KR20070084532A - 보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토식물 - Google Patents

보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토식물 Download PDF

Info

Publication number
KR20070084532A
KR20070084532A KR1020077011767A KR20077011767A KR20070084532A KR 20070084532 A KR20070084532 A KR 20070084532A KR 1020077011767 A KR1020077011767 A KR 1020077011767A KR 20077011767 A KR20077011767 A KR 20077011767A KR 20070084532 A KR20070084532 A KR 20070084532A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
botrytis
lycopersicon
plant
qtl
tomato
Prior art date
Application number
KR1020077011767A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101329485B1 (ko
Inventor
요하네스 아르놀두스 라우렌티우스 반 칸
아르젠 텐 해브
빌렘 헨드릭 린드호우트
헨드리쿠스 요하네스 핀커
렘코 반 베루
아드리안 빌렘 반 허드슨
Original Assignee
드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34928600&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20070084532(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이. filed Critical 드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이.
Publication of KR20070084532A publication Critical patent/KR20070084532A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101329485B1 publication Critical patent/KR101329485B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/825—Solanum lycopersicum [tomato]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/138—Amplified fragment length polymorphism [AFLP]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

본 발명은 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물을 비-내성, 또는 보트리티스-감염되기 쉬운, 수용자 토마토 식물과 교배시키는 단계, 하나 이상의 후손 식물을 보트리티스의 감염량과 접촉시키는 단계, 상기 하나 이상의 자손 식물에서 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도를 정량적으로 측정하는 단계, 상기 하나 이상의 자손 식물에서 상기 공여자 토마토 식물의 염색체 마커의 존재에 관찰된 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도를 연결시키는 유전 연관 지도를 확립하는 단계, 및 QTL에 감소된 질환 발병률 및/또는 감소된 병변 성장 속도에 연관된 상기 지도 상의 인접한 마커를 할당하는 단계를 포함하는, 토마토에서 보트리티스 시네레아에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리(QTL)을 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
토마토, 보트리티스, 내성, 교배

