KR20070093889A - 로즈마린산을 포함하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 로즈마린산을 포함하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 로즈마린산은 IKKβ 활성을 억제하여 염증유발 신호전달체계인 NF-κB를 차단함으로써, IKKβ에 의해 야기되는 염증성 질환, 특히 로사시아의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

로즈마린산을 포함하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물 {Composition for skin external application comprising rosmarinic acid for preventing or treating rosacea}

도 1은 인간 섬유아세포와 마우스 섬유아세포 세포주에서 본 발명의 로즈마린산의 농도에 따른 TNF-α에 의한 NF-κB 활성 억제 효과를 나타낸 도이다(RA : 로즈마린산, PDTC : 피롤리딘 디티오카바메이트(pyrrolidine dithiocarbamate)).

도 2는 본 발명의 로즈마린산에 의한 IκBα의 인산화와 분해 억제 효과를 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 로즈마린산에 의한 NF-κB 이종 이합체(heterodimer)의 핵이동 억제 효과를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 로즈마린산에 의한 IKKβ 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명의 로즈마린산에 의해 CCL11과 CCR3의 발현이 억제되는 현상을 나타낸 도이다.

도 6은 본 발명의 로즈마린산에 의해 ICAM-1과 VCAM-1의 발현이 억제되는 현상을 나타낸 도이다.

도 7은 본 발명의 로즈마린산을 함유한 피부 외용제의 아토피 개선 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 로즈마린산을 포함하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

로사시아(rosacea)는 주로 얼굴에 호발하는 만성 피부질환으로, 심해지면 두피나 상체로 번지기도 하는 만성 피부질환이다. 이 질환은 주로 20대 이후 누구에게나 나타날 수 있으며, 얼굴의 모든 부위에서 처음에는 홍조로서 나타난다. 질환이 시작되면 홍조는 혈색을 좋아 보이게 하지만, 시간이 지나면서 가는 혈관들이 뚜렷해지면서 전체적으로 얼굴을 더욱 붉게 만든다. 이를 그대로 방치하면 붉게된 부분에서 여드름이나 뾰로지 등이 발생하기도 하고, 얼굴이 건조한 상태가 되며 가끔씩 가렵기도 한다.

로사시아는 여드름과 유사한 증상을 보여 서로 혼동되기도 한다. 그러나, 사춘기에 대표적으로 나타나는 여드름과는 달리 로사시아는 20대에서 40대에 나타나고, 여드름과 같은 구진 농포 등의 증상이 피지 과다분비에 의한 것보다는 세균이 분비한 독소나 유전적 체질, 온도차에 의한 비정상적인 혈류확장 등에서 기인한다. 로사시아의 발병 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으며, 한번 시작되면 짧은 기간 내에 치료되지 않고 만성화되는 질환이다.

로사시아는 염증유도 매개체(proinflammatory mediators)에 의해 유발된다고 보고되어 있다. 염증유도 매개체로는 인터루킨-8, CCL11, CCR3, ICAM-1, VCAM-1, GM-CSF, ICAM-1, COX-2 등이 포함된다. 염증성 질환들의 치료에 있어서 염증 유도 매개체들의 생성을 억제하는 것이 매우 효과적이라는 보고에 따라, 최근에는 이러한 염증 매개체들에 대한 전사적인 조절(transcriptional regulation)에 많은 관심이 집중되고 있다(Barnes PJ. Nature 1999. 402, 659-663).

