KR20070044399A - 피리미딘 합성 저해제 관련 조성물 및 방법 - Google Patents

피리미딘 합성 저해제 관련 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20070044399A
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사디스 마타론
이안 씨. 다비스
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유에이비 리서치 파운데이션
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Abstract

본 발명에서 제공되는 것은 피리미딘 합성 저해제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이다. 이러한 조성물은 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 제거를 증가시키는 방법; 대상의 폐 질환 치료 방법; 대상의 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 하나 이상의 징후 또는 신체적 증상의 감소 방법; 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험에 처한 대상을 확인하여 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 방법; 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상을 확인하여 대상의 Na+ 의존성 폐포 체액을 감소시키기에 효과적인 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 방법; 및 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 스크리닝하는 방법에 사용될 수 있다.

Description

피리미딘 합성 저해제 관련 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO PYRIMIDINE SYNTHESIS INHIBITORS}
본 발명은 피리미딘 합성 저해제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
출원에 관련된 문헌
본 출원은 2004년 5월 21일에 출원된 미국 우선 출원 제60/573,558호의 권리를 주장하며, 이 특허는 문헌 전체로서 본원에 인용된다.
감사
본 발명은 국립 건강 협회의 등록번호 RR17626, HL31197, HL075540, HL51173 및 HL72817 하에서 정부의 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대해 정해진 권리를 가진다.
호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory, syncytial virus, RSV)는 전세계의 신생아 및 유아의 하부 호흡기 기관(lower respiratory tract, LRT) 질병의 주요한 공통 원인이며, 성인 중에서 공동체-후천성 LRT 감염의 원인으로서 진단받을 수도 있다.
1980-1996년 동안, 5세 미만의 7백만명의 유아 중에서 165만명의 기관지염 환자가 발생한 것으로 추정된다. 6개월 미만의 유아 중에서 57%의 환자 및 1세 미만의 유아 중에서 81%의 환자가 발생했다. 1세 미만의 유아 중에서, 연간 기관지염 환자율은 1980년에 1000명당 12.9명에서 1996년에 1000명당 31.2명으로 2.4배 증가하였다. 기관지염에 걸린 1세 미만의 유아 중에서 하부 호흡기 기관 질병에 걸린 환자의 비율은 1980년에 22.2%에서 1996년에 47.4%로 증가하였으며, 전체 환자 중에서 이 비율은 5.4%에서 16.4%로 증가하였다. 1세 미만의 유아 중에서 연간 51,240 내지 81,985명의 기관지염 환자가 RSV 감염과 관련이 있는 것으로 추측된다. 만약, 폐렴에 걸린 기관지염 환자를 고려한다면, RSV 감염은 미국 내에서만 연간 126,000명의 환자로 계수된다. 현재까지 RSV에 대한 효과적인 치료법이 없다.
비루(Rhinorrhea), 폐 출혈 및 저산소증은 RSV 감염을 포함한 대부분의 호흡기 감염의 중요한 인자이지만, 이러한 질병에서의 변화된 폐 체액 동역학(lung fluid dynamics)의 기초가 되는 메카니즘은 거의 알려져 있지 않다. 게다가, 역학 연구에서는 신생아의 심각한 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)-유도성 기관지염과 알러지성 질병 사이의 강력한 연관관계를 제시한다. RSV 감염은 가축에서도 중요한데, 이러한 감염이 유발할 수 있는 것은 심각한 호흡기 기관 질병이다.
당업계에 요구되는 것은 RSV 감염을 포함한 호흡기 감염을 예방 및 치료하기 위한 향상된 방법 및 조성물이다.
첨부되는 도면은 명세서의 일부이며 하기 기술된 수개의 양태를 설명한다.
도 1은 피리미딘 및 퓨린 생합성 경로를 나타내는 개략도이다.
도 2는 RSV 감염이 말초 산소화에 미치는 영향을 보여준다. (A) RSV 감염이 시간경과에 따라 의식이 있는 BALB/c 생쥐(일당 n=10-16)의 SmO2 (혼합 산소 포화)에 미치는 영향. (B) 2일째의 모의(mock)-감염된 생쥐 및 RSV-감염된 생쥐에 대한 폐포 체액 제거(AFC) 기간의 시작 및 마지막에서의 샘플 3-리드 ECG(electrocardiogram) 추적. (C) d2에서의 %ΔHR30에 대한 RSV 감염의 영향(모의-감염된 생쥐에 대해 n=17; RSV-감염된 생쥐에 대해 b=11). 모의-감염된 생쥐와 비교할 때, *p<0.05.
도 3은 BALB/c 생쥐의 코의 전위 차이(NPD)에 대한 RSV 감염의 영향을 보여준다. (A) d4에서의 모의-감염된 생쥐 및 RSV-감염된 생쥐의 전형적 NPD 추적. (B) 기준 NPD에 대한 RSV 감염의 영향. (C) NPD의 아밀로라이드-민감성 성분(NPDAMIL)에 대한 RSV 감염의 영향. (D) d4에서의 모의-감염된 생쥐 및 RSV-감염된 생쥐의 코 상피세포로 ±60 nA 펄스를 적용한 NPD 변화의 샘플 추적. (E) 코 상피세포로의 ±60 nA 펄스 적용 후의 ΔNPD에 대한 RSV 감염의 영향. 모든 그룹에 대해 n=5-9. 샘플 추적에 있는 빗금선은 기록지 상에서 0mV를 나타내고, 화살표는 100 ㎛ 아밀로라이드 첨가 시간을 나타낸다. 모의-감염된 생쥐에 비교할 때, *p<0.05, **p<0.005.
도 4는 RSV 감염후의 체중에 대한 뉴클레오타이드 합성 저해의 영향을 보여준다. (A) BALB/c 생쥐의 RSV 감염 후의 급성 체중 감소에 대한 레플루노마이드(UTP 합성 저해제)의 영향(무처리 생쥐에 대해 n=35; 레플루노마이드-처리된 생쥐에 대해 n=19). (B) BALB/c 생쥐의 RSV 감염 후의 급성 체중 감소에 대한 6-MP 처리의 영향(무처리 생쥐에 대해 n=35; 6-MP-처리된 생쥐에 대해 n=30). 각 시간 포인트에서 무처리 생쥐의 체중과 비교할 때, *p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005.
도 5는 감염후 2일째의, 레플루노마이드(LEF) 처리된 생쥐의 급식이 RSV-매개성 AFC의 저해를 역전시키는데 미치는 영향을 보여준다. LEF의 영향은 유리딘의 동시 투여에 의해 억제된다.
도 6은 감염후 2일째의, 레플루노마이드(LEF) 처리된 생쥐의 급식이 폐 물 성분에 증가된 RSV-유도성 증가를 역전시키는데 미치는 영향을 보여준다. 레플루노마이드의 영향은 유리딘의 동시 투여에 의해 억제된다. 중요하게도, LEF 및/또는 유리딘을 이용한 생쥐 처리는 감염후 2일째의 폐 조직에 있는 바이러스 복제에 전혀 영향을 주지 않는다.
도 7은 감염후 2일째의, AFC 적하에 대한 부피-조절된 음이온 채널(VRACs) 저해제의 광범위한 첨가가 RSV 매개성 AFC 저해를 역전시키는데 미치는 영향을 보여준다.
도 8은 RSV 감염 후의 폐의 물 성분에 미치는 뉴클레오타이드 합성 저해의 영향을 보여준다. (A) 2일째에 폐의 물 성분에 미치는 레플루노마이드 및 유리딘 처리의 영향(모든 그룹에 대해 n=7-8). (B) 2일째에 폐의 물 성분에 미치는 6-MP의 영향(모든 미처리 생쥐에 대해 n=8; 미처리된, RSV-감염된 생쥐에 되에 n=7; 6-MP-처리된 생쥐에 대해 n=15). 폐의 물 성분은 습식중량:건중량 비율로 측정되었다. 미감염된 생쥐의 습식중량:건중량과 비교할 때, ***p<0.0005.
도 9는 생쥐 폐의 RSV 복제에 미치는 뉴클레오타이드 합성 저해의 영향을 보여준다. (A) 2일째에 바이러스 복제에 미치는 레플루노마이드 및 유리딘 처리의 영향(미처리된, 유리딘-처리된 그리고 레플루노마이드-처리된, 유리딘-처리된 생쥐에 Δ대해 n=6; 레플루노마이드-처리된 생쥐에 대해 n=12). (B) 2일째에 바이러스 복제에 미치는 6-MP의 영향 (미처리된 생쥐에 대해 n=6; 6-MP 처리된 생쥐에 대해 n=12). (C) 8일째에 바이러스 복제에 미치는 레플루노마이드의 계속 처리의 영향 (미처리된 생쥐에 대해 n=6; 레플루노마이드-처리된 생쥐에 대해 n=12). (D) 2일까지의 레플루노마이드 처리가 8일째 바이러스 복제에 미치는 영향(두 그룹에 대해 n=6). 빗금선은 분석 검출 한계를 나타낸다. 미처리된 생쥐의 바이러스 타이터와 비교할 때, ***p<0.0005.
도 10은 RSV 감염 후에 레플루노마이드 처리가 저산소증에 미치는 영향을 보여준다. (A) 레플루노마이드 처리가 2일째 생쥐 SmO2에 미치는 영향(미처리된, RSV-감염된 생쥐에 대해 n=8; 레플루노마이드-처리된, RSV-감염된 생쥐에 대해 n=7). (B) RSV 감염 및 레플루노마이드 처리가 2일째 %ΔHR30에 미치는 영향(미감염된, RSV-감염된 생쥐에 대해 n=11; 레플루노마이드-처리된, RSV-감염된 생쥐에 대해 n=9). 미처리된 값과 비교할 때, *p<0.05.
도 11은 레플루노마이드 처리가 BALB/c 생쥐의 NPD에 미치는 영향을 보여준다. (A) 레플루노마이드-처리된, RSV-감염된 생쥐의 4일째 샘플 NPD 추적. (B) 레플루노마이드 처리가 RSV-감염된 생쥐의 기준 NPD에 미치는 영향. (C) 레플루노마이드 처리가 RSV-감염된 생쥐의 NPDAMIL에 미치는 영향. 모든 그룹에 대해 n=5-9. 샘플 추적 상의 빗금선은 차트 상에서 0mV를 나타내고, 화살표는 100 ㎛ 아밀로라이드 첨가 시간을 나타낸다. 미처리된 동물의 NPD와 비교할 때, *p<0.05, **p<0.005.
