KR20070098838A - 허혈심장질환의 치료 및／또는 예방을 위한 제제로３，４＇，５－트리히드록시－스틸벤－３－베타－ｄ－글루코사이드를 사용하는 방법 - Google Patents
허혈심장질환의 치료 및／또는 예방을 위한 제제로３，４＇，５－트리히드록시－스틸벤－３－베타－ｄ－글루코사이드를 사용하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 새로운 용도를 제공한다. 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 정맥내 투여 및/또는 경구 투여로 항심근허혈(anti-myocardial ischemia)에 효능이 있다. 항심근허혈제로서의 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 허혈심장질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 약으로 조제하여 사용되는 장점이 있다.
심근허혈, 심근경색
Description
본 발명은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 새로운 용도에 관한 것이며, 특히 허혈심장질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약을 조제하는 화합물로서의 응용에 관한 것이다.
3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG), 또는 폴리다틴(polydatin) 또는 페이신(peicin) 화합물의 구조는 아래 화학식 I과 같다.
3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 1960년대에 의학용 식 물(medical plant)인 Polygonum cuspidatum Sieb , et Zucc .로부터 처음 발견되었으며, 후에 사할린 가문비(Sakhalin spruce), 포도, 땅콩 및 다른 식물들에서도 발견되었다. 1970년대 후에 화학식 I의 화합물에 대한 약리(pharmacological) 연구들에 의해 상기 화합물은 다음의 작용들을 가지고 있다는 것이 알려졌다.
(1) 혈액 지질(blood lipid) 감소 효과: 예를 들어, 고지혈증(hyperlipemia) 환자들에게 1회 복용시 체중 1kg당 2.2mg(2.2mg/kg/d)의 양으로 혀 밑에 투여(sublingual administration)하는 경우 총 콜레스테롤 일반 콜레스테린(total cholesterol general cholesterin)에 대한 고밀도 지방단백질(high density lipoprotein)의 비율, 및 저밀도 지방단백질에 대한 고밀도 지방단백질의 비율을 낮출 수 있다.( Zhang Peiwen et al . Journal of First Military Medical University 1995; 15(1): 47-48).
(2) 혈소판 응집(platelet aggregation) 및 혈전형성(thrombogenesis)의 억제: 예를 들어, 6 내지 100 μmol/L의 TSG는 혈소판 응집과 아라키돈산(arachidonic acid), 아데노신 디포스페이트(adenosine diphosphate) 및 아드레날린으로부터 유도된 트롬복산(thromboxane) B2의 생성을 방지한다.(Shan Chunwen et al. Acta Pharmacologica Sinica, 1990, 11(6): 527~530);
(3) 심근 수축 촉진 효과(positive inotropic effect): 배양 심장 근육(cultured cardiac myocyte)의 수축 크기 및 주기를 증가시킬 수 있다.(Jin Chunhua et al . Chinese Pharmacological Bulletin , 2000; 16(4): 400~402);
(4) 항산화(antioxidation): TSG는 PMNs 호흡 터짐(respiratory burst), 크 산틴 시스템(xanthine system) 및 VitC-Cu2 + 시스템으로부터 생성된 자유 라디칼을 억제 또는 청소하는 효과를 가진다.(Tian Jingwei et al . Chinese Traditional and Herbal drugs , 2001, 32(10): 918~920);
(5) 미세순환(microcirculation) 및 치료 충격(treatment shock)을 향상시키는 효과(Zhao kesen , Jin Lijuan ; Shock and Its Molecular Basis , Science Press , Beijing , 1989; 319~323).
허혈심장질환은 심장질환의 일종으로, 협착(stenosis) 또는 관상동맥죽상경화증(coronary atherosclerosis)에 의한 혈관 차단(block of blood vessel), 또는/및 전부 관상동맥죽상경화 심장질환(coronary atherosclerotic heart disease, 또는 CHD)이라 불리는 관상동맥의 기능 변화(발작(spasm))에 의한 허혈(ischemia), 무산소증(anoxia), 또는 괴사(necrosis)에 의해 유도된 심장질환에 의해 일어난다. CHD는 사람들의 건강을 심각하게 위협하는 통상적인 질병이다. CHD는 무증상 심근허혈(asymptomatic myocardial ischemia), 협심증(angina), 심근경색증(myocardial infarction), 허혈 심근병증(ischemic cardiomyopathy), 심부전(heart failure) 또는 급사(sudden death)로 분류될 수 있다.
CHD의 치료는 의약요법(medical therapy), 중재요법(interventional therapy) 및 수술요법(surgical therapy)을 포함한다. 현재로서, 병원에서 가장 통상적으로 사용되는 항심근허혈제(antimyocardial ischemic medicine)는 질산에스테르(nitrate esters), β 수용체차단제(receptor blocker) 및 칼슘대항제(calcium antagonist)를 포함한다. 다른 심근허혈대항제(myocardial ischemic antagonist)는 안지오텐신 전환 효소 억제제(angiotensin converting enzyme inhibitor), 특정 서맥제(specific bradycardic agent) 등을 포함한다. 상기 항심근허혈제들의 공통적인 특징은 혈관확장(vasodilation)에 의해 심작업량(cardiac work load)의 경감 및 심근 산소 소비량(myocardial oxygen consumption)의 감소로 CHD의 증세를 완화시키는 것이다.
니트로혈관확장제(nitrovasodilators), 또는 질산 에스테르(nitrate esters)는 일산화질소(NO)를 방출할 수 있으며, cGMP를 증가시킴으로써 혈관 평활근(vascular smooth muscle)을 이완시킨다. 병원에서 사용되는 질산 에스테르는, 니트로글리세린(nitroglycerin) 및 이소소르비드 디니트레이트(isosorbide dinitrate)와 같이 모든 종류의 협심증(angina cordis)을 보통은 즉시 완화시킬 수 있으며 협심증의 예방 및 치료에 폭넓게 사용된다. 그러나, "질산 에스테르시스(nitrate estersis)는 증상들을 완화시키는 약의 종류일 뿐이고 질병의 결과에 이득을 준다는 어떠한 증거도 없다. 이론적으로, 이러한 약은 반사적으로 심장박동수(heart rate)를 증가시키고 장기적으로 심근허혈(myocardial ischemia)의 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있다."(Hu Dayi et al . Evidence - based Cardiovascology, Tianjin Science and Technology Press 2001) 추가적으로, 질산 에스테르약은 두개내압(intracranial pressure)을 증가시키고 녹내장(glaucoma)을 유발하는 부작용(adverse effect)을 나타내며, 곧 약물내성(drug resistance)을 만들어낼 수 있다.
심장혈관(cardiovascular) 의학 연구에서 칼슘대항제(calcium antagonist) 및 β 수용체차단제(receptor blocker)의 응용은 매우 중요하다. 지금까지도 이러한 약은 CHD의 치료에 있어 가장 널리 쓰이는 것들 중 하나이다. 니페디핀(nifedipine)과 같은 칼슘대항제는 심근수축성(myocardial contractility)의 억제, 심근 산소 소비량의 감소, 관상동맥경련(coronary artery spasm)의 완화, 심근으로의 혈액 공급의 향상, 주위 혈관의 확장, 심장작업량의 감소와 같은 약리적 효과를 가진다. 그러나 칼슘 대항제의 제1 세대가 임상에 응용된 지 20년이 더 지난 후에, 이러한 약이 심근경색증(myocardial infarction)의 위험을 증가시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 임상시험결과는 칼슘 대항제가 변형된 심근경색(deformed myocardial infarction), 변형된 협심증(varied angina cordis) 및 심부전증(cardiac insufficiency)의 예후를 전혀 향상시키지 못하는 것으로 나타났다(Su Dingfeng et al . Cardiovascular Pharmacology , Science Press , 2001).
연구 결과에 따르면 통상적인 항심근허혈제(anti-myocardial ischemia medicine)(질산 에스테르, β 수용체차단제 및 칼슘 대항제)는 협심증을 완화시킬 수 있으나, 운동 협심증(exertional angina pectoris)의 예후에 대한 그것의 효과는 알려지지 않았다. 현재로서 불안정형 협심증(unstable angina cordis)의 결과에 대한 항심근허혈제의 효과에 대해 어떠한 정보도 없다. 속효성 니페디핀(short-acting nifedipine)은 급성 관상동맥증후군(acute coronary artery syndrome)의 사망률을 증가시킬 수 있는 반면, 혈액지질을 감소할 수 있는 안지오텐신(angiotensin) 및 스타르틴(startin)은 항심근허혈제에 간접적 효과가 있 다.(Hu Dayi et al . Evidence - based Cardiovascology , Tianjin Science and Technology Press 2001).
명백하게도, CHD의 임상치료에 이용할 수 있는 약은 많지만, 보다 안전하고 CHD의 치료에 효과가 있는 새로운 약들이 심근허혈심장질환의 예후와 결과를 좋게 하기 위하여 매우 요구되고 있다.
상술한 바와 같이, 기존의 문헌들은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 심장혈관 작용(cardiovascular activity)에 대해 보고하고 있다. 그러나, 그것의 응용 가치는 주로 반충격 효과(anti-shock effect) 및 혈액 지질 감소(blood lipid-lowering) 작용에서 보여졌다. 이 화합물에 대한 어떠한 참고 문헌도 상기 화합물의 항심근허혈 효과(anti-myocardial ischemic effect)와 CHD의 치료 및/또는 예방으로 사용할 수 있는 잠재적 가치에 관해 언급하거나 제시하고 있지 않다. 그 이유는 다음과 같을 수 있다:
CHD의 원인은 관상동맥의 협착(stenosis)에 의해 심근(myocardium)으로 혈액 공급이 감소하기 때문이며, 이는 심장 근육(cardiac muscle)으로 혈액의 수요와 공급의 모순을 가져오고 통증과 같은 일련의 증상들을 가져온다. 일반적으로, 대부분의 항심근허혈제들은 환자의 혈류역학 특성(hemodynamical characters)의 개선에 초점을 맞추며, 특히 최종적으로는 심장작업량과 심근 산소 소비량의 감소를 목표로 한다. 임상에서 CHD의 치료로 가장 많이 사용된 약으로 앞서 설명한 질산 에스테르, β 수용체차단제 및 칼슘 대항제들은 상기와 같은 특성들을 효과로 가지고 있다.
기존의 문헌에 따르면, 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 시험관내 배양 심근(cultured myocardium in vitro) 및 적출 심장(isolated heart)의 수축 크기와 수축 회수를 증가시킬 수 있으며, 심근의 세포내 칼슘 농도(intracellular calcium concentration)를 증가시킬 수 있다.(Jin Chunhua , et al. Chinese Pharmacological Bulletin , 2000, 16(4): 400~402; Jin Xingzhong , et al . Journal of First Military Medical University, 1992; 12(1): 31~33); 명백하게도, 이러한 화합물의 심근수축촉진 효과(positive inotropic effect) 및 심장박동수증가 효과(positive chronotropic effect)는 상기 화합물이 환자의 심장박동수와 심근 수축력을 증가시킬 수 있음을 나타내며, 이는 환자의 심근 산소 소비량과 심근 부하(myocardial burden)를 확실하게 증가시킬 수 있고 심장 근육들에 혈액의 수요 및 공급의 모순을 악화시킬 수 있다. 그러므로, 기존 문헌에 근거하여 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드가 CHD에 대해 치료법상 가치(therapeutic value)가 있는지 평가하는 것은 어렵지만, 이에 반하여 상기 화합물은 심장 근육에 혈액 수요 및 공급의 모순을 악화시키는 듯하다.
한편으로는, 혈관에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 효과에 관한 기존 문헌에 의한 보고에서, 5.12mM의 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 토끼의 적출 목동맥(isolated carotid)과 폐동맥(pulmonary arteries)을 이완(relax)시키지만 3.28mM에서는 주목할만한 효과가 전혀 나타나지 않는다. 상기 화합물은 1.71mM의 농도에서는 노아드레날린(noadrenalin)의 혈관수축(vasoconstriction)에 대한 대항 효과(antagonistic effect)를 가질 수 있으나, 1.37mM의 농도에서는 주목할만한 효과가 전혀 나타나지 않다.(Luo Sufang et al ., Journal of First Military Medical University , 1992; 12(1): 10~13). 다른 한편으로는, 상기 화합물은 0.02mM~2mM의 농도에서는 혈관 평활근(vascular smooth muscle)의 세포내 칼슘 농도를 현저하게 증가시킬 수 있다. 그러므로 혈관 평활근에 대한 직접적인 효과는 심근수축촉진 효과(positive inotropic effect) 및 안지오타시스(angiotasis)의 증가이다.(Jin Chunhua et al . China Pathophysiological Journal , 1998, 14(2): 195~198; Jin Chunhua et al . Chinese Pharmacological Bulletin , 2000, 16(2): 151~154). 분명하게, 일상적인 투여에서 혈장 약물 농도(plasma drug concentration)인 5.12mM를 인식하기는 쉽지 않다. 본 발명을 개에 적용한 약물동태학(pharmacokinetic) 연구에 의하면 30mg/kg의 투여 후에 일과성 최대 혈장 약물 농도(transient maximum plasma drug concentration)는 약 100μm/ml로 나타났으며, 이는 대략 0.25mM이다. 따라서, 5.12mM의 혈장 약물 농도는 600mg/kg의 투여를 요한다. 본 발명의 연구 결과에 의하면, 상기 투여로 동물들의 50% 치사량(LD50)에 달한다. 비교하여 말하면, 0.02mM~2mM의 상기 혈장 약물 농도는 정상 투여에 의해 도달할 수 있는 것이다. 그러므로, 기존 문헌에 기초할 때, 정상 투여에서 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 혈관에 대한 효과는 안지오타시스(angiotasis)의 증가일 수 있다. 만일 이것이 맞다면, 상기 화합물은 CHD의 증상들을 완화시키는데 도움을 주지 않으므로 심장작업량은 증가되어야만 한다.
기존 문헌에 기초할 때, 혈류역학(hemodynamics)적 효과의 관점에서 3,4',5- 트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드가 허혈심장질환(ischemic heart disease)에 치료법상 이로운 효과가 있는지 여부를 판단하는 것은 어렵다. 한편으로, 통상적인 견해에 따라 정반대의 결론이 내려질 수도 있다. 그러므로, 지금까지 왜 상기 화합물에 대한 항심근허혈(anti-myocardial ischemic) 실험 및 연구 결과에 대한 보고가 없는지에 대하여 이해하는 것은 어렵지 않다.
추가적으로, 다른 문헌에 따르면, 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 클로르프로마진(Chlorpromazine), 엔도톡신(endotoxin) 및 다른 인자들에 의한 시험관내 배양 심근 세포(cultured myocardial cells in vitro)의 손상에 대해 보호 효과가 있다.(Luo Sufang et al . Chinese Pharmacology Journal , 1990, 11(2): 147~150; Zhao Qing et al . Journal of First Military Medical University, 2003, 3(4): 364~365). 이러한 연구들은 시험관내 배양 심근 세포의 화학적 손상과 관련이 있고, CHD의 병리 과정(pathological process) 및 치료 메카니즘(therapeutic mechanism)과 다르므로, 상기 연구들은 본 발명에서 기술되는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 CHD에 대한 치료적 가치와 관련이 없다.
더 나아가, 중국특허출원 제02134928.2호는 미세순환을 향상시킬 수 있는 폴리다틴(polydatin) 또는 이의 제약적으로 허용되는 염(pharmaceutically acceptable salt)을 함유하는 제약 조성물(pharmaceutical composition) 및 미세순환을 향상시킬 수 있는 상기 제약 조성물의 의약품 조제로서의 용도에 대해 개시하고 있다. 상기 특허는 미세순환 장애에 의한 심장-뇌혈관 질환의 치료와 관련된 다. 허혈심장질환은 모세 혈관의 미세순환 장애라기보다 관상동맥 폐쇄질환(coronary arterial occlusive disease)이며, 그러므로 상기 특허출원은 허혈심장질환의 치료와는 전혀 상관이 없다.
중국특허출원 제02139335.4호는 폴리다틴이 폐동맥 고혈압(pulmonary artery hypertension)을 감소시킬 수 있는 점에 대해 언급할 때 상기 화합물은 관상동맥을 확장하고 혈류를 증가시킬 수 있다고 기술하고 있다. 상기 특허출원에 기재된 실시예들은 저산소증(hypoxia)에서의 동물의 폐압(pulmonary pressure)과 혈액학적 작용 요인(hematological active factor)들(응고에 효과가 있는 TXA2, PGI2와 같은 혈액학적 요인들) 및 허혈 동물 모델(ischemic animal model)들에 대한 상기 화합물의 효과에 대해서만 제시하고 있다. 그러나 이는 관상동맥 및 이의 혈류에 대한 효과와는 관련이 없으며, 최근의 결과가 아니다. 상기 화합물이 관상동맥을 확장하고 혈류를 증가시킨다는 점에 대한 어떠한 연구 보고도 없으며, 그러므로, 상기 특허에서 기술하고 있는 상기 관상동맥의 확장 및 관상동맥 혈류량의 증가는 과학적 연구 결과라기보다 추측(conjecture)일 수 있다.
본 발명의 일 목적은 허혈심장질환들을 치료 및/또는 예방하기 위한 제제 (製劑, preparation for pharmaceutical)로서 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 허혈심장질환들을 치료 및/또는 예방하기 위한 제제(製劑)로서 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 함유하는 제약 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측에 따르면, 본 발명에서 기술되는 상기 허혈심장질환에는 무증상 심근허혈(asymptomatic myocardial ischemia), 협심증(angina), 심근경색증(myocardial infarction), 허혈 심근병증(ischemic cardiomyopathy), 심부전(heart failure) 및 급사(sudden death)를 포함한다. 허혈심장질환의 치료 또는 예방에 적용될 때, 사람에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 투여량은 시간당 60kg 체중당 20 내지 300mg(20 ~ 300mg/60kg weight/time)이다. 이는 동물(쥐)에 대한 생체 실험(in vivo test) 결과인 시간당 1kg 체중당 2 내지 30mg(2 ~ 30mg/kg weight/time)의 유효 치료 투여량(effective therapeutic administrative dose)을 기초로 하여 체표면적을 기준으로 환산한 값이다. 사람에 대한 바람직한 투여 범위는 쥐의 경우인 5 ~ 20mg/kg에 대응하여 50 ~ 200mg/60kg weight/time이다. TSG는 치료에서 경구 투여(oral administration) 또는 정맥내 주사(intravenous injection)로 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측에 따르면, 본 발명의 제약 조성물은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 및 제약상 허용되는 보조제(pharmaceutically acceptable adjuvant)를 유효 성분으로 해서 본 기술 분야의 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 이러한 제약 조성물의 사용을 포함한다. 본 발명에 의한 상기 제약 조성물을 의료용 제제(medical preparation)로 제조할 때, 복용 형태는 다음과 같을 수 있다: 알약(tablet), 캡슐(하드 캡슐, 소프트 캡슐, 창자 도착 캡슐(enteric coated capsule) 및 마이크로 캡슐), 분말(powder), 과립(granule) 및 시럽(syrup)과 같은 경구 투여 제제; 주사, 좌약(suppository), 필(pill), 젤(gels), 및 패치(patch)를 포함하는 비경구 투여 제제(preparations of non-oral administration). 이러한 전형적인 형태에 추가하여, 본 발명에서는 경구 투여를 위한 (알약 및 과립과 같은) 즉효성 고형제제(instant solid preparation) 및 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 (알약, 과립, 미세 과립, 필, 캡슐, 시럽, 에멀젼(emulsion), 현탁액(suspension), 용액(solution)과 같은) 지효성 약제(sustained release preparation)가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 제제는 경우에 따라 코팅된 형태 또는 코팅되지 않은 형태일 수 있다. 본 발명에서 TSG를 적용하는 가장 바람직한 투여 형태는 경구 및 정맥내 투여를 위한 제제의 형태이다.