Description

보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토 식물{TOMATO PLANTS HAVING HIGHER LEVELS OF RESISTANCE TO BOTRYTIS}
본 발명은 식물 육종(breeding) 및 분자 생물학에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 토마토에서 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리(QTL)를 검출하는 방법, 그와 함께 보트리티스-내성 토마토를 생성하는 방법 및 그에 따라 얻어진 보트리스-내성 토마토 식물 및 그것의 부분에 관한 것이다.
보트리스 시네레아는 적어도 235의 가능한 숙주를 포함하는 예외적으로 넓은 숙주 범위를 갖는 네크로트로픽(necrotrophic) 병원성 진균이다. 그것의 폭넓은 숙주 범위 때문에 그리고 그것이 식물 B. 시네레아의 경제적으로 중요한 부분에 영향을 끼치기 때문에 많은 상업적으로 재배된 곡물에서 주요한 문제이다. 재배자들 사이에서, 이 진균(fungus)은 흔히 보트리티스라고 일컬어진다. 재배된 토마토(주로 Lycopersicon esculentum)는 또한 보트리티스에 의한 감염에 영향받기 쉽고 진균은대개 줄기, 잎 및 토마토 식물의 과실에 영향을 끼친다. 가열된 온실에서 줄기 상의 보트리티스에 의한 감염의 발생은 특히 흔하다.
보트리티스는 무름병(soft rot), 마름병(blights), 잎점무늬병(leaf spot), 모잘록병(damping-off) 및 줄기 암(stem cancers)을 일으켜서, 능동적으로 감염된 세포를 죽인다. 영향받은 잎들이 코니디오포레(conidiophores) 및 코니디아(conidia)로 뒤덮혀지고 그 후 쇠약해지고 시들어버린다. 진균은 죽은 잎들로부터 줄기로 성장하고 길이가 수 밀리미터에서 수 센티미터까지의 마르고, 밝은 갈색의 병변(lesions)을 생성한다. 병변은 또한 줄기 상에 전지된 옆흔(scars)에서 형성될 수도 있다. 줄기 병변은 또한 회색의 곰팡이로 덮힐 수도 있다. 심각한 경우에, 감염은 줄기를 환상박피하고 식물을 죽인다. 토마토 식물의 더 오래되고, 늙은 조직은 보통 더 어린 조직보다 보트리티스에 의한 공격에 더 영향받기 쉽다.
온실 재배 토마토에서의 보트리티스의 발달을 예방하기 위해, 온도 및 상대 습도는 면밀히 조절되어야 한다. 잎을 적시지 않고서 물을 제공하는 것이 또한 중요하다. 들판 재배 식물에 대해서는, 우수한 배수 및 잡초 억제가 이용되어야 한다. 게다가, 식물의 영양 수준이 높게 유지되어야 한다. 하지만, 이들 예방 조치들은 감염의 경우에서 상당한 산출 손실의 발생을 완전히 막을 수는 없다.
살진균제는 온실 및 들판 재배 토마토 둘 다에서 보트리티스를 억제하는데 이용할 수 있다. 몇몇 살진균제의 예로는 Dowicide A® 및 클로로탈로닐을 포함하고, 이것들은 또한 수확 후 토마토 과실에 적용될 수 있다. 하지만, 보트리티스는 여러 흔하게 사용되는 살진균제에 대해 내성을 발달시킨다고 알려져 있다. 또한, 살진균제의 사용은 경제적이고 환경적인 관점 둘 다로부터 바람직하지 않다. 현재, 보트리티스에 대한 내성을 나타내는 상업적 토마토 품종에 대한 필요성이 있다.
보트리티스에 대한 부분적 내성은 Lycopersicon의 여러 야생종에서 발견되어 왔다(Egashira et al. 2000; Nicot et al. 2002; Urbasch 1986). 이들 식물들은 하지만 상업적 농작물 토마토를 생산하지 못한다.
L. hirsutum이 보트리티스에 대한 부분적 내성에 관련된 게놈의 염색체 10 상의 유전 영역을 포함한다는 것이 WO 02/085105로부터 알려져 있다. 이러한 유전 물질의 재배되는 토마토 품종으로의 유전자 이입은 보트리티스에 대해 부분적으로 내성이 있는 재배된 토마토 식물에게 제공할 수 있다고 믿어진다.
하지만, 지금까지, 토마토에서 보트리티스에 대해 내성을 제공하는 것을 목표로 삼은 육종 프로그램은 제한된 성공을 가져왔다. 이들 빈약한 결과의 원인은 현재 분명하지 않다. 하나의 부분에 대해, 이것은 보트리스-내성의 유전적 기초 및 유전에 대한 불충분한 지식에 기인할 수 있다. 또 하나의 부분에 대해, 이것은 육종 프로그램에서 얻어진 토마토 식물에서의 보트리스-내성을 평가하기 위한 적당한 생물학적 분석의 부족에 기인할 수 있다. 지식 및 방법의 결핍은 또한 보트리스에 대한 내성과 관련된 유전자를 포함하는 야생의 취득물(accessions) 및 자손 식물 둘다 중의 식물의 선택을 복잡하게 한다.
보트리티스에 내성이 있는 상업적 토마토 품종을 제공하는 것에 목표를 둔 육종 프로그램의 성공을 개선시키는 것이 본 발명의 목적이다. 상업적 토마토 품종에서의 보트리티스에 대한 추가적이고 그리고/또는 개선된 내성을 제공하는 것이 본 발명의 또 하나의 목적이다. 게다가 보트리티스에 대한 내성의 원천(sources)으로서 추가적인 야생 Lycopersicon 취득물을 발견하기 위한 방법 및 보트리티스에 대한 토마토의 내성에 관련된 식물의 게놈에서 추가적인 유전 물질을 발견하기 위 한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 하나의 목적이다. 그러한 추가적인 원천 및 추가적인 유전 물질은 재배된 토마토의 보트리티스-내성 품종을 생산하기 위한 기준을 넓혀주기 위해 사용될 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 분자 마커 검출 기술과 조합하여 토마토 식물에서 보트리티스에의 감염의 초기 및/Ehms 진전된 파라미터의 측정을 포함하는 특별한 정량적 생물학적 분석은 야생 Lycopersicon 취득물 중에서 보트리티스에 대한 내성의 원천을 검출하기 위한 그리고 보트리티스에 대한 토마토의 개선된 내성에 관련된 식물들의 게놈에서 유전 물질을 검출하기 위한 매우 유익한 방법을 제공한다는 것이 현재 발견되었다.
기술들의 이러한 조합을 사용함으로서, 본 발명자들은 토마토의 두 계통(lines)의 야생의 친척, 즉, Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 보트리티스에 대한 부분적 내성을 성공적으로 확인했다.
발명자들은 그 후 비-내성 수용자 토마토 식물과 이들 보트리티스-내성 야생(공여자) 토마토 계통으로부터의 식물들을 교배시킴으로서 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산할 수 있었다. 이들 식물들은 WO 02/085105에 개시된 바와 같이 보트리티스 내성과 관련된 L. hirsutum의 염색체 10 상의 유전 영역을 포함하는 식물들보다 더 높은 수준의 내성을 나타내었다.
공여자 식물의 분자 마커의 존재에 관하여 이들 새롭게 생산된 교배들의 개체군(F2 개체군)을 분리시키는데에 있어서 보트리티스에 대한 내성을 평가함으로서, 본 발명자들은 내성 야생 토마토 계통에서 보트리티스-내성에 연결된 다중 양적 형질 유전자 자리(quantitative trait loci, QTLs)를 확인할 수 있었고 그럼으로써 게놈에서 다중 내성-부여 DNA 서열의 위치를 확립한다. 결과로서, 본 발명자들은 토마토에서 보트리티스 내성이 다중유전적으로 유전된다는 것을 이제 발견했고, 그것은 부분적으로 빈약한 육종 결과를 설명한다. 이 발견은 이제 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 방법의 개선을 제공한다. 하기 기술에서, 토마토에서의 보트리티스에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리(QTL)가 보트리티스-내성에 대한 QTL로서 또는 보트리티스-내성과 관련된 QTL로서 짧게 다루어질 것이다.
보트리티스-내성에 대한 여섯 개의 새로운 QTLs의 전체가 두 개의 야생 토마토 계통에서 발견되었다. 이들 여섯 개의 QTLs 중 네 개가 감염의 초기 확립을 감소시키는 식물의 능력을 반영하는 정량적 파라미터에 연결될 수 있었고, 이하 질환 발병률에 대한 파라미터로 일컬어졌다. 이들 여섯 개의 QTLs 중 두 개는 감염의 진전을 늦추는 식물의 능력을 반영하는 정량적 파라미터로 연결될 수 있었고, 이 하 병변 성장 속도에 대한 파라미터로서 일컬어졌다.
유전 연관 지도를 만듦으로서, L. hirsutum LYC 4/78의 염색체 1은 보트리티스 감염에 의해 유래된 병변의 성장의 감소된 속도에 연결된 QTL을 품고(harbors) 동일한 취득물의 염색체 2 및 4 둘 다는 감소된 질환 발병률에 연관된 QTL을 품는다는 것이 발견되었다. L. parviflorum G1.1601에서, 병변 성장의 감소된 속도에 대한 QTL은, 감소된 질환 발병률에 대한 두 별개의 QTLs가 염색체 3 및 4 상에 위치된 다는 것이 발견된 반면, 염색체 9 상에 위치된다는 것이 발견되었다. 이전의 당업계에서 보고되었듯이, 염색체 10 상의 QTL은 이러한 방법에 의해 검출될 수 없었다. 상기에 언급된 양적 생물학적 분석을 사용함으로서 그에 따라 시험된 L. hirsutum LYC 4/78에서의 모든 QTLs는 조사 하에 QTLs에 대해 분리된 BC2S1 (역교배 2, 자가수분됨) 자손에서의 질환 내성을 평가함으로서 확인될 수 있었다.
본 발명은 첫 번째 양상에서 보트리티스-내성 토마토 식물에 관한 것이고, 여기서 상기 식물은 생물학적 분석에 의해 측정될 때 영향받기 쉬운 대조군(control) 식물보다 적어도 3배 더 낮은 보트리티스 시네레아에 대한 감염가능성을 갖고 여기서 성체 식물에서 보트리티스 시네레아 감염으로부터 생기는 줄기 병변의 평균 길이는 표준 실행 조건 하에서 3주 기간 중에 측정된다. 내성의 수준에 대한 측정으로서 여기서 사용되듯이 3주의 기간에 걸친 줄기 병변 길이는 여기서 기술되어 있듯이 표준 실행 조건에 의해 측정될 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 보트리티스-내성 토마토 식물은 상기 식물이 그것의 게놈 내에 적어도 하나의 QTL 또는 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 보트리티스-내성과 관련된 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택된 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함한다는 것을 특징으로 하고, 여기서 상기 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성 부여 부분은 그것의 천연 유전 배경에 없다.
본 발명은 또 하나의 양상에서 토마토에서 보트리티스에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리(QTL)를 검출하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물을 비-내성 또는 부분적으로 내성인 (보트리티스에 감염되기 쉬운) 수용자 토마토 식물과 교배시키는 단계; 하나 이상의 자손 식물을 보트리티스의 감염량과 접촉시키는 단계; 질환 발병률 및/또는 상기 하나 이상의 자손 식물에서 병변 성장의 속도를 양적으로 측정하는 단계; 관찰된 질환 발병률 및/또는 상기 하나 이상의 자손 식물에서 상기 공여자 토마토 식물의 염색체 마커의 존재에 대한 병변 성장 속도를 연결하는 유전 연관 지도를 확립하는 단계; 및 양적 형질 유전자 자리로 감소된 질환 발병률 및/또는 감소된 병변 성장 속도에 연관된 상기 지도 상의 연속 마커를 할당하는 단계를 포함한다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 상기에 약술되어 있듯이 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 QTL을 검출하기 위하 방법에 의해 얻어진 QTLs에 관한 것이다. 이들 QTLs는 종래의 당업의 QTLs와는 다르다. 하나에 대해, 종래의 당업의 QTLs는 발견될 수 없었다. 게다가, 본 발명의 QTLs는 그것들이 그 질환의 발병률에 대항하는 식물의 능력에 관련된 특징, 또는 질환의 진행을 늦추는 식물의 능력에 관련된 특징을 나타내기 때문에 종래의 당업의 것보다 더 유익하다. 그러한 정보는 그것의 조합이 개선된 내성을 적절하게 제공할 수 있고, 한 세대로부터 다른 세대로의 내성 형질(trait)의 적당한 유전은 더 잘 억제될 수 있다.
본 발명은 게다가 토마토에서 보트리티스-내성에 대한 QTL에 관한 것이고, 여기서 상기 QTL은 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 보트리티스-내성과 관련된 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 QTLs는 보트리티스에 대한 내성과 이전에 관련되지 않은 게놈의 위치 상에 위치된다. 이들 QTLs의 상세는 여기서 하기에 더 상세히 기술되어 있다.
이들 QTLs에 의해 나타내지는 게놈의 위치 상에 존재하는 대립 유전자는 본 발명의 하나의 양상이다.
본 발명의 QTL은 단리된, 바람직하기는 상기 QTL 또는 그것의 내성-부여 부분을 포함하는 이중 가닥을 가진 핵산의 형태일 수 있다. 매우 적절하게는, 예를 들면 적절한 공여자 식물의 염색체로부터 단리될 수 있는, 핵산 서열의 크기는 상기 염색체 상의 1-100 cM, 바람직하기는 10-50 cM의 유전적 거리를 나타낼 수 있다. 상기 핵산은 적어도 50, 더 바람직하기는 적어도 500, 훨씬 더 바람직하기는 적어도 1000, 훨씬 더 바람직하기는 적어도 5000 염기쌍을 포함할 수 있다. QTL을 포함하는 하나 이상의 핵산 서열 또는 본 발명에 따른 그것의 내성-부여 부분은 핵산 구성체에 차례로 포함될 수 있고, 상기 구성체는 상기 하나 이상의 핵산 서열의 측면에 위치하는(flank) 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 영역은 상기 하나 이상의 핵산 서열의 적절한 보트리티스에-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물로의 전이를 위한 적절한 벡터로 통합될 수 있다. 벡터는 적절한 프로모터 영역 또는 다른 조절 서열을 또한 포함할 수 있다. QTLs는 또한 토마토 식물의 게놈 내에 존재하는 형태일 수 있다. 본 발명의 QTLs는 바람직하기는 표 1 및 2의 마커 및 상기 QTL에 연결된 도 1, 5 및 6에 나타내지는 것과 같은 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 보트리티스-내성과 관련된 하나 이상의 마커, 바람직하기는 둘, 더 바람직하기는 셋, 훨씬 더 바람직하기는 넷, 훨씬 더 바람직하기는 넷 이상의 마커를 포함한다.
본 발명은 또한 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 양적 형질 유전자 자리(QTL)을 검출하기 위한 방법들 중의 하나를 수행하기 위해 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물에서의 보트리티스-내성에 대한 QTL을 검출하는 단계, 그리고 상기 공여자 식물로부터 보트리티스에-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물로, 그에 따라 검출된 적어도 하나의 QTL을 포함하는 핵산, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 전이시키는 단계를 포함한다.
적어도 하나의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산의 전이는 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물을 자손 식물을 생산하기 위해 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물과 교배시키는 단계; 및 자손 식물 중으로부터 그것의 게놈에 상기 공여자 토마토 식물로부터 이입된(introgressed) 핵산을 포함하는 식물을 선택하는 단계에 의해 적절하게 수행될 수 있고, 여기서 상기 이입된 핵산은 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함한다. 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 하나 이상의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분의 상기 이입된 핵산에서의 존재는 본 발명에 따른 방법에 의해 적절하게 검출될 수 있고 여기서 표 1 및 2의 마커 및 보트리티스-내성에 연관된 도 1, 5 및 6에 나타내지는 것과 같은 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커가 검출된다.
그러므로 바람직한 선택 방법은 상기 이입된 DNA의 마커-어시스티드(assisted) 선택(MAS)을 포함하고(예를 들면 Tanksley et al. 1998 참조) 여기서 상기 QTL과 관련된 하나 이상의 마커는 자손 식물에서 검출된다. MAS는 예를 들면 상기 자손 식물로부터 유전 물질을 단리함으로서 그리고 분자 기술에 의해, 하나 이상의 공여자 식물 마커의 거기에서의 존재를 측정함으로서 실행될 수 있다. 대안으로, 분자 마커 검출 방법은 유전 물질의 이전의 단리 없이 사용될 수 있다. 임의로, 마커 검출에 더하여, 보트리티스 내성에 대한 표현형 시험이 적절한 식물을 선택하도록 수행될 수 있다. 그러므로 매우 적절한 시험은 여기서 기술되듯이 정량적인 생물학적 분석이고, 그것에 의해(whereby) 질환 발병률과 같은 파라미터 및/또는 병변 성장의 속도가 측정된다. 내성 표현형의 존재의 확립과 조합하여 보트리티스-내성에 대한 QTL로부터 적어도 하나의 마커의 존재의 확인은 공여자 식물로부터 수용자 식물로의, 적어도 하나의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산의 성공적인 전이를 위한 증거를 제공한다.
보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 방법의 대안적 구현예에서, 핵산의 나타내어진 전이는 트랜스제닉 방법(예를 들면 형질전환에 의한), 원형질체 융합에 의해, 이중 단상체(haploid) 기술에 의해 또는 미숙배배양(embryo rescue)에 의해 수행될 수 있다.
보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 방법의 바람직한 구현예에서, 공여자 식물은 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 및/또는 Lycopersicon parviflorum G1.1601이고 이들 공여자 식물로부터 수용자 식물로 전이된 핵산은 바람직하기는 보트리티스 내성과 관련된 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1 (QTL-1h), 2 (QTL-2h) 및 4 (QTL-4h) 상의 QTLs 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3 (QTL-3p), 4 (QTL-4p) 및 9 (QTL-9p) 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택된 보트리티스-내성에 대한 하나 이상의 QTL을 포함한다.
보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 또 하나의 바람직한 구현예에서, 본 방법은 첫번째 세대 자손 식물을 생산하도록 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물을 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물과 교배시키는 단계; 그것의 게놈에 상기 공여자 토마토 식물로부터 이입된 핵산을 포함하는 첫번째 세대 자손 식물 중에서부터 선택하는 단계, 여기서 상기 이입된 핵산은 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 적어도 하나의 QTL, 바람직하기는 둘, 더 바람직하기는 둘 이상의 QTLs, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 식물을 포함한다; 상기 선택된 자손 식물을 두 번째 세대 자손 식물을 생산하도록 적절한 상업적 토마토 계통과 교배시키는 단계; 그것의 게놈에 상기 첫번째 세대 자손 토마토 식물로부터 이입된 핵산을 포함하는 두 번째 세대 자손 식물 가운데서 선택하는 단계, 여기서 상기 이입된 핵산은 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 적어도 하나의 QTL, 바람직하기는 둘, 더 바람직하기는 둘 이상의 QTLs, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하고, 임의로 자손 식물의 또 하나의 세대를 생산하는 단계를 포함한다. 언급된 자손 식물에 이입된 보트리티스-내성에 대한 바람직하기는 둘, 더 바람직하기는 둘 이상의 QTLs는 질환 발병률에 대한 QTLs, 병변 성장 속도에 대한 QTLs 또는 이들 유형의 조합일 수 있다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 보트리티스-내성 토마토 식물, 또는 그것의 부분에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 그것의 게놈에 하나 이상의 QTLs, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는, 보트리티스-내성 토마토 식물, 또는 그것의 부분에 관한 것이고, 여기서 상기 QTL은 보트리티스-내성과 관련된 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 QTL 또는 상기 그것의 보트리티스-내성-부여 부분은 그것의 천연인 유전적 배경에 있지 않다.
게다가 또 하나의 양상에서, 본 발명은 보트리티스-내성 근교(inbred) 토마토 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 본 발명의 방법에 따른 보트리티스-내성 토마토 식물을 생성하는 단계, 상기 식물을 자가수분(selfing)하는 단계, 상기 자가수분된 식물로부터 얻어진 종자를 새로운 식물로 성장시키는 단계; 보트리티스 내성을 나타내고 상기 새로운 식물 가운데서 상업적으로 바람직한 특징을 소유하는 식물을 확인하는 단계, 및 보트리티스 내성을 나타내고 상업적으로 바람직한 특징을 소유하는 근교 토마토 식물이 생산될 때까지 자가수분과 선택 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
보트리티스-내성 근교 토마토 식물을 생산하는 방법은 또한 보트리티스 내성을 나타내고 상업적으로 바람직한 특징을 소유하는 동형접합체 근교 토마토 식물을 선택하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는, 보트리티스-내성 근교 토마토 식물, 또는 그것의 부분에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 보트리티스에 대한 내성을 나타내는, 교잡종(hybrid) 토마토 식물, 또는 그것의 부분에 관한 것이고, 여기서 상기 교잡종 토마토 식물은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 보트리티스-내성 근교 토마토 식물을 상업적으로 바람직한 특징을 나타내는 근교 토마토 식물과 교배시킴으로서 얻어질 수 있다.
본 발명은 게다가 본 발명의 토마토 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양에 관한 것이다. 그러한 조직 배양의 바람직한 구현예에서, 세포 또는 상기 세포의 원형질체는 잎, 꽃가루, 배(embryo), 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 과실, 및 줄기 및 종자로 이루어진 군으로부터 선택된 조직으로부터 단리되었다.
본 발명은 게다가 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 QTLs의 검출을 위한, 그리고/또는 보트리티스-내성 토마토 식물의 검출을 위한, 표 1 및 2의 마커 및 도 1, 5 및 6에 나타내진 것과 같은 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서 사용된 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물은 바람직하기는 Lycopersicon cerasiforme , Lycopersicon cheesmanii , Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii , Lycopersicon esculentum , Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum , Lycopersicon pennellii , Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium 및 Solanum lycopersicoides로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하기는 야생 Lycopersicon 취득물(accession)이 공여자 식물로서 사용된다. 아주 바람직한 공여자 식물은 Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum , 특히, Lycopersicon hirsutum LYC 4/78, Lycopersicon parviflorum G1.1601이다.
본 발명의 방법에서 사용된 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물은 바람직하기는 종 Lycopersicon esculentum, 더 바람직하기는 상업적으로 바람직한 특징을 소유한 L. esculentum 품종, 또는 또 하나의 상업적 토마토 계통의 식물이다.
정의
여기서 제공된 제목은 전체로서 명세서에 대한 참조로서 가질 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 하기에 즉각적으로 정의된 용어들은 전체로서 명세서에 대한 참조로서 더 충분히 정의된다.
여기서 사용되듯이, "보트리티스"라는 용어는 토마토의 줄기, 잎 및 과실 상에서 흔히 발견되는 질환, 회색 곰팡이 또는 그레이 스폿으로서 또한 알려진, 보트리티스 시네레아를 의미한다. 식물 병원성 진균 Sclerotinia sclerotiorum은 B. cinerea의 것과 유사한 감염 메커니즘을 갖는다고 대개 생각된다(Prins et al., 2000). 토마토에서 S. sclerotiorum-감염은 경제적으로 B. cinerea-감염보다 훨씬 덜 중요하고, 둘 다의 진균류는 프로테아제의 스펙트럼, 식물 세포 벽-퇴화 효소, 옥살산 뿐만 아니라 독소들을 분비한다. 이들 요인들 중 일부는 둘 다의 진균류의 감염 전략에서 역할을 한다고 알려져 있다. 그 결과, 보트리티스에 대한 내성을 부여하는 메커니즘 및 유전자는 S. sclerotiorum에 의한 감염에 대한 내성을 제공하는데 동등하게 유효하다고 믿어진다. 그러므로, 여기서 '보트리티스-내성'으로 일컬어질 때, 그러한 내성은 Sclerotiniaceae의 일족의 어떤 진균류에 대한 내성, 바람직하기는 S. sclerotiorum 및 B. cinerea에 대한 내성, 더 바람직하기는 B. cinerea에 대한 내성을 포함하는 것으로써 이해되어야 한다.
여기서 사용되듯이, "대립 유전자(들)"이라는 용어는 유전자의 하나 이상의 대안적 형태 중 어떤 것을 의미하고, 대립 유전자들 모두는 적어도 하나의 형질 또는 특징과 관련된다. 이배체(diploid) 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자 중 두 대립 유전자는 상동 염색체 한 쌍 위의 상응하는 유전자 자리를 차지한다. 본 발명이 QTLs, 즉 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있는 유전 영역, 그러나 또한 조절 서열에 관한 것이기 때문에, 그것은 일부 경우에서 "대립 유전자" 대신 "단상형"으로 불리는 것이 더 정확하고, 하지만 그러한 경우들에서, "대립 유전자"라는 용어는 "단상형"이라는 용어를 포함한다고 이해되어야 한다.
"유전자"는 염색체 상에 특정한 위치를 차지하고 유기체에서 특별한 특징 또는 형질에 대한 유전 지시를 함유하는 DNA의 서열로 이루어진 유전적 유니트로서 여기서 정의된다.
"유전자 자리(locus)"는 주어진 유전자가 주어진 종의 염색체 상에서 차지하는 위치로서 여기서 정의된다.
여기서 사용되듯이, "이형접합(heterozygous)"이라는 용어는 상동 염색체 상에 상응하는 유전자 자리에 다른 대립 유전자가 있을 때 존재하는 유전 조건을 의미한다.
여기서 사용되듯이, "동형접합(homozygous)"이라는 용어는 상동 염색체 상에 상응하는 유전자 자리에 동일한 대립 유전자가 있을 때 존재하는 유전 조건을 의미한다.
여기서 사용되듯이, "교잡종(hybrid)"이라는 용어는 두 근교 계통 사이의 교배를 포함하지만 그것에 한정되지는 않는, 두 유전적으로 다른 개체 사이의 교배의 어떤 자손을 의미한다.
여기서 사용되듯이, "근교(inbred)"라는 용어는 실질적으로 동형접합 개체 또는 계통을 의미한다.
이 출원에서 "재조합 이벤트"는 감수 역-교차(crossing-over)로 이해된다.
여기서 사용되듯이, "이입(introgression)", "이입된" 및 "이입하는"이라는 용어는 천연 및 인위적 방법 둘 다에 관한 것이고 그것에 의해 하나의 종의 유전자, 품종 또는 재배종은 그들 종을 교배시킴으로서, 또 하나의 종, 품종 또는 재배종으로 이동되고, 그 방법은 되풀이하여 부모 (recurrent parent)로 역교배시킴으로서 임의로 완수될 수 있다.
"유전 공학", "형질전환" 및 "유전 변형(modification)"은 또 하나의 유기체의, 단리되고 클론된 유전자의 DNA, 보통 염색체 DNA, 또는 게놈으로의 전이에 대한 동의어로서 여기서 모두 사용된다.
여기서 사용되듯이, "분자 마커"라는 용어는 핵산 서열의 특징의 차이를 시각화하기 위한 방법으로 사용되는 지표를 나타낸다. 그러한 지표의 예로는 제한 절편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 마커, 증폭 단편 길이 다형성(amplified fragment length polymorphism, AFLP) 마커, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs), 미소위성(microsatellite) 마커(예를 들면 SSRs), 서열-특정된 증폭 영역(sequence-characterized amplified region, SCAR) 마커, cleaved amplified polymorphic sequence(CAPS) 마커 또는 동질효소 마커 또는 특정한 유전적 및 염색체 위치를 정의하는 여기에 기술된 마커들의 조합이 있다.
"내성인(resistant)" 및 "내성"이라는 용어는 감염에 대한 부분적 및 완전한 내성 둘 다를 포함한다. 보트리티스-감염되기 쉬운 토마토 식물은 비-내성이거나 보트리티스에 의한 감염에 대해 낮은 수준의 내성을 갖는다.
여기서 사용되듯이, "식물 부분(plant part)"이라는 용어는 단일 세포 및 식물, 세포 단괴(clumps) 및 토마토 식물이 재생될 수 있는 조직 배양물에서 변하지 않은(intact) 식물 세포와 같은 세포 조직을 포함하는, 토마토 식물의 부분을 나타낸다. 식물 부분의 예로는 꽃가루, 배주(ovules), 잎, 배(embryos), 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 슈트(shoots), 접순(scions), 뿌리줄기(rootstocks), 종자, 원형질체, 칼리(calli), 등 뿐만 아니라, 꽃가루, 배주, 잎, 배, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 줄기 슈트 및 종자로부터의 단일 세포 및 조직을 포함하지만, 이것에 한정되지는 않는다.
여기서 사용되듯이, "개체군(pooulation)"이라는 용어는 공통적 유전적 유래를 공유하는 식물의 유전적으로 이종인 모집물들을 의미한다.
여기서 사용되듯이, "토마토"라는 용어는 Lycopersicon cerasiforme , Lycopersicon cheesmanii , Lycopersicon chilense , Lycopersicon chmielewskii , Lycopersicon esculentum(또는 Solanum lycopersicum), Lycopersicon hirsutum , Lycopersicon parviflorum , Lycopersicon pennellii , Lycopersicon peruvianum , Lycopersicon pimpinellifolium , 또는 Solanum lycopersicoides를 포함하지만 이것에 한정되지는 않는 어떤 식물, 계통 또는 개체군을 의미한다. 린네가 현대의 토마토를 Solanum으로서 최초로 분류했지만, 여러 해 동안 그것의 과학적 명칭은 Lycopersicon esculentum이었다. 유사하게, 현대의 토마토의 야생 친척들은 L. pennellii, L. hirsutum, L. peruvianum, L. chilense, L. parviflorum, L. chmielewskii, L. cheesmanii, L. cerasiforme , 및 L. pimpinellifolium과 같은 Lycopersicon 속 내에서 분류되었다. 과거 수 년에 걸쳐, 이들 종들의 명칭들을 재분류하자는 토마토 연구자들 및 식물학자 사이의 논쟁이 있어왔다. 현대의 토마토에 대한 새롭게 제안된 과학적 명칭은 Solanum lycopersicum이다. 유사하게, 야생 종의 명칭이 변경될 수 있다. L. pennellii는 Solanum pennellii가 될 수 있고, L. hirsutum은 S. habrochaites가 될 수 있고, Lycopersicon peruvianum은 S. 'N peruvianum' 과 S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, 및 S. corneliomuelleri로 갈라질 수 있고, L. parviflorum은 S. neorickii가 될 수 있고, L. chmielewskii는 S. chmielewskii가 될 수 있고, L. chilense는 S. chilense가 될 수 있고, L. cheesmaniae는 S. cheesmaniae 또는 S. galapagense가 될 수 있고, L. pimpinellifolium은 S. pimpinellifolium이 될 수 있다(Solanacea Genome Network (2005) Spooner and Knapp; http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum nomenclature.html).
여기서 사용되듯이, "품종(variety)" 또는 "재배종(cultivar)"이라는 용어는 구조적 또는 유전적 특징 및/또는 수행(performance)에 의해 동일 종 내의 다른 품종들과 구별될 수 있는 유사한 식물의 군을 의미한다.
"QTL"이라는 용어는 그것의 당업계에서-인정된 의미로 여기서 사용된다. 보트리티스-내성에 대한 QTL"이라는 더 짧은 용어뿐만 아니라 "토마토에서 B. cinerea에 대한 내성과 관련된 QTL"이라는 용어는 보트리티스-내성에 대해 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 조절 영역과 관련된 토마토의 특정한 염색체 상에 위치된 영역, 즉 보트리티스-내성에 포함된 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 염색체의 영역을 일컫는다. 그 유전자의 표현형 발현은 예를 들면 병변 성장의 감소된 속도 및/또는 감소된 질환 발병률로서 관찰될 수 있다. QTS은 예를 들면 생산물이 유전적 내성을 부여하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 대안으로, QTL은 예를 들면 생산물이 식물의 게놈에서 다른 유전자 자리 상의 유전자의 발현에 영향을 끼치고 그것에 의해 보트리티스-내성을 부여하는 조절 유전자 또는 서열을 포함한다. 본 발명의 QTLs는 하나 이상의 분자 유전 마커를 사용하여 각각의 야생 Lycopersicon 취득물의 게놈에서의 그것들의 유전 위치를 나타냄으로서 정의될 수 있다. 차례로, 하나 이상의 마커는 특정한 유전자 자리를 나타낸다. 유전자 자리 사이의 거리는 보통 동일한 염색체 상의 유전자 자리 사이의 교차(crossing-over) 빈도에 의해 측정된다. 반대로, 두 유전자자리가 함께 근접하다면, 교차는 그것들 사이에서 덜 일어날 것이다. 대개, 일 센티모건(cM)은 유전자자리(마커) 사이의 1% 재조합과 동일하다. QTL이 다수 마커에 의해 나타내질 때 종점 마커 사이의 유전 거리는 QTL의 크기로 나타낸다.
