KR20070101258A - Immunochromatogaraphic test instrument and semiquantitative method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 면역학적 크로마토그래피(면역 크로마토그래피법)를 사용하여, 검체 중의 측정 대상물질을 반정량하기 위한 시험구, 및 이 시험구를 사용한 반정량 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a test piece for semi-quantifying a substance to be measured in a sample using immunological chromatography (immune chromatography), and a semi-quantitative method using the test piece.
면역 크로마토그래피용 시험구는 혈청 또는 혈장을 포함하는 혈액, 뇨 등의 체액 등을 검체로 하여 혈청 검체 중의 항-HBs 항원의 검출, 혈청 또는 혈장 검체 중의 항-트레포네마팔리덤 항체의 검출, 혈액형의 판정, 뇨 검체 중의 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)의 검출 등에 사용되고 있다.The immunochromatography test kit is for detecting anti-HBs antigens in serum samples, anti-treponemapallidum antibodies in serum or plasma samples, blood types, using blood or urine or other body fluids including serum or plasma. And detection of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine specimens.
도 5는 종래의 면역 크로마토그래피용 시험구의 일예를 나타내는 개념도이며, 도 5a는 면역 크로마토그래피용 시험구의 평면도이며, 도 5b는 그 측면도이다. 도 5c는 도 5a와 동일한 도이지만, 사용 후의 면역 크로마토그래피용 시험구를 나타내고 있다.FIG. 5 is a conceptual diagram showing an example of a conventional test kit for immunochromatography, FIG. 5A is a plan view of the test kit for immunochromatography, and FIG. 5B is a side view thereof. Although FIG. 5C is the same drawing as FIG. 5A, the test tool for immunochromatography after use is shown.
도 5a 및 5b에 나타내는 면역 크로마토그래피용 시험구(11)에서는, 시트상의 기체(12) 상에 샘플 패드(13)가 형성되어 있다. 시험구(11)를 사용하는 경우, 그 샘플 패드(13)를 측정 대상이 되는 검체에 침지시킨다. 샘플 패드(13)에 흡수된 검체는 모관 현상에 의해 그 샘플 패드(13)에 인접해서 형성된 시약 패드(14)로 이동한다. 시약 패드(14)에는 표지된 항체 또는 항원이 담지되어 있다.In the test tool for
샘플 패드(13)에 흡수된 검체가 시약 패드(14)에 도달하면, 시약 패드(14)에 담지되어 있는 표지된 항체 또는 항원이 용출된다. 검체 중의 측정 대상물질과 표지된 항체 또는 항원은 복합체를 형성하는 경우도 있다. 이것들을 포함한 검체는 모관 현상에 의해 시약 패드(14)에 인접해서 형성된 다공체(15)로 이동한다. 다공체(15)에 도달한 복합체는 모관 현상에 의해 하류방향(도면 중, 샘플 패드(13) 측을 상류측으로 한 경우)으로 이동한다.When the sample absorbed in the
다공체(15) 상에는 항체 또는 항원을 고정한 반응영역(16)이 형성되어 있다. 모관 현상에 의해 다공체(15) 중을 이동해 온 항원, 항체, 혹은 상기 복합체는 반응영역(16)에서 포착된다. 도 5c에 나타내는 바와 같이 이 포착은 그 영역(16)에서의 정색(呈色, coloration)(16')에 의해 확인할 수 있다. 이렇게 하여, 검체 중의 측정 대상물질의 유무를 눈으로 확인할 수 있다.On the
시험구(11)의 더 하류측에는 검체 중의 다른 성분 및 포착되지 않았던 측정 대상물질 등을 흡수하기 위한 흡수패드(17)가 형성되고 있다.Further downstream of the
또, 도시한 면역 크로마토그래피용 시험구를 사용하여, 검체 중의 측정 대상물질을 반정량할 수도 있다. 예를 들면 각각 측정 대상물질에 대한 검출 감도가 다른 반응영역(16)을 복수 형성하고, 정색(16')이 발생한 영역(16) 수에 의해, 검체 중의 측정 대상물질을 반정량할 수 있다.In addition, the test target for immunochromatography can be used to semi-quantify the substance to be measured in the sample. For example, a plurality of
이러한 면역 크로마토그래피용 시험구 및 이것을 사용해서 검체 중의 측정 대상물질을 검출하는 방법 또는 그 측정 대상물질을 반정량하는 방법이 특허문헌1∼6에 기재되어 있다.
특허문헌 1에는 액체 중의 항원 또는 항체를 면역 크로마토그래피법을 원리로 하는 시트상의 시험구를 사용해서 측정하는 방법에 관한 기재가 있다. 그러나, 해당 문헌에는 항원 또는 항체를 반정량하는 것에 관한 개시, 시사는 없으며, 다공체 상에 표준 정색을 나타내는 영역을 가지는 시험구에 관한 개시, 시사도 없다.
특허문헌 2에는, 색소 표지한 항원 또는 항체를 사용하여 액체 중의 항원 또는 항체의 존부를 측정하기 위한 시험구에 관한 기재가 있다. 그러나, 해당 문헌에도 항원 또는 항체를 반정량하는 것에 관한 개시, 시사는 없으며, 다공체 상에 표준 정색을 나타내는 영역을 가지는 시험구에 관한 개시, 시사도 없다.
특허문헌 3에는, 검체 용액 중의 항원 또는 항체를 정량하기 위한 시험구에 관한 기재가 있다. 이 시험구는 상류로부터 하류를 향해서 증가하는 량의 포착시약이 고정화되어 있는 복수의 반응영역을 가지는 것을 특징으로 하고, 발색한 반응영역의 수에 의해 분석 대상을 정량하는 것이다. 반응영역이 복수인 것이 필수요건이지만, 반응영역을 복수 형성하는 것은, 제조공정이 번잡하게 되어 바람직하지 못하다. 또 이 시험구에는 다공체 상에 표준 정색을 나타내는 영역을 가지는 시험구에 관한 개시, 시사는 없다.
특허문헌 4에는, 검체 용액 중의 항원 또는 항체를 반정량하기 위한 시험구에 관한 기재가 있다. 이 시험구는 입자 표지된 항원 또는 항체, 검체 용액의 전개 방향에 대해서 직렬에 나열되어 있는 복수의 반응영역을 가지고, 샌드위치법의 원리에 의해 항원 또는 항체의 량을 반정량적으로 추측할 수 있다는 취지의의 개시가 있다. 반응영역이 복수인 것이 필수요건이지만, 반응영역을 복수 형성하는 것은, 제조공정이 번잡하게 되어 바람직하지 못하다. 또 이 시험구에는 다공체 상에 표준 정색을 나타내는 영역을 가지는 시험구에 관한 개시, 시사는 없다.
특허문헌 5에는, 동일 막 상에 일정한 색조가 나타나는 부분과 검체의 농도 의존성의 색조가 나타나는 부분을 구비한 면역학적 크로마트 분석편을 사용하여, 그 면역학적 크로마트 분석편에 미지 농도의 검체를 주입하고 크로마트 전개시킨 후, 일정한 색조가 나타나는 부분의 색조와, 검체의 농도 의존성의 색조가 나타나는 부분의 색조를 광학적 농도 측정장치 또는 목시(目視)적으로 리딩 미지 검체의 농도를 측정하는 방법이 기재되어 있다. 해당 방법은 대조의 정색 영역과, 검체의 농도 의존성의 정색 영역이 동일 막 상에 있는 점이 특징적이지만, 이 대조의 정색 영역은 검체와는 다른 고정화 항체 및 표지항체를 사용하여 정색시키는 것으로, 번잡함과 동시에, 특정한 검체의 농도에 상당하는 정색으로 조정하는 것은 용이하지 않다.
