상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 홍삼으로부터 한외여과에 의하여 분리된 신규의 고비율 파낙사디올 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A)을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 한외여과법을 이용한 홍삼으로부터 분리되는 PD 계열 사포닌 분획물, 특히 Rb1 사포닌의 고비율 함유 분획물은 홍삼사포닌 추출 및 고분자 물질의 제거과정, 그리고 한외여과 장치 통과 과정의 2단계로 제조된다.
본 발명에 따른 홍삼 사포닌 추출 및 고분자 물질 제거 과정은 홍삼 분말을 80% 주정 또는 물로 추출하여 얻어지는 각각의 인삼사포닌 추출액 중에 다량 존재하는 다당체 등 고분자 물질을 주정을 가하여 침전시키고 여과 또는 원심분리하여 제거하는 과정이다.
또한 본 발명에 따른 한외여과장치를 이용한 고비율의 PD계열 인삼사포닌 함유 분획물(RGSF-A)의 제조과정은 상기 과정에서와 같이 알콜에 의한 침전물이 제거된 홍삼의 물 또는 주정 추출물에 물을 가하여 희석한 후 한외여과 장치(Millipore, USA)에 통과시켜 저분자 유리당 등을 제거하는 과정이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 홍삼 사포닌 추출 및 고분자 물질 제거 과정에서 먼저 홍삼 분말에 80% 주정 또는 물을 시료 무게당 5- 10 배량 가하여 85℃에서 6시간씩 3회 반복 추출한 후 여과한다. 주정 추출액의 경우 농축하여 주정을 제거하고 고형분이 최종 20 % 되게 농축한다. 물 추출액의 경우도 농축하여 고형분이 20 %되게 한다.
각 추출액에 알콜농도가 60% 되도록 주정을 가하여 침전을 유도한다. 상등액은 여과 또는 원심분리한다. 홍삼 물 또는 주정 추출물에 주정을 가하여 홍삼 중에 존재하는 다당체 등의 고분자 물질을 침전시켜 제거한 후 상등액에는 사포닌 외에도 침전을 생성하지 않는 유기물질(예 ; 저분자 당류)이 다량 존재한다.
상기 상등액을 농축하여 알콜을 제거한 다음 얻어지는 농축액에 물을 가하여 고형분이 5 % 되게 희석한다. 상기 상등액은 약 60%의 주정을 함유하는데, 곧바로 한외여과 장치를 통과시키면 상기 상등액은 고농도(약 60%)의 주정을 함유하고 있 어, 한외여과시 PD계 사포닌이 그대로 통과해 버려 분리가 불가능하거나 또는 고농도인 주정에 의하여 한외여과 장치 통과시에 여과 장치 중 일부 구조가 주정에 변성될 수 있기 때문에 상등액을 농축하여 주정을 제거 및 희석하여 한외여과장치를 통과하는 것이 바람직하다.
상기 상등액의 농축액은 물을 가해 고형분이 약 5% 되게 희석한다. 상기 희석액을 한외여과 장치에 통과시킨다. 상기 희석액을 분자량 5,000 내지 100,000 멤브레인 필터 카세트가 장착된 한외여과 장치(Millipore, USA)에 통과시켜 1/50 내지 1/2의 농축배율로 농축시킨다. 이 농축액을 감압건조함으로써 한외여과를 이용한 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A)을 획득할 수 있다.
상기와 같이 희석액의 한외여과 장치의 통과는 통과되지 않는 물질(사포닌)의 농축을 의미한다. 본 발명은 한외여과 장치로 농축을 많이 할수록 사포닌 순도는 증가하나, 수득율은 적어진다. 예를 들면, 본 발명은 사포닌 순도 17%일 때 수득율은 30%이며, 순도 26%이면 수득율은 20%이다.