본 발명의 제약상 허용되는 보조제는 부형제(excipient), 윤활제(lubricant), 결합제(binding agent), 붕괴제(disintegrant), 안정제(stabilizer), 조형제(forming agent), 코팅제(coating agent) 등의 고형 제제 또는 용액, 용해화제(solubilizer), 현탁용제(suspending agent), 등장제(isotonizing agent), 버퍼(buffer), 완화제(emollient), 유화제(emulsifier) 등의 반 고형(semi-solid) 및 액상 제제(liquid preparation)이다. 더 나아가, 보존제(preservative), 항산화제(antioxidant), 착색제(colorant), 감미료(sweetner) 및 조미료(condiment) 등의 다른 의학용 첨가제들도 필요한 경우 또한 사용될 수 있다.
제약 조성물 제제에 있어서, 각 제제 단위(preparation unit) 내 TSG 유효 성분의 함량은 20mg ~ 300mg이며, 바람직하게는 50mg ~ 200mg이다. 상기 제제 단위는 일회 투여에 요구되는 총 제제의 양을 말한다. 따라서, 상기 TSG 함량은 단일 투약 내에 포함된 TSG의 총함량을 말한다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자들은 단위 제제(알약 낱개 또는 제제의 각 조각) 내의 TSG 함량을 제제 및 그것의 적용이 요구하는 것에 따라 결정할 수 있다. 예를 들어, 알약의 경우, 각 단위 제제는 투여 필요에 따라 TSG 2 ~ 30mg의 양으로 만들어질 수 있으며, 각 투여 때마다 1 내지 10개의 알약을 투여할 수 있다.
본 발명의 일련의 실험 연구 결과에서, TSG는 여러 요인들에 의해 발생한 동물 심근 허혈(animal myocardial ischemia)에 대항하여 현저한 보호 효과가 있다는 것이 증명되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 하이포피신(hypophysin)에 의해 유도된 쥐 심근 허혈에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 효과가 관찰되었다. 쥐의 혀정맥(lingual vein)을 통해 6U/kg의 하이포피신을 빠르게 주사로 투여하면 심장외막(epicardial) 및 심장내막(endocardial) 심근허혈이 유도될 수 있다. 이는 쥐 심전도(ECG)에서 ST 부(segment)가 빠르게 상승한 후 15~30초 후에 꼭지점에서 서서히 감소하여 T 파(wave)가 감소 또는 역전(inverse)하는 것, 또는 ST 부의 현저한 억제(suppression), 빈번한 심실 조기 박동(frequent ventricular premature) 및 또한 높은 또는 완전 방실차단(high or complete atrioventricular block) 특징을 보이는 것으로부터 알 수 있다. 3일 연속으로 5, 10, 20mg/kg을 투여한 후에, 10mg/kg 및 20mg/kg의 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 투여하면 심전도(ECG)에서 마취된 SD 쥐(anesthetized SD rats)에 대한 하이포피신의 정맥내 주사로 인한 심근 손상의 결과에 인한 ST 부 상승(ST segment elevation)을 현저하게 감소할 수 있음이 밝혀졌으며(대조군과의 비교에 의하면, △ST는 큰 차이를 나타냈다), 상기 화합물 10mg/kg 및 20mg/kg po은 하이포피신에 의한 쥐의 심근허혈손상을 효과적으로 예방할 수 있다는 것이 제안되었다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, SD 쥐의 심근 허혈 재관류 손상(reperfusion injury)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주사의 효과가 관찰되었다. 실험에서 심근 허혈 재관류 모델(myocardial ischemia reperfusion model)을 준비하는데 관상 동맥 결찰(coronary artery ligation)이 사용되었다. 실험에서 사용된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주사량은 각각 7.5, 15, 30mg/kg이었다.(체표면적 계산에 따르면, 개에 대한 7.5mg/kg은 70kg 체중인 사람에 대한 100mg/사람의 투여량과 같다.) 실험 결과에 의하면 심근 허혈 재관류 후에, 혈청(serum) LDH 및 CK 수치가 현저하게 증가하고 심근경색부(infarct area of myocardium)의 무게도 현저하게 증가하였으며, 겉보기 수술(sham operation) 대조군과 비교할 때 명백한 차이점(P<0.01)을 보였다. 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 낮은, 중간 및 높은 투여량(7.5, 15, 30mg/kg)은 혈청 CK의 활성을 현저하게 감소시킬 수 있으며, 심근경색부의 무게를 감소시킬 수 있다.(모델군(model group)과 비교할 때, P<0.05) 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 중간 및 높은 투여량(15 및 30mg/kg)은 혈청 LDH의 수치를 현저하게 감소시킬 수 있다.(모델군(model group)과 비교할 때, P<0.05) 이러한 결과는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주입(intravenous infusion)은 쥐의 허혈 재관류(ischemia reperfusion)에 의한 심근 손상에 대항하여 보호 효과가 있으며, 쥐 심근이 허혈 재관류에 의해 손상되었을 때 LDH 및 CK의 누출(leakage)을 현저하게 억제할 수 있고, 혈청 LDH 및 CK의 수치를 감소시키고, 심근경색부의 무게를 감소시킬 수 있다는 것을 가리킨다. 상기 결과는 투여량에 따라 변하는 관계를 보여준다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 심근경색 모델에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 치료 효과는 개의 경우 관상 동맥 결찰(coronary artery ligation)에 의한 것이라는 점이 관찰되었다. 이번 실험에서 관상 동맥 결찰은 심근허혈 재관류 모델 준비에도 사용(also used to prepare myocardial ischemic reperfusion model)되었다. 이번 실험에서 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 정맥내 주사로 각각 2.5, 5 및 10mg/kg의 투여량으로 사용되었다. 실험 결과는 관상 동맥 결찰을 한 지 5분 후에, 용매 대조군(solvent control group)에서 심장외막 전기도(epicardial electrogram)의 ST 부의 총합(ΣST)은 명백히 상승하는 것으로 나타났다. 30분 후에 상기 총합은 최대값에 도달(ΣST가 18.2% 증가)하였으며, 그런 다음 서서히 감소하였다. TSG를 2.5~10mg/kg만큼 정맥내 투여하면 투여량에 따라 ΣST의 상승을 억제할 수 있다. 2.5mg/kg 투여량군(2.5mg/kg dose group)과 용매 대조군(solvent control group) 간에는 30~90분이 지난 시점에서 큰 차이를 나타냈다. 5mg/kg 투여량군은 또한 용매 대조군과 비교할 때 모든 시점에서 큰 차이를 나타냈다. 10mg/kg의 고투여량군은 투여 직후 명백한 효과가 생겼으며, 이는 120분간 지속되었다. 실험 결과는 TSG를 2.5, 5 및 10mg/kg의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하면, 관상 동맥 결찰에 의해 유도된 개의 급성 심근허혈(canine acute myocardial ischemia)의 범위에서 명백한 치료 효과를 보이는 것으로 나타났다.
이와 유사하게, TSG는 투여량에 따라 심근허혈부의 크기 및 심장외막 전기도의 N-ST 수치를 낮출 수 있으며 이러한 효과는 120분 동안 지속될 수 있다. 같은 시점을 기준으로 전구간에 걸쳐 2.5mg/kg 투여량군과 용매 대조군의 N-ST 감소율을 비교한 결과, 30~90분 동안 큰 차이(P<0.05)를 보였다. 또한, 같은 시점을 기준으로 전구간에 걸쳐 5mg/kg 투여량군과 용매 대조군의 N-ST 감소율을 비교한 결과, 15~120분 동안 큰 차이를 보였다. 10mg/kg 투여량군의 경우, 용매 대조군과 비교하면 5~120분 동안 심근허혈의 감소가 매우 큰 차이를 나타냈다.
심근경색증 부위에 대한 정량적인 조직 검출(quantitative histological detection of the area of myocardial infarction)은 투여량에 따라 심근 경색부의 크기를 감소시킬 수 있는 2.5~10mg/kg의 투여량으로 TSG를 정맥내 투여한 것을 보여주기 위해 N-BT 염색을 채용한다. 결과는 심장외막 전기도로부터 검출된 것과 일치한다. TSG 2.5, 5, 10mg/kg의 투여 후, 경색부/좌심실의 비율(ratio of infarct zone/left ventricle)은 대조군과 비교할 때 매우 감소하였다(P<0.01). 경색부/전체 심장의 비율도 또한 대조군과 비교할 때 크게 감소하였다(P<0.05~0.01).
관상 동맥 결찰 후, 혈청락트산탈수소효소(serum lactate dehydrogenase, LDH) 및 크레아틴키나아제(creatine kinase, CK)의 수치가 둘 다 모든 군에서 상승하였다. TSG의 투여는 혈청 LDH 및 CK의 증가 정도를 2.5, 5, 10mg/kg의 투여량에서 크게 감소시킬 수 있으며, 고투여량(10mg/kg)의 경우 가장 강한 약역학 작용(pharmacodynamic action)을 보였다.
이러한 실험 결과들은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주입은 관상 동맥 결찰에 의해 유도된 개의 심근 허혈 정도를 감소(reduce the extent of canine myocardial ischemia induced by coronary artery ligation)시킬 수 있고, 심근 허혈부의 크기를 최소화(minimize the area of myocardial ischemia)할 수 있다. 이러한 작용의 강도는 투여량에 따라 달라진다. 조직의 정량적 검출 결과(results of quantitative detection of histology)는 심장외막 전기도의 결과와 일치하며, 이는 관상 동맥 결찰에 의해 유도된 개의 심근 경색증에 대해 TSG 정맥내 주사가 명백한 치료 효과를 가진다는 것을 시사한다. 실험 결과는 또한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 락트산탈수소효소 및 크레아틴키나아제의 혈청 증가 정도(degree of serum increment of lactate dehydrogenase and creatine kinase)를 크게 감소시킬 수 있다는 것을 보여주며, 이는 상기 화합물이 혈청 LDH 및 CK의 유출(efflux)을 감소시킬 수 있어, 심근허혈에 의한 세포 손상(cellular damage)을 최소하하고 심근 세포(myocardial cells)에 대한 보호 효과를 가진다는 것을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 위내 투여(intragastric administration)가 개의 급성 심근경색증(canine acute myocardial infarction)에 대해 보호 효과를 가진다는 것이 관찰되었다. 실험 모델은 실시예 2와 동일하다. 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 경구 투여(위내 투여)는 7.5, 15 및 30mg/kg의 투여량을 각각 채용하였다. 실험 결과는 TSG 7.5, 15 및 30mg/kg po는 심근 허혈에 의해 유도된 ST 부(ST segment)의 상승을 감소시킬 수 있으며, 가장 최적의 결과는 20mg/kg군이라는 것을 보여준다. TSG 7.5, 15 및 30mg/kg po는 ΣST를 다른 정도로 감소시킬 수 있다. 위내 관류(intragastric perfusion)후 대부분의 시간 동안, ST 부는 현저한 억제를 보였다. TSG의 7.5, 15 및 30mg/kg 투여 후, N-ST는 완만하게 감소하였다. 용매 대조군과 같은 시간 동안 비교할 때 투여한 지 90분 후에 현저한 감소를 보였다. TSG 10 및 20mg/kg po는 혈청 LDH의 활성을 크게 감소시킬 수 있다. 정량적 인 조직 검출(N-BT 염색법)은 TSG 10 및 20mg/kg po가 심근 경색부의 크기를 현저하게 최소화할 수 있다는 것을 나타냈다. 실시예 4는 TSG의 경구 투여가 심근허혈을 완화시키는 효과가 있다는 것을 보여주며, 마취된 개에서 급성 심근 경색증으로 유도된 심근 손상에 대한 보호 효과가 있다는 것을 보여준다.
본 발명의 다른 실시예에서, 건강한 마취 개의 심근 산소 소비량에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주사의 효과가 관찰되었다. 실험 결과는 다음과 같다: 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)를 2.5, 5, 10mg/kg으로 정맥내 주사한 후 대조군과 비교할 때 심근 산소 소비량에 큰 차이(P>0.05)는 없었다. 심근 산소 섭취율(myocardial oxygen uptake)은 현저히 감소되었다. 2.5mg/kg군을 대조군과 동일 시점에서 비교할 때, 15, 60 및 90분에서 상기 감소율이 크게 나타났다. 5 및 10mg/kg군들은 둘 다 15분에서 120분 사이에 큰 감소를 보였다. 2.5, 5, 10mg/kg으로 TSG를 정맥내 주사로 투여하면 관상 동맥류(coronary artery flow)를 증가시킬 수 있으며, 다양한 투여군들의 증가율은 동일 시점에서 용매 대조군과 비교되었을 때 15~120분 내에 큰 차이를 보였다. TSG를 5,10mg/kg 투여하고 120분 내에, 용매 대조군과 동일 시점에서 비교할 때 관상 저항 감소율(coronary resistance drop rate)에 큰 차이가 나타났다. TSG는 개의 심박출량(canine cardiac output)를 증가시킬 수 있다. 동일 시점에서 용매 대조군과 비교되었을 때, 5mg/kg 투여군은 60분 및 90분에 심박출량 변화율에 큰 차이를 나타내고, 10mg/kg 투여군은 15분 및 30분에 심박출량 변화율에 큰 차이를 나타냈으며(P<0.05), 60분 및 90분에서는 매우 큰 차이를 나타냈다(P<0.01). 상기 결과들은 마취 개에서 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드가 관상 동맥류 및 심박출량을 증가시킬 수 있고 심근 산소 섭취율을 현저하게 감소시키고 관상 저항을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
마취된 정상 개들의 심장 박동수(heart rate), 혈압, 심장의 수축 및 이완 기능(systolic and diastolic function of heart)과 같은 혈류역학적 지수(hemodynamic indexes)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주사의 영향이 본 발명의 다른 실시예에서 관찰되었다. 실험 결과는 TSG 2.5, 5mg/kg iv 후에, 심장 박동수, 혈압, 좌심실압(left ventricular pressure) 및 좌심실내 압력 변화의 최대값(maximal rate of left intraventricular pressure changes)이 변화하는 것을 보여준다. 그러나 투여 전의 값들과 비교하였을 때 큰 차이를 나타내지는 않았다. TSG 10mg/kg iv는 마취된 개의 혈압을 상승시켰다. 그러나 투여 전과 비교할 때 큰 차이는 없으며, 다른 지수들의 경우에도 큰 변화가 있지는 않다.
만성 심근허혈(chronic myocardial ischemia)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 위내 투여에 의한 치료 효과는 본 발명의 다른 실시예에서 쥐에 대해 관찰되었다. 관상 동맥 결찰에 의해 유도된 만성 심근허혈이 실험 모델로 사용되었으며, 상기 모델을 준비하는 시간은 6주 동안 지속되었다. 모델 준비가 완성된 후, TSG의 투여는 20mg/kg의 투여량으로 6주 동안 계속되었다. 실험 결과는 대조군 내에서 허혈 동물의 평균 동맥압(average artery pressure of ischemic animal)이 겉보기 수술(sham operation)보다 낮게 나타난 반면, TSG 투여군 내에서 동물의 혈압은 겉보기 수술군의 수준으로 돌아온 것으로 나타났다. 허혈 조절 동물(ischemic control animal)의 LVDP는 대조군의 것보다 높았다. 그러나 LVESP 및 ±dp/dtmax는 감소되었다. TSG 투여 동물의 대응되는 혈류 역학 지수(hemadynamic indexes)는 현저한 향상을 보였다. 추가적으로, TSG 투여 동물의 상기 허혈 및 경색 세포(ischemic and infarct tissue)는 허혈 조절 동물의 것과 비교할 때 크게 감소하였다. 실험 결과는 TSG의 위내 투여는 쥐의 만성 심근 허혈에 중대한 치료 효과가 있음을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면 TSG를 쥐의 꼬리에 정맥내 주사로 투여한 경우 LD50은 648.94mg/kg으로 나타났으며, 95% 신뢰도 범위는 571.18mg/kg 내지 726.70mg/kg이다.
TSG iv의 일회 투여에 의한 개의 약물동태(canine pharmacokinetics)가 본 발명의 다른 실시예에서 관찰되었다. 실험 결과는 TSG 10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg을 건강한 비글(Beagle) 개들에게 정맥내 주사로 투여한 후에 TSG의 생리적 기질(physiological disposition)이 두 개의 구획 모델(compartment model)과 같다는 것을 보여 준다. 즉, 농도-시간 커브에서 최종 소실 반감기(terminal elimination half lives)(t1/2)는 각각 168분, 152분, 373분이었다. AUC 0~∞(약물농도곡선하면적, area under the concentration-time curve)는 각각 315, 745 및 1552μg·min/ml인 반면, AUC는 주로 투여량과 긍정적 상관관계(positive correlation)를 가지며, 상관계수 r은 0.985이다.
상기 연구 결과는 TSG가 명백한 항심근허혈 효과(anti-myocardial ischemic effect)를 가진다는 것을 나타내며, 그러므로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자들은 상기 화합물이 심장허혈질병, 즉 CHD의 치료 및/또는 예방에 훌륭한 응용 가치를 지니고 있다는 것을 이해할 수 있다.
본 발명의 일련의 실험들은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주사 및/또는 경구 투여는 심근허혈손상(myocardial ischemic injury) 및 하이포피신 및/또는 관상 동맥 결찰에 의한 심장의 기능 손상에 대한 놀라운 치료 및/또는 예방 효과가 있다는 것을 증명한다. 상기 효과는 허혈에 의한 심근허혈 손상의 크기 및 정도를 감소시키고, 급성 심근허혈에 의한 혈청 LDH 수치를 감소시키며, 만성 심근허혈에 의한 심장 기능을 회복하고 심근 손상을 완화시키는 특징이 있다.
