KR20070036033A - 보체 Ｃ５ａ 수용체 조절제를 이용한 신경계 증상의치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C5a 수용체의 활성을 조절할 수 있는, 신규한 환형 펩타이드 및 펩타이드모방성 화합물을 이용한 신경계 증상의 치료에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 C5a 수용체의 길항제로서 작용하며 다형핵백혈구, 단핵구, 림프구 및/또는 대식세포의 C5a 수용체에 대한 활성이 있다. 본 발명의 바람직한 형태에서, 상기 신경계 증상은 신경퇴행성 질환, 신경면역성 질환, 혈액뇌장벽의 부전으로 인한 질환 및 뇌졸증이다.

C5a 수용체 길항제, 신경퇴행성 질환, 펩타이드모방체, 펩타이드.

Description

보체 Ｃ５ａ 수용체 조절제를 이용한 신경계 증상의 치료방법 {TREATMENT OF NEUROLOGICAL CONDITIONS USING COMPLEMENT C5a RECEPTOR MODULATORS}

본 발명은 C5a 수용체 활성 조절 능력이 있는, 신규한 환형 펩타이드 또는 펩타이드모방성 화합물을 사용한 신경계 증상의 치료에 관한 것이다. 본 화합물은 바람직하게는 C5a 수용체의 길항제로서 작용하며, 다형핵 백혈구, 단핵구, 림프구 및/또는 대식세포 상의 C5a에 대한 길항활성이 있다. 본 발명의 바람직한 한 형태에서, 상기 신경계 증상은 신경퇴행성 질환, 신경면역성 질환, 혈액뇌장벽의 부전으로 인한 질환 및 뇌졸증이다.

본 명세서에서 인용한 임의의 특허 또는 특허출원을 포함하는 모든 참조문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 어떤 참조문헌에 대하여도 선행기술을 구성하는 것임을 자인하는 것이 아니다. 참조문헌에 대한 언급은 각 참조문헌의 저자가 주장하는 바를 기재하는 것이며, 본 출원인은 참조한 문헌의 정확성 및 관련성에 대하여 이의를 제기할 권리를 유보한다. 비록 다수의 선행기술 문헌을 본원에 참조하지만, 이러한 어떤 참조문헌도 호주 또는 임의의 다른 국가에서 당해 기술분야의 통상적 지식의 일부를 구성하는 것임을 자인하는 것이 아니라는 것을 당업자라면 명백하게 이해할 것이다.

알려진 세포 수용체 유형의 약 60%를 구성하는, G 단백질-연결 수용체는 신체 전반에 걸쳐 매우 흔하며, 세포막을 통하여, 매우 광범위한 내인성 리간드에 대한 신호전달을 매개한다. 이들 수용체는 심혈관, 중추 및 말초 신경계, 생식, 대사, 소화, 면역, 염증, 및 성장 질환과 기타 세포 조절 및 증식성 질환과 연관된 질환들을 포함하는 다양한 형태의 생리적 및 병태병리학적 과정에 관여하나, 이로 제한되는 것은 아니다. G 단백질-연결 수용체의 기능을 선택적으로 조절하는 제제는 치료제로서 중요한 의미를 갖는다. 이러한 수용체는 신호전달에 있어서의 이들의 필수불가결한 역할로 인하여, 점점더 중요한 약물 표적으로 인식되고 있다 (G protein-coupled receptors, IBC Biomedical Library Series, 1996).

그 중 가장 중점적으로 연구된 G 단백질-연결 수용체 중의 하나가 C5a이다. C5a는 알려진 가장 강력한 화학주성 제제이다. 이는 하기의 활성을 포함하는 다양한 활성을 갖는다:

(a) 손상 부위로의 호중성 백혈구 및 대식세포의 동원;

(b) 호중성 백혈구 및 대식세포 형태의 변경;

(c) 호중성 백혈구의 탈과립화 유발;

(d) 칼슘 가동화, 혈관투과성(혈관부종) 및 호중성 백혈구 부착성 증가;

(e) 민무늬근육의 수축유도;

(f) 히스타민, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, 프로스타글란딘 및 류코트리엔을 포함하는 염증 매개체의 방출 자극;

(g) 리소좀 효소의 방출 자극;

(h) 산소 라디칼 형성 촉진; 및

(i) 항체 생성의 증강 (Gerard and Gerard, 1994).