특허문헌 6에는, 모관 현상에 의해 검체가 이동하는 다공체 상에 판정 라인의 종별표시가 직접 인쇄된 면역 크로마토그래피용 시험구가 기재되어 있다. 특허문헌6에 기재되어 있는 바와 같이, 모관 현상에 의해 검체가 이동하는 다공체 상에 인쇄를 실시한다는 발상은 특허문헌 6 이전에는 없고, 그 다공체 상에 측정 대상물질의 농도를 측정하는데 유용한 표시를 형성한다는 사상은 종래에는 전혀 없었다.
특허문헌 1: 일본 공개특허공보 H07-55808호 Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-Open No. H07-55808
특허문헌 2: 일본 공개특허공보 H10-73592호 Patent Document 2: Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-73592
특허문헌 3: 일본 공개특허공보 H05-5743호 Patent Document 3: Japanese Patent Application Laid-Open No. H05-5743
특허문헌 4: 일본 공개특허공보 H08-278305호 Patent Document 4: JP H08-278305
특허문헌 5: 일본 공개특허공보 2001-83153호 Patent Document 5: Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-83153
특허문헌 6: 일본 공개특허공보 2001-13143호Patent Document 6: Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-13143
발명이 해결하려고 하는 과제Challenges the invention seeks to solve
따라서, 본 발명은 면역 크로마토그래피법을 사용하여 제조가 용이고, 또한 검체 중에 포함되는 측정 대상물질의 농도를 용이하게 반정량하기 위한 신규의 시험구, 및 이 시험구를 이용한 반정량 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, the present invention provides a novel test apparatus for easy production using an immunochromatography method, and a semi-quantitative method for easily semi-quantifying the concentration of a measurement target contained in a sample, and a semi-quantitative method using the test tool. It aims to do it.
과제를 해결하기 위한 수단Means to solve the problem
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 검체가 모관 현상에 의해 이동 가능한 다공체를 가지는 면역 크로마토그래피용 시험구로서,In order to achieve the above object, the present invention provides a test instrument for immunochromatography having a porous body in which a specimen is movable by capillary phenomenon,
(1) 상기 검체 중의 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는, 표지된 항체 또는 항원이, 이동 가능한 상태로 배치된 영역,(1) a region in which a labeled antibody or antigen capable of specifically binding to a substance to be measured in the sample is arranged in a movable state,
2) 상기 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역, 및,2) a region in which an antibody or antigen that can specifically bind to the measurement target substance is arranged in a fixed state on the porous body, and
(3) 상기 측정 대상물질의 특정한 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역을 가지며,(3) has a region in which a standard color corresponding to a color at a specific concentration of the measurement target material is arranged fixed on the porous body,
상기 영역(2)에 발생하는 정색과, 상기 표준 정색을 비교하는 것에 의해, 상기 검체 중의 상기 측정 대상물질을 반정량하기 위한 시험구(이하, 「본 발명의 시험구」라고 한다.)를 제공한다.A test tool (hereinafter referred to as the "test tool of the present invention") for semi-quantifying the measurement target substance in the sample by comparing the color generated in the
본 발명의 시험구의 바람직한 형태로서, 상기 (2)의 상기 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역과, 상기 (3)의 상기 측정 대상물질의 특정한 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역이, 전개용매의 전개방향에 대해서, 직렬 또는 병렬로 배치된 상기 시험구를 들 수 있다.As a preferable aspect of the test tool of the present invention, a region in which an antibody or antigen capable of specifically binding to the measurement target material of (2) is disposed on the porous body, and the measurement of (3) above The test instrument in which a region in which a standard color corresponding to a color at a specific concentration of a target substance is fixed on the porous body is arranged in the series or parallel to the developing direction of the developing solvent is mentioned.
본 발명의 시험구의 다른 바람직한 형태로서, 상기 (1)의 상기 검체 중의 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는, 표지된 항체 또는 항원이 이동 가능한 상태로 배치된 영역에 사용하는 표지용 색소와, 상기 (3)의 상기 측정 대상물질의 특정한 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역에 사용하는 표준 정색용 색소가 동일한 색소인 상기 시험구를 들 수 있다.As another preferable form of the test tool of the present invention, the labeling pigment used in the region in which the labeled antibody or antigen is movable in a state where the labeled antibody or antigen which can specifically bind to the substance to be measured in the sample of (1) and And the test sphere wherein the standard coloring pigment used in the region where the standard coloring corresponding to the coloring at a specific concentration of the measurement target substance of the above (3) is fixed on the porous body is the same dye. have.
또, 본 발명은 본 발명의 시험구를 사용하여 검체 중의 측정 대상물질을 반정량하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for semi-quantifying a substance to be measured in a sample using the test tool of the present invention.
발명의 효과Effects of the Invention
본 발명의 시험구는 면역 크로마토그래피용 시험구의 다공체 상에 고정된 표준 정색과, 측정 대상물질이 다공체 상에 고정된 항체 또는 항원에 포착 되는 것에 의해서 발생하는 정색을 비교함으로써, 검체 중에 포함되는 측정 대상물질을 용이하게 반정량할 수 있다.The test sphere of the present invention compares the standard color immobilized on the porous body of the test chromatography for immunochromatography with the color generated by being captured by the antibody or antigen immobilized on the porous body, thereby being included in the sample. The material can be easily semi-quantified.
또, 본 발명의 시험구는 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원이 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역(반응영역), 및 측정 대상물질의 특정한 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역을 가지기 때문에, 동일 조건하에서 반응영역의 정색과 표준 정색을 비교하는 것이 가능하여, 높은 정밀도를 얻을 수 있다.In addition, the test apparatus of the present invention corresponds to a region (reaction zone) in which an antibody or antigen that can specifically bind to a substance to be measured is immobilized on a porous body, and to color at a specific concentration of the substance to be measured. Since the standard color has a region arranged in a fixed state on the porous body, it is possible to compare the color of the reaction region with the standard color under the same conditions, thereby obtaining high precision.
또, 본 발명의 시험구는 적어도 1개의 반응영역과, 표준 정색을 나타내는 영역이 있으면, 반정량이 가능하기 때문에, 반정량하기 위해서 복수의 반응영역을 필수요건으로 하는 시험구에 비해서, 간편하게 제조할 수 있다. 또 표준 정색을 나타내는 영역에 대해서는 색소 등을, 항체, 항원 등을 통하지 않고, 직접 다공체 상에 고정하고 있기 때문에, 항체, 항원 등을 통해서 고정하는 것을 필수요건으로 하는 시험구에 비해서, 간편하게 제조할 수 있다. 또 간접적으로 항원 항체 반응 등의 반응을 통하지 않고 본 시험구를 사용하는 데 있어서, 상기 표준 정색의 색조가 여러 가지 사용 조건의 차이에 전혀 영향 받지 않는다.In addition, since the test tool of the present invention has at least one reaction region and a region showing standard coloration, semi-quantification is possible. Therefore, the test tool of the present invention can be easily prepared as compared with a test tool having a plurality of reaction regions as essential requirements for semi-quantification. Can be. In addition, since the pigment or the like is directly fixed on the porous body without passing through antibodies, antigens, or the like for the region showing standard coloration, it is easier to prepare the pigments, etc., than the test strips that require fixing with antibodies, antigens, or the like. Can be. In addition, when using this test tool indirectly without a reaction such as an antigen antibody reaction, the color tone of the standard color is not affected at all by the difference in various conditions of use.
도 1은 본 발명의 시험구의 1 실시형태의 개념도이다.1 is a conceptual diagram of one embodiment of a test fixture of the present invention.
도 2는 도 1의 시험구의 측면도이다.FIG. 2 is a side view of the test fixture of FIG. 1. FIG.
