KR20070091656A

KR20070091656A - 다단계 처리를 수행하기 위한 베슬용 캡 및 다단계 처리방법

Info

Publication number: KR20070091656A
Application number: KR1020077016147A
Authority: KR
Inventors: 로날드 창
Original assignee: 세페이드
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2007-09-11
Also published as: JP2008524987A; CA2588946A1; US20060169708A1; EP1824754A2; CN101437729B; HK1102800A1; CA2588946C; AU2005316296A1; JP5022229B2; EP1824754B1; CN101437729A; WO2006066245A3; EP1824754A4; US20100084402A1; US7621418B2; AU2005316296B2; US8205764B2; WO2006066245A2

Abstract

본 발명의 실시형태는 샘플을 분석하기 위한, 이중 PCR 또는 RT-PCR과 같은 다단계 처리를 수행하기 위한 베슬용 캡을 제공한다. 일 실시형태에서, 캡은 베슬 내부를 에워싸도록 베슬과 결합되게 구성된 본체와, 시약을 수용하기 위한 캡 공동, 및 캡 공동이 에워싸여져 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계 위치와 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치 사이에서 본체에 대하여 조절 가능한 캡 공동 제어부을 포함한다.

중합효소 연쇄반응, 베슬, 캡

Description

다단계 처리를 수행하기 위한 베슬용 캡 및 다단계 처리 방법{CAP FOR VESSEL FOR PERFORMING MULTI-STAGE PROCESS}

본 명세서는 통상적으로 밀폐 환경하에서 하나 이상의 핵산(Nucleic Acid)의 존재에 대해 샘플을 분석하는 시스템 및 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 이러한 분석, 특히 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)과 같은 핵산 증폭 반응을 수행하는데 사용되는 베슬용 캡에 관한 것이다.

핵산 증폭 반응은 많은 연구와, 의학적 그리고 산업적 용도에서 중요하다. 이러한 반응은 예컨대, Current Opinion in Biotechnology 저널에 2001년 vol. 12, pp. 21- 27, Schweitzer 등이 개시한 논문 그리고, Nature Reviews Drug Discovery 저널 2004년 vol.3, pp. 749-761, Koch가 개시한 논문의, 임상 및 생체 연구, 감염성 질병의 검출과 모니터링, 돌연변이의 검출, 표지자(Cancer Markers)의 검출, 환경 모니터링, 유전학적 동정(Genetic Identification), 생체방어 기술에서 병원균의 검출 등에서 사용된다. 특히, 중합효소 연쇄반응(PCR)은, 예컨대 Clin. Microbiol. Infect 저널에 2004년, vol 10, pp.190-212, Mackay가 개시한 논문, Clinical Chemistry 저널에 2002년 vol 48, pp. 1178-1185, Bernard 등이 개시한 논문에서의, 바이러스 및 세균 검출, 바이러스 수치 모니터링, 희박하고 및/또는 배양하기 어려운 병원균의 검출, 생물 테러 위협의 신속한 감지, 암 환자의 미세 잔류암의 검출, 음식물의 병원균, 혈액 공급 심사 등을 포함하는 모든 분야에서의 응용에 근거를 부여한다. 중합효소 연쇄반응에 대한, 이러한 광범위한 사용의 주된 이유는 그 사용의 신속성과 용이성(통상적으로 표준화된 키트와 비교적 단순하고 저가인 기구를 사용하여 단시간 내에 수행됨), 그 민감도(주로 샘플 내 표적 서열의 수십 번의 복제에서 검출될 수 있는 정도), 그리고 그 강도(불량 샘플 또는, 법의학 샘플 또는 고정된 세포 샘플과 같은 보존된 샘플들의 신속한 분석)에 있으며, 이는 1999년, 뉴욕 John Wiley & Sons 출판사에 의해 발행된 Strachan과 Read의 "Human Molecular Genetics 2"에 개시되어 있다.

이와 같은 광범위한 응용에 반영된 핵산 증폭 기술에서의 진전에도, 속도와 민감도에서, 특히 감염성 질병 검출, 미세 잔류 질병의 검출, 생체방어 기술 등과 같은 영역의 속도와 민감도에서 그 이상의 향상이 여전히 요구된다.

중합효소 연쇄반응에 대한 현저한 민감도 개선은 2 단계의 증폭 반응에서 프라이머 2종 세트를 사용함으로써 획득할 수 있고, 이는 예컨대 J. Clin. Microbiol 저널 1999년 vol 28, pp. 1560-1564, Albert 등이 개시한 것이다. 이러한 접근 방법에서, 제1 증폭 반응의 증폭 산물(Amplicon)이 새로운 프라이머 세트를 사용한 제2 증폭 반응용 샘플이 되고, 새로운 프라이머 세트 중 하나 이상이 제1 증폭 산물의 내부 위치에 부착된다. 반면 민감도가 증가함에 따라, 이러한 접근 방법은 증가된 시약의 취급과, 위양성(False Positive)을 야기할 수 있는 서열 오염의 창출 위험의 증가를 겪는다.

또한, 밀폐된 환경 내에서 반응을 수행함으로써 민감도의 현저한 개선과 위양성의 감소가 획득된다. 매우 민감한 증폭 기술의 결점은 위양성 검사 결과의 발생에 있으며, 이는 예컨대 Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 저널에 2004년 vol 23, pp. 289-299, Borst 등이 개시한 바와 같이, 비표적 서열의 부적절한 증폭에 의해 야기된다. 비표적 서열의 존재는 이러한 반응에서의 특이성(specificity)의 부족, 또는 선행 반응으로부터의 오염(즉, 검체간 오염(Carry Over contamination)), 또는 인접 환경, 예컨대, 물, 쓰레기, 시약 등으로부터의 오염에 기인할 수 있다. 이러한 문제들은 밀폐된 베슬 내에서 증폭을 수행함으로써 개선될 수 있으며, 일단 샘플과 시약을 부가하고 베슬을 밀봉한 후에는, 더 이상 시약 또는 생성물의 조작을 가하지 않는다. 반응 혼합물 내 생성물의 양을 계속 보고하는 라벨을 채택한 "실시간" 증폭의 출현에 의해, 이러한 작업이 대부분 가능해질 수 있었다.

이중 중합효소 연쇄반응(nested PCR)과 같은 대부분의 처리들은 차례로 수행되는 두 가지 처리를 포함한다. 예컨대, 통상적인 이중 중합효소 연쇄반응 절차는 두 가지 순차적인 증폭 처리를 사용하고, 연장된 표적 서열을 외측 프라이머와 증폭하는 제1 원형 반응과, 제1 원형 반응의 생성물로부터의 내측 서열을 내측 프라이머와 증폭하는 제2 원형 반응을 포함한다. 이러한 내측 서열은 연장된 서열의 단부 중 하나와 오버랩되거나 오버랩되지 않을 수 있다. 이중 중합효소 연쇄반응의 민감도 향상은 소망하는 반응물의 생성을 허여하도록 제1 및 제2 증폭 처리 동안 반응 조건을 조심스럽게 조절함으로써 획득된다. 불행하게도, 이중 중합효소 연쇄반응 절차에 의해 제공된 높은 민감도는 잠재적인 위양성을 희생함으로써 획득된 것으로서, 고농도의 제1 증폭 산물을 함유하는 반응 튜브가 개방되고 제2 증폭을 설정하도록 조작됨으로써, 오염 기회가 창출되고, 이러한 오염 기회는 위양성 결과의 상당한 원인이 되며, 분석 신뢰성을 감소시킨다.

본 발명의 실시형태는 2단계 중합효소 연쇄반응 처리, 예컨대 이중 중합효소 연쇄반응 처리 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(Rreverse Transcription Polymerase Chain Reaction ; RT-PCR)과 같이 샘플을 분석하기 위해 다단계 반응을 수행하는 베슬용 캡과 방법을 제공한다. 유리하게 캡은, 반응 단계 사이에 외부 환경에 대한 베슬의 개방 또는 베슬 내용물을 노출할 필요 없이 다단계 반응이 수행되도록 하여, 오염 위험성을 현저하게 감소시킨다.

일 양태에 따르면, 본 발명은 베슬 내에서 샘플을 반응시키기 위한 다단계 처리를 제공한다. 베슬은 베슬 내부를 에워싸는(enclose) 캡을 수용하도록 구성된다. 이 캡은 본체와 캡 공동을 포함하고, 이 캡은 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계 위치와 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치 사이에서 조절 가능하다. 본 발명의 방법은 제1 단계 반응을 행하기 위하여 제1 단계 시약과 혼합된 샘플을 베슬 내부에 제공하는 단계, 베슬에 캡의 본체를 결합하는 단계, 베슬 내부에서 샘플과 제1 단계 시약을 이용하여 제1 단계 반응을 행하는 단계를 포함한다. 제1 단계 반응은 제1 단계 위치에서, 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 캡을 이용하여 행해진다. 제1 단계 반응이 행해질 때 캡은 베슬 내부를 에워싼다. 본 발명의 방법은 캡 공동 내에 저장된 제2 단계 시약을 제1 단계 반응의 반응 생성물에 부가하는 단계를 더 포함한다. 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되어 제2 단계 시약을 제1 단계 반응의 반응 생성물과 혼합하는 제2 단계 위치로 캡을 이동함으로써 제2 단계 시약이 부가된다. 따라서 베슬 내부에서 제1 단계 반응의 반응 생성물과 제2 단계 시약을 이용하여 제2 단계 반응이 행해진다. 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로의 전환 동안에, 베슬과 캡에 대하여 밀폐계를 유지함으로써, 오염의 위험성이 감소된다.