C5a의 향(pro)-염증성 활성을 제한하는 제제는 급성 및 만성 염증과, 염증에 수반되는 통증 및 조직손상을 억제할 잠재성을 가진다. 이러한 화합물은 상기 언급한 다양한 염증 매개체의 전 단계에서 작용하여 많은 경우 이들 화합물의 형성을 억제하기 때문에, 매개체 또는 수용체의 활성을 직접적으로 억제하는 것보다, 염증성 증상의 억제 또는 경감에 보다 더 강력한 효과를 가질 수 있다.

본 발명자의 종전 특허출원 PCT/AU98/00490에서, 본 발명자들은 인간 C5a의 C-말단과의 일부 유사체의 3차 구조를 기술하였으며, 이 정보를 이용하여, 인간 C5a 수용체 (C5aR)에 결합하는, C5a의 길항제 또는 작용제로서 기능하는 신규한 화합물을 디자인하였다. 종전에 잠재적인 길항제가 수용체에 결합하고 길항제로서 기능하기 위해서는 C-말단 아르기닌 및 C-말단 카르복실산염이 필요할 것으로 생각되었다. 그러나, 본 발명자들은 실제로 말단 카르복실기가 일반적으로 C5a 수용체에 대한 고친화성 결합 또는 길항제 활성에 요구되지 않음을 밝혔다. 대신, 지금까지는 인식되지 않았던 구조적 특징, 회전 입체형태(conformation)가 호중성 백혈구 상의 인간 C5a 수용체에의 고친화성 결합에 필요한 중요한 특징임을 발견하였다. 본 발명자의 종전 국제특허출원 PCT/AU01/01427에 기술된 바대로, 본 발명자들은 이러한 결과를 근거로, C5a 수용체와의 상호작용을 위해 소수성기로 하여금 소수성 배열을 이루도록 하는 강제적 구조 주형을 디자인하였다. 본 명세서에 참조한 상기 명세서 전부는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

운동이상 질환은, 인구 집단 중 특히 노인 집단에서 심각한 건강문제이다. 이러한 운동이상 질환은 종종 뇌병변 또는 신경퇴행성 증상의 결과이다. 운동이상 질환을 초래하는 대뇌기저핵이 연관되어 있는 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병 및 윌슨병을 포함한다. 나아가, 운동장애는 종종 뇌허혈 및 기타 신경계 질환의 후유증으로서 발생한다.

신경퇴행성 증상은 일반적으로 돌이킬 수 없는, 운동 및/또는 인지 기능의 감소와 연관된 만성 진행성 증상이다. 예컨대 알츠하이머병, 헌팅톤병, 전측두엽치매 (Pick's disease), 레비(Lewy)체 형성이 수반되는 치매, 파킨슨병, 크로이츠펠트야콥병 및 신종의 변형된 형태의 크로이츠펠트야콥병과 같은 프라이온과 연관된 증상, 및 근육위축가쪽경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS); 또한 루게릭병으로도 알려짐)과 같은 일부 질환은 뇌에 단백질 응집물의 축적과 연관되어 있다. 예컨대 다발경화증과 같은 다른 질환은 자가면역 기전과 관련되어 있다. 외상으로부터 유래되는 뇌손상, 감염, 선천적 대사이상, 뇌출혈 또는 뇌혈전은 마비 및/또는 인지장애를 포함하는 심각한 불구의 매우 흔한 원인이다. 운동신경 질환은 신경계의 심각한 질환군을 포함하며, 이들 각각은 운동신경이 점차적으로 퇴행하는 특징이 있다. 운동 신경 질환은 뇌로부터 연수 또는 척수까지 이어지는 상부 운동 신경 및/또는 척수부터 신체의 근육까지 이어지는 하부 운동신경에 영향을 미칠 수 있다. 경련 및 과다반사는 상부 운동뉴런의 손상을 나타낸다. 신경전달이 단절된 진행성 근육 위축증 및 쇠약증은 하부 운동뉴런의 손상을 나타낸다. 이러한 그룹의 증상은 근육위축가쪽경화증; 진행성 연수마비; 영아 및 소아형을 포함하 는 척수근육위축증; 쿠겔베르그-웰란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome); 듀센 마비(Duchenne's paralysis); 워드니그-호프만병(Werdnig-Hoffmann disease); 및 양성 국소근위축증을 포함한다. 이러한 모든 증상은 극도로 고통스러우며, 치료방법이 있다 하더라도 제한적이며 매우 비싸거나, 또는 사용가능한 효과적인 치료방법이 없다. 그 결과, 이러한 증상을 치료할 수 있는 향상된, 특히 비용면에서 효율적인 치료방법의 개발이 급선무이다.