염증 매개체들의 조절은 편재하는(ubiquitous) 전사인자(transcription factor)인 NF-κB에 의해 조절되고(Ghosh & Karin. Cell. 109, S81-S96), NF-κB는 RelA(p65), RelB, c-Rel, NF-κB1(p105/50), NF-κB2(p100/p52)로 이루어진 Rel 종류의 동종 이합체(homodimer) 또는 이종 이합체(heterodimer)로 이루어진다. 휴지기 세포(resting cell)에서는 카파 B 억제제(inhibitor of kappa B (IκB)) 단백질이 NF-κB 단백질에 결합함으로써 NF-κB에 의한 전사활성화(transcriptional activation)를 억제한다. IL-1β 또는 TNF-α가 각각 자신의 수용체(receptor)에 결합을 하면 IκB 키나제 복합체(IKK complex) 형성을 유도하여, IκBα 단백질을 분해하고, NF-κB 단백질을 활성화 시킨다(Ghosh & Karin. Cell. 109, S81-S96).

IKK 복합체는 구조 단백질(structural protein)인 IKKγ와 IκBα의 인산화를 유도하는 IKKα와 IKKβ로 구성되어 있다. IκBα의 인산화는 26S 프로테아좀 (proteasome)에 의한 단백질 분해를 유도하는 편재화를 촉진시킨다. NF-κB 활성화를 유도하는 대부분의 신호들은 IKK 복합체를 경유하기 때문에, NF-κB 활성화 차단을 통해 치료제를 개발하고자 하는 전략의 핵심타켓이 되는 단백질이 IKK 복합체이다. IKK 복합체 중에서 IKKβ가 특히 유용한 타겟으로 알려져 있다. IKKβ 억제 제로 최근에 알려진 물질들은 아스피린, 소듐 살리실레이트(sodium salicylate), 퀴나졸린(quinazoline) 동족체, β-카볼린(carbolin) 동족체, 이미다조퀴녹살린 (imidazoquinoxaline) 유도체, 피리독사지논(pyridoxazinone) 등이 있다. 이러한 물질들은 염증성 질환들, 바람직하게는 뚜렷한 치료제가 없는 만성 염증성 질환들, 그 중에서도 특히 로사시아에 대한 치료제 후보물질로 작용할 것으로 기대되고 있다.

이에, 본 발명자들은 만성 염증성 질환에 대한 후보물질을 탐색하는 과정에서 로즈마린산이 IKKβ 활성을 억제하여 염증유발 신호전달체계인 NF-κB를 차단하고 로사시아의 증상을 효과적으로 개선시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

발명은 로즈마린산을 포함하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 로즈마린산을 포함하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분인 로즈마린산은 레몬으로부터 추출·분리하여 사용하였으며, 다른 생약재로부터 추출·분리하거나 화학적인 합성 방법으로 제조하거나 또는 시판되는 시약을 구입하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 로즈마린산은 TNF-α에 의해 유도된 NF-κB 프로모터 활성, IκBα 인산화와 분해, NF-κB 이종 이합체의 핵 내 이동 및 IKKβ 활성을 농도 의존적으로 억제한다. 또한, 본 발명의 로즈마린산은 염증성 질환 유발에 중요한 역할을 하는 CCL11, CCR3, VCAM-1 및 ICAM-1의 생성을 모두 억제한다. 또한, 본 발명의 로즈마린산은 피부에 대한 안정성이 우수하고, 로사시아 개선 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 로즈마린산은 IKKβ에 의해 야기되는 염증성 질환, 특히 로사시아의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 염증개선을 위한 화장품 및 의약품 등에 적용할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 로즈마린산의 함량은 조성물의 총 중량에 대해 0.001 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%를 포함할 수 있다. 만일 로즈마린산의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 염증개선 효과가 너무 미약하고, 20 중량%를 초과하는 경우에는 함량 증가에 따른 염증개선 효과의 증가가 미비하고 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 조성물은 로즈마린산 외에 염증개선 효과에 유해한 영향을 끼치지 않는 한, 염증개선 효과를 갖는 공지의 활성 물질을 함께 포함할 수 있다.