본 발명은 한외여과시 농축 정도에 따라 사포닌 순도가 낮더라도 높은 수득율로 사포닌 분획물을 분리할 수 있다. 본 발명은 사포닌 분획물을 이용한 기능성 식품등에는 사포닌 순도가 낮더라도 높은 수득율로 사포닌 분획물을 이용할 수 있으며, 의약 등의 원료에는 순도가 높은 분획물을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 PD계 사포닌은 분자량이 2,000 이하이지만 분자량 5,000 내지 100,000 맴브레인을 통과하지 못하는 것은 PD계 사포닌의 분자량에 관계없이 수용액 내에서는 분자끼리 마이셀(micelle)을 형성해서 고분자 형태로 존재하기 때문인 것이라 추측된다.
본 발명은 인삼사포닌의 정성분석을 위하여 TLC법에 따라 시험하고 도면 2에 나타내었다. 본 발명에 따라 제조되는 분획물은 전개용매; 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 65: 35: 10로 전개한 후 풍건하여 발색제(30% 황산)를 분무하고 110℃ 에서 약 10분 간 가온하면 Rf 0.03 - 0.65사이에서 10개 이상의 적색 반점이 나타난다. 표준액과 검액을 비교시 Rf 0.17에서 Rb1, Rf 0.22에서 Rb2 + Rc, Rf 0.31에서 Rd, Rf 0.34 에서 Re, Rf 0.41에서 Rf, Rf 0.44에서 Rg1에 해당하는 적색반점이 나타난다.
본 발명의 한외여과법에 의하여 제조되는 분획물은 부탄올 추출법 및 에이치피-20법에서 제조된 분획물에 비하여 PD/PT 및 Rb1/Rg1 ratio가 현저히 다른 새로운 물성치를 갖는 물질임을 확인할 수 있다.
더구나, 진세노사이드 Rb1(Diol saponin)은 염증성 cytokine의 생성을 억제함으로써 항염증 작용이 있는 것으로 보고(A.T. Smolinski and J.J. Pestka : Food and Chemical Toxocology 41(2003): 1381-1390)된 바 있어, 본 발명에 의해서 분리 되는 파낙사디올(PD) 계열 사포닌 분획물(RGSF-A)은 항염증 효과를 나타내어 염증 치료 및 예방을 위한 약학조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 신규의 고비율 파낙사디올 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A) 및 애엽추출물(Artemisia asiatica, A. mongolica, A. princeps, A. argyi)의 혼합조성물에 의한 항염증용 약학조성물을 제공한다.
애엽 추출물은 통상적으로 제조되는 용매에 의하여 추출되며, 물 또는 유기용매, 예를들면 메탄올 또는 에탄올로 추출하는 것이 좋다.
본 발명에서는 애엽을 물로 추출한 후 감압건조 및 동결건조하여 고형물로 제조된 애엽추출물을 고비율 파낙사디올 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A)과 혼합한다. 이 때, RGSF-A : 애엽추출물은 1 : 2의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다.
본 발명은 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등과 혼합하여 고비율 파낙사디올(PD) 계열 사포닌 분획물(RGSF-A)을 함유하는 항염증제를 제조할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 등의 경구투여용 제제나 통상의 방법으로 주사용 증류수에 용해하여 주사제로 또는 에어로졸, 로션, 크림 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 생리활성물질 인 고비율 파낙사디올(PD) 계열 사포닌 분획물(RGSF-A)은 성인 기준으로 약 0.01mg 내지 100㎎/kg, 바람직하게는 약 1mg/kg 내지 50mg/kg 범위이다. 또한 애엽추출물은 1일 10~1000㎎을 RGSF-A와 혼합하여 1회 내지 수회 나누어 복용할 수 있다. 그러나 실제적으로 투여되는 생리활성물질의 양은 치료하려는 질환의 상태, 선택된 투여 경로, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응, 병의 중증도를 비롯한 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이므로 상기 투여 범위는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
이하 본 발명을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 한외여과법을 이용한 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A)의 제조
건조된 홍삼 분말 10kg에 80% 주정 50L를 가하고 8시간 3회 반복 추출한 후 추출액을 합쳐 여과포로 여과하고 감압농축하여 수분함량 36%의 홍삼 주정 추출엑기스 약 3.6kg을 제조하였다.