도 12는 RSV 감염이 감염후 2일 및 4일에 기준 폐포 체액 제거를 유의하게 저해함을 보여준다. 모의 감염(M)은 미감염된 생쥐(U)에 비해 AFC에 영향을 주지 않는다. 기준 AFC는 2일째에 43%(모의-감염된 값으로부터), 4일째에 26%까지 저해되었다. AFC의 아밀로라이드 민감성도 감염후 1일째에 감소되고, 2일 및 4일째에는 없어졌다.
도 13은 AFC 점적 주입(instillate)에 대한 디하이드로-오레이트 리덕타제 저해제(25 ㎛ A77-1726)의 첨가가 감염후 2일에 RSV-매개성 AFC 저해를 역전시킴을 보여준다. A77-1726의 영향은 AFC 점적 주입에 대해 계속적으로 50 mM 유리딘을 첨가함으로써 완전히 역전되었으며, 25 mM 제니스테인(비특이적 타이로신 키나아제 저해제)에 의해 재현되지 않았다.
도 14는 AFC 점적 주입에 대한 IMP 디하이드로게나아제(25 ㎛ 6-MP 또는 MPA)의 첨가가 감염후 2일째에 RSV-매개성 AFC 저해에 매우 미약한 영향을 미친다 는 것을 보여준다. IMP 디하이드로게나아제 저해제의 미약한 영향은 새로운(de novo) 피리미딘 합성에 필수적인 전구체인 ATP가 고갈된 결과이다. MPA 영향은 AFC 점적 주입에 대해 50 mM 하이폭산틴(HXA)을 계속적으로 첨가함으로써 완전히 역전되었으며, 퓨린 구제 과정에 의해 ATP의 합성을 가능하게 하였다.
발명의 요약
본 발명에서 제공되는 것은 피리미딘 합성 저해제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이다. 이 조성물은 대상(subject)의 폐 상피세포에 국소 투여하기에 적합하다. 또한, 본원에 제공되는 것은 치료학적 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 하나 이상의 계량된 용량으로 포함하는 장치이다. 각 계량된 용량은 대상의 폐 질환을 치료하기 위한 피리미딘 합성 저해제의 치료학적 용량 또는 이의 일부를 포함한다.
또한, 본 발명에서 제공되는 것은 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 제거를 증가시키는 방법, 대상의 폐 질환 치료 방법, 대상의 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 하나 이상의 징후 또는 신체적 증상의 감소 방법, 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험에 처한 대상을 확인하여 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 방법, 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상을 확인하여 대상의 Na+ 의존성 폐포 체액을 감소시키기에 효과적인 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 방법, 및 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 스크리닝하는 방법이다.
추가의 이점은 하기의 명세서에 일부로서 기재될 것이며, 이 일부는 본 명세서로부터 명백해지거나 하기에 기재된 태양의 실시에 의해 이해될 수 있을 것이다. 하기에 기재된 이점은 청구된 청구항에 기재된 구성 및 조합에 의해 얻을 수 있고 명확해질 것이다. 전술한 일반적 설명 및 하기의 상세한 설명 모두는 단지 일례일 뿐이며 본원을 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명의 바람직한 구현예의 상세한 설명 및 이에 포함된 실시예 뒤에 있는 참고문헌, 그리고 도면들과 이의 전 후에 있는 설명에 의해 더욱 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
본 출원을 통틀어 다양한 공개문헌이 참조된다. 이들 공개문헌의 명세서는 이에 속하는 당해 기술의 상황을 더욱더 자세히 설명하기 위해 전체로서 본 명세서에 참조된다. 또한, 개시된 참조문헌은 참조문헌이 속한 문장에서 언급된 이에 포함된 자료에 대해 개별적 및 구체적으로 본 명세서에 참조문헌으로서 포함된다.
명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 단수형은 특별히 다르게 지시하지 않는한 복수개의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "피리미딘 합성 저해제"는 하나 이상의 피리미딘 합성 저해제들 등을 포함한다. 유사하게, "폐 상피세포"는 하나 이상의 폐 상피세포들을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폐 상피세포"에 투여하기에 적합한 조성물은 하나 이상의 이러한 세포들에 처리하기에 적합하다.
전체적으로 약자가 사용될 수 있으며 다음과 같은 의미를 갖는다. 이러한 약자는 하기를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다, AFC(폐포 체액 제거, Alveolar fluid clearance), ALF(에어스페이스 내층 체액, Airspace lining fluid), BALF(기관지폐포 세척 체액, Bronchoalveolar lavage fluid), NPD(코의 전위 차이에서의 변화), DHOD(디하이드로-오로테이트 디하이드로게나제), HXA(하이폭산틴), HRSTART(호흡 기간의 시작에서의 심박률), HREND(호흡 기간의 마지막에서의 심박률), LEF(레플루노마이드), MPA(마이코페놀릭산), 6-MP(6-머캅토퓨린), NPD(코의 전위 차이), NPDAMIL(코의 전위 차이의 아밀로라이드-민감성 성분), NRte(코의 상피투과성 저항), %HR30(30분의 호흡 기간 이상동안의 % 심박률 변화), P2YR(P2Y 퓨린성 뉴클레오타이드 수용체), RSV(호흡기 세포융합 바이러스), SmO2(평균 헤모글로빈 O2 포화), 및 VRAC(부피-조절된 음이온 채널). 아울러, 다른 약자도 사용될 수 있는데, 이는 당업자에게 있어서 당연하고 및/또는 제시된 약자가 사용된 문맥으로부터 명백할 것이다.
범위는 본 발명에서 "약"은 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 다른 구현예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 "약"을 앞에 사용하여 근사값으로 표현될 때는, 특정 값 형태의 다른 구현예로 이해될 수 있을 것이다. 각 범위의 종료점은 다른 종료점과 관계가 있고, 그리고 다른 종료점과 관계없이 모두 유의한 것으로 이해될 것이다.
전체적으로 사용된 "대상"은 개체를 의미한다. 따라서, "대상"은 고양이, 개 등과 같은 길들여진 동물, 가축(예, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험 동물(예, 생쥐, 토끼, 쥐, 기니아 피그 등) 및 조류를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 대상은 예를 들어 보스 타우루스(Bos taurus), 보스 인디쿠스(Bos indicus) 또는 이의 잡종과 같은 소 종이다. 다른 양태에서, 대상은 영장류 또는 인간을 포함하는 포유류이다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 실질적으로 기재된 사건 또는 일어날 수 있거나 일어날 수 없는 상황을 의미하며, 사건 또는 상황이 일어난 상태 및 그렇지 않은 상태를 포함하는 기재를 의미한다. 예를 들어, 구문 "선택적으로 조성물은 조합을 포함할 수 있다"는 조성물이 다른 분자의 조합을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 것을 포함할 수 있으며, 이로 인해 이 기재는 조합 및 조합의 부재(즉, 조합 각각의 멤버)를 포함한다.
용어 "높은", "증가하다", "상승하다" 또는 "상승"은 대조군 값(예, 기준 레벨) 이상으로 증가하는 것을 의미한다. 용어 "낮은", "더낮은", "감소하다" 또는 "감소"는 대조군 값(예, 기준 레벨) 이하로 감소하는 것을 의미한다. 예를 들어, 기준 레벨은 레플루노마이드, A77-1726 또는 다른 피리미딘 합성 저해제의 첨가 이전 또는 부재하에서 생체 내에서 정상이다. 또한, 대조군 레벨은 질병 상태의 부재하에서 대상 또는 샘플로부터의 값을 포함할 수 있다. 대조군 값은 질병 또는 치료 이전 또는 이후의 동일한 대상(들) 또는 샘플(들)로부터 결정될 수 있다. 대조군 값은 질병 또는 치료의 부재하에서 다른 대상(들) 또는 샘플(들)로부터 결정될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 것은 피리미딘 합성 저해제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이다. 이러한 조성물은 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 제거를 증가시키는 방법; 대상의 폐 질환 치료 방법; 대상의 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 하나 이상의 징후 또는 신체적 증상의 감소 방법; 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험에 처한 대상을 확인하여 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 방법; 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상을 확인하여 대상의 Na+ 의존성 폐포 체액을 감소시키기에 효과적인 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 방법; 및 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 스크리닝하는 방법에 사용될 수 있으며, 이는 하기에 좀 보다 상세하게 기술된다.
본 발명에서 사용된 "치료"는 대상에게 주어진 호흡기 감염의 징후 또는 신체적 증상의 감소를 포함한다. 따라서, 기재된 조성물 및 방법은 호흡기 감염된 대상의 하나 이상의 징후 또는 신체적 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다. 이러한 징후 및 신체적 증상은 반드시 이에 한정되는 것은 아니나, 비루, 저산소증, 폐 수종, 감소된 심장 기능, 기침, 체중 감소, 쌕쌕거림, 악액질 및 폐 충혈을 포함한다.
기재된 조성물 및 방법으로 치료하기 위한 일례의 질병은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염이다. RSV는 BALB/c 생쥐에서 Na+-의존성 폐포 체액 제거(AFC)를 저해하며, P2Y 뉴클레오타이드 수용체 길항제 및 피리미디노라이틱 효소 모두는 AFC의 저해를 억제한다. RSV 감염은 ALF로의 UPT 및 ATP 모두의 분비를 유발하며, AFC 감소는 숙주의 유의한 신체적 장애를 유발하는 RSV 감염의 초기 단계와 관련이 있다.
심한 RSV 감염에 대해 호흡한 신생아의 폐에서, 표면 단백질 SP-A 및 SP-D의 레벨이 감소되며, 주요한(main) 표면 인지질, 디팔미틸포스파티딜콜린의 양이 감소되며, 회복된 계면활성제의 생물리적 표면 활성은 대조군 신생아에 비해 손상된다(Kerr and Patton, 1999). 비록, 베타 아드레너직 수용체 작용제(βARA) 기관지확장제가 세포내 cAMP를 상승시킴으로써 성인 호흡기 피로 증후군에서 폐포 체액 제거를 향상시키는 데에 사용되더라도, 호흡기 상피세포의 베타 아드레너직 수용체-매개 신호는 RSV 감염 후에 비정상이며, RSV 치료법에서 βARA의 미약한 효과를 나타낼 것이다. 따라서, RSV 감염의 경우, 본 발명에 개시된 방법 및 조성물은 신생아에서 디팔미틸포스파티딜콜린과 같은 표면 인지질의 레벨을 증가시키는데 사용되거나 베타 아드레너직 수용체 작용체(βARA) 기관지확장제의 효과를 향상시키는데 사용된다.