한 부류의 특이한 유전병인 폴리글루타민 반복 질환이 있는 가족은 예상이라고 불리는 증상을 나타내며, 이 경우 부모는 증상이 없으나, 그들 자손의 50퍼센트에서 상기 질환이 발생한다. 이러한 질병은 헌팅톤병, 및 척수 및 연수 근육퇴행위축증, 수개의 형태의 척수소뇌성 실조증, 및 DRPLA (dentatorubral pallidoluysian atrophy)를 포함하는 기타 신경퇴행성 질환을 포함한다. 이러한 증상은 특정 유전자에서 나타나는 삼핵산반복서열로 특징되며, 이는 해당 단백질에서 폴리글루타민 서열을 코딩하여, 불용성 응집물의 형성을 초래한다; 그러나, 원인이 되는 단백질은 이를 제외하고는 관련성이 없으며, 알려진 기능이 없을 수도 있다. 단백질의 응집 기전은 아직도 규명되지 않은 병리상태를 유발한다.

헌팅톤병의 증상은 무도병 (움직임이 조화되지 않으므로 인한 팔과 다리의 경련적인, 부자연스러운 움직임), 언어장애, 기억력장애, 집중장애, 삼키는데 있어서 곤란 및 우울증과 같은 정신적 증상을 포함한다. 발병 나이는 빨라지는 반면, 세대가 지날수록 질환의 심각성은 증가한다. 헌팅톤병의 특징적인 단백질인 헌팅톤은 알려진 기능이 없다. 헌팅톤을 코딩하는 유전자의 제1 엑손은 일련의 삼핵산 CAG(글루타민) 반복서열을 코딩하며, 반복의 정도는 세대가 지나면서 자연적으로 증가한다. 반복된 정도가 임계적 수치인 35 반복을 초과하면 헌팅톤 단백질의 정상적 기능을 저해한다. 그 결과 초래되는 신경독성 효과로 인해 대뇌 피질 및 선조체의 뉴런이 죽어 기억력, 고급 인식기능, 및 움직임의 조화에 큰 타격을 받는다. 특징적인 선조체 병변이 관찰된다.

모든 사람은 상기 유전자를 가지고 있으며, 만약 삼핵산이 5 내지 35로 반복될 경우는 영향이 없다; 하지만, 상기 값을 초과할 경우, 상기 유전자는 불안정해지며, 자발적으로 증폭한다. 이러한 반복수는 발병의 나이와 관련성이 아주 높다: 200반복의 경우, 1 또는 2세 정도의 어린이도 증상을 나타낼 수 있으며, 유년기 초기에 죽을 것이다. 이와는 대조적으로, 35 내지 39개가 반복된 사람의 경우는 질환이 항상 발생하는 것은 아니며, 아주 늦은 시기에 질환이 발생하는 경향이 있다. 결함이 있는 유전자가 부계로부터 유전된 경우는 질환이 보다 초기에 발병하는 것으로 보이며, 증상도 보다 심각해진다.