시험관내 약리 실험 결과의 보고와 다르게, 본 발명의 실험예의 투여 범위 내에서, TSG는 마취된 정상 동물의 심장 박동수와 심장 기능에 중요한 효과를 나타내지 못한다. 그러므로 TSG는 이러한 투여량 범위 내로 살아있는 동물에 대해서 심근 작업량을 증가시키거나 심박동 증가 효과(positive chronotropic effect) 및 심근 수축 촉진 효과(positive inotropic effect)에 의한 심근 산소 소비량의 현저한 변화를 일으키지 않는다. 본 발명의 연구는 실험에서의 투여량 범위로, TSG는 실험 동물의 관상동맥 혈류량을 증가시킬 수 있으며, 관상 동맥의 저항 및 산소 섭취율(resistance and oxygen uptake rate of coronary artery)을 감소시킬 수 있다는 것을 제시한다. 이러한 효과들이 TSG의 항심근허혈 효과에 도움을 준다는 것은 명백하다. 기존 문헌에 이러한 효과들에 대한 어떠한 보고도 없으며 또한 기존 문헌들로부터 유추되는 이러한 효과들에 대한 어떠한 보고도 없다.
약물동태학 연구에서 밝혀진 바로는, 본 발명에서 사용된 30mg/kg의 최대 투여량을 TSG 정맥내 주사로 투여하여 얻어진 혈장(plasma)의 최대 농도는 단지 10μg/ml 즉 대략 0.25 mmol/L이며, 실험에서 직접 시험관내 혈관확장(vasodilation)을 하여 얻어진 혈장 농도(5.25mM)와는 10배 이상 다르다(Luo Sufang et al ., Journal of First Military Medical University , 1992; 12(1); 10~13). 만일 5mM의 혈장 농도가 요구되면, 투여량은 600mg/kg이어야 한다. 사실, 이러한 투여량은 정맥내 주사로 쥐에 대한 DL50(640mg/kg)과 가까우며, 따라서 실제로 사용하기는 명백히 불가능하다. 다른 한편으로, 문헌에 따르면, TSG 0.02mM ~ 2mM는 혈관 평활근(vascular smooth muscle)의 세포내 칼슘 농도를 현저히 증가시킬 수 있다. 그러므로, 혈관 평활근에 대한 직접적인 효과는 심근 수축 촉진 효과(positive inotropic effect) 및 안지오타시스의 증가(enhancement of angiotasis)이다(Jin Chunhua et al . Chinese Pharmacological Bulletin , 2000; 16(2): 151~154). 그러나, 본 발명의 전체 동물 실험은 투여량 범위 내의 TSG는 말초혈관저항(peripheral vascular resistance)에 현저한 효과가 없다는 것을 증명하며, 이는 본 발명에서 항심근허혈 투여량의 TSG는 생체내(in vivo) 저항 혈관(resistance vessel)에 대한 현저한 효과가 없다는 것을 나타낸다.
본 발명에서 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 연속적 경구 투어 및 정맥내 주사는 항심근허혈 효과가 있다는 것이 더 밝혀졌다.
그러므로, 본 발명은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드가 항심근허혈제로서 관상 동맥 심질환(coronary heart disease)의 치료 및/또는 예방을 위한 제제로 사용할 이로운 가치가 있다는 것을 제기한다.
기존 문헌에는 본 발명과 직접적으로 관련 있는 어떠한 보고도 없으며 기존의 기초 연구 정보는 TSG의 항심근허혈에 대한 잠재적 가치에 대해 나타내는 바가 없고, 다른 한편으로, 시험관내 배양 심근 세포 및 혈관 평활근 세포(cultured myocardial cells and vascular smooth muscle cells in vitro)에 대한 실험 결과에 따르면(Jin Chunhua et al . Chinese Pharmacological Bulletin , 2000, 16(4): 400~402; Jin Chunhua et al . Chinese Journal of Pathophysiology , 1998, 14(2): 195~198; Jin Chunhua et al . Chinese Pharmacological Bulletin , 2000, 16(2): 151~154), TSG는 심근허혈의 조건 하에서 혈류 역학(hemadynamics)의 향상에 도움이 되지 않을 수 있으며 허혈심근(ischemic myocardium)의 혈액 공급 및 수요의 모순을 악화시킬 수 있다고 추정된다. 보고된 항심근허혈에 대한 유효용량(effective dose)에서 심근 수축 촉진 효과 및 안지오타시스의 증가는 일어나지 않는다는 것을 본 발명은 증명하며, 당해 기술 분야에서 숙련된 기술자들이 본 발명은 신규하고 진보성을 갖추고 있다고 이해할 수 있다는 것은 명백하다.
도 1은 관상 동맥 결찰(coronary artery ligation) 후 개의 심근허혈 정도(심장외막 전기도(epicardial electrogram)에서 ΣST)에 대한 TSG의 효과를 나타낸다.
종좌표(ordinates)는 ΣST의 변화율을 나타내고, 횡좌표(abscissas)는 관상 동맥 결찰 후 시간을 나타낸다.
결과: 용매 대조군과 비교하면, 양성 조절군(positive control group) 및 TSG를 투여하는 모든 군들에서 심근허혈의 정도가 줄어든다.(보다 자세한 사항은 실시예 2를 참조)
도 2는 관상 동맥 결찰 후 개의 심근 허혈부의 크기(심장외막 전기도에서 N-ST)에 대한 TSG의 효과를 나타낸다.
종좌표(ordinates)는 N-ST의 변화율을 나타내고, 횡좌표(abscissas)는 관상 동맥 결찰 후 시간을 나타낸다.
명백하게도, 용매 대조군과 비교하면, 양성 조절군 및 TSG를 투여하는 모든 군들에서 심근허혈부의 크기가 감소한다.(보다 자세한 사항은 실시예 2를 참조)
도 3은 마취된 개의 심근 산소 소비량에 대한 TSG의 효과를 나타낸다.
종좌표(ordinates)는 심근 산소 섭취율의 변화율(%)을 나타내고, 횡좌표(abscissas)는 투여 후 시간을 나타낸다.
상기 도면은 투여 후, 마취된 개에서 TSG의 모든 투여량군에서 심근 산소 섭취율이 감소하였음을 증명한다.(보다 자세한 사항은 실시예 5를 참조)
도 4는 마취된 개에서 관상 혈류(coronary blood flow)에 대한 TSG의 효과를 나타낸다.
종좌표는 관상 혈류의 변화율(%)을 나타내고, 횡좌표는 투여 후 시간을 나타낸다.
상기 도면은 투여 후, 마취된 개에서 TSG의 모든 투여량군에서 관상 혈류가 증가하였음을 증명한다.(보다 자세한 사항은 실시예 5를 참조)
도 5는 마취된 개에서 심박출량(cardiac output)에 대한 TSG의 효과를 나타낸다.
종좌표는 심박출량의 변화율(%)을 나타내고, 횡좌표는 투여 후 시간을 나타낸다.
상기 도면은 TSG의 중간투여량 및 고투여량군에서, 상기 투여군에 해당되는 마취된 개의 심박출량이 증가되었다는 것을 증명한다.(보다 자세한 사항은 실시예 5를 참조)
도 6은 비글 개들에게 TSG 10, 20 및 30mg/kg을 정맥내 주사로 일회 투여한 후의 농도-시간 곡선을 나타낸다.
종좌표는 혈액 약물 농도의 변화율(change rate of blood drug concentration)(μg/ml)을 나타내고, 횡좌표는 투여 후 시간을 나타낸다.(보다 자세한 사항은 실시예 9를 참조)
본 발명의 내용은 하기 실시예들로 보다 더 상세히 서술된다. 특별히 설명하지 않는 한, 실시예에서 사용된 재료들은 상업적으로 구입한 것들이다.
3,4',5-
트리히드록시
-
스틸벤
-3-베타-D-
글루코사이드(TSG)의
실험 샘플 준비
하기 실시예들에서 사용된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)는 중국특허출원 제200310112538.3호의 폴리다틴 및 레스베라트롤의 새로운 제조 방법(NEW METHOD FOR PREPARATION OF POLYDATIN AND RESVERATROL)에 기술된 방법으로 준비되었다.(제품번호(Batch no): 031011, 센젠 넵투너스 파마쑤티컬 캄퍼니 리미티드에 의해 제조됨(prepared by Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co., Ltd.))
(1) 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 과립(granule)(실시예 1, 4 및 7에서 사용된 샘플)의 준비
조제(prescription):
| 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 | 20g |
| 녹말(starch) | 40g |
| 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose)(PH301) | 40g |
| 과립의 중량 | 100g |
조제: 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 젖당(lactose) 및 미결정 셀룰로오스(PH301)과 균질 혼합물을 형성할 때까지 혼합된다. 적합한 양의 알콜-물을 첨가한 후, 상기 혼합물 분말은 건조 및 수집(harvest) 전에 과립으로 만들어진다.
(2) 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 용액(실시예 2, 3, 5, 6, 8 및 9에서 사용된 샘플)의 준비
| 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 | 100g |
| 무수 알코올(dehydrated alcohol) | 8L |
| pH 9의 NaOH 용액 및 첨가된 물 | 10L |
| 재포장(repacked in) | 1000 앰풀 또는 병 |
조제: 40g의 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 8L의 무수 알코올에 가열하여 용해한다. 밀리포어 필터(millipore filter)로 여과되고 1000개의 앰풀(ampouls) 또는 병으로 재포장되기 전에, 용액의 총부피가 10L로 될 때까지 pH 8.5인 NaOH 수용액을 첨가한다.
실시예
1
쥐의 하이포피신에 의해 유도된 심근 허혈에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 경구 투여의 효과
본 실시예의 목적은 쥐의 경우에 있어서 하이포피신에 의해 유도된 심근 허혈에 대해 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 경구 투여한 경우의 효과를 확인하기 위한 것이다.
약물 및 약제(drugs and agents)
실험 약물(test drug): 투여 전에 0.8% CMC에 의해 농도 1.25, 2.5 및 5mg/ml의 서스펜션(suspension)으로 준비된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 (제품번호: 031011)
대조 약물(control drug): 투여 전에 0.8% CMC와 농도 20mg/ml의 서스펜션(suspension)으로 준비된 샹하이 레이 윤 샹 파마쑤티컬 캄퍼니 리미티드(Shanghai Lei Yun Shang Pharmaceutical Co.,Ltd)의 제품인 단쉔 알약(Danshen Tablet) (제품번호: 030926), 300mg/tab
실험 동물(test animal)
제2 군의대학(Second Military Medical University)의 실험 동물 센터에서 제공된 무게 300~425g의 50 마리의 수컷 SD 쥐들
군들 및 투여량(groups and administration)
실험을 위해 공대조군(blank control group), 단쉔 알약군(300mg/kg) 및 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 저투여량군(5mg/kg), 중간 투여량군(10mg/kg) 및 고투여량군(20mg/kg)을 포함하는 5개의 군들이 준비되었다. 실험 약물 및 대조 약물 모두 다른 농도에서 동일한 부피로 위내 투여되었다. 위내 투여량의 부피는 모든 군들의 경우에서 3ml/kg이었다. 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 저투여량, 중간 투여량 및 고투여량은 각각 5, 10 및 20mg/kg이었다. 단쉔 알약군의 투여량은 300mg/kg이며, 공대조군은 동일한 부 피의 0.8% CMC가 투여되었다.
실험 방법(test method)
50 마리의 건강한 수컷 SD 쥐들이 5개의 군으로 임의로 나누어졌으며, 3일 연속으로 하루에 한번씩 약물 및 대조 용매들의 위내 투여를 수행하였다. 세번째 날에서 투여한 지 한 시간 뒤에 동물들에게 3% 펜토바르비탈 소듐(pentobarbital sodium) ip를 30mg/kg씩 투여하여 마취하였다. 정상 V3 심전도유도(normal electrocardiogram of V3 lead)가 1mV=1cm로 전압을 표시하여 기록되었다.(샹하이 포토일렉트리칼 메디칼 일렉트로닉 아파라투스 컴파니, 리미티드(Shanghai Photoelectrical Medical Electronic Apparatus Co., Ltd.)에서 제조된 ECG-6511 심전도계를 사용) 다만, 기초 심전도(basic ECG)가 비정상인 동물은 실험에서 사용되지 않았다. 15분 동안 안정화된 후, 동물에게 하이포피신(제품번호: 020601, 샹하이 헤펑 파마쑤티컬 컴파니, 리미티드(Shanghai Hefeng Pharmaceutical Co., Ltd.)에 의해 생산되었으며, 사용 전 생리식염수 0.6U/ml로 준비됨)을 혀정맥(lingual vein)을 통해 6U/kg의 투여량으로 빠르게 주입하였다. 하이포피신의 투여전 시점, 투여 직후, 투여 후 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 및 60분이 지난 시점에서 V3 심전도유도가 기록되었다. ST 부 상승(ST segment elevation)은 모든 시점에서 통계적 처리되었으며, ST 부 상승의 정도 변화(△ST, mV) 및 동물들의 사망 조건이 관찰되었다.
실험 결과
(1) 하이포피신의 정맥내 주사 후 심전도(ECG)의 일반적 변화: 하이포피신의 주입 후, 쥐의 ECG에 나타낸 주된 특징은 ST 부의 빠른 상승이었으며, 단지 15~30초 후에 최대값에 도달하였고, 그 다음 T-파 감소 또는 역전(T-wave being lowering or inversing)으로 서서히 감소하기 시작하거나 또는 ST 부가 현저히 억제되어 심장내막 및 심장외막의 심근 허혈을 나타내거나, 또는 높은 정도 또는 완전한 방실차단(atrial ventricular block)을 나타내면서 심실조기수축(ventricular premature contraction)이 자주 발생하는 것이 관찰되었다.
(2) 외상 ST 부 상승(traumatic ST segment elevation)에 대한 실험 약물의 효과: 하이포피신의 주입에 의한 상처로부터 유도된 ST 부 상승의 정도 변화(△ST, mV)가 판단의 기준으로 사용되었다. 실험 결과에 의하면, 마취된 SD 쥐에게 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 10mg/kg 및 20mg/kg 투여하면, 하이포피신(hypophysin)을 정맥내 주사로 투여하여 발생한 심근 손상에 의한 심전도(ECG)의 ST 부 상승이 현저히 감소할 수 있다는 것을 보여준다.
결론
마취된 쥐에게 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 10mg/kg 및 20mg/kg의 투여량으로 주입하면, 하이포피신의 정맥내 주사로 인한 심근 손상에 의한 ECG의 ST 부 상승을 현저히 감소할 수 있으며, 이는 상기 화합물을 10mg/kg 및 20mg/kg po로 투여하면 하이포피신에 의한 심근허혈손상의 예방에 비교 적 효과가 있다는 것을 나타낸다.
하기 표 1은 SD 쥐에서 하이포피신에 의해 유도된 ST 부 상승(△ST)에 대한 TSG의 영향(
, mV, n=10)을 나타낸다.
| 용매 조절 (solvent control) | 단쉔 알약 (Danshen Tablet) 80mg/kg | TSG 20mg/kg | TSG 10mg/kg | TSG 5mg/kg | |
| 투여 후 30초 경과 | 0.096±0.063 | 0.056±0.047 | 0.110±0.055 | 0.066±0.22 | 0.075±0.070 |
| 투여 후 1분 경과 | 0.103±0.071 | 0.078±0.059 | 0.086±0.062 | 0.081±0.063 | 0.078±0.072 |
| 투여 후 2분 경과 | 0.093±0.062 | 0.076±0.061 | 0.075±0.051 | 0.070±0.055 | 0.083±0.070 |
| 투여 후 5분 경과 | 0.121±0.071 | 0.080±0.054 | 0.068±0.060 | 0.069±0.067 | 0.056±0.048* |
| 투여 후 10분 경과 | 0.142±0.197 | 0.093±0.061 | 0.073±0.061 | 0.083±0.070 | 0.076±0.066 |
| 투여 후 15분 경과 | 0.158±0.074 | 0.086±0.060* | 0.059±0.040** | 0.066±0.042** | 0.076±0.058* |
| 투여 후 20분 경과 | 0.135±0.089 | 0.065±0.032* | 0.049±0.047* | 0.055±0.046* | 0.072±0.054* |
| 투여 후 30분 경과 | 0.119±0.068 | 0.079±0.058 | 0.041±0.036** | 0.074±0.072 | 0.067±0.079 |
| 투여 후 40분 경과 | 0.137±0.081 | 0.066±0.057* | 0.052±0.040** | 0.069±0068 | 0.102±0.093 |
| 투여 후 50분 경과 | 0.160±0.090 | 0.078±0.070* | 0.066±0.058* | 0.079±0.073* | 0.089±0.081 |
| 투여 후 60분 경과 | 0.174±0.109 | 0.079±0.092 | 0.054±0.046** | 0.064±0.056** | 0.088±0.069* |
대조군과 비교한 경우 P<0.05; **P<0.01
실시예
2
쥐의 심근 허혈 재관류 손상(ischemic reperfusion injury of myocardium)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 iv의 보호 작용
본 실시예의 목적은 SD 쥐에서 심근의 허혈 재관류 손상에 대해 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 정맥내 주사로 주입한 경우의 효과를 관찰하는 것이다.
실험 약물
실험 약(test drug): 사용 전에 생리식염수로 100mg/10ml로 희석된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(제품번호: 031030302).
양성 조절 약물(positive control drug): 독일 슈바르츠 파마 에이쥐(Germany Schwarz Pharma AG)로부터 제조되고 추하이 슈바르츠 파마 캄퍼니 리미티드(Zhuhai Schwarz Pharma Co., Ltd.)로부터 재포장된 소르비드 니트레이트(sorbide nitrate) 주입(이소소르비드 디니트레이트, 제품번호: 479210)
실험 동물
제1 군의 대학(First Military Medical University)의 실험 동물 센터로부터 제공된 각 무게가 250~300g인 SPF 등급의 수컷 SD 쥐들.
군들 및 투여량
겉보기 수술군, 생리 식염수 조절군 및 이소소르비드 디니트레이트 조절군(0.6mg/kg) 및 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 저투여량군(7.5mg/kg), 중간 투여량군(15mg/kg) 및 고투여량군(30mg/kg)이 실험을 위해 준비되었다(표면적 방법으로 계산하면, 7.5mg/kg의 저투여량은 체중 70kg인 사람에 대해 100mg의 투여량과 동일하다). 투여는 대퇴 정맥내 주입(femoral intravenous injection)에 의해 수행되었다.