홍삼 주정엑기스 2kg(수분 36%)에 증류수를 가하고 녹여 4 L가 되게 한 다음 다시 주정 6 L를 가하고 하룻밤 정치한 다음 원심분리 하였다. 얻어진 상등액을 농축하여 주정을 제거한 다음 증류수를 가하여 20 L로 하였다. 이 용액을 분자량 10,000 멤브레인(polyethersulfone) 카세트가 장착된 한외여과장치에 2 L가 남을 때까지 농축(통과)시켰다. 멤브레인을 통과하지 않은 2 L를 감압건조(수분 10% 내외)하여 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A) 약 250 g을 얻었다.
상기 획득된 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A) 중 진세노사이드의 HPLC 프로파일은 도 3에 나타내었으며, HPLC 정량분석결과 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A) 중 진세노사이드 함량 및 조성비는 표 1과 같다.
[표 1] 홍삼으로부터 한외여과법으로 제조한 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A) 중 진세노사이드 함량
[단위: dry extract(%)]
Rb1 |
Rb2 |
Rc |
Rd |
Re |
Rf |
Rg1 |
Rg2 |
Rg3 |
total |
Diol |
Triol |
PD/PT |
Rb1/Rg1 |
9.94 |
4.22 |
4.29 |
1.72 |
1.66 |
1.27 |
1.52 |
0.695 |
0.925 |
26.24 |
21.10 |
5.15 |
4.1 |
6.54 |
- 용해성 : 물에 가용, 에탄올 및 메탄올에 난용성, 에테르 및 클로로포름에 불용
- pH : 4.56(0.1% 수용액의 상태에서 측정한 결과)
- 수분량 : 10 ~ 15% , 총사포닌 : 20 ~ 30%
- 총지질 : 0.3 ~ 0.5% , 총 단백질 : 3 ~ 5% , 총 당 : 50 ~ 60%(비색법)
- 자외선 흡수 : λmax = 277nm (0.1% 수용액)
<비교예 1> 부탄올법을 이용한 사포닌 함유 분획물의 제조
건조된 홍삼 10 kg에 80% 주정 50 L를 가하고 8 시간 3회 반복 환류추출한 다음 추출액을 합쳐 여과포로 여과하고 감압 농축하여 수분함량 36%의 홍삼 주정 추출물 약 3.6 kg(주정 엑기스 건물량으로 2.3kg)을 제조하였다. 상기 주정 추출물에 물을 가하고 녹여 50 L가 되게 한 다음 분획여두에서 에틸에테르 50 L로 2회 반복 분배추출하여 지질을 제거한다. 물층(50 L)을 계속해서 물포화 부탄올 50 L로 3회 반복 분배 추출한 다음 부탄올 층을 합하여 감압농축함으로써 부탄올 추출에 의한 홍삼 사포닌 분획물(조사포닌) 460 g(주정 엑기스 건물량 대비 수득율 20%)을 얻었다.
- pH : 3.87(0.1% 수용액의 상태에서 측정한 결과)
- 자외선 흡수 : λmax = 266nm(0.1% 수용액)
<비교예 2> 에이치피-20법에 의한 사포닌 함유 분획물의 제조
대한민국 특허등록 제444394호에 기재된 에이치피-20법에 따라 인삼사포닌 고함유 추출물을 제조하였다. 에이치피-20법에 따라 인삼사포닌 고함유 추출물의 특성은 본 발명에서 제조되는 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A)과는 다른 물리적 특성을 나타냈다.
- pH : 3.48(0.1% 수용액의 상태에서 측정한 결과)
- 자외선 흡수 : λmax = 283,272nm(0.1% 수용액)
상기 실시예 1 및 비교예 1, 2에서 분리된 분획물의 PD/PT 및 Rb1/Rg1 ratio의 비율은 표 2에 나타내었다.