아울러, 역학 연구에서는 신생아의 심각한 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)-유도성 기관지염과 알러지성 질병 사이의 강한 연관성을 제시하였다. 본 발명에 개시된 조성물과 방법은 RSV 감염 동안 실질적으로 천식을 발전시키는 RSV-유도성 호흡기 과민감도 및 소인을 감소시키는데 유용하게 제공된다. 또한, RSV 감염은 소(즉, 보스 타우루스 및 보스 인디쿠스, 또는 이의 교배종)에서 매우 중요하며 심각한 호흡기 기관 질병을 유발할 수 있다.
폐포 체액 제거는 폐 상피세포의 이온 전달과 관련이 있다. 예를 들어, 폐포 상피 벽은 두가지 형태의 세포로 구성되어 있다: 타입 I 세포 및 타입 II 세포. 타입 I 세포는 폐포 상피세포의 대부분(약 95%)을 차지한다. 타입 II 세포는 계면활성제를 생산한다. 최근에는 타입 I 및 타입 II 세포 모두가 능동적인 방법으로 나트륨 이온을 전달하는 것으로 여겨진다. 상피세포의 기저외측 표면에 위치한 나트륨-칼륨 펌프는 폐포 공간으로부터 세포질로 들어가는 나트륨 이온을 선호하는 맨끝 멤브레인(membrane)을 통해 전기화학적 농도구배를 구성한다. 나트륨은 채널이라고 불리는, 단백질이 주로 통과하는 폐포 상피세포를 관통한다. 일단 세포질에 있게 되면, 이들은 ATP를 이용하는 나트륨-칼륨 펌프에 의해 기저외측 멤브레인을 통해 배출된다. 전기적 중립을 유지하기 위해, 염소 이온은 세포간 또는 세포 채널을 통해 위치한 경로를 통해 나트륨 이온의 이동을 따른다. 이온의 이동은 체액의 재흡수를 선호하는 사이질(interstitium) 및 폐포 공간 사이의 삼투압 차이를 유발한다.
능동적인 나트륨 전달은 수많은 병리적 조건(바이러스 감염, 폐렴, 급성 폐 손상 등)에 있는 폐포 공간의 체액의 양을 제한하는데 중요한 역할을 한다. 기준 조건 하에서, 호흡기 상피세포의 우세한 이온 전달 과정은 능동적이며, 관강(lumenal) 체액로부터 사이질 공간으로의 아밀로라이드-민감성 Na+ 이온의 전달은 상피세포를 덮는다. 폐포 내층 체액(ALF)에 있는 Na+ 이온은 양이온 및 최외각 멤브레인에 있는 Na+-선택적, 아밀로라이드-민감성 상피세포 Na+ 채널(ENaC)을 통해 우선적으로 기관지폐포 상피세포로 수동적으로 확산된다. Cl- 이온은 세포주위 경로를 통해 Na+ 이동을 따르거나, 낭포 섬유증 막통과 조절제(cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR)를 통해 수동적으로 전기적 중립을 유지한다. NaCl의 전달은 상피통과 삼투압 농도구배를 유발한다. 호흡기 상피의 상피통과 물 투과성이 높기 때문에, 농도구배는 공기층으로부터 사이질로 물이 수동적으로 이동하게 함으로써 공기층의 체액을 통과한다.
RSV-매개성 AFC 저해는 저산소증, 심장 기능 부전 및 기관지 폐포 세척 유동액의 증가된 UTP 및 ATP 함량과 관련이 있다. 아울러, 폐의 RSV 복제에 대해 직접적인 항바이러스 영향이 없는데도 불구하고, 레플루노마이드를 이용한 새로운 피리미딘 합성의 전체적인 저해는 AFC 및 폐의 물 성분 뿐만 아니라 RSV-감염된 생쥐의 신체적 부전(감소된 체중, 감소된 SmO2 및 심장 기능, 및 변화된 코의 전위 차이를 포함)을 향상시킨다. RSV-매개성 AFC의 저해는, RSV-매개성 AFC의 저해가 유발되는데 필요한 VRACs를 통해 새로운 UTP 합성 및 분비를 보여주는 부피 조절된 음이온 채널(VRACs)의 약동학적 차단에 의해 억제될 수 있으며, 새로운 피리미딘 합성 및 분비 과정이 RSV 감염 또는 다른 호흡기 감염의 징후를 경감하기 위해 디자인된 저해제 치료법에 대한 공격적인 표적임을 증명한다.
도 1은 피리미딘 및 퓨린 생합성 과정을 나타내는 개략도이다. UTP는 글루타민, ATP 및 HCO3 -로부터 새롭게 합성된다. 또한, UTP는 세척 과정을 통해 유리딘으로부터 합성될 수 있다. 레플루노마이드 및 이의 활성 대사물인 A77-1726 모두는 디하이드로-오로테이트를 오로테이트로 전환하는 디하이드로-오로테이트 디하이드로게나아제의 활성을 저해한다. 상기 제제 모두는 새로운 피리미딘 합성을 차단하지만, 피리미딘 세척 과정 또는 퓨린 합성에는 영향을 주지 않는다.
선택적으로, 상기 조성물이 포함하는 피리미딘 합성 저해제는 레플루노마이드이다. 선택적으로, 상기 조성물이 포함하는 피리미딘 합성 저해제는 A77-1726이다. 선택적으로, 상기 조성물은 레플루노마이드 및 A77-1726의 조합 및/또는 레플루노마이드 또는 A77-1726과 다른 피리미딘 합성 저해제의 조합을 포함한다. 레플루노마이드, 이의 활성 대사물이 A77-1726인 전구약물은 류마티스 관절염 치료에 사용되며, 상품명 ARAVA®(Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)로 판매된다. 레플루노마이드 및 A77-1726 모두는, 삼작용기성 효소 컴플렉스 CAD(카바밀 포스페이트 신테타제, 아스파테이트 트랜스카바밀라아제 및 디하이드로-오로테아제)의 성분, 새로운 피리미딘 합성 과정의 중심 성분인 디하이드로-오로테이트 리덕타제 효소(디하이드로-오레이트 디하이드로게네이트 또는 디하이드로-오로테아제로도 알려져 있음)의 저해제로서 작용한다. 따라서, 레플루노마이드 및 A77-1726와 마찬가지로, 상기 조성물은 디하이드로-오레이트 리덕타제의 저해제가 될 수 있다.
상기 조성물은 생체내에서 약제학적으로 허용되는 담체로 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한" 이란 생물학적으로 또는 다르게 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미한다. 따라서, 상기 물질은 바람직하지 않은 생물학적 영향 또는 이것이 포함된 약제학적 조성물의 다른 모든 성분과 유해한 방식으로 작용하지 않으면서 대상에게 투여될 수 있다. 상기 담체는 활성 성분의 어떠한 분해든지 최소화하도록, 그리고 대상에 미치는 모든 부작용을 최소화하기 위해 자연적으로 선택될 수 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 물질은 용액, 현탁액(예를 들어, 마이크로입자, 리포좀 또는 세포에 삽입됨)에 있을 수 있다. 이들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 통해 특정 타입의 세포를 표적으로 할 수 있다.
적합한 담체 및 이의 제형은 Remington : The Science and Practice of Pharmacy (19th ed) ed. A.R. Gennaro, Mack Pulishing Company, Easton, PA 1995에 개시되어 있다. 전형적으로, 적당량의 약제학적으로-허용가능한 염이 제형의 삼투압을 유지하기 위해 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8.5이고, 더욱 바람직하게는 약 7.8 내지 약 8.2이다. 추가로, 담체는 항체를 포함하는 고형의 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스(matrix)와 같은 서방형 제형을 포함하며, 이 매트릭스는 예를 들어 필름, 리포좀 또는 마이크로입자와 같은 성형된 제품의 형태를 가진다. 당업자에게 있어서, 특정 담체가 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 의존하는 것이 더욱 바람직하다는 것은 당연하다. 예를 들어, 당업자라면 흡입 및/또는 비강내 투여, 또는 폐 상피세포에 국소 투여하기 위해 적합한 조성물에 적합한 특정 담체를 선택할 것이다.
상기 조성물은, 조성물 및 담체에 추가로 점증제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 안정화제 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 항미생물제제, 항-염증제, 마취제 등과 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수도 있다.
본 발명에 개시된 조성물은 폐 상피세포 또는 대상의 다양한 폐 상피세포에 국소 투여하기에 적합하다. 따라서, 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물은 선택적으로는 흡입을 통해 투여하기에 적합하다(즉, 조성물은 흡입제이다). 아울러, 상기 조성물은 선택적으로는 연무제이다. 또한, 상기 조성물은 선택적으로는 분무제이다. 흡입을 통한 조성물은 스프레이 또는 점적 메카니즘을 가진 전달체를 통해 코 또는 입을 통해 투여될 수 있다. 또한, 삽관을 통해 호흡기 시스템(예, 폐)의 모든 부위에 직접 전달될 수 있다. 선택적으로, 조성물이 투여되는 폐 상피세포는 대상의 비강 공간, 비강 통로, 코인두, 인두, 기관, 기관지, 세기관지 또는 폐포에 위치한다. 선택적으로, 조성물이 투여되는 폐 상피세포는 기관지폐포 상피세포이다. 더불어, 만약 상기 조성물이 다양한 폐 상피세포에 투여된다면, 세포는 상기 해부학적 위치의 일부 또는 모두, 또는 이러한 위치의 조합에 선택적으로 위치할 수 있다.
따라서, 폐 상피세포로의 국소 투여는 분무, 연무 또는 직접 폐 점적주입을 통해 폐에 전달될 수 있다. 그러므로, 대상의 폐 상피세포에 국소 투여하기에 적합한 조성물은 흡입 조성물, 예를 들어 분무 제형 또는 연무 제형에 적합한 조성물을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 흡입제, 예를 들어 계량된 흡입기 또는 건조분말 흡입기, 취분기, 분무기 또는 흡입 약물을 투여하는데 통상적으로 알려진 다른 방법을 이용하여 개체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 흡입가능 용액일 수 있다. 흡입가능 용액은 분무를 통해 투여하기에 적합할 수 있다. 상기 조성물은 액상 현택액으로 제공될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 제형은 액상 현탁액으로써 치료학적으로 유효한 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함한다.
선택적으로, 상기 조성물은 적어도 하나의 적합한 분사제 또는 계면활성제 또는 계면활성제 혼합물과 함께, 피리미딘 합성 저해제, 또는 이의 염 또는 에스테르를 각각 포함하는 가압된 에어로졸을 이용해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공되는 것은 본 발명에서 제공된 조성물 및 분무제의 조합을 포함한다. 또한, 본 발명에서 제공되는 것은 본 발명에 개시된 제제 및 조성물을 포함하는 용기이다. 이 용기는 예를 들어, 코 스프레이, 분무기, 흡입기, 병 또는 점액 표면에 투여하기위한 형태로 조성물을 포함하는 모든 다른 수단이 될 수 있다. 선택적으로, 용기는 계량된 용량의 조성물을 전달할 수 있다.