일부 실시형태에서, 본체는 막힌 바닥과 개방된 상부를 포함하고, 캡 공동은 본체 내에 배치되고, 막힌 바닥은 베슬 내부를 에워싸고 제1 단계 위치에서 베슬 내부로부터 캡 공동을 유체적으로 분리시킨다. 바람직하게 캡은 상부가 스파이크(spike)에 접속된 스파이크 캡 부분을 포함하고, 캡을 제2 단계 위치로 이동하는 단계는 바람직하게 캡 공동을 베슬 내부와 유체적으로 연통시키기 위해 막힌 바닥을 스파이크를 이용하여 관통하는 단계를 포함한다. 제1 단계 위치에서, 스파이크는 바람직하게 막힌 바닥을 관통하지 않고 캡 공동 내에 배치되고, 스파이크 상부 부분은 캡 공동을 에워싼다. 일부 실시형태에서, 막힌 바닥을 스파이크를 이용하여 관통하는 단계는 캡의 구동 캡 부분의 베어링 면을 스파이크 캡 부분의 상부에 대하여 가압하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 착탈 가능한 스톱은 제1 단계 위치에서 스파이크 캡 부분에 분리 가능하게 결합되고, 착탈 가능한 스톱은 스파이크 캡 부분을 캡 공동에 대하여 위치시켜 스파이크가 제1 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하지 않도록 한다. 착탈 가능한 스톱은, 스파이크가 막힌 바닥을 관통하도록 제2 단계 위치에서 스파이크 캡 부분으로부터 제거된다.

일부 실시형태에서, 본체는 개방 캡 채널을 포함하고, 캡은 어퍼쳐(aperture)를 가진 캡 공동을 갖는 개구된 포켓 부분을 포함하고, 어퍼쳐는 캡 공동 장착 위치에서 베슬 외부로부터의 제2 단계 시약의 도입을 위해 개방된다. 일부 실시형태에서, 개구된 포켓 부분은, 어퍼쳐가 본체의 측면에 의해 에워싸여져, 캡 공동이 제1 단계 위치의 베슬 내부 그리고 베슬 외부로부터 유체적으로 분리되고, 개구된 포켓 부분이 제1 단계 위치의 베슬 내부를 에워쌀 때까지 본체의 개방 캡 채널로 이동된다. 일부 실시형태에서, 캡을 제2 단계 위치로 이동하는 단계는, 어퍼쳐가 제2 단계 위치의 베슬 내부에 노출되고, 개구된 포켓 부분이 제2 단계 위치의 베슬 내부를 에워쌀 때까지, 개구된 포켓 부분을 제1 단계 위치로부터 본체의 개방 캡 채널 내부로 추가로 이동시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 착탈 가능한 스톱은 제1 단계 위치에서 개구된 포켓 부분에 분리 가능하게 결합되고, 착탈 가능한 스톱은 제1 단계 위치에서 베슬 내부에 어퍼쳐가 노출되지 않도록 개방 캡 채널에 대하여 개구된 포켓 부분을 위치시킨다. 착탈 가능한 스톱은 캡을 제2 단계 위치로 이동하기 전에 개구된 포켓 부분으로부터 제거되어, 개구된 포켓 부분의 어퍼쳐가 제2 단계 위치에서 베슬 내부에 노출될 수 있도록 한다.

일부 실시형태에서, 본체는 그 내부에 제1 개구를 가진 제1 바닥벽을 갖는 기저부를 포함하고, 캡은 이 기저부로 삽입되는 삽입부를 더 포함하며, 캡 공동은 이 삽입부 내에 배치되고, 이 삽입부는 그 내부에 제2 개구를 가진 제2 바닥벽을 갖고, 캡을 제2 단계 위치로 이동하는 단계는 기저부에 대하여 삽입부를 회전시켜, 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되게 제1 및 제2 개구를 정렬하는 단계를 포함한다. 이 회전 단계는 바람직하게 삽입부의 상부의 놉을 비틀어 돌리는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베슬용 캡을 제공한다. 캡은 베슬과 결합하여 베슬 내부를 에워싸도록 구성된다. 이 캡은 베슬과 결합하도록 구성된 본체와, 캡 공동, 및 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계 위치와 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치 사이에서 본체에 대하여 조절 가능한 캡 공동 제어부를 포함한다.

일부 실시형태에서, 캡 공동은 본체 내에 배치되고, 본체는 막힌 바닥과 개방된 상부를 포함하고, 막힌 바닥은 제1 단계 위치에서 캡 공동을 베슬 내부로부터 유체적으로 분리시킨다. 바람직하게 캡 공동 제어부는 상부가 스파이크에 접속된 스파이크 캡 부분을 포함하고, 스파이크 캡 부분은 바람직하게 제1 단계 위치에서 스파이크가 막힌 바닥을 관통하지 않게 캡 공동 내에 배치되고, 상부는 캡 공동을 에워싸도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 캡은 본체로부터 상방향으로 연장하는 상부벽을 더 포함하고, 스파이크 캡 부분의 상부는 제1 단계 위치에서 상부벽의 상부 에지와 실질적으로 정렬된다. 바람직하게 상부벽은 제1 단계 위치에서 부분적으로 스파이크 캡 부분을 둘러싸며, 상부벽이 스파이크 캡 부분을 둘러싸지 않는 개구 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 캡은 가요성 스트립과 같은 스파이크 캡 아암을 포함하고, 캡 아암은 스파이크 캡 부분과 개방 영역의 본체 사이를 접속한다. 바람직하게, 캡은 스파이크 캡 부분을 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로 이동시키도록 스파이크 캡 부분의 상부에 대하여 가압되도록 구성된 베어링 면을 가진 구동 캡 부분과, 제2 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하여 캡 공동을 베슬 내부와 유체적으로 연통시키도록 구성된 스파이크를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡은 가요성 스트립과 같은 구동 캡 아암을 더 포함하고, 구동 캡 아암은 구동 캡 부분과 상부벽 사이를 접속한다. 일부 실시형태에서, 캡은 스파이크 캡 부분과 본체 사이를 접속하는 스파이크 캡 아암을 더 포함하고, 이 스파이크 캡 아암과 구동 캡 아암은 통상적으로 서로 대항하게 배치된다.

일부 실시형태에서, 캡은 스파이크 캡 부분에 분리 가능하게 결합된 착탈 가능한 스톱을 더 포함하고, 스파이크가 제1 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하지 않도록 착탈 가능한 스톱이 스파이크 캡 부분을 캡 공동에 대하여 위치시킨다. 착탈 가능한 스톱을 스파이크 캡 부분으로부터 제거하여 스파이크가 제2 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하도록 한다. 일부 실시형태에서, 캡 공동이 베슬 외부로부터 시약을 수용하도록 개방하는 장착 위치에 캡 공동을 위치시키도록, 캡 공동 제어부가 본체에 대하여 추가로 조절 가능하다. 일부 실시형태에서, 캡은 본체의 일측에 결합되는 잠금 부재를 포함하고, 잠금 부재는 본체를 베슬에 고정하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 단계 반응이 베슬 내부에서 수행된 후에 제2 단계 반응이 수행되도록 캡 공동은 제2 단계 시약(예컨대 건조되거나 동결 건조된 형태)을 수용한다.

일부 실시형태에서, 본체는 개방 캡 채널을 포함하고, 캡 공동 제어부는 어퍼쳐를 가진 캡 공동을 갖는 개구된 포켓 부분을 포함한다. 개구된 포켓 부분이 본체의 개방 캡 채널 내부에 부분적으로 삽입됨에 따라, 어퍼쳐는 캡 공동 장착 위치에서 베슬 외부로부터의 시약의 도입을 위해 개방된다. 어퍼쳐가 본체의 일 측면에 의해 에워싸여, 제1 단계 위치에서 캡 공동이 베슬 내부로부터 그리고 베슬 외부로부터 유체적으로 분리될 때까지, 개구된 포켓 부분은 캡 공동 장착 위치로부터 본체의 개방 캡 채널 내부로 추가로 이동 가능하다. 제2 단계 위치에서 어퍼쳐가 베슬 내부에 노출될 때까지, 개구된 포켓 부분은 제1 단계 위치로부터 본체의 개방 캡 채널 내부로 추가로 이동 가능하다. 일부 실시형태에서, 착탈 가능한 스톱은 개구된 포켓 부분에 분리 가능하게 결합되고, 어퍼쳐가 제1 단계 위치에서 베슬 내부에 노출되지 않도록 착탈 가능한 스톱은 개방 캡 채널에 대하여 개구된 포켓 부분을 위치시킨다. 개구된 포켓 부분은 바람직하게 제1 단계 위치 및 제2 단계 위치에서 베슬 내부를 에워싸도록 구성된다.

일부 실시형태에서, 본체는 그 내부에 제1 개구를 가진 제1 바닥벽을 갖는 기저부를 포함하고, 캡 공동 제어부는 이 기저부로 삽입되는 삽입부를 포함하고, 캡 공동은 이 삽입부 내에 배치되며, 삽입부는 그 내부에 제2 개구를 가진 제2 바닥벽을 갖고, 제1 단계 위치에서 제1 및 제2 개구를 오정렬하여 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되도록, 그리고 제2 단계 위치에서 제1 및 제2 개구를 정렬하여 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되도록, 삽입부는 기저부에 대하여 회전 가능하게 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡은 삽입부의 상부에 삽입부를 회전시키기 위한 놉을 더 포함한다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베슬용 캡을 제공한다. 캡은 베슬과 결합하여 베슬 내부를 에워싸도록 구성된다. 캡은 베슬과 결합하도록 구성된 본체와, 캡 공동, 그리고 캡 공동이 에워 싸여 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계 위치로부터 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치로 캡을 전환하기 위한 제어 수단을 포함한다. 캡은 바람직하게 제1 단계 위치 및 제2 단계 위치에서 베슬 내부를 에워싸는 수단을 더 포함한다.