"보트리티스-감염되기 쉬운(susceptible) 수용자 토마토 식물"이라는 용어는 보트리티스-내성에 대한 QTL을 포함하는 공여자 토마토 식물로부터 얻어진 DAN를 받는 토마토 식물을 나타내기 위해 여기서 사용된다. 상기 "보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물"은 보트리티스-내성에 대하 하나 이상의 QTLs를 이미 포함하거나 포함할 수 없고, 이 경우에 그 용어는 추가적 QTL을 받는 식물을 나타낸다.
"천연 유전 배경(natural genetic background)"이라는 용어는 QTL의 본래의 유전 배경을 나타내기 위해 여기서 사용된다. 그러한 배경은 예를 들면 토마토의 보트리티스-내성 야생 취득물의 게놈일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 QTLs는 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 특정 위치에서 발견되었다. 하나의 예로서, Lycopersicon hirsutum LYC 4/78은 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs의 천연 유전 배경을 나타낸다. 또한 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78은 상기 QTLs의 천연 유전 배경을 나타낸다. 반대로, Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1로부터 또 하나의 토마토 종의 염색체 1 상의 동일한 위치로, QTL, 또는 그것의 내성-부여 부분을 포함하는 DNA의 전이를 포함하는 방법은 그 QTL, 또는 상기 그것의 내성 부여 부분을 초래할 것이고, 그것의 천연 유전 배경에 없을 것이다.
"질환 발병률"이라는 용어는 감염의 확립을 감소시키는 식물의 능력을 반영하는 파라미터로서 여기서 정의되고 예를 들면 감염원과의 접촉시 식물의 감염을 달성하는 결과를 측정함으로서 확립될 수 있다.
"병변(lesion) 성장의 속도" 또는 "병변 성장 속도"라는 용어는 감염의 진행을 늦추거나 감소시키는 식물의 능력을 반영하는 파라미터로서 여기서 정의되고, 예를 들면 확장된 병변의 성장 속도를 측정함으로서 확립될 수 있다.
"정량적 측정"이라는 용어는 측정, 특히 양 및 수의 조건으로 측정가능한 양상들의 측정을 포함하는 방식으로 확립하거나 평가하는 것으로서 여기서 정의된다. 엄정한 정도 및 더 크고, 더 많고, 더 적은 표시 도수(indications)의 측정은 "정량적 측정"이라는 현재의 용어에 포함되지 않고, 용어는 절대값을 측정하기 위한 객관적 계수 메커니즘의 존재를 궁극적으로 내포한다. 그러므로, "정량적으로 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도를 측정하는 것"은 바람직하기는 식물 및 측정가능한 병변(질환 발병률을 평가하기 위한)을 가져오는 감염원 사이의 모든 잠재적으로 감염성이 있는 접촉의 백분율을 측정하는 것, 및/또는 진균 성장에 대한 우호적 조건 하에 시간에 대한 하나 이상의 상기 병변의 지름, 원주, 표면적 또는 부피(병변 성장의 속도를 평가하기 위한)를 포함한다.
"표준 실행 조건", "표준 온실 조건" 및 "표준 조건"이라는 용어는 예를 들면 표준인 것으로서, 질환 발병률의 표현형적 특징부여 목적을 위해, 식물이 성장되거나 배양되는 빛, 습도, 온도, 등의 조건을 일컫는다. 예를 들어 온실에 대해서는, 이것은 일 16-h, 15℃-25℃를 일컫는다. 더 일반적으로, 그 용어들은 8-24 h의 명기(photoperiod) (광합성 광자 플럭스(PPF) 50-1000 μmol m-2s-1), 바람직하기는 600-700 ppm CO2 및 대기 O2 농도 및 대기 압(일반적으로 1008 hPa)에서 16 시간의 빛 과 8시간의 암의 빛 상황, 낮 동안 약 19℃ 및 밤에는 15℃를, 약 60%-85%의 상대 습도(RH)에 상응하는 약 4.4 g m-3의 물 증기압 부족을 갖는 표준 및 참조 성장 조건을 일컫는다. 물 및 영양분은 줄기 가까이에서 드롭 와이즈(drop wise)가 주어질 수 있거나, 분무 또는 미스트(mist)의 형태로 주어질 수 있다. 줄기 병변 길이 분석, 질환 발병률 및 병변 성장 속도 측정과 같은, 표준 생화학적 분석 실험 조건은 하기 실시예에서 더 잘 상술된다. 더 상세히, 평균 줄기 병변 길이 분석이 실시예 3.10 및 3.11에 기술되어 있듯이 수행될 것이다.
토마토에서 보트리티스에 대한 내성과 관련된 QTLs 의 확인
야생 Lycopersicon 종은 질환에 대한 적절한 원천(sources) 및 해충 내성 형질을 제공하고 야생 Lycopersicon 종의 잎에서의 B. cinerea에 대한 부분적 내성의 존재는 문서로 증명되었다(Urbasch, 1986). 두 요인이 과거에 토마토에서의 B. cinerea에 대한 육종을 방해해왔다. 첫번째로, 부분적 내성을 상업적 육종 계통으로 교배시키는 것은 제한된 성공과 마주쳤다. 두 번째로, 신뢰할 만하고 재생가능한 질환 분석은 내성을 부여하는데 책임이 있는 유전 물질의 확인 및 위치 측정을 가능하게 하는 결핍이었다.
예를 들면, 감염 과정에 강하게 영향을 끼치는, 영양분의 과잉을 진균류에 제공하는 아가 플러그를 사용하여 균사체로 잎을 감염시켰다. 다른 연구자들은 양적 형질 유전자 자리(QTLs)의 확인을 위해 요구되는 정량적 분석에 부적절한, 주관적 식물 질환 지표를 사용했다.
실험실 조건 하에 Lycopersicon esculentum에서의 보트리티스 시네레아 감염은 상대적으로 잘 연구되었다 (예를 들면, Benito et al., 1998). 잎들의 작은 물방울 접목 및 그 후의 중간 온도(15-20℃)에서의 배양은 접종원의 부위에서 괴사 반점의 급속한 (16-24 h 감염-후(hpi)) 발달을 가져온다. 감염은 대략 48h 동안 이 점에서 일시적으로 제한된다. 그 순간으로부터 앞으로 병변의 비율은 (대개 5-10%)확대되기 시작한다. 이들 소위 "확장 병변"의 결과는 균류 바이오매스에서의 증가에 의해 동반되고 다음 48h에 완전한 작은 잎의 군체 형성을 가져온다.
본 발명자들은 토마토에서의 보트리티스-내성과 관련된 특정한 QTLs가 내성을 측정하기 위한 생물학적 분석이 사용될 때 확인될 수 있다는 것을 발견했고 여기서 감염의 진행의 속도 및 또는 감염원과의 접촉 시 감염을 달성하는 성공은 토마토 식물의 부분, 바람직하기는 분리된 부분 상에서, 더 바람직하기는 줄기 구획 상에서 정량적으로 측정된다. 보트리티스-내성에 대한 다중 QTLs가 보트리티스-내성 토마토 식물의 게놈에 존재한다는 것이 놀랍게도 발견되었고, 반면에 종래의 당업의 방법은 보트리티스-내성의 단지 단일한 QTL의 시험적인 확인을 가져왔다. 더욱이, 이들 방법을 사용함으로서 발견된 QTLs는 토마토 식물의 보트리티스-내성과 이전에 관련되지 않은 염색체 상에 위치되었고 QTLs는 내성의 여러 표현형적 발현과 관련되었다. 그러므로, 본 발명의 방법은 토마토에서 보트리티스-내성의 유전적 기초가 폴리제닉한 새로운 시야를 제공했다.
예를 들면, 염색체 1 상에 존재하는 유전 영역은 병변 성장의 감소된 속도를 적어도 부분적으로 초래한 반면, L. hirsutum LYC 4/78의 염색체 2 및 4 상에 존재하는 유전 영역이 감소된 질환 발병률을 초래했다는 것이 발견되었다. 이들 표현형에 연관된 유사한 유전 영역은, 비록 이들이 필수적으로 동일한 염색체 상에 위치되지는 않지만, L. parviflorum G1.1601에 존재한다는 것이 발견되었다.
더욱이 새로운 QTL 영역이 종래의 당업의 염색체 10 상의 QTL과 관련된 것보다 내성의 더 높은 수준과 관련되었다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 이전에 달성된 것보다 더 높은 식물에 대한 내성의 수준을 부여하는 보트리티스 내성에 대한 주요한 QTLs를 드러낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 가지 장점은 그것이 더 높은 수준의 보트리티스에 대한 내성과 관련된 QTLs의 발견을 가져온다는 것이다. 이러한 수준의 내성은 본 발명의 방법을 사용함에 의해서와 같이 또는 종래의 당업의 전통적 방법을 사용함에 의해서와 같은, 이용가능한 어떤 방법에 의해 측정될 수 있다. 실험 설정의 상세한 기술과 조건은 하기 실시예에 제공된다.
반면에 양적 형질 유전자 자리 (QTL)를 확인하거나 위치시키는 방법으로서 불릴 수 있는, 본 발명에 따른 토마토에서의 보트리티스에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리 (QTL)을 검출하는 방법은 (부분적으로) 보트리티스-내성 토마토 식물의 이용가능성을 요구한다. 그러한 식물은 당업계에 알려진 어떤 수단에 의해, 그리고 상기 식물에서의 상기(부분적) 내성의 존재의 측정을 위한 어떤 방법을 사용함에 의해 제공될 수 있다. (부분적으로) 보트리티스-내성 토마토 식물(본 발명의 방법에서 공여자 식물로서 더 한층 작용함)의 준비(provision)는 적어도 하나에 대해서, 하지만 바람직하기는 상기 식물의 모든 염색체에 대해서, 염색체 마커, 바람직하기는 AFLP, CAPS 및/또는 SCAR 마커, 가장 바람직하기는 CAPS 및/또는 SCAR 마커의 확립 또는 준비를 가능하게 한다. 상기 염색체의 전체 길이에 대한 염색체 마커의 모집(collection)을 수립함으로서, 상기 염색체의 여러 위치가 효과적으로 표시될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 실험 방법은 여기 하기에 더 상세히 기술될 것이다.
본 발명에 따라 토마토에서 보트리티스에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리 (QTL)을 검출하는 방법은 자손 식물을 생산하도록 상기 (부분적으로) 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물의 비-내성, 또는 보트리티스 감염되기 쉬운, 수용자 토마토 식물과의 교배를 첫 번째 단계로서 포함한다. 그 후 하나 이상의 자손 식물이 보트리티스의 감염량과 접촉된다. 그러한 양은 식물들 사이에 그리고 시험될 균류 종 사이에 변화할 수 있다. 보통 상기 진균의 약 500-5000의 conidia의 양에 대해 약 1~10의 양이 충분할 것이다.
연이은 단계는 상기 교배로부터 생산된 하나 이상의 자손 식물에서의 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도를 양적으로 측정하는 것을 포함한다. 상기 양적 측정은 바람직하기는 다수의(multiple) 자손 식물에서 실행된다. 자손 식물은 바람직하기는 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물 및 비-내성 또는 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물 사이에 교배로부터 유래된 F2 개체군의 식물들이다. 바람직하기는, 자손으로서, 분리(segregating) F2 개체군, 더 바람직하기는, L. esculentum cv. Moneymaker 및 L. hirsutum LYC 4/78 사이의 교배로부터 유래된 F2 개체군이 사용된다. 실제적으로, 상기 교배로부터 유래된 F1 종자는 F1 식물로 자랄 수 있고, 여기서 하나의 단일 F1 식물이 그 후 F2 종자를 생산하도록 자가 수분된 후에 그 중 연이어 유래된 F2 식물이 본 발명의 방법에서 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도의 측정을 위해 사용된다. 대안으로, F3 계통은 내성 분석을 위해 사용될 수 있다.
하나 이상의 자손 식물을 보트리티스의 감염량과 접촉시키고 질환 발병률 및/또는 상기 하나 이상의 자손 식물에서의 병변 성장의 속도를 양적으로 측정하는 단계는 바람직하기는 여기서 기술되듯이 줄기 구획(segments) 또는 잎 상에서 내성 생물학적 분석의 일부, 바람직하기는 줄기 구획에 대한 내성 생물학적 분석의 일부로서 실행된다. 당업자는 여기서 하기에 기술된 것과 같이 이들 분석에 대한 편차(variations)가 가능하다는 것을 이해할 것이다.
줄기 구획에 대한 내성 생물학적 분석은 필수적으로 하기와 같이 실행될 수 있다: 첫번째로, 자손 식물의 종자가 심어지고 적절하게 대략 50 cm 높이의 묘목/식물로 성장된다. 식물의 줄기의 상층 5-10 cm 및 바닥 5-10 cm는 제거될 수 있고 남은 30 cm는 5-6 cm의 동일한 구획으로 절단될 수 있다. 줄기 구획은 바람직하기는 젖은 필터 종이 상의 줄기 바닥을 가진 격자에서 수직으로 놓인다. 접종에 앞서, 줄기 구획은 병변된 표면 상의 접종물의 동일한 확산을 확실하게 하도록 물로 적절하게 분무된다. 각각의 줄기 구획은 그 후 B. cinerea의 코니디얼(conidial) 현탁물에 의해 접종될 수 있다. 대략 106 코니디아(conidia) ml-1을 포함하는, 접종물의 적절한 양, 예를 들면 약 5 ㎕의 한 방울은 각각의 줄기 구획의 상부 상에 거기에 적용될 수 있다. 줄기 구획은 그 후 적절하게 약 16 ℃의 온도로, 바람직하기는 어둠 속에서, 그리고 바람직하기는 높은 습도 (예를 들면 100% RH)에서 접종된다. 감염 진행은 Vernier 캘리퍼와의 접종 후 여러 시간 간격으로 로트(rot) 증상의 최대 진행을 측정함으로서 양적으로 측정될 수 있다. 많은 적절한 시간 간격으로, 예를 들면 96, 120 및 144 시간 감염-후 (hpi)에, 줄기는 정량적 방식으로, 병변 형성 (질환 발병률) 및 병변 성장에 대해 조사될 수 있다. 매우 적절한 파라미터는 예를 들면, 캘리퍼를 사용함으로서 병변의 크기의 측정을 포함한다. 식물의 활동기 또는 재배에 의해 야기된 편차에 대해 교정하기 위해, 생물학적 분석의 양적 측정은 감염되기 쉬운 대조군 또는 참조 계통에서 유사한 측정과 관련될 수 있다. 질환 발병률은 접종 작은방울(droplets)의 총 수로 병변을 확장시키는 총 수를 나눔으로서 적절하게 측정될 수 있다. 특정한 유전형에 대한 병변을 확장시키는 비율은 그 후 대조군 또는 참조 유전형에서 관찰된 병변을 확장시키는 비율로 나누어질 수 있고 백분율로서 나타내질 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 병변 성장 속도는 적절한 기간, 예를 들면 24 h 기간에 걸쳐 병변 크기 (예를 들면 mm로)의 증가를 계산함으로서 측정될 수 있다. 비-확장 병변에 대한 데이터는 양적 분석으로부터 삭제될 수 있다. 얻어진 병변 성장 속도는 그 후 대조군 또는 참조 유전형에서 관찰된 병변 성장 속도로 임의로 나누어질 수 있고 백분율로써 또는 절대적 수로서, 예를 들면 밀리미터로 나타내질 수 있다.
대안으로, 식물은 하기와 같은 잎 감염 생물학적 분석을 사용함으로서 스크린될 수 있다: 첫번째로, 토마토 종자가 심어지고 묘목/식물로 성장된다. 각각의 개별 식물에 대해 하나 또는 두 복합 잎들이 주된 줄기로부터 절단될 수 있고 사전에 적셔진 화초 재배자 거품(florist foam)으로 이동될 수 있다. 화초 재배자 거품은 그 후 수도물을 함유한 페트리 디쉬에 그 후 놓이고 그 후 젖은 필터 종이를 함유한 스프레이-적셔진 용기에 놓인다. B. 시네레아 코니디아를 포함한 적절한 접종물이 예를 들면 Benito et al., 1998과 같은, 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 복합(compound) 잎은 그 후 많은 물방울, 예를 들면 각각 2 ㎕의 6~10의 물방울을 잎의 상부 표면 상에 적절하게 놓음으로서 B. 시네레아의 코니디알(conidial) 현탁물로 접종된다. 용기는 그 후 폐쇄되고 잎들은 적절하게 15℃-20℃ 사이의 온도로, 바람직하기는 어둠 속에서, 그리고 바람직하기는 높은 습도에서 배양된다. 많은 적절한 시간 간격에서, 예를 들면 96, 120 및 144 hpi에서, 잎들은 그 후 줄기 생물학적 분석에 대해 상기에 기술된 바와 같이 양적 방식으로 질환 발병률 및 병변 성장에 대해 조사될 수 있다.
본 발명에 따라 토마토에서 보트리티스에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리 (QTL)을 검출하는 방법은 관찰된 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도를 상기 하나 이상의 자손 식물에서의 상기 공여자 토마토 식물의 염색체 마커의 존재와 연결시키는 유전 연관 지도를 확립하는 단계 및 감소된 질환 발병률 및/또는 양적 형질 유전자 자리에 대한 병변 성장의 감소된 속도에 연관된 상기 지도 상의 인접한 마커들을 할당하는 단계를 또한 포함한다.
관찰된 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도를 상기 하나 이상의 자손 식물에서 공여자 토마토 식물의 염색체 마커의 존재와 연결시키는 유전 연관 지도는 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 확립될 수 있다. 당업자는 내성 양적 형질 유전자 자리 (QTLs)에 연결된 분자 마커를 확인하고 유전 연관 지도 상의 이들 마커의 맵핑 방법을 알고 있다(예를 들면 Bai et al., 2003; Foolad et al., 2002; van Heusden et al., 1999). 보트리티스-내성 표현형 및 마커 유전형 사이의 연관은 JoinMap® 및 MapQTL®(실시예 참조) 또는 분산 분석의 분석을 수행할 수 있는 어떤 표준 통계 패키지과 같은 소프트웨어 패키지를 사용함으로서 적절하게 실행될 수 있다. 분자 마커는 유전 연관 지도를 구축하기 위해 그리고 보트리티스 내성에 대한 양적 형질 유전자 자리 (QTLs)를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 분자 마커의 적절한 유형 및 그것들을 얻기 위한 방법은 여기서 하기에 더 상세히 기술되어 있다.
보트리티스에 대한 내성과 연관된 양적 형질 유전자 자리 (QTL)을 검출하기 위한 방법은 생물학적 분석에서 실험적 편차를 감소시킴으로서 및/또는 완전한 역교배 근교 개체군 (BIL)의 구축에 의해 더 한층 개선될 수 있다. 본 발명의 방법과 조합하여 그러한 BIL 계통을 사용함으로서, B. 시네레아에 대한 양적인 내성은 훨씬 더 정교하게 평가될 수 있고 추가적 QTLs는 확인될 수 있다.
분자 마커 및 QTLs
분자 마커는 핵산 서열의 차이의 시각화를 위해 사용된다. 이러한 시각화는 DNA-DNA 잡종화(hybridisation) 기술(RFLP) 때문에 및/또는 폴리머라제 사슬 반응 (예를 들면 STS, 미소위성, AFLP)를 사용하는 기술 때문에 가능하다. 두 부모 유전형 사이의 모든 차이는 이들 부모 유전형의 교배에 근거를 둔 맵핑 개체군 (예를 들면 BC1, F2; 도 2 참조)에서 분리될 것이다. 다른 마커의 분리는 비교될 수 있고 재조합 빈도는 계산될 수 있다. 다른 염색체 상의 분자 마커의 재조합 빈도는 일반적으로 50%이다. 동일한 염색체 상에 위치된 분자 마커 사이에 재조합 빈도는 마커들 사이에 거리에 의존한다. 낮은 재조합 빈도는 염색체 상의 마커 사이의 낮은 거리에 상응한다. 모든 재조합 빈도를 비교하는 것은 염색체 상의 분자 마커의 가장 논리적인 순서를 가져올 것이다. 이 가장 논리적인 순서는 연관 지도에 묘사될 수 있다 (Paterson, 1996). 감소된 질환 발병률 및/또는 감소된 병변 성장 속도에 관련된 연관 지도 상에서 부근의 또는 인접한 마커의 군은 QTL의 위치를 정확하게 나타낸다.
QTL의 확인 시, QTL 효과 (내성)는 예를 들면 조사 하의 QTLs에 대해 분리하는 BC2S1 후손에서의 보트리티스-내성을 평가함으로서 확인될 수 있다. 보트리티스 내성의 평가는 여기에 기술되어 있듯이 줄기 또는 잎 생물학적 분석을 사용함으로서 적절하게 실행될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용함으로서 얻어질 수 있는 토마토에서의 보트리티스에 대한 내성에 대한 QTLs는 본 발명의 하나의 양상이다. 그러한 QTLs의 특징은 식물에서 존재할 때, 그것들이 코니디아 또는 균사체의 형태에서와 같이, 어떤 형태로 물질이 제공될 수 있는, 보트리티스 물질의 감염량과 상기 식물을 접촉시킬 때 감소된 질환 발병률 및/또는 감소된 병변 성장 속도의 존재를 나타낸다는 것이다.
본 발명은 또한 토마토에서의 보트리티스에 대한 내성에 대한 QTL에 관한 것이고, 여기서 상기 QTL은 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 보트리티스 내성과 연관된 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 QTLs는 표 1 및 2에 기재되고 도 1, 5 및 6에 나타내져 있는 것과 같은 마커에 의해 더 분명하게 정의되거나 나타내질 수 있다. 표 1 및 도 1 및 6은 L. esculentum cv. Moneymaker x L. hirsutum LYC 4/78의 교배로부터 유래된 F2 개체군에서 발견된 QTLs를 나타낸다. 표 2 및 도 5는 L. esculentum cv. Moneymaker x L. parviflorum G1.1601의 교배로부터 유래된 F2 개체군에서 발견된 QTLs를 나타낸다. 둘 다의 표에서, QTLs가 위치된 유전 영역은 기재된 AFLP-마커에 의해 나타내진다. 본 발명의 QTLs는 토마토 식물에서의 (부분적) 보트리티스 질환 발병률 또는 보트리티스 병변 성장의 감소된 속도를 부여하는 원인인 DNA의 형태에 유전 정보를 포함한다. 유전 정보는 예를 들면 유전자 또는 조절 요소를 포함한다.
표 1. L. esculentum cv . Moneymaker x L. hirsutum LYC 4/78의 교배의 자손에서 발견되는 QTLs 및 관련된 양적 내성 정보
Figure 112007037994733-PCT00001
1마커 명명법: 예를 들어 P-GT M-CAT-412h, 여기서 P와 M은 두 자리(digit)의 확장 코드에 의해 지시된 대로 2 또는 3 별도의 선택성 염기들이 뒤따르는, 공통 PstI와 MseI 프라이머 서열 또는 만능 프라이머(Vos et al., 1995; Bai et al. 2003)이다. 412는 결과의 다형 단편의 염기쌍들에서 대략의 크기이다(주어진 크기±2). 크기는 일반적으로 반올림되지만 소수로도 또한 주어진다. 이 단편은 L. esculentum cv. Moneymaker (e) 또는 L. hirsutum LYC 4/78 (h)중 하나에 증폭된다. 프라이머와 어뎁터 서열은 Bai et al. 2003에 의해 상세히 기술된다.
2AFLP 프라이머 조합이 일반적으로 지시되는 코드. P, M에 대해서는 마커 명명법을 보라. 두 자리의 확장 코드는 다음과 같다: 14: AT; 15: CA; 18: CT; 22:GT; 48: CAC; 49: CAG; 50: CAT; 51: CCA; 60: CTC; 61: CTG.
가장 신뢰할만하게는, QTL-1h가 위치된 유전 영역은 도 6에 도시되어 있듯이 마커 TG301 (표 11) 및 TG460.61 (표 12) 사이에 위치된다. 그러므로, 그 영역 이내에 위치된 어떠한 마커라도, 일치 지도(consensus maps) 토마토-EXPEN 1992 (Tanksley et al., 1992), 토마토-EXHIR 1997 (Bernacchi 및 Tanksley, 1997), 토마토-EXPEN 2000 (Fulton et al., 2002) 또는 토마토-EXPIMP 2001 (Grandillo 및 Tanksley, 1996; Tanksley et al. 1996, Doganlar et al. 2002)로부터와 같이, 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 하는 영역에 위치된다고 알려진 어떤 마커 뿐만 아니라, 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다. 가장 바람직한 영역은 도 6에서의 막대에 의해 나타내진다.
가장 신뢰할만하게는, QTL-2h가 위치된 유전 영역은 도 6에 도시되어 있듯이 마커 TG145 (표 15) 및 At5g64670 (표 19) 사이에 위치된다. 그러므로, 그 영역 이내에 위치된 어떤 마커도 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 하는 영역에 위치된다고 알려진 어떤 마커 뿐만 아니라, 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다. 가장 바람직한 영역은 도 6에서의 막대에 의해 나타내진다.
가장 신뢰할만하게는, QTL-4h가 위치된 유전 영역은 도 6에 도시되어 있듯이 마커 TG609 (표 20) 및 C2At1g74970 (표 24) 사이에 위치된다. 그러므로, 그 영역 이내에 위치된 어떤 마커도 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 하는 영역에 위치된다고 알려진 어떤 마커 뿐만 아니라, 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다.
표 2. L. esculentum cv . Moneymaker x L. parviflorum G1 .1601의 교배의 자손에서 발견되는 QTLs 및 관련된 양적 내성 정보
Figure 112007037994733-PCT00002
1마커 명명법: 예를 들어 P-CA M-CAC-234p, 여기서 P, M 및 E는 지시된 대로 2 또는 3 별도의 선택성 염기들이 뒤따르는, 공통 PstI, EcoRI 및 MseI 프라이머 서열 또는 만능 프라이머(Vos et al., 1995; Bai et al. 2003)이다. 234는 결과의 다형 단편의 염기쌍들에서 대략의 크기이다(주어진 크기±2). 이 단편은 L. esculentum cv. Moneymaker (e) 또는 L. parviflorum G1.1601 (p)중 하나에서 증폭된다. 프라이머와 어뎁터 서열은 Bai et al. 2003에 의해 상세히 설명된다.
2AFLP 프라이머 조합이 일반적으로 지시되는 코드. P, M에 대해서는 마커 명명법을 보라.
3aa, 마커 동형 접합 L. esculentum; b-, 하나의 대립형질 야생 친족(여기는 L. parviflorum) 및 나머지 대립형질은 L. esculentum 또는 야생 친족(relative) 중 하나가 될 수 있다.
가장 신뢰할만하게는, QTL-3p가 위치된 유전 영역은 마커 P15M48-234, P18M50-167, TG599, P18M51-486, P22M50-151 및 P14M60-65에 의해 나타내진다.
가장 신뢰할만하게는, QTL-4p가 위치된 유전 영역은 마커 P14M48-158 및 P14M48-34xCD(=표 2에서의 P14M48-349)에 의해 나타내진다.
가장 신뢰할만하게는, QTL-9p가 위치된 유전 영역은 마커 TG10, P22M50-56, P14M48-56, P14M48-56, P14M50-82, P14M50-204, P15M48-138 (=표 2에서의 P15M48-137), P14M50-174(=표 2에서의 P14M50-176), P22M51-201, P15M48-54, TM2a, P22M51-165, P14M48-120, TG551, P15M48-15xCD (=표 2에서의 P15M48-155)에 의해 나타내진다.
공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 하는 영역에 위치된다고 알려진 어떤 마커 뿐만 아니라, 여기서 기술되어 있는 바와 같이 L. esculentum cv. Moneymaker x L. parviflorum G1.1601의 교배의 자손에서 발견된 QTLs에 대한 모든 마커들은 본 발명의 양상에서 사용될 수 있다.
바람직하기는, 본 발명의 QTL은 표 1 또는 2의 또는 상기 QTL과 연관된 도 1, 5 또는 6에서 나타내지는 바와 같은 적어도 하나의 마커를 포함한다. 보트리티스 내성을 부여하는 원인이 되는 QTL의 핵산 서열은 여기서 확인된 전체 QTL의 단지 분획일 수 있기 때문에, 마커는 단순히 유전 영역의 연결된 유전 또는 그러한 유전 영역 이내에서 관찰된 재조합의 부재를 나타낸다. 그러므로, 표 1 및 2에 기재되고 도 1, 5 및 6에 나타내진 바와 같은 마커는 본 발명의 QTL이 명기된 Lycopersicon 계통의 게놈에 위치된 염색체 영역을 나타낸다는 것 및 그러한 마커들은 필수적으로 그 QTL의 경계 또는 구조를 정의하지 않는다는 것이 유념된다. 따라서, 필수적 내성을 부여하는 핵산 서열(들)을 포함하는 QTL의 부분은 특정한 QTL에 대해 기재된 인접한 마커들에 의해 나타내진 것보다 상당히 더 작을 수 있다. 그러한 부분은 여기서 QTL의 "내성-부여 부분"이라고 일컬어진다. 그 결과 QTL의 내성-부여 부분은 상기 기재된 마커의 어떤 것을 필수적으로 포함할 필요는 없다. 또한 그러한 마커들이 유전적으로 QTLs에 연결되고 당업자가 본 발명의 것들과 유사한 QTL을 발견하거나 사용할 수 있다면, 다른 마커는 여러 QTLs를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 그러나 여기서 표 1 또는 2에 기재되거나 상기 QTL에 연결된 것으로서 도 1, 5 또는 6에 나타내진 하나 이상의 마커는 없다.
토마토에서 보트리티스에 대한 내성에 대한 QTL의 보트리티스-내성-부여 부분은 예를 들면 표 1 또는 2에 보여지거나 도 1, 5 또는 6에 나타내지는 QTL에 대한 하나 이상의 마커를 가지고, 바람직하기는 내성 생물학적 분석과 조합하여 분자 마커 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 QTL의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하지 않은 토마토 식물은 보트리티스에 의한 감염에 상대적으로 감염되기 쉽다.
본 발명에 의해 제공된 마커들은 추측되는 보트리티스-내성 토마토 식물에서 본 발명의 하나 이상의 QTLs의 존재를 검출하는데 적절하게 사용될 수 있고, 그러므로 마커-어시트티드(assisted) 육종 및 보트리티스 내성 토마토 식물의 선택을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 바람직하기는, 본 발명의 QTL의 존재를 검출하는 것은 표 1 또는 2에서 보여지거나 상기 QTL에 연결된 것으로서 도 1, 5 또는 6에 나타내진 QTL에 대한 적어도 하나의 마커에 의해 수행된다. 그러므로 본 발명은 또 하나의 양상에서 상기 마커들의 사용에 의해 존재가 검출될 수 있는, 추측되는 보트리티스-내성 토마토 식물에서 상기 QTL의 핵산 서열의 존재를 검출하는 것을 포함하여, 보트리티스-내성에 대한 QTLs의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 QTL의 핵산 서열은 당업자에게 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 상기 QTL 또는 그것의 내성-부여 부분을 포함하는 핵산 서열은 상기 식물의 게놈을 단편화시키고 상기 QTL을 나타내는 하나 이상의 마커를 품은 단편들을 선택함에 의해 보트리티스-내성 공여자 식물로부터 단리될 수 있다. 이후, 또는 대안으로, 상기 QTL을 나타내는 마커 서열(그것의 부분)은 상기 식물로부터 얻어진 게놈 핵산 샘플 또는 게놈 단편으로부터의 상기 QTL을 포함하는 핵산 서열을 증폭시키기 위해 (PCR) 증폭 프라이머로써 사용될 수 있다. 증폭된 서열은 그 후 단리된 QTL을 얻기 위해 정제될 수 있다. QTL의, 및/또는 여기서 포함된 어떤 추가적 마커들의 뉴클레오티드 서열은 그 후 표준 시퀀싱 방법에 의해 얻어질 수 있다.
그러므로 본 발명은 또한 본 발명의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 단리된 핵산 (바람직하기는 DNA) 서열에 관한 것이다. 따라서, 여기에 기술된 여러 QTLs를 정확하게 나타내는 마커들은 보트리티스 내성에 대해 코딩하는 토마토로부터 하나 이상의 유전자의 확인, 단리 및 정제를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 QTL의 뉴클레오티드 서열은 예를 들면 또한 상기 QTL과 관련된 하나 이상의 마커들의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, 상기 마커 서열의 외부의 QTL 서열을 추가 측정하기 위해 사용될 수 있는 상기 마커 서열에 대한 내부 프라이머를 설계하는 것에 의해 또한 해결될 수 있다. 예를 들면 표 1 및 2로부터의 AFLP 마커들의 뉴클레오티드 서열은 상기 식물의 게놈에서 상기 마커들의 존재의 측정에 사용된 전기영동 겔로부터 상기 마커들을 단리시키고, 당업계에 잘 알려진, 예를 들면 디데옥시 연쇄 종결법에 의해 상기 마커들의 뉴클레오티드 서열을 측정함에 의해 얻어질 수 있다.
추측되는 보트리티스-내성 토마토 식물에서의 QTL의 존재를 검출하는 방법의 구현예로, 본 방법은 또한 바람직하기는 표 1 및 2의 마커들로부터 선택되고 상기 QTL에 연결된 것으로서 도 1, 5 또는 6에 나타내진, 상기 QTL에 연결된 마커의 핵산 서열에 대한 엄격한 잡종화 조건 하에 잡종화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 추측되는 보트리티스-내성 토마토 식물의 유전 핵산과 접촉시키는 단계, 및 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 상기 유전 핵산에 대한 특정한 잡종화의 존재를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하기는 본래 잡종화 방법이 또한 사용될 수 있지만, 상기 방법은 상기 추측되는 보트리티스-내성 토마토 식물로부터 얻어진 핵산 샘플 상에서 수행된다. 대안으로, 그리고 더 바람직한 구현예로는, 당업자는 일단 QTL의 뉴클레오티드 서열이 측정되면, 엄격한 잡종화 조건 하에 상기 QTL의 핵산 서열에 대한 잡종화할 수 있는 특정적 잡종화 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 설계할 수 있고 추측되는 보트리티스-내성 토마토 식물에서 본 발명의 QTL의 존재를 검출하기 위한 방법에서 그러한 잡종화 프로브를 사용할 수 있다.
"엄격한 잡종화 (stringent hybridization) 조건"이라는 어구는 프로브 또는 폴리뉴클레오티드가, 전형적으로는 핵산의 복합 혼합물에서, 그것의 표적 하위서열로 잡종화하지만, 필수적으로 다른 서열로는 잡종화가 없는 조건을 일컫는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 다른 환경에서 다를 것이다. 더 긴 서열들은 더 높은 온도에서 명확하게 잡종화한다. 핵산의 잡종화에 대한 광범위한 안내가 Tijssen (Thijssen, 1993)에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대해 열적 녹는점 (Tm)보다 약 5-10℃가 더 낮도록 선택된다. Tm은 평형에서 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열로 잡종화하는 온도 (정의된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에)이다. 엄격한 조건은 pH 7.0-8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 소디움 이온, 전형적으로는 약 0.01-1.0 M 소디움 이온 농도 (또는 다른 염) 미만인 것들일 것이고 온도는 짧은 프로브 (예를 들면, 10-50 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 30℃이고 긴 프로브 (예를 들면 50 뉴클레오티드보다 더 큰)에 대해서는 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적이거나 특이적 잡종화를 위해, 포지티브 신호는 적어도 두배 배경, 바람직하기는 10배 배경 잡종화이다. 실례가 되는 엄격한 잡종화 조건은 종종: 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS, 42℃에서 배양하는 것, 또는 0.2xSSC에서 세척과 함께, 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 배양하는 것, 그리고 65℃에서 0.1% SDS이다. PCR에 대해서는, 아닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 및 48℃ 사이에서 변화할 수 있지만, 약 36℃의 온도가 낮은 엄격성 증폭화에 대해 전형적이다. 잡종화 파라미터를 측정하기 위한 부가적인 가이드라인은 다양한 참고 문헌, 예를 들면 Current Protocols in Molecular Biology, eds, Ausubel, et al. 1995에 제공된다.