도 3은 각종 농도로 조정한 hCG에 본 발명의 시험구를 침지시킨 후의 표준 정색(8) 및 정색(6')의 정색도의 정도의 경시변화를 본 그래프이다.Fig. 3 is a graph showing the change over time of the degree of color intensity of
도 4a는 실시예에서 사용된 시험구의 평면도로서, 뇨 검체에 침지시키기 전 의 미사용의 시험구를 나타내고 있다. 4A is a plan view of the test tool used in the example, showing an unused test tool before being immersed in the urine sample.
도 4b는 실시예에서 사용된 시험구의 평면도로서, hCG농도 25 IU/L의 검체를 사용하여 반정량을 실시한 후의 시험구를 나타내고 있다. 4B is a plan view of the test tool used in the Example, showing the test tool after semi-quantification using a sample having a hCG concentration of 25 IU / L.
도 4c는 실시예에서 사용된 시험구의 평면도로서, hCG농도 1000 IU/L의 검체를 사용하여 반정량을 실시한 후의 시험구를 나타내고 있다. Fig. 4C is a plan view of the test tool used in the example, and shows the test tool after semi-quantification using a sample having a hCG concentration of 1000 IU / L.
도 4d는 실시예에서 사용된 시험구의 평면도로서, hCG농도 10000 IU/L의 검체를 사용하여 반정량을 실시한 후의 시험구를 나타내고 있다. FIG. 4D is a plan view of the test sphere used in the Example, and shows the test sphere after semi-quantification using a sample having a hCG concentration of 10000 IU / L.
도 4e는 실시예에서 사용된 시험구의 평면도로서, hCG농도 0 IU/L(음성)의 검체를 사용하여 반정량을 실시한 후의 시험구를 나타내고 있다. Fig. 4E is a plan view of the test sphere used in the example, and shows the test sphere after semi-quantification using a sample having a hCG concentration of 0 IU / L (negative).
도 5a는 종래의 면역 크로마토그래피법용 시험구를 나타내는 개념도로서, 시험구를 평면도에 의해 나타내고 있다. Fig. 5A is a conceptual diagram showing a test tool for a conventional immunochromatography method, and the test tool is shown by a plan view.
도 5b는 도 5a에 나타내는 시험구의 측면도이다. FIG. 5B is a side view of the test fixture shown in FIG. 5A. FIG.
도 5c는 도 5a와 동일한 도이지만, 사용후의 시험구를 나타내고 있다.Although FIG. 5C is the same view as FIG. 5A, the test tool after use is shown.
부호의 설명 Explanation of the sign
1: 시험구 2: 기체 1: Test Specimen 2: Gas
3: 샘플 패드 4: 시약 패드 3: sample pad 4: reagent pad
5: 다공체 6: 반응영역 5: porous body 6: reaction zone
6': 정색 7: 흡수패드 6 ': color 7: absorption pad
8: 표준 정색 9: 영역 8: Standard color: 9: Area
9': 정색 11: 시험구 9 ': color 11: test sphere
12: 기체 13: 샘플 패드 12: gas 13: sample pad
14: 시약 패드 15: 다공체 14: reagent pad 15: porous body
16: 반응영역 16': 정색 16: reaction zone 16 ': color
17: 흡수패드 20: 보호필름 17: absorbent pad 20: protective film
21: 투명부분 22: 창 21: transparent part 22: window
23, 23', 23": 불투명 부분23, 23 ', 23 ": opaque portion
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 시험구에 관하여 설명한다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the test tool of this invention is demonstrated with reference to drawings.
도 1은 본 발명의 시험구의 1 실시형태의 개념도이며, 도 2는 도 1에 나타내는 시험구의 측면도이다.1 is a conceptual diagram of one embodiment of a test fixture of the present invention, and FIG. 2 is a side view of the test fixture shown in FIG. 1.
도 1 및 도 2에 나타내는 시험구(1)는 시트상의 기체(2) 상에 샘플 패드(3), 시약 패드(4), 다공체(5) 및 흡수패드(7)가 형성되어 있다. 시험구(1) 중, 시약 패드(4), 다공체(5) 및 흡수패드(7)는 보호필름(20)에 의해 피복되어 있다.In the
이하, 본 발명의 시험구(1)의 각 구성요소에 관하여 설명한다.Hereinafter, each component of the
도 1에 나타내는 시험구(1)에 있어서, 각 구성요소는 시트상의 기체(2) 상에 형성되어 있다. 기체(2)는 면역 크로마토그래피법 시에 각 구성요소 중을 통과하는 검체를 흡수 또는 투과하지 않으며, 검체가 접촉하였을 때에, 검체를 변성시키지 않는 재료로 제작된다. 이러한 재료로서는 의료용구에 사용되는 플라스틱 재료, 구체적으로는 예를 들면 염화비닐, 폴리에틸렌, 에틸렌아세트산비닐 수지, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리스틸렌, 실리콘수지, 불소수지, 폴리에틸 렌테레프탈레이트, 폴리아미드, ABS 수지 등을 들 수 있다. 또 기체(2)는 표면에 발수 발유 가공된 종이제 일수도 있다. In the
샘플 패드(3)는 검체가 적하되는, 또는 검체 중에 침지되는 부위로서, 검체 중에 불용성 물질이 존재하고 있는 경우, 그 불용성 물질을 제거하는 필터로서도 작용한다. 이 관점에서, 샘플 패드(3)는 입경 20㎛∼100㎛, 바람직하게는 30㎛∼40㎛의 부직포 또는 다공질막이 예시되지만, 특별히 이것들에 한정되지 않는다. 샘플 패드(3)에 사용 가능한 재료로서는, 일정량의 검체를 채취할 수 있고, 친수성이며, 필터 기능을 가지는 것이라면 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면 재생 셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 니트로셀룰로오스, 폴리아크릴로니트릴, 에틸렌아세트산비닐, 폴리우레탄, 폴리메틸메타크릴레이트, 나일론 수지, 유리섬유, 펄프, 면, 레이온, 아크릴, 폴리에스테르 등이 예시되지만, 특별히 이것들에 한정되지 않는다.The
샘플 패드(3)에 적하된 검체는 모관 현상에 의해서 하류방향, 즉 시약 패드(4)로 이동한다. 이하, 본 명세서에 있어서, 시험구(1)의 샘플 패드(3)의 측을 상류측으로 하고, 그 반대측을 하류측으로 한다. 또 샘플 패드(3)에 적하된 검체라고 말한 경우, 샘플 패드(3)를 검체에 침지된 결과, 그 샘플 패드(3) 중에 포함된 검체도 의미한다.The sample dropped on the
시약 패드(4)의 재질로서는 샘플 패드(3)와 동일하게, 부직포 또는 다공질막이 예시되지만, 특별히 이것들에 한정되지 않는다. 시약 패드(4)에는 검체 중의 측정 대상물질과 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 항원이 색소 등의 표지물질로 표 지된 상태로 담지되어 있다.As a material of the
측정 대상물질과 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 항원은 측정 대상물질에 따라서 적당하게 선택된다. 측정 대상물질이 뇨 검체 중의 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)인 경우, 항-hCC 항체, 더 상세하게는, 항-hCC 마우스 폴리클로널 항체, 항-hCG 마우스 모노클로널 항체 등이 사용된다. 측정 대상물질이 알파페토프로틴(AFP)인 경우, 항-AFP 항체가 사용된다. 측정 대상물질이 항-HIV 항체인 경우, HIV항원 펩티드 등이 사용된다. 측정 대상물질이 반정량이 필요한 암 마커인 전립선 특이항원(PSA)인 경우, 예를 들면 항-인간 PSA 토끼 항체 등이 사용된다.Antibodies or antigens that can specifically bind to the measurement target are appropriately selected depending on the measurement target. When the substance to be measured is human chorionic gonadotropin (hCG) in the urine sample, an anti-hCC antibody, more specifically, an anti-hCC mouse polyclonal antibody, an anti-hCG mouse monoclonal antibody, or the like is used. . If the substance to be measured is alphafetoprotein (AFP), an anti-AFP antibody is used. When the substance to be measured is an anti-HIV antibody, an HIV antigen peptide or the like is used. When the substance to be measured is a prostate specific antigen (PSA), which is a semi-quantitative cancer marker, for example, an anti-human PSA rabbit antibody or the like is used.