일부 실시형태에서, 본체는 막힌 바닥과 개방된 상부를 포함하고, 캡 공동은 본체 내에 배치된다. 바람직하게 제어 수단은 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로 이동 가능하며, 막힌 바닥을 관통하여 캡 공동을 베슬 내부와 유체적으로 관통시키는 스파이크를 포함한다. 바람직하게 캡은, 또한 캡 공동이 베슬 외부로부터의 시약을 수용하도록 개방되는 장착 위치로 전환 가능하다. 일부 실시형태에서, 캡 공동은 제1 단계 반응이 베슬 내부에서 수행된 후에 제2 단계 반응이 수행되도록 제2 단계 시약(예컨대, 건조된 또는 동결 건조된 시약)을 수용한다.

일부 실시형태에서, 본체는 개방 캡 채널을 포함하고, 제어 수단은 어퍼쳐를 가진 캡 공동을 갖는 개구된 포켓 부분을 포함한다. 어퍼쳐가 본체의 일 측면에 의해 에워싸여, 제1 단계 위치에서 캡 공동이 베슬 내부로부터 그리고 베슬 외부로부터 유체적으로 분리될 때까지, 개구된 포켓 부분은 본체의 개방 캡 채널 내부로 추가로 이동 가능하다. 제2 단계 위치에서 어퍼쳐가 베슬 내부에 노출될 때까지, 개구된 포켓 부분은 제1 단계 위치로부터 본체의 개방 캡 채널 내부로 추가로 이동 가능하다. 일부 실시형태에서, 착탈 가능한 스톱은 개구된 포켓 부분에 분리 가능하게 결합되고, 어퍼쳐가 제1 단계 위치에서 베슬 내부에 노출되지 않도록 착탈 가능한 스톱은 개방 캡 채널에 대하여 개구된 포켓 부분을 위치시킨다. 개구된 포켓 부분은 바람직하게 제1 단계 위치 및 제2 단계 위치에서 베슬 내부를 에워싸도록 구성된다.

일부 실시형태에서, 본체는 그 내부에 제1 개구를 가진 제1 바닥벽을 갖는 기저부를 포함하고, 제어 수단은 이 기저부로 삽입되는 삽입부를 포함하고, 캡 공동은 이 삽입부 내에 배치되며, 이 삽입부는 그 내부에 제2 개구를 가진 제2 바닥벽을 갖고, 제1 단계 위치에서 제1 및 제2 개구를 오정렬하여 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되도록, 그리고 제2 단계 위치에서 제1 및 제2 개구를 정렬하여 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되도록, 삽입부는 기저부에 대하여 회전 가능하게 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡은 삽입부의 상부에 삽입부를 회전시키기 위한 놉을 더 포함한다.

본 발명은 공동으로 양도되고, "Closed-System Multi-Stage Nucleic Acid Amplification Reactions" 라는 명칭으로 2004년 10월 27일 동시계속 출원된 미국 특허출원번호 제60/622,393호에 기재된 것과 같은 밀폐계 다단계 핵산 증폭 반응에 특히 유용하며, 본건의 전체 내용은 본 명세서에 참고로서 통합되어 있다.

본 명세서에서 사용된 것과 같은, "중합효소 연쇄반응" 또는 "PCR"은 DNA의 대응 가닥에 동시에 존재하는 프라이머의 연장에 의해 특정 DNA 서열의 비트로 증폭을 위한(Vitro Amplification)을 위한 반응을 의미한다. 즉, PCR은 프라이머 바인딩 영역(Primer Binding Sites)에 접하는 표적 핵산의 다중 복사 또는 복제를 위한 반응이며, 이러한 반응은 다음 단계로 이루어진 한번 이상의 복제를 포함한다. 이는 (i) 표적 핵산을 변성시키는 단계, (ii) 프라이머들을 프라이머 바인딩 영역에 어닐링하는 단계, 및 (iii) 뉴클레오시드 3인산(Nucleoside triphosphate/NTP)의 앞에서 핵산 중합효소에 의해 프라이머를 연장하는 단계를 포함한다. 통상적으로, 열 순환 기구에서 각 단계에 최적화된 상이한 온도를 통하여 반응이 순환된다. 특정 온도에서, 각 단계에서의 지속 시간 및 각 단계 사이의 변성율은 당업계의 당업자에게 잘 알려진 여러 인자, 예컨대 참조, McPherson 등의 "PCR: A Practical Approach" 및 "PCR2: A Practical Approach"라는 명칭의 저서(IRL Press, Oxford, 각각 1991년 및 1995년 발행)에 의해 예시된 것에 좌우된다. 예컨대, 내열성 DNA 중합효소(Taq DNA Polymerase)를 이용하는 통상적인 PCR에서, 이중나선 표적 핵산은 온도〉90℃에서 변성될 수 있고, 프라이머는 50-75℃의 온도 범위에서 어닐링되고, 프라이머는 72-78℃ 온도 범위에서 연장될 수 있다. 용어, "PCR"은 반응의 파생 형상을 포함하고, RT-PCR, 실시간 PCR, 이중 PCR(nested PCR), 정량 PCR(Quantitative PCR), 다중 PCR 등을 포함하지만 이에 한정된 것은 아니다. 반응 체적은 수백 나노리터, 예컨대, 200 nL로부터 수백 μＬ 예컨대, 200 μＬ의 범위에 이른다. "역전사 PCR" 또는 "RT-PCR,"은 표적 RNA를 단일 대응 가닥 DNA로 전환한 후 증폭되는 역전사 반응에 의해 진행되는 PCR을 의미하며, 이는 예컨대, Tecott 등에 허여된 미국특허번호 제5,168,038호에 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다. "실시간 PCR"은 반응 생성물의 양, 즉 증폭 산물이 반응 진행에 따라 모니터링되는 PCR을 의미한다. 많은 형태의 실시간 PCR이 존재하는데, 예컨대, Gelfand 등에 허여된 미국특허번호 제5,210,015호 ("택맨(taqman)"), Wittwer 등에 허여된 미국특허번호 제6,174,670호 및 제6,569,627호(삽입 색소(intercalating dyes)), Tyagi 등에 허여된 미국특허번호 제5,925,517호(분자 비콘(molecular beacons))에서는 반응 생성물을 모니터링하기 위해 사용된 검출 화학이 주로 상이하며, 이들 특허는 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다. Nucleic Acids Research 저널 2002년 vol. 30, pp. 1292-1305, Mackay 등의 논문도 실시간 PCR용 검사 화학을 검토했으며, 이는 또한 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다. "이중 PCR"은, 제1 PCR의 증폭 산물이 새로운 세트의 프라이머를 사용하는 제2 PCR용 샘플이 되고, 새로운 세트의 프라이머 중 하나 이상이 제1 증폭 산물의 내부 위치에 부착하는 2단계 PCR을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이중 증폭 반응에 대한 "초기 프라이머"는 제1 증폭 산물을 생성하는데 사용되는 프라이머를 의미하고, "제2 프라이머"는 제2 또는 이중 증폭 산물을 생성하는데 사용되는 하나 이상의 프라이머를 의미한다. "다중 PCR"은 예컨대, Bernard 등의 "2색 실시간 PCR(two-color real-time PCR)"라는 명칭으로 Anal. Biochem.저널에 1999년 vol. 273, pp.221-228에 기재된 논문과 같이, 다중 표적 서열(단일 표적 서열과 하나 이상의 참조 서열)이 동일한 반응 혼합물 내에서 동시에 수행되는 PCR을 의미한다. 대개, 개별 세트의 프라이머들은 증폭되는 각 서열을 위해 채용된다. 통상적으로, 다중 PCR 내에서 표적 서열의 수는 2 내지 10의 범위 또는 2 내지 6의 범위, 좀 더 의례적으로는 2 내지 4의 범위 내에 있다. "정량 PCR(Quantitative PCR)"은 샘플 또는 견본 내 하나 이상의 특정 표적 서열의 존재비(abundance)를 측정하도록 형성된 PCR을 의미한다. 정량 PCR은 그러한 표적 서열의 절대적인 양과 상대적인 양을 모두 포함한다. 정량 측정은 하나 이상의 참조 서열을 이용하여 이루어지고, 이 참조 서열은 표적 서열과 개별적으로 또는 함께 분석될 수 있다. 참조 서열은 샘플 또는 견본에 내인성(endogenous) 또는 외인성(exogenous)이 되며, 후자의 경우 참조 서열은 하나 이상의 경쟁 주형(template)을 포함할 수 있다. 통상적인 내인성 참조 서열은 다음 유전 인자, β-액틴, GAPDH, β2-microglobulin, 리보솜 RNA(ribosomal RNA) 등의 전사의 세그먼트를 포함한다. 정량 PCR용 기술은 본 명세서에 참조로서 통합된 다음 참조, Biotechniques 저널에 1999년, vol. 26, pp. 112-126 Freeman 등의 논문, Nucleic Acids Research 저널 1989년, vol. 17, pp. 9437-9447, Becker-Andre 등의 논문, Biotechniques 저널 1996년 vol. 21, pp. 268-279, Zimmerman 등의 논문, Gene 저널 1992년 vol. 122, pp. 3013-3020, Diviacco 등의 논문, Nucleic Acids Research 저널 1989년 vol. 17, pp. 9437-9446, Becker-Andre 등의 논문 등에서 예시된 것과 같이, 당업계의 당업자에게 잘 공지되어 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따라 스파이크 캡 부분과 구동 캡 부분을 갖는, 개방 위치의 캡의 상부 사시도이고,