여기서 사용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 문법적 당량은 공유적으로 함께 연결된 적어도 두 개의 뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 길이가 약 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 40, 50으로부터 약 100개까지의 뉴클레오티드이다. 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000, 등등의 더 긴 길이를 포함하는 어떤 길이의 폴리머이다. 본 발명의 핵산은 일부 경우에, 핵산 유사체가 포함되지만, 일반적으로 예를 들면, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 O-메틸포포로아미디트 연결(Eckstein, 1991 참조), 및 펩티드 핵산 백본 및 연관을 포함하는, 교대의(alternate) 백본을 가질 수 있는 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이다. 천연으로 발생하는 핵산 및 유사체의 혼합물들이 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 특히 바람직한 유사체는 펩티드 핵산 (PNA)이다.
트랜스제닉 방법에 의한 보트리티스 -내성 토마토 식물의 생산
본 발명의 또 하나의 양상에 따라, 본 발명의 하나 이상의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산 (바람직하기는 DNA) 서열은 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산을 위해 사용될 수 있다. 이러한 양상에서, 본 발명은 용도가 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물에서 상기 QTL을 포함하는 핵산 서열의 도입을 포함하는 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하기 위한, 본 발명의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분의 사용을 제공한다. 명시했듯이, 상기 핵산 서열은 적절한 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물로부터 유래될 수 있다. 여기서 전에 기술된 QTLs, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분의 하나 이상을 포함하는 핵산 서열을 제공할 수 있는 두 개의 적절한 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물은 L. hirsutum LYC 4/78 및 L. parviflorum G1.1601이다. 보트리티스에 대한 내성을 나타내고 보트리티스 내성에 대해 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 다른 관련된 토마토 식물은 또한 본 발명이 이 물질이 확인될 수 있는지를 설명하므로 보트리티스-내성 공여자 식물로서 활용될 수 있다. 토마토 종의 다른 취득물은 Lycopersicon cerasiforme , Lycopersicon cheesmanii , Lycopersicon chilense , Lycopersicon chmielewskii , Lycopersicon esculentum , Lycopersicon hirsutum , Lycopersicon parviflorum , Lycopersicon pennellii , Lycopersicon peruvianum , Lycopersicon pimpinellifolium 및 Solanum lycopersicoides를 포함하지만, 이것들에 한정되지는 않는 보트리티스-내성에 대해 검사될 수 있다.
일단 적절한 공여자 토마토 식물에서 확인되면, 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산 서열은 이용가능한 어떤 방법에 의해 적절한 수용자 식물로 전이될 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 서열은 형질전환에 의해, 원형질체 융합에 의해, 반수성 이배체 기술에 의해 또는 미숙배배양에 의해 또는 어떤 다른 핵산 전이 시스템에 의해 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물을 감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물 (즉, 이입에 의해)과 교배시킴으로서 전이될 수 있고, 임의로 QTL을 포함하고 보트리티스-내성을 나타내는 자손 식물의 선택이 뒤따른다. 전이의 트랜스제닉 방법을 위해 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 QTL을 포함하는 핵산 서열, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산 서열은 당업계에 알려진 방법을 사용함으로서 상기 공여자 식물로부터 단리될 수 있고 그에 따라 단리된 핵산 서열은 트랜스제닉 방법에 의해, 예를 들면 생식체에서, 또는 상기 핵산 서열로 코팅된 탄도 입자와 같은, 어떤 다른 적절한 전이 요소에서, 벡터에 의해 수용자 식물로 전이될 수 있다.
식물 형질전환은 일반적으로 식물 세포에서 기능할 발현 벡터의 구축을 포함한다. 본 발명에서, 그러한 벡터는 본 발명의 보트리티스-내성에 대한 QTL, 또는 벡터가 조건 하에 있거나 프로모터와 같은, 조절 요소에 실효적으로 연결된 보트리티스-내성-부여 유전자를 포함할 수 있는, 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 그 조합에 함유된 하나 이상의 유전자가 보트리티스-내성에 대해 코딩하면, 발현 벡터는 하나 이상의 그러한 실시 가능하게 연결된 유전자/조절 요소 조합을 함유할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드의 형태일 수 있고, 아그로박테리움 형질전환 시스템과 같은, 당업계에 알려진 형질전환 방법을 사용하여, 보트리티스에 대한 내성이 있는 트랜스제닉 식물을 제공하도록, 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합하여 사용될 수 있다.
발현 벡터는 네거티브 선택 (선택가능한 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장을 억제함에 의한)에 의해, 또는 포지티브 선택 (마커 유전자에 의해 코딩된 생산물에 대해 스크리닝함에 의한)에 의해 재생하도록 마커를 함유하는 형질전환된 세포를 허용하는 조절 요소 (프로모터와 같은)로 실시가능하게 연결된, 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 식물 형질전환을 위해 흔히 사용되는 많은 선택가능한 마커 유전자가 당업계에 알려져 있고 예를 들면, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택적 화학 제제의 독을 대사적으로 제거하는 효소에 대해 코딩하는 유전자, 또는 억제제에 대해 영향받지 않는 변경된 표적을 코딩하는 유전자를 포함한다. 여러 포지티브 선택 방법은 만노스 선택과 같이, 당업계에 알려져 있다. 대안으로, 무-마커(marker-less) 형질전환이 언급된 마커 유전자 없이 식물을 얻기 위해 사용될 수 있고, 그 기술은 당업계에 알려져 있다.
발현 벡터를 식물로 도입하는 하나의 방법은 아그로박테리움 (Horsch et al., 1985 참조)의 천연 형질전환 시스템을 기초로 한다. tumefaciens 및 A. rhizogenes는 유전적으로 식물 세포를 형질전환하는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. tumefaciens 및 A. rhizogenes의 Ti 및 Ri 플라스미드가 각각, 식물의 유전적 형질전환의 원인이 되는 유전자를 지닌다(예를 들면 Kado, 1991 참조). 발현 벡터를 식물 조직으로 도입하는 방법은 직접 감염 또는 아그로박테리움 tumefaciens와의 식물 세포의 공-재배를 포함한다(Horsch et al., 1985). 아크로박테리움 벡터 시스템의 설명 및 아그로박테리움-매개 유전자 전이에 대한 방법은 Gruber 및 Crosby, 1993 및 Moloney et al., 1989에 의해 제공된다. 또한 미국 특허 제 5,591,616호 참조. 식물 발현 벡터 및 리포터 유전자 및 형질전환 프로토콜의 일반적 설명 및 아그로박테리움 벡터 시스템의 설명 및 아그로박테리움-매개 유전자 전이의 방법은 Gruber 및 Crosby, 1993에서 발견될 수 있다. 식물 조직을 재배하는 일반적 방법은 예를 들면 Miki et al., 1993에 의해 그리고 Phillips, et al., 1988에 의해 제공된다. 분자 클로닝 기술 및 적절한 발현 벡터에 대한 적당한 참고 안내서는 Sambrook 및 Russell(2001)이다.
발현 벡터를 식물로 도입하는 또 하나의 방법은 마이크로프로젝틸-매개 형질전환을 기초로 하고 여기서 DNA는 마이크로프로젝틸의 표면 상에 지니게 된다. 발현 벡터는 식물 세포벽 및 막에 침투하기에 충분한 300~600 m/s의 속도로 마이크로프로젝틸을 가속하는 바이오리스틱 도구로 식물 조직으로 도입된다 (Sanford et al., 1987, 1993; Sanford, 1988, 1990; Klein et al., 1988, 1992 참조). DNA를 식물로 도입하는 또 하나의 방법은 표적 세포의 초음파처리를 통해서이다(Zhang et al., 1991 참조). 대안으로, 리포솜 또는 스페로플라스트 융합이 발현 벡터를 식물로 도입하기 위해 사용되었다(예를 들면 Deshayes et al., 1985 및 Christou et al., 1987 참조). CaCl2 침전, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 사용하는 DNA의 원형질체로의 직접적인 흡수가 보고되었다 (예를 들면, Hain et al. 1985 및 Draper et al., 1982 참조). 원형질체 및 전체 세포 및 조직들의 전기천공법(electroporation)이 또한 설명되었다(D'Halluin et al., 1992 및 Laursen et al., 1994).
토마토 표적 조직의 형질전환 후, 상기에 설명된 선택가능한 마커 유전자의 발현은 현재 당업계에 잘 알려진 재생 및 선택 방법을 사용하여, 형질전환된 세포, 조직 및/또는 식물의 우선적 선택을 고려한다. 표 1 및 2의 마커들이 또한 그러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
비- 트랜스제닉 방법에 의한 보트리티스 -내성 토마토 식물의 생산
보트리티스-내성 토마토 식물을 생성하기 위한 대안적 구현예에서, 원형질체 융합은 공여자 식물로부터 수용자 식물로 핵산의 전이를 위해 사용될 수 있다. 원형질체 융합은 단일 bi- 또는 멀티-핵 세포를 생성하도록 둘 이상의 원형질체 사이의, (그 세포벽의 세포는 효소 처리에 의해 제거된다)체세포 잡종화와 같은, 유도되고 자연적인 결합이다. 심지어는 천연적으로 상호육종될 수 없는 식물 종으로 얻어질 수 있는, 융합된 세포는 형질의 바람직한 조합을 나타내는 잡종 식물로 재배된 조직이다. 더 상세하게는, 첫번째 원형질체는 보트리티스에 의한 감염에 대해 내성을 나타내는 토마토 식물 또는 다른 식물 계통으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들면, L. hiesutum LYC 4/78로부터의 원형질체가 사용될 수 있다. 두번째 원형질체는 두번째 토마토 또는 다른 토마토 품종, 바람직하기는 질환 내성, 곤충 내성, 귀중한 과실 특징, 등과 같은 상업적으로 바람직한 특징을 포함하지만, 그것에 한정되지는 않는 토마토 계통으로부터 얻어질 수 있다. 원형질체는 그 후 당업계에 알려진, 전통적인 원형질체 융합 절차를 사용하여 융합된다.
대안으로, 미숙배배양이 공여자 식물로부터 수용자 식물로의 본 발명의 하나 이상의 QTLs를 포함하는 핵산의 전이에서 사용될 수 있다. 미숙배배양은 교배로부터 배를 단리시키기 위한 절차로서 사용될 수 있고 여기서 식물은 생육가능한 종자를 생성하지 못한다. 이러한 과정에서, 수정된 씨방 또는 식물의 미성숙 종자는 새로운 식물을 만들기 위해 배양된 조직이다(Pierik, 1999).
본 발명은 또한 상기에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 공여자 토마토 식물에서 B. 시네레아에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리 (QTL)의 존재를 검출하기 위한 방법을 수행하는 단계, 및 그에 따라 검출된 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산 서열을 상기 공여자 식물로부터 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물로 전이시키는 단계를 포함하는 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵산 서열의 전이는 여기서 이전에 기술된 방법에 의해 수행될 수 있다.
그러한 방법의 바람직한 구현예는 상기 식물들을 교배시킴으로서 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물로부터 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물로 상기 핵산 서열의 이입에 의한 전이를 포함한다. 이 전이는 따라서 전통적 육종 기술을 사용함으로서 적절하게 달성될 수 있다. QTLs는 바람직하기는 마커-어시트티드 육종 (MAS)을 사용함으로서 상업적 토마토 품종으로 이입된다. 마커-어시스티드 육종 또는 마커-어시스티드 선택은 바람직한 형질에 대해 코딩된 하나 이상의 유전자를 함유한 자손 식물들의 확인 및 선택을 위한 하나 이상의 분자 마커의 사용을 포함한다. 본 경우에서, 그러한 확인 및 선택은 본 발명의 QTLs 또는 그와 함께 관련된 마커의 선택을 토대로 한다. MAS는, 각각의 QTL 효과의 더 상세한 연구를 허용하면서 또한 관심 대상의 QTL을 품은 근-동질 유전자 계통 (NIL)을 개발하도록 사용될 수 있고 또한 역교배 근교계(BIL) 개체군의 발달을 위한 유효한 방법이다(Nesbitt et al., 2001; van Berloo et al., 2001). 이 바람직한 구현예에 따라 개발된 토마토 식물은 수용자 식물로부터 그것들의 형질의 대다수를 유익하게 유도할 수 있고, 공여자 식물로부터 보트리티스-내성을 유도할 수 있다.
B 시네레아에 대한 내성은 다유전자적으로 유전되다는 것이 현재 발견되었기 때문에, 적어도 둘, 바람직하기는 세 개의 QTLs 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분은 단일 수용자 식물로 적절한 전이 방법에 의해 삽입되는 것이 바람직하다. 즉 다중 QTLs은 수용자 식물의 게놈에 쌓인다. 본 발명의 둘 이상의 QTLs의 스태킹(stacking)은 보트리티스에 대한 증가된 내성을 초래할 수 있다. 당업자가 쉽게 이해하듯이, 스태킹은 어떤 방법, 예를 들면, 식물을 본 발명의 다중 QTLs를 포함하는 핵산 구성체로 형질전환함에 의해 달성될 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 QTL은 둘 이상의 QTLs가 그 결과의 교잡종에 포함되도록, 교배의 각각의 부모 식물에 존재할 수 있다. 이들 내성 형질의 스태킹에 의해 매우 내성이 강한 식물들이 얻어질 수 있다. 그러한 식물들은 본 발명의 아주 바람직한 구현예이다.
상기에 짧게 논의되어 있듯이, 전통적 육종 기술은 보트리티스 내성에 대해 코딩하는 핵산 서열을 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물로 이입하기 위해 사용될 수 있다. 가계 육종으로 일컬어지는, 하나의 방법에서, 보트리티스에 대해 내성을 나타내고 보트리티스 내성에 대해 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 토마토 식물은 바람직하기는 질환 내성, 곤충 내성, 귀중한 과실 특징, 등과 같은 상업적으로 바람직한 특징을 나타내지만, 그것에 한정되지는 않는 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물과 교배된다. 그 결과의 식물 개체군 (F1 하이브리드를 나타내는)은 그 후 자가-수분되고 종자가 뿌려진다(F2 종자). F2 종자로부터 성장된 F2 식물은 그 후 보트리티스에 대한 내성에 대해 스크리닝된다. 개체군은 많은 다른 방법들로 스크리닝될 수 있다.
첫째로, 그 개체군은 전통적 질환 스크린을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 그러한 질환은 당업계에 알려져 있다. 바람직하기는 정량적 줄기 또는 잎 감염 생물학적 분석이 사용되고, 바람직하기는 여기서 상기에 더 상세히 약술된 바와 같이 본 발명의 방법에서 사용된 줄기 생물학적 분석 및 실시예가 사용된다. 둘째로, 마커-어시스티드 선택은 보트리티스-내성에 대해 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 그러한 후대를 확인하도록 여기서 이전에 기술된 하나 이상의 분자 마커들을 사용하여 수행될 수 있다. 여기서 상기에 QTL의 존재를 검출하는 방법으로 일컬어진, 다른 방법들이 사용될 수 있다. 또한, 마커-어시스티드 선택은 정량적 생물학적 분석으로부터 얻어진 결과를 확인하도록 사용될 수 있고 그러므로, 여러 방법들이 조합하여 또한 사용될 수 있다.
보트리티스 -내성 토마토 식물 및 종자
본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물은 높은 수준의 내성을 갖는 것에 특징이 있다. 이것은 감염되기 쉬운 대조군 식물에 대해 관찰된 것보다 더 높은 내성 수준이라는 것으로서 정의된다. 사실, 본 발명의 식물은 어떠한 상업적 토마토 품종, 즉, 지금까지 알려진 상업적으로 바람직한 특징을 갖는 품종의 것보다 더 높은 내성의 수준을 갖는다. 본 발명의 식물은 생물학적 분석에 의해 측정될 때 감염되기 쉬운 대조군 식물보다 적어도 3배 낮은 보트리티스 시네레아에 대한 감염가능성을 갖는다. 예를 들면 생물학적 분석에 의해 측정될 때 여기서 성체 식물에서의 보트리티스 시네레아 감염으로부터 생긴 줄기 병변의 평균 길이는 실시예 3.10 및 3.11에서 더 상세히 기술되는 바와 같은 표준 실행 조건 하에 3주 기간 중에 측정된다. 전형적으로, 본 발명의 식물은 그러한 특징을 기초로 하는 내성을 측정하기 위해 설계된 내성 생물학적 분석에서 표준 실행 조건을 사용한 접종 3주 후에 성체 식물에서 3.2 cm 미만의 보트리티스 시네레아 병변의 평균 줄기 병변 길이를 초래하는 내성의 수준을 갖는다. 더 전형적으로는, 본 발명의 식물은 2.9 cm 미만의 평균 줄기 병변 길이를 보여준다. 본 발명의 일부 식물들은 심지어 2.0 cm의 평균 줄기 병변 길이를 보여준다. 상기 숫자들은 2 cm 초기 접종 상처를 포함하는 병변의 길이를 나타낸다는 것을 고려하여, 높은 수준의 내성, 및 심지어 일부 QTLs의 경우에 완전한 내성이 본 발명의 식물들에서 관찰된다는 것이 추론될 수 있다. 비교하여 볼때, 감염되기 쉬운 대조군 식물들은 동일한 조건 하에 4.85 cm의 평균을 갖는, 약 3.6 cm~ 약 6.0 cm의 평균 줄기 병변 길이를 보여준다(표 10 참조). 또한 비교로써, WO02/085105의 부분적으로 보트리티스 내성 원천을 함유한 L. hirsutum LA 1777, QTL-10은 동일한 조건 하에 약 4.3 cm의 평균 줄기 병변길이를 보여준다. 요약하면, 본 발명의 식물들은 상기에 언급된 내성 생물학적 분석에서 일반적으로 감염되기 쉬운 대조군 식물들의 순 길이의 약 30% (0.9/2.85 x100%) 미만, 및 일반적으로 부분적으로 내성인 L. hirsutum LA 1777의 순 길이의 약 40% (0.9/2.3 x 100%) 미만인 순 줄기 병변을 보여준다.
따라서, 본 발명의 식물은 생물학적 분석에 의해 측정될 때 감염되기 쉬운 대조군 식물보다 3배 더 낮은, 1/3 수준 미만인 보트리티스 시네레아에 대한 감염가능성을 갖는다. 상반되게, 본 발명의 식물은 여기서 정의되고 기술된 바와 같이 생물학적 분석으로 측정된, 감염되기 쉬운 대조군 식물보다 3배 이상 더 내성이 있다. 일부 QTLs 또는 QTLs의 조합으로 (예를 들면, QTL-1h 및 QTL-3p+QTL-4p 또는 QTL-9p+QTL4p), 완전한 내성이 관찰된다(표 10 참조). 감염되기 쉬운 대조군 식물은 보트리티스 시네레아 감염에 대해, 정상 감염가능성을 보여주거나 내성이 없는 식물로서 정의된다. 감염되기 쉬운 대조군 식물들의 예로는 순잡종 Lycopersicon esculentum cv. "Tradiro" 및 Lycopersicon esculentum cv. "Moneyberg"이다(De Ruiter Seeds CV, Bergschenhoek, The Netherlands).
본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는, 보트리티스-내성 토마토 식물, 또는 그것의 부분은 또한 본 발명의 하나의 양상이다.
본 발명의 또 하나의 양상은 그것의 게놈 내에 보트리티스 내성과 관련된 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택된, 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는, 보트리티스-내성 토마토 식물, 또는 그것의 부분에 관한 것이고, 여기서 상기 QTL 또는 상기 그것의 보트리티스-내성-부여 부분은 그것의 천연 유전적 배경에 없다. 본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물은 근교, 순잡종, 단상체, 이성반수체, 단성결실 또는 트랜스제닉과 같은 유전자형일 수 있다. 게다가, 본 발명의 식물들은 내성 형질에 대한 이종접합 또는 동종접합, 바람직하기는 동종접합일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 QTLs뿐만 아니라, 그것의 보트리티스-내성-부여 부분 뿐만 아니라, 본 발명의 QTLs는 보트리티스-내성 식물을 제공하도록 어떤 식물에 전이될 수 있지만, 본 발명의 방법 및 식물들은 Solanaceae 과(family), 더 바람직하기는 토마토의 식물들에 관한 것이다.
근교 보트리티스-내성 토마토 종자 계통은 반복(recurrent) 선택 및 역교배, 자가수분 및/또는 이성반수체의 기술 또는 부모 계통을 만들기 위해 사용된 어떤 다른 기술을 사용하여 개발될 수 있다. 선택 및 역교배의 방법에서, 보트리티스-내성은 반복친(recurrent parent)을 첫번째 공여자 식물(반복친과는 다르고 "비-반복친"으로서 여기서 불림)과 교배시킴으로서 표적 수용자 식물(반복친이라고 불림)으로 이입될 수 있다. 반복친은 비-내성인 식물이거나 보트리티스에 대한 낮은 수준의 내성을 갖고 질환 내성, 곤충 내성, 귀중한 과실 특징, 등과 같은 상업적으로 바람직한 특징을 소유하지만 그것에 한정되지는 않는다. 비-반복친은 보트리티스 내성을 나타내고 보트리티스 내성에 대해 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 비-반복친은 어떤 식물 품종 또는 반복친과 교차-수정하는 근교계일 수 있다. 반복친과 비-반복친 사이의 교배로부터 생기는 후대는 반복친에 대해 역교배된다. 그 결과의 식물 개체군은 그 후 스크리닝된다. 그 개체군은 많은 다른 방법들로 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 그 개체군은 여기서 이전에 기술된 바와 같이 줄기 정량 생화학적 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 보트리티스-내성 표현형을 나타내는 F1 잡종 식물은 보트리티스 내성에 대해 코딩하는 필수 핵산 서열을 포함하고, 상업적으로 바람직한 특징을 소유하며, 그 후 선택되고 자가수분되고 토모토 식물이 점차적으로 근교되도록 하기 위해서 많은 세대에 대해 선택된다. 계속된 자가수분 및 선택의 이러한 방법은 2-5 도는 더 많은 세대에 대해 수행될 수 있다. 그러한 육종 및 선택의 결과는 상업적 관심의 형질과 관련된 다른 유전자 뿐만 아니라 보트리티스 내성과 관련된 유전자에 대해 유전적으로 상동인 계통의 생산이다. 생화학적 분석의 표현형 병리학 스크린을 사용하는 대신에, MAS는 보트리티스-내성에 대해 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 그러한 후대를 확인하기 위해 여기서 전에 기술된 하나 이상의 분자 마커, 잡종화 프로브 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로, MAS는 정량적 생화학적 분석으로부터 얻어진 결과를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일단 적절한 선택이 이루어지면, 그 방법은 반복된다. 반복친에 대해 역교배하는 방법 및 보트리티스-내성에 대해 선택하는 방법은 대략 5 또는 더 많은 세대에 대해 반복된다. 이 방법으로부터 생기는 후대는 보트리티스-내성에 대해 코딩하는 하나 이상의 유전자에 대해 이종접합체이다. 마지막 역교배 세대는 그 후 보트리티스-내성에 대해 동종접합 순수 육종 후대를 제공하도록 자가수분된다.
여기서 기술된 보트리티스-내성 근교 토마토 계통은 보트리티스-내성 교잡종 식물들을 만들도록 추가적 교배에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 첫번째 보트리티스-내성 근교 토마토 식물은 질환 내성, 곤충 내성, 바람직한 과실 특징, 등을 소유하지만 그것에 한정되지는 않는 두번째 근교 토마토 식물과 교배될 수 있다. 이 두번째 근교 토마토 계통은 보트리티스-내성일 수 있거나 아닐 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양상은 보트리티스-내성 토마토 식물로 성장될 수 있는 종자를 생성하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 그 방법은 본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물을 제공하는 단계, 상기 보트리티스-내성 식물을 Lycopersicon esculentum 식물과 교배시키는 단계 및 심을 때, 보트리티스-내성 토마토 식물을 생성하는, 상기 교배로부터 생긴 종자를 모으는 단계를 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 본 방법은 본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물을 제공하는 단계, 상기 보트리티스-내성 식물을 Lycopersicon esculentum 식물과 교배시키는 단계, 상기 교배로부터 생긴 종자를 모으는 단계, 상기 종자를 식물로 재생시키는 단계, 여기서 기술된 방법에 중 어떤 것에 의해 보트리티스-내성 식물을 선택하는 단계, 식물에서 보트리티스-내성을 부여하는 대립유전자에 대해 고정된 식물을 얻도록 충분한 수의 재생을 위해 선택된 식물을 자가-교배시키는 단계, 그에 따라 생산된 식물을 보트리티스-내성이고 바람직한 표현형 형질을 갖는 L. esculentum 식물을 얻기 위해 충분한 수의 세대에 대한 바람직한 표현형 형질을 갖는 L. esculentum과 역교배시키는 단계, 및 심을 때, 보트리티스-내성인 토마토 식물을 생산하는, 마지막 역교배로부터 생긴 식물로부터 생성된 종자를 모으는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예가 이제 주어질 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 L. esculentum cv. Moneymaker x L. hirsutum LYC 4/78의 교배로부터 유래된 F2 개체군에서 발견된 QTLs를 나타낸다
도 2는 L. esculentum x L. hirsutum LYC 4/78 개체군(populations)의 발달의 도식적 개략도이다.
도 3은 병변 성장(도 3B 및 3D) 및 질환 발병률(도 3A 및 3C)에 대해 분리하는 두 BC2S1 개체군(개체군 크기 60 resp. 47)에서의 분리를 보여준다.
도 4는 L. esculentum cv. Moneymaker x L. parviflorum G1.1601 교배의 결과를 보여준다.
도 5는 L. parviflorum QTLs의 연관 지도를 보여준다.
도 6은 L. esculentum cv. Moneymaker x L. hirsutum LYC 4/78의 교배로부터 유래된 F2 개체군에서 발견된 QTLs를 나타내는 도 1의 업데이트이다.
실시예 1. 식물의 보트리티스 시네레아에 대한 내성 확인 방법
1.1. 소개
이 실시예는 모집된 야생 토마토 유전자형의 보트리티스 시네레아에 대한 내성을 평가하기 위한 정량적 생물학적 분석의 발달을 제시한다.
보트리티스 시네레아에 대한 부분 내성이 야생 Lycopersicon 종에서 보고되었지만, 이들 보고서는 주로 서술적이고 정성적이다. 부분적으로 내성인 유전자형의 확인은 다루기 쉬운 내성 수준을 갖는 계통을 얻도록 상업적 육종 계통으로 내성을 이입하는 시각을 제공할 것이다. 유전적으로 측정된 (부분적) 회색 곰팡이 내성을 갖는 유전형의 확인 뿐만 아니라, 재현가능하고, 객관적이며 정량적인 분석의 이용가능성은 재배된 토마토 품종에서 내성 육종을 위한 방법을 열어준다.
본 실시예는 정량적 질환분석을 기술한다. 그 분석은 잎(잎 접종 분석) 및 줄기 구획(줄기 접종 분석)에 적용된다. 질환 감염가능성에 대한 두 개의 파라미터가 검사되었다. 첫 번째 파라미터는 질환 발병률(DI), 즉, 확장된 병변을 가져오는 접종 작은 물방울의 비율이었다. 특정한 숙주 유전자형 상에서 확장시키는 1차(primary) B.시네레아 병변의 (부분적) 실패는 식물의 유전적 형질이고, 이러한 형질은 수확물에서 다수의 질환 병소(foci)의 수를 직접적으로 제한하므로 중요하다. 시험된 두 번째 파라미터는 24 h의 기간에 걸쳐 병변 성장 속도(lesion growth rate)이었다. 1차 접종 부위(spot)로부터 확장된 병변은 잎의 가장자리 또는 줄기 구획의 바닥 끝에 병변이 도달할 때까지 한결같은 속도(mm/day)로 확산되는 것으로 보였다. 본 분석은 두 세트의 정량적 형질 데이터를 가져오는, B. 시네레아 감염의 발생(질환 발병률) 및 발달(병변 성장)의 정량화를 가능하게 한다. 이 분석은 내성의 존재에 대한 Lycopersicon 종(이하 또한 "취득물(accessions)"이라고 명명함)의 모집물(colections)을 스크니링하는데 사용되었다.
1.2 식물
실험된 식물 유전자형들은 표 3에 수록되어 있다.
표 3. 시험된 Lycopersicon 유전형의 목록
Figure 112007037994733-PCT00003
1 DRS: De Ruiter Seeds, Bergschenhoek, The Netherlands, WU PPW: Plantkundig Proefcentrum Wageningen, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; LoPB: Laboratory of Plant Breeding, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; MPIZK: Max Planck Institut Fur Zuchtungsforschung an Kulturpflanze, Koln, Germany; TGRC: Tomato Genetics Resouce Center, University of California at Davis, Davis CA, USA; IPK: Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersliben, Germany.
2Y는 유전자형이 특정 분석에서 시험되었다는 것을 나타내고, S는 감염되기 쉬운 참조 대조군으로서 역할하는 유전자형을 나타낸다.
(3)B. cinerea에 대해 내성으로서 전에 출판됨.
식물은 최저 15℃를 갖는 온실에서 흙을 담은 12cm의 화분에서 재배되었다. 10월에서 3월까지 인공적 소디움 램프 불빛을 가하였다. 발아 후 5-7일에 10ml FeNaEDTA 용액 (3.5g/l)이 첨가되었고, 3일 뒤 10ml 미량영양소(0.286 g/l H3BO3; 0.1558 g/l MnSO4.H20; 0.008 g/l CuO4.H2O; 0.022 g/l ZnSO4; 0.00196 (NH4)6Mo7O24.4H2O) 용액이 뒤따랐다. 발아 2주 후부터 줄곧, 주 단위로 5ml의 호아그랜드(Hoagland)용액(5mM Ca(NO3)2; 5 mM KNO3; 2 mM MgSO4; 1 mM KH2PO4)을 첨가하였다.
1.3 잎 분석
B. 시네레아 균주(strain) B05.10으로부터의 접종물이 Benito(1998)에 따라 제조되었다. 각각의 개별 식물에 대해 완전히 쭉 펼쳐진 하나 또는 두가지 복옆(compound leaf)들은 날카로운 면도칼로 주 줄기에서 분리되어 사전에-적셔진 화초재배자 거품(florist foam)으로 전이되었다. 화초재배자 거품은 수도물을 함유한 페트리 디쉬에 놓여졌고, 그 다음에 젖은 필터 종이를 함유한 스프레이-적셔진 용기에 놓여졌다. 복옆들은 잎의 상부 표면 상으로 총 6-10의 접종물(2ul) 방울을 조심스럽게 피펫팅함으로서 B. 시네레아의 코니디알 현탁물로 그 후 접종된다. 용기는 스프레이-적셔진(spray-wetted) 덮개로 덮히고, 필수적으로 Benito et al., 1998에 의해 기술되어 있듯이, 100% RH 어둠에서 15℃로 배양되었다. 표 4의 데이터는 시험으로부터 유래되었고 여기서 하나의 한가지 콤포지트(composite) 잎을 네 개의 작은 잎으로 나누었고, 여기서 모든 작은잎은 각각 2000 코니디아를 포함하는, 2 ul의 10 방울로 접종되었다. 공격적 확장 병변의 비율(질환 발병률) 및 병변 성장 속도는 몇일에 걸쳐 모니터되었다.
식물의 계절과 재배에 의해 야기된 편차를 보정하기 위해서 각각의 실험에서 특정한 유전자형의 질환 발병률은 동일한 시험에서 시험된 Moneymaker의 질환 발병률과 관련되었다.
병변 크기는 칼리퍼를 사용하여 96, 120, 144 hpi 로 측정되었다. 질환 발병률은 접종된 물방울의 총수로 확장된 병변의 총수를 나눔으로서 측정되었다. 병변 성장 속도는 24 h 기간에 걸친 병변 크기의 증가를 계산하여 측정되었다. 무-확장 병변에 대한 데이타는 정량적 분석으로부터 삭제되었다. 잎 분석의 결과는 표 4에 나타나있다.
표 4: B. cinerea 가 접종된 Lycopersicon 취득물의 입들에서 질환 발병률( DI , %) 및 병변 상장 속도 (LG, mm/일 ± 표준편차). 실험은 지시된 바와 같이 1999 및 2000에서 다른 주(weeks)에 수행되었다.
Figure 112007037994733-PCT00004
1.4. 줄기 분석 (표준화된 절차)
줄기 분석은 아래와 같이 수행되었다: 대략 50cm 높이의 식물의 줄기 상부 5-10 cm 및 하부 5-10 cm를 제거하고, 남은 30 cm를 5-6cm의 같은 구획으로 잘라냈다. 각 줄기 절편(segment)은 젖은 필터 종이 상에 줄기 기준(base)으로 격자에 수직으로 세웠다. 접종에 앞서, 상처 표면에 걸쳐 접종물의 동일한 확산을 확실히 하기 위해 줄기 구획에 수도물이 분무되었다. 접종물은 잎 분석에 대해 기술된 대로 제조되었다. 대략 106 코니디아 ml- 1를 함유한, 5ul의 접종물 한방울이 각 줄기 구 획의 꼭대기에 가해졌다. 재배는 상대습도 100%의 어둠에서 섭씨 15±2℃에서 실행되었다. 감염진행은 Vernier 칼리퍼로 접종후 여러 시간 간격으로 부패 증상의 최대 진행을 측정하여 결정하였다.
각 유전자형에 대해, 감염된 줄기 조각의 백분율이 계산되었다. 질환 발병률은 확장도니 병변을 갖는 줄기 구획의 총수를 접종된 구획의 총수로 나누어 측정하였다. 병변 성장 속도는 24 h에 걸친 병변 크기의 증가를 계산하여 측정하였고, 그것에 따라 확장된 병변이 없는 데이터는 분석에서 삭제시켰다. 줄기 분석의 결과는 표 5에 제시하였다.
표 5. B. cinerea 가 접종된 Lycopersicon 취득물의 줄기 절편에서 질환 발병률(DI, %) 및 병변 상장 속도 (LG, mm/일 ± 표준편차). 실험은 지시된 바와 같이 1999 및 2000에서 다른 주(weeks)에 수행되었다.
Figure 112007037994733-PCT00005
1.5. 결과