피부누적자극 시험을 실시한 결과, 로즈마린산은 인체 피부에 대해 안전한 물질로 판정되었으므로 피부 외용제로 사용하는데 적합하다. 본 발명의 피부 외용제 조성물의 제형은 파우더(power), 젤(gel), 연고(ointment), 크림(cream), 액체 (liquid), 에어로졸(aerosol) 등의 제형을 가지나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 피부 외용제 조성물의 적용가능한 하나의 형태는 화장료 조성물이다. 화장료 조성물은 로즈마린산 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 임의로 선정하여 첨가할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에는, 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH 조절제, 향료 등이 배합될 수 있다.

유분으로는 미네랄오일, 사이클로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브오일, 마카다미아 너트오일, 글리세릴옥타노에이트, 캐스터오일, 에틸헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 시클로펜타실록산, 선플라워씨드오일(sunflower seed oil) 등이 사용될 수 있다.

계면활성제로는 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리소르베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레이트, 디이에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/수크로오스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글리콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 아라키딜알콜/베헤닐알콜/아라키딜 글루코사이드, 폴리프로필렌글리콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글리콜-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 등이 사용될 수 있다.

보습제로는 글리세린, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 디글리세린, 베타인, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20 등이 사용될 수 있다.

고급 알콜로는 세틸알콜, 스테아릴 알콜, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알콜 등이 사용될 수 있다.

증점제로는 잔탄검, 카보머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등이 사용될 수 있다.

킬레이트제로는 디소듐이디티에이, 테트라소듐이디티에이 등이 사용될 수 있다.

색소로는 청색 1호, 적색 40호, 황색 4호, 황색 5호 등이 사용될 수 있다.

지방산으로는 스테아릭산, 미리스틱산, 팔미틱산, 이소스테아릭산, 라우릭산 등이 사용될 수 있다.

산화방지제로는 토코페릴아세테이트, 부틸레이티드히드록시톨루엔 등이 사용될 수 있다.

방부제로는 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신 등이 사용될 수 있다.

왁스로는 카나우바왁스, 칸데닐라왁스, 밀납, 경납 등이 사용될 수 있다.

pH 조절제로는 트리에탄올아민, 시트르산 등이 사용될 수 있다.

향료로는 천연향료, 조합향료 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 로션, 젤, 에센스, 마사지 크림, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물의 적용가능한 다른 하나의 형태는 의약 국소제제이다. 본 발명의 조성물은 염증개선 효과를 갖기 위하여, 유효성분인 로즈마린산 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 국소제제로 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 통상적인 방법에 따라 연고, 크림, 젤, 피부 유화액, 피부 현탁액, 패치 또는 분무제 등의 국소제제로 제형화하여 사용할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 로즈마린산의 일일 투여량은 0.01 내지 300㎎/㎠ 바람직하고, 하루 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아 니다.

제조예 : 레몬으로부터 로즈마린산의 분리

신선한 레몬 100g을 파쇄기를 이용하여 잘게 파쇄한 후 2배량의 클로로포름을 가하고 실온에서 3시간 동안 추출하였다. 추출액을 여과한 다음, 잔류물을 클로로포름으로 2회 더 추출하여 휘발성 물질과 색소를 제거하였다. 휘발성 물질과 색소가 제거된 잔류물에 80% 메탄올(또는 에탄올)을 가한 다음 교반하면서 1일간 추출하였다. 추출액을 여과하고 잔류물을 2회 더 추출하였다. 추출물을 모은 다음 감압농축하였다. 농축액에 5㎖의 메탄올을 가하여 용해한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출용매 - 클로로포름:메탄올:물=55:38:7)를 실시하여 순도 89%의 로즈마린산을 얻었다. 이를 다시 소량의 메탄올에 용해한 후 세파덱스 엘에치-20을 이용한 겔 크로마토그래피(용출용매 : 100% 메탄올)에 의해 분리하여 순도 98%의 로즈마린산 0.7g(수율 : 0.7%)을 얻었다.