도 2는 도 1의 캡의 하부 사시도이며,

도 3은 도 1의 캡의 단면도이고,

도 4는 제1 단계 위치에서의, 도 1의 캡의 단면도이며,

도 5는 제2 단계 위치에서의, 도 1의 캡의 단면도이고,

도 6은 캡 배치 이전에 베슬 내부로의 제1 액상 시약의 도입을 도시하는 베슬의 사시도이며,

도 7은 캡의 캡 공동으로의 제2 액상 시약의 도입을 도시하고, 도 1의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 사시도이며,

도 8은 제1 단계 위치에서 캡의 스파이크 캡 부분에 의한 캡 공동의 밀폐를 도시하고, 도 1의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 사시도이고,

도 9는 제2 단계 위치에서 구동 캡 부분을 밀폐함으로써 캡 공동으로부터 베슬 내부로의 제2 액상 시약의 이송을 도시하고, 도 1의 캡이 에워싸여진 베슬의 사시도이며,

도 10은 도 8에서 보여진 것과 같이 제1 단계 위치에서 캡이 에워싸여진 베슬의 단면도이고,

도 11은 도 9에서 보여진 것과 같이 제2 단계 위치에서 캡에 의해 에워싸인 베슬의 단면도이며,

도 12는 본 발명의 또 다른 실시형태에 따라 스파이크 캡 부분과 착탈 가능한 스톱을 갖는 개방 위치에서의 캡의 상부 사시도이고,

도 13은 도 12의 캡의 단면도이며,

도 14는 캡의 캡 공동으로의 제2 액상 시약의 도입을 도시하고, 도 12의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 사시도이며,

도 15는 착탈 가능한 스톱에 의해 제1 단계 위치에 지지되는 캡의 스파이크 캡 부분에 의한 캡 공동의 밀폐를 도시하고, 도 12의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 사시도이고,

도 16은 착탈 가능한 스톱을 제거하고 스파이크 캡 부분을 제2 단계 위치로 가압함으로써 캡 공동으로부터 베슬 내부로의 제2 액상 시약의 이송을 도시하고, 도 12의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 사시도이며,

도 17은 도 15에서 도시된 것과 같이 제1 단계 위치에서 캡에 의해 에워싸인 베슬의 단면도이고,

도 18은 도 16에서 도시된 것과 같이 제2 단계 위치에서 캡에 의해 에워싸인 베슬의 단면도이며,

도 19는 본 발명의 또 다른 실시형태에 따라 개방 위치에 개구된 포켓을 갖는 캡의 단면도이고,

도 20은 포켓 장착 위치의 개구된 포켓으로의 제2 액상 시약의 도입을 도시하고, 도 19의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 단면도이고,

도 21은 착탈 가능한 스톱에 의해 지지되어 제1 단계 위치에서 개구된 포켓의 밀폐를 도시하고, 도 19의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 단면도이며,

도 22는 착탈 가능한 스톱을 제거하고 개구된 포켓 부분을 제2 단계 위치로 가압함으로써 개구된 포켓으로부터 베슬 내부로의 제2 액상 시약의 이송을 도시하고, 도 19의 캡에 의해 에워싸인 베슬의 단면도이고,

도 23은 본 발명의 또 다른 실시형태에 따라 베슬용 캡의 분해 사시도이며,

도 24는 도 23의 캡 및 베슬의 전방에서 본 분해 정면도이다.

도 1 내지 도 5는 본 발명의 제1 실시형태에 따른 캡(10)을 나타낸다. 캡(10)은 핵산 분석 장치에 부가되는 기능성과 성능에 따라 부스터 캡으로서 언급될 수 있다. 캡(10)은, 캡 공동(16) 역할을 하는 본체 공동을 형성하도록 막힌 바닥(14)을 갖는 본체(12)를 포함한다. 캡 공동(16)은 시약을 수용하기 위한 컨테이너이다. 시약은 액체 형태(예를 들어 수용액), 또는 건조되거나 동결 건조된 형태(예를 들어, 동결 건조된 비드의 형태)일 수 있다. 잠금 부재(18)는 본체(12)의 측면에 배치되고, 본체(12)의 일 측면으로부터 외측으로 이격되는 후크 또는 그런 종류의 다른 것으로 형성될 수 있다. 스파이크 캡 부분(20)은 스파이크 캡 아암(22)에 의해 본체(12)에 접속된다. 스파이크 캡 부분(20)은 막힌 상부(24)와, 날카로운 원단을 가진 스파이크(26)를 포함한다. 스파이크 캡 아암(22)은 가요성 스트립으로서, 스파이크 캡 부분(20)이 도 1의 개방 위치와 도 4 및 도 5의 위치 사이에서 이동되게 한다. 구동 캡 부분(30)은 구동 캡 아암(32)에 의해 본체(12)에 접속되고, 베어링 면(34)을 갖는다. 구동 캡 아암(32)은 가요성 스트립으로서, 구동 캡 부분(30)이 도 1의 개방 위치와 도 5의 제2 단계 위치 사이에서 이동되게 한다. 스파이크 캡 아암(22)과 구동 캡 아암(32)은 임의의 적합한 방식으로 본체(12)에 접속될 수 있다. 도시된 구성에 있어서, 스파이크 캡 아암(22)은 본체(12)의 상부 단에 접속되고, 구동 캡 아암(32)은 본체(12)의 상부 단으로부터 상방향으로 연장하는 상부벽(36)에 접속된다. 스파이크 캡 아암(22)이 본체(12)에 접속되는 영역에서 상부벽(36)은 바람직하게 개방한다. 구동 캡 아암(32)은 통상 적으로 스파이크 캡 아암(22)으로부터 반대방향으로 배치되나, 다른 실시형태에서는 아암의 방향성이 달라질 수 있다.

도 6 내지 도 9는, 밀폐 환경하에서 하나 이상의 핵산의 존재를 얻기 위하여 샘플을 분석하는 다단계 반응, 특히 이중 PCR, RT-PCR 등을 포함하는 중합효소 연쇄반응(PCR)과 같은 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 캡(10)의 사용을 도시한다. 대개, 본 발명의 캡은, 베슬 내부(예를 들어, 반응 챔버)와, 샘플 및 시약을 베슬 내부로 부가하기 위한 개구(예를 들어, 포트)를 갖는 임의 종류의 베슬과 함께 사용하도록 구성될 수 있다. 본 발명의 방법 및 캡에 적합한, 다양한 반응 베슬(예를 들어, 테스트 튜브, 반응 튜브, 카트리지, 유리 모세관, 플라스틱 베슬 등)이 당업계에 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하다. 도시된 특정 실시형태에서, 베슬(50)은 본 명세서에 참조로서 통합되고, "다중 채널 광학 검사 시스템" 라는 명칭으로 공동으로 허여된 미국특허번호 제6,369,893호에 개시된 반응 베슬이다. 당업계에 공지되고 및/또는 상업적으로 이용가능하며, 본 발명의 캡 및 방법에 적합한 많은 다른 형태의 반응 베슬이 존재하며, 본 발명의 범주는 도시된 특정 베슬에 한정되지 않는 것은 물론이다. 캡은 베슬 내부를 에워싸게 베슬에 결합되어, 베슬 내부가 다단계 반응 동안에 베슬의 외부 환경과 차단된 상태로 남아있도록 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 캡(10)은 베슬의 일부 내에 삽입되도록 구성된 본체를 갖는다. 그러나, 본 발명의 캡 및 방법이 이러한 바람직한 실시형태로만 한정되지 않는 것은 말할 것도 없다. 캡이 베슬 내부를 에워싸도록 베슬에 결합될 수 있는 많은 다른 방법이 존재하고, 이는 다음 실시형태를 포함하나, 이에 한정되지 는 않는다. 캡은 베슬 상에 또는 그 내부에 스크류 결합될 수 있다. 캡은 베슬 내에, 그 상부에, 또는 베슬 상에 억지 끼워 넣어지도록 가압될 수 있다. 캡은 베슬 상에, 그 내부에 스냅 결합되거나 또는 베슬과 동평면을 이룰 수 있다. 캡은 베슬에 부착되거나, 달라붙어 있거나, 그 상에 용해되거나 또는 베슬 내부에 용해될 수 있다.