실험 방법
(1) 관상 동맥 결찰 및 수술의 방법: 수컷 SD 쥐들이 펜토바르비탈 소듐(45mg/kg)으로 마취되었고 심전도계(ECG-6851C, 샹하이 포토일렉트리칼 메디칼 일렉트로닉 아파라투스 캄퍼니 리미티드(Shanghai Photoelectrical Medical Electronic Apparatus Co., Ltd.)에 의해 제조됨)로 II lead ECG의 기록을 위해 상기 쥐들의 등을 고정시켰다(immobilized on their backs for records of II lead ECG with an electrocardiograph). 기관(tracheas)들은 관이 삽입되고(intubated) 호흡 장치와 연결되었다. 네번째/다섯번째 갈비를 잘라내고 심장을 노출시키기 위해 심장의 심장막(pericardium)을 여는 개흉술(thoracotomy)이 왼쪽 가슴의 갈비사이공간(intercostal space)에 수행되었다. A 0/3 봉합선(suture line)은 관상 동맥으로부터 내려오는 앞왼갈래가지(anterior left branch)의 아래를 지나도록 하였다. 안정화한 지 10분 후에 비정상 심전도(ECG)를 보이는 쥐들은 폐기되었다. 미세 실리콘 튜브의 작은 부분을 통과하여 지나는 두 개의 실(thrumbs)로 허혈 결찰을 위한 미세 실리콘 튜브의 다른 작은 부분과 묶기를 하였다(a ligature was made on another small piece of fine silicone tube for ischemic ligation). ST 부와 T-파에 변화를 보이지 않는 것들은 배제하였다. 결찰된 지 10분 후, 대퇴 정맥을 통해 약물을 천천히 주입하였다. 40분 후, 결찰선(ligation line)은 내림앞가지(anterior descending branch)의 재관류를 위해 30분 동안 잘라졌다.
(2) 락트산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 및 크레아틴키나아제(creatine kinase, CK)의 검출: 재관류가 완료된 후에, 자외선 분광법(ultraviolet spectrometry)으로 LDH 및 CK의 혈청 작용을 측정하기 위해 복부 대동맥(abdominal aorta)으로부터 혈액을 견본으로 추출하였다.
(3) 심근 경색부의 크기 측정(measurement of the area of myocardial infarction): 관상 결찰선(line of coronary ligation) 아래 부분으로부터 방실고랑(atrioventricular furrow)과 평행하게 5개의 심실 심근(vetntricular myocardium) 조각이 같은 두께로 절단되었으며, 니트로블루테트라졸리움 염색 용액(staining solution of nitroblue tetrazolium, N-BT) 내에 15분 동안 투입되어 흔들면서 염색되었다. 정상 심근은 라슈레우스 색(lasureous color)으로 염색되는 반면, 심근 경색부는 염색되지 않고 창백한 노란색을 띤다. 현미경 하에서, 상기 경색부를 분리하고 무게를 측정하였으며, 심근 무게의 총합에 대한 경색부 무게의 퍼센트(%)가 심근경색부의 크기에 관한 지수(index)로 채용되었다.
(4) 데이타 및 통계적 처리: 모든 군들의 데이타는 
로 나타냈으며 데이타의 중요성을 확인하기 위해 변화율에 대한 분석이 채용되었다.
실험 결과
심근 허혈 재관류 후에, 혈청 LDH와 CK의 활성 및 경색부의 무게가 모두 명백하게 증가하였으며, 겉보기 수술군과 비교할 때 차이가 매우 크다(P<0.01). 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 저투여량, 중간 투여량 및 고투여량군(7.5, 15, 30mg/kg)에서, 상기 혈청 LDH와 CK의 활성 및 심근의 경색부 크기의 무게는 명백히 모델군의 그것들에 비해 낮게 나타났다(P<0.05). 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드군들과 유사하게, 이소소르비드 디니트레이트군의 혈청 LDH와 CK의 활성 및 심근의 경색부 크기의 무게는 명백히 감소하였다(P<0.05).(표 2 참조)
결론
3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주사는 허혈 재관류에 의한 쥐의 심근 손상에 대해 보호 작용을 가진다. 상기 화합물은 심근 손상이 허혈 재관류가 일어나는 시간 동안 발생한 경우 LDH 및 CK의 유출(efflux)을 억제할 수 있으며, 특정 투여-효과 관계(dose-effect relationship)를 나타내면서 혈청에서 LDH 및 CK의 활성과 심근 경색부 크기의 무게를 감소시킬 수 있다.
하기 표 2는 허혈 재관류 쥐들의 혈청 활성 및 심근 경색 정도에 대한 TSG의 효과(
, n=10)(Effect of TSG on serum activities and extent of myocardial infarction in ischemic reperfusion rats)를 나타낸다.
| 군들(Groups) | 투여량 (Doses) | CK(IU/L) | LDH(IU/L) | 경색부 퍼센트(%) (infarct area percentage) |
| 겉보기 수술 (Sham operation) | 1.0ml/kg | 510.8±80.9 | 655.5±78.3 | -- |
| 생리 식염수 (Normal saline) | 1.0ml/kg | 865.4±189.1△△△ | 989.9±184.6△△△ | 33.73±3.83△△△ |
| 이소소르비드 디니트레이트 (Isosorbide Dinitrate) | 0.6mg/kg | 637.1±100.4*** | 806.0±92.0*** | 23.98±3.16*** |
| 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 군들 | ||||
| 저 투여량 | 7.5mg/kg | 710.7±106.8** | 857.7±124.0 | 27.57±5.33*** |
| 중간 투여량 | 15.0mg/kg | 630.6±108.6*** | 809.4±128.4** | 24.80±3.32*** |
| 고 투여량 | 30.0mg/kg | 559.4±72.9*** | 744.0±149.2*** | 23.71±3.66*** |
생리 식염수 군과 비교한 경우 **P<0.05, ***P<0.01; 겉보기 수술군과 비교한 경우 △△△P<0.01
실시예
3
관상 동맥 결찰에 의해 유도된 개의 심근 경색 모델에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 iv의 치료 효과
본 실시예의 목적은 관상 동맥 결찰에 의해 유도된 개의 심근 경색 모델에 대해 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 치료 효과를 관찰하는 것이다.
실험 약물
실험 약: 사용 전 생리식염수로 100mg/10ml로 희석된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(제품번호: 03030302).
양성 조절 약물(positive control drug): 독일 슈바르츠 파마 에이쥐(Germany Schwarz Pharma AG)로부터 제조되고 추하이 슈바르츠 파마 캄퍼니 리미티드(Zhuhai Schwarz Pharma Co., Ltd.)로부터 재포장된 소르비드 니트레이트(sorbide nitrate) 주입(이소소르비드 디니트레이트, 제품번호: 479210)
실험 동물
제 군의 대학의 실험 동물 센터로부터 제공된 각 무게가 10~15kg인 건강한 수컷 및 암컷 잡종(hybrid) 개.
군들 및 투여량
겉보기 수술군, 생리 식염소 조절군 및 이소소르비드 디니트레이트 조절군(0.4mg/kg) 및 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 저투여량군(2.5mg/kg), 중간 투여량군(5mg/kg) 및 고투여량군(10mg/kg)이 실험을 위해 준비되었다. 약물은 정맥내 주사로 투여되었다. 투여된 약물의 부피는 허혈 재관류 동물 모델군의 생리 식염수의 부피인 2ml/kg과 동일하였다.
실험 방법
무게 측정 후, 상기 동물들은 30mg/kg의 펜토바르비탈 소듐(pentobarbital sodium) iv로 마취되었다. 기관삽관(tracheal intubation)이 수행되었고 SC-M5 마취 호흡기(샹하이 의료 기구 공장에서 제조됨)가 흉골좌연(胸骨左緣, left sternal border)의 네번째 갈비사이공간(fourth intercostal space)에 대한 개흉술(thoracotomy) 후에 기계적 환기(mechanical ventilation)를 위해 연결되었다(350~550ml의 일회 호흡량으로 분당 16~18번). 심장의 노출로, 심장막 해먹(pericardium hammock)을 만들기 위해 심장막이 절개되었다. 관상 동맥은 첫번째와 두번째 좌전하행 관상 동맥 가지(first and second branches of left anterior descending coronary artery) 사이가 분리되었으며, 아래에는 두 단계 결찰(two-step ligation)를 위해 명주실(silk thread)이 통과하였다. 심장의 표면에는 30-포인트 심장외막유도(30-point epicardial leads)가 배치되고, 4개의 사지(limbs)는 바늘 전극(needle electrode)을 통해 연결되었으며, 교대로 Powerlab/8s (AD Instruments)에 멀티채널 스위치를 통해 연결되었다. 해리스 두단계 결찰(Harris Two-step Ligation)이 수행되었다. 첫번째 결찰 2분 전, 부정맥(arrhythmia)을 예방하기 위해 5mg/kg의 리도카인(lidocaine)이 대퇴 정맥으로 주입되었다. 결찰을 수행하는 동안 관상 동맥과 함께 묶일 수 있기 위해 직경 1mm의 강철 와이어가 첫번째 매듭을 통해 삽입되었다. 이후, 상기 강철 와이어가 밖으로 제거된 뒤 30분 후, 두번째 매듭이 결찰을 완성하기 위해 만들어졌다.
상기 결찰이 완성되고 10분 동안 약물 투여 전 조절값(control value)으로서 심장외막 전기도가 기록되었다. 이후, 음성 조절군(negative control group)에 동일한 부피의 용매가 주입되는 동안 실험 약물은 대퇴 정맥내로 주입되었다. 모든 군들에서 정량 펌프(constant flow pump, 콴주 리즈홍 전자 의료 기기 공장(Quanzhou Lizhong Electronic Medical Instrument Factory)에 의해 제조된 SH-88AB 조절가능 정맥내 주입기(Controllable Intravenous Injector))로 정량 방울주입(constant dripping)이 30분 내로 완성되었다. 정량 방울주입의 완성 후, 투여된 지 5, 15, 30, 60, 90 및 120분 후에 심장외막 전기도(epicardial electrogram)의 변화가 각각 기록되었다. ST 부의 상승 또는 하강의 수치는 2mV 이상이며, ST 부 상승의 총합(ΣST)이 심장외막 전기도의 변화 관찰을 위한 지표로서 적용되었고 총 심장의 무게에 대한 경색부 무게의 비율(퍼센트) 또는 좌심실 무게에 대한 경색부 무게의 비율을 계산하기 위한 지표로 적용되었다. 우심실로부터 3ml의 혈액이 결찰 전과 투여한 지 2시간 후에 견본으로 추출되었다. 상기 혈액을 3000rpm으로 15분 동안 원심분리한 후, 락트산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 및 혈청 크레아틴키나아제(creatine kinase, CK)을 검출하기 위해 혈청을 분리하였다. LDH 및 CK 측정 키트(assay kit)(제품번호: 20020523, 난징 지안청 바이오엔지니어링 인스티투트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute))(ENR: U90625, Randox Company, UK)의 설명서에 따른 방법이 검출을 위해 채용되었다. 측정은 UV751GD 타입의 자외선/가시광선 범위의 분광광도계(spectrophotometer)(샹하이 분석 기기 공장(Shanghai Analytical Appratus Factory)로 이루어졌다.
실험 결과
(1) 심근 허혈 정도(심장외막 전기도에서 ΣST)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 효과: 관상 동맥 결찰이 이루어진 지 5분 후, 용매 대조군의 심장외막 전기도에서 ST 부의 총합(ΣST)이 명백히 상승하였다. 결찰 30분 후에, ΣST는 용매 대조군에서 18.2% 상승하였으며, 그 후에는 서서히 감소하였다. 2.5~10mg/kg의 투여량으로 TSG를 정맥내 투여하면 투여량에 따라 심근허혈의 정도를 완화시킬 수 있으며 ΣST를 명백하게 감소시킬 수 있다. 또한 30~90분 시점에서 저투여량군과 용매 조절군 사이에 현저한 차이점이 있었다. 중간 투여량군도 용매 대조군과 비교할 때 모든 시점에서 큰 차이를 나타냈다. 고투여량군에서는 투여 직후 명백한 효과가 발생하였으며 이는 120분 동안 지속되었다. 이소소르비드 디니트레이트군은 투여 후 5분 내지 90분 사이에 ΣST가 감소하였으나, 용매 대조군과 90분에서 120분 사이의 시점에서 비교할 때 큰 차이를 나타내지는 않았다. 실험 결과는 TSG를 2.5, 5 및 10mg/kg의 투여량으로 정맥내 주사하는 것은 관상 동맥 결절로 유도된 개의 급성 심근 허혈 정도에 명백한 치료 효과가 있다는 것을 보여준다.(표 3, 도 1 참조)
(2) 심근 허헐부의 크기(심장외막 전기도에서 N-ST)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 효과: TSG는 투여량에 따라 심근 허혈부의 크기 및 N-ST 값을 감소시킬 수 있으며, 이러한 효과는 120분 동안 지속될 수 있다. 2.5mg/kg인 저투여량군의 N-ST 감소율을 모든 시점에서 용매 대조군의 N-ST 감소율과 동일 시점에서 비교하면, 30~90분에 현저한 차이가 나타났다(P<0.05). 또한 5mg/kg인 중간 투여량군의 N-ST 감소율을 모든 시점에서 용매 대조군의 N-ST 감소율과 동일 시점에서 비교하면, 15~120분에 현저한 차이가 나타났다. 고투여량군(10mg/kg)에서는, 5~120분 시점에서 용매 대조군과 비교할 때 심근 허혈의 감소에 매우 현저한 차이가 나타났다. 이소소르비드 디니트레이트군의 심근 허혈부의 크기(area of myocardial ischemia)는 투여 5분 후에 용매 대조군과 동일 시점에서 비교할 때 현저하게 감소하였다.(표 4, 도 2 참조)
(3) 심근 경색부 크기의 정량적 조직 검출(quantitative histological detection)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 효과: 심근 경색부 크기에 대한 정량적 조직 검출은 N-BT 염색을 이용하여 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 심근 경색 크기에 대한 효과를 보이는 것이며, 결과는 심장외막 전기도(epicardial electrogram)에서 측정된 것과 동일하다. TSG를 2.5~10mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여하면 투여량에 따라 심근 경색부의 크기를 감소할 수 있다. 경색 영역/좌심실(infarct zone/left ventricle, IZ/LV)의 비율은 저투여량, 중간 투여량 및 고투여량군(2.5, 5, 10mg/kg)에서 용매 대조군의 것과 비교할 때 현저히 감소되었다(P<0.01). 용매 대조군과 비교할 때, 경색 영역/전체 심장(infarct zone/whole heart, IZ/WH)의 비율은 저투여량군에서 현저히 감소하였으며(P<0.05) 중간 투여량 및 고투여량군들에서는 매우 현저히 감소하였다(P<0.01). 고투여량군에서 효과가 가장 강하게 나타났다. 이소소르비드 디니트레이트군도 또한 심근 경색부의 크기가 현저하게 감소하였다(P<0.01).(표 5 참조)
(4) 관상 동맥 결착 후 혈청 생화학 지표(serum biochemical indicator)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 효과: 관상 동맥 결착 후, 혈청 락트산탈수소효소(LDH) 및 크레아틴키나아제(CK)가 모든 군들에서 모두 상승하였다. TSG는 저투여량, 중간 투여량 및 고투여량군에서 혈청 LDH의 증가 정도를 용매 대조군에 비해 감소시킬 수 있으며(P<0.01), TSG는 혈청 CK 증가 정도를 저투여량군에서 현저히 감소시킬 수 있는 반면(P<0.05), 중간 투여량군 및 고투여량군에서 용매 대조군에 비해 현저히 감소시킬 수 있다(P<0.01). 모든 군들 중, 고투여량군(10mg/kg)이 가장 강한 약역학적 작용(pharmacodynamic action)을 보였다.(표 6 참조)
결론
실험 결과는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 정맥내 주사는 관상 동맥 결찰에 의해 유도된 개의 심근허혈 정도를 명백히 감소시킬 수 있으며 심근 경색부 크기를 최소화할 수 있다는 것을 증명하였다. 이러한 작용의 강도는 투여량에 따라 달라진다(dose-dependent). 조직 정량 검출(quantitative detection of histology)의 결과는 심장외막 전기도에서 검출된 결과와 동일하다. 용매 대조군과 비교할 때, 경색 영역(infarct zone)은 현저히 줄어들며, 이는 TSG 정맥내 주사가 관상 동맥 결찰로 유도된 개의 심근 허혈에 명백한 치료 효과가 있다는 것을 보여준다. 실험 결과는 또한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드가 혈청 락트산탈수소효소(LDH) 및 크레아틴키나아제(CK)의 증가 정도를 현저히 감소시킬 수 있다는 것을 증명하며, 이는 상기 화합물이 카디오사이트(cadiocyte)로부터 LDH 및 CK의 유출을 감소시킬 수 있고 심근허혈에 의한 세포 손상을 최소화할 수 있다는 것을 나타내며, 심근 세포들(myocardial cells)에 대한 보호 효과가 있다는 것을 나타낸다.