모든 분무기는 본 발명에 개시된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용하기 위한 분무기는 본 발명에 제공된 조성물을 포함하고 분사제를 포함하지 않는 액상 제형을 분무한다. 분무기는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 가압 공기, 초음파, 또는 진동을 포함하는 당업계에 공지된 모든 방법에 분무된 미스트를 생산할 수 있다. 분무기는 내부 배플(baffle)을 추가로 포함할 수 있다. 내부 배플은 분무기의 하우징과 함께 충격에 의해 미스트로부터 생성되는 큰 방울을 선택적으로 제거하며, 이 방울을 저장소로 되돌려 보내게 한다. 따라서, 미세한 에어로졸 방울이 흡입 공기/산소에 의해 폐로 들어갈 수 있다.
따라서, 분사제를 포함하지 않는 액상 제형을 분무하는 분무기는 본 발명에서 제공되는 조성물과 함께 사용하기에 적합하다. 이러한 분무기의 예는 당업계에 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다. 또한, 본 발명에서 사용하기에 적합한 분무기는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 제트 분무기, 초음파 분무기 등을 포함한다. 예를 들어 제트 분무기는 당업계에 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다.
상기 조성물은 멸균 여과되어서, 분무기에 사용되고 적합하게 분무되는 멸균된 단위 용량의 제형을 제공하는 단위 용량 용기를 포함하는 용기에 채워질 수 있다. 각 단위 용량 용기는 멸균될 수 있으며 다른 용기 또는 다음 용량을 오염시키지 않으면서 적합하게 분무될 수 있다.
선택적으로, 개시된 조성물은 비강내 투여하기에 적합한 제형이다. 이러한 조성물은 한쪽 또는 양쪽 코를 통해 코 및 콧구멍으로 전달되기에 적합하며, 분무 메커니즘 또는 점적 메커니즘, 또는 연무를 통한 전달을 포함할 수 있다.
상기 조성물이 본 발명의 방법에 사용된다면, 국소 폐 투여는 사용되지 않으며, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 경구, 비경구(예, 정맥내), 점막내 주사, 복강내 주사 및 경피에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 추가로 제공되는 것은 치료학적 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 적어도 하나 이상의 계량된 용량의 조성물을 포함하는 장치이며, 여기서 각 계량된 용량은 대상의 폐 질환을 치료하기 위한 피리미딘 합성 저해제의 치료학적 용량 또는 그 일부를 포함한다. 피리미딘 합성 저해제는 상술한 바와 같은 피리미딘 합성 저해제 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공되는 것은 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 제거를 증가시키는 방법이다. 상기 접촉 단계는 세포에 의한 Na+ 의존성 체액 제거의 증가를 유발한다. 선택적으로, 폐 상피세포가 생체내 접촉된다. 선택적으로, 폐 상피세포가 시험관내 접촉된다.
추가로 제공되는 것은 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 대상의 다양한 폐 상피세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상의 폐 질환을 치료하는 방법이다. 유효량의 피리미딘 합성 저해제는 대상의 Na+ 의존성 체액 제거의 증가를 유발한다. 상기 방법은 진행성 호흡기 세포융합 바이러스 감염되었거나 위험이 있는 대상에게 사용될 수 있다. 질병을 유발하는 다른 폐 병원체에 대해 본 발명의 방법이 사용될 수 있으며, 이러한 병원체는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 파라믹소바이러스(호흡기 세포융합 바이러스[인간 및 소], 메타뉴바이러스, 파라인플루엔자, 홍역), 오쏘믹소바이러스(인플루엔자 A, B 및 C 바이러스), 폭스바이러스(스몰폭스, 몽키폭스), 뉴 월드 한타바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스(심각한 급성 호흡기 증후군 제제), 허피스바이러스(헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스), 스트렙토코커스 뉴모니아, 헤모필러스 인플루엔자, 슈도모나스 에루지노사, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코플라즈마 뉴모니아, 바실러스 안트라시스, 레지오넬라 뉴모필라, 클렙시엘라 뉴모니아, 클라미디아, 리스테리아 모노사이토젠, 파스튜렐라 뮬토시다 및 버콜데리아 세파시아를 포함한다.
추가로 제공되는 것은 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험에 있는 대상의 호흡기 바이러스 감염의 하나 이상의 징후 또는 신체적 증상을 감소시키는 방법이다. 상기 기술된 바와 같이, 이러한 징후 또는 신체적 증상은, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 비루, 저산소증, 폐 부종, 감소된 심장 기능, 기침, 체중감소, 쌕쌕거림, 악액질 및 폐 충혈을 포함한다. 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험에 처한 대상은 당업자에 의해 손쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 이러한 확인은 대상의 약력, 나타나는 증상/신체적 징후, 물리적 실험, 진단적 테스트 또는 이들의 조합을 기초로 하여 의사 또는 수의사에 의해 수행될 수 있다.
또한, 제공되는 것은 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험에 있는 대상을 확인하는 단계 및 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 아울러, 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상을 확인하는 단계 및 대상의 Na+ 의존성 폐포 체액를 감소시키기에 효과적인 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명에 개시된 방법에서, 피리미딘 합성 저해제는 선택적으로 레플루노마이드, A77-1726, 또는 이의 조합이다. 아울러, 레플루노마이드 및/또는 A77-1726은 하나 이상의 다른 피리미딘 합성 저해제와 함께 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
"유효량" 및 "유효 용량" 또는 "치료학적 용량"라는 용어는 혼용하여 사용될 수 있다. "유효량"이란 용어는 바람직한 신체적 반응을 유발하는데 필요한 모든 용량으로 정의된다. 개시된 방법에 사용된 조성물의 유효량 및 투여 스케줄은 실험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 하는 것은 당업계 기술의 범위 내이다. 개시된 방법에 사용된 조성물을 투여하기 위한 유효 용량 범위는 질환의 증상이 영향을 받은 바람직한 영향을 유발하기에 충분히 크다. 이 용량은 바람직하지 않은 교차-반응, 과민 반응 등과 같은 부작용을 유발할 정도로 크지 않아야 한다.
일반적으로, 치료학적 양 또는 용량은 대상의 나이, 상태, 성별 및 질병의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되었는지 여부에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 용량은 모든 카운터인디케이션(counterindication)과 함께 의사 또는 수의사에 의해 적정될 수 있다. 용량은 달라질 수 있으며, 1일 또는 수일 동안 매일 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 요구되는 개시된 방법에 사용된 조성물의 유효량은 사용되는 방법 및 처리되는 호흡기 질환, 특정 피리미딘 합성 저해제 또는 사용된 담체, 투여 방법, 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 각 조성물에 대한 정확한 용량을 특정할 필요는 없다. 그러나, 적합한 용량은 본 발명에 제시된 통상적인 실험만을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 생체내 사용되는 디하이드로-오로테이트 리덕테이트 또는 피리미딘 합성 저해제는 약 10-50 ㎎/㎏ 용량, 약 25-45 ㎎/㎏ 용량, 또는 약 30-40 ㎎/㎏ 용량으로 투여될 수 있다.
A77-1726, 레플루노마이드, 및/또는 다른 피리미딘 저해제의 치료학적 용량, 유효량 또는 유효 용량은 적당한 간격으로 효과를 유지하면서 에어로졸로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 개시된 조성물의 유효 용량은 S.I.D., B.I.D., Q.I.D., 또는 1일, 수일, 1주 또는 그 이상 동안 1시간 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물은 매 1, 2, 4, 8, 12, 또는 24시간에, 또는 이의 조합에, 또는 이러한 간격으로, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1주일 또는 이 이상의 기간 또는 이의 조합 동안 한번씩 투여될 수 있다. 간격이 의미하는 것은 제공되는 값 내의 시간의 모든 증가이다. 따라서, 예를 들어 상기 조성물은 3시간 내지 12시간 마다 투여될 수 있다. 선택적으로, 상기 조성물은 1회 투여된다. 이러한 시간 코스는 예를 들어 유효 용량을 결정하기 위해 상기 기술된 파라미터를 이용해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 개시된 방법에 따라 특정 용량으로 조성물을 투여하는 효과는 대상의 약력, 징후, 증상, 및 RSV 감염과 같은 폐 감염되거나 감염과 같은 접촉의 위험에 처한 대상의 상태를 관찰하기에 유용한 것으로 알려진 객관적 실험실 테스트에 의해 확인될 수 있다. 이러한 징후, 증상 및 객관적 실험실 테스트는 이러한 대상을 치료하는 모든 의사 또는 이 분야의 실험을 수행하는 연구자에게 잘 알려진 바와 같이, 치료되거나 억제되어야 하는 각 질병 또는 상태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 만약 적합한 대조군 그룹 및/또는 일반적인 모집단 또는 특정 개체의 질병의 정상적인 과정과 비교하여 1) 대상의 신체적 상태는 향상되는 것으로 보이고(예, 폐 출혈이 감소 또는 제거됨), 2) 질환, 감염의 과정이 안정되고, 늦춰지거나 역전되는 것으로 보이거나, 3) 질환 또는 상태를 치료하기 위한 다른 요법의 필요가 줄어들거나 제거되면, 특정 치료 요법이 효과가 있는 것으로 여겨질 것이다. 이러한 영향은 모집단에 있는 단일 대상에서 결정될 수 있다(예, 역학적 연구를 이용해).
본 발명에서는 또한 스크리닝 방법도 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공되는 것은 과량의 UTP의 존재하에서 테스트 화합물을 폐 상피세포에 접촉시키는 단계, 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수 및 대조군에 비교해 증가된 Na+ 의존성 체액 흡수를 검출하는 단계 및 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 표시하는 단계를 포함하는, 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물의 스크리닝 방법이다. 선택적으로, 상기 세포는 생체내 접촉된다. 선택적으로 상기 세포는 시험관내 접촉된다. 상기 방법은 선택적으로 UTP를 제거하는 단계 및 Na+ 의존성 체액 흡수 증가의 역전을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 스크리닝 방법의 예는, 피리미딘 합성 유전자를 인코딩하는 이종유래 핵산을 발현하는 세포에 테스트 화합물을 접촉시키는 단계, 세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수 및 대조군 레벨에 비교해 증가된 Na+ 의존성 체액 흡수를 검출하는 단계 및 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 표시하는 단계를 포함하는, 세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물의 스크리닝 방법이다. 선택적으로, 상기 세포는 생체내 접촉된다. 선택적으로 상기 세포는 시험관내 접촉된다.