도 6에서, 베슬(50)은 그 내부 방향으로의 개구 또는 포트(52)와, 캡(10)의 잠금 부재(18)와 결합하도록 구성된 레지(ledge) 또는 핀(54)을 갖는다. 다단계 반응에서 분석될 샘플이 튜브(58), 시린지, 피펫 등에 의해 포트(52)를 매개로 베슬 내부로 도입된다. 샘플은 다단계 반응 중 제1 단계를 수행하도록 베슬 내부에 위치되기 전에 제1 단계 시약과 혼합될 수 있으며, 또는 샘플은 베슬 내부에서 제1 단계 시약과 혼합될 수 있다. 예컨대, 제1 단계 시약은 베슬 내부에 액상으로, 건조되거나 또는 동결 건조된 형태로 저장될 수 있으며, 샘플을 베슬 내부에서 시약에 부가하고 혼합하는데 단지 하나의 형태를 요구한다. 어느 경우에서도, 제1 단계 시약은 샘플과의 의도된 제1 단계 반응을 수행하기에 충분해야만 한다. 예를 들어, 다단계 반응이 이중 PCR인 경우, 제1 단계 시약은 제1 PCR을 수행하는데 필요한 엔자임과 프라이머를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 의도된 다단계 반응이 RT-PCR인 경우, 제1 단계 시약은 역전사를 수행하기에 충분하다. 따라서, 포트(52)는 도 7에서 도시된 것과 같이 베슬 내부에 밀폐계가 제공되도록 캡(10)에 의해 밀폐된다. 바람직하게, 캡(10)의 잠금 부재(18)는 베슬(50)의 핀(54)과 결합하여, 캡(10)을 베슬(50)에 체결한다. 이는 베슬(50)의 포트(52)와 결합하도록 캡(10)을 가압하고, 오프셋 위치(예컨대, 90°오프셋으로)에 잠금 부재(18)와 핀(54)을 위치시킨 다음, 잠금 부재(18) 및 핀(54)이 서로 결합할 때까지 캡(10)을 비틀어 돌림으로써 행해질 수 있다. 선택적으로, 정지부는 캡 공동(16) 내에 위치되고, 캡(10)이 베슬(50)과 결합된 후에는 캡 공동(16)을 노출하도록 제거된다. 도 7에서 도시된 바와 같이, 다단계 반응 중 제2 단계를 행하기 위한 제2 단계 시약은 베슬(50) 외부로부터 캡(10)의 캡 공동(16) 내부로 도입되고, 캡 공동은 캡 공동 장착 위치에 있다. 별도의 실시형태에서, 제2 단계 시약이 제조 시에 캡 공동(16) 내에 위치되므로, 시약이 선 적재된 상태이기 때문에, 사용자는 시약을 캡 공동(16) 내부로 적재하는 단계를 건너뛸 수 있다. 어느 경우에서든, 제2 단계 시약은 제1 단계 반응의 반응 생성물과의 의도된 제2 단계 반응을 형성하기에 충분해야만 한다. 예컨대, 다단계 반응이 이중 PCR인 경우, 제2 단계 시약은 이중 핵산 서열을 증폭하는데 필요한 엔자임과 프라이머를 포함한다. 또 다른 실시예와 같이, 의도된 다단계 반응이 RT-PCR인 경우, 제2 단계 시약은 제1 단계의 역전사 반응에서 생성된 DNA의 PCR 증폭을 수행하기에 충분하다. 제2 단계 시약은 액상으로, 탈수 건조되거나(dried down) 또는 동결 건조된 형태일 수 있다. 시약이 건조되거나 또는 동결 건조된 형태인 경우, 최종 사용자는 버퍼(예를 들어, 물)를 캡 공동(16)에 부가하여, 시약을 복원할 수 있다. 도 8에서, 스파이크 캡 부분(20)의 스파이크(26)는 캡 공동(16) 내부로 가압되어, 제1 단계 위치에서 캡 공동(16)을 밀폐한다. 제1 단계 위치에서, 스파이크 캡 부분(20)의 상부(24)는 통상적으로 상부벽(36)의 상부 에지와 정렬된다. 상부벽(36)은 부분적으로, 바람직하게 둘레의 절반 이상(즉, 180°이상)에 의해, 스파이크 캡 부분(20)을 에워싼다. 상부벽(36)은, 스파이크(26)가 막힌 바닥(14)을 관통하지 않는 그러한 위치에서 스파이크 캡 부분(20)의 상부(24)를 배치하는 높이를 갖는다.

도 9에서, 구동 캡 부분(30)의 베어링 면(34)은 스파이크 캡 부분(20)의 막힌 상부(24)와 접촉하도록 위치되어, 스파이크(26)를 막힌 바닥(14)을 통하여 베슬 내부로 가압하고, 제2 액상 시약을 제2 단계 위치 내 베슬 내부로 도입한다. 구동 캡 부분(30)은, 스파이크가 막힌 바닥(14)을 관통하는 제2 단계 위치로 스파이크 캡 부분(20)을 배치하는 높이는 갖는다. 스파이크 캡 아암(22)과 면하는 영역 내에서 상부벽이 개구하기 때문에, 바람직하게 상부벽(36)은 스파이크 캡 부분(20)과 스파이크 캡 아암(22)의 하향이동을 간섭하지 않는다. 스파이크 캡 부분(20)은 도 7의 캡 공동 장착 위치, 도 8의 제1 단계 위치 및 도 9의 제2 단계 위치 사이에서 본체(12)에 대하여 이동 가능하다.

도 10은 도 8에서 보여지는 것과 같이 제1 단계 위치에서 캡(10)에 의해 에워싸인 베슬(50)의 단면도이다. 스파이크 캡 부분(20)의 스파이크(26)는 캡 공동(16) 내에 배치되고, 이는 막힌 바닥(14)에 의해 베슬 내부(60)로부터 유체적으로 분리된다. 제1 단계 위치에서, 베슬(50)은 제1 시약과 샘플 사이의 제1 단계 반응, 밀폐된 베슬 내부(60)에서의 제1 단계 PCR 반응 또는 RT 반응과 같은 반응을 형성하는데 사용될 수 있다. 베슬에서 필수 반응 온도를 제어하기 위한 온도 제어 시스템 또는 열 순환기가 당업계에 잘 공지되어 있다.

도 11은 도 9에서 보여지는 것과 같이 제2 단계 위치에서 캡(10)에 의해 에 워싸인 베슬(50)의 단면도이다. 날카로운 스파이크(26)의 원단이 본체(12)의 막힌 바닥(14)을 관통하거나 부수고, 베슬 내부(60)로 진입한다. 이는 제2 단계 위치에서 베슬 내부(50)에 제2 단계 시약을 방출한다. 베슬(50)은, 제2 단계 시약과 베슬 내부(60)의 제1 단계 반응의 반응 생성물을 혼합하기 위하여 스피너 또는 원심 장비 내에 통상적으로 위치된다. 따라서, 베슬(50)은, 베슬(50)을 온도 제어 시스템(예를 들어, 열 순환기)에 결합함으로써 밀폐된 베슬 내부(50)에서 제2 단계 PCR 반응과 같은 제2 단계 반응을 형성하는데 사용될 수 있다. 베슬 내부(60)는 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로의 전환 동안 밀폐계를 유지하므로 오염 문제는 없다.

도 12 및 도 13에서 도시된 것과 같은 또 다른 실시형태에서, 캡(110)은 막힌 바닥(114)과, 캡 공동(116) 역할을 하는 본체 공동을 갖는 본체(112)를 포함한다. 본 실시형태는 잠금 부재를 도시하지 않지만 하나가 제공될 수 있다. 스파이크 캡 부분(120)이 스파이크 캡 아암(122)에 의해 본체(112)에 접속된다. 스파이크 캡 부분(120)은 막힌 상부(124)와, 날카로운 원단을 가진 스파이크(126)을 포함한다. 스파이크 캡 아암(122)은 가요성 스트립으로서, 스파이크 캡 부분(120)이 도 14의 개방 위치와 도 15 및 도 16의 위치 사이에서 이동되게 한다. 스파이크 캡 아암(122)은 임의의 적합한 방법으로 본체(112)에 접속될 수 있다. 도시된 구성에 있어서, 스파이크 캡 아암(122)은 본체(112)의 상부 단에 접속된다. 착탈 가능한 스톱 또는 클립(130)은 커플링 부분(132) 및 스톱 부분(134)을 포함한다. 커플링 부분(132)은 스파이크 캡 부분(120)과 착탈 가능한 가능하게 결합된다. 도시 된 실시형태에서, 커플링 부분(132)은 클립이지만, 다른 실시형태에서 다른 착탈 가능한 가능한 커플링 매커니즘이 사용될 수 있다.

도 14 내지 도 16은 밀폐 환경하에서 하나 이상의 핵산의 존재를 얻기 위하여 샘플을 분석하도록 2 단계 처리를 수행하기 위한 캡(110)의 사용을 도시한다. 도 6에서 베슬(50)을 다시 참조하여, 다단계 반응으로 분석될 샘플이 튜브(58), 시린지, 피펫 등에 의해 포트(52)를 매개로 베슬 내부로 도입된다. 샘플은 다단계 반응 중 제1 단계를 수행하도록 베슬 내부에 위치되기 전에 제1 단계 시약과 혼합될 수 있으며, 또는 샘플은 베슬 내부에서 제1 단계 시약과 혼합될 수 있다. 따라서, 포트(52)는 도 14에서 도시된 것과 같이, 베슬 내부(60)에 밀폐계를 제공하도록 캡(110)에 의해 밀폐된다. 이러한 캡 공동 장착 위치에서, 제2 단계 시약이 베슬(50) 외부로부터 캡 공동(116)으로 도입된다. 도 15에서, 스파이크 캡 부분(120)의 스파이크(126)는 캡 공동(116) 내부로 가압되어 제1 단계 위치에서 캡 공동(116)을 밀폐한다. 착탈 가능한 스톱(130)은 스파이크 캡 부분(120)의 막힌 상부를 캡(110)의 본체(112)로부터 이격시켜, 스파이크 캡 부분(120)이 막힌 바닥(114)을 관통하는 것을 방지한다. 착탈 가능한 스톱(130)은 스파이크 캡 부분(120)을 위치시키는 편리하고 안전한 방법을 제공하여, 제1 단계 위치를 획득한다. 사용자가 스파이크 캡 부분(120)을 제1 단계 위치에 위치시켜 착탈 가능한 스톱(130)을 사용하지 않고 막힌 바닥(114)을 관통하는 것을 피할 수 있는 경우, 착탈 가능한 스톱(130)은 생략될 수 있다. 도 16에서, 착탈 가능한 스톱(130)이 스파이크 캡 부분(120)으로부터 제거되고, 스파이크 캡 부분(120)이 제1 단계 위치로 부터 제2 단계 위치인, 베슬 내부(60)로 추가로 이동된다. 제2 단계 위치에서, 스파이크(126)는 막힌 바닥(114)을 통해 베슬 내부(60)로 가압 되고, 제 2 단계 시약을 베슬 내부(60)에 방출한다. 스파이크 캡 부분(120)은 도 14의 캡 공동 장착 위치, 도 15의 제1 단계 위치 및 도 16의 제2 단계 위치 사이에서 본체(112)에 대하여 이동 가능하다.