제제예 : 로즈마린산을 함유한 피부 외용제

1. 영양크림

로즈마린산을 함유한 영양크림의 성분과 함량은 하기에 나타내었다. 수상인 정제수, 트리에탄올아민, 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하여 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 로즈마린산과 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산 (rosmarinic acid)	0.1	0.5	1.0
호호바 오일	5.0	5.0	5.0
유동 파라핀	7.0	7.0	7.0
세틸아릴 알콜	2.0	2.0	2.0
폴리글리세릴-3 메틸 글루코스 디스테아레이트	2.0	2.0	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5	0.5	0.5
스쿠알란	3.0	3.0	3.0
프로필렌글리콜	4.0	4.0	4.0
글리세린	5.0	5.0	5.0
트리에탄올아민	0.3	0.3	0.3
카복시 비닐폴리머	0.3	0.3	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2	0.2	0.2
방부제, 향	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
합 계	100	100	100

2. 화장수

a) 유연 화장수

로즈마린산을 함유한 유연 화장수의 성분과 함량은 하기에 나타내었다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였다. 로즈마린산, 유성성분, 유화제, 방부제, 향을 실온에서 용해시킨 후, 수상에 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	0.10
EDTA	0.05
PEG 1500	4.00
카보머	0.16
1,3-부틸렌글리콜	3.00
폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터 오일	0.45
트리에탄올아민	0.12
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합 계	100

b) 수렴화장수

로즈마린산을 함유한 수렴화장수의 성분과 함량은 하기에 나타내었다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였다. 로즈마린산, 유상성분, 유화제, 방부제, 향을 에탄올에 가하고 실온에서 용해시켜 알콜상을 제조한 다음 수상에 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	0.10
글리세린	2.00
1,3-부틸렌글리콜	3.00
EDTA	0.05
에탄올	7.00
폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터 오일	0.40
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합 계	100

3. 로션

로즈마린산을 함유한 로션의 성분과 함량은 하기에 나타내었다. 수상인 정제수, 트리에탄올아민, 부틸렌 글리콜을 70℃로 가열하여 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 친수성 증점제인 잔탄검 2% 용액을 첨가하여 전체에 대해 0.05 중량%가 되도록 조절하였다. 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후, 로즈마린산, 향 및 색소를 첨가하고 혼합한 다음 30℃로 냉각하였다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	0.10
글리세린	3.00
카보머	0.10
잔탄검	0.05
1,3-부틸렌 글리콜	3.00
폴리글리세릴-3 메틸글루코스 디스테아레이트	1.50
글리세릴 스테아레이트	0.50
세틸아릴 알콜	0.30
호호바 오일	3.00
유동 파라핀	2.00
스쿠알란	3.00
디메치콘	0.50
토코페릴아세테이트	0.20
트리에탄올아민	0.10
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합 계	100

4. 젤

로즈마린산을 함유한 겔의 성분과 함량은 하기에 나타내었다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	0.10
EDTA	0.02
1,3-부틸렌 글리콜	4.00
카보머	0.60
글리세린	5.00
히드록시에틸 셀룰로오스	0.15
트리에탄올아민	0.12
트리클로산	0.20
에탄올	5.00
폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터 오일	4.00
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합 계	100

5. 에센스

로즈마린산을 함유한 에센스의 성분과 함량은 하기에 나타내었다. 정제수에 점증제를 천천히 교반하면서 가하여 균일하게 분산시켰다. 수상 성분들을 혼합하여 수상을 제조하였다. 유화제, 피부 유연제, 향, 방부제에 에탄올을 가하여 용해시켰 다. 수상에 알콜상을 교반하면서 가하고 알칼리제를 첨가하였다. 최종적으로 로즈마린산과 색소를 첨가하였다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	0.10
EDTA	0.05
포타슘-세틸포스페이트	0.30
글리세린	5.00
1,3-부틸렌 글리콜	4.00
글리세릴스테아레이트/피이지 100 스테아레이트	0.50
소르비탄 스테아레이트	0.30
호호바 오일	0.50
마카데미아 넛 오일	0.50
토코페릴 아세테이트	0.50
부틸레이티드히드록시 톨루엔	0.05
디메치콘	3.00
폴리아크릴아마이드/C13-14 이소파라핀/라우레쓰-7	1.50
글리세릴폴리메타아크릴레이트/프로필렌 글리콜	5.00
에탄올	3.00
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합 계	100