다른 스크리닝 방법은 테스트 화합물을 감염된 세포 또는 세포주에 접촉시키는 단계, 감염된 세포 또는 감염된 세포주의 세포를 통과하는 이온 전달을 측정하는 단계를 포함하는, 호흡기 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물의 스크리닝 방법이다. 대조군에 비해 감염된 H441 세포 또는 세포주를 통과하는 이온 전달의 증가는 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 표시한다. 이온 전달은 대조군 세포 또는 세포주, 선택적으로는 비-RSV 감염된 H441 세포주 또는 테스트 화합물이 존재하지 않는 감염된 H441 세포 또는 세포주를 통과하는 이온 전달과 비교될 수 있다. 선택적으로, 테스트 화합물은 피리미딘 합성 저해제를 포함한다. 선택적으로, 상기 세포는 생체내 접촉된다. 선택적으로 상기 세포는 시험관내 접촉된다.
하기 실시예는 당업계의 통상적인 기술을 제공하기 위해 본 발명에서 청구된 방법의 완전한 기재 및 기술과 함께 기재되며, 이는 본 발명의 일례로서 간주되는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하지는 않는 것으로 간주되며, 첨부되는 청구항에 포함된 것을 제외하거나 확장하지 않는다. 숫자(예, 양, 온도, 등)와 관련한 정확성을 위한 노력이 시도되었으나, 일부 에러 및 편차가 고려되어야 한다.
실험방법:
바이러스 접종물의 준비 및 생쥐 감염.
바이러스 농축물의 제조 및 8주령 내지 12주령의 무병원체 BALB/c 생쥐 6마리를 RSV 균주 A2(100 ㎕에 106 PFU)로 비강내 감염시키는 방법은 데이비스 등(Davis et al.,)의 문헌에 따라 수행하였다: "Nucleotide-mediated inhibition of alveolar fluid clearance in BALB/c mice after respiratory syncytial virus infection," Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 286:L112-L120. (2004). 각 실험 그룹에 대한 데이터는 2회의 독립적인 감염의 최소값으로부터 도출하였다.
말초 혈액 산소 포화의 측정.
말초 혈액 산소 포화는 의식이 있는 생쥐에서 TUFFSATTM 펄스 옥시미터(Datex-Ohmeda, Inc., Madison, WI)에 장착되어 있는 PREEMIE OXYTIP® 센서(Datex-Ohmeda, Inc., Madison, WI)를 이용해 측정하였다. 생쥐의 매우 빠른 박 펄스 레이트로 인해, 산소측정법 값은 동맥혈 및 정맥혈로부터의 평균 헤모글로빈 O2 포화(SmO2)이다.
심박률의 측정은 호흡에 따라 변화한다. ECG 추적은 AFC 분석의 시작(HRSTART) 및 마지막(HREND)에 심박률(QRS 컴플렉스/cm의 수)을 측정하는데 사용되었다. 30분 이상의 호흡 기간 동안의 심박률의 % 변화(%ΔHR30)는 (HRSTART-HREND)/HRSTART로 계산하였다.
코의 전위 차이의 측정.
마취된 생쥐(표준으로서 꼬리에)의 코를 통한 전위 차이는 전술한 그러브 등의 문헌(Grubb et al., (1994) "Hyperabsorption of Na+ and raised Ca(2+)-mediated Cl- secretion in nasal epithelia of CF mice", Am. J. Physiol 266:C1478-C483)에 따라 측정하였다. 기준 NPD는 젖산화(lactated) 링거액으로 코의 상피에 관류시키는 동안 측정하였다. NPD의 아밀로라이드-민감성 성분(NPDAMIL)은 100 ㎛ 아밀로라이드를 포함하는 젖산화 링거액으로 관류시킴으로써 결정하였다. ±60 nA의 전류 펄스를 200 MΩ 리지스터가 있는 시리즈의 12 V 배터리를 사용해 상피를 통해 적용하였다. 전류 펄스에 따른 NPD 반응의 변화(코의 상피통과 저항에 대한 부분, NRte)를 기록하였다(ΔNPD).
기관지폐포 세척.
기관지폐포 세척 체액(BALF)을 데이비스 등의 문헌(Davis et al., (2004))에 전술된 대로 사이토카인 ELISA를 위해 멸균진 1 ㎖의 생리식염수를 이용하거나 뉴 클레오타이드 분석을 위해 멸균된 0.3 ㎖의 생리식염수를 이용해 수득하였다. 세척물은 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액을 -80℃에 보관하였다.
BALF 에 있는 뉴클레오타이드의 측정.
BALF에 있는 내인성 뉴클레오티아아제를 가열해 변성시키고(100℃, 3분), UDP-글루코스 파이로포스포릴라아제 및 루시페린-루시퍼라아제 분석을 각각 이용해 UTP/ATP 성분을 측정하였다.
BALF 에 있는 헴( heme )의 측정.
BALF 헴 성분은 Drabkins 분석을 이용해 분광학적으로 측정하였다.
새로운 피리미딘 및 퓨린 합성의 전체적 저해.
레플루노마이드(5-methylisoxazole-4-[4-trifluoromethyl]carboxanilide, 1% 메틸셀룰로즈를 포함하는 증류수에 35 ㎎/㎏ 녹아있음)를 감염시키기 전에 매일 1회씩 8일 동안 생쥐당 300 ㎕ 부피로 경구투여한 뒤, 감염 기간을 거쳤다. 매체(vehicle) 대조군은 증류수에 녹은 1% 메틸셀룰로즈를 동일 부피로 투여하였다. 유리딘(0.9% NaCl에 1 g/㎏ 녹아있음)은 100 ㎕ 부피로 12시간마다 복강내(i.p.) 주사로 투여하였다(8). 6-MP(1N HaOH에 35 ㎎/㎏ 녹아있음, 2 M Na2HPO4로 pH를 7.9로 적정함)는 감염시키기 전 5일 동안 매 24시간마다 100 ㎕ 부피로 복강내 주입으로 투여한 뒤, 감염 기간을 거쳤다.
BALF 에 있는 전염증성 사이토카인의 측정.
사이토카인 레벨은 제조사의 방침에 따라 Quantikine M ELISA kit(R&D Systems)를 사용해 측정하였다.
통계 분석.
기술적 통계는 Instat 소프트웨어(GraphPad, San Die해, CA)를이용해 계산하였다. 그룹 평균간의 차이는 적합한 포스트 테스트를 이용해 ANOVA 또는 Student's 테스트로 분석하였다. 모든 데이터 값은 평균±SE로 나타내었다.
결과:
RSV 감염이 말초 혈액 포화에 미치는 영향.
2일째에 기준 AFC의 장애는 적게 관련되어 있지만 모의-감염된 동물과 비교한 말초 혈액 SmO2에서는 상당히 감소되어 있다 (도 2a). 다른 시간 포인트에서는 SmO2의 감소가 전혀 발견되지 않았다.
저산소증의 추가 지표로서, AFC 측정 과정(%ΔHR30) 동안 심박률 변화의 증거로서 2일째에 모의-감염된 생쥐 및 RSV-감염된 생쥐로부터 3-리드 EGC 기록이 측정되었다. RSV 감염은 2일째에 %ΔHR30에서의 매우 유의한 증가와 관련이 있었다(도 2b 및 2c). 두 그룹간의 마취 기간에는 차이가 없었다.
RSV 감염이 코의 전위 차이에 미치는 영향.
2일 동안의 RSV 감염은 모의-감염된 동물과 비교해 BALB/c 생쥐의 기준 NPD(코의 전위 차이) 또는 NPDAMIL(코의 전위 차이의 아밀로리 6-민감성 성분)에 어떠한 영향도 주지 않았다. 그러나, 기준 NPD 및 NPDAMIL은 4일 및 8일째에 유의 하게 감소하였다(도 3a-3c).
RSV 감염 후의 NRte(코의 상피통과 저항)의 추정치로써, ±60 nA 펄스를 코의 상피에 적용함으로써 유발되는 NPD의 변화(ΔNPD)가 측정되었다. ΔNPD는 모의-감염된 대조군에 비해 4일 및 8일째에 유의하게 커졌다(도 3d-3e).
RSV 감염 및 뉴클레오타이드 합성 저해가 BALF 뉴클레오타이드에 미치는 영향.
미감염된 생쥐로부터의 BALF는 균등 레벨의 ATP 및 UTP를 포함하였으며, 이는 모의 감염에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, RSV 감염은 BALF 헴 성분의 동시 증가 없이, 2일째에 UTP 및 ATP 레벨이 두배가 되게 하였다(2일째 7.3±1.4㎛ vs 미감염된 생쥐는 7.3±0.7㎛). BALF 뉴클레오타이드는 6일째에 대조군 레벨로 돌아갔다(표 1).
레플루노마이드-처리된 생쥐 및 RSV-감염된 생쥐에서는 BALF 뉴클레오타이드 레벨의 증가가 검출되지 않았다. 사실, 상기 두 뉴클레오타이드의 레플루노마이드 처리된 감소된 BALF 성분은 그 레벨이 미처리된 생쥐 및 미감염된 생쥐보다 낮았다(표 1). 동시 유리딘 처리는 BALF UTP 및 ATP 레벨에 미치는 레플루노마이드의 영향을 역전시키지 않을 뿐만 아니라 미처리된 RSV-감염된 생쥐보다 BALF 뉴클레오타이드 성분을 유의하게 증가시켰다.
RSV 감염 및 뉴클레오타이드 합성 저해가 BALF 뉴클레오타이드 레벨에 미치는 영향
nA ATPB UTPB
미감염 11 16±2 16±4
모의(mock) 6 13±4 10±4
d2 14 38±7*** 32±4**
d6 9 17±2 11±4
d2 LEFC 9 6±1** 5±2***
d2 LEF + UD 7 69±29 95±29**
A: 뉴클레오타이드 레벨이 측정된 그룹당 생쥐의 수
B: 평균 뉴클레오타이드 농도 BALF±SE(nmol/l)
C: 레플루노마이드-처리된 생쥐
D: 레플루노마이드-처리 및 유리딘-처리된 생쥐
미감염된 생쥐에 비교하여 **p<0.005, ***p<0.0005
뉴클레오타이드 합성 저해가 생쥐 체중에 미치는 영향.
전처리 기간동안, 레플루노마이드는 메틸셀룰로즈-처리된 생쥐 또는 미처리된 생쥐와 비교해, 체중에 있어서 유의한 감소를 유발하지 않았다. 더욱 중요하게는, 감염 기간 동안, 레플루노마이드 치료법은 1일 및 2일째에 BALB/c 생쥐에서 정상적으로 보여지는 체중 감소 정도를 유의하게 감소시켰다(도 4). 레플루노마이드 처리 기간 동안의 동시 유리딘 처리는 이 영향을 억제하지 못했다.