케네디병(척수 및 연수 근육퇴행위축증)은 이러한 질환의 또다른 일원으로서, 50,000 명당 1명꼴로 발생하며, 안드로겐 수용체 단백질에서의 폴리글루타민의 반복 또는 확장을 초래하는 돌연변이에 의해 야기된다 (La Spada, 1991). 인간의 X-연관된 이러한 질환은 일반적으로 40대의 남성에서 발병하며, 운동 뉴런의 손실, 근육위축증 및 고환에 질환을 초래한다. 안드로겐 수용체에 결합하는 테스토스테론이 상기 질환의 진행 조절에 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 생각되었다. 여자는 혈액중의 테스토스테론의 양이 현저히 적으며, 이는 신경퇴행성의 발병 비율 에 영향을 미칠 수 있다.

파킨슨병의 전형적인 4가지 증상은 경련, 경직, 운동불능증 및 자세의 변화이다. 파킨슨 질환은 또한 통상적으로 우울증, 치매 및 전반적인 인지능력 감소와도 연관되어 있다. 파킨슨병은 총 인구집단에서 1000 명당 1명꼴의 빈도로 발병하며 60세 이상의 인구에서는 100명당 1명꼴로 빈도가 증가한다. 흑색질의 도파민 신경세포의 퇴행 및 후속적인 선조체에서의 도파민 간질 농도의 감소는 이러한 증상의 발생에 결정적이다; 흑색질 유래의 약 80%의 세포가 파괴되어야 비로소 임상적 증상이 나타난다.

현재 파킨슨병의 치료방법은 트랜스미터 교체 치료법(L-디하이드록시페닐아세트산(L-DOPA)), 모노아민 옥시다제(e.g. Deprenyl

), 도파민 수용체 작용제(e.g. 브로모크립틴 및 아포몰핀) 및 항콜린작용제(e.g.벤츠트로핀 및 올페나드린)에 기본을 둔 것들이다. 그러나, 이러한 치료법은, 특히 트랜스미터 교체 치료법은 임상적 효과가 지속적이지 않다. 장기간의 트랜스미터 교체 치료법을 받은 후, "on-off"증상이 발병하며, 상기 치료는 또한 비자발적 무정위운동 및 무도(chorea), 메스꺼움 및 구토와도 연관되어 있다. 더구나, 현재의 치료법은 신경퇴행성 질환을 근복적으로 치료하지 못하여, 치료에도 불구하고, 환자는 계속적으로 인지능력이 감소한다.

당 기술분야에서의 최근의 발전에도 불구하고, 운동이상 질환, 특히 헌팅톤병 및 파킨슨병, 및 ALS와 같은 신경퇴행성 증상의 치료를 위한 향상된 치료법의 개발이 요구된다. 특히, 투여 횟수가 적으며, 심각한 부작용이 거의 없거나/없고 감소되었거나/되었고, 근간을 이루는 신경퇴행성 질환을 조절 또는 정상으로 되돌릴 수 있는 효과적인 치료법의 개발이 요구된다.

비록 염증 기전이, 헌팅톤병, 전측두엽치매, 다발성 경화증. 알츠하이머병, 파킨슨병 및 노인성 신경퇴행증(치매), 및 뇌졸증 및 외상에 의해 야기되는 급성 뇌손상을 포함하는, 신경퇴행성 증상의 발병기전과 연관되어 있는 것으로 널리 생각되지만. 상대적으로 이러한 증상에서 보체의 가능한 역활에 대하여는 관심을 기울이지 않았다. 헌팅톤병, 전측두엽치매 및 알츠하이머병에서의 보체의 활성에 대하여 연구가 되었으며, 정상 및 병에 걸린 뇌에서 보체의 성분이 모두 널리 발현되는 것으로 알려졌다. 보체 활성화제인 C1r, C4 및 C3, 보체 조절자 C1 억제제, 클러스테린, MCP, DAF 및 CD59, 및 아나필로톡신 C3a 및 C5의 수용체를 포함하는, 보체경로의 수개 성분의 상향조절이 헌팅톤병에 걸린 환자의 뇌에서 검출되었다. 이에, 헌팅톤병의 미상엽 뉴런에 축적되는 돌연변이 헌팅톤 단백질이 C1q에 결합할 수도 있어, 이로 인해 전통적인 보체 경로의 활성화를 개시하는 것으로 생각되었다 (Singhrao et al, 1999).