6. 분무제

로즈마린산을 함유한 분무제의 성분과 함량은 하기에 나타내었으며, 펌프 용기에 담아 사용한다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	5.00
트리에탄올아민	0.20
폴리비닐피롤리돈/비닐아세테이트	3.00
글리세린	5.00
폴리아크릴레이트	0.20
정제수	잔량
합 계	100

7. 연고

로즈마린산을 함유한 연고의 성분과 함량은 하기에 나타내었다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	5.00
카프린/카프릴트리글리세리드	10.00
액상 파라핀	10.00
소르비탄세스퀴놀리에이트	6.00
옥틸도데세스-25	9.00
세틸에틸헥사노에이트	10.00
스쿠알란	1.00
살리실산	1.00
글리세린	15.00
소르비톨	10.00
정제수	잔량
합 계	100

8. 패치

로즈마린산을 함유한 패치의 성분과 함량은 하기에 나타내었다.

성 분	함량 (중량%)
로즈마린산	5.00
폴리비닐알콜	2.00
폴리비닐피롤리돈	3.00
소듐 폴리아크릴산	3.00
소듐 알기네이트	1.00
레티닐 팔미테이트	1.00
부틸렌글리콜	3.00
황산콘드로이친	1.00
메도폼 오일	1.00
PEG 20/소르비탄스테아레이트	1.00
BHT	미량
산화아연	미량
정제수	잔량
합 계	100

실시예 1 : 로즈마린산의 NF -κB 루시퍼라제 활성 억제 효과

로즈마린산의 NF-κB 활성 억제 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

NF-κB 수용체 DNA를 인간 섬유아세포와 마우스 섬유아세포 세포주인 NIH3T3 세포에 슈퍼펙트(superfect)를 이용하여 삽입하므로써 형질전환을 유도하였다. 형 질전환된 지 24시간 후에 TNF-α(40 ng/㎖)와 상기 제조예에서 제조한 로즈마린산 (1, 10, 20, 40 μM)을 처리하였다. 16시간이 경과되면 세포를 수집하고, 발광분석기(luminometer; Berthold, Germany)를 이용하여 450 ㎚에서 발광을 측정하였다(참고: Planta medica 2005; 71:338-343).

대조군으로는 NF-κB 활성 저해제인 피롤리딘 디티오카바메이트(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)를 사용하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산은 TNF-α에 의해 유도된 NF-κB 프로모터 활성을 농도 의존적으로 크게 감소시켰다. 따라서, 로즈마린산이 염증억제 작용을 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 2 : 로즈마린산의 IκBα의 인산화와 분해 억제 효과

로즈마린산이 TNF-α에 의한 NF-κB 프로모터 활성을 억제하는데 있어서, 이러한 로즈마린산의 억제 작용이 NF-κB 프로모터 활성을 억제하는 단백질인 IκBα의 인산화와 분해 유도에 의한 것인지의 여부를 웨스턴 블롯(western blot)으로 관찰하였다.

먼저, 인간 섬유 아세포(human normal fibroblast cell)를 TNF-α(40 ng/㎖)로 처리함과 동시에 상기 제조예에서 제조한 로즈마린산(10, 40 μM)으로 처리하여 30분 동안 인큐베이션 하였다. 30분 후, 세포를 수집하여 용해(lysis)시켰다. 용해된 세포를 SDS-PAGE에 전기영동한 후, 니트로셀룰로오스 막에 이동시킨 다음, Phospho-IκBα와 IκBα에 대한 항체(cell signaling technology)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산은 TNF-α에 의해 유도된 IκBα 인산화와 분해를 농도의존적으로 차단하였다.