표지물질로서는 가시적으로 발색이 인정되는 것이라면, 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 금 콜로이드로 대표되는 금속 콜로이드, 비금속 콜로이드, 염료졸 혹은 분산염료와 같은 염료입자, 라텍스 입자 또는 착색 미립자 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 발색성이 우수하고, 색조 및 입자경이 풍부하고, 항체 혹은 항원에로의 표지화 방법이 복수 존재하는 등의 관점에서, 염료 혹은 안료로 착색된 라텍스 미립자 또는 폴리스틸렌 미립자가 바람직하다. 한편, 이 표지화 방법은 당업자에 의해 주지되어 있으며, 흡착에 의한 방법이나 화학결합에 의한 방법 등이 있다. 특히, 염료 혹은 안료로 착색된 입경 0.5㎛ 이하, 바람직하게는 입경 0.05∼0.5㎛의 구상(球狀) 또는 거의 구상(球狀)의 라텍스 미립자 또는 폴리스틸렌 미립자가 바람직하다. 가장 바람직하게는 블루 라텍스이다.The labeling substance is not particularly limited as long as it can be visually recognized. Examples of the labeling substance include metal colloids, non-metal colloids, dye particles such as dye sol or dispersion dyes, latex particles or colored fine particles represented by gold colloids. have. Among them, latex fine particles or polystyrene fine particles colored with dyes or pigments are preferable from the viewpoint of excellent color development, rich color tone and particle diameter, and plural labeling methods for antibodies or antigens. On the other hand, this labeling method is well known by those skilled in the art, and there are a method by adsorption, a method by chemical bonding, and the like. Particularly, spherical or nearly spherical latex fine particles or polystyrene fine particles having a particle size of 0.5 μm or less, preferably a particle size of 0.05 to 0.5 μm, colored with a dye or pigment are preferable. Most preferably blue latex.
표지된 항체 또는 항원은 이동 가능한 상태로 시약 패드(4)에 담지되어 있다. 여기에서, 이동 가능한 상태로 담지되어 있다고 하는 것은 미 사용시, 즉 시 약 패드(4)가 건조되어 있는 상태에서는, 표지된 항체 또는 항원이 시약 패드(4) 속에 유지되고 있지만, 사용시, 즉 검체의 도달에 의해 시약 패드(4)가 습윤하게 되면, 표지된 항체 또는 항원은 이동 가능하게 되는 것을 의미한다. 이것을 위해서는, 시약 패드(4)가 표지된 항체 또는 항원을 흡착하지 않는 재료가 아니면 안되지만, 흡착해버리는 재료라면, 미리 별도의 BSA 등의 불활성의 단백질로 마스킹 처리함으로써 사용할 수 있다. 그렇게 해서 표지된 항체 또는 항원은 예를 들면 시약 패드(4)에 함침시킨 후, 동결건조함으로써, 시약 패드(4)에 유지되고 있다.The labeled antibody or antigen is carried on the
따라서 시험구(1)에서는 시약 패드(4)가 검체 중의 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는 표지된 항체 또는 항원이 이동 가능한 상태로 배치된 영역을 이루고 있다.Therefore, in the
샘플 패드(3)에 적하된 검체는 모관 현상에 의해 시약 패드(4)로 이동한다. 이 때문에, 시약 패드(4)의 입경은 샘플 패드(3)보다도 입경이 같거나 작은 것이 바람직하다. 시약 패드(4)의 입경은 1㎛∼50㎛이 예시되며, 바람직하게는 5㎛∼30㎛이다.The sample dropped on the
도 1 및 도 2에 나타내는 시험구(1)에서는, 모관 현상에 의한 검체의 이동을 쉽게 하기 위해서, 샘플 패드(3)와 시약 패드(4)가 일부 적층된 상태가 되어 있다. 단, 모관 현상에 의해 검체가 적절하게 이동할 수 있는 것이라면, 샘플 패드(3)와 시약 패드(4)는 단순하게 인접해서 배치될 수도 있으며, 또한, 동일 패드로 할 수도 있다.In the
시약 패드(4)에 검체가 도달하면, 검체 중의 측정 대상물질과 패드(4) 중의 표지된 항체 또는 항원은 모관 현상에 의해 하류방향으로, 즉 다공체(5)로 이동한다. 또, 측정 대상물질과 표지된 항원 또는 항체가, 항원과 항체의 관계에 있는 경우에는, 양자의 일부 또는 전부는 항원-항체 복합체를 형성하고, 이것도 하류방향으로, 즉 다공체(5)로 이동한다. 도 1 및 도 2에 나타내는 시험구(1)에서는, 이 이동을 쉽게 하기 위해서 시약 패드(4)와 다공체(5) 가 일부 적층된 상태가 되어 있다. 단, 모관 현상에 의해 검체가 적절하게 이동할 수 있는 것이라면, 시약 패드(4)와 다공체(5)는 단순하게 인접해서 배치될 수도 있으며, 또한 시약 패드(4)가 다공체(5)을 겸할 수도 있고, 그 반대일 수도 있다.When the sample reaches the
다공체(5)는 그 구조가 스펀지상의 세공을 가진 것, 또는, 망목상을 가진 것으로서, 모관 현상에 의해 검체가 이동 가능한 매체이다. 도 1 및 도 2에 나타내는 시험구(1)에서는, 시트상의 다공질막으로서 나타나 있다. 다공체(5)의 재료로서는 면역 크로마토그래피법이 실시 가능하다면 특별하게 한정되지 않지만, 구체적으로는 예를 들면 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 에틸렌아세트산비닐, 폴리우레탄, 폴리메틸메타크릴레이트, 나일론수지, 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 등의 다공성 합성폴리머 등을 원료로 하는 직포, 부직포나 멤브레인, 글래스화이버 필터, 각종 여지 등을 들 수 있고, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 다공성 합성폴리머를 사용한 것이 바람직하며, 니트로셀룰로오스를 사용한 것이 특히 바람직하다. 다공체(5)의 입경은, 1㎛∼30㎛이 예시되며, 바람직하게는 1㎛∼20㎛이다.The
다공체(5)는 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원이 고정된 영역(6)(반응영역)을 갖는다. 영역(6)에 고정되는 항체 또는 항원은 측정 대상물질에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 구체적으로는, 측정 대상물질이 hCG인 경우, 항-hCG 항체, 더 상세하게는, 항-hCG 마우스 폴리클로널 항체, 항-hCG 마우스 모노클로널 항체 등을 사용할 수 있다. 측정 대상물질이 AFP인 경우, 항-AFP 항체를 사용할 수 있다. 측정 대상물질이 항-HIV 항체인 경우, HIV항원 펩티드 등을 사용할 수 있다. 측정 대상물질이 PSA인 경우, 항-PSA 마우스 모노클로널 항체, 항-PSA 토끼 항체 등을 사용할 수 있다. 또한, 이것들의 고정화 방법은 예를 들면 다공체(5)가 니트로셀룰로오스나 나일론 등인 경우, 상기한 항체 또는 항원의 용액을 직접적으로 도포하여 건조하는 것에 의해서 용이하게 고정화시킬 수 있다. 또한 직접 도포, 건조함으로써 고정화시킬 수 없는 글래스화이버 필터나 여지 등의 다공체의 경우에는, 다공체의 활성화나, 고정화하는 항체 또는 항원의 활성화 등에 의한 전처리를 수행하는 것에 의해서 용이하게 고정화시킬 수 있고, 이것들의 고정화 방법은 당업자에 잘 알려져 있는 기술이다.The