그러나, C5a 수용체의 억제제, 특히 상기 수용체에 대한 저분자량 길항제가 염증과 관련된 신경계 또는 신경퇴행성 증상의 치료에 유용할 수도 있다는 것에 대하여는 지금까지 어떤 증거도 없었다.

발명의 요약

본 발명자들은 놀랍게도, 작은 환형 펩타이드인 저분자량의 C5a 수용체 길항제가 대사- 허혈-유도로 신경세포가 죽는 동물모델에서 신경 손상을 예방 또는 경감시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 동물 모델을 다양한 신경계 증상, 특히 선조체 병변과 관련된 증상에 대한 모델시스템으로 사용하였다. 본 발명자들은 ALS 동물모델에서 생존률이 향상되었으며, 운동기능의 손실이 늦춰지는 것을 증명하였다.

제1양태에 따르면, 본 발명은 염증과 관련된 신경퇴행성 증상 또는 신경계 증상의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 C5a 수용체의 억제제를 상기 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게 상기 증상은 증가된 보체경로의 활성과 관련되어 있는 것이다. 바람직하게 상기 억제제는:

(a) C5a 수용체의 길항제이며;

(b) 실질적으로 작용제의 활성은 없으며;

(c) 화학식 (I)의 환형 펩타이드 또는 펩타이드모방성 화합물이다.

식 중에서,

A는 H, 알킬, 아릴, NH₂, NH-알킬, N(알킬)₂, NH-아릴, NH-아실, NH-벤조일, NHSO₃, NHSO₂- 알킬, NHS0₂-아릴, OH, O-알킬, 또는 0-아릴이며;

B는 알킬, 아릴, 페닐, 벤질, 나프틸 또는 인돌 기, 또는 예컨대 L-페닐알라닌 또는 L-페닐글라이신과 같은 D- 또는 L-아미노산의 측쇄이나, 글라이신, D-페닐알라닌, L- 호모페닐알라닌, L-트립토판, L-호모트립토판, L- 타이로신, 또는 L-호모타이로신의 측쇄는 아니며;

C는 예컨대 글라이신, 알라닌, 루이신, 발린, 프롤린, 하이드록시프롤린, 또는 티오프롤린과 같은, 예컨대 D-, L- 또는 호모-아미노산의 측쇄와 같은 작은 치환체이나, 바람직하게는, 부피가 큰 치환체 예컨대 이소루이신, 페닐알라닌, 또는 시클로헥실알라닌의 치환체는 아니며;

D는 예컨대 D-루이신, D-호모루이신, D-시클로헥실알라닌, D- 호모시클로헥실알라닌, D-발린, D-노르루이신, D-호모- 노르루이신, D-페닐알라닌, D-테트라하이드로이소퀴놀린, D-글루타민, D-글루타메이트, 또는 D-타이로신과 같은 중성 D-아미노산의 측쇄이나, 바람직하게는, 예컨대 글라이신 또는 D-알라닌의 측쇄와 같은 작은 치환체, 예컨대 D- 트립토판과 같은 큰 평면형 측쇄, 또는 예컨대 D-알지닌 또는 D-라이신과 같은 하전된 큰 측쇄는 아니며;

E는 L- 페닐알라닌, L-트립토판 및 L-호모트립토판으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산의 측쇄와 같은 큰 치환체이거나, 또는 L- 1-나프틸 또는 L-3-벤 조티에닐 알라닌이나, D-트립토판, L-N-메틸트립토판, L-호모페닐알라닌, L-2-나프틸 L- 테트라하이드로이소퀴놀린, L-시클로헥실알라닌, D-루이신, L- 플루오레닐알라닌, 또는 L-히스티딘의 측쇄는 아니며;