분리된 잎 감염 실험에서 질환 발병률 및 병변 성장은 보통 감염-후 2-4일부터 각각의 유전자형에 대해 수 일에 걸쳐 측정되였다. 참고로서 알맞은, L. esculentum cv. Moneymaker에서의 질환 발병률은, 이들 실험에서 15와 78% 사이에서 변동이 있었다. 표 4는 잎당 40개의 접종점을 가진(잎조각당 10개), 적어도 5개의 개개의 식물로부터 유래한 분리된 복옆이 접종된 14개의 유전자형의 결과를 보여준다. 이들 14개의 유전자형에서의 질환 발병률은 동일한 실험/주에서 측정된 대조군 계통 L.esculentum cv. Moneymaker에서의 것과 비교되어야 한다.
유전자형 82/2577과 83/2896(둘 다 L. esculentum 종)을 제외하고는, 시험된 유전자형은 모든 실험에서 Moneymaker보다 더 낮은 질환 발병률을 보여주었다. 유전자형 G1.1556, G1.1560 및 G1.1601은 세가지 독립적 실험에서 0~21% 범위로, 낮은 질환발병률을 보여주었다. 통계적인 분석은 유전자형 78/1604, 91/4311, 96/4326, G1.1556, GI 1558, G1.1560, G1.1601, LA716 및 LYC 4/78에서의 질환 발병률은 대조군 계통 L. esculentum cv. Moneymaker(p<0.05)에서보다 상당히 더 낮았다. 하지만, 분리된 잎 분석에서 관찰된 주(weeks)와 일부 차이점들 사이에 있는 큰 편차는, 실험/주(weeks)(15~78%) 사이의 질환 발병률에서의 변동때문에 실제로 매우 강한 것은 아닐 것이다.
이들 내성이 있는 유전자형 내에(Moneymaker 참조에서의 것보다 상당히 낮은 질환 발병률을 가짐), 성공적으로 확장된 병변은 종종 Moneymaker에서와 유사한 비율이었다.(예를 들면 96/4326, G1.1560, LA716). 반대 상황은 발견되지 않았다. Moneymaker의 질환 발병률과 유사한 질환 발병률은 어느 유전자형에서도 나타나지 않았지만, 병변 성장 속도는 Moneymaker보다 더 느렸다.
표 4 또한 24h 기간(48과 72 hpi 사이에서)에 걸친 각 유전자형에 대해 확장된 병변의 평균 성장 속도에 대한 데이타를 제시한다. 대부분의 유전자형에서의 병변 성장 속도는 Moneymaker와 같은 범위에 있었다. 다섯 개의 취득물은 (91/4311, 160/79, G1.1556, GL.1601 및 LYC 4/78) 통계적으로 L. esculentum cv.Moneymaker의 것과 상당히 다른, 더 낮은 병변 성장 속도를 보여주었다.
줄기구획 감염분석(표 5)은 다른 계절에 이행된 실험 사이에서의 재현성의 측면에서 잎 분석보다 더 확고함을 보여준다. 비록 줄기 구획(식물당 5-8 구획)을 갖는 데이터 포인트의 수가 잎분석(복옆 당 40 접종 물방울(droplet), 식물당 1개 또는 2개의 잎이 실험될 수 있었다)이 가진 것보다 상당히 작더라도, 실험 간의 변화성은 일반적으로 줄기 구획 분석에서 더 낮았다. 대조군 유전자형 L. esculentum cv. Moneymaker에 대한 줄기 분석에서의 질환 발병률은 52-95%의 범위였다. 17개의 유전자형(표 5)에서의 질환 발병률은 같은 실험/주에서 측정된 대조군 계통 L. esculentum cv. Moneymaker의 질환 발병률과 비교되어야 한다. 대부분의 유전자형은 Moneymaker 대조군 계통과 유사한 범위로 질환 발병률을 보여주었다. 유전자형 G.1560만이 대조군과 통계적으로 상당히(p<0.05) 달랐다.
대조군 유전자형 L. esculentum cv. Moneymaker에 대한 줄기 분석(표 5)에서의 병변 성장 속도는 5.4-9.2mm/일의 범위였다. 많은 유전자형의 병변 성장 속도는 대조군과 유사한 범위에 있었다. 하지만, 취득물 89/3793, G1.1601, LYC 4/78, T566-81에서, 병변 성장 속도는 통계적으로 대조군 cv. Moneymaker와 상당히 달랐다(p<0.01).
줄기 구획 분석에서 부분적으로 내성이 있다고 평가(rated)된 많은 유전자형을 가지고, 정성적 분석이 Rockwool® 상의 온실에서 재배된 모든 식물에 대해 수행되었다. 그 목적은 실험실 조건 하에 줄기 구획에서 내성이 있는 것으로 보이는 유전자형이 실제로 준-상업적 수확 시스템에서 대조군 계통보다 더 내성이 있는지를 평가하는 것이었다. 식물은 Rockwool®의 열에서 무작위한 순서로 배양되었고, 온실 칸막이는 포자형성의 시점에 B. 시네레아에 의해 심하게 감염된 감귤류 과실로 채워졌다. 온실 칸막이는 수도물로 하루에 두번 바닥에 뿌리고 문과 창문을 폐쇄함으로서 높은 습도를 유지하였다. 모든 식물에서 일정한 간격으로 전지된 상처가 만들어졌고, 회색곰팡이 발생이 시간이 흐르면서 모니터되었다.
두 파라미터의 심한 감소가 나타난 많은 야생 Lycopersicon 취득물이, 그에 따라 둘을 L. esculentum으로 부분적 내성의 잠재적으로 독립적인 메커니즘을 이입하기 위한 잠재적 원천을 제공하면서, 확인되었다.
실시예 2. 이종간의 Lycopersicon 교배에서 보트리티스에 대한 내성에 대한 QTL - 맵핑 ( L. esculentum cv . Moneymaker x Lycopersicon parviflorum G1 .1601)
2.1. 소개
다른 기원으로부터의 Lycopersicon 취득물의 세트가 실시예 1에서 기술하였듯이 균류 병원성 보트리티스 시네레아에 대한 내성에 대해 스크리닝 되었다. 취득 물 Lycopersicon parviflorum G1.1601은 잎 분석에서 더 낮은 질환 발병률과 더 느린 병변 성장(상기 표 4와 표 5 참조)를 보여주었다. L. parviflorum G.1601과 L.esculentum cv Moneymaker 사이의 교배로부터 유래된, 130의 F2-유래된 F3 개체군으로 이루어진, 분리 개체군을 줄기 분석에서 B. 시네레아에 대해 내성에 대해 평가하였다.
증폭된 단편 길이 다형 마커는 연관 지도를 구축하기 위해 그리고 양적 형질 유전자 자리를 수행하기 위해 사용되었다. 질환 발병률과 병변 성장 둘 다에 대해 QTLs가 검출되었다.
2.2. 식물 물질
내성이 있는 취득물(accession), Lycopersicon parviflorum G1.1601의 확인 후에, 이 취득물을 창립 부모로서 가진 분리 개체군(Huang, 2001)이 추가적 분석을 위해 사용되었다. 분리한 개체군은 130의 F2-유래된 F3 개체군으로 이루어졌다.
2.3. 질환 평가
130의 F3 개체군의 각각으로부터 5개의 묘목이 재배되었고 실시예 1에서 기술된 줄기 분석을 받았다. 실제적인 이유 때문에 완전한 세트의 측정은 동일한 크기의 13 부분으로 나뉘었다(무작위로). 매주 50개의 식물로 이루어진 하나의 부분이 측정되었다. 감염되기 쉬운 Moneymaker 대조군 식물의 커다란 세트가 주들(weeks) 사이의 환경적 차이에 대해 보정하기 위하여 사용되었다. 실제적인 이유를 위해 L. parviflorum G1.1601은 실험에 포함되지 않았다. 측정은 실시예 1에 기술 한대로 수행하였다.
감염의 진행은 (감염 후 96 및 120시간) 접종 후에 2회 시점 상에 기록되었다. 이런 방식으로 관찰의 최종순간에 질환 증상을 보여주는 접종된 줄기 부분의 백분율로서 정의된, 질환 발병률, 및 24-시간 기간 후 토마토 줄기에서의 병변 발달의 속도로 정의되는, 병변 성장 둘 다를 실시예 1에서 기술한 대로 측정하였다.
측정값의 분포는 표 4에 표시되었다. 분포는 일반적, 정량적 형질 특성을 제시하고, 그러므로 QTL 맵핑 접근을 위해 적절하였다.
2.4. 분자 마커
F2 물질은 이용불가했다; 그러므로 130의 F2-유래된 각각의 유래된 12개의 F3 식물의 잎들은 풀되었고(pooled) DNA-단리를 위해 사용되었다. 10 Pst/Mse 프라이머 조합을 사용하여 Vos et al.(1995)에 따라 AFLP 측정이 수행되었다.
2.5. 연관 분석과 QTL 맵핑
AFLP 마커의 지배적 특성때문에, 부계(L. parviflorum)와 모계(L. esculentum) 연관 군을 별도로 계산하였다.
마커 데이터가 분석되었고 JoinMap® 소프트웨어 패키지(version 3.0: Plant Research International, Wageningen, The Netherlands)를 사용하여 유전 연관 지도가 계산되었다. 연관 군은 여러 로그-가능성(log-likelihood, LOD) 트레숄드(thresholds)에서 형성되었다. 재조합 단편은 Kosambi function(Kosambi,1944)를 이용하여 거리를 지도로 만들기 위해 변환되었다. JoinMap®로부터의 산출은 MapChart프로그램(Plant Research International)을 사용하여 연관 지도 및 QTL 플롯을 위해 그래픽 형태로 변환되었다. 표현형 데이터는 해석되었고 QTLs는 MapQTL®(version 4.0: Kyazma B.V.,Wageningen, The Netherlands)을 이용하여 간격 맵핑(IM) 및 다중 QTL 맵핑(MQM)에 의해 계산되었다(Jansen, 1993, 1994). F2 개체군에 대한 계산된 표현형 데이터는 F3 계통 내의 모든 식물의 질환 분석의 평균값으로부터 나왔다. 질환 발병률 데이터를 표준화하기 위해 아크사인 변환이 사용되었다. QTLs는 간격 맵핑(interval mapping) 알고리즘을 이용하여 계산되었다.
130개의 F3 개체군의 각각에 대하여 마커의 조합된 데이터와 질환 데이타는 MapQTL®을 이용하여 QTL 분석되었다. 간격 맵핑의 제 1 라운드가 수행되었고, LOD에서의 최고점이 확인되었다. 하나 또는 다른 부모에서 유래한 모든 마커는 독립된 연관 지도를 계산하는데 직접적으로 사용되었다. 총 192의 AFLP 마커는 부계와 모계 연관 지도 상에 놓여졌다. 수컷과 암컷의 연관 지도가 개별적으로 QTL-맵핑에 사용되었다. 세 개의 QTLs가 측정되었다(표 6 참조).
표 6. 비-통합된 맵에 기초한 QTL 맵핑 결과
Figure 112007037994733-PCT00006
aa는 완전 염색체 영역를 위한 동형접합 L. esculentum이다. b-는 QTL-영역을 위한 이형접합 또는 동형접합의 L. parviflorum이다.
모든 세개의 QTL-범위 이종접합 또는 동종접합 L. parviflorum (b-)을 가진 11개의 식물의 평균 보트리티스 내성은 40%의 질환 발병률 및 하루 5.0 mm의 병변성장을 반영했다. 오직 하나의 식물만이 모든 세 개의 QTL-범위에 대해 동종접합 L.esculentum이었고, 72%의 질환 발병률 및 하루 7.2mm의 병변 성장을 가졌다. 다섯 개의 식물은 세 개의 QTLs 중 두 개에 대해 동종접합 L. esculentum이었고, 5.8mm의 병변 성장(데이타는 보이지 않음)과 조합하여 그것들의 평균 질환발병률율은 67%였다.
이 실시예는 L. parviflorum G1.1601과 같은 유전 원천은 토마토에서 보트리 티스 시네레아에 대한 내성을 향상시키는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 병변 발생에 대해서처럼 질환 발병률에 대해서도 몇몇 QTLs가 확인될 수 있었다(표 6). 이들 QTLs는 역교배 계통과 같은 더 진보된 육종 물질에서 확인될 수 있다.
표 7은 L. esculentum cv Moneymaker와 L. parviflorum G.1601 간의 교배에서 생긴 여러 F3 계통의 질환 내성 시험의 실험결과를 보여준다. 이 실험에서 사용된 BChirs5 참조 계통은 기재된 L. parviflorum(L. parv) 계통의 것보다 더 높은 수준의 내성을 나타낸다는 것이 분명하게 보여진다. 하지만, QTL 효과의 존재는 parviflorum QTLs에 대해서 또한 확립될 수 있다.
표 7. 접종 이후 3주, L. parviflorum 취득물 G. 1601의 성체 식물에서의 Botrytis cinerea 병변 중의 평균 줄기 병변 길이
Figure 112007037994733-PCT00007
*)참조 라인들은 굵은 형의 활자체로 나타내었다: Tradiro는 재배자에 따라 Botrytis에 감염되기 쉬운, 잡종이다; Durintha는 재배자에 따라 부분적 내성을 가진 잡종이다; Moneyberg 및 Moneymaker는 감염되기 쉬운 라인들과 유사한 유형이다; GT는 TMV 내성을 가진 Moneyberg이다; BChirs5는 L. hirsutum LYC 4/78 이입 으로 초래된 역교배 라인이고, 병변 성장을 위한 hirsutum QTL-1h을 포함한다.(+): 이형접합 또는 동형접합 존재; (-): 부존재; n.d.: 측정되지 않음.
실시예 . 3. 이종간 토마토 개체군에서의 보트리티스 시네레아에 대한 부분적 내성의 맵핑( L. esculentum cv Moneymaker x L. hirsutum 취득물 LYC 4/78)
이 실시예서, L. hirsutum LYC 4/78로부터 유래한 보트리티스 시네레아에 대한 부분적인 내성을 부여하는 두 개의 QTL 유전자자리가 제시되었다. 결과에 대한 확인은 각각 두 QTL 유전자자리 중 하나에 대해 분리하는 두 BC2S1 개체군에서의 B. 시네레아에 대한 내성 수준을 평가함으로서 얻어졌다.
3.1. 식물 물질
독일, Gatersleben, Institute for Plant Genetics and Crop Plant Research 유전자에 위치된 유전자 은행으로부터 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78(이후 LYC 4/78로서 불림)의 종자를 얻었다.
네델란드 Bergschenhoek, De Ruiter Seeds cv의 종자 은행으로부터 Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker (이후 Moneymaker로 불림)의 종자를 얻었다.
Moneymaker와 LYC 4/78간의 이종간 교배는 F1 종자를 생산했다. F1 종자는 F1 식물로 성장했다. 하나의 F1 식물을 자가수분하는 것으로부터 유래된 F2 종자는 174 개체의 F2 개체군을 얻기 위해 뿌려진다. 59개의 개체의 A BC2(역교배 2) 개체군이 반복(recurrent) 및 암(female) 친(parent)로서 Moneymaker와 두 라운드의 역교배에 의해 발생되었다. MAS를 사용하여, 두 개의 확인된 QTLs 중 하나를 함유한 BC2, BC3, 및 BC4 유전자형이 선택되었고 몇몇 BC2는 BC2S1 종자(도 2 참조)를 생산하기 위해 자가수분되었다. 두 BC2S1 개체군은 성장되었다: 질환 발병률에 대한 QTL을 위해 분리된 60개의 BC2S1 개체들 중 하나 및 병변 성장에 대한 QTL을 위해 분리된 47 개의 BC2S1 개체들 중의 또 다른 하나.
3.2. 줄기 분석
B. 시네레아 균류 B05.10으로부터의 접종물은 Benito(1998)에 따라 제조되었다. 줄기 분석은 실시예 1에서 설명하였듯이 실행되었다.
3.3. DNA 단리 및 마커 분석
게놈 DNA는 Steward 및 Via (1993)에 따른 프로토콜을 기초로 하여 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 사용하여 두 어린(둥글게 말아진(rolled up)) 잎으로부터 단리되었고, 1ml 마이크로닉 튜브(Micronic BV, Lelystad, The Netherlands)을 사용하여 높은 처리량(throughout) DNA 단리를위해 맞춰지고 Retsch 300mm 교반기(Retsch BV, Ochten, The Netherlands)를 사용하여 최대 속도로 분쇄되었다(grounded). F2, BC2, BC3, BC4 및 BC2S1 개체군의 AFLP 분석(Vos et al., 1995)이 행해졌고, AFLP 단편은 Myburg(Myburg et al. 2001)에 의해 출판된 방법을 필수적으로 따르는, LI-COR 4200 DNA 시퀀서 상에서 분석되었다. 선택적 Pst 프라이머는 IRD 700 또는 IRD 800의 형광성 라벨로 라벨링되었다. AFLP 겔 이미지는 AFLP-Quantar Pro 소프트웨어 패키지(Keygene BV, Wageningen, The Netherlands)를 사용하여 점수가 매겨졌다. 하기의 열 개의 프라이머 조합 및 아답터 서열이 유전자형 분석(genotyping)에 사용되었다: Bai et al (2003)에 의해 기술되었듯이, P14M48, P14M49, P14M50, P14M60, P14M61, P15M48, P18M50, P18M51, P22M50 및 P22M51.
3.4. F 2 개체군의 표현형 분석
다른 보트리티스 분석 사이의 질환 발병률에서의 편차가 관찰되었다(상기 실시예 1 참조). 그러므로 일곱 개의 독립적 연속적 줄기 질환 분석은 Moneymaker x LYC 4/78 사이의 교배로부터 유래된 F2 개체군의 174개의 개체 중 172개 상에서 수행되었다. 이것은 거의 각각의 F2 유전자형에 대한 질환 생물학적 분석의 적어도 5개의 독립적인 평가를 가져왔다. 각각의 개체군 질환 생물학적 분석에서 여섯 개의 줄기 구획이 병변 성장 계산에 기여하였다. F2 개체군에 대한 질환 발병률과 병변 성장의 평균값은 일반적 분포를 보여주었다(데이타는 보여지지 않는다). Moneymaker에 대한 평균 질환 발병률은 59%, 병변 성장은 9.2 mm/일이었다. F2 개체군에서의 평균 질환 발병률은 10%-97%의 범위였고, 개체군 평균은 48%였다. 병변 성장은 평균 7.8mm/일을 갖는, 3.3mm-11.5mm/일의 범위였다.
평균 병변 성장이 6.2mm-7.9mm/일의 범위인 반면, 각각의 개별적 실험의 평균 질환 발병률은 31%-73%의 범위였다(표 8). 병변 성장은 여섯 개의 줄기 조각 중의적어도 하나에서 감염이 있으면, 계산될 수 있다. 그 결과로서 병변 성장에 대한 지식을 주는(informative) 유전자형의 수의 증가는 더 높은 질환 발병률과 함께 관찰될 수 있었다. 예를 들어, 낮은 평균 질환 발병률(31%)이 있는 유전자형의 오직 52%만이 병변 성장에 대한 지식을 주었다.
표 8. 실시예 3.4에 따른 7개 실험들의 평균 질환 발병률과 평균 병변 성장. 주들의 평균값들은 질환 발병률 백분율에 따라 순서되었다 .
Figure 112007037994733-PCT00008
3.5. 분자 마커 & 유전자 연관(linkage) 지도
유전자 연관 지도는 Moneymaker x LYC 4/78의 교배로부터 유fo된 F2 개체군(n=174)에 대해 계산되었다. 열 개의 프라이머 조합은 F2 개체군(n=174)에서 218개의 증폭 단편 길이 다형(AFLP) 마커를 얻기 위해 사용되었다. 총 69개의 마커 (31.7%)가 공동-우세적으로(co-dominantly) 용이하게 점수가 매겨질 수 있었고, 그에 따라 통합된 F2 유전자 연관 지도의 계산을 가능하게 했다. BC2, BC3 및 BC2S1 유전자형에 대해 수행된 마커 분석은 이들 145개의 추가적인 AFLP 마커 중 총 102개가 F2 겔의 복잡성 때문에 이전에 점수가 매겨지지(scored) 않았다. 전체적인 유전자 연관 지도는 14개의 연관 군의 315개의 AFLP 마커스로 이루어졌고, 958 cM의 총 길이를 가진다. 종 내에 상호-이동(co-migrating) AFLP 마커는 일반적으로 특이적 대립유전자이기 때문에, 다른 AFLP 연관 지도와의 상호-선형성(co-linearity)은 염색체에 연관 군을 할당하는데 쓰였다. 일부 Moneymaker 특이적 AFLP 마커는 발간되어 있듯이 유전자 연관 지도와 공통이었고(Haanstra et al. 1999: Bai et al. 2003), 그러므로 일부 연관 군은 확인된 QTLs를 품은 연관 군을 포함하여, 염색체로 할당될 수 있었다. QTL 간격에서의 연관 지도를 개선하기 위해, 진단 CAPS 마커가 발간된 L. esculentum x L. pennelli 지도를 근거로 하는 이들 범위에 첨가되었다(Tanksley et al. 1992; Haanstra et al. 1999).
3.6. 연관 분석과 QTL 맵핑
마커 데이터는 분석되었고 유전자 연관 지도는 실시예 2에 기술한 것과 같이 계산되었다.
F2 연관 지도의 총 길이는 958 cM이고, 이것은 발간된 다른 1200-1400 cM의 범위의 유전자 길이를 가지는 이종간 Lycopersicon 지도보다 덜하다(Foolad et al. 2002; Haanstra et al. 1999; Tanksley et al. 1992). 부가된 AFLP 마커는 역교배와 BC2S1 개체군으로부터 얻어진 AFLP 마커 데이터를 이용하여 점수가 매겨졌다. 비록 46% 이상의 마커가 연관 지도 상에 위치되었지만, 유전자 연관 지도의 길이는 늘어나지 않았다. 이것에 대한 이유는 사용된 데이터가 여러 작은 아-과(sub-families)로부터 얻어졌고, 그에 따라 유전자 거리의 계산에는 유용하지 않았지만, 그 위치의 추정은 그래픽적(graphical) 유전자형의 시각에 의한 검사에 의해 가능하다(Van Berloo,1999).
3.7. F 2 개체군에서의 QTL 맵핑
표현형 및 마커 데이터는 간격 맵핑에 의하여 QTLs의 확인을 위해 사용되었다(IM, 실시예 2 참조). IM은 개개 레플리케이트(replicates)로부터 얻어진 데이터 및 레플리케이트의 평균값에 둘 다 적용되었다.
질환 발병률
F2 개체군에서의 질환 발병률의 간격(interval) 맵핑은 50% 보다 더 낮은 평균 질환 발병률을 가진 개개 질환 시험에 대해 그리고 모든 질환 시험으로부터 얻어진 평균 데이터에 대해 행해졌다(표 8). 모든 시험의 평균 데이터는 간격 맵핑 절차에서 질환 발병률에 대한 단일의 중요한 QTL을 주었다(오em의 가능성(likelihood of odds(LOD) 점수는 P<0.05의 게놈-와이드(genome-wide) 신뢰 수준의 3.4 보다 더 높아야 한다). 이 QTL은 4.5의 LOD 점수를 가졌고 총 표현형 편차(표 9)의 13%를 설명했다. 내성에 기여한 대립유전자는 내성 부모 LYC 4/78로부터 유래했다. 각각의 개체 실험에 대한 QTL 맵핑은 모든 네 개의 경우에 동일한 QTL 영역을 주었다. 각각의 독립적인 실험에서 이따금 다른 "minor QTLs"가 관찰되었다.
병변 성장
높은 질환 발병률을 가진 그러한 질환 시험에서 병변 성장이 가장 잘 측정된다. QTL 맵핑을 위해 모든 7개의 질환 시험의 평균이 사용되었고 B. 시네레아의 병변 성장에 대한 하나의 QTL은 트레숄드를 초과하여 확인되었다(P<0.05의 게놈-와이드 신뢰 수준에 대한 LOD 3.4). 이 QTL은 4.2의 LOD 점수를 가졌고 총 표현형 편차 의 12%를 설명했다(표 9). 포지티브 효과가 내성 부모 LYC 4/78로부터 유래했다. 단지 하나의 단일 반복(repetition)에서만 트레숄드를 초과하는 LOD 프로파일이 발견되었기 때문에 다중 질환 시험을 수행하기 위한 필요성은 예증되었다.
표 9. 식물 동형접합 Moneymaker (A), 이형접합 (H) 또는 동형접합 LYC 4/78 (B)를 위한 계산된 효과의 평가. BC 2 S 1 개체군에 대한 점수는 Kruskal - Wallis 분석으로 계산된데 반해, F 2 개체군에 대한 점수는 간격 맵핑 절차로 계산되었다.
Figure 112007037994733-PCT00009
*ND: 측정되지 않았음
3.8. 생물학적 분석에서의 QTLs 의 확인
교배 Moneymaker x LYC 4/78의 F1 식물은 Moneymaker와 두번 역교배되었고, 59의 후손 식물이 AFLP 마커를 사용하여 두 확인된 QTL-영역 (질환 발병에 대한 하나 및 병변 성장에 대한 하나)의 존재에 대해 스크리닝되었다. 식물, 두 개의 확인된 QTLs중 하나에 대한 이종접합이 선택되었고, 두 개의 BC2S1 개체군을 얻기 위해 자가수분되었다. 총 4의 질환 생물학적 분석이 각 BC2S1 유전자형으로 수행되었다. SPSS로 분석된, 둘 다의 BC2S1 하위개체군의 데이터는 병변 성장에 대해 정상적 분포를 보여주지만, 일부 서브클래스가 관찰되었으므로, 질환 발병률에 대한 정상적 분포는 보여주지 않았다 (도 2).
모든 BC2S1 식물은 상기 섹션 3.3에서 F2 개체군에 대해 기술된 것과 동일한 10개의 프라이머 조합으로 유전자형분석된(genotyped) AFLP였다. 다른 개체군에서 6.3 mm/일의 평균 병변 성장이 관찰되는 반면 병변 성장 유전자자리에 대해 분리하는 개체군에서의 평균 병변 성장은 5.3 mm/일이었다. 어느 하나의 식물도 내성이 있는 부모 LYC 4/78만큼 낮은 병변 성장은 갖지 않았다. 질환 발병률에 대해, 하지만, 내성이 있는 부모 LYC 4/78 보다 더 낮은 질환 발병률을 갖는 식물이 관찰되었다. 둘 다의 BC2S1 개체군에 대한 평균 질환 발병률은 동일했다(57-59%).
각각의 QTL의 포지티브 효과는 BC2S1 개체군에서 확인되었다. 질환 발병률에 대한 QTL은 감염 기회가 17%로 감소했고(부모 변이의 46%), 병변 성장에 대한 QTL은 균류 성장이 1.3mm/일로 감소되었다(부모 변이의 33%).
F2 개체군으로부터 얻은 데이터를 가지고 비교한 것은 표 8에 나타냈다. 둘 다의 QTLs의 효과에 의해서 오직 한 부분의 변이가 설명되어질 수 있다. 약간의 부가적인 ("minor) QTL 유전자자리가 확인되었다.
F2 및 BC2S1 유전자형 둘다로부터 얻어진 질환 시험 데이터를 분석하는 동안, 질환 발병률에 대한 하나의 주요 QTL이 확인되었다(QTL-2h). 이 QTL외에, 질환 발 병률에 대한 다른 "추정의(putative)" QTL 유전자자리가 확인 되었다. 이 정보 보조인자(information cofactor)를 사용하는 것은 F2 데이터세트 상의 제한된 '다중 QTL 맵핑'(MQM) 절차를 수행하도록 선택되었다. 이 분석에서, 질환 발병률에 대한 하나의 추가적인 "소수(minor)" QTL 유전자자리가 확인되었다(QTL-4h). QTL은 그것의 점수가 LOD-3.4의 분명한 한계(threshold) 미만일 때 "소수"로 표시된다. 하지만 이 효과가 실제 QTL 효과라고 믿어진다.
QTL-4 h는 염색체 4 상에 위치되고 질환 발병률을 감소시킨다(표 1 참조). QTL은 2.9의 LOD 점수를 갖고, 다음의 AFLP 마커에 커플링된다; P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, 및 P14M61-292.7h. 이 유전자자리의 포지티브 효과는 내성이 있는 부모 L. hirsutum에서 유래되었다. 포지티브 효과는 F2와 BC2S1 개체군 둘 다에서 확인되었다. 이 QTL은 처음에 QTL-2h의 분리를 결핍한 BC2S1 개체군에서 확인되었고 또한 AFLP 마커 P14M38-345e, P14M48-177e, 및 P18M50-147e에 커플링되었다. 이 영역에 대한 공동-우세성(co-cominant) CAPS 마커의 분리는 염색체 2 및 염색체 4 둘 다에 위치된 유전자자리에 대한 BC2S1 개체군 및 F2 개체군 둘 다에서 평가되었다. 염색체 2 상의 CAPS 마커, AT4G30930은 염색체 4에 대해 이 염색체 상에 동등하게 분포된 10의 CAPS 마커의 세트에 대한 분리 데이터가 분석되는 동안 염색체 2 상의 QTL에 타이트하게 연결된다. 염색체 4 상의 CAPS 마커 AT4G30930 ㅁ및 CAPS 마커 TG609를 포함하는, ANOVA 분석은 CAPS 마커 TG609가 형질 질환 발병률에 의미있게 연결된다는 것을 보여주었다.
각각의 "소수" QTLs의 효과를 증명하기 위해서, QTL 효과를 함유한 영역에 대한 가까운 동질유전자 계통(NIL)은 발달될 수 있다. 그에 병행하여, L.esculentum cv. Moneymaker 유전자 배경에 있는 L. hirsutum LYC 4/78의 역교배 근교 계통(BIL) 개체군은 발달될 수 있다.
3.9 질환분석과 QTL 맵핑의 결론
B. 시네레아에 대한 내성을 측정하기 위한 생물학적 분석은 가치 있는 도구로 증명되었다. 그렇지만, 아직 크고 알려지지 않은 변이가 감염 과정의 발달에 영향을 주는 것 같다. 이 큰 비-유전적 변이는 표준화된 절차를 사용함으로서 그리고 많은 독립적인 복제를 수행함으로서 최소화될 수 있다. 변이는 줄기의 생리적인 조건의 차이를 일으키는 (광주기, 일광 시간 및 온도) 매주 변화되는 온실 조건이 원인이 될 수 있다. 또한, 균류 접종물의 제조에서의 작은 변이가 감염과정의 변이에서 역할을 할 수도 있다. 다른 관찰은 질환의 발달은 또한 줄기 조각이 있는 트레이에서의 소기후에 의해 영향을 받을 수 있다는 것이다. 열 개의 다른 실험 트레이가 BC2S1 생물학적 분석에 사용되었다. 통계적 분석은 실험 사이에서의 그리고 실험내의 변이를 보충하는데 사용하였다. 더 적당한 질환 발병률을 가지는 실험이 더 유익하지만 가장 높은 평균 질환 발병률을 갖는 실험은 병변 성장을 측정하는데 가장 유익하였다. 두 형질 간의 선형 상관은 관찰되지 않았기 때문에, 질환 발병률과 병변 성장은 독립적인 형질이다.
토마토에서 B. 시네레아에 대한 내성에 대한 양적 형질 유전자자리는 F2에서 확인되었다. 이 확인된 QTLs는 BC2S1 개체군에서 확인되었고 질환 발병률과 병변 성장에 대한 부모 변이의 각각 46%와 33%를 설명했다. 이러한 결과는 B. 시네레아에 대한 내성을 부여하는 모든 QTLs가 원래의 맵핑 개체군에서 검출되지는 않는다는 것을 시사하는 것이다. 둘 다의 BC2S1 개체군에서, 식물들은 내성이 있는 부모 LYC 4/78 보다 더 높은 내성 수준을 갖는다는 것이 발견되었다. 이것은 BC2S1 개체군에서 분리하는 추가적인 내성 유전자자리의 존재에 대해 나타낸다. 내성의 추가적 분리는 두 BC2S1 개체군의 게놈의 이미 큰 부분이 동종접합 Moneymaker라는 것이 예상되었기 때문에 놀랍다.
3.10 온실 조건에서의 개개의 QTLs 의 효과의 확인
상기에 기술된 QTLs 중 어느 하나를 함유한 식물은 도 2에서 기술된 방법을 사용하여 L.esculentum 배경에 놓여졌다. BC2S2 계통은 네덜란드에서 표준 실행 조건 하에 온실의 토양에 놓여졌고 재배되었다. 3개월 후 식물은 주 줄기의 상처에 보트리티스를 함유한 아가르 디스크를 놓음으로서 접종되었다. 상처는 이어서 Parafilm®을 사용하여 폐쇄되었다. 접종 3주 후 줄기 병변 길이가 측정되었다(cm로)(더 많은 세부사항은 하기 참조). 결론은 표 10에 기재되어 있다. 분명히, 병변 성장에 대한 QTL을 함유한 계통들은 병변 크기에서 극도의 감소를 보여준다.
표 10. 접종 3주 후, L. hirsutum 취득물 LYC 4/78 및 L. hirsutum LA 1777 의 성체 식물에서 Botrytis cinerea 병변 중의 평균 줄기 병변 길이
Figure 112007037994733-PCT00010
***) a, b, c 및 d는 개별 반복이 5개 식물들을 나타내는 반복들이다; e와 f는 개별 반복이 3개 식물들을 나타내는 반복들이다; GT는 TMV 내성을 가진 Moneyberg이다; Durintha는 재배자에 따라 부분적 내성을 가진 잡종이다; Tradiro는 재배자에 따라 Botrytis에 감염되기 쉬운 잡종이다; BChirs는 L. hirsutum LYC 4/78 이입으로 초래된 역교배 라인이다; LA 1777는 야생종 이입 L. hirsutum LA 1777이다; BC chrs 10은 L. hirsutum LA 1777로부터의 염색체 10에서 이입을 가진 역교배 라인을 지시한다; parv는 L. parviflorum 이입으로부터 초래된 라인을 나타낸다.
3.11 L. hirsutum LYC 4/78 QTLs 에 의해 부여받은 보트리티스에 대한 내성 수준은 염색체 10에서의 L. peruvianum LA 1777 QTLs 에 의해 부여받은 내성의 수준보다 더 높다.
여기에 기술된 L. hirsutm LYC 4/78 QTLs를 함유한 식물에서의 내성의 수준은 L. hirsutum LA1777 염색체 10 상에 부분적 보트리티스 내성을 위한 QTL을 함유한 WO02/085105의 공급원의 것과, 그리고 염색체 10에서의 이입들을 갖는 그로부터 유래된 이입 계통과 비교되었다.
계통들은 온실의 토양에 놓였고 네덜란드에서 표준 실행 조건 하에 성장되었다. 3개월 후 식물들은 주 줄기에서 2 cm 길이의 수직 줄기 상처에 보트리티스를 함유하는 0.5 cm x 0.5 cm 아가르 디스크를 놓음으로서 접종되었다. 상처는 이후 Parafilm®을 사용하여 폐쇄되었다. 접종 3주 후 줄기 병변 길이(균류 성장이 점재된 변색 조직의 길이)는 병변의 꼭대기로부터 바닥까지 (cm로) 측정되었다. 표 10에 결과가 기재되어 있다. L. hirsutum LYC 4/78로부터의 QTLs를 함유하는 계통은 LA 1777 원천 및 IL-계통보다 보트리티스에 대한 더 높은 수준의 내성을 보여주었다는 것이 관찰되었다. 부가적으로, 염색체 4 상에 질환 발병률에 대한 QTL의 조합 및 염색체 9상에 병변 성장의 것(계통 68), 또는 염색체 3 및 염색체 4(계통 78) 상에 질환 발병률에 대한 둘 다의 QTLs의 조합을 함유하는 L. parviflorum은 LA 1777 원천 및 IL-계통에 비교되었다. 더 이전의 계통은 줄기 상에 병변 성장이 덜했고 따라서 LA 1777로부터 유래된 계통보다 더 높은 수준의 보트리티스에 대한 내성을 나타낸다(표 10 참조). 2.0 cm의 병변 길이가 기록된 경우, 원래의 상처만이 측정될 수 있었고 균류 성장은 관찰되지 않았고, 이것은 더 높은 수준의 내성을 나타낸다. 따라서, 2 cm의 줄기 병변 길이는 순 성장의 부재를 나타낸다.
여기서 사용되는 것과 같은 마커 서열
하기 표는 여러 연관 지도에 나타나 있듯이 그리고 본 발명의 QTLs와의 취득물에 대해 나타나 있듯이 여러 RFLP 및 COS-Ⅱ에 대한 상세한 정보를 제공한다. 그 정보는 Cornell University에서 주관한 SOL Genomic Network (SGN) 데이터베이스, 2005년 10월의 version으로부터 직접 복사되었다.
표 11
Figure 112007037994733-PCT00011
표 12
Figure 112007037994733-PCT00012
표 13
Figure 112007037994733-PCT00013
표 14
Figure 112007037994733-PCT00014
표 15
Figure 112007037994733-PCT00015
표 16
Figure 112007037994733-PCT00016
표 17
Figure 112007037994733-PCT00017
표 18
Figure 112007037994733-PCT00018
표 19
Figure 112007037994733-PCT00019
표 20
Figure 112007037994733-PCT00020
표 21
Figure 112007037994733-PCT00021
표 22
Figure 112007037994733-PCT00022
표 23
Figure 112007037994733-PCT00023
표 24
Figure 112007037994733-PCT00024
표 25
Figure 112007037994733-PCT00025
표 26
Figure 112007037994733-PCT00026
표 27
Figure 112007037994733-PCT00027
표 28
Figure 112007037994733-PCT00028
표 29
Figure 112007037994733-PCT00029
참고문헌
Figure 112007037994733-PCT00030
Figure 112007037994733-PCT00031
Figure 112007037994733-PCT00032
Figure 112007037994733-PCT00033
Figure 112007037994733-PCT00034