모관 현상에 의해서, 다공체(5) 중을 이동해 온 항원, 항체 및/또는 복합체는 영역(6)에 고정된 항체 또는 항원에 의해 포착된다. 표지물질을 포함한 항원, 항체 및/또는 복합체가 포착되면 영역(6)에 발생하는 정색으로 확인할 수 있다. 여기에서 영역(6)에 발생하는 정색의 색조는 사용하는 면역 크로마토그래피법(시약의 조합)과 검체 중의 측정 대상물질의 농도에 의존한다. 예를 들면, 검체 중의 항원과 시약 패드(4)에 유지되고 있었던 표지항체에 의해 형성된 복합체를 반응영역에 있어서의 고정화 항체로 포착하는 경우에 있어서는, 검체 중의 측정 대상물질의 농 도가 높으면, 영역(6)에서 포착되는 복합체가 증가하기 때문에, 강한 색조의 정색을 나타내고, 검체 중의 측정 대상물질의 농도가 낮으면, 영역(6)에서 포착되는 복합체가 감소하기 때문에, 약한 색조의 정색을 나타낸다. 한편, 예를 들면 검체 중의 항원과 시약 패드(4)에 유지되고 있었던 표지항원과의 경합반응에 있어서, 반응영역에서 표지항원을 고정화 항체에 의해 포착하는 경우에 있어서는, 검체 중의 측정 대상물질의 농도가 높으면, 영역(6)에서 포착되는 표지항원이 감소하기 때문에, 약한 색조의 정색을 나타내고, 검체 중의 측정 대상물질의 농도가 낮으면, 영역(6)에서 포착되는 표지항원이 증가하기 때문에 강한 색조의 정색을 일으킨다. By the capillary phenomenon, the antigen, the antibody, and / or the complex which have moved in the
다공체(5)는 측정 대상물질의 특정 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색(8)이 고정된 영역을 가지고 있다. 즉, 시험구(1)에서는 측정 대상물질을 특정 농도(이하, 「기준농도」라고 한다.)를 함유하는 검체를 사용하였을 경우에, 영역(6)에 발생하는 정색과 동일한 색조를 가지는 영역이 다공체(5) 상에 형성되어 있다. 또한, 표준 정색(8)의 고정화 방법에서도 상기 반응영역과 동일한 고정화 방법을 사용할 수 있다.The
본 발명의 시험구에서는 각각 시험구(1)의 다공체(5) 상에 존재하는 영역(6)에 발생하는 정색의 색조와, 표준 정색(8)의 색조를 비교함으로써 검체 중의 측정 대상물질을 용이하게 반정량할 수 있다. 즉, 예를 들면 검체 중의 항원과 시약 패드(4)에 유지되고 있었던 표지항체에 의해 형성된 복합체를 반응영역에 있어서의 고정화 항체로 포착하는 경우에 있어서는, 영역(6)에 발생하는 정색의 색조가 표준 정색(8)의 색조보다도 약한 경우, 검체 중의 측정 대상물질의 농도가 기준농도보다 도 낮게 된다. 영역(6)에 발생하는 정색의 색조가 표준 정색(8)의 색조보다도 강한 경우, 검체 중의 측정 대상물질의 농도가 기준농도보다도 높게 된다. 영역(6)에 발생하는 정색의 색조가 표준 정색(8)의 색조와 같은 정도의 경우, 검체 중의 측정 대상물질의 농도가 기준농도와 동일 정도라고 말하게 된다. 또한 영역(6)에 정색이 발생하지 않았을 경우, 검체 중에 측정 대상물질이 존재하지 않거나, 혹은 검출 감도 이하임을 의미한다. 따라서 본 발명의 시험구(1)는 영역(6)에 있어서의 정색의 유무에 의해, 측정 대상물질의 특정한 감도에 있어서의 정성평가를 수행할 수도 있다.In the test sphere of the present invention, the measurement target substance in the sample is easily obtained by comparing the color tone of the color generated in the
또, 영역(6)에 발생하는 정색의 색조와, 표준 정색(8)의 색조를 광학적 농도계 등을 사용해서 비교함으로써, 검체 중의 측정 대상물질의 농도를 정확하게 측정할 수 있다.In addition, by comparing the color tone of the color generated in the
다공체(5)는 모관 현상에 의해 그 내부를 검체가 이동하기 때문에, 표준 정색(8)은 다공체(5)의 표면에 고정되어 있는 것이 바람직하다. 여기에서, 표준 정색(8)은 시약 패드(4)에 담지되는 항체 또는 항원을 표지하는데 사용한 표지물질인 것이 바람직하다. 따라서 금 콜로이드로 대표되는 금속 콜로이드, 비금속 콜로이드, 염료졸 혹은 분산염료와 같은 염료입자, 라텍스 입자 또는 착색 미립자 등이 바람직하게 예시된다. 그 중에서도, 발색성이 우수하고, 색조 및 입자경이 풍부해서, 항체 혹은 항원에로의 표지화 방법이 복수 존재하는 등의 관점에서, 염료 혹은 안료로 착색된 라텍스 미립자 또는 폴리스틸렌 미립자가 바람직하다. 또한, 이 표지화 방법은 당업자에 의해 주지되어 있는 것으로, 흡착에 의한 방법이나 화학결합 에 의한 방법 등이 있다. 특히, 염료 혹은 안료로 착색 된 입경 0.5㎛ 이하, 바람직하게는 입경 0.05∼0.5㎛의, 구상 또는 거의 구형상을 한 라텍스 미립자 또는 폴리스틸렌 미립자가 바람직하다. 가장 바람직하게는 블루 라텍스이다.Since the specimen moves inside the
단, 표준 정색(8)은 측정 대상물질의 특정농도에서의 정색과 동일한 색조인 한, 색소, 염료, 안료 등, 다른 물질을 사용해서 형성해도 좋다.However, the
또, 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역(반응영역(6))과, 측정 대상물질의 특정한 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역(표준 정색(8))은 전개용매의 전개방향에 대해서, 직렬 또는 병렬로 배치되어 있는 것이 바람직하고, 직렬로 배치되어 있는 것이 가장 바람직하다. 또한 양자가 근방에 위치하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 양자의 거리는 20 mm 이내인 것이 바람직하고, 10 mm 이내인 것이 더 바람직하다.In addition, a region (reaction region 6) in which an antibody or antigen that can specifically bind to a substance to be measured is immobilized on the porous body (reaction region 6), and a standard corresponding to coloration at a specific concentration of the substance to be measured It is preferable that the area | region (standard coloration 8) arrange | positioned in the state which fixed color is fixed on the said porous body is arrange | positioned in series or parallel with respect to the development direction of a developing solvent, and it is most preferable to arrange in series. It is also preferable that both are located in the vicinity. Specifically, the distance between the two is preferably within 20 mm, more preferably within 10 mm.
또, 전개용매는 보통 검체에 함유될 수 있는 것이면 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면 물(검체 중에 포함되는 수분을 포함함); 생리식염수; 아세톤 등의 유기용매 등을 들 수 있다.The developing solvent is not particularly limited as long as it can be contained in a normal sample. For example water (including water contained in the sample); Saline solution; Organic solvents, such as acetone, etc. are mentioned.