F는 L-알지닌, L-호모알지닌, L-시트룰린, 또는 L-카나바닌의 측쇄, 또는 그 생동배체(bioisostere), 즉, 말단 구아니딘 또는 우레아기를 보유하고 있는 측쇄로서, 탄소골격이 상이한 구조의 기로 치환되었으나, 측쇄가 전체적으로 모(parent)기와 동일한 방식으로 표적 단백질과 반응하며; 그리고

X는 -(CH₂)_nNH- 또는 (CH₂)_n-S-, 식 중에서 n은 1 내지 4의 정수, 바람직하게는 2 또는 3이며; -(CH₂)₂O-; -(CH₂)₃0-; -(CH₂)₃-; -(CH₂)₄-; -CH₂COCHRNH-; 또는 -CH2-CHCOCHRNH-이며, 식 중에서 R은 임의의 통상적 또는 비통상적 아미노산의 측쇄이다.

C에, 하이드록시프롤린 및 티오프롤린의 시스 및 트랜스 형태가 모두 사용될 수 있다.

바람직하게, A는 아세트아미드기, 아미노메틸기 또는 치환 또는 비치환된 설폰아미드기이다.

바람직하게, A가 치환된 설폰아미드인 경우, 상기 치환체는 탄소원자수 1 내지 6의 알킬쇄, 바람직하게는 탄소원자수 1 내지 4의 알킬쇄이거나, 또는 페닐 또는 톨루일기이다.

특히 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 C5aR에 대하여 길항작용을 가지며 C5a에 대한 작용제로서의 기능은 실질적으로 없다.

상기 화합물은, 바람직하게는, 이로 제한하는 것은 아니나, 인간 다형핵백혈구, 단핵구, 림프구 및 대식세포를 포함하는 인간 및 포유류 세포에 대한 C5a 수용체의 길항제이다. 상기 화합물은 바람직하게는 C5a 수용체에 선택적으로 강하게 결합하며, 더욱 바람직하게는 마이크로몰라 수준의 농도보다 낮은 농도에서 강력한 길항작용을 갖는다. 더더욱 바람직하게는 상기 화합물은 IC₅₀<25μM 의 수용체 친화도를 갖으며 길항제 효능은 IC₅₀<lμM이다.

가장 바람직하게, 상기 화합물은 국제특허출원 PCT/AU02/01427에 기술된 화합물 1(PMX53; AcF[OP-DCha-WR]), 화합물 33 (PMX273; AcF[OP5- DPhe-WR]), 화합물 60 (PMX95; AcF[OP-DCha-FR]) 또는 화합물 45 (PMX201; AcF[OP-DCha-WCit]), 또는 HC-[OPdChaWR] (PMX205) 또는 HC-[OPdPheWR] (PMX218)이다. 이러한 환형 펩타이드의 구조는 도 1에 도식화되어 있다.

한 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 혈액뇌장벽을 통과할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 PMX205 또는 PMX53- 이다.

본 발명의 한 바람직한 형태에서, 상기 증상은 선조체 병변 및/또는 폴리글루타민 반복과 연관된 신경퇴행성 증상이다.

이러한 형태의 본 발명에서, 상기 증상은 더욱 바람직하게는 헌팅톤병, 척수 및 연수 근육퇴행위축증, 척수소뇌성 실조증, DRPLA, 선초체 손상, 및 급성의 유형 I 글루타르산 요증과 연관된 급성 선조체 세포괴사로 구성되는 군으로부터 선택된 다.

본 발명의 다른 바람직한 형태에서, 상기 증상은 운동 뉴런 질환 예컨대 근육위축가쪽경화증, 진행성 연수마비, 영아 및 소아형을 포함하는 척수근육위축증; 쿠겔베르그-웰란더 증후군; 듀센 마비; 워드니그-호프만병; 및 양성 국소근위축증이다.