이러한 발견과는 반대로, 6-MP 처리는 전감염 기간 동안 유의한 체중 감소를 유발하였으며, 마취에 대한 내성이 부족하였으며(산발성 사망을 유발), 미처리된, RSV-감염된 생쥐 및 레플루노마이드-처리된, RSV-감염된 생쥐와 비교해, 1일 및 2일째에 체중 감소를 유의하게 증가시켰다(도 4b).
뉴클레오타이드 합성 저해가 RSV -매개성 AFC 저해에 미치는 영향.
RSV-감염된 생쥐의 레플루노마이드 전처리는 2일째에 RSV-유도성 AFC 저해를 차단하였다(표 2). 이 영향은 메틸셀룰로스 단독으로 급식하는 것에 의해 모방되지 않았고, 유리딘 동시처리에 의해 역전되었다. 유리딘 단독 처리는 AFC에 영향을 주지 않았다. 또한, 레플루노마이드 처리는 AFC에 대한 정상적인 아밀로라이드 민감성의 회복을 유발하였다: 2일째의 레플루노마이드-처리된 생쥐의 AFC의 57%는 미감염된 생쥐와 비교해 61%, 미처리된 생쥐에 비교해 8%의 아밀로라이드-민감성을 나타내었다.
레플루노마이드 치료법의 이로운 영향과는 반대로, 새로운 퓨린 합성 저해제인 6-머캅토퓨린(6-MP)로 전체적으로 전처리하는 유사한 요법은 2일째의 AFC에 영향을 주지 않았다(표 2). 최종적으로, 레플루노마이드를 미감염된 생쥐에 처리하는 것은 AFC에 유의한 저해를 유발하였다.
2일째에, 뉴클레오타이드 합성 저해가 RSV-매개 AFC 저해에 미치는 영향
nA AFCB
미감염 7 34.89±2.49***
미감염된 AMILC 7 14.65±1.59
Figure 112006084760982-PCT00001
Figure 112006084760982-PCT00002
Figure 112006084760982-PCT00003
미감염된 LEFD 17 29.98±1.5**
d2 25 22.01±1.04
d2 AML 7 22.82±1.92
d2 MCE 11 22.89±1.27
d2 LEF 14 34.52±2.1***
d2 LEF + AMIL 11 14.92±2.3
Figure 112006084760982-PCT00004
Figure 112006084760982-PCT00005
Figure 112006084760982-PCT00006
d2 UF 19 22.89±2.22
d2 LEF + UG 10 21.9±2.69
d2 6-MPH 11 16.52±2.51
A: AFC가 측정된 생쥐의 수
B: 평균 % AFC±SE
C: 1.5 mM 아밀로라이드가 점적주입으로 추가된 AFC
D: 레플루노마이드-처리된 생쥐
E: 메틸셀룰로즈-처리된 생쥐
F: 유리딘-처리된 생쥐
G: 레플루노마이드-처리 및 유리딘-처리된 생쥐
H: 6-머캅토퓨린-처리된 생쥐
2일째에 AFC에 비교하여 **p<0.005, ***p<0.0005
2일째에 ALM에 있는 AFC에 비교하여
Figure 112006084760982-PCT00007
Figure 112006084760982-PCT00008
Figure 112006084760982-PCT00009
p<0.0005,
새로운 피리미딘 합성을 전체적으로 차단하기 위하여, 생쥐를 감염시키기 전에 디하이드로-오로테이트 리덕타제(DHOR) 저해제인 레플루노마이드(1% 메틸셀룰로즈에 5 ㎎/㎏ 현탁되어있음) 또는 매개체 8일 동안 매일 1회씩 생쥐당 300 ㎖ 용량으로 주입하였으며, 그리고 난 뒤 0시간 및 24시간의 p.i.에, AFC 점적 주입을 하지 않은 감염후 48시간에 AFC 연구를 수행하였다.
표시된 바와 같이, 레플루노마이드 처리 기간(1 ㎎/㎏, 복강내, q12h) 동안 유리딘을 동시 투여함으로써 레플루노마이드(LEF)의 영향을 역전시키기 위한 시도를 수행하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 레플루노마이드(LEF)를 급식시킨 생쥐는 감염후 2일째에 RSV-매개성 AFC 저해를 역전시켰다. LEF의 영향은 유리딘의 동시 투여에 의해 억제되었다. LEF는 정상 생쥐의 AFC에는 영향을 주지 않았다.
또한, LEF 처리는 감염후 1일 및 2일째에 체중 감소 및 기관지폐포 세척 전염증성 사이토카인(IFN-a, IL-b, TNF-a, KC) 농도에 있어서 유의한 감소를 유발하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 레플루노마이드(LEF)를 급식시킨 생쥐는 감염후 2일째에 RSV-매개성 폐의 체액 성분의 증가를 역전시켰다. LEF의 영향은 유리딘의 동시 투여에 의해 억제되었다. 중요하게, LEF 및/또는 유리딘을 생쥐에 처리하는 것은 감염후 2일째에 폐 조직의 바이러스 복제에 영향을 주지 않았다.
도 7에서 보는 바와 같이, 부피-조절된 음이온 채널(VRACs)의 광범위한 저해제를 AFC 점적 주입에 첨가하는 것은 감염후 2일째에 RSV 매개성 AFC 저해를 역전시켰다. 사용된 일부 저해제들이 다양한 다른 세포 기능에 다른 영향을 주지만, 이러한 제제들은 VRAC 저해에만 공통의 영향을 주었다. 그러나, NPPB(100 mM)는 상대적으로 VRAC-특이적이다. 이러한 발견은 UTP가 초기 RSV 감염 동안 VRACs를 통해 세포로부터 분비됨을 증명해준다. 또한, 플루옥세틴(10 mM)은 선택적 세로토닌 재흡수 저해제로서 작용한다. 또한, 베라파밀(10 mM)은 Ca++ 채널차단제로서 작용한다. 타목시펜(25 mM)은 항-에스트로겐이다.
호흡기 세포융합 바이러스는 BALB/c 생쥐 모델의 감염 후의 초기 타임포인트에서 유의한 호흡기 상피세포병리를 유발하지 않으면서 아밀로라이드-민감성 AFC(활성 Na+ 전달제의 표지자)를 저해한다. 아울러, RSV가 AFC에 미치는 저해 효과는 UTP에 의해 매개되며, 폐에 있는 P2Y 퓨린성 수용체에 작용한다.
감염후 2일째에 RSV-유도성 AFC 저해를 유발하는 UTP는 새로운 합성으로부터 유발되며, 이 과정의 저해는 RSV-유도성 AFC 감소를 억제하고, 바이러스 복제를 변화시키지 않으면서 폐의 체액 성분을 증가시킨다. 더불어, 감염후 2일째에 RSV-유도성 AFC 저해를 유발하는 UTP는 부피-조절된 음이온 채널을 통해 분비된다.
감염후 2일째에 RSV-유도성 AFC 저해에 레플루노마이드가 미치는 영향을 증명하였다. 8일 동안 레플루노마이드(5 ㎎/㎏, 1% 메틸셀룰로즈에 현탁되어 있음, 하루에 한번)를 생쥐에 구강투여로 전처리하고, 그 후 RSV를 감염시켜 감염후 24시간에 다시 레플루노마이드를 처리하였다. 이러한 요법은 감염후 2일째에 RSV-유도성 AFC 저해를 억제시켰다. 이러한 영향은 메틸셀룰로즈 단독 금식에 의해 모방되지 않았으며, 레플루노마이드 처리 기간(1 ㎎/㎏, 복강내, 10일 동안 q12h) 동안 유리딘의 동시 투여에 의해 역전되었다. 다시, 유리딘 단독 처리는 AFC에 영향을 주지 않았다. 또한, 레플루노마이드 처리는 정상(모의-감염된) 생쥐에 유해한 영향을 주지 않았다.
감염후 2일째에, 레플루노마이드가 RSV-유도성 AFC 저해에 미치는 영향
처리 nA AFC30BASAL B
미처리 23 21.19±0.94
메틸셀룰로즈 11 22.89±1.27
레플루노마이드 12 33.4±3.00***
유리딘 19 22.89±2.22
레플루노마이드+유리딘 10 21.9±2.69
레플루노마이드(모의-감염된 생쥐) 7 33.16±2.40***
A: AFC가 측정된 생쥐의 수; B:30분 후의 평균 % 기준 AFC ±SE; ***:p<0.0005(미처리 생쥐에 대한). 모의-감염된 BALB/c 생쥐에서의 AFC30BASAL은 37.21±1.2%(n=8).
레플루노마이드의 저해 효과는 단순히 항바이러스 효과의 결과가 아니었다. 바이러스 복제는 메틸셀룰로즈, 레플루노마이드, 또는 유리딘 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서, RSV-유도성 AFC 저해의 취소는 바이러스 복제 억제의 단순한 결과가 아니었으나, 새로운 피리미딘 합성에 미치는 레플루노마이드의 특정 저해 효과의 결과였다.
레플루노마이드 치료법은 습식중량:건중량 비율(폐의 체액 성분과 부종 형성의 지표)의 정상화와 관련이 있으며, RSV 감염 2일 후에 증가하였다. 유리딘 동시 처리는 증가된 습식중량:건중량 비율의 증가를 유발하였다(모의-감염된 생쥐와 비교해). 레플루노마이드 치료법은 감염후 1일 및 2일째에 BALB/c 생쥐에서 정상적으로 보여지는 체중 감소 정도를 유의하게 감소시켰으며, 이는 식욕에 이로운 영향을 제시한다(항-염증성 영향과 긍정적으로 관계). 또한, 이는 이 용량에서 매우 제한된 레플루노마이드 독성을 제안한다. 레플루노마이드 치료법은 감염후 2일째에 평균 혈액 O2 포화를 증가시켰으며, 이때 저산소증 정도는 정상적이었다. 레플루노마이드 치료법은 기관지폐포 세척 전염증성 사이토카인(인터페론-α, 인터루킨-1β, KC[인간 인터루킨-8의 생쥐 호몰로그; 및 종양 괴사 인자-α) 레벨을 유의하게 감소시켰으며, 이 영향은 유리딘 동시 치료법에 의해 부분적으로만 역전되었다(그리고, 이는 약물에 의한 비특이적 타이로신 키나아제 저해의 부분적인 결과가 될 것이다).
그리고 이와 함께, 이러한 데이터는 레플루노마이드가 직접적인 항바이러스 영향을 주지 않으면서 RSV 질병에 수개의 이로운 영향을 준다는 것을 증명해준다. 이러한 영향은 저산소증 및 폐 부종의 취소, 체중 증가 및 폐 염증 감소를 포함한다.