전개용매의 전개방향은 도 1에 있어서는, 샘플 패드(3)에서 흡수패드(7)로의 방향이다.The developing direction of the developing solvent is the direction from the
또, 검체 중의 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는, 표지된 항체 또는 항원이 이동 가능한 상태로 배치된 영역(시약 패드(4))에 사용하는 표지용 색소와, 측정 대상물질의 특정한 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역(표준 정색(8))에 사용하는 표준 정색용 색소는 동일한 색소인 것이 바람직하고, 라텍스 입자인 것이 더욱 바람직하다.In addition, the labeling pigment used in the region (reagent pad 4) arranged in a state where the labeled antibody or antigen is movable in a state capable of specifically binding to the substance to be measured in the sample, and the specific concentration of the substance to be measured. It is preferable that the standard coloring pigment used for the area | region (standard coloring 8) arrange | positioned in the state in which the standard color corresponding to the coloration in the state is fixed on the said porous body is the same dye, and it is more preferable that it is a latex particle.
표준 정색(8)으로 나타나는 기준농도나 검출 감도는 측정 대상물질의 종류나, 시험구의 용도에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들면 시험구(1)가 뇨 검체 중의 hCG의 양을 측정하는 것인 경우, 검출 감도는 25 IU/L, 기준농도는 1000 IU/L인 것이 바람직하다. hCG 의 검출 감도를 25 IU/L로 하였을 경우, 영역(6)의 발색의 유무에 의해 임신진단이 가능하게 된다. 기준농도를 1000 IU/L로 하였을 경우, 자궁외 임신, 유조산, 융모성 종양의 예후 판정 등의 평가가 가능하게 된다. 결과적으로, hCG농도 25 IU/L과 1000 IU/L을 기준으로 하여 검체 중의 측정 대상물질이 일회의 측정으로 반정량 가능하게 된다. 예를 들면 혈액중의 PSA의 양을 측정하는 것일 경우, 검출 감도는 1 ng/㎖, 기준농도는 4 ng/㎖인 것이 바람직하다. PSA 의 검출 감도를 1 ng/㎖로 하였을 경우, 영역(6)의 발색의 유무에 의해 전립선 비대의 진단이 가능하게 되고, 기준농도를 4 ng/㎖로 하였을 경우, 전립선 암의 진단이 가능하게 된다. 결과적으로, 일회의 조작으로 PSA농도1 ng/㎖과 4 ng/㎖을 기준으로 하여 검체 중의 PSA 농도의 반정량이 가능하게 된다.The standard concentration and the detection sensitivity represented by the standard color (8) can be appropriately selected depending on the kind of the substance to be measured and the purpose of the test fixture. For example, when the
상기한 바와 같이, 다공체(5) 중을 이동하는 검체 중의 측정 대상물질의 부분 혹은 전부는 영역(6)에 고정된 항체 또는 항원에 의해 포착된다. 한편, 검체 중의 다른 성분 및 포착되지 않은 측정 대상물질 등은 다공체(5) 중을 하류방향으로 이동한다. 도 1 및 2에 나타내는 시험구(1)에는 이것들을 흡수하기 위한 흡수패드(7)가 형성되어 있다. 흡수패드(7)는 다공체(5) 중을 이동해 온 검체를 흡수하 고, 유지할 수 있는 것인 한 특별하게 한정되지 않는다. 따라서 흡수패드(7)는 여과지, 부직포, 다공질막 등, 액체를 흡수해서 그 내부에 유지하는 목적으로 종래 사용되고 있는 것을 널리 사용할 수 있다. 흡수패드(7)는 실리카겔과 같은 흡수성ㆍ흡습성을 갖는 물질을 함유하고 있어도 좋다. As described above, part or all of the substance to be measured in the specimen moving in the
상기한 바와 같이, 검체 중에 측정 대상물질이 포함되어 있지 않을 경우 또는 포함되어 있어도 검출 감도 이하인 경우, 영역(6)에 정색은 발생하지 않고, 시험구(1)는 외견상 미 사용시와 변화가 없다. 이 때문에, 본 발명의 시험구(1)는 시험 종료를 확인하기 위한 기구를 가지고 있는 것이 바람직하다. 도 1 및 도 2에 나타내는 시험구(1)에서는 다공체(5)의 표준 정색(8)이 고정된 영역보다도 하류측에, 검체가 도달하였을 때에 발색을 일으키는 영역(9)이 형성되어 있다. 다공체(5)를 피복하는 보호필름(20) 중, 그 영역(9)을 피복하는 부분에는 투명한 창(22)이 형성되어 있다. 도 1에 있어서, 보호필름(20) 중, 부분(21) 및 (22)는 투명하고, 부분(23, 23', 23")은 불투명하다.As described above, when the measurement target material is not included in the sample or is less than the detection sensitivity even when it is included, coloration does not occur in the
도 1 및 도 2에 나타내는 시험구(1)에서는 그 영역(9) 및 창(22)이 시험 종료를 확인하는 기구를 이룬다. 즉, 다공체(5) 중을 이동해 온 검체가 영역(9)에 도달하면 발색을 일으키고, 이 발색은 창(22)에 의해 확인할 수 있다. 이에 따라 시험이 종료하였음을 확인할 수 있다.In the
이 목적을 위해서, 영역(9)에는 여러 가지의 발색제가 함침 또는 고정화된다. 영역(9)에 함침 또는 고정화되는 발색제로서는 소정 pH의 액상시료와의 접촉에 의해 발색하는 발색제, 구체적으로는 예를 들면, 에오신B, 플록신B, 벤조 퍼퓨린 4B, 콩고레드, 브롬페놀블루, 브롬크레졸그린, 2,5-디니트로페놀, 또는 이것들의 관련물질을 들 수 있다. 또, 발색제는 검체가 영역(9)에 도달하였을 때에, 그 수분에 의해서 발색하는 것일 수도 있다. For this purpose, various coloring agents are impregnated or immobilized in the
또, 다공체(5)의 창(22)보다도 상류측의 영역에, 예를 들면 불투명 부분(23')으로 피복된 영역에 검체가 도달하였을 때에 용해하도록, 수용성의 색소를 함침시켜 두고, 검체 중에 용해되어 이동하는 색소를 창(22)으로 확인하는 것일 수도 있다. In addition, a water-soluble pigment is impregnated so as to dissolve when the sample reaches an area upstream of the
또, 표지된 항원 혹은 항체로 특이적으로 반응하는 성분, 예를 들면 표지 항-hCG 마우스 모노클로널 항체를 사용하는 경우에는 항-마우스 양 항체 등을 영역(9)에 고정화해 두어도, 해당 목적을 달성할 수 있다.In the case of using a component that specifically reacts with a labeled antigen or antibody, for example, a labeled anti-hCG mouse monoclonal antibody, even if the anti-mouse antibody or the like is immobilized in the region (9), Can be achieved.
또한 측정에 관여하지 않는 표지항체나 표지 비오틴이나 키홀헤모시안 등을 시약 패드(4)에 유지시켜 두고, 상기 표지항체와 특이적으로 반응하는 항체 또는 항원이나 아비딘 혹은 항-키홀헤모시아닌 항체를 영역(9)에 고정화해 두어도 해당 목적을 달성할 수 있다.In addition, the antibody or antigen, avidin, or anti-keyhole hemocyanin antibody, which specifically reacts with the label antibody, is retained on the
이상, 도면을 참조하여 본 발명의 시험구에 대해서 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 시험구는 도시한 형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 시험구는 검체가 모관 현상에 의해 이동 가능한 다공체를 갖는 면역 크로마토그래피용 시험구로서, 하기 (1)∼(3)의 영역을 가지는 것을 널리 사용할 수 있다.As mentioned above, although the test tool of this invention was demonstrated in detail with reference to drawings, the test tool of this invention is not limited to the form of illustration. The test tool of the present invention is a test tool for immunochromatography having a porous body in which a specimen can move by capillary phenomenon, and one having a region of the following (1) to (3) can be widely used.