실시예 3 : 로즈마린산의 NF -κB 이종 이합체의 핵이동 억제 효과

상기 실시예 2에서 로즈마린산이 TNF-α에 의한 IκBα의 인산화와 분해를 억제함을 확인하였다. 이러한 로즈마린산의 억제 작용이 IκBα의 인산화와 분해단계의 바로 다음 단계에서 발생하는 NF-κB 이종 이합체의 핵 내 이동에도 영향을 미치는지를 웨스턴 블롯으로 관찰하였다.

먼저, 인간 섬유 아세포를 TNF-α(40 ng/㎖)로 처리함과 동시에 상기 제조예에서 제조한 로즈마린산(10, 40 μM)으로 처리하여 30분 동안 인큐베이션 하였다. 30분 후, 세포를 수집한 후 핵층(nuclear fraction)과 세포질층(cytosolic fraction)으로 분리한 후, 핵층과 세포질층에서의 NF-κB p65의 양을 안티-NF-κB p65(Cell signaling technology)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산은 TNF-α에 의해 유도된 NF-κB p65의 핵 내 이동을 농도의존적으로 차단하였다.

실시예 4 : 로즈마린산의 IKK β 활성 억제 효과

실시예 1, 2 및 3에서 로즈마린산이 TNF-α에 의한 NF-κB 활성화를 차단하고 그 메커니즘이 IκBα의 인산화와 분해를 억제하고 이를 통한 NF-κB 이종 이합체의 핵내 이동을 차단함을 알 수 있었다.

실시예 2에서 로즈마린산이 IκBα의 인산화를 차단하였기 때문에, 로즈마린산에 의한 IκBα 인산화 억제효과가 IKKβ의 효소활성을 차단함으로 발생한 것인지를 확인하기 위해, 면역침전법(immunoprecipitation)과 웨스턴 블롯을 수행하였다. 인간 섬유 아세포를 TNF-α(40 ng/㎖)로 처리함과 동시에 상기 제조예에서 제조한 로즈마린산(10, 40 μM)을 처리하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후, 세포를 수집하여 안티-IKKβ 항체를 이용해서 IKKβ에 대한 면역침전을 수행하고, IKKβ에 대한 키나제 어세이(assay)를 수행하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산은 TNF-α에 의해 유도된 IKKβ 활성을 농도 의존적으로 억제하였다. 따라서, 로즈마린산이 염증을 유도하는 NF-κB 신호전달체계에서 IKKβ 활성을 억제하므로써 염증을 억제할 수 있다는 사실을 입증하였다.

실시예 5 : 로즈마린산의 CCL11 , CCR3 , VCAM -1, ICAM -1의 생성 억제 효과

일반적으로 염증성 질환들의 병변에 염증성 사이토킨, 즉 CCL11, VCAM-1, ICAM-1, CCR3 들의 함량이 매우 높다는 사실이 규명되어 염증성 질환의 발병에 중 요한 역할을 한다는 사실이 보고되었다. 또한 이들의 발현에 NF-κB 프로모터가 중요한 역할을 하기 때문에 로즈마린산이 상기의 사이토킨 생성을 억제하는지를 관찰하였다.

결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산은 CCL11, CCR3, VCAM-1 및 ICAM-1의 생성을 모두 억제하였다. 따라서, 본 발명의 로즈마린산은 염증성 질환에 효과적으로 작용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 6 : 피부누적자극 시험

로즈마린산의 인체피부에 대한 안전성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 피부누적자극 시험을 수행하였다.

스쿠알렌을 베이스로 하여 상기 제조예에서 제조한 로즈마린산을 각각 1%, 5%, 10%를 첨가한 제형(크림)을 제조하고, 이를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포를 시행하여 로즈마린산이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.

첩포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부 외용제를 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응 정도를 하기 수학식 1을 이용하여 점수화 하였다.