하기 표 3은 관상 동맥 결찰된 개의 심장외막 전기도에서 ST 부 상승의 총합(ΣST)에 대한 TSG의 효과(mV, 
, n=6)를 나타낸다.
| 군들 (Groups) | 지수들 (Indexes) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
153.3±43.7 | 175.7±51.7 | 177.8±40.7 | 178.8±44.0 | 173.0±42.1 | 165.5±41.7 | 148.5±43.2 |
| 변화율 % | 14.7±7.4 | 17.7±10.1 | 18.2±10.6 | 14.5±11.7 | 8.8±3.9 | -3.1±7.8 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
160.5±41.2 | 149.3±36.7 | 128.7±46.6 | 111.2±44.5 | 111.0±38.2 | 115.8±29.7 | 138.5±45.5 |
| 변화율 % | -6.7±4.3** | -20.9±13.8** | -32.6±11.0** | -31.4±7.6** | -27.4±6.7** | -13.7±18.0 | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
154.5±60.4 | 154.7±55.0 | 149.5±52.8 | 129.2±57.7 | 122.7±59.6 | 128.3±55.1 | 130.2±54.1 |
| 변화율 % | 1.5±9.5 | -1.1±20.3 | -17.4±8.5** | -22.2±12.3** | -17.3±12.4* | -15.5±16.8 | ||
| TSG 5.0mg/kg |
 |
153.8±50.7 | 148.0±39.9 | 133.7±52.7 | 116.2±53.7 | 105.3±53.6 | 103.8±54.1 | 100.5±48.3 |
| 변화율 % | -1.7±10.3** | -11.7±23.2* | -25.4±17.8** | -32.6±19.5** | -33.2±21.9** | -32.1±24.8* | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
155.0±46.4 | 151.7±35.6 | 132.0±43.1 | 115.2±50.9 | 104.7±45.5 | 102.0±51.8 | 103.3±46.4 |
| 변화율 % | -0.7±7.7* | -15.4±5.6* | -28.0±12.8** | -34.1±13.0** | -37.1±15.7** | -35.3±14.3* | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 4는 관상 동맥 결찰로 유도된 개의 심근 경색부의 크기(N-ST)에 대한 TSG의 효과(
, n=6)를 나타낸다.
| 군들 (Groups) | 지수들 (Indexes) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
26.5±4.5 | 28.2±3.9 | 28.3±2.7 | 29.2±2.9 | 29.5±1.2 | 28.3±1.6 | 27.0±2.2 |
| 변화율 % | 6.5±5.4 | 7.2±6.0 | 10.5±9.4 | 11.9±9.1 | 9.4±10.6 | 2.3±9.8 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
28.2±3.2 | 26.2±2.7 | 23.2±6.7 | 20.0±5.9** | 21.5±1.5** | 22.2±2.4** | 22.8±2.4 |
| 변화율 % | -7.0±8.3* | -17.9±10.7** | -28.9±14.3** | -23.6±3.9** | -21.3±7.1** | -18.8±8.5* | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
26.7±4.1 | 27.5±4.5 | 26.0±5.6 | 23.2±5.3* | 21.8±3.8** | 23.8±2.3 | 23.8±3.9 |
| 변화율 % | 3.4±11.7 | -2.5±10.0 | -12.6±11.1* | -18.4±10.3** | -10.7±3.0* | -10.8±11.1 | ||
| TSG 5.0mg/kg |
 |
26.7±3.9 | 25.8±3.7 | 24.3±5.1 | 21.0±8.2** | 19.0±4.2** | 19.7±5.2** | 17.8±4.0** |
| 변화율 (varia-tion) % | -3.0±7.4 | -8.3±14.3* | -20.6±17.9** | -28.3±16.7** | -25.4±21.2** | -32.9±15.5** | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
27.8±3.1 | 24.8±6.4 | 22.2±8.4 | 18.7±6.8** | 18.7±2.5** | 19.2±1.9** | 20.2±1.8** |
| 변화율 % | -10.9±12.7** | -20.5±12.7** | -32.9±18.6** | -32.8±9.1** | -31.0±8.0** | -27.6±4.9** | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 5는 N-BT 염색에 의해 검출된 심근 경색부의 크기에 대한 TSG의 효과(
, n=6)를 나타낸다.
| 군들(Groups) | IZ/WH(%) | IZ/LV(%) | |
| 용매 대조군 2ml/kg | 14.84±2.18 | 26.15±1.55 | |
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h | 9.57±2.48* | 15.47±3.80** | |
| TSG 2.5mg/kg | 11.70±0.93* | 21.68±1.88** | |
| TSG 5.0mg/kg | 9.03±1.16** | 15.25±1.41** | |
| TSG 10mg/kg | 8.65±1.11** | 13.92±1.32** | |
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 6은 관상 동맥 결찰 후 혈청 생화학 지표(serum biochemical indicators)에 대한 TSG의 효과(
, n=6)를 나타낸다.
| 군들 (Groups) | LDH(IU/L) | CK(IU/L) | ||||
| 투여 전(B) | 투여 후(A) | A/B | 투여 전(B) | 투여 후(A) | A/B | |
| 용매 대조군 2ml/kg | 326.8±55.1 | 919.6±211.2 | 2.81±0.35 | 171.3±25.8 | 526.2±102.9 | 3.07±0.37 |
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h | 330.0±78.4 | 663.1±133.3 | 2.03±0.22** | 172.7±13.2 | 360.2±51.9 | 2.09±0.25** |
| TSG 2.5mg/kg | 359.7±70.5 | 823.3±186.3 | 2.28±0.21** | 176.7±18.8 | 446.6±39.4 | 2.54±0.27* |
| TSG 5.0mg/kg | 281.2±80.9 | 587.1±170.6 | 2.09±0.16** | 180.8±13.2 | 356.2±64.8 | 1.98±0.38** |
| TSG 10mg/kg | 279.3±70.8 | 551.6±131.3 | 1.99±0.14** | 172.7±11.1 | 299.5±63.9 | 1.74±0.37** |
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
실시예
4
마취된 개의 심근 경색에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 경구 투여의 보호 작용
본 실시예의 목적은 개의 급성 심근 경색에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 위내 투여가 가지는 보호 작용을 관찰하는 것이다.
실험 약물
실험 약물(test drug): 투여 전에 0.8% CMC로 농도 1, 2 및 4mg/ml의 서스펜션으로 준비된(prepared with 0.8% CMC into suspension with concentration of 1, 2, 4mg/ml before administration) 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(제품번호: 031019)
대조 약물(control drug): 샹하이 레이 윤 샹 파마쑤티컬 캄퍼니 리미티드(Shanghai Lei Yun Shang Pharmaceutical Co.,Ltd)의 제품인 단쉔 알약(Danshen Tablet) (제품번호: 030926), 300mg/tab
실험 동물
제1 군의 대학(First Military Medical University)의 실험 동물 센터에서 제공된 각 무게가 12~14kg인 30 마리의 건강한 수컷 및 암컷 잡종 개.
군들 및 투여량
용매 대조군, 양성 조절군(단쉔 알약 45mg/kg) 및 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 투여량이 5, 10 및 20mg/kg인 군들. 다른 농도의 약물들은 동일한 부피로 위내 투여되었다. 위내 투여의 부피는 5ml/kg이었으며, 상기 언급한 모든 군들에 대하여 기록상 지수들이 안정화되고 30분 후에 약물을 위내 투여하였다.
실험 방법
무게를 측정한 후, 동물들은 3% 펜토바르비탈 소듐 iv를 30mg/kg 투여하여 마취되었다. 기관삽관(tracheal intubation)이 수행되었고 마취 호흡기(SC-M5, 샹하이 의료 기구 공장에서 제조됨)가 개흉술(thoracotomy) 후에 기계적 환기(mechanical ventilation)를 위해 연결되었다(350~550ml의 일회 호흡량으로 분당 18~20번). V3 및 ECG를 모니터링하기 위해 바늘 전극들이 네개의 사지를 통하여 뚫고 지나며, 표준 사지 전극(standard limb lead)을 가슴 피부 밑으로 하였다. 개흉술은 흉골좌연(left sternal border)의 세번째 갈비사이공간(third intercostal space)에서 수행되었으며, 심장의 전체 노출을 위해 네번째 갈비뼈가 제거되었다. 심장막(pericardium)이 절개되어 심장막 해먹(pericardium hammock)을 만들었다. 관상 동맥은 두번째와 세번째 좌전하행 관상 동맥 가지(second and third branches of left anterior descending coronary artery) 사이가 분리되었으며, 상기 관상 동맥의 아래에는 두 단계 결찰(two-step ligation)를 위해 명주실(silk thread)이 통과하였다. 심장의 표면에는 30-포인트 심장외막유도(30-point epicardial leads)가 배치되고, 4개의 사지(limbs)는 바늘 전극(needle electrode)을 통해 연결되었으며, 심장외막 전기도를 기록하기 위해 교대로 Powerlab/8s (AD Instruments)에 멀티채널 스위치를 통해 연결되었다.
급성 십근허혈의 동물 모델들은 두 단계 결찰 방법(method of two-step ligaton)으로 준비되었다. 첫번째 결찰 2분 전, 부정맥(arrhythmia)을 예방하기 위해 5mg/kg의 리도카인(lidocaine)이 대퇴 정맥으로 주입(femoral intravenous injection)되었다. 생리 식염수(normal saline) 또는 실험 약물(test drug)의 투여 5, 15, 30, 60, 90, 120, 180분 후, 심장외막 전기도는 30개의 맵핑 포인트에서 기록되었으며, 2mV를 초과하는 ST 부 상승을 심근 허혈의 정도(Σ-ST total millivolts of ST segment elevation) 및 심근 허혈의 크기(N-ST total points of ST segment elevation exceeding 2mV)를 계산하고 판단하는 기준으로 택하였다. 180분 후, 4ml의 혈액을 대퇴 정맥으로부터 채취한 후 10000rpm으로 5분 동안 원심분리를 하여 혈청을 분리하였으며, 상기 혈청은 LDH의 검출(LDH kit, 제품번호: 20020523, 난징 지안청 바이오엔지니어링 인스티투트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)을 위해 -18℃에 저장되었다. 좌심장의 무게를 측정하기 위해 귓바퀴(auricle) 및 우심실(right ventricle)을 절개하기 전에 상기 심장을 적출하여 무게를 측정하였으며, 다음으로 심근을 0.5~1cm의 두께의 조각으로 얇게 잘랐다. 생리 식염수로 씻은 다음, 상기 심근 조각들은 37℃에서 스위스 플루카 케미칼스 앤드 에이전츠 컴파니 리미티드 엔비티(Swiss Fluka Chemical and Agents Co., Ltd. NBT)에 의해 제조된 니트로테트라졸리움 블루 클로라이드(Nitro-tetrazolium Blue chloride), N-BT로 염색되었다. 심근의 다른 부위가 검푸른색으로 염색되는 반면, 경색 심근은 색깔이 물들지 않는다. 다음으로, 상기 경색 심근(infarct myocardium)을 절개하여 무게를 측정하였다.
상기 실험의 결과는 
로 보여지며, 통계는 매치되지 않은 쌍의 t-test로 확인되었다(statistics were checked with t-test of non-matched pair). P<0.05일 때 통계적으로 현저한 차이가 있다고 판단되었다.
실험 결과
(1) 마취된 개의 심장박동수(표면 심전도)에 대한 TSG의 효과: 용매 대조군, 양성 조절군 및 3가지 투여량의 TSG군들은 투여 전후로 큰 변화를 보이지 않는다.(표 7 참조)
하기 표 7은 마취된 개의 심장 박동수에 대한 경구 TSG의 효과(
, 시간/분, n=6)를 나타낸다.
| 용매 대조군 | 단쉔 알약군 45mg/kg | TSG 5mg/kg | TSG 10mg/kg | TSG 20mg/kg | |
| 투여 전 | 164±15 | 170±12 | 173±16 | 169±12 | 185±10 |
| 투여 5분 후 | 161±12 | 176±13 | 174±18 | 169±11 | 186±13 |
| 투여 15분 후 | 167±17 | 175±11 | 168±17 | 167±10 | 182±11 |
| 투여 30분 후 | 164±18 | 173±14 | 170±16 | 165±12 | 184±12 |
| 투여 60분 후 | 168±16 | 167±13 | 167±12 | 163±16 | 178±16 |
| 투여 90분 후 | 165±11 | 168±16 | 165±12 | 165±12 | 177±15 |
| 투여 120분 후 | 166±18 | 172±13 | 167±13 | 162±11 | 180±21 |
| 투여 180분 후 | 169±18 | 164±16 | 163±12 | 159±14 | 168±19 |
(2) 심근 허혈 개들의 표면 심전도(Surface ECG of myocardial ischemia dogs)에서 ST 부 상승(△ST) 정도에 대한 TSG의 효과: 위내 투여한 단쉔 알약 및 TSG의 모든 투여량에서 심근 허혈에 의해 유도된 ST 부 상승을 감소시킬 수 있다. 20mg/kg의 TSG군은 현저한 결과를 달성하였다.(표 8 참조)
하기 표 8은 개의 △ST에 대한 경구 TSG의 효과(
, mV, n=6)를 나타낸다.
| 용매 대조군 | 단쉔 알약군 45mg/kg | TSG 5mg/kg | TSG 10mg/kg | TSG 20mg/kg | |
| 투여 전 | 1.10±0.60 | 0.41±0.34* | 0.66±0.45 | 0.55±0.40 | 0.58±0.30 |
| 투여 5분 후 | 1.04±0.63 | 0.77±0.42 | 0.70±0.50 | 0.68±0.51 | 0.45±0.17* |
| 투여 15분 후 | 1.21±0.80 | 0.60±0.30 | 0.71±0.48 | 0.69±0.52 | 0.39±0.16* |
| 투여 30분 후 | 1.09±0.48 | 0.71±0.43 | 0.73±0.51 | 0.69±0.45 | 0.35±0.19* |
| 투여 60분 후 | 1.30±0.75 | 0.69±0.44 | 0.88±0.54 | 0.70±0.44 | 0.26±0.15** |
| 투여 90분 후 | 1.32±0.68 | 0.64±0.38 | 0.82±0.49 | 0.75±0.46 | 0.28±0.13** |
| 투여 120분 후 | 1.40±0.71 | 0.55±0.33* | 0.86±0.52 | 0.81±0.52 | 0.23±0.16** |
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
(3) 마취된 개의 급성 심근 허혈 정도(심장외막 전기도에서 Σ-ST)에 대한 TSG의 효과: 용매 대조군과 비교할 때, 모든 투여량군에서 Σ-ST는 다른 정도로 감소하였다. 위내 투여 후 대부분의 시간 동안, ST 부(ST segment)는 현저하게 떨어졌다.(표 9 참조)
하기 표 9는 개의 심근허혈 정도(Σ-ST)에 대한 경구 TSG의 효과(
, mV, n=6)(Effect of oral TSG on extent of myocardial ischemia in dogs)를 나타낸다.
| 용매 대조군 | 단쉔 알약군 45mg/kg | TSG 5mg/kg | TSG 10mg/kg | TSG 20mg/kg | |
| 투여 전 | 55.6±9.11 | 59.2±7.03 | 55.7±6.14 | 54.3±1.89 | 62.1±6.34 |
| 투여 5분 후 | 92.1±12.8 | 82.0±13.7 | 77.3±15.0 | 77.9±10.6 | 78.7±5.68* |
| 투여 15분 후 | 95.0±8.23 | 77.9±14.7* | 77.9±13.9* | 69.6±7.90*** | 77.8±8.49** |
| 투여 30분 후 | 93.0±6.81 | 72.2±12.7** | 71.6±8.71*** | 69.8±7.32*** | 70.6±4.79*** |
| 투여 60분 후 | 87.3±5.59 | 70.9±10.9** | 72.2±8.68** | 75.9±16.3 | 68.7±6.25*** |
| 투여 90분 후 | 90.6±11.4 | 69.1±12.4* | 70.5±8.46** | 68.8±7.83** | 65.7±7.12** |
| 투여 120분 후 | 89.1±5.58 | 66.0±7.68*** | 73.6±8.00** | 66.3±5.60*** | 65.0±6.12*** |
| 투여 180분 후 | 82.4±8.82 | 61.7±5.17*** | 67.4±8.19* | 64.2±5.45** | 62.5±3.03*** |
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001
(4) 마취된 개의 급성 심근 허혈 크기(심장외막 전기도에서 N-ST)에 대한 TSG의 효과: 32개의 전극들 중에서 2mV를 초과하는 ST 부의 퍼센트로 보여졌으며, N-ST의 변화는 용매 대조군에서 투여 후에 현저하게 나타나지 않았고, 단쉔 알약군 및 TSG의 모든 투여량군에서는 투여 후 서서히 감소하였다. 같은 시간 동안 용매 대조군과 비교할 때, 투여 90분 후에 감소가 가장 크게 나타났다.(표 10 참조)
하기 표 10은 개의 N-ST에 대한 경구 TSG의 효과(
, %, n=6)를 나타낸다.
| 용매 대조군 | 단쉔 알약군 45mg/kg | TSG 5mg/kg | TSG 10mg/kg | TSG 20mg/kg | |
| 투여 전 | 34.6±13.7 | 35.2±19.3 | 26.5±17.6 | 22.8±9.44 | 42.3±20.6 |
| 투여 5분 후 | 85.6±19.3 | 86.4±13.69 | 70.3±21.4 | 79.5±19.5 | 89.2±20.3 |
| 투여 15분 후 | 79.6±14.3 | 81.1±16.3 | 66.9±19.8 | 72.3±15.9 | 78.9±13.7 |
| 투여 30분 후 | 81.0±15.5 | 76.1±16.2 | 70.3±16.3 | 69.4±13.2 | 74.9±12.9 |
| 투여 60분 후 | 85.2±8.03 | 66.3±19.8 | 69.5±15.8 | 68.0±18.8 | 67.2±16.5 |
| 투여 90분 후 | 86.3±9.89 | 68.9±16.6* | 63.0±18.7* | 68.6±15.6* | 59.2±18.9* |
| 투여 120분 후 | 83.4±8.69 | 57.9±16.8* | 63.2±12.8* | 61.9±14.9* | 56.4±13.6** |
| 투여 180분 후 | 80.1±17.2 | 49.6±18.6** | 58.3±19.3 | 55.5±16.7* | 46.8±14.9** |
N-ST: 32개의 전극 중 2mV를 초과하는 ST 부(ST segment)의 퍼센트;
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
(5) 마취된 개의 급성 심근 경색 후 혈청 효소학(serum enzymology)에 대한 TSG의 효과: 용매 대조군과 비교할 때, 10 및 20mg/kg 투여량의 TSG는 위내 투여 후 LDH 수치를 현저히 감소시킬 수 있다.(표 11 참조)
하기 표 11은 마취된 개의 급성 심근경색 후 LDH에 대한 경구 TSG의 효과(
, IU/L, n=6)(Effect of oral TSG on LDH after acute myocardial infarction in anesthetized dogs)를 나타낸다.
| 용매 대조군 | 단쉔 알약군 45mg/kg | TSG 5mg/kg | TSG 10mg/kg | TSG 20mg/kg | |
| LDH | 206±47.3 | 173±81.4 | 159±80.4 | 140±47.6** | 120±40.0** |
용매 대조군과 비교한 경우 **P<0.01
(6) 마취된 개의 급성 심근 경색 크기에 대한 TSG의 효과: 정량적 조직 검출(N-BT 염색법)에 의하면 용매 대조군과 비교할 때, 심근 경색부의 크기는 단쉔 알약군 및 모든 TSG군들의 경우에서 현저히 작아졌음을 보여준다.(표 12 참조)
하기 표 12는 마취된 개의 급성 심근경색부의 크기에 대한 경구 TSG의 효과(
, g, n=6)를 나타낸다.
| 용매 대조군 | 단쉔 알약군 45mg/kg | TSG 5mg/kg | TSG 10mg/kg | TSG 20mg/kg | |
| 심장의 무게(g) | 68.3±11.6 | 78.7±15.6 | 79.7±6.68 | 68.8±6.05 | 80.6±13.1 |
| 좌심장(LH)의 무게(g) | 46.2±9.26 | 53.8±10.8 | 55.1±4.15 | 48.2±4.84 | 56.2±9.58 |
| 경색심근(IM)의 무게(g) | 4.58±0.83 | 3.67±0.98* | 5.98±1.71 | 3.17±0.66* | 2.31±0.70** |
| IM의 무게/LH의 무게 | 9.96±1.68 | 6.94±1.67* | 10.8±2.81 | 6.61±1.31** | 4.03±0.61*** |
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001
결론
(1) 5, 10 및 20mg/kg의 투여량으로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 위내 투여하면, 관상 동맥 결찰에 의해 유도된 개의 심근 허혈에 대한 표면 심전도 및 심장외막 전기도에서 ST 부 상승의 증가를 감소시킬 수 있으며, 이는 상기 화합물의 경구 투여는 심근 허혈을 완화시키는 효과가 있다는 것을 나타낸다.