(1) 상기 검체 중의 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는, 표지된 항체 또는 항원이 이동 가능한 상태로 배치된 영역,(1) a region in which a labeled antibody or antigen is arranged in a movable state that can specifically bind to a substance to be measured in the sample,
(2) 상기 측정 대상물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역, 및,(2) a region in which an antibody or antigen that can specifically bind to the measurement target substance is arranged in a fixed state on the porous body, and
(3) 상기 측정 대상물질의 특정한 농도에서의 정색에 대응하는 표준 정색이 상기 다공체 상에 고정된 상태로 배치된 영역.(3) A region in which a standard color corresponding to a color at a specific concentration of the substance to be measured is fixed on the porous body.
따라서, 본 발명의 시험구는 일본 공개특허공보 H01-503174호, 일본 공개특허공보 H06-180320호, 일본 공개특허공보 H06-160388호에 기재되어 있는 면역 크로마토그래피용 시험장치와 같이, 다공체 등의 구성요소를 수용하는 케이싱을 가질 수도 있다. 또 본 발명의 도면에 예시한 보호필름(20)은 본 발명의 시험구에 필수적이지 않다. Therefore, the test tool of the present invention is composed of a porous body and the like as the test apparatus for immunochromatography described in Japanese Patent Application Laid-Open No. H01-503174, Japanese Patent Application Laid-Open No. H06-180320, and Japanese Patent Application Laid-open No. H06-160388. It may have a casing to receive the element. In addition, the
다공체 상에 고정되는 반응영역 및/또는 표준 정색의 형상도 도시한 것 같이 선상(線狀)으로 한정되지 않고, 다른 형상일 수도 있다. 또한 다공체 상에는 각각 측정 대상물질이 다른 농도에서의 정색에 대응하는 복수의 반응영역 및/또는 표준 정색이 고정될 수도 있다. The shape of the reaction region and / or the standard color to be fixed on the porous body is not limited to the line shape as shown, but may be another shape. In addition, a plurality of reaction zones and / or standard colors may be fixed on the porous body, each corresponding to a color at a different concentration.
본 발명의 시험구는 생물유래의 여러 가지의 액체시료에 대해서 적용할 수 있다. 이러한 액체시료로서는 구체적으로는 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨, 대변 추출액, 조직 추출액 등을 들 수 있다. 이것들의 액체시료에 함유되는 측정 대상물질로서는 항원 혹은 항체로서 기능하는 각종 단백질이나 펩티드, 복합 단백질, 지질, 복합 지방질, 핵산, 렉틴, 당쇄 혹은 이것을 가지는 화합물, 비오틴, 아비딘, 호르몬, 효소, 효소기질, 효소 인히비터, 리셉터, 리간드, 약물, 약물 대사산물, 분석 대상물의 유도체 등이며, 더 구체적으로는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG), 황체형성 호르몬(LH), 알파페토프로틴(AFP), 암태아성 항원(CEA), 인간 태반 락토젠(hPL), 베타2마이크로글로블린(β2m), 페리틴, HBs항원, 에스트로겐, PSA등 및 이것들에 대한 항체가 예시된다. 본 발명에 있어서는, 항체, 항원, 핵산, 아비딘, 비오틴이 바람직하게 사용되고, 항체 혹은 항원이 특히 바람직하다.The test tool of the present invention can be applied to various biological samples derived from living organisms. Specific examples of such liquid samples include blood, plasma, serum, saliva, urine, fecal extract, tissue extract, and the like. As the measurement targets contained in these liquid samples, various proteins, peptides, complex proteins, lipids, complex fats, nucleic acids, lectins, sugar chains or compounds having the same, biotin, avidin, hormones, enzymes, enzyme substrates, which function as antigens or antibodies , Enzyme inhibitors, receptors, ligands, drugs, drug metabolites, derivatives of analytes, and more specifically, human chorionic gonadotropin (hCG), luteinizing hormone (LH), alphafetoprotein (AFP) , Cancerous fetal antigen (CEA), human placental lactogen (hPL),
또, 본 발명의 시험구는 상기에서 예시한 것과 같은 측정 대상물질의 표준품을 생리식염수 등에 용해하여 조제한 용액에 대하서도 적용할 수 있다.In addition, the test tool of the present invention can also be applied to a solution prepared by dissolving a standard product of a measurement target as exemplified above in physiological saline or the like.
실시예Example
이하, 실시예에 의해 본 발명의 시험구를 추가로 설명한다.Hereinafter, the test tool of the present invention will be further described with reference to Examples.
본 실시예에서는 도 1 및 도 2에 나타내는 시험구(1)를 사용하였다.In the present Example, the
시험구(1)의 각 구성은 아래와 같다.Each structure of the
기체(2): 폴리에스테르제, 종 125 mm×횡 8 mm×두께 0.25 mm Base (2): polyester, vertical 125 mm x 8 mm x 0.25 mm thick
샘플 패드(3): 종 30 mm×횡8 mm×두께 0.3 mm의 부직포(벤리제, 아사히화성사제)를 접착하였다. Sample pad (3): A nonwoven fabric (Benley, manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) of 30 mm long x 8 mm wide and 0.3 mm thick was adhered.
시약 패드(4): 종 15 mm×횡 8 mm×두께 0.3 mm의 부직포(유리섬유, 밀리포어사제)에, 표지된 항체(표지물질로서 청색염료로 착색된 라텍스 입자(입경 0.3㎛의 구상(球狀) 입자)를 결합시킨 항-hCG 마우스 모노클로널 항체를 충전하여 동결건조시킨 것을 사용하였다. 이것을 기체(2) 상에 접착시켰다. Reagent pad (4): Latex particles (particle size 0.3 μm) colored with a blue dye as a labeled antibody (labeled as a labeling substance) on a nonwoven fabric (glass fiber, manufactured by Millipore) having a length of 15 mm × 8 mm × 0.3 mm Lyophilized, filled with anti-hCG mouse monoclonal antibody bound to the particles) was used, which was adhered onto the substrate (2).
샘플 패드(3)와 시약 패드(4)는 단부 끼리가 적층되어 있다(종 약 4 mm분).End portions of the
다공체(5): 니트로셀룰로오스막(종 25 mm×횡 8 mm×두께 235 ㎛, 입경 약 8 ㎛)을 기체(2) 상에 접착시켰다. Porous body 5: A nitrocellulose film (
다공체(5)와 시약 패드(4)는 단부 끼리가 적층되어 있다(종 2 mm분). The ends of the
다공체(5) 상에 1.5 mg/㎖의 항-hCG 마우스 모노클로널 항체를 도포하고, 건조시킴으로써, 그 모노클로널 항체를 영역(6)에 고정시켰다. The monoclonal antibody was immobilized in the
표준 정색(8): 농도 1000 IU/L(기준농도)의 hCG가 영역(6)에서 항체에 포착되었을 때의 정색으로 동일한 색조가 되도록, 표준 정색(8)으로 표지물질로서 사용한 것과 동일한 라텍스 입자(청색염료로 착색)를 다공체(5)의 표면에 고정하였다.Standard color (8): The same latex particles as those used as labeling in standard color (8) so that hCG at a concentration of 1000 IU / L (reference concentration) is the same color as the color when captured by the antibody in region (6) (Colored with blue dye) was fixed to the surface of the
시험 종료를 나타내는 지표로서 다공체(5)의 표준 정색(8) 보다도 하류측의 영역(9)에, 발색제로서 에오신B를 함침시켜서 건조시켰다. As an indicator of completion of the test, Eosin B was impregnated as a color developer in the
흡수패드(7): 종 20 mm×횡 8 mm×두께 0.4 mm의 부직포(유리섬유, 왓토만사제)를 기체(2) 상에 접착하였다. Absorbent pad 7: A nonwoven fabric (glass fiber, manufactured by Whatman Co., Ltd.) having a length of 20 mm × 8 mm × 0.4 mm in thickness was adhered on the
보호필름: 샘플 패드(3)를 제외하고, 시험구(1)의 상부를 투명부분(21, 22) 및 불투명 부분(23, 23', 23'')을 가지는 보호필름(폴리에틸렌테레프탈레이트제)을 사용하여 피복하였다.Protective film: Except for the
이 시험구(1)을 사용하여 측정 대상물질을 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)으로 하여 반정량을 실시하였다.Using this test fixture (1), the seminal quantitative measurement was carried out using the target substance as chorionic gonadotropin (hCG).