도 17은 도 15에서 도시된 것과 같이 제1 단계 위치에서 캡(110)에 의해 에워싸인 제1 베슬(50)의 단면도이다. 스파이크 캡 부분(120)의 스파이크(126)는 캡 공동(116) 내에 배치되고, 막힌 바닥(114)에 의해 베슬 내부(60)로부터 유체적으로 분리된다. 제1 단계 위치에서, 베슬(50)은, 베슬(50)을 온도 제어 시스템에 결합함으로써, 제1 액상 시약과 샘플사이의, 밀폐된 베슬 내부(60) 에서의 제1 단계 PCR 반응과 같은 제1 반응을 형성하는데 사용될 수 있다.

도 18은 도 16에서 보여지는 것과 같이 제2 단계 위치에서 캡(110)에 의해 에워싸인 베슬(50)의 단면도이다. 날카로운 스파이크(126)의 원단은 본체(112)의 막힌 바닥(114)을 뚫고, 베슬 내부(60)로 진입한다. 이는 제2 단계 시약을 제2 단계 위치의 베슬 내부(50)에 방출한다. 베슬(50)은, 제2 단계 시약과 베슬 내부(60)의 제1 단계 반응의 반응 생성물을 혼합하기 위하여 스피너 또는 원심 장비 내에 통상적으로 위치된다. 따라서, 베슬(50)은, 베슬(50)을 온도 제어 시스템(예를 들어, 열 순환기)에 결합함으로써 밀폐된 베슬 내부(50)에서의 제2 단계 PCR 반응과 같은 제2 단계 반응을 형성하는데 사용될 수 있다. 베슬 내부(60)는 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로의 전환 동안 밀폐계를 유지한다.

도 19에서 도시된 바와 같은 또 다른 실시형태에서, 캡(210)은 개방 캡 채널(216)을 가진 본체(212)를 포함한다. 본 실시형태는 잠금 부재를 도시하지 않지만 하나가 제공될 수 있다. 개구된 포켓 부분(220)이 포켓 아암(222)에 의해 본체(212)에 접속된다. 개구된 포켓 부분(220)은 막힌 상부(224)와, 유체가 개구된 포켓(226)의 안팎으로 이송될 수 있도록 일측으로 개방된 어퍼쳐(228)를 가진 개구된 포켓(226)을 포함한다. 이 실시형태에서 개구된 포켓(226)은 캡 공동으로서 역할한다. 포켓 아암(222)은 가요성 스트립으로서, 개구된 포켓 부분(220)이 도 19의 개방 위치와 도 20 내지 도 22의 위치 사이에서 이동되게 한다. 포켓 아암(222)은 임의의 적합한 방법으로 본체(212)에 접속될 수 있다. 도시된 구성에 있어서, 포켓 아암(222)은 본체(212)의 상부 단에 접속된다. 착탈 가능한 스톱 또는 클립(230)은 도 12에서 도시된 착탈 가능한 스톱(130)과 유사하고, 커플링 부분(232) 및 스톱 부분(234)을 포함한다. 커플링 부분(232)은 개구된 포켓 부분(220)과 분리 가능하게 결합된다.

도 20 내지 도 22는 밀폐 환경하에서 하나 이상의 핵산의 존재를 얻기 위하여 샘플을 분석하도록 2 단계 처리를 수행하기 위한 캡(210)의 사용을 도시한다. 도 6에서 베슬(50)을 다시 참조하여, 다단계 반응으로 분석될 샘플이 튜브(58), 시린지, 피펫 등에 의해 포트(52)를 매개로 베슬 내부로 도입된다. 샘플은 다단계 반응 중 제1 단계를 수행하도록 베슬 내부에 위치되기 전에 제1 단계 시약과 혼합될 수 있으며, 또는 샘플은 베슬 내부에서 제1 단계 시약과 혼합될 수 있다. 따라서, 포트(52)는 도 20에서 보여지는 것과 같이, 베슬 내부에 밀폐계를 제공하도록 캡(10)에 의해 밀폐된다. 도 20의 포켓 또는 캡 공동 장착 위치에서, 어퍼쳐(228)가 노출되어, 제2 단계 시약이 베슬(50) 외측으로부터 포켓(226) 내부로 도입된다. 캡 공동에서와 같이, 포켓(226)은 제2 단계 시약을 수용하여 시약이 어퍼쳐(228)를 통해 쏟아지지 않도록 어퍼쳐(228) 보다 깊은 깊이를 갖는다.

도 21에서, 개구된 포켓 부분(220)은 캡 채널(216) 내부로 좀 더 가압된다. 캡 채널(216)의 측면이 어퍼쳐(228)를 밀폐하여, 포켓(226)이 제1 단계 위치에서 외부로부터 그리고 베슬 내부(60)로부터 유체적으로 분리된다. 착탈 가능한 스톱(230)은 개구된 포켓 부분(220)의 막힌 상부(224)를 캡(210)의 본체(212)로부터 이격시켜, 개구된 포켓 부분(220)이 베슬 내부(60)로 너무 많이 이동하는 것을 방지한다. 사용자가 개구된 포켓 부분(220)을 제1 단계 위치에 위치시켜, 착탈 가능한 스톱(130)을 사용하지 않고도 베슬 내부(60)로 너무 많이 이동하는 것을 방지한 경우, 착탈 가능한 스톱(230)은 생략될 수 있다.

도 22에서, 착탈 가능한 스톱(230)은 개구된 포켓 부분(220)으로부터 제거되고, 개구된 포켓 부분(220)은 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치인 베슬 내부(60)로 추가로 이동된다. 제2 단계 위치에서, 어퍼쳐(228)는 캡 채널(216)의 측면에 의해 더 이상 밀폐되지 않지만, 어퍼쳐(228)가 베슬 내부(60)의 측면으로부터 이격되어 있기 때문에 베슬 내부(60)로 노출된다. 이는 제2 단계 시약이 베슬 내부(60)로 도입되도록 한다. 도 21의 제1 단계 위치에서, 베슬(50)은 제1 액상 시약과 샘플 사이의, 밀폐된 베슬 내부(60)에서의 제1 단계 PCR 반응과 같은 제1 반응을 형성하는데 사용될 수 있다. 제2 단계 위치에서, 베슬(50)은 제2 단계 시약 을 베슬 내부(60)의 제1 단계 반응의 반응 생성물과 혼합하도록 원심 기구 내에 위치되어, 밀폐된 베슬 내부(60)에서의 제2 단계 PCR 반응과 같은 제2 단계 반응을 형성하는데 사용될 수 있다. 개구된 포켓 부분(220)은 도 20의 캡 공동 장착 위치, 도 21의 제1 단계 위치 및 도 22의 제2 단계 위치 사이에서 본체(212)에 대하여 이동 가능하다. 베슬 내부(60)는 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로의 전환 동안 밀폐계를 유지한다.

도 23 및 도 24는 본 발명의 또 다른 실시형태를 나타낸다. 캡(310)은 원통형 기저부(312A)와 이 기저부(312A)로 삽입되도록 구성된 삽입부(312B)(도 23 및 도 24에서 기저부(312A)로부터 전개되어 도시됨)를 가진 본체를 포함한다. 기저부(312A)는 베슬(50)의 포트(52) 내부로 삽입되도록 구성된다. 기저부는 그 내부에 제1 개구(318A)을 가진 바닥벽(314A)을 갖는다. 유사하게, 삽입부(312B)는 그 내부에 제2 개구(318B)를 가진 바닥벽(314B)을 갖는다. 삽입부(312B) 내에는 캡 공동(316)이 배치된다. 이 삽입부(312B)가 기저부(312A)로 삽입된 때, 삽입부(312B)는 기저부(312A)에 대하여 회전 가능하게 조절될 수 있어서, 캡 공동(316)을 베슬 내부(60)로부터 유체적으로 분리시키거나(제1 단계 위치) 베슬 내부(60)와 유체적으로 연통시키도록(제2 단계 위치) 조절한다. 바람직하게, 삽입부(312B)의 상부에는 삽입부(312B)를 회전시키거나 비틀어 돌리기 위한 놉(324)이 있다. 삽입부(312B)를 비틀어 돌림으로써 캡 공동의 제어가 달성되고, 제1 단계 위치에서의 개구(318A, 및 318B)들의 정렬과 오버랩이 이루어지지 않으므로, 바닥벽(314A 및 314B)들이 결합하여 캡(310)에는 막힌 바닥이 제공된다. 캡(310)을 제2 단계 위치 로 이동하기 위해, 개구(318A, 및 318B)들이 적어도 부분적으로 정렬될 때까지 삽입부(312B)를 회전시키므로, 개구(318A, 및 318B)들이 캡(310)의 바닥에 개구를 제공하고 캡 공동(316)은 베슬 내부(60)와 유체적으로 연통된다.