(2) N-BT 염색법에 의할 때, 10 및 20mg/kg의 투여량으로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 경구 투여하는 것은 마취된 개의 급성 심근 허혈의 정도를 현저히 감소시키고 심근 경색 크기를 최소화할 수 있다는 것을 보여준다. LDH 활성의 검출은 개의 급성 심근 경색 후에 5, 10 및 20mg/kg의 투여량으로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 경구 투여하는 것이 투여량에 따라 LDH 수치 증가를 억제할 수 있다는 것을 증명하며, 이는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 경구 투여는 마취된 개의 급성 심근 경색에 의해 유도된 심근 손상에 대해 보호 효과를 가진다는 것을 보여준다.
실시예
5
마취된 개의 심근 산소 섭취량에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 iv의 효과
본 실시예의 목적은 마취된 개의 심근 산소 섭취량에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 위내 투여를 관찰하는 것이다.
실험 약물
실험 약물: 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(제품번호: 03030302), 100mg/10ml; 사용 전 생리 식염수로 희석됨.
대조 약물: 독일 슈바르츠 파마 에이쥐(Germany Schwarz Pharma AG)로부터 제조되고 추하이 슈바르츠 파마 캄퍼니 리미티드(Zhuhai Schwarz Pharma Co., Ltd.)로부터 재포장된 소르비드 니트레이트(sorbide nitrate) 주입(이소소르비드 디니트레이트, 제품번호: 479210)
실험 동물
제1 군의 대학의 실험 동물 센터로부터 제공된 각 무게가 10~14kg인 건강한 수컷 및 암컷 잡종 개들.
군들 및 투여량
용매 대조군, 이소소르비드 디니트레이트 대조군(0.4mg/kg/h) 및 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 저투여량군(2.5mg/kg), 중간 투여량군(5mg/kg) 또는 고투여량군(10mg/kg)이 실험을 위해 준비되었다. 이소소르비드 디니트레이트 대조군은 지속정맥주입(continuous intravenous infusion)에 의해 투약되었고 다른 군들은 정맥내 주사(intravenous injection)으로 투약되었다.
실험 방법
상기 동물들은 3% 펜토바르비탈 소듐 iv을 30mg/kg의 투여량으로 투여하여 마취되었다. 기관삽관(tracheal intubation)이 수행되었고 SC-M5 마취 호흡기(샹하이 의료 기구 공장(Shanghai Medical Instrument Factory)에서 제조됨, 350~550ml의 일회 호흡량으로 분당 16~18번)가 연결되었다. 양쪽 대퇴 동맥들(bilateral femoral arteries)은 혈액 샘플링 및 분석 및 평균 혈압의 측정을 위해 분리되었다. 심장을 노출하고 심장막을 열어 심장막 해먹(pericardium hammock)을 만들기 위해 네번째 갈비사이공간에서 개흉술이 수행되었다. 심박출량 및 관상 동맥 혈류량을 측정하기 위해 오름대동맥근(ascending aortic root) 및 전하 관상동맥의 왼쪽 갈래(left branch of anterior descending coronary artery)는 각각 전자유량계(일본 니혼 코덴공사(Japanese Nihon Kohden Company)에 의해 제조된 MFV-1100/1200) 탐침을 놓기 위해 분리되었다. 오른목정맥(right jugular vein)은 고정 전에 관상정맥동굴들(coronary venous sinuses)로 인도된 심장도관의 삽입(insertion of a cardiac catheter)을 위해 분리되었다. 이와 동시에, 관상정맥동굴(coronary sinus) 및 대퇴동맥(femoral artery)으로부터 혈액을 추출하였다(항응고(anticoagulation)를 위해 0.5% 헤파린(heparin)이 첨가되었음). pO2 및 pH가 혈액 가스 분석기(DH-1830 Blood Gas Acid-base Analyze, 난징분석기기공장(Nanjing Analysis Apparatus Factory))로 검출되었으며, 상기 값들은 동맥 및 정맥 산소 함량으로 변환되었다. 대조 용매 또는 약물의 정맥 주입 후, 모든 군들에 정량 펌프(constant flow pump, 콴주 리즈홍 전자 의료 기기 공장(Quanzhou Lizhong Electronic Medical Instrument Factory)에 의해 제조된 SH-88AB 조절가능 정맥내 주입기)로 정량 주입(constant infusion)이 완성되었다. 동맥혈액가스와 정맥혈액가스는 모두 투여 전 또는 투여 후 5, 15, 30, 60, 90 및 120분 후에 분석되었으며, 0, 5, 15, 30, 60, 90 및 120분의 평균 혈압 및 심박출량이 관찰되었다. 실험의 마지막 단계에서, 심장의 무게가 측정되었으며, 10-15ml의 10% 샹하이 슈페리어 카본 잉크(Shanghai Superior Carbon Ink)의 역주입(adverse infusion)에 의해 전자 유량계(electromagnetic flowmeter)로 측정된 검게된 부분(blackened part)은 절단된 후 무게가 측정되었으며, 상기 측정된 무게로 심근 산소 소비량 및 심근 산소 소비량 지표가 투여 전 및 투여 후 5, 15, 30, 60, 90, 및 120분일 때 다음의 수식에 의해 계산되었다.
심근 산소 소비량 (ml/min/100g) = 관상 혈류 ml/min/100g × 동맥 산소 - 관상정맥동굴 산소(coronary sinus oxygen) ml%
심근 산소 섭취율(%) = (동맥 산소 ml% - 관상정맥동굴 산소(coronary sinus oxygen) ml%) / 동맥 산소 ml%
일반 순환의 총 말초 저항(total peripheral resistance of general circulation) (dyn·s·cm-5) = 평균 동맥 혈압 [MAP(KPa)] × 80/심박출량 [CO(L/min)]
= 평균 동맥 혈압 [MAP(mmHg)] × 10.6/심박출량 [CO(L/min)]
관상 동맥 저항 [Kpa/ml/min] = 평균 동맥 혈압 [MAP(KPa)]/관상동맥 혈류.
실험 결과
(1) 마취된 개의 심근 산소 소비량에 대한 효과: 2.5, 5, 10mg/kg의 투여량으로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)를 정맥내 주사로 투여한 후, 심근 산소 소비량은 용매 대조군과 비교할 때 큰 차이를 나타내지 않았다(P>0.05). 보다 상세한 사항은 표 13을 참조.
(2) 마취된 개의 심근 산소 섭취율에 대한 효과: 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)를 정맥내 주사로 투여한 후, 심근 산소 섭취율은 현저히 감소하였으며, 용매 대조군과 동일한 시점에서 비교할 때 감소율의 차이는 저투여량군에서 15, 60 및 90분에 현저하게 나타났다. 중간 및 고투여량군에서는, 심근 산소 섭취율 감소의 차이가 용매 대조군과 비교할 때 15분 내지 120분의 시간에 크게 나타났다. 보다 상세한 사항은 표 14 및 도 3 참조.
(3) 마취된 개의 관상 혈류 비율에 대한 효과: 관상 혈류 비율(coronary flow rate)은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 모든 투여량군에서 증가하였다. 용매 대조군과 동일 시점에서 비교하면, 저투여량군에서 상기 증가 비율은 15분부터 현저하게 차이가 났으며(P<0.05) 30~90분 사이에 매우 현저하게 차이를 나타냈다(P<0.01). 중간 및 고투여량군에서는 15~120분의 시간 동안 차이가 매우 현저하게 나타났다. 보다 상세한 사항은 표 15 및 도 4를 참조.
(4) 관상 동맥 저항에 대한 효과: 용매 대조군과 동일한 시점에서 비교할 때, 모든 투여량군에서 TSG 정맥내 주사는 5~90분 사이에서 관상 동맥 저항에 큰 차이를 만들지 않았으나, 중간 및 고투여량군에서 관상 동맥 저항의 감소율은 120분에 용매 대조군과 매우 큰 차이를 나타냈다(P<0.01). 보다 상세한 사항은 표 16 참조.
(5) 마취된 개의 심박출량 및 말초혈관 저항(peripheral resistance)에 대한 효과: TSG는 개의 심박출량을 증가시킬 수 있다. 용매 대조군과 동일한 시점에서 비교할 때, 중간 투여량군에서 60분 및 90분일 때와 고투여량군에서는 15분 및 30분일 때 어떠한 큰 차이도 목격되지 않았다(P<0.05). 그러나, 고투여량군에서 60분 및 90분일 때 매우 큰 차이점이 관찰될 수 있다(P<0.01). 양성 조절군(positive control group)은 심박출량에 전혀 영향을 받지 않았다. TSG는 말초혈관 저항에 영향이 없었다. 보다 상세한 사항은 표 17, 18 및 도 5 참조.
(6) 결론
3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 마취된 개의 관상 동맥 혈류 및 심박출량을 명백히 증가시킬 수 있으며, 심근 산소 섭취율 및 관상 동맥 저항을 감소시킬 수 있다. 상기 화합물은 심근 산소 소비량 및 말초혈관 저항에는 명백한 효과가 없다.
하기 표 13은 개의 심근 산소 소비량에 대한 TSG iv의 효과(mL/min.100g-1, 
, n=6)(Effect of TSG iv on canine myocardial oxygen consumption)를 나타낸다.
| 군 (Group) | 지수 (Index) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
214.6±7.34 | 216.2±7.51 | 217.0±6.78 | 214.4±7.48 | 217.3±4.87 | 219.4±7.65 | 217.0±6.38 |
| 변화율 % | 0.73±2.15 | 1.15±3.68 | -0.10±2.28 | 1.31±3.25 | 2.29±4.98 | 1.1±1.67 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
212.8±16.2 | 209.6±10.5 | 212.9±12.9 | 202.0±11.8* | 196.0±5.52** | 199.3±6.67** | 200.5±16.0 |
| 변화율 % | -1.46±9.67 | 0.10±7.99 | -5.0±19.1* | -7.83±1.67** | -6.3±2.38** | -5.6±6.4 | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
214.6±5.24 | 215.5±8.73 | 217.0±6.75 | 218.2±6.85 | 218.0±8.95 | 214.1±8.39 | 214.0±6.87 |
| 변화율 % | 0.40±3.16 | 1.11±1.44 | 1.66±1.48 | 1.57±2.94 | -0.25±2.84 | -0.3±1.9 | ||
| TSG 5mg/kg |
 |
211.4±4.05 | 210.4±6.48 | 211.5±9.81 | 212.0±8.65 | 212.9±7.2 | 209.6±9.01 | 211.7±8.07 |
| 변화율 % | -0.52±1.59 | 0.05±4.29 | -0.59±2.68 | 0.68±1.74 | -0.91±2.81 | 0.14±4.0 | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
214.1±6.66 | 211.0±5.44 | 215.0±3.39 | 208.0±5.3 | 210.3±6.32 | 209.1±6.38 | 208.7±7.78 |
| 변화율 % | -1.45±1.13 | 0.04±2.01 | -2.77±3.75 | -1.75±3.51 | -2.28±3.5 | -2.5±4.33 | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 14는 심근 산소 섭취율에 대한 TSG iv의 효과(%, 
, n=6)(Effect of TSG iv on myocardial oxygen uptake)를 나타낸다.
| 군 (Group) | 지수 (Index) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
79.1±3.53 | 79.8±3.46 | 81.3±4.09 | 80.7±3.60 | 82.7±3.61 | 83.9±4.25 | 84.7±4.06 |
| 변화율 % | 0.9±2.29 | 2.75±1.96 | 1.96±1.58 | 4.57±3.04 | 6.04±3.35 | 7.01±2.70 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
75.4±4.31 | 74.6±2.99 | 73.3±3.59* | 66.0±3.69 | 63.6±3.92** | 65.5±4.03** | 67.3±9.07** |
| 변화율 % | -1.02±2.44 | -2.71±1.08** | -12.4±1.93** | -15.7±1.68** | -13.2±2.22** | -11.0±8.2** | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
76.9±5.50 | 77.4±5.38 | 75.7±5.53 | 74.2±5.11 | 73.1±6.16 | 75.0±6.24 | 77.5±5.23 |
| 변화율 % | 0.72±1.72 | -1.55±1.97* | -3.47±1.59 | -4.99±3.01** | -2.58±2.67** | 0.78±3.24 | ||
| TSG 5mg/kg |
 |
79.5±6.93 | 79.6±5.92 | 77.5±4.22 | 74.8±5.66 | 74.5±6.05 | 75.1±6.48 | 76.6±7.07 |
| 변화율 % | 0.15±1.81 | -2.26±3.95** | -5.76±5.34** | -6.24±4.39** | -5.51±4.5** | -3.65±4.29** | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
80.0±6.55 | 78.7±5.83 | 76.8±5.70 | 71.3±5.28 | 71.7±5.71* | 72.4±5.51** | 73.4±5.24* |
| 변화율 % | -1.46±3.92 | -3.89±1.18** | -10.7±4.01** | -10.3±5.25** | -9.32±3.22** | -8.1±3.21** | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 15는 관상 동맥류에 대한 TSG의 효과(ml/min, 
, n=6)(Effect of TSG on coronary artery flow)를 나타낸다.
| 군 (Group) | 지수 (Index) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
42.2±5.81 | 42.2±5.81 | 41.5±5.56 | 41.2±5.73 | 41.3±4.96 | 40.8±5.84 | 40.0±4.93 |
| 변화율 % | 0.0±0.0 | -1.52±1.09 | -2.39±1.19 | -1.73±2.11 | -3.2±1.81 | -4.94±1.86 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
43.5±7.26 | 43.8±6.80 | 44.8±7.65 | 43.3±7.17 | 48.0±7.51 | 47.3±7.55 | 46.8±7.89 |
| 변화율 % | 0.96±1.91 | 3.02±1.51** | 9.08±2.45** | 10.6±2.96** | 8.96±2.96** | 7.72±4.14** | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
44.2±7.57 | 44.0±7.32 | 45.2±8.04 | 46.2±8.01 | 47.0±7.87 | 45.4±7.40 | 43.8±7.36 |
| 변화율 % | -0.31±0.76 | 2.16±1.27* | 4.51±1.17** | 6.52±1.80** | 3.15±1.46** | -0.70±1.09 | ||
| TSG 5mg/kg |
 |
40.8±5.85 | 40.7±5.50 | 41.8±5.42 | 43.3±5.82 | 45.0±6.07 | 44.3±6.09 | 43.3±5.92 |
| 변화율 % | -0.33±0.80 | 2.6±1.68** | 6.23±2.19** | 10.3±1.97** | 8.65±2.56** | 6.21±2.78** | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
44.0±5.83 | 44.0±6.03 | 45.7±5.28 | 47.8±6.46 | 48.7±6.19 | 47.8±6.71 | 47.5±6.83 |
| 변화율 % | -0.05±2.50 | 4.01±2.75** | 8.68±0.97** | 10.7±3.53** | 8.65±3.62** | 7.85±3.77** | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 16은 관상 동맥 저항에 대한 TSG의 효과(Kpa/ml/min, 
, n=6)(Effect of TSG on coronary artery resistance)를 나타낸다.
| 군 (Group) | 지수 (Index) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
0.271±0.024 | 0.275±0.032 | 0.275±0.037 | 0.282±0.030 | 0.276±0.023 | 0.281±0.026 | 0.288±0.020 |
| 변화율 % | 1.36±7.11 | 1.24±9.29 | 3.99±4.30 | 2.06±2.82 | 3.68±1.61 | 6.31±3.52 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
0.295±0.016 | 0.280±0.025 | 0.272±0.022 | 0.253±0.016 | 0.248±0.020 | 0.254±0.017 | 0.267±0.027 |
| 변화율 % | -5.00±3.71 | -7.91±3.24** | -14.28±1.96** | -15.97±2.66** | -13.75±0.99** | -9.71±4.80** | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
0.268±0.050 | 0.269±0.050 | 0.266±0.049 | 0.257±0.054 | 0.261±0.051 | 0.267±0.054 | 0.271±0.055 |
| 변화율 % | 0.81±6.09 | -0.34±2.36 | -3.82±9.83 | -2.48±8.17 | -0.24±10.72 | 1.19±6.55 | ||
| TSG 5mg/kg |
 |
0.299±0.029 | 0.308±0.028 | 0.305±0.029 | 0.299±0.026 | 0.288±0.026 | 0.287±0.028 | 0.287±0.031 |
| 변화율 % | 3.03±1.60 | 2.18±2.46 | 0.02±3.86 | -3.62±3.63 | -4.03±2.13 | -3.99±3.34** | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
0.273±0.032 | 0.286±0.036 | 0.278±0.028 | 0.274±0.035 | 0.267±0.037 | 0.270±0.040 | 0.263±0.038 |
| 변화율 % | 4.63±3.07 | 1.79±3.25 | 0.21±1.44 | -2.64±2.78 | -1.69±4.78 | -4.10±5.44** | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 17은 개의 심박출량에 대한 TSG의 효과(L/min, 
, n=6)(Effect of TSG on canine cardiac output)를 나타낸다.
