는 상업적으로 이용가능한 DNA 프로브 (Vysis)를 사용하여 cMYC 유전자 카피수를 확인하기 위하여 사용되었다. 4 카피 이상의 cMYC 유전자를 나타내는 10% 이상의 세포를 갖는 모든 종양은 이 분석에서 증폭된 cMYC 유전자로 분류되었다. 시험한 총 1344 증례 중에서 399 증례가 증폭된 cMYC로 분류되었다. cMYC 증폭을 갖는 종양은 HER2 시그날이 트라스투주마브에 의해서 억제된 경우에 그의 전-세포소멸성 시그날의 활성화에 기인하여 HER2 시그날링의 억제에 대해서 민감한 것으로 믿어졌으며, 이것은 cMYC의 증폭이 없는 환자에 비해 cMYC 증폭된 코호트에서 재발율의 훨씬 더 상당한 감소로 해석할 수 있다.

cMYC 증폭상태에 따른 B-31 환자의 재발이 없는 생존은 도 34에 나타내었다. cMYC 유전자의 증폭이 없는 환자 (N=945)에서는 트라스투주마브를 화학요법에 첨가한 경우에 재발율에서 34% 감소가 있었다 (p=0.02). 다른 한편으로, cMYC 증폭이 있는 환자에서는 (N=399) 트라스투주마브를 화학요법에 첨가한 경우에 재발율에서 74% 감소가 있었다 (p<0.0001). 상호작용 시험에 대한 P-값은 두개의 코호트 사이에서의 이러한 차이가 통계학적으로 의미가 있는 것인지 여부를 측정하기 위하여 0.14였으며, 이것은 트라스투주마브 상호작용에 의한 cMYC를 입증하는 것이었다. 매우 불량한 예후로 시작함에도 불구하고, HER2 및 cMYC의 공동-증폭이 있는 환자는 화학요법과 함께 트라스투주마브에 의해서 이들 질병이 거의 치료된 상태가 되도록 귀결된다.

트라스투주마브가 HER2 과발현성 종양을 모두 치유하지는 않지만, 혈관형성의 억제제와 같은 다른 표적화된 치료법을 부가하는 전략이 유용할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 매우 독성이 있으며, 매우 비용이 많이 든다. cMYC 증폭된 증례는 트라스투주마브에 대한 그들의 민감성으로 인하여 (트라스투주마브 이외의) 추가의 치료법을 필요로 하지 않아야 한다. 따라서, 본 발명의 한가지는 트라스투주마브에 다른 표적화된 치료법을 부가하는 방법에 대하여 환자를 스크리닝하는 것이다. 또한, 본 발명은 cMYC 및 HER2 상태의 암환자 증폭을 측정하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 다른 HER2-표적화된 치료법에도 적용할 수 있는데, 이는 효과가 cMYC의 전-세포소멸성 역할의 활성화를 통해서 간접적인 것이기 때문이다. 즉, 본 명세서에 기술된 본 발명은 치료를 결정하고 트라스투주마브와 환자의 cMYC 및 HER2 상태를 근거로 한 다른 물질로 환자를 치료하는 방법을 포함한다.

그 밖의 다른 구체예에서, 본 발명은 HER2 증폭이 없는 cMYC 증폭된 종양에서 cMYC의 전-세포소멸성 기능을 이용하는데 적용될 수 있다. cMYC 활성을 직접적으로 억제하는 대신에 생존 시그날을 억제하는 간접적인 방법은 cMYC의 전-세포소멸성 기능의 활성화에 의해서 이러한 종양이 세포사 프로그램을 거치도록 만들 수 있는 것 같다.

본 발명에서 cMYC에 대한 시험은 HER2, cMYC, HTPAP 및 기준 유전자를 포함하여 이들 세개의 유전자의 증폭의 존재를 동시에 검출하고, 트라스투주마브 또는 그 밖의 다른 HER2 표적화된 치료법에 대한 반응의 예견뿐만 아니라 예후 정보 둘다, 및 분석방법 및 이러한 분석방법의 결과를 근거로 환자를 치료하는 방법을 제공하는 단일 튜브 "실시간 (real-time)" 정량적 폴리머라제 연쇄반응 (PCR에서) 시험을 포함한 균질화된 종양조직에서의 FISH, 정량적 폴리머라제 연쇄반응, 면역조직화학 또는 그 밖의 다른 면역학적 검출방법의 형태일 수 있다. 그 밖의 다른 구체예에서, 본 발명은 HER2 증폭이 없는 cMYC 증폭된 종양에서 cMYC의 전-세포소멸성 기능을 이용하는데 적용될 수 있다. cMYC 활성을 직접적으로 억제하는 대신에 생존 시그날을 억제하는 간접적인 방법은 cMYC의 전-세포소멸성 기능의 활성화에 의해서 이러한 종양이 세포사 프로그램을 거치도록 만들 수 있는 것 같다.