캡(310)은 밀폐 환경하에서 하나 이상의 핵산의 존재를 얻기 위하여 샘플을 분석하도록 2 단계 처리를 수행하는데 사용된다. 다단계 반응으로 분석될 샘플은 튜브, 시린지, 피펫 등에 의해 포트(52)를 매개로 베슬 내부로 도입된다. 샘플은 다단계 반응 중 제1 단계를 수행하도록 베슬 내부에 위치되기 전에 제1 단계 시약과 혼합될 수 있으며, 또는 샘플은 베슬 내부에서 제1 단계 시약과 혼합될 수 있다. 삽입부(312B)가 기저부(312A) 내부로 삽입되어 개구(318A, 및 318B)들이 정렬된 시약 장착 위치로 회전된다. 제2 단계 반응을 수행하기 위한 제2 단계 시약이 개구(318A, 및 318B)들을 통하여 캡 공동(316) 내에 위치된다. 따라서, 개구(318A, 및 318B)들이 더 이상 정렬되지 않고 오버랩을 이루지 않아, 바닥벽(314A 및 314B)들이 결합하여 캡(310)에 일시적으로 막힌 바닥을 제공할 때까지, 삽입부(312B)가 비틀어 돌려진다. 캡(310)의 기저부(312A)가 베슬(50)의 포트(52) 내부로 삽입되어, 베슬 내부(60)를 에워싼다. 개구(318A, 및 318B)들이 정렬되지 않고, 캡 공동(316)이 베슬 내부(60)로부터 유체적으로 분리되는 이 제1 단계 위치에서, 제1 단계 반응, 이중 PCR의 제1 단계 또는 RT-PCR의 제1 단계인 역전사 반응과 같은 반응이 베슬 내부(60)에서 행해진다.

제1 단계 반응이 행해진 후, 개구(318A, 및 318B)들 정렬될 때까지 삽입부(312B)를 비틀어 돌림으로써, 캡 공동이 베슬 내부(60)와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치로 캡(310)이 이동된다. 이는 제2 단계 시약을 제2 단계 위치의 베슬 내부(60)에 방출한다. 베슬(50)은, 제2 단계 시약과 베슬 내부(60)의 제1 단계 반응의 반응 생성물을 혼합하기 위하여 스피너 또는 원심 장비 내에 통상적으로 위치된다. 따라서, 베슬(50)은, 베슬(50)을 온도 제어 시스템(예를 들어, 열 순환기)에 결합함으로써 밀폐된 베슬 내부(50)에서의 제2 단계 PCR 반응과 같은 제2 단계 반응을 형성하는데 사용될 수 있다. 베슬 내부(60)는 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로의 전환 동안 외부 환경에 대해 밀폐된 상태를 유지하므로 오염이 없다.

전술한 캡은 임의의 적합한 공정을 사용하는 임의의 적합한 재료로 제작될 수 있다. 일 실시형태에서, 캡은 사출 성형 등을 사용하는 플라스틱 재료로 몰딩된다. 착탈 가능한 스톱을 채택하는 이들 구성을 위해, 착탈 가능한 스톱은 플라스틱 재료로 몰딩되는 것처럼 개별적으로 형성된다.

본 발명은 도시되어 있는 세부 사항으로만 한정되도록 의도되는 것은 아니다. 전술한 상세한 설명을 검토함으로써 당업계의 당업자에게 많은 실시형태들이 명백해질 것이다. 예컨대, 또 다른 일 실시형태에서는 제1 단계 반응이 완료된 후 까지 제2 단계 시약이 캡 공동에 부가되지 않는다. 따라서, 제2 단계 시약은 제1 단계 반응에 요구되는 온도에 노출되지 않는다. 이들 실시형태들과 다른 많은 실시형태들이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명을 참조하여 판단되는 것이 아니라, 모든 범위의 균등물과 함께 첨부된 청구항들을 참조하여 판단돼야 한다.

Claims

베슬과 결합하여 베슬 내부를 에워싸도록 구성된 베슬용 캡으로서,

a) 베슬에 결합하도록 구성된 본체,

b) 캡 공동, 및

c) 상기 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계 위치와, 상기 캡 공동이 상기 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치 사이에서 상기 본체에 대하여 조절 가능한 캡 공동 제어부를 포함하는 베슬용 캡.
제1항에 있어서, 상기 캡 공동은 상기 본체 내에 배치되고, 상기 본체는 막힌 바닥과 개방된 상부를 갖고, 상기 막힌 바닥은 제1 단계 위치에서 상기 캡 공동을 베슬 내부로부터 유체적으로 분리하는 것인 베슬용 캡.
제2항에 있어서, 상기 캡 공동 제어부는 상부가 스파이크에 접속된 스파이크 캡 부분을 포함하고, 상기 스파이크 캡 부분은, 제1 단계 위치에서 상기 스파이크가 막힌 바닥을 관통함이 없이 캡 공동 내에 배치되고 상기 상부가 캡 공동을 에워싸도록 구성된 것인 베슬용 캡.
제3항에 있어서, 상기 본체로부터 상방향으로 연장하는 상부벽을 더 포함하고, 상기 스파이크 캡 부분의 상부는 제1 단계 위치에서 상부벽의 상부 에지와 실 질적으로 정렬되는 것인 베슬용 캡.
제4항에 있어서, 상기 상부벽은 제1 단계 위치에서 스파이크 캡 부분을 부분적으로 둘러싸고, 상기 상부벽이 상기 스파이크 캡 부분을 둘러싸지 않는 개구 영역을 포함하는 것인 베슬용 캡.
제5항에 있어서, 상기 개구 영역에서 스파이크 캡 부분과 본체 사이를 연결하는 스파이크 캡 아암을 더 포함하는 것인 베슬용 캡.
제6항에 있어서, 상기 스파이크 캡 아암은 가요성 스트립을 포함하는 것인 베슬용 캡.
제3항에 있어서, 상기 스파이크 캡 부분의 상부를 향하여 가압되어 스파이크 캡 부분을 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로 이동시키도록 구성된 베어링 면을 갖는 구동 캡 부분을 더 포함하며,

상기 스파이크는 제2 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하여 상기 캡 공동을 베슬 내부와 유체적으로 연통하도록 구성된 것인 베슬용 캡.
제8항에 있어서, 상기 구동 캡 부분과 상부벽 사이를 연결하는 구동 캡 아암을 더 포함하는 것인 베슬용 캡.
제9항에 있어서, 상기 구동 캡 아암은 가요성 스트립을 포함하는 것인 베슬용 캡.
제9항에 있어서, 상기 스파이크 캡 부분과 본체 사이를 연결하는 스파이크 캡 아암을 더 포함하고, 상기 스파이크 캡 아암과 구동 캡 아암은 통상적으로 서로 대향되게 배치되는 것인 베슬용 캡.
제3항에 있어서, 상기 스파이크 캡 부분에 분리 가능하게 결합된 착탈 가능한 스톱을 더 포함하고, 상기 착탈 가능한 스톱은 상기 스파이크가 제1 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하지 않도록, 상기 스파이크 캡 부분을 상기 캡 공동에 대하여 위치시키는 것인 베슬용 캡.
제12항에 있어서, 상기 착탈 가능한 스톱은 상기 스파이크 캡 부분으로부터 제거되어 상기 스파이크가 제2 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하도록 하는 것인 베슬용 캡.
제1항에 있어서, 상기 캡 공동 제어부는 캡 공동이 베슬 외부로부터 시약을 수용하도록 개방되는 장착 위치에 캡 공동을 위치하도록 본체에 대하여 추가로 조절 가능한 것인 베슬용 캡.
제1항에 있어서, 상기 본체는 개방 캡 채널을 포함하고, 상기 캡 공동 제어부는 어퍼쳐를 가진 캡 공동을 갖는 개구된 포켓 부분을 포함하는 것인 베슬용 캡.
제15항에 있어서, 상기 개구된 포켓 부분은 본체의 개방 캡 채널로 부분적으로 삽입되어, 상기 어퍼쳐가 캡 공동 장착 위치에서 베슬 외부로부터의 시약의 도입을 위해 개방하는 것인 베슬용 캡.
제16항에 있어서, 상기 개구된 포켓 부분은, 상기 어퍼쳐가 본체의 측면에 의해 에워싸여 캡 공동이 제1 단계 위치에서 베슬 내부로부터 그리고 베슬 외부로부터 유체적으로 분리될 때까지, 상기 캡 공동 장착 위치로부터 본체의 개방 캡 채널로 추가로 이동 가능한 것인 베슬용 캡.
제17항에 있어서, 상기 개구된 포켓 부분은, 상기 어퍼쳐가 제2 단계 위치에서 베슬 내부에 노출될 때까지 제1 단계 위치로부터 본체의 개방 캡 채널 내부로 추가로 이동 가능한 것인 베슬용 캡.
제15항에 있어서, 상기 개구된 포켓 부분에 분리 가능하게 결합되는 착탈 가능한 스톱을 더 포함하고, 상기 착탈 가능한 스톱은 어퍼쳐가 제1 단계 위치에서 베슬 내부로 노출되지 않도록 개구된 포켓 부분을 개방 캡 채널에 대하여 위치시키 는 것인 베슬용 캡.
제15항에 있어서, 상기 개구된 포켓 부분은 제1 단계 위치와 제2 단계 위치에서 베슬 내부를 에워싸도록 구성된 것인 베슬용 캡.
제1항에 있어서, 본체의 일 측면에 결합되는 잠금 부재를 더 포함하고, 상기 잠금 부재는 본체를 베슬에 체결하도록 구성된 것인 베슬용 캡.
제1항에 있어서, 상기 본체는 그 내부에 제1 개구를 가진 제1 바닥벽을 갖는 기저부를 포함하고, 상기 캡 공동 제어부는 상기 기저부로 삽입되는 삽입부를 포함하고, 상기 캡 공동은 상기 삽입부 내에 배치되고, 상기 삽입부는 내부에 제2 개구를 가진 제2 바닥벽을 갖고, 상기 삽입부는 기저부에 대하여 회전 가능하게 조절되어 제1 단계 위치에서는 제1 개구 및 제2 개구를 오정렬하여 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되고, 제2 단계 위치에서는 제1 개구 및 제2 개구를 정렬하여 캡 공동이 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 것인 베슬용 캡.
제22항에 있어서, 상기 삽입부의 상부에 상기 삽입부를 회전하기 위한 놉을 더 포함하는 것인 베슬용 캡.
제1항에 있어서, 상기 캡 공동은, 상기 베슬 내부에서 제1 단계 반응이 수행 된 후 제2 단계 반응을 수행하기 위한 제2 단계 시약을 수용하는 것인 베슬용 캡.
제24항에 있어서, 상기 제2 단계 시약은 상기 캡 공동 내에 건조되거나 또는 동결 건조된 형태로 위치된 것인 베슬용 캡.
베슬과 결합하여 베슬 내부를 에워싸도록 구성된 베슬용 캡으로서,