| 군 (Group) | 지수 (Index) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
1.09±0.12 | 1.11±0.12 | 1.11±0.12 | 1.12±0.12 | 1.11±0.14 | 1.11±0.12 | 1.11±0.11 |
| 변화율 % | 1.88±0.96 | 2.38±2.08 | 2.65±1.45 | 1.59±1.82 | 2.49±0.82 | 2.33±3.46 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
1.11±0.12 | 1.14±0.12 | 0.14±0.11 | 0.15±0.11 | 1.16±0.12 | 0.14±0.11 | 1.14±0.12 |
| 변화율 % | 3.05±2.86 | 3.08±1.75 | 4.31±1.87 | 4.86±2.26 | 3.55±2.82 | 3.36±1.94 | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
1.06±0.13 | 1.09±0.12 | 1.09±0.14 | 1.10±0.13 | 1.11±0.13 | 1.11±0.13 | 1.10±0.14 |
| 변화율 % | 2.50±2.42 | 1.97±1.55 | 3.88±3.48 | 4.41±1.40 | 4.40±1.64 | 3.23±2.57 | ||
| TSG 5mg/kg |
 |
1.09±0.14 | 1.13±0.12 | 1.13±0.13 | 1.15±0.14 | 1.16±0.14 | 1.16±0.13 | 1.14±0.13 |
| 변화율 % | 3.58±2.00 | 3.47±0.97 | 5.25±2.62 | 6.05±2.06* | 5.98±2.02* | 4.86±2.88 | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
1.08±0.15 | 1.13±0.13 | 1.14±0.14 | 1.16±0.13 | 1.18±0.14 | 1.18±0.15 | 1.15±0.16 |
| 변화율 % | 4.60±3.19 | 5.74±2.02* | 7.43±3.40* | 9.41±4.82** | 9.05±2.24** | 6.53±2.43* | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
하기 표 18은 총 말초혈관저항에 대한 TSG의 효과(TPR, dyn·s·cm-5, 
, n=6)(Effect of TSG on total peripheral resistance)를 나타낸다.
| 군 (Group) | 지수 (Index) | 투여 전 | 투여 후 | |||||
| 0분 | 5분 | 15분 | 30분 | 60분 | 90분 | 120분 | ||
| 용매 대조군 2ml/kg |
 |
845.3±146.3 | 841.7±160.9 | 815.0±96.0 | 832.0±117.6 | 834.5±149.2 | 830.3±166.7 | 830.5±109.8 |
| 변화율 % | -0.50±7.08 | -2.56±9.55 | -1.07±5.41 | -1.26±3.04 | -2.06±3.27 | -1.16±4.82 | ||
| 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h |
 |
924.4±109.9 | 860.7±116.3 | 848.7±73.6 | 827.7±99.6 | 818.7±107.2 | 837.9±87.9 | 868.8±113.3 |
| 변화율 % | -6.88±5.39 | -7.97±2.92 | -10.35±0.76* | -11.43±1.49** | -9.19±3.65 | -6.05±1.79 | ||
| TSG 2.5mg/kg |
 |
888.8±200.9 | 873.5±210.3 | 888.7±208.8 | 869.1±249.3 | 890.2±240.3 | 877.6±225.1 | 868.6±221.8 |
| 변화율 % | -1.89±6.74 | -0.10±4.21 | -3.22±9.65 | -0.56±7.52 | -1.52±9.42 | -2.58±7.26 | ||
| TSG 5mg/kg |
 |
906.3±193.9 | 897.1±184.7 | 916.6±186.2 | 915.2±199.9 | 907.8±194.0 | 891.7±188.6 | 881.8±188.9 |
| 변화율 % | -0.82±2.72 | 1.31±2.04 | 0.90±1.20 | 0.20±1.19 | -1.59±3.63 | -2.75±3.55 | ||
| TSG 10mg/kg |
 |
891.8±93.4 | 890.5±82.2 | 891.3±78.1 | 903.4±76.9 | 878.7±90.9 | 872.9±98.6 | 863.7±80.0 |
| 변화율 % | 0.02±4.07 | 0.09±2.25 | 1.49±3.81 | -1.42±3.68 | -2.16±2.50 | -3.00±4.04 | ||
용매 대조군과 비교한 경우 *P<0.05, **P<0.01
실시예
6
마취된 개의 혈류 역학에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 iv의 효과
본 실시예의 목적은 심장박동수, 혈압 및 심장의 수축 및 이완 기능(systolic and diastolic function of heart)과 같은 혈류역학적 지수(hemodynamic indexes)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 iv 투여의 효과를 실험하고 관찰하는 것이다.
실험 약물
실험 약물: 사용 전에 생리식염수로 100mg/10ml로 희석된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(제품번호: 03030302, 센젠 넵투너스 파마쑤티컬 컴파니, 리미티드에 의해 제조됨).
대조 약물(control drug): 독일 슈바르츠 파마 에이쥐(Germany Schwarz Pharma AG)로부터 제조되고 추하이 슈바르츠 파마 캄퍼니 리미티드(Zhuhai Schwarz Pharma Co., Ltd.)로부터 재포장된 소르비드 니트레이트(sorbide nitrate) 주입(이소소르비드 디니트레이트, 제품번호: 479210)
실험 동물
제1 군의 대학의 실험 동물 센터에서 제공되고 각 무게가 10~14kg인 건강한 수컷 및 암컷 잡종개들.
군들 및 투여량
용매 대조군, 이소소르비드 디니트레이트 대조군(0.4mg/kg/h) 및 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 저투여량군(2.5mg/kg), 중간 투여량군(5mg/kg) 또는 고투여량군(10mg/kg)이 실험을 위해 준비되었다. 이소소르비드 디니트레이트 대조군은 지속 정맥 주입(continuous intravenous infusion)에 의해 투약되었으며 다른 군들은 정맥내 주사로 투약되었다.
실험 방법
펜토바르비탈 소듐(pentobarbital sodium)으로 마취된 후, 상기 개는 등이 고정되어 움직이지 못하게 하였다. 동맥 혈압을 기록하기 위한 도관 삽입(insertion of a catheter)을 위해 대퇴 동맥(femoral artery)이 분리되었다. 심장 도관(cardiac catheter)이 우온목동맥(right common carotid artery)으로부터 좌심실로 역으로 인도되었다(guided inversely). 양 도관은 압력 전송기(pressure transmitter)와 연결되어 있다. 압력 신호는 캐리어(carrier)로 증폭된 후, Powerlab system 8s(ML785/8S, AD Instruments, Australia) 전기생리그래프(electrophysiolograph)로 입력되었다. 바늘 전극들은 표준 2-lead ECG를 모니터하기 위해 네 사지를 뚫었다. 실시간 모니터링 및 데이타의 저장을 위해 컴퓨터(chart4.12, ML785/8S, AD Instruments, Australia)가 사용되었다. 수술 후, 안정화를 위해 30분의 시간이 있으며 그 다음으로는 투여 전에 기초 지수들이 기록되었다. 음성 조절군은 2ml/kg의 용매를 외부적으로 주입(extraneously injection)한 반면, 양성 조절군은 0.4mg/kg/h를 정맥내 주입(intravenously infused)하였다. 투여량군들(administration groups)에 대해서는 TSG가 전자 정량 펌프(electronic constant flow pump, 콴주 리즈홍 전자 의료 기기 공장(Quanzhou Lizhong Electronic Medical Instrument Factory)에 의해 제조된 SH-88AB 조절가능 정맥내 주입기(Controllable Intravenous Injector))로 정맥내 주사에 의해 투여되었으며, 지속 주입(constant infusion)은 30분 내에 완료되었다.
관찰 지수로는 심장박동수(HR), 수축기혈압(systolic blood pressure, BPs), 이완기혈압(diastolic blood pressure, BPd), 평균 혈압(BPm), 좌심실 수축기혈압(LVSP), 좌심실 이완기혈압(LVDP), 좌심실 수축기 혈압 상승 및 하강의 최대 변화율(±dp/dt max), 좌심실이완기말압(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP) 및 심전도(ECG)를 포함한다.
실험 결과들은 
로 나타내었으며, 변화율 분석에는 SPSS 10.0 소프트웨어를 사용하였다. 차이들의 중요성이 확인되었다.
실험 결과
결과는 다음과 같다: 2.5mg/kg 및 5mg/kg iv의 투여량으로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)를 정맥내 주사로 투여한 후, 심장 박동수, 혈압, 죄심실압(left ventricular pressure) 및 좌심실 수축기압 상승 및 하강의 최대 변화율(the maximum change rate of left ventricular systolic pressure rise and fall)에 변동이 있었으나, 투여 전의 값들과 비교하여 큰 차이를 나타내지는 않았다. 10mg/kg iv의 투여량으로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 투여한 경우 마취된 개의 혈압은 증가하였으나, 투여 전의 값과 비교할 때 큰 차이를 나타내지는 않았다. 다른 지수들도 또한 명백한 변화를 보이지 않았다. 보다 상세한 사항은 표 19 내지 23을 참조.
하기 표 19는 마취된 개의 혈류 역학에 대한 용매 2ml/kg iv의 효과(
, n=5)(Effect of solvent at 2ml/kg iv on hemodynamics of anesthetized dogs)를 나타낸다.
| 시간 | 0 | 10 | 30 | 60 | 120 |
| HR(p/min) | 169.5±29.5 | 171.8±28.4 | 170.6±24.9 | 179.7±42.6 | 168.0±32.4 |
| BPs(KPa) | 23.0±3.9 | 22.6±3.3 | 23.1±3.0 | 24.2±2.8 | 23.3±2.2 |
| BPm(KPa) | 19.0±3.7 | 19.0±2.9 | 19.5±3.0 | 20.5±2.8 | 19.6±2.1 |
| BPd(KPa) | 16.7±3.4 | 16.6±2.6 | 17.2±3.1 | 18.1±3.1 | 17.1±2.3 |
| LVSP(KPa) | 23.5±4.5 | 24.4±3.8 | 24.7±3.8 | 23.1±5.8 | 23.5±6.5 |
| LVDP(KPa) | 0.24±1.49 | 0.34±1.58 | 0.45±1.44 | 0.34±1.44 | 0.49±1.59 |
| LVEDP(KPa) | 1.23±1.70 | 1.11±1.40 | 1.21±1.31 | 1.00±1.41 | 1.06±1.66 |
| +dp/dt max (Kpa/s) | 801.1±284.0 | 836.3±185.7 | 731.4±172.3 | 802.2±334.0 | 847.1±266.5 |
| -dp/dt max (Kpa/s) | 815.0±105.3 | 733.1±201.3 | 746.8±124.3 | 759.4±207.7 | 786.5±180.0 |
하기 표 20은 마취된 개의 혈류 역학에 대한 이소소르비드 디니트레이트 0.4mg/kg/h iv의 효과(
, n=5)(Effect of Isosorbide Dinitrate at 0.4mg/kg/h iv on hemodynamics of anesthetized dogs)를 나타낸다.
| 시간 | 0 | 10 | 30 | 60 | 120 |
| HR(p/min) | 197.3±36.5 | 198.6±30.3 | 209.8±31.7 | 204.7±33.7 | 171.5±34.6 |
| BPs(KPa) | 26.8±1.2 | 25.3±1.7 | 24.8±1.3* | 24.9±0.7* | 25.4±1.0 |
| BPm(KPa) | 21.5±0.7 | 20.6±1.0 | 20.4±0.8 | 20.5±0.7 | 20.7±0.8 |
| BPd(KPa) | 18.9±0.6 | 18.4±0.7 | 18.1±0.7 | 18.2±0.7 | 18.4±0.8 |
| LVSP(KPa) | 24.1±0.9 | 22.9±1.3 | 23.0±0.4 | 23.0±0.8 | 22.7±0.6 |
| LVDP(KPa) | -0.29±0.42 | -0.37±0.39 | -0.17±0.34 | -0.42±0.26 | -0.47±0.21 |
| LVEDP(KPa) | 0.51±0.13 | 0.58±0.20 | 0.63±0.16 | 0.39±0.21 | 0.41±0.08 |
| +dp/dt max (Kpa/s) | 1081.0±334.0 | 1047.5±266.3 | 1123.9±225.3 | 1124.6±228.4 | 972.5±925.8 |
| -dp/dt max (Kpa/s) | 816.1±121.2 | 786.5±128.2 | 718.2±103.5 | 751.1±153.7 | 741.9±102.4 |
하기 표 21은 마취된 개의 혈류 역학에 대한 TSG 2.5mg/kg iv의 효과(
, n=5)(Effect of TSG at 2.5mg/kg iv on hemodynamics of anesthetized dogs)를 나타낸다.
| 시간 | 0 | 10 | 30 | 60 | 120 |
| HR(p/min) | 163.7±21.1 | 160.4±18.4 | 161.7±18.0 | 171.1±18.8 | 170.5±16.1 |
| BPs(KPa) | 25.3±3.0 | 24.5±2.0 | 24.7±1.3 | 25.5±1.6 | 23.7±3.3 |
| BPm(KPa) | 21.1±2.0 | 20.7±2.1 | 20.8±1.7 | 21.6±2.0 | 20.2±2.3 |
| BPd(KPa) | 18.5±1.7 | 18.3±2.3 | 18.5±2.2 | 19.1±2.5 | 18.1±1.8 |
| LVSP(KPa) | 24.9±4.0 | 25.2±4.2 | 25.7±3.8 | 26.5±2.5 | 26.7±2.3 |
| LVDP(KPa) | 0.39±2.20 | 0.45±2.40 | 0.28±2.40 | 0.26±2.35 | 0.50±2.06 |
| LVEDP(KPa) | 1.14±2.18 | 1.00±2.33 | 1.11±2.50 | 0.78±2.37 | 1.09±2.16 |
| +dp/dt max (Kpa/s) | 853.1±321.1 | 829.1±308.3 | 869.6±235.9 | 993.9±206.2 | 957.9±190.0 |
| -dp/dt max (Kpa/s) | 772.0±201.0 | 777.3±241.8 | 873.9±236.8 | 905.9±207.8 | 852.5±159.6 |
하기 표 22는 마취된 개의 혈류 역학에 대한 TSG 5mg/kg iv의 효과(
, n=5)를 나타낸다.
| 시간 | 0 | 15 | 30 | 60 | 120 |
| HR(p/min) | 177.2±35.5 | 171.0±35.6 | 170.0±35.5 | 178.0±29.5 | 170.2±37.1 |
| BPs(KPa) | 25.4±6.4 | 25.4±5.8 | 26.1±5.3 | 26.6±4.1 | 25.0±5.0 |
| BPm(KPa) | 21.1±4.7 | 21.1±4.7 | 21.7±4.2 | 22.1±3.3 | 21.0±4.4 |
| BPd(KPa) | 18.9±4.2 | 18.7±4.4 | 19.2±4.0 | 19.8±3.3 | 18.8±4.4 |
| LVSP(KPa) | 24.1±4.4 | 24.3±4.6 | 24.6±4.6 | 25.6±3.0 | 25.1±5.2 |
| LVDP(KPa) | 0.31±1.31 | -0.09±2.03 | 0.18±1.64 | 0.09±1.29 | 0.27±1.50 |
| LVEDP(KPa) | 1.05±1.34 | 1.08±1.62 | 1.19±1.76 | 0.99±1.19 | 0.98±1.42 |
| +dp/dt max (Kpa/s) | 822.6±353.8 | 793.8±299.0 | 855.5±296.5 | 936.1±199.9 | 921.4±327.1 |
| -dp/dt max (Kpa/s) | 866.2±350.7 | 812.2±350.7 | 912.3±318.8 | 891.5±261.8 | 872.0±291.7 |
하기 표 23은 마취된 개의 혈류 역학에 대한 TSG 10mg/kg iv의 효과(
, n=5)를 나타낸다.
| 시간 | 0 | 10 | 30 | 60 | 120 |
| HR(p/min) | 212.5±31.3 | 209.7±33.4 | 210.2±33.8 | 207.1±38.1 | 205.6±50.2 |
| BPs(KPa) | 28.5±7.5 | 32.4±8.2 | 33.2±8.5 | 33.6±5.5 | 29.0±4.8 |
| BPm(KPa) | 22.5±4.8 | 24.5±5.9 | 25.1±5.9 | 24.4±5.1 | 22.7±3.0 |
| BPd(KPa) | 19.6±3.7 | 21.0±5.1 | 21.4±5.5 | 20.6±4.8 | 20.2±3.0 |
| LVSP(KPa) | 30.1±5.9 | 32.4±6.3 | 32.4±6.8 | 31.7±5.5 | 29.5±2.7 |
| LVDP(KPa) | -1.18±1.71 | -1.30±2.12 | -1.25±2.47 | -1.87±2.00 | -1.04±2.11 |
| LVEDP(KPa) | 0.99±0.60 | 0.93±0.50 | 0.78±0.43 | 0.63±0.44 | 1.69±2.78 |
| +dp/dt max (Kpa/s) | 1455.5±637.7 | 1646.2±807.8 | 1623.9±729.5 | 1518.5±708.1 | 1266.6±334.8 |
| -dp/dt max (Kpa/s) | 1164.1±488.8 | 1200.6±447.6 | 1120.4±357.8 | 1189.6±461.6 | 1068.5±208.6 |
실시예
7
쥐의 만성 심근 허혈에 대한 경구 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 치료 효과
본 실시예의 목적은 쥐의 만성 심근 허혈(chronic myocardial ischemia)에 대한 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 위내 투여의 치료 효과를 관찰하는 것이다.
실험 약물
센젠 넵투너스 파마쑤티컬 컴파니 리미티드(Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co., Ltd)에 의해 생산되었으며, 사용 전에 0.8% CMC로 2 및 4mg/ml 농도의 서스펜션(suspension)으로 준비된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 과립 (제품번호: 031011)
실험 동물
제1 군의 대학의 실험 동물 센터에서 제공되고 각 무게가 250~300g인 수컷 SD 쥐들.
실험 방법
(1) 동물의 수술 및 관상 동맥 결찰: 60마리의 수컷 SD 쥐들은 두 개의 군으로 나누어졌다: 15 마리는 겉보기 수술군이고 45 마리는 수술군이며, 100mg/kg의 투여량으로 우레탄(urethane) ip 마취에 의해 움직이지 못하게 등을 고정하였다. 심전도계(샹하이 광전 & 전자 의료기기 유한공사(Shanghai Photoelectrical & Electronic Medical Apparatus Co., Ltd.)에 의해 제조된 ECG-6851C)가 II 유도 심전도(II lead electrocardiogram)를 기록하기 위해 사용되었다. 기관삽관(tracheal intubation)이 수행되었고 인공 호흡기로 연결되었으며 흉골좌연의 네번째 갈비사이공간에 대한 개흉술이 피부 멸균 후에 수행되었다. 심장이 노출되고, 좌전하행 관상 동맥 가지 뿌리의 3-4mm에서 결찰(ligation)이 수행되었다. ECG는 전 과정에 걸쳐 모니터링되었으며, 상승된 T-파(wave)의 진폭(amplitude)뿐만 아니라 ST 부의 현저한 상승 및 하강을 보여주는 그래프가 관상 동맥 결찰의 성공을 위한 지수로서 보여졌다. 상기 결찰 후, 가슴(thorax)을 닫고 공기를 외부로 빼냈다. 수술 후에 규칙적인 영양 공급이 지속되었으며, 페니실린(penicillin)의 근육내 주사(intramuscular injection)가 수술한 지 1 주 뒤에 감염을 예방하기 위하여 수행되었다. 겉보기 수술군(sham operation group)에서는 관상 동맥 결찰 없이 개흉술이 수행되었다.