SEQUENCE LISTING <110> De Ruiter Seeds R&D B.V. Van Kan, Johannes A.L. Ten Have, Arjen Lindhout, Willem H. Finkers, Hendrikus J. Van Berloo, Remco Van Heusden, Adriaan W. <120> Tomato plants having higher levels of resistance to Botrytis <130> P68869PC00 <140> PCT/NL2005/000762 <141> 2005-10-24 <150> EP 04077931.6 <151> 2004-10-25 <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 476 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG301, forward sequence <400> 1 ttgtaactta ctaaattaag agctcaggat gaacagaaca cgaattatta gttcatatta 60 agcaagaaac ttaaaaaact tcaccttctc caacatactc tacaacaaac tcttttgtct 120 tgatatcttc atctgccaca atcccagtgc cacatttctc agtctgcacg ttatgagtca 180 acaaaacttt agttttttag atgattattg cttggttttc aaaagaaacg aaaataagaa 240 gaatacaaaa taaccaacat ttctttactt cttcaccaga tacacaactg aattaaatgc 300 aaaaatagat atgaaaaatg ttaccagcct gcacttttga tgcagattgt acttgtttgc 360 aattgaaaag tgtcgaatgg tcatttttgg taaaaactga tgaatgtggt attttgagaa 420 aggatttatg acggtccttt tgcttaatta tccctcttat aaacgttagt aaaggc 476 <210> 2 <211> 485 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG301, reverse sequence <400> 2 tattctgaat ctggaaaatt gttctgccaa tttctttgac caaccagaca ataccctttt 60 aatctaagac cctaattaca aggttactga caatcacttt tgacaccaat gtctttgata 120 aagcactgtt aaaattttca gatgtgcttt aatactctgc atccttttta ggaactcttt 180 tgtctacttt cactttttaa aagaaagaac ttaaggagag gacatactta ttatttttgc 240 attttctata tcaagtaaag tgagaagact tccattaatt tgcatccagc ggatgctaat 300 ggctacaaca tagctacttt aagcaaatag gtgatttgat caagattctt tacgttttca 360 agatcacagc aacaaaaagg gttccttaaa aacctagcct ttactaacgt ttataagagg 420 gataattaag caaaaggacc gtcataaatc ctttctcaaa ataccacatt catcagtttt 480 tacca 485 <210> 3 <211> 466 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG460, forward sequence <400> 3 ccttagtttt gaaatcttta agtagcaatt agtaatcggt agctctccag tatgaaaagt 60 tcataatcac ttggtggatc tcttattatt tgcatcattt gtgtgcaata ggcataagag 120 gtagtcattt cacaatgcct ctgaaatgtg tgcattgaca tttgagaaca cttgaggatg 180 ggatacactc tctgtcatca ggaactactt aggtgacaaa tagatgtgaa gattcacggc 240 atagtgtctt ttgatccata tcataaccag aaagtgagta tccccatttc tcacattagc 300 tatatgaagg aagaaaggga aaacaaagga aagcgctacc cttattcgtc gaaagctagc 360 cttcatgata aaccaaatga aattagaaaa atttaagaac tttgctatag cttcaaagaa 420 atcttttaga ttcttgttta caaagttttg ctgatctttc ttacat 466 <210> 4 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG460, reverse sequence <400> 4 ttatgatgct caaaatttct tattttagac agactcgaaa tgtgactatt ccagagaaaa 60 ataaacaaga tccctcggga cactgaacct gagaacaggt tcaaattccc tactgtaccc 120 caacagacaa agggaagaga gagctatcag tttctctttg gtttgagaaa aaacataata 180 gtatggagtg taccagatgc ttcaggattt cagacatgtt ctgacttgtt acctaatgta 240 tttgatttca tagtataaat cttaggtgtt ctgcttgact agaagtatgg aaagtcattc 300 ttgtcagtag tcagtcttga gatataagat ataatttgat atacatctaa atagatcttg 360 gattcattag ataagttcaa caagcatggg tcaataagca cattgatcaa ttacaggatg 420 tagaataact ttgcttattg tgaaatcctc aaaaatgaat gatgcaggca agaagtgcaa 480 attacc 486 <210> 5 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG55, forward sequence <400> 5 tggattcagt gtgaagaaag gggacatggt gagttaccta ccatatgcaa tgggaagaat 60 gaaatttata tggggcgatg atgcagaaga atatacaccg gagagatggc ttgatgggga 120 cggtttcttc aggcaataca atcccttcaa atttacagct ttccagggtg ttttgaagct 180 catcataagc tttgattatc attttgttaa agccttgaac gcaagtctat acttaacttg 240 cctagagcta tgtactgtcg acatatgatc aattaactaa gcacattctt ttgttaataa 300 aacaggcagg gccaaggatt tgcttgggaa aggagtttgc ttataggcaa atgaagatat 360 tctctgctgt tttattacat cacttcgttt tcaagctgag tgatgacaac aaggctacca 420 actacaggac aatgattact cttcacattg atgggggatt 460 <210> 6 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG55, reverse sequence <400> 6 gatccaaaat atgcttttct gatgaccctt accagatgga ttcagtgtga agaaagggga 60 catggtgagt tacctaccat atgcaatggg aagaatgaaa tttatatggg gtgatgatgc 120 agaagaatat aaaccggaga gatggcttga tggggacggt ttcttcaggc aagagaatcc 180 cttcaaattt acagctttcc aggttgtttt aaagctcatc ataagctttg attatcattt 240 tgttaaagcc ttgaacgcga gtctatactt aacttgccta gtgctatgta ctgtcgtcat 300 atgatcaatt aactaagcac attcttttgt taataaaaca ggcagggcca aggatttgct 360 tgggaaagga gtttgcttat aggcaaatga agatattctc tgctgtttta ttacatcact 420 ttgttttcaa gttgagtgat gacaacaagg ctaccaacta caggacaatg attactcttc 480 acattgatgg gggattgcat gttcgtgtct ttagta 516 <210> 7 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG59, forward sequence <400> 7 tcgacctgca gatatttcat aaaagaatgc cccctgaagc agttgatttg gtgtcgaggc 60 ttctccaata ttctccaact ctacgctgca ctgctgtaag taaaaagttt tcttctcaat 120 tatcaagtat ttaggatatt ctggtagttt cccattttac ccatcattca aacatggtgt 180 tccatttttg ttatgtttca atatgcgagt tctcattgat tgtcctttta gcacttctgt 240 tttccgggga tattgagaac attttgtgtt tattgacagt tggaagcatg tgcacaccct 300 ttctttgatt ctttaaggga accaaatgct tgcttgccaa atgggcgacc tctgcctccc 360 ctattcaact tttcacctca aggtgagctt cagtctagct ttctcctttt atttcacatg 420 atttgatacg tcaat 435 <210> 8 <211> 526 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG59, reverse sequence <400> 8 agttgggaat tatatcctgt tcagtagaca aattacccaa ccagaatata cgtacctgaa 60 tgttcatgtg atagataagt ccatactagt acttctgtct tgtgaatatc tgtgtgttgc 120 cttgtgagta aggatattca ttgctccaat gcaaaaccat tatgtcattg tcttagggag 180 ctttctgttg tttgtatggc atgaaaagtt aatcctaaaa gaaaggtaaa gtaaaggtgc 240 atcctaggtt agtataatgt tctgaaggca aagatgtttt tcttttgatt taaacttatg 300 tttttttttc tttgattccg tctccttccc taatagcaaa aactgggaag ttgaaactac 360 gttataactg gacaacctca taaatgaaaa agatggtaaa taatgccatt tctggggtgg 420 ggtaattttc cttagatgag tgtgatactg ttgtacctgt tgcttgaact cctaagtttc 480 ctcattttct tcctttttgt ttatgctaaa tgccgtgtgt actgtg 526 <210> 9 <211> 430 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG145, forward sequence <400> 9 atgggctatg cttggtgctc ttggatgtgt cttccctgag ctattggccc gtaatggtgt 60 caagttcggt gaggctgtgt ggttcaaggc tggatcccag atcttcagcg agggtggact 120 tgattacttg ggcaacccaa gcttggtcca tgcacaaagc atcttggcca tctgggcttg 180 ccaagttgtg ttgatgggag ccgttgaggg ataccgcatt gctggtggac ctcttggtga 240 ggttgtcgac ccactctacc ccggtggcag cttcgaccca ttaggccttg ctgaagaccc 300 ggaggcattt gctgagctta aggttaagga gatcaagaac ggcagacttg ctatgttctc 360 tatgtttggg ttctttgttc aggccattgt taccggaaag ggtccattgg agaacctcgc 420 tgaccacctt 430 <210> 10 <211> 481 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG145, reverse sequence <400> 10 ggagacaacc ttgcatgcca gcagtggatc acctcgagtc cacggttctt ggcaaaggtt 60 tctggatctg ctgaaagtcc agcggtgtcc cacccgtagt caccagggaa ttcaccattc 120 aagtagctag gggactcacc agagaatgga cccaagtact taacacggtc agggccatac 180 catgggctgc tagatggggc tgactttgcg acagcctttc tcatagtgat ccttccattt 240 cctgtgattt ctgaggcaga tggtaagagt ttcactgctt gtccagcaaa agaaggggaa 300 gaaagagcca ttgtagcagc tgccatggtg tttatatcaa gagaaatgta agtgtttgat 360 ggtatgagat attgttgaag ttggctgtaa tgagatgaag ttacaaggaa ttaattcacc 420 atatatatag ggagtaatta agagggaaag agtccaaatt atctaatgat atctatatct 480 a 481 <210> 11 <211> 479 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker CT128, forward sequence <400> 11 cttttttttt ttttcaacac aaacaaaatt tcattatatt gtcaggtagc acactacatc 60 tttacactgt catcaaacga ccagagactt gagaacgttt taagagattc attttccggg 120 gacaaagttt gtggcgaaag cccaggcatt gttgtttacg gggtctgcaa ggtggtcagc 180 aaggttctcc aatggaccct ttccggtgac aatagcttga acaaagaatc caaacataga 240 gaacatagca agtctaccgt tcttgatctc ctttaccttg agctcagcaa atgcctctgg 300 gtcttcagca aggcctaatg ggtcgaagct gccaccaggg tagagtgggt cgacaacctc 360 accaagaggt ccaccagcaa tacggtatcc ctcaacagct cccatcaaca caacttggca 420 agcccagatg gccaagatgc tttgtgcatg gaccaagctt gggttgccca agtagtcaa 479 <210> 12 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker CT128, reverse sequence <400> 12 ctggtgatta cgggtgggat accgctggac tttcagcaga ccctgaaact tttgccaaga 60 accgtgaact tgaggtgatc cactgcagat gggctatgct tggtgctctt ggatgtgtct 120 tccctgagct cttggcccgt aatggtgtca agttcggtga ggctgtgtgg ttcaaggccg 180 gatcccagat cttcagtgaa ggtggacttg actacttggg caacccaagc ttggtccatg 240 cacaaagcat cttggccatc tgggcttgcc aagttgtgtt gatgggagct gttgagggat 300 accgtattgc tggtgggacc tcttggtgag gttgtcgacc cactctaccc tggtggcagc 360 ttcgacccat taggccttgc tgaagaccca gaggcatttg ctgagctcaa ggtaaaggag 420 atcaagaacg gtagacttgc tatgttctct atgtttggat tctttgttca agctattgtc 480 accggaaagg gtcca 495 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer <400> 13 atcatacctt ctctctccaa accc 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer <400> 14 tcgccattgc tcactttaaa ctg 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer <400> 15 ttgggcgacc acgctgaatc 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer <400> 16 ttacccacat caggaccttg cc 22 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer <400> 17 tgataaatgc tgggaagatt gactc 25 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer <400> 18 atcaacctgg ctccatcttc tatttg 26 <210> 19 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG609, forward sequence <400> 19 gagacagctt gcatgcctgc agaggtgata aattcaccaa ggtttcatat ttaggaaaca 60 agaaaattaa aagatcatta acacagatga aaggatatga ctaggaggca atgactgatc 120 tttgactatc aaatacttct cagggaaaca atgtgaatgg gcttttacat gcagagatat 180 tgattgtgat catgttgaag aacttaggaa acatgaaatt aaatgatcat taacactgat 240 gcaaggatat gccaagtagg caagcaaatt aaggttgaac ataaatgtct gtgatctttg 300 actatcaaat atcttctcag aaaaaaaaat gtgaatgctc atttacatgc agagatggct 360 attgtgatca tgtggctcag ccttgagtct atattgaggt gcagacaaca tagtccctaa 420 ccacatgtgt gatcaagcaa cttttttgat gtccacaggg ttataagtag gcaacattta 480 agcaagaaaa aacacaggat cactattgag tcagctgctg ttgcctgt 528 <210> 20 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG609, reverse sequence <400> 20 ggagacaagc ttgcatgcct gcagaggtga taaattcacc aaggtttcat atttaggaaa 60 caagaaaatt aaaagatcat taacacagat gaaaggatat gactagtagg caatgactga 120 tctttgacta tcaaatactt ctcagggaaa caatgtgaat gggcttttac atgcagagat 180 attgattgtg atcatgttga agaacttagg aaacatgaaa ttaaatgatc attaacactg 240 atgcaaggat atgccaagta ggcaagcaaa ttaaggttga acataaatgt ctgtgatctt 300 tgactatcaa atatcttctc agaaaaaaaa atgtgaatgc tcatttacat gcagagatgg 360 ctattgtgat catgtggctc agccttgagt ctatattgag gtgcagacaa catagtccct 420 aaccacatgt gtgatcaagc aacttttttg atgtccacag gtttataagt aggcaacatt 480 taagcaagaa aaaacacagg atcactattg agtcagctgc tgttgcctgt tactgag 537 <210> 21 <211> 517 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG62, forward sequence <400> 21 caaaatgctt cagctactgg ctaaatgaag tatgttctca acatattcac aagcttctgt 60 cttcgaagct caagaagtgt cggtattatc tgaattaaat agtaaagcaa agagatggtt 120 ttatgtttct taagcagcat ttcttagctt aacggccctc cagatatatg gtggacaaaa 180 tagaatccat tagatataac aaatgggatt agtataatga tcttttactt tgttagatga 240 tcatactaac agattgcaag ttaatcatat ccaacatatt ctgtagatat ttcacattgg 300 ctagcatgag gaaaggtcat gtaggaaatt gaatagagtt caattttggg aaaagttgca 360 ttgaagaagg taacttcaac aaacgtgtga aaaaatcaca tttgagttgc ccgctcacca 420 tcgtgattcc agtacgaact actcaaaaat ttacttttga gccttaaaca tcattttaag 480 ccttgaaaag ctgcttttga aaagatctaa gcaagat 517 <210> 22 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG62, reverse sequence <400> 22 ggagaatatt gtcactctat cagatagttc aaaactatcg gagaatgaaa tggtcaattc 60 ttctcacaag atattcatgc ctagttgcag tgtccgaatt aacataacat gctcaatttt 120 catatcttgc agcaaaattt atcattgaaa ctctctgaga tggaaacaga gaacaaagac 180 catattggaa agcttcaatc agacatgcag aaaaaggaag atgagattca tgttttacgc 240 aaggaaattg acaattacac ggaaacagtg gattcactgg agaagcatgt tacagagatt 300 aacaataaat tggaggagaa agatcagctt gttcaggaac ttcaggacaa ggagaagcag 360 ttggaagctg acagagaaaa ggtttttact acggatactt ttagttctac aaattctatt 420 ataaccaata caatgtgttc aagtgactag tgttttgcac cttgttgcag attcaggcat 480 ctttgcttgc tgctgaaagc aagctcacag aatccaaaaa gcagtatgat cagatgt 537 <210> 23 <211> 478 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG555, forward sequence <400> 23 aattcggagc tcactgcttc taatcctcag tgagacttat tttctacata ttaaacaata 60 agaaatttac gaaggaatat tatagactga attccttggt gacaagtatc aagacatctt 120 gaccaagttt aaagttttgt agtggcagtt cttttaagct ttacttgtgt gaggtagaca 180 tcaaggaaga taagtagcag ctactcttca cggagcagcc cataggacac tcaaattcac 240 tattgcgagg gtcaatctac caatttatgg aacgatacca gtaaagtcat ttttatgtaa 300 acatcagaca gcttttgact aagcagagac atgaataagt tctatttgtt agaagtcgaa 360 gagacaaata agttaatttc acctatgcta taaaagagga ctcttatagt tataaataca 420 gtacatttta ttaagggttc taattgttga ctatgatagc aagcatgccg tactaatt 478 <210> 24 <211> 503 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG555, reverse sequence <400> 24 acattttgag gaagacagga gttatgtatc gccatctggt gtgctccaag aacatgacag 60 atataaaaga ccgcggggtg caccagagaa atgttgcatt ggagcatatt gaacatcata 120 ggctcaatgg aattgtttac tttgcagatg atgataatat ctactcactt gagttgtttg 180 agagcattag atcgatcaag taagttgaga ttcatcagtc ttgtttacat gacttgtctt 240 tgttttgtcc tgctgtgagc atgttcagga tgatgttatg tgctttatgt agatgttcaa 300 gtcgataata gtgaatagtc tagagctatt tcacatatat tacaacttca ctaacaaatt 360 cttttcctgg tgtcctcggt tcatcactct tcatagttat aagaataaca gttgtagatt 420 agaccactgg tcgtgtgatt tttggactta attattatct caattcttcc tcaaaatagc 480 agtccttaga ttagaagctg agg 503 <210> 25 <211> 454 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker CT50, forward sequence <400> 25 cttttttttt ttttttatat attgtggtat agattattat ataataacaa ggtgaattaa 60 catgagaaat gaataattgt cacattcttg ttctgtccat tttccagtag cggctagttg 120 gaaaatttgt tgtaacatgt aacacaggct gtccacattc tactccagag agaaagttgg 180 taagtagtgg gggcaaaaga tagagacccc aatagctatc aattcacttt gttgacaatc 240 aagatttgag aaaaaagatc aaaactttac caacttagat agctccataa tcaactgtag 300 gtacaattct ttagtgaaat tgcggcgttc atcttctggg gacgaagagt aagtagacaa 360 tcaattgtct tgtagaactt gggctttacc attttcccta ggacataagc tcttgatcga 420 agcttgaagt ttaattttag tggcactggt aatg 454 <210> 26 <211> 496 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker CT50, reverse sequence <400> 26 tttttttttt tttttagcca aaatgcatac aaaaactgat tcagaagata cgagcttggc 60 tccttcgtcg ccggacaata gagggccgac ggcgtattac gttcagagtc cgtcacgtga 120 ttctcacgat ggcgagaaga caacgacgtc gtttcactct actcctgtta tcagtcccat 180 gggttctcct cctcactctc actcatccgt cggccgtcac tcccgtgatt cctcttcctc 240 cagattctcc ggctccctca agcctggatc tcagaagatt ttacccgacg ccgccggagg 300 cgtcggcggc cgtcaccacc gcaaagggca gaagccctgg aaggaatgtg atgttatttg 360 aggaagaagg actacttgaa gatgatagat ccagtaaatc tcttccacgt cgttgctatg 420 tccttgcttt ttgttgttgg tttcttcgtc cttttctcct tctttgctct catcctttgg 480 ggtgctagtc gacctc 496 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer <400> 27 tcatcatcaa ctatcgtgat gctaag 26 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer <400> 28 acgcttgcga gccttcttga gac 23 <210> 29 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG599, forward sequence <400> 29 tgctttgaga cagatgtctc tcattaagtg actgaagctt tcttctagtt ggctagcata 60 ttcattttca gcatataatc tgtatcatga acaaaattgc gacagtattg aatttttatt 120 gttgaatagt ctttttatta tccccgaagt tgagggtgga acttacattt tctgttgatc 180 cttgcttgct gtttttgtaa acaaaaaagc gtcacccatt atttttcttt tattctttct 240 aggttgggac taagattttt tgaaatgaga aaggtattcg ctaccttgag ggctgtggtt 300 gaagtgatgg agtatctgag caaagatgca gctcctgatg gtgtgggaag gcttataaag 360 gaggagggag tatttccttt catttctttg tatttccgtg tgtgtatagt ccggaactgg 420 ttccctactt atgaattctt tcatggtttg gtcaattgag aaggatcaag aaatctgatg 480 ctactttatc atgggaactt 500 <210> 30 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG599, reverse sequence <400> 30 gcttgcatgc ctgcagagtg gtcatacaat aaaaggtaaa aatcaacatt cttacctctg 60 gaaagaaacc aatagcattg gtcaatgatg ctgcctctag aggaacaata ttgtatggtg 120 caagttcccc tgataaagta gcatcagatt tcttgatcct tctcaactga ccaaaccatg 180 aaagaattca taagtaggga accagttccg gactatacac acacggaaat acaaagaaat 240 gaaaggaaat actacctcct cctttataag ccttcccaca ccatcaggag ctgcatcttt 300 gctcagatac tccatcactt caaccacagc cctcaaggta gcgaatacct ttctcatttc 360 aaaaaatctt agtcccaacc tagaaagaat aaaagaaaaa taatgggtga cgcttttttg 420 tttacaaaaa cagcaagcaa ggatcaacag aaaatctaag ttccaccctc aacttcgggg 480 ataataaaaa gactattcaa caataaaaat tcaatactgt cgcaa 525 <210> 31 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG10, forward sequence <400> 31 aactctgctc tgccaatagt agtcaggcag atcaagatgc tcaaaatttt ctatttgaat 60 tggaagcatc aagatggttc ttagcattta ttttagaaag actaaccata ttatcaaata 120 accagactga gacgcacaca aaagtttccc tctattattt ttataatgat gtgaagatgc 180 tacataatga gtacactttg ccttacttta ctgcagatgg acctaccagg cccaaacgga 240 catgtagcta tgacagaaga gcaaccgcta tgaatgtctc aaactgttgg cctaggcgat 300 cagcacagat gatgaatctg gaagtacatt ccaagaagga aagctggagc gtgggaacta 360 accagatgca ggggatgaat ccacaccttt cagttgatca tctgaaggga aaactaagaa 420 ttttcatgag aaaatgactg gctattttca actttg 456 <210> 32 <211> 562 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG10, reverse sequence <400> 32 ttcaatgcat ttaagctcaa aaaaacaaag ctgtaggaag gagcatatta gtagcctaac 60 tctgctctgc caataatagt taagcagatc aagatgctca aaattttcta attgaattgt 120 tagcatcaag atgcttctta gcatttattt tagaaagatt aaccatatta tcaaataacc 180 agacagagac gcacacaaaa gtttcaatct attattttta taatgatgtg aaaatgctac 240 ataatgagta cactttccct tactttactg cagatggacc taccaggccc aaacggtcat 300 gtagttatga cagaagaaca acagtatgaa tttctcaaac tgttggccaa ggtgatcagc 360 aaagattatg aatttggaag tacattccaa gaggaaagct ggagcatcgt aactaaccag 420 atgcagggga tgaatccaca cctttcagtt gatcatctga aggcaaaact aagaattttc 480 atgagaaaat actggttatt ttcaactttg ttggccagac gaggagtcca atgggataga 540 aggactaact caatgacgta tg 562 <210> 33 <211> 422 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TM marker TM2A <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is unknown <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> n is unknown <400> 33 cnagctcgan nnaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc ggtggcggcc 60 gctctagaac tagtggatcc cccgggctgc aggctcctcc attgaaaagg gaatcaagtt 120 tgccaaagaa aactaaaaaa acaaaattat ggtctagttt tctatagtga cagttttgga 180 tctttttggg tcaattgttt ttgtatcctt tgcaagtttc ttgcagccgg aggcttagat 240 ttagctcttt tgatattata cccaacattt ctacaaaata atgtatggca aactgggggc 300 ctatcccatt tgccttagtg tggaggtgtt attctcacat gaatcgtttt ccaattatgg 360 ttagtagcag acaattgatg caaaatgaag aaatgttcat gaccaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aa 422 <210> 34 <211> 458 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG551, forward sequence <400> 34 aatgaagttc agttgataag ctaaatggtg gaaatactaa ttttaattga cagtaacttt 60 gcatttcaag gtccatacca aaacatttgc taacaccagt tgctttgtca acgaaaacct 120 tggcactcaa aaccctacca aaaggctgaa atgcatttgc aagctcttga tcaccaaatt 180 cttgaggaat atggtaaata aatagattag caccaggtgg acctgtaaac agcaaaatcg 240 tttttgataa gtacaggttt atttctacat gttcaactac cactgccaag tacactagtt 300 caagtgacat ctccaccact taattgcata aagctttacc aacgacaaat ataacaaact 360 tgtgcaagta atttgagttc ctgtctatac agtccagaat ctccatatgc tgctcatctc 420 acaatgttgg ttaaggaaat ttgtcaagta aagttcaa 458 <210> 35 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RFLP marker TG551, reverse sequence <400> 35 catcttcaag tgtcagctca agtacagggg gtcaggttga aggttgttga acatttattt 60 tgtgaccttt ttagctctag aatttctgta gctaatcaag tacagtccca taacctaggg 120 gctgttaggg ttttctgctg aatgaggctg cttgtcttta ttttggttaa ttattttctg 180 gaaattgttc ctcgtcatag agaatagaag tagaagaaga agaagatagt ataatctatt 240 atatttgttt tttacttaat ttataaagat tccataaatg catgtgatct ttgatcaatg 300 atatcttata caagtgtatc actagaatct attatatttg gatttactta ttttatatag 360 gatttcataa acgcatgtga tc 382