a) 베슬에 결합하도록 구성된 본체,

b) 캡 공동, 및

c) 상기 캡 공동이 에워싸여져 상기 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계 위치로부터, 상기 캡 공동이 상기 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치로 캡을 전환하는 제어 수단을 포함하는 베슬용 캡.
제26항에 있어서, 상기 제1 단계 위치와 제2 단계 위치에서 베슬 내부를 에워싸는 수단을 더 포함하는 것인 베슬용 캡.
제26항에 있어서, 상기 본체는 막힌 바닥과 개방된 상부를 갖고, 상기 캡 공동은 본체 내에 배치되는 것인 베슬용 캡.
제26항에 있어서, 상기 제어 수단은, 막힌 바닥을 관통하여 상기 캡 공동을 상기 베슬 내부와 유체적으로 연통하도록, 제1 단계 위치로부터 제2 단계 위치로 이동 가능한 스파이크를 포함하는 것인 베슬용 캡.
제26항에 있어서, 상기 제어 수단은, 상기 캡 공동이 베슬 외부로부터 시약을 수용하도록 개방되는 장착 위치로 캡을 전환하는 수단을 포함하는 것인 베슬용 캡.
제26항에 있어서, 상기 캡 공동은, 베슬 내부에서 제1 단계 반응이 수행된 후 제2 단계 반응을 수행하기 위한 제2 단계 시약을 수용하는 것인 베슬용 캡.
제31항에 있어서, 상기 제2 단계 시약은 상기 캡 공동 내에 건조되거나 또는 동결 건조된 형태로 위치된 것인 베슬용 캡.
베슬에서 샘플을 반응하기 위한 다단계 처리 방법으로서,

상기 베슬은 베슬 내부를 에워싸는 캡을 수용하도록 구성되고, 상기 캡은 본체와 캡 공동을 포함하고, 상기 캡은 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계와, 캡 공동이 상기 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 사이에서 조절 가능하며,

a) 상기 베슬 내부에 제1 단계 반응을 행하기 위한 제1 단계 시약과 혼합되는 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 베슬 내부를 에워싸도록 상기 캡을 상기 베슬에 결합하는 단계,

c) 상기 베슬 내부에서 상기 샘플과 제1 단계 시약을 이용하여 제1 단계 반응을 행하는 단계로서, 상기 제1 단계 반응은 상기 캡 공동이 베슬 내부로부터 유체적으로 분리되는 제1 단계 위치에서 캡을 이용하여 행해지는 것인 제1 단계 반응을 행하는 단계,

d) 상기 캡 공동에 저장된 제2 단계 시약을 제1 단계 반응의 반응 생성물에 부가하는 단계로서, 상기 캡 공동이 상기 베슬 내부와 유체적으로 연통되는 제2 단계 위치로 캡을 이동시키는 단계와 제2 단계 시약을 제1 단계 시약의 반응 생성물과 혼합함으로써 상기 제2 단계 시약을 부가하는 단계에 의해 상기 제2 단계 시약 부가 단계, 및

e) 제1 단계 반응의 반응 생성물과 제2 단계 시약을 이용하여 베슬 내부에서 제2 단계 반응을 행하는 단계를 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 본체는 막힌 바닥과 개방된 상부를 갖고, 상기 캡 공동은 상기 본체 내에 배치되고, 상기 막힌 바닥은 베슬 내부를 에워싸고 제1 단계 위치에서 베슬 내부로부터 상기 캡 공동을 유체적으로 분리하는 것인 다단계 처리 방법.
제34항에 있어서, 상기 캡은 상부가 스파이크에 연결된 스파이크 캡 부분을 포함하고, 상기 캡을 제2 단계 위치로 이동시키는 단계는 막힌 바닥을 상기 스파이크로 관통하여 상기 캡 공동을 상기 베슬 내부와 유체적으로 연통하는 단계를 포함 하는 것인 다단계 처리 방법.
제35항에 있어서, 제1 단계 위치에서 상기 스파이크는 막힌 바닥을 관통하지 않고 캡 공동 내에 배치되고, 상기 스파이크 상부 부분이 상기 캡 공동을 에워싸는 것인 다단계 처리 방법.
제35항에 있어서, 상기 막힌 바닥을 스파이크로 관통하는 것은 캡의 구동 캡 부분의 베어링 면을 상기 스파이크 캡 부분의 상부에 대하여 가압하는 것을 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제35항에 있어서, 착탈 가능한 스톱이 제1 단계 위치에서 스파이크 캡 부분에 분리 가능하게 결합되고, 착탈 가능한 스톱은 스파이크가 제1 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하지 않도록 스파이크 캡 부분을 캡 공동에 대하여 위치시키는 것인 다단계 처리 방법.
제38항에 있어서, 상기 착탈 가능한 스톱은 상기 스파이크 캡 부분으로부터 제거되어 상기 스파이크가 제2 단계 위치에서 막힌 바닥을 관통하도록 하는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 캡의 본체를 베슬의 포트 내부로 삽입한 후에 캡 공 동 내에 제2 단계 시약을 위치시키는 단계를 더 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제40항에 있어서, 상기 본체는 개방 캡 채널을 포함하고, 상기 캡은 어퍼쳐를 가진 캡 공동을 갖는 개구된 포켓 부분을 포함하고, 상기 어퍼쳐는 캡 공동 장착 위치에서 베슬 외부로부터의 제2 단계 시약의 도입을 위해 개방된 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 본체는 개방 캡 채널을 포함하고, 상기 캡은 어퍼쳐를 가진 캡 공동을 갖는 개구된 포켓 부분을 포함하고, 상기 어퍼쳐가 본체의 측면에 의해 에워싸여 제1 단계 위치에서 캡 공동이 베슬 내부로부터 그리고 베슬 외부로부터 유체적으로 분리되고, 개구된 포켓 부분이 제1 단계 위치에서 베슬 내부를 에워쌀 때까지, 상기 개구된 포켓 부분은 본체의 개방 캡 채널 내부로 이동되는 것인 다단계 처리 방법.
제42항에 있어서, 상기 제2 단계 위치로 캡을 이동하는 단계는, 어퍼쳐가 제2 단계 위치에서 베슬 내부에 노출되어 개구된 포켓 부분이 제2 단계 위치에서 베슬 내부를 에워쌀 때까지 제1 단계 위치로부터 본체의 개방 캡 채널 내부로 개구된 포켓 부분을 추가로 이동시키는 단계를 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제43항에 있어서, 착탈 가능한 스톱이 제1 단계 위치에서 개구된 포켓 부분 에 분리 가능하게 결합되고, 상기 착탈 가능한 스톱은 어퍼쳐가 제1 단계 위치의 베슬 내부로 노출되지 않도록 개구된 포켓 부분을 개방 캡 채널에 대하여 위치시키는 것인 다단계 처리 방법.
제44항에 있어서, 상기 캡을 상기 제2 단계 위치로 이동하기 전에 상기 착탈 가능한 스톱이 개구된 포켓 위치로부터 제거되어, 개구된 포켓 부분의 어퍼쳐가 제2 단계 위치에서 베슬 내부로 노출되도록 하는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 본체는 내부에 제1 개구를 가진 제1 바닥벽을 갖는 기저부를 포함하고, 상기 캡은 상기 기저부로 삽입되는 삽입부를 더 포함하고, 상기 캡 공동은 상기 삽입부 내에 배치되고, 상기 삽입부는 그 내부에 제2 개구를 가진 제2 바닥벽을 갖고, 캡을 제2 단계 위치로 이동하는 단계는 제1 및 제2 개구를 정렬하여 캡 공동이 상기 베슬 내부와 유체적으로 연통되도록 상기 삽입부를 상기 기저부에 대하여 회전하는 단계를 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제46항에 있어서, 상기 회전 단계는 상기 삽입부의 상부에 놉을 비틀어 돌리는 단계를 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 제1 단계 반응은 제1 단계 중합효소 연쇄반응을 포함하고, 제2 단계 반응은 제2 단계 중합효소 연쇄반응을 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단계 반응은 이중 PCR 처리의 제1 및 제2 단계 반응인 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 제1 단계 반응은 역전사 반응을 포함하고, 상기 제2 단계 반응은 중합 효소 연쇄 반응을 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 제2 단계 시약은 캡 내에 건조되거나 동결 건조된 형태로 저장되는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 혼합 단계는 베슬 및 캡에 스피닝 또는 원심력을 작용시키는 단계를 포함하는 것인 다단계 처리 방법.
제33항에 있어서, 상기 혼합 단계는 베슬 및 캡을 흔드는 단계를 포함하는 것인 다단계 처리 방법.