(2) 군들 및 투여량: 5주 뒤, 11마리의 쥐들이 겉보기 수술군에서 생존하였고, 24마리의 쥐들이 수술군에서 생존하였다. 다음으로 상기 수술군은 다시 임의로 2개의 군으로 나뉘었다: 허혈 대조군(ischemic control group) 및 20mg/kg의 투여량으로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 투여하는 군. 여섯번째 주부터, 일요일을 제외하고 일주일에 6일씩 약물이 투여되었으며, 이는 6주 동안 지속되었다. 투여된 약물의 부피는 5ml/kg이었다.
(3) 치료 효과의 평가: 치료 효과는 수술 후 12번째 주에 평가되었다. 최종 투여한 지 30분 후, 쥐들은 등 부위가 고정되어 움직이지 못하게 되었고 기관삽관(tracheal intubation)이 수행되었다. 동맥 혈압을 기록하기 위한 도관 삽입을 위해 대퇴 동맥(arteria femoralis)이 분리되었다. 심장 도관(cardiac catheter)이 우온목동맥(right common carotid artery)으로부터 좌심실로 역으로 인도되었다(guided inversely). 양 도관은 압력 센서(pressure sensor)와 연결되어 있으며, 다음으로 압력 신호는 캐리어(carrier)로 증폭된 후, Powerlab system 8s(ML785/8S, 에이디 장비(AD Instruments), 호주에서 제조) 전기생리그래프(electrophysiolograph)로 입력되었다. 바늘 전극들은 표준 2 유도 ECG(standard two lead ECG)를 모니터링하기 위하여 피하로(subcutaneously) 삽입되어 네 사지(limbs)에 연결되었다. 모니터링 및 데이타의 저장을 위해 컴퓨터(chart4.12 software, ML785/8S, AD Instruments, 호주에서 제조)가 사용되었다. 수술한지 30분 후, 심장박동수(HR), 평균 혈압(BPm), 좌심실 수축기혈압(LVSP), 좌심실 이완기혈압(LVDP), 좌심실 수축기 혈압의 최대 변화율(±dp/dt max), 좌심실이완기말압(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP), 및 심전도(ECG)가 관찰되었다. 한 시간 후, 동물들은 사망 처리(execute)되었고, 좌심실은 적출되었다. 좌심장은 두께 5mm의 조각으로 잘렸으며, 생리 식염수로 세척되고 37℃에서 염색을 위해 0.025% 니트로블루테트라졸리움(N-BT, 스위스 플루카 화학 회사(Fluka Chemistry Company)에 의해 제조됨)에 투입되었다. 정상 심근(normal myocardium)은 진한 푸른색으로 염색되고, 경색부의 심근(myocardium in infarction area)은 염색되지 않고 연노란색으로 유지된다. 경색부(infarction area)는 정상 심근과 해부 현미경(anatomic microscopy)하에서 분리되며, 상기 양 심근은 각각 무게가 측정된다. 전체 무게에 대한 경색부 무게의 비율(%)은 심근 경색부의 크기 측정의 지표로 여겨진다.
실험 결과는 
로 표현되었다. 홑 t-실험(unpaired t-test)이 통계적 과정에 적용되었으며, P<0.05일 때 현저한 차이가 있었다.
실험 결과
겉보기 수술군, 허혈 대조군 및 TSG 투여군들 간에 큰 차이는 나타나지 않았다. 허혈 대조군의 평균 동맥 혈압은 겉보기 수술군의 것보다 낮은 반면, TSG 투여군의 동맥 혈압은 겉보기 수술군의 수준으로 다시 증가하였다. 허혈 대조군 및 TSG 투여군의 심전도는 둘 다 ST 부의 상승 또는 하강(ST segment elevation or depression)이 다른 정도로 보였으며, 이는 심근 허혈의 존재를 나타낸다. 대조군과 비교할 때, 허혈 대조군의 좌심실이완기 혈압(left ventricular developed pressure, LVDP)이 증가한 반면, 좌심실수축기말압(left ventricular end systolic pressure, LVESP) 및 ±dp/dt max는 감소하였다. TSG 투여군의 대응하는 혈류 역학 지수들은 훨씬 좋게 나타났으며, 허혈 및 경색된 조직은 현저히 감소하였다. 실험 결과는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 위내 투여는 쥐들의 만성 심근 허혈에 현저한 치료 효과가 있음을 나타냈다.(표 24 참조)
하기 표 24는 쥐의 만성 심근 허혈에 대한 TSG 위내 투여의 치료 효과(
)(Therapeutic effect of TSG intragastric administration on rat chronic myocardial ischemia)를 나타낸다.
| 겉보기 수술군 (Sham operation group) | 허혈 대조군 (Ischemic control group) | TSG 투여군 (TSG administration group) | |
| n | 11 | 12 | 12 |
| HR(p/min) | 364±32 | 383±52 | 354±45△ |
| BP(KPa) | 19.7±1.2 | 17.5±1.3* | 19.2±1.8△ |
| LVSP(KPa) | 20.6±1.8 | 17.7±1.6* | 19.8±2.1△ |
| LVEDP(KPa) | 0.68±0.16 | 1.09±0.25* | 0.82±0.19△ |
| +dp/dt max(Kpa/s) | 1456±223 | 1106±164* | 1389±142△ |
| 경색 크기 비율(%) (Infarct size ratio) | -- | 14.5±2.3 | 5.9±1.2△△ |
겉보기 수술군과 비교할 때 *P<0.05;
허혈 대조군과 비교할 때 △P<0.05, △△P<0.01
실시예
8
정맥내 주사로 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 쥐들에게 투약하여 급성 독성 실험(acute toxicity test)
본 실시예의 목적은 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 정맥내 주사 후에 쥐들의 급성 독성 반응을 관찰하는 것이다.
실험 약물
센젠 넵투너스 파마쑤티컬 컴파니, 리미티드(Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co., Ltd.)에 의해 제조되고 사용 전 생리식염수로 희석된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 과립(제품번호:031011)
실험 동물
제1 군의 대학의 실험 동물 센터에서 제공되고 각각의 무게는 18~22g이며 수컷과 암컷이 절반씩인 쿤밍 쥐들.
투여 방법
약물은 20ml/kg의 동일한 부피로 각기 다른 농도로 정맥내 주사를 통해 투약되었다.
실험 방법
40마리의 건강한 쿤밍 쥐들이 선택되고 4개의 군으로 임의로 나뉘었다. 약물은 꼬리 정맥을 통해 한 번에 주사로 투여되었으며, 투여량은 각각 300mg/kg, 425mg/kg, 600mg/kg 및 850mg/kg이었다. 쥐들은 주사 후 4시간 동안 지속적으로 관찰되었다. 그 이후, 7일 동안 연속하여 아침에 한 번, 오후에 한 번씩 관찰을 수행하였다. 중독 증상(signs of intoxation)과 사망 시각이 기록되었다. LD50과 95% 신뢰도 범위를 계산하는데 블리스 방법(Bliss method)이 사용되었다.
실험 결과
꼬리 정맥내 주사로 1회 투여한 후, 몸체 흔들기(body shaking), 간헐적으로 안절부절증(ocassionally restlessness), 경련(twitch) 및 다른 반응들이 나타났다. 이러한 증상들은 투여량이 증가한 경우 더욱 명백해졌다. 약물 주사 후 쥐들의 사망은 5분에서 24시간 동안 일어났다. 생존한 쥐들은 이틀 후 회복하여, 정상적인 활동 및 영양 섭취로 잘 성장하였다. 죽은 쥐들의 주요 기관(main organ)들에 대한 육안 해부(gross anatomy)에서 어떠한 비정상적인 점도 발견되지 않았다. LD50 및 95% 신뢰도 범위는 표 25에 나타냈다.
하기 표 25는 정맥내 주사를 통해 TSG를 투약한 쥐들에 대한 급성 독성 실험의 결과(n=10)를 나타낸다.
| 투여량(Doses) (mg/kg) | 로그 투여량 (logarithm dose) (x) | 사망수 (Death number) | 사망율 (Deat rate) (%) | LD50 및95% 신뢰도 범위(g/kg) |
| 360 | 2.556 | 0 | 0 | LD50 = 648.94 95% 신뢰도 범위는 571.18~726.70 |
| 510 | 2.708 | 1 | 10 | |
| 720 | 2.857 | 7 | 70 | |
| 1020 | 3.009 | 10 | 100 |
결론
쥐들에개 정맥내 주사로 TSG를 투약한 경우 LD50은 648.94mg/kg이며, 95% 신뢰도 범위는 571.18mg/kg ~ 726.70mg/kg이다.
실시예
9
개에게 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 정맥내 주사로 1회 투여한 경우의 약물동태학(pharmacokinetics)
본 실시예의 목적은 개에게 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG) iv를 1회 투여한 경우에 있어서 약물동태학 변수들을 관찰하는 것이다.
실험 약물
센젠 넵투너스 파마쑤티컬 캄퍼니 리미티드(Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co., Ltd.)에 의해 제조되고 사용 전에 생리식염수로 희석된 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 용액(제품번호: 03030302, 100mg/10ml)
실험 동물
제2 군의 대학의 실험 동물 센터에서 제공되고 각 무게가 10.8~10.5kg인 건강한 암컷 및 수컷 비글(Beagle) 성체(adult) 개들.
실험 방법
약물동태학 연구는 10mg/kg, 20mg/kg 및 30mg/kg의 세 투여량군에서 수행되었다. 5마리의 건강한 성체 비글 개들이 각 투여량군으로 선택되었다. 각 투여량군에서 실험에 사용된 비글 개들은 실험 전에 하룻밤 동안(14시간) 공복 상태로 유지하였으며, 각각 10mg/Kg, 20mg/Kg 및 30mg/Kg의 TSG를 정맥내 주사로 다음날 아침 8:00에 0.5ml/kg의 부피로 투여하였다. 정맥내 주사는 각 실험 개들의 앞다리 중 하나에 5분 동안 매우 천천히 수행되었다. 상기 정맥내 주사 3시간 후, 개들에게 먹이가 공급될 수 있다. 각 실험 개들의 다른 앞다리로부터 투여 전 및 투여 후 0, 5, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360 및 480분에 헤파린 관들(heparinized tubes)로 3ml의 정맥혈이 추출되었다. 혈액 샘플들은 1ml의 혈장을 얻기 위하여 원심분리되었다. 혈장 내의 TSG 농도는 혈액 샘플 전처리 방법(method of blood sample pre-treatment)(TSG 주사를 1회 투여한 후 비글 개들의 고농도 혈액 샘플들은 공혈장(blank plasma)으로 희석되어야 한다.)에 따라 측정되었다.
데이타 분석(Data Analysis)
비구획모델링법(non compartmental modeling method)(통계적 모멘트)가 데이타 분석에 사용되었다. 각 변수들의 계산 식은 아래와 같다.
상기 식에서 λ는 농도-시간 곡선에서 최종 제거율값(number of terminal eliminating rate)을 나타낸다. tn 및 Cn은 각각 혈액 샘플링의 가장 최근 시간(the latest time of blood-sampling)과 혈장 약물 농도(plasma drug concentration)를 나타낸다. tmax와 Cmax와 같은 약물동태학 변수들은 혈장 샘플의 대응하는 측정값을 가진다(take the corresponding measuring value of plasma samples).
실험 결과
고성능 액체 크로마토그래픽 방법(High-Performance Liquid Chromatographic Method, HPLC)이 10mg/Kg, 20mg/Kg 및 30mg/Kg의 투여량군들에서 각각 5마리의 성체 비글 개들의 TSG 혈청 약물 농도를 각기 다른 시간에 측정하기 위하여 사용되었다. 표 26은 혈장 농도-시간 데이타를 보여준다. 도 6, 7 및 8은 각각 정맥내 주사를 통해 비글 개들에게 10mg/Kg, 20mg/Kg 및 30mg/Kg의 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)를 투여한 경우의 평균 혈장 약물 농도-시간 곡선(average plasma drug concentration-time curve)을 나타낸다. 표 27에서는 10mg/Kg, 20mg/Kg 및 30mg/Kg의 일회 투여량으로 TSG를 5마리의 건강한 성체 비글 개들에게 TSG를 투여한 경우의 약물동태학 변수(pharmacokinetic parameter)들을 나타낸다. 이들 약물동태학 변수들은 비구획모델링법으로 구해졌다.
실험 결과는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드(TSG)의 정맥내 주사 후 건강한 비글 개들에 대한 TSG의 생리적 소인(physiological disposition)이 2-구획 모델(two-compartment model)과 일치한다는 것을 나타낸다. 농도-시간 곡선에서 TSG 약물동태학 변수인 최종 소실 반감기(terminal elimination half lives)(t1/2)는 각각 167.87±170.90분, 151.05±57.32분 및 373.09±372.98분이다. 10mg/Kg, 20mg/Kg 및 30mg/Kg 투여량군들에서 AUC0~∞ 값들은 각각 315.42±60.82μg·min/ml, 745.75±175.84μg·min/ml 및 1552.71±227.28μg·min/ml이다. AUC는 투여량과 긍정적 상관 관계를 가지며, 상관 계수(r)는 0.985이다.
하기 표 26은 시간에 따른 SG의 일회 투여 iv의 혈장 약물 농도(μg/ml, 
)(Plasma drug concentration of single dose iv of TSG at different time)를 나타낸다.
| 투여량 | 시간(분) | ||||||||||||
| 0 | 5 | 10 | 20 | 40 | 60 | 90 | 120 | 180 | 240 | 300 | 360 | 480 | |
| 10 mg/Kg | 22.35 ± 4.92 | 6.84 ± 1.89 | 3.88 ± 0.66 | 2.17 ± 1.19 | 1.45 ± 0.52 | 0.93 ± 0.55 | 0.52 ± 0.20 | 0.35 ± 0.10 | 0.30 ± 0.06 | 0.24 ± 0.04 | 0.17 ± 0.06 | 0.10 ± 0.04 | 0.02 ± 0.04 |
| 20 mg/Kg | 47.68 ± 6.51 | 21.82 ± 4.59 | 21.82 ± 4.59 | 8.25 ± 4.90 | 3.48 ± 1.23 | 2.36 ± 1.12 | 0.84 ± 0.60 | 0.68 ± 0.40 | 0.46 ± 0.11 | 0.35 ± 0.13 | 0.29 ± 0.08 | 0.20 ± 0.05 | 0.07 ± 0.06 |
| 30 mg/Kg | 100.72 ± 5.85 | 49.29 ± 19.52 | 49.29 ± 19.52 | 15.21 ± 7.11 | 8.02 ± 2.95 | 5.01 ± 1.63 | 1.67 ± 0.66 | 1.08 ± 0.54 | 0.62 ± 0.30 | 0.50 ± 0.22 | 0.33 ± 0.05 | 0.29 ± 0.05 | 0.21 ± 0.02 |
하기 표 27은 비글 개들에게 TSG iv를 일회 투여한 경우 약물동태학 변수들(
)(pharmacokinetic parameters of single dose of TSG iv in Beagle dogs)을 나타낸다.
| 투여량 | t1 /2 (분) | MRT (분) | Cl (L/min) | AUC0~480 (μg·min/ml) | AUC0~∞ (μg·min/ml) | Vss (L) |
| 10 mg/Kg | 167.87 ± 170.90 | 140.06 ± 124.87 | 0.03 ± 0.01 | 283.05 ± 49.85 | 315.42 ± 60.82 | 4.21 ± 3.06 |
| 20 mg/Kg | 151.05 ± 57.32 | 78.08 ± 12.24 | 0.03 ± 0.01 | 718.32 ± 179.10 | 745.75 ± 175.84 | 2.24 ± 0.78 |
| 30 mg/Kg | 373.09 ± 372.98 | 184.08 ± 240.08 | 0.02 ± 0.00 | 1432.17 ± 349.97 | 1552.71 ± 227.28 | 4.25 ± 6.35 |
3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 새로운 용도가 제공된다. 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 정맥내 주사 및/또는 경구 투여에 의해 항심근허혈에 대한 효능이 있다. 항심근허혈제로서 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드가 허혈 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 조제에 사용되는 것은 장점을 가진다.
Claims (9)
- 허혈심장질환(ischemic heart disease)의 치료 및/또는 예방을 위한 제제를 화학식 I의 3,4',5-트리히드록시(trihydroxy)-스틸벤(stilbene)-3-베타(β)-D-글루코사이드(glucoside)로 제조하는, 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 사용 방법.
(I) - 제1항에 있어서,상기 허혈심장질환은 무증상 심근허혈(asymptomatic myocardial ischemia), 협심증(angina), 심근경색증(myocardial infarction), 허혈 심근병증(ischemic cardiomyopathy), 심부전(heart failure) 또는 급사(sudden death)인 것을 특징으로 하는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 사용 방법.
- 제1항에 있어서,상기 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코스의 투여 복용량(administrative dose)은 60kg 체중당 시간당 20 내지 300 mg(20 ~ 300mg/60 kg body-weight/time)인 것을 특징으로 하는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 사용 방법.
- 제3항에 있어서,상기 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코스의 투여 복용량은 60kg 체중당 시간당 50 내지 200 mg(50 ~ 200mg/60 kg body-weight/time)인 것을 특징으로 하는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 사용 방법.
- 제1항에 있어서,상기 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드는 경구 투여(oral administration) 또는 정맥내 투여(intravenous administration)를 위한 제제의 형태(form of preparations)로 사용되는 것을 특징으로 하는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드의 사용 방법.
- 허혈심장질환(ischemic heart disease)의 치료 또는 예방을 위한 제제를 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 함유한 제약 조성물(pharmaceutical composition)로 제조하는, 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 함유한 제약 조성물의 사용 방법.
- 제6항에 있어서,상기 제약 조성물의 각 제제 단위(every unit of the preparation of the said pharmaceutical composition)는 20 내지 300 mg의 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 및 제약상 허용되는 보조제(pharmaceutically acceptable adjuvant)를 함유하며, 상기 각 제제 단위는 단일 투여 복용에 필요한 총 제제의 양(total amount of preparation needed in a single dose of administration)인 것을 특징으로 하는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 함유한 제약 조성물의 사용 방법.
- 제7항에 있어서,상기 제약 조성물의 각 제제 단위는 50 내지 200 mg의 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드 및 제약상 허용되는 보조제(pharmaceutically acceptable adjuvant)를 함유하는 것을 특징으로 하는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 함유한 제약 조성물의 사용 방법.
- 제6항에 있어서,상기 제약 조성물은 경구 투여(oral administration) 또는 정맥내 투여(intravenous administration)를 위한 제제의 형태인 것을 특징으로 하는 3,4',5-트리히드록시-스틸벤-3-베타-D-글루코사이드를 함유한 제약 조성물의 사용 방법.
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