뉴클레오타이드 합성 저해가 폐의 체액 성분에 미치는 영향.
레플루노마이드를 이용한 전체적 치료법은 2일째에 정상적인 폐의 습식중량:건중량을 회복시켰으나, 레플루노마이드 처리 기간 동안의 유리딘 동시 투여는 이러한 영향을 억제시켰다(도 8a). 그러나, 2일째에 AFC에 이로운 영향을 주지 않는 6-MP를 이용한 전체적 치료법은 2일째에 폐의 습식중량:건중량을 변화시키지 않았다(도 8b).
뉴클레오타이드 합성 저해가 전염증성 사이토카인에 미치는 영향.
레플루노마이드는 면역억제제로서 임상적으로 사용된다. 치료 요법의 효능을 확인하기 위해, BAL의 전염증성 사이토카인 레벨에 미치는 영향을 분석하였다. 감염후 어떤 타임포인트에서도 IL-4 또는 IL-10이 검출되지 않았다. 모의-감염된 생쥐의 BALF에서 매우 소량의 IL-1β 및 KC(인간 IL-8의 생쥐 호몰로그)가 검출되었다(표 4). IFN-γ를 제외한 모든 다른 사이토카인의 유효량은 2일째에 나타났으나, IL-1β, KC 및 TNF-γ 레벨은 4일-8일째에 감소하였다. 유효량의 IFN-v는 6일 및 8일째 BALF에서만 발견되었다.
레플루노마이드 치료법은 2일째 BALF의 IFN-α, IL-1β, KC 및 TNF-α 레벨을 유의하게 감소시켰다(표 4). IFN-α를 제외하고, 이러한 영향은 유리딘 동시 치료법에 의해 부분적으로 역전되었다.
중요하게, 6-MP 치료법은은 레플루노마이드 치료법에 의해 유발된 BALF IFN-α, IL-1β, KC 및 TNF-α 레벨을 비교할만하게 감소시켰다(표 4). 2일째에 다른 제제로 처리한 생쥐의 IFN-α, IL-1β, KC 및 TNF-α 레벨 사이에는 유의한 차이가 없었다.
RSV 감염 및 뉴클레오타이드 합성 저해가 BALF 전염증성 사이토카인에 미치는 영향
nA IFN-αB IFN-γB IL-1βB KCB TNF-αB
모의 8 0*** 0 10±6*** 80±21*** 0***
d2 13 151±12 2±1 136±24 913±36 81±16
d4 8 NDF 30±16 6±1*** 106±27*** 0***
d6 8 ND 912±116*** 20±3*** 72±9*** 1±1***
d8 6 ND 195±25*** 8±2*** 88±16*** 0***
d2 LEFC 12 72±12*** ND 20±8*** 425±58*** 0***
d2 LEF+UD 10 246±68 ND 20±6*** 334±62*** 0***
d2 6-MPE 8 105±14* ND 9±3*** 329±63*** 0***
A: BALF 사이토카인 레벨이 측정된 생쥐의 수
B: 평균 사이토카인 농도 BALF±SE(pg/㎖)
C: 레플루노마이드-처리된 생쥐
D: 레플루노마이드-처리 및 유리딘-처리된 생쥐
E: 6-머캅토퓨린-처리된 생쥐
F: 미실시
d2에 있는 AFC에 비교하여 ***p<0.0005
뉴클레오타이드 합성 저해가 생쥐 폐의 RSV 복제에 미치는 영향.
2일째의 바이러스 복제는 레플루노마이드 또는 유리딘 처리 어느것에 의해서도 영향을 받지 않았다(도 9a). 이와 함께, 6-MP 전처리는 2일째 생쥐 폐의 바이러스 복제에 유의한 저해 효과를 나타내지 않았다(도 9b). 레플루노마이드 처리가 8일의 감염 기간 동안 계속될 때, 바이러스 복제는 8일째에 매우 높게 지속되었다(도 9c). 그러나, 레플루노마이드 처리가 2일 후에 계속되지 않았을 때, 바이러스 복제는 8일째에 오직 소량으로 증가하였다(도 9d).
레플루노마이드 치료법이 RSV 감염후의 저산소증에 미치는 영향.
레플루노마이드 치료법은 2일째의 SmO2 리딩의 정상화를 유발하였다(도 10a). 이와 같이, 레플루노마이드 치료법은 2일째 AFC 과정 동안 RSV-감염된 생쥐에서 %ΔHR30의 증가를 억제시켰다(도 10b).
레플루노마이드 치료법이 RSV 감염후의 코의 전위 차이에 미치는 영향.
감염 기간 동안의 레플루노마이드 처리는 기준 NPD 및 NPDAMIL의 RSV-유도성 감소를 완전히 억제시켰다(도 11a-11c).
음이온 채널 차단이 RSV - 매개성 AFC 저해에 미치는 영향.
2일째의 RSV-매개성 AFC 저해는 수개의 구조적으로 관련없는 VRAC 저해제인 플루옥세틴, 타목시펜, 클로미펜, 베라파밀, NPPB 또는 IAA-95를 AFC 점적주입에 첨가함으로써 차단되었다(표 5). 이러한 영향은 점적주입에 500 nM UTP를 동시 첨가함으로써 역전되었다. 대조적으로, 2일째의 AFC는 글리벤클라미드 및 니플루믹산 각각과 함께 낭종 섬유증 막통과 조절제 및 Ca2 + 활성화된 Cl- 채널 활성의 저해에 의해 영향을 받지 않았다.
2일째에, AFC 점적주입에 첨가한 음이온 채널 저해제가 AFC의 RSV-매개성 저해에 미치는 영향
저해제 농도(㎛) nA AFCB
없음 - 25 22.01±1.04
플루옥세틴 10 16 34.54±0.79***
플루옥세틴+UTP 10/0.5 8 23.64±2.42
타목시펜 25 9 34.50±0.94***
클로미펜 20 8 31.05±2.65***
베라파밀 10 6 33.04±1.49**
NPPBC 100 9 32.70±2.18**
R(+)-IAA 94D 100 5 34.25±1.98***
글리벤클라마이드 100 9 24.24±4.24
니플루믹산 100 10 20.28±1.53
A: AFC가 측정된 생쥐의 수
B: 평균 %AFC±SE
C: 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)벤조산
D: R(+)-[(6,7-디클로로-2-사이클로펜틸-2,3-디하이드로-2-메틸-1-옥소-1H-인덴-5일)-옥시] 아세트산 94
d2에서 AFC30BASAL과 비교하여 **p<0.005, ***p<0.0005
A77-1726이 RSV -매개성 AFC 저해에 미치는 영향.
이미 공지된 바와 같이, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 균주 A2를 BALB/c 생쥐에 비강내 감염시키는 것은 감염후(post infection, p.i.) 2일 및 4일째에 기준 및 아밀로라이드-민감성 AFC를 감소시켰으며, 이러한 저해는 UTP에 의해 매개되어 P2Y 수용체(AJPLCMP, 2004)를 통해 작용한다. 감염후 2일째의 RSV-매개성 AFC 저해는 새로운 피리미딘 합성을 차단하는 A77-1726 25 mM을 AFC 점적주입에 첨가함으로써 억제되는 것으로 추가로 확인되었으나, 새로운 퓨린 합성을 차단하는 마이코페놀산 또는 6-머캅토퓨린에 의해서는 억제되지 않았다. A77-1726-매개성 차단은 50 mM 유리딘(이는 세척 과정을 통해 피리미딘을 합성하게 함)의 첨가에 의해 역전되나, 25 mM 제니스테인(이는 A77-1726의 비특이적 타이로신 키나아제 저해제 효과를 모방함)에 의해서는 재현되지 않아, A77-1726의 차단 효과가 새로운 피리미딘 합성 과정을 통해 매개됨을 보여준다. 유사하게, 새로운 피리미딘 합성 저해제인 레플루노마이드(1일 동안 1% 메틸셀룰로즈에 5 ㎎/㎏ p.p.로 녹아있음)를 생쥐에 처리하면 AFC에 대한 RSV의 저해 효과를 역전시켰다. 더불어, 플루옥세틴(10 mM), 베라파밀(10 mM) 및 타목시펜(25 mM)과 같은 부피-조절된 음이온 채널(VRAC) 기능 저해제는 감염 후 2일 째에 RSV-매개성 AFC 저해를 차단하였다. 이와 함께, 이러한 데이터는 새로운 피리미딘 합성으로부터 유발되고 VRACs를 통해 분비되는 RSV 감염 동안 UTP가 AFC를 저해함을 증명해준다. 이러한 과정은 UTP-유도성 AFC 감소를 억제하기 위한 새로운 치료학적 접근을 제공하며, 이는 체액 점액, 호흡기 출혈 및 RSV 감염후의 콧물의 부피를 증가시키는데 영향을 준다.
도 12에서 보는 바와 같이, RSV 감염은 감염후 2일 및 4일째에 기준 폐포 채액 제거(AFC)를 유의하게 저해시켰다. 모의 감염(M)은 미감염된 생쥐(U)에 비해 AFC에 영향을 주지 않았다. 기준 AFC는 2일째에 43%(모의-감염된 값으로부터)까지, 4일째에 26%까지 저해되었다. 또한, AFC의 아밀로라이드 민감성은 감염후 1일째에 감소하였으나, 감염후 2일 및 4일에는 나타나지 않았다.
감염후 2일째의 RSV-매개성 AFC 저해는 아피라제(apyrase, 이는 UTP 및 ATP 모두를 감소시킴) 또는 UDP-글루코스 파이로포스포릴라아제(이는 글루코스-1-포스페이트 및 무기 파이로포스파타제의 존재하에서 UTP를 감소시킴)를 AFC 점적주입에 첨가함으로써 역전되나, 헥소키나아제(이는 글루코스의 존재하에서 ATP를 감소시킴)의 첨가에 의해서는 역전되지 않는다. P2Y 수용체-특이적 길항제(200 mM XAMR0721)를 점적주입에 첨가하는 것은 감염후 2일째에 RSV-매개성 AFC 저해를 역전시켰다.
마취되고, 의식이 있으며 정상 체온과 혈액 기체를 가진 BALB/c 생쥐에서 5% 지방산-무첨가 BSA를 포함하는 등몰 농도의 NaCl 0.3 ㎖를 기관내 점적주입한 후 30분 이상 동안 AFC 연구를 수행하였다. 각 그룹당 분석된 생쥐의 수를 각 그래프의 적당한 막대에 나타내었다.