Claims

유방암이 있는 환자에게서 HTPAP의 발현 수준 또는 증폭을 측정하고;

증가된 수준의 HTAP 발현 또는 HTPAP 증폭이 있는 환자에게 HTPAP의 포스파티딘산 포스파타제 활성을 저해하는 1종 이상의 화합물의 치료학적 양을 제공하는 것

을 포함하는, 유방암을 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서, HTPAP의 발현 수준이 효소-결합된 면역흡착시험, 방사선면역측정법 및 유동세포분석법으로 구성된 군으로부터 선택되는 기술에 의해서 측정되는 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 효소-결합된 면역흡착시험이 가용성 HTPAP 단백질 농도를 측정하기 위하여 환자로부터의 상등액에 대해서 수행되는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, HTPAP의 발현 수준이 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄반응시험을 통해서 측정되는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 1종 이상의 화합물이 안티-HTPAP 특이적 항체인 것인 방법.
제 5 항에 있어서, 안티-HTPAP 특이적 항체가 인간화된 모노클로날 항체인 것인 방법.
제 1 항에 있어서, HTPAP 증폭이 형광동소하이브리드화를 통해서 측정되는 방법.
유방암이 있는 환자에게서 HTPAP의 발현 수준 또는 증폭을 측정하는 것을 포함하며, HTPAP의 양의 감소는 유익한 치료를 나타내는 것인, 유방암 치료를 모니터하는 방법.
제 8 항에 있어서, HTPAP의 발현 수준이 효소-결합된 면역흡착시험, 방사선면역측정법 및 유동세포분석법으로 구성된 군으로부터 선택되는 기술에 의해서 측정되는 것인 방법.
제 9 항에 있어서, 효소-결합된 면역흡착시험이 가용성 HTPAP 단백질 농도를 측정하기 위하여 환자로부터의 상등액에 대해서 수행되는 것인 방법.
제 8 항에 있어서, HTPAP의 발현 수준이 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄반응시험을 통해서 측정되는 것인 방법.
제 8 항에 있어서, HTPAP 증폭이 형광동소하이브리드화를 통해서 측정되는 것인 방법.
유방암 환자를 cMYC 유전자의 증폭에 대해서 스크리닝하고;

cMYC 유전자의 증폭이 있는 환자를 HER2 시그날링을 저해하는 화합물의 치료학적 양으로 치료하는 것

을 포함하여, 유방암을 치료하는 방법.
제 13 항에 있어서, HER2 시그날링을 저해하는 화합물이 트라스투주마브 (Trastuzumab)인 방법.
제 13 항에 있어서, cMYC 유전자의 증폭에 대한 스크리닝이 암조직의 샘플을 사용한 형광동소하이브리드화를 통해서 수행되는 것인 방법.
제 13 항에 있어서, HER2 유전자의 증폭에 대해서 유방암 환자를 스크리닝하는 것을 더 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서, HER2 유전자의 증폭에 대한 스크리닝이 암조직의 샘플을 사용한 형광동소하이브리드화를 통해서 수행되는 것인 방법.
제 16 항에 있어서, HER2 시그날링을 저해하는 화합물의 치료학적 양이 cMYC 및 HER2 유전자 둘 다의 증폭을 갖는 환자를 치료하는데 사용되는 것인 방법.
제 13 항에 있어서, 환자를 HER2 시그날링을 저해하는 화합물과 함께 화학요법으로 치료하는 것을 더 포함하는 방법.
제 13 항에 있어서, cMYC 유전자의 증폭에 대한 스크리닝이 암조직의 샘플을 사용한 형광동소하이브리드화를 통해서 수행되는 것인 방법.
임상적 추적 데이타로 주석을 단 다수의 조직샘플을 포함하는 조직은행으로부터 조직 마이크로어레이를 구성하고;

종양형성원 또는 잠재적인 앰플리콘으로 알려진 암 연관된 유전자에 대해서 특이적인 폴리핵산 프로브를 표지하고;

조직 마이크로어레이에 대해서 형광동소하이브리드화 분석을 수행하고;

형광동소하이브리드화의 결과를 임상적 추적 데이타와 상호 연관시키는 것

을 포함하여, 명시된 암의 효능을 예견하는데 유용한 마커를 스크리닝하는 방법.