[표 2] 한외여과법, 부탄올법 및 에이치피-20법에 의해 분리된 홍삼 사포닌 분획물의 PD/PT 및 Rb1/Rg1 비율비교
방 법 |
PD/PT |
Rb1/Rg1 |
실시예 1 |
4.10 |
6.54 |
비교예 1 |
2.11 |
1.57 |
비교예 2 |
1.74 |
1.88 |
상기 실시예 1의 한외여과법에 의한 분획물은 비교예 1 및 2에서 제조된 분획물과 pH 및 자외선 흡수에 따른 물성치는 현저히 다른 새로운 물성치를 갖는 물질임을 확인할 수 있다.
또한 상기 실시예 1의 한외여과법에 의한 고비율 PD 계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A)은 비교예 1 및 2에서 제조된 분획물에 비하여 PD/PT ratio가 2 배 이상 고비율로 함유되어 있으며, 특히 고비율의 PD 계열 사포닌 함유 분획물은 Rb1/Rg1 ratio가 비교예 1, 2에 비하여 4 배 이상 비율로 함유되어 있어, 진세노사이드Rb1은 염증성 cytokine의 생성을 억제함으로써 항염증 작용이 있는 것으로 보고된 바에 의하면, 본 발명에 의해서 분리되는 분획물은 항염증 효과를 나타내어 염증 치료 및 예방용으로 유용하게 사용될 수 있다.
<실시예 2> 애엽추출물의 제조
건조된 애엽(Artemisia asiatica, A. mongolica, A. princeps, A. argyi) 분 말 600g에 물 5 L를 가하고 85℃에서 6시간 3회 반복 열수추출한 후 추출액을 합쳐 여과포로 여과하고 감압장치를 이용하여 농축한 후 동결건조하였다.
<실시예 3> RGSF-A 및 애엽추출물의 혼합조성물의 제조
실시예 1에서 제조된 RGSF-A 100g과 실시예 2에서 제조된 애엽추출물 200g을 균질하게 혼합하여 RGSF-A 및 애엽추출물의 혼합조성물의 제조하였다.
상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 RGSF-A 및/또는 애엽 추출물 투여에 대한 항염증효과를 비교하기 위하여 동물실험을 실시하였다.
<실험예 1> 모세혈관 투과도에 미치는 효과
가. 실험재료
마우스(ICR mouse) 수놈( 20 ~ 25g)을 한 실험군에 10 ~ 15마리씩 배정하여 각 시험을 실시하였다.
나. 실험 및 효과 비교
고비율 PD계열 사포닌 함유 분획물(RGSF-A), 애엽 추출물 및 조성물을 1시간 경구 투여 후 실험을 실시하였다.
0.6% acetic acid를 복강 투여 후 20분 만에 Evans blue를 꼬리 정맥 투여한 다음 20분 만에 희생시켰다. 희생시킨 마우스에 0.9% 생리식염수 5ml를 복강에 주사한 후 복강으로부터 생리식염수를 다시 포집하여 ELISA를 이용하여 흡광도 측정 하였다. 각각의 실험군에 용량별(10, 25, 50 mg/kg,b.w)로 RGSF-A, 애엽 추출물 및 조성물을 경구 투여하여 모세혈관 투과도 억제율 측정하여그 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3] RGSF-A, 애엽 추출물 및 조성물 투여가 모세혈관 투과도에 미치는 효과
(Unit :%control)
용량 |
대조군 |
실시예 1 |
실시예 2 |
실시예 3 |
10mg/kg |
100.0 ± 12.8 |
105.8 ± 8.9 |
105.8 ± 9.8 |
88.5 ± 15.7 |
25mg/kg |
100.0 ± 12.8 |
95.7 ± 10.8 |
110.3 ± 11.3 |
70.5 ± 21.0 * |
50mg/kg |
100.0 ± 12.8 |
89.3 ± 6.8 * |
108.5 ± 10.5 |
81.4 ± 16.8 * |
* p<0.05 : 대조군 vs 투여군 **p<0.01 대조군 vs 투여군
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 RGSF-A의 경우 50mg/kg 투여군에서 항염증 효과가 있는 것으로 나타내어 일정 투여용량에서 항염증 효과가 있음을 알 수 있다. 실시예 2에서 제조된 애엽추출물은 문헌에는 항염증 작용이 있는 것으로 알려졌으나 본 발명의 실험에 적용한 용량에서는 항염증 작용을 나타내지 않았다. 그런데, RGSF-A와 애엽추출물을 혼합한 혼합조성물은 RGSF-A 단독 투여보다 1/2배의 낮은 용량에서도 모세혈관 투과도 억제를 나타내어 RGSF-A의 항염증 효과는 애엽추출물을 혼합한 혼합조성물에서 시너지 효과가 있음을 알 수 있다.