도 13에서 보는 바와 같이, 디하이드로-오로테이트 리덕타제 저해제(25 ㎛ A77-1726)를 AFC 점적주입에 첨가하는 것은 감염후 2일째의 RSV-매개성 AFC 저해를 역전시켰다. A77-1726의 영향은 50 mM 유리딘을 AFC 점적주입에 동시 첨가함으로써 완전히 역전되었으나 25 mM 제니스테인(비특이적 타이로신 키나아제 저해제)에 의해서는 재현되지 않았다. 따라서, A77-1726의 영향은 새로운 피리미딘 합성 과정에 특이적이다.
도 14에서 보는 바와 같이, IMP 디하이드로게나아제 저해제(25 ㎛ 6-MP 또는 MPA)를 AFC 점적주입에 투여하는 것은 감염후 2일째의 RSV-매개성 AFC 저해에 오직 극소의 영향만을 주었다. IMP 디하이드로게나아제 저해제의 적은 영향은 새로운 피리미딘 합성에 필수적인 전구체인 ATP 결핍의 결과였다. MPA 영향은 50 mM 하이폭산틴(HXA)를 AFC 점적주입에 동시 첨가함으로써 완전히 역전되어 퓨린 세척 과정을 통해 ATP 합성을 가능하게 하였다. 이러한 발견은 ATP 역전이 RSV 감염 동안 낮음을 증명해준다.
감염후 2일째의 RSV -매개성 AFC 저해는 새로운 피리미딘 합성 저해제인 A77-1726에 의해 억제된다.
A77-1726의 영향은 세척 과정을 통해 UTP 합성을 촉진하는 외인성 유리딘의 첨가에 의해 차단되었으며, A77-1726의 비특이적 타이로신 키나아제 저해 효과를 모방하는 제니스테인에 의해 복제되지 않았다. 마이코페놀산(MPA) 및 6-머캅토퓨린(6-MP)와 같은 새로운 퓨린 합성 저해제는 감소된 ATP(ATP는 새로운 피리미딘 합성에 대한 필수 전구체임) 합성의 결과로서 RSV-매개성 AFC 저해에 대해 매우 소량의 차단 효과를 나타낸다. 다시, 이러한 효과는 세척 과정을 통해 ATP 합성을 촉진하는 외인성 하이폭산틴의 첨가에 의해 차단되었다. 흥미롭게도, 감염후 2일째의 RSV-유도성 AFC 저해는, ATP 및 UTP에 대한 분비 메카니즘으로서 제시되었던 다양한 부피-조절된 음이온 채널(VRACs)에 의해, 그리고 RSV에 의해 활성화되고 VRACs를 활성화시키는 것으로 알려진 Rho 키나아제의 저해에 의해 억제되었다.
감염후 2일째의, 피리미딘 및 퓨린 합성 저해제 및 VRACs가 RSV-유도성 AFC 저해에 미치는 영향
표적 저해제 농도A nB AFC30BASAL C
없음 - 23 21.19±0.94
새로운 피리미딘 합성 A77-1726 25 16 34.06±1.88***
A77-1726+유리딘 25/50 12 21.3±2.02
타이로산 키나아제 새로운 퓨린 합성 제니스테인 25 7 20.39±0.73
MPA 25 12 26.2±1.7*
VRACs 6-MP 25 12 26.31±1.85*
MPA+하이폭산틴 25/50 7 22.36±2.73
플루옥세틴 10 16 34.54±0.79***
베라파밀 10 6 33.04±1.49***
타목시펜 25 9 34.5±0.95***
클로미펜 20 8 31.0±2.67**
NPPB 100 7 35.12±1.94***
Rho 키나아제 ROCK 저해제 20 10 36.58±2.11***
A: 최종 농도(㎛); B: AFC가 측정된 생쥐의 수; C: 30분후의 평균 % 기준 AFC ±SE; *: p<0.05; **:p<0.005; ***: p<0.0005 (모두 무처리 생쥐에 대하여). 모의-처리된 BALB/c 생쥐의 AFC30BASAL은 37.21±1.2%(n=8)임.
감염후 2일째의, RSV -유도성 AFC 저해에 대한 후-감염 A77-1726 처리.
생쥐에 A77-1726(100 ㎕ 생리식염수에 50㎛ 녹아있음, 두 콧구멍에 나누어 투여)을 비강내 투여로 24시간 p.i.처리 했을때, 감염후 24시간의 AFC에 미치는 RSV의 저해 효과는 완전히 차단되었으며, 이는 A77-1726이 폐로 국소 투여되었을 때 새로운 피리미딘 합성에 지연된 효과를 나타냄을 증명해준다. 또한, A77-1726 비강내 전처리는 폐의 습식중량:건중량 비율(폐의 체액 함량 및 부종 형성의 지표)의 정상화와 관련이 있으며, 이는 RSV 감염후에 감소하였다.
감염후 2일째, 24시간째의, 비강내 A77-1726 처리가 RSV-유도성 AFC 저해에 미치는 영향
감염 상태 처리 nA AFC30BASAL B
미감염 없음 7 34.9±2.5
미감염 A77-1726C 10 23.19±5.95***
RSV-2일 p.i. 없음 23 21.19±0.94
RSV-2일 p.i. A77-1726D 14 32.68±1.1***
A: AFC가 측정된 생쥐의 수; B: 30분 후의 평균 % 기준 AFC ±SE; C: 100 ㎕ 식염수에 50 ㎛, AFC 분석 전 24시간에 비강내 투여됨; D: 100 ㎕ 식염수에 50 ㎛, 감염후 24시간에 비강내 투여됨; ***p<0.0005 (무처리 생쥐에 비교하여).
본 발명에 개시된 화합물, 조성물 및 방법은 다양하게 모방 및 변형될 수 있다. 본 발명에 개시된 다른 양태의 화합물, 조성물 및 방법은 본 명세서 및 본 발명에 개시된 화합물, 조성물 및 방법의 실시에 의해 명백해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 일례로서 간주된다.
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Claims (56)

  1. 피리미딘 합성 저해제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 대상의 폐 상피세포에 국소 투여하기에 적합한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 흡입제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약액제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분무제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 레플루노마이드(leflunomide)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 A77-1726인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 디하이드로-오레이트(dihydro-orate) 리덕타제 저해제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 비강내 투여에 적합한 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 폐 상피세포는 대상의 비강, 콧구멍, 코인두, 인두, 기관, 기관지, 세기관지 또는 폐포에 위치한 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폐 상피세포는 기관지폐포(bronchoalveolar) 상피세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 치료학적 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 하나 이상의 계량(metered dose)된 조성물을 포함하는 장치로서, 상기 각 계량은 대상의 폐 질환을 치료하기 위한 피리미딘 합성 저해제의 치료학적 용량 또는 이의 일부인 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 대상의 폐 상피세포에 국소 투여하기에 적합한 제형인 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 흡입제인 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 연무제인 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 분무제인 것을 특징으로 하는 장치.
  16. 제11항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 레플루노마이드인 것을 특징으로 하는 장치.
  17. 제11항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 A77-1726인 것을 특징으로 하는 장치.
  18. 제11항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 디하이드로-오레이트 리덕타제 저해제인 것을 특징으로 하는 장치.
  19. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 비강내 투여에 적합한 제형인 것을 특징으로 하는 장치.
  20. 제11항에 있어서, 상기 폐 질환은 호흡기 세포융합 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 장치.
  21. 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 폐 상 피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 제거의 증가 방법으로서, 상기 접촉은 세포에 의한 Na+ 의존성 체액(fluid) 제거를 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폐 상피세포는 생체 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 폐 상피세포는 시험관 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 레플루노마이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 A77-1726인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 디하이드로-오레이트 리덕타제 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 대상의 폐 상피세포의 대부분에 접촉시키 는 단계를 포함하는 대상의 폐 질환 치료 방법으로서, 상기 유효량의 피리미딘 합성 저해제는 대상의 Na+ 의존성 폐포 체액 제거를 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 폐 상피세포는 비강, 콧구멍, 코인두, 인두, 기관, 기관지, 세기관지 또는 폐포에 위치한 세포인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 폐 상피세포는 기관지폐포 상피세포인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 폐 질환은 호흡기 세포융합 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 레플루노마이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 A77-1726을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  33. 제27항에 있어서, 상기 유효량의 피리미딘 합성 저해제는 디하이드로-오레이트 리덕타제 저해제를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  34. 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험에 있는 대상의 호흡기 바이러스 감염의 하나 이상의 징후 또는 신체적 증상을 감소시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 디하이드로-오레이트 리덕타제 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 레플루노마이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 A77-1726인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 위험이 있는 대상을 확인하는 단계 및 유효량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 디하이드로-오레이트 리덕타제 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 레플루노마이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 피리미딘 합성 저해제는 A77-1726인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상을 확인하는 단계 및 상기 대상의 Na+ 의존성 폐포 체액를 감소시키기에 효과적인 용량의 피리미딘 합성 저해제를 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제1항의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상의 치료 방법.
  44. 제2항의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상의 치료 방법.
  45. 제5항의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상의 치료 방법.
  46. 제8항의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 감염된 대상의 치료 방법.
  47. 과량의 UTP의 존재하에서 테스트 화합물을 폐 상피세포에 접촉시키는 단계, 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수 및 대조군에 비교해 증가된 Na+ 의존성 체액 흡수를 검출하는 단계 및 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 표시하는 단계를 포함하는, 폐 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물의 스크리닝 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세포는 생체 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 세포는 시험관 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 방법은 UTP를 제거하는 단계 및 Na+ 의존성 체액 흡 수 증가의 비가역성을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것읖 특징으로 하는 방법.
  51. 피리미딘 합성 유전자를 인코딩하는 이종 유래 핵산을 발현하는 세포에 테스트 화합물을 접촉시키는 단계, 세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수 및 대조군 레벨에 비교해 증가된 Na+ 의존성 체액 흡수를 검출하는 단계 및 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물을 표시하는 단계를 포함하는, 세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물의 스크리닝 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 세포는 생체 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 세포는 시험관 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. H441 세포 또는 세포주를 호흡기 세포융합 바이러스로 감염시키는 단계, 상기 감염된 세포 또는 세포주를 피리미딘 합성 저해제와 접촉시키는 단계, 및 상기 감염된 세포 또는 감염된 세포주의 세포들을 통과하는 이온 전달을 측정하는 단계를 포함하는 호흡기 상피세포에 의한 Na+ 의존성 체액 흡수를 증가시키는 테스트 화합물의 스크리닝 방법으로서, 대조군 레벨과 비교하여 이온 전달이 증가하는 것이 테스트 화합물이 Na+ 의존성 체액 섭취를 증가시키는 것을 나타내는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 세포는 생체 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 세포는 시험관 내 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
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