Claims (30)

  1. 보트리티스-내성 토마토 식물로, 상기 식물은 생화학적 분석에 의해 측정될 때 감염되기 쉬운 대조군 식물보다 적어도 3배 더 낮은 보트리티스 시네레아에 대한 감염가능성을 갖고, 여기서 성체 식물에서 보트리티스 시네레아 감염으로부터 생긴 줄기 병변의 평균 길이는 표준 실행 조건 하에서 3주 기간 중에 측정된 것인 보트리티스-내성 토마토 식물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 식물은 그것의 게놈 내에 보트리티스-내성과 관련된 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택된, 하나 이상의 상기 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하고, 여기서 상기 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분은 천연 유전 배경에는 있지 않는 것을 특징으로 하는 보트리티스-내성 토마토 식물.
  3. 하기 단계들을 포함하는 토마토에서 개선된 보트리티스-내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리(QTL)의 검출 방법:
    a) 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물을 비-내성, 또는 보트리티스에 감염되기 쉬운, 수용자 토마토 식물과 교배시키는 단계;
    b) 하나 이상의 자손 식물을 감염량의 보트리티스와 접촉시키는 단계;
    c) 질환 발병률 및/또는 상기 하나 이상의 자손 식물에서 병변 성장의 속도를 양적으로 측정하는 단계;
    d) 관찰된 질환 발병률 및/또는 상기 하나 이상의 자손 식물에서 상기 공여자 토마토 식물의 염색체 마커의 존재에 대한 병변 성장 속도를 연결하는 유전 연관 지도를 수립하는 단계, 및
    e) QTL로 감소된 질환 발병률 및/또는 감소된 병변 성장 속도에 연결된 상기 지도 상의 연속(contiguous) 마커를 할당하는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물은 Lycopersicon cerasiforme , Lycopersicon cheesmanii , Lycopersicon chilense , Lycopersicon chmielewskii , Lycopersicon esculentum , Lycopersicon hirsutum , Lycopersicon parviflorum , Lycopersicon pennellii , Lycopersicon peruvianum , Lycopersicon pimpinellifolium 및 Solanum lycopersicoides로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물은 Lycopersicon hirsutum 또는 Lycopersicon parviflorum , 더 바람직하기는 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 또는 Lycopersicon parviflorum G1.1601의 야생 취득물(accession)인 것인 방법.
  6. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물은 종 Lycopersicon esculentum, 바람직하기는 Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker의 식물인 것인 방법.
  7. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 발병률의 정량적 측정은 감염원 및 식물 사이의 잠재적으로 감염성이 있는 접촉의 총 수에 대해 성공적인 감염 (병변)의 수의 비율을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 병변 성장의 속도의 정량적 측정은 시간이 흐름에 따라 하나 이상의 상기 병변의 지름, 원주, 표면적 또는 체적의 증가를 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 발병률 및/또는 병변 성장의 속도의 정량적 측정은 다중 자손 식물에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 자손 식물은 상기 공여자 및 수용자 식물 사이의 교배로부터 유래된 분리(segregating) F2 개체군의 식물인 것인 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 F2 개체군은 F1 개체군의 식물을 자가수분시키는 것으로부터 얻어진 종자로부터 유래된 것인 방법.
  11. 제 3항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 상기 QTL을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 토마토에서의 보트리티스-내성과 관련된 QTL.
  13. QTL이 보트리티스-내성과 관련된 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택되는 토마토에서 보트리티스-내성과 관련된 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분.
  14. 제 13항에 있어서, 표 1 및 2의 마커 및 QTL에 연결된 것으로서 도 1, 5 및 6에 나타내진 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분.
  15. 보트리티스-내성-토마토 식물을 생산하는 방법으로, 상기 방법은 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물로부터 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물로, 하나 이상의 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산을 전이시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 핵산의 상기 전이는 형질전환에 의해, 원형질체 융합에 의해, 이중 단상체 (haploid) 기술에 의해 또는 미숙배배양(embryo rescue)에 의해 수행되는 것인 방법.
  16. 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산 방법으로, 상기 방법은 보트리티스-내성 토마토 식물에서 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 토마토에서 보트리티스-내성과 관련된 QTL을 검출하는 방법을 수행하고, 그에 따라 검출된 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 핵산을, 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물로부터 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물로 전이시키는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물은 Lycopersicon cerasiforme , Lycopersicon cheesmanii , Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii , Lycopersicon esculentum , Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum , Lycopersicon pennellii , Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium 및 Solanum lycopersicoides로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물은 Lycopersicon hirsutum 또는 Lycopersicon parviflorum , 더 바람직하기는 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 또는 Lycopersicon parviflorum G1.1601의 야생 취득물인 것인 방법.
  19. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물은 상업적으로 바람직한 특징을 소유한 종 Lycopersicon esculentum, 더 바람직하기는 L. esculentum 계통의 식물인 것인 방법.
  20. 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산의 전이는 상기 보트리티스-내성 공여자 토마토 식물을 보트리티스-감염되기 쉬운 수용자 토마토 식물과 교배시켜 자손 식물을 생산하는 단계, 및 자손 식물들 중에서 그것의 게놈에 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 식물을 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 선택은 표 1 및 2의 마커 및 상기 QTL에 연결된 것으로서 도 1, 5 및 6에 나타내진 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 마커에 의한 마커-어시스티드 선택을 포함하는 방법.
  22. 제 15항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 식물은 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 및/또는 Lycopersicon parviflorum G1.1601인 것이고, 여기서 상기 공여자 식물로부터 상기 수용자 식물로 전이된 상기 DNA는, 보트리티스-내성과 관련된 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상 의 QTLs 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택된, 토마토에서 보트리티스-내성과 관련된 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하는 것인 방법.
  23. 제 13항 내지 22항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는, 보트리티스-내성 토마토 식물, 또는 그것의 부분.
  24. 보트리티스-내성 토마토 식물, 또는 그것의 부분으로, 그것의 게놈에 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-부여 부분을 포함하고, 상기 QTL은 보트리티스-내성과 관련된 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4 상의 QTLs 및 Lycopersicon parviflorum G1.1601에서 염색체 3, 4 및 9 상의 QTLs로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 QTL 또는 상기 그것의 보트리티스-내성-부여 부분은 그것의 천연 유전 배경에 없는 것인 식물 또는 식물 부분.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 QTLs는 표 1 및 2의 마커 및 상기 QTL에 연결된 것으로서 도 1, 5 및 6에 나타내진 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커에 의해 나타내지는 것인, 식물 또는 식물 부분.
  26. 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 따른 토마토 식물을 상업적으로 바람직한 특징을 나타내는 토마토 식물과 교배시킴으로서 얻을 수 있는, 교잡종 토마토 식물, 또는 그것의 부분.
  27. 제 23항 내지 26항 중 어느 한 항에 따른 토마토 식물을 재배시킴으로서 생산되는 토마토 종자.
  28. 제 26항의 식물을 바람직한 표현형 형질을 갖는 L. esculentum 식물과 역교배시켜서 보트리티스-내성이 있고 바람직한 표현형 형질을 갖는 L. esculentum 식물을 얻고, 상기 식물에 의해 생산된 종자를 모집함에 의해 생산되는 토마토 종자.
  29. 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산을 위한 제 11항 또는 제 12항에 따른 QTL의 용도.
  30. 보트리티스-내성 토마토 식물의 검출을 위한 보트리티스-내성과 관련된 표 1 및 2의 마커 및 QTL에 연결된 것으로서 도 1, 5 및 6에 나타내진 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 용도.
KR1020077011767A 2004-10-25 2005-10-24 보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토식물 KR101329485B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04077931A EP1652930A1 (en) 2004-10-25 2004-10-25 Botrytis-resistant tomato plants
EP04077931.6 2004-10-25
PCT/NL2005/000762 WO2006046861A2 (en) 2004-10-25 2005-10-24 Tomato plants having higher levels of resistance to botrytis