<실험예 2> 슬와부 종창에 미치는 효과 비교
가. 실험재료
랫드(S.D rat)수놈( 180 ~ 200g)을 한 실험군에 10 ~ 15마리씩 배정하여 각 시험을 실시하였다.
나. 실험 및 효과 비교
Zymosan-A로 염증을 유도한 후 실시예 1, 2 및 3에서 제조한 RGSF-A, 애엽 추출물 및 조성물을 용량별로 4일간 투여한 다음 5일째 희생시켜 슬와부 종창의 무게를 비교하였다.
슬와부 종창(Polpliteal node)내에는 inflammatory인 T cell 및 macrophage가 침윤되어 있으며, 이들 세포에서 분비된 cytokine에 의해 염증이 매개된다고 알려져 있다. Zymosan-A(50mg/kg, i,p)를 투여하면 염증 세포 침윤이 발생된다. Zymosan-A 투여 1시간 후에 RGSF-A 단독, 애엽 추출물 단독 및 조성물을 4일간 10, 25, 50mg/kg으로 흰쥐에 경구 투여하였다. 5일째 흰쥐를 희생시킨 후 슬와부 종창의 무게를 측정하고 그 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4] 슬와부 종창에 미치는 영향
(Unit : mg)
용량 |
대조군 |
실시예 1 |
실시예 2 |
실시예 3 |
10mg/kg |
13.7 ± 2.3 |
13.4 ± 1.2 |
13.4 ± 1.5 |
7.8 ± 1.5** |
25mg/kg |
13.7 ± 2.3 |
12.8 ± 1.5 |
13.7 ± 1.8 |
5.5 ± 1.6** |
50mg/kg |
13.7 ± 2.3 |
8.1 ± 0.7 ** |
13.1 ± 1.3 |
6.4 ± 1.4** |
* p<0.05 : 대조군 vs 투여군 ** p<0.01 : 대조군 vs 투여군
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 RGSF-A 단독 투여에 있어서는 50mg/kg의 용량에서 슬와부 종창의 무게를 유의적으로 억제함으로서 항염증 작용을 나타냈으나, 실시예 2에서 제조된 애엽 추출물 단독 투여군의 경우 상기 투여 용량에서는 슬와부 종창의 무게 감소를 나타내지 않으므로 항염증 작용이 없는 것으로 판단된다. 또한 실시예 3에서 제조된 조성물 투여군의 경우 RGSF-A 단독 투여의 용량에 비해 1/5배 낮은 용량에서도 슬와부 종창의 무게를 유의적으로 감소함을 나타내므로 RGSF-A 비해 항염증 작용이 매우 우수한 것으로 생각된다.
그러므로 본 발명에 따른 RGSF-A 및 애엽 추출물의 혼합조성물은 상기 실험예 1 및 실험예 2에서 알 수 있는 바와 같이, 염증 반응에 관련하여 모세혈관 투과도 및 슬와부 종창에 미치는 효과가 매우 우수하여 각종의 면역 증진 및 염증 인자의 억제를 통하여 생체의 정상화 기능을 회복시키는 항염증제로 사용될 수 있다.