본 발명의 제3의 바람직한 형태에서, 상기 증상은 신경퇴행성 및/또는 허혈성 손상을 포함하는 질환으로, 파킨슨병, 알츠하이머병, 윌슨병, 및 대뇌 허혈의 후속으로 발생하는 병변, 및 혈액뇌장벽의 부전과 연관된 질환을 포함하는, 기타 다른 신경계 질환을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 3-NP가 무산조증을 유발하기 때문에, 선초체 영역이 뇌졸증으로 인해 가장 영향을 많이 받는 부위이며, 3-NP 모델이 유용한 뇌졸증 모델로 알려져 있다. 파킨슨-유형의 질환 중에서 특히 흥미로운 것이 파킨슨병, 약물로 유발된 파킨슨증, 뇌염 후 파킨슨증, 중독(예를 들면 MPTP, 망간 또는 일산화질소 중독)으로 인해 유발된 파킨슨증 및 외상 후 파킨슨병(펀치 드렁크증)이다. 기타 치료가 필요한 운동이상 질환은 진행성 핵상마비, 헌팅톤병, 대뇌 신경퇴행성 질환군(multiple system atrophy), 피질-기저핵 변성증, 윌슨병, 할러보르덴-스파츠 질환(Hallervorden- Spatz disease, 뇌의 철분 축적과 관련되어 있는 질환), 진행성 담창위축증, 도파-반응성 근긴장이상-파킨슨증, 경직, 알츠하이머병 및 기타 비정상적 운동 또는 자세를 유발하는 기저핵 질환을 포함한다.

억제제는 상기 증상의 치료를 위해 하나 이상의 기타 제제와 사용될 수 있 다. 예를 들면, 트레할로스, 코팍손, 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오타이드, 크레아틴, 미노사이클린 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 다양한 제제가 헌팅톤병의 치료제로서 제시되어 왔다. 글루타메이트 경로의 길항제인 릴루존은 ALS의 치료제로서 승인되었으며, 크레아틴, 재조합 인간 IGF-1 및 섬모 신경성 인자(ciliary neurotrophic factor)가 모두 상기 증상의 치료를 위한 임상실험 중에 있다. 최근 가족력 형태의 ALS가 유전자치료법을 이용한 정상의 SODl 유전자의 도입과 함께 RNA 간섭(interference)을 사용한, 비정상 SODl 유전자의 억제로 치료될 수도 있음이 제시되었다 (Raoul et al., 2005; Ralph et al., 2005). 그러나, 이러한 방법이 임상에서 실제 사용되기까지는 수년의 기간이 걸릴 것이다. 항-안드로겐 제제인 류프로렐린이 척수 및 연수 근육퇴행위축증의 치료제로서 테스트 중이다 (Katsuno et al, 2003). 전달체 대체제인 L-디하이드록시페닐 아세트산 (L-DOPA), 모노아민 산화제 억제제 예컨대 Deprenyl

, 도파민 수용체 작용체 예컨대 브로모크립틴 및 아포모르핀 및 항콜린작용제 예컨대 벤츠트로핀 및 올페나드린 이 현재 파킨슨병의 치료에 사용되고 있다.

본 발명의 조성물은 경구, 비경구, 흡입, 비강, 직장 또는 경피용으로 제형화될 수 있으나, 경구 또는 비경구 제형이 바람직하다. 전부가 아니라면 대분의 본 발명의 화합물은 대사성 효소 예컨대 장관, 혈액, 허파 또는 세포내 효소와 같은 효소의 존재 중에서 안정할 것이다. 이러한 안정성은 기술분야의 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 용이하게 시험될 수 있다.

선택적으로, 이러한 제형은 혈액뇌장벽을 통하여 화합물의 전달을 촉진시킬 수 있는 제제 또는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 여러가지 제제가 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 삼투적 활성제제 예컨대 만니톨이다.

임의의 바람직한 경로에 의한 투여에 적합한 제형은 표준 방법, 예를 들면 주지된 교과서 예컨대 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. II, 2000 (20th edition), A.R. Gennaro (ed), Williams & Wilkins, Pennsylvania를 참조하여 제조될 수 있다.