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137010619A Division KR101365296B1 (ko) 2004-10-25 2005-10-24 보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토 식물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070084532A true KR20070084532A (ko) 2007-08-24
KR101329485B1 KR101329485B1 (ko) 2013-11-22

Family

ID=34928600

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077011767A KR101329485B1 (ko) 2004-10-25 2005-10-24 보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토식물
KR1020137010619A KR101365296B1 (ko) 2004-10-25 2005-10-24 보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토 식물

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137010619A KR101365296B1 (ko) 2004-10-25 2005-10-24 보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토 식물

Country Status (14)

Country Link
US (2) US7968773B2 (ko)
EP (3) EP1652930A1 (ko)
JP (1) JP5464804B2 (ko)
KR (2) KR101329485B1 (ko)
CN (1) CN101087884B (ko)
AU (1) AU2005300181B8 (ko)
BR (1) BRPI0516970A (ko)
CA (1) CA2584780C (ko)
ES (1) ES2436094T3 (ko)
IL (2) IL182722A (ko)
MA (1) MA29041B1 (ko)
MX (2) MX349007B (ko)
RU (1) RU2403709C2 (ko)
WO (1) WO2006046861A2 (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1652930A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-03 De Ruiter Seeds R&D B.V. Botrytis-resistant tomato plants
US8420890B2 (en) 2006-03-28 2013-04-16 Cornell Research Foundation, Inc. Use of NAP gene to manipulate leaf senescence in plants
EP1849871A1 (en) * 2006-04-25 2007-10-31 De Ruiter Seeds R&D B.V. Tomato plants having higher levels of resistance to Botrytis
NL1033758C2 (nl) * 2006-06-01 2007-11-13 De Ruiter Seeds R & D Bv ToTV-resistente planten.
EP1992218A1 (en) * 2007-05-18 2008-11-19 De Ruiter Seeds R&D B.V. Parthenocarpic genetic elements derived from S. habrochaites
EP2583548A1 (en) 2007-07-05 2013-04-24 Western Seed International B.V. Parthenocarpy genes in tomato
WO2010147467A2 (en) * 2009-06-17 2010-12-23 Monsanto Invest N.V. Novel tomato plants
EP2525658B1 (de) 2010-01-22 2017-03-01 Bayer Intellectual Property GmbH Akarizide und/oder insektizide wirkstoffkombinationen
WO2012050962A1 (en) 2010-09-29 2012-04-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Hybrid cotton plants with improved fiber quality and yield traits
KR20130116074A (ko) 2010-11-02 2013-10-22 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 Ｎ-헤타릴메틸 피라졸릴카르복사미드
CN103313971B (zh) 2010-11-15 2015-12-02 拜耳知识产权有限责任公司 N-芳基吡唑（硫代）甲酰胺
US20130289077A1 (en) 2010-12-29 2013-10-31 Juergen Benting Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
US9265252B2 (en) 2011-08-10 2016-02-23 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
WO2013033210A1 (en) * 2011-08-30 2013-03-07 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for producing capsicum plants with powdery mildew resistance
CN102759513A (zh) * 2012-07-25 2012-10-31 山东农业大学 一种快速检测灰霉病菌对杀菌剂敏感性的方法
CA3000049A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Tomato plant producing fruits with beneficial compounds
JP2019129705A (ja) 2016-03-31 2019-08-08 日本たばこ産業株式会社 植物に物質を導入する方法
EP3257944A1 (en) 2016-06-14 2017-12-20 Nunhems B.V. Tomato plants having alterations in the dmr6 gene

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
US7799976B2 (en) * 2001-04-25 2010-09-21 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Tomato plants that exhibit resistance to botrytis cinerea
EP1381266A4 (en) * 2001-04-25 2004-09-22 Seminis Vegetables Seeds Inc TOMATO PLANTS WITH RESISTANCE TO BOTRYTIS CINEREA
EP1652930A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-03 De Ruiter Seeds R&D B.V. Botrytis-resistant tomato plants
EP1849871A1 (en) * 2006-04-25 2007-10-31 De Ruiter Seeds R&D B.V. Tomato plants having higher levels of resistance to Botrytis

Also Published As

Publication number Publication date
US20070300314A1 (en) 2007-12-27
IL182722A (en) 2014-01-30
MX2007004779A (es) 2007-07-11
KR20130055024A (ko) 2013-05-27
CN101087884B (zh) 2014-05-14
AU2005300181A8 (en) 2011-08-11
ES2436094T3 (es) 2013-12-27
IL182722A0 (en) 2007-07-24
WO2006046861A2 (en) 2006-05-04
CA2584780C (en) 2021-07-06
KR101365296B1 (ko) 2014-02-19
US8575451B2 (en) 2013-11-05
EP1652930A1 (en) 2006-05-03
EP1812575A2 (en) 2007-08-01
JP2008517621A (ja) 2008-05-29
EP1812575B1 (en) 2013-08-28
AU2005300181B2 (en) 2011-07-28
CN101087884A (zh) 2007-12-12
MA29041B1 (fr) 2007-11-01
JP5464804B2 (ja) 2014-04-09
AU2005300181B8 (en) 2011-08-11
BRPI0516970A (pt) 2008-09-30
RU2403709C2 (ru) 2010-11-20
WO2006046861A3 (en) 2006-09-08
RU2007119388A (ru) 2008-11-27
EP2298068A3 (en) 2011-06-15
IL217617A (en) 2014-01-30
KR101329485B1 (ko) 2013-11-22
EP2298068A2 (en) 2011-03-23
AU2005300181A1 (en) 2006-05-04
US7968773B2 (en) 2011-06-28
US20110321192A1 (en) 2011-12-29
CA2584780A1 (en) 2006-05-04
MX349007B (es) 2017-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101329485B1 (ko) 보트리티스에 대해 더 높은 수준의 내성을 갖는 토마토식물
RU2418405C2 (ru) Растения огурца, устойчивые к заболеваниям
US10064351B2 (en) F. oxysporum F.sp. melonis race 1,2-resistant melons
MX2010011357A (es) Plantas de pepino resistentes al mildiu velloso.
IL202170A (en) Parthenocritic genetic elements from s.habrochaites
EP2887796A2 (en) Multiple-virus-resistant melon
JP2014050395A (ja) ボトリチスに対して高レベルの耐性を有するトマト植物
AU2010284996B2 (en) Disease resistant tomato plants
CA2753796A1 (en) Fusarium resistant cucumber plants
IL262069A (en) Yield and increased amount of soluble sugars attributed to fruits in tomato plants
US20230227839A1 (en) Novel disease resistant melon plants

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161024

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171023

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181024

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191029

Year of fee payment: 7