평균 반응도 = {[(반응지수×반응도) / (총피검자수×최고점수(4점))] × 100} ÷ 검사횟수 (9회)

이때, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균 반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정하였다.

결과는 표 1에 나타내었다.

시험물질	반응이 나타난 피검자 수									평균 반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	4차	5차	6차	7차	8차	9차
	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++
대조군 (스쿠알렌)	2 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
로즈마린산 (1%)	2 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
로즈마린산 (5%)	2 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
로즈마린산 (10%)	2 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
피검인원	30	30	30	30	30	30	30	30	30

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산을 포함하는 피부 외용제의 경우 ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 2명, 0명, 0명이었고, 평균 반응도는 0.18 이었다. 평균 반응도가 3 미만이므로, 로즈마린산은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않는 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.

실시예 7 : 아토피 개선 효과 측정

로즈마린산을 함유한 피부 외용제의 아토피 개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 상기 제제예(로즈마린산 0.1% 함유)에서 제조한 영양크림과 로즈마린산을 함유하지 않은 영양크림(비교 제제예)을 사용하였다.

30명의 소아 아토피 환자를 대상으로 1일 2회, 4주 동안 처리한 후, 아토피의 증상에 대한 로즈마린산의 효과를 측정하였다. 측정시기는 0주, 2주 및 4주 후에 각각 EASI 스코어를 기록하였다. 아토피 개선 효과는 아토피의 전반적인 증상을 나타내는 지수인 EASI(Echzema Area Severity Index) 스코어의 변화를 통해 평가하였다.

결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산을 함유한 피부 외용제를 사용하였을 경우 로즈마린산을 함유하지 않은 피부 외용제(비교 제제예)에 비해 EASI 스코어가 통계적으로 유의하게 감소하였다. 따라서 본 발명의 로즈마린산은 아토피 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

실시예 8 : 로사시아 ( rosacea ) 개선 효과 측정

로즈마린산을 함유한 피부 외용제의 로사시아 개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 상기 제제예(로즈마린산 0.1% 함유)에서 제조한 영양크림을 사용하였다.

30명의 로사시아 환자를 대상으로 1일 2회, 12주 동안 처리한 후, 로사시아의 증상에 대한 로즈마린산의 효과를 측정하였다. 측정시기는 0주와 12주 후에 각각 상기의 항목에 대한 평가를 수행하였다. 로사시아 개선 효과는 로사시아의 전반적인 증상을 나타내는 지수인, 조사자 중심의 전반적인 중증도 평가(investigator global severity), 염증도(inflammatory lesions), 홍반(erythema), 피검자 중심의 개선도 평가(subject global improvement), 안전성 평가(overall tolerance(all subjects) of subjects with good or excellent)에 대한 항목의 평가를 통해 이루어졌다.

결과는 표 2에 나타내었다.

지수	로사시아 증상 개선율 (%)
조사자 중심의 전반적인 중증도 평가	75
염증도	72
홍반	55
피검자 중심의 개선도 평가	62
안전성 평가	76

표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 로즈마린산을 함유한 피부 외용제를 사용하였을 경우 로사시아의 전반적인 증상을 나타내는 지수가 높게 나타났다. 따라서 본 발명의 로즈마린산은 로사시아 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 로즈마린산은 IKKβ 활성을 억제하여 염증유발 신호전달체계인 NF-κB를 차단함으로써, IKKβ에 의해 야기되는 염증성 질환, 특히 로사시아의 증상을 효과적으로 개선시킨다.

Claims (5)

1. 로즈마린산을 포함하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 로즈마린산은 레몬으로부터 추출·분리하여 얻은 것임을 특징으로 하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 로즈마린산은 조성물의 총 중량에 대해 0.001 내지 20.0 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 영양 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 로션, 젤, 에센스, 마사지 크림, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 화장료로 제형화되는 것을 특징으로 하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 연고, 크림, 젤, 피부 유화액, 피부 현탁액, 패치 또는 분무제의 국소제제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 로사시아 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.

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