hCG(국립의약품식품 위생연구소 제)를 이하의 각종 농도로 함유하도록, 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수로 희석한 용액에, 시험구(1)의 샘플 패드(3) 부분을, 약3초간 침지시켰다. 다음에 보호필름(20)이 위가 되도록 시험구(1)를 수평방향으로 약 3분간 정치하였다. 창(22)에 반응이 종료한 것을 나타내는 정색(9')이 명확 하게 발생한 시점에서, 표준 정색(8)과 영역(6)의 정색(6')을 덴시토미터로 측정하였다.Immerse the sample pad (3) portion of the test fixture (1) in a solution diluted with physiological saline containing 0.1% BSA to contain hCG (manufactured by the National Institute of Pharmaceutical Food Hygiene) at various concentrations below. I was. Next, the
여기에서, 검체는 hCG농도가 0 IU/L(음성), 25 IU/L, 100 IU/L, 250 IU/L, 500 IU/L, 1000 IU/L 및 10000 IU/L의 것을 사용하였다.Here, the samples used hCG concentrations of 0 IU / L (negative), 25 IU / L, 100 IU / L, 250 IU / L, 500 IU / L, 1000 IU / L and 10000 IU / L.
이하에, 각 농도의 검체의 영역(6)의 정색(6')의 정색도(呈色度)의 정도를 덴시토미터에서 수득한 수치로 나타낸다.Below, the grade of the chromaticity of the color 6 'of the area |
한편, 표준 정색(8)의 정색도의 정도를 덴시토미터로 측정한 값은 9800이었다.On the other hand, the value measured by the densitometer of the degree of color intensity of the
음성 검체에서는 거의 발색하지 않고, 25 IU/L에서 발색, 농도가 올라감에 따라서 발색도 증강하여, 1000 IU/L 에서 거의 표준 정색과 동등한 발색을 나타내고, 그 이상의 농도에서는 표준 정색보다 강한 발색을 나타내어, 반정량의 시험구로서 유용하였다.Negative samples hardly developed, and color development also increased with increasing color and concentration at 25 IU / L, resulting in a color almost equivalent to standard color at 1000 IU / L. It was useful as a semiquantitative test.
또, 이 시험구(1)를 사용하여, 경시적인 정색도의 변화의 유무를 확인하였다. 즉, 샘플 패드(3)가 잠기도록 시험구(1)를 농도 조정한 검체 중에 약 3초간 침지시켰다. 다음에 보호필름(20)이 위가 되도록 시험구(1)를 수평방향으로 약 3∼30분간 정치하고, 각 시간의 표준 정색(8)과 영역(6)의 정색(6')을 덴시토미터로 측정하였다.Moreover, using this
여기에서, 검체는 hCG 농도가 0 IU/L(음성), 25 IU/L, 500 IU/L, 1000 IU/L 및 106 IU/L의 것을 사용하였다.Here, the sample used was that the hCG concentration of 0 IU / L (negative), 25 IU / L, 500 IU / L, 1000 IU / L and 10 6 IU / L.
도 3 및 하기 표에, 정색도의 정도를 덴시토미터에서 수득한 수치의 경시변화로 나타냈다.In FIG. 3 and the following table, the degree of color intensity is shown with the change with the numerical value obtained with the densitometer.
또한, 정색도는 각 농도 3회 측정한 평균값이다. 표준 정색의 수치는 각 농도 3회 (합계 15회)의 평균값이다.In addition, color intensity is the average value measured 3 times of each density. The numerical value of the standard color is an average value of 3 times each concentration (15 times in total).
30 분까지의 경시변화를 보면 표준 정색(8)이나 각 농도에서의 영역(6)의 정색(6')에 있어서의 발색이 시험 개시 후 5∼10분에서 피크를 나타내고, 그 후는 다공체(5)에 대한 검체의 공급량 감소에 따른 다공체(5)의 건조에 의해 발색도가 저하되었다. 측정 개시로부터 시간이 경과하여도, 음성 검체에서는 거의 발색하지 않고, 25 IU/L에서 발색, 1000 IU/L에서 거의 표준 정색과 동등한 발색, 그 이상의 농도에서는 표준 정색보다 강한 발색을 나타내는 경향은 변하지 않았으며, 반정량의 시험구로서 유용하였다.With the change over time up to 30 minutes, the color development in the
또, 표 1, 표 2 및 도 3에 나타낸 본 시험결과는, 덴시토미터로 측정한 결과로서 수치로 나타냈지만, 육안에 의한 판정에 있어서도, 정색의 유무 및 표준 정색과의 강약의 관점에서는, 동일한 결과를 얻을 수 있었다.In addition, although the test results shown in Table 1, Table 2, and FIG. 3 were shown as numerical values as a result measured with a densitometer, in the visual observation, from the viewpoint of the presence or absence of coloration and the strength and weakness with standard coloration, The same result was obtained.
도 4는 반정량을 실시한 전후의 시험구(1)를 나타낸 평면도이다. 도 4a는 검체에 침지시키기 전의 미사용의 시험구, 도 4b는 hCG 농도 25 IU/L의 뇨 검체를 사용해서 반정량을 실시한 후의 시험구, 도 4c는 hCG 농도 1000 IU/L의 검체를 사용해서 반정량을 실시한 후의 시험구, 도 4d는 hCG 농도 10000 IU/L의 검체를 사용해서 반정량을 실시한 후의 시험구, 도 4e는 hCG 농도 0 IU/L(음성)의 검체를 사용해서 반정량을 실시한 후의 시험구를 각각 나타내고 있다.4 is a plan view showing the
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 반정량을 실시한 후의 시험구(1)인 것은, 창(22)에 발생하는 정색(9')에 의해 확인할 수 있다 (도 4b∼e). 음성 검체를 사용한 예에서는, 영역(6)에 정색은 발생하지 않고, 투명부분(21)에서는 표준 정색(8) 만이 확인되었다. 한편, hCG를 포함한 검체에서는 hCG와 표지된 항체와의 복합체가 영역(6)에서 항체에 포착된 것을 나타내는 정색(6')이 확인되었다. 이 정색(6')은 검체 중의 hCG농도에 의해 색조가 달랐다. 구체적으로는, hCG농도가 기준농도보다도 낮은 25 IU/L의 검체를 사용한 예에서는, 정색(6')은 표준 정색(S)에 비해서 훨씬 색조가 약했다 (도 4b). hCG 농도가 기준농도와 동일한 1000 IU/L의 검체를 사용한 예에서는, 정색(6')의 색조는 표준 정색(8)과 거의 동일하였다(도 4c). hCG 농도가 기준농도보다도 높은 10000 IU/L의 검체를 사용한 예에서는, 정색(6')의 색조는 표준 정색(8) 보다도 강했다(도 4d).As can be seen from FIG. 4, the
본 발명은 면역학적 크로마토그래피(면역 크로마토그래피법)을 사용하여, 검체 중의 측정 대상물질을 반정량하기 위한 시험구 및 이 시험구를 사용한 반정량 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a test piece for semi-quantifying a substance to be measured in a sample using immunological chromatography (immune chromatography) and a semi-quantitative method using the test piece.
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