본 발명은 어떤 식으로든 임의의 특정 동물 또는 특정 종의 치료로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 특히 인간의 치료에 유익할 것으로 판단되며, 또한 수의과, 특히 개 및 고양이와 같은 애완동물의 치료, 가금 예컨대 소, 말 및 양과 비인간 영장류, 큰 솟과 동물, 고양이과 동물, 유제동물 및 개과 동물을 포함하는 동물원 동물의 치료에도 유용할 것이다.

화합물은 임의의 적합한 투여량으로 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있다. 경구, 경피 또는 비강내 투여가 보다 나은 편리성 및 수용성(acceptibility)으로 인해 바람직하다. 유효량은 치료될 증상의 성질, 치료될 환자의 나이, 체중 및 기본 건강상태에 따라 달라질 것이다. 담당 의사 및 수의사의 결정에 따라 정해질 것이다. 적절한 용량은 기술분야의 주지된 방법을 사용한 실험을 하여 시행착오를 통해 용이하게 결정될 수 있을 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 이제 하기의 일반적 방법 및 실험적 예를 단지 참조로 하여 기술 될 것이다.

본 명세서의 목적을 위해, 용어 "포함하는"은 이로 제한하는 것은 아니나 이를 포함하는"을 의미하며, "포함한다"도 상응하는 의미를 가진다는 것을 명백하게 이해될 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 단수를 나타내는 용어 "a", "an", 및 지시어 "the"는 맥락에서 명백하게 다른 지시가 없으면 복수형의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들면 "하나의 효소"에 대한 언급은 복수의 상기 효소를 포함하며, "하나의 아미노산"에 대한 언급은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것이다. 수치의 범위를 나타낸 경우, 이러한 범위는 상기 범위의 상한치 및 하한치를 포함한다는 것이 명백하게 이해될 것이다.

달리 정의가 없으며, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 임의의 물질 또는 방법을 사용하여 본 발명을 실시 또는 테스트할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법을 하기에 기술한다.

본 명세서에 사용된 약어는 하기와 같다:

C5aR C5a 수용체

Cit 시트룰린

dCha D-사이클로헥실아민

DPhe D-페닐알라닌

IL-6 인터루킨-6

ip 복강내

i.v. 정맥내

LPS 리포폴리사카라이드

MPO 미엘로퍼옥시다제

3-NP 3-니트로프로피온산

PBS 인산완충식염수

PMN 다형핵 과립구

PMSF 페닐메틸설포닐 플루오라이드

po 경구

sc 피하

TdT 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제

TNF-α 종양괴사인자-α

본 명세서 전반에 걸쳐, 통상의 단문자 및 삼문자 코드를 사용하여 아미노산을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "알킬"은 선형, 분지형 또는 환형의 치환 또는 비치환된 탄소원자수 1 내지 6, 바람직하게는 탄소원자수 1 내지 4의 알킬쇄이다. 가장 바람직하게는 상기 알킬기는 메틸기이다. 용어 "아실"은 치환 또는 비치환된 탄소원자수 1 내지 6, 바람직하게는 탄소원자수 1 내지 4의 아실을 의미하며, 가장 바 람직하게는 상기 아실기는 아세틸이다. 용어 "아릴"은 치환 또는 비치환된 호모시클릭 또는 헤테로시클릭 아릴기이며, 여기에서 고리는 바람직하게는 5 내지 6원이다.

"통상적" 아미노산은 글라이신, 루이신, 이소루이신, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 아스파테이트, 아스파라진, 글루타메이트, 글루타민, 시스테인, 메티오닌, 알지닌, 라이신, 프롤린, 세린, 쓰레오닌 및 히스티딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 L-아미노산이다.

"비통상적" 아미노산은 D-아미노산, 호모-아미노산, N-알킬 아미노산, 데하이드로아미노산, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 제외한 방항족 아미노산, 오쏘-, 메타- 또는 파라- 아미노벤조산, 오르니틴, 시트룰린, 카나바닌, 노르루이신, γ-글루탐산, 아미노부티르산, L-플루오레닐알라닌, L-3-벤조티에닐알라닌, 및 α,α-이치환된 아미노산을 포함하나, 이로 한정하는 것은 아니다.

일반적으로, 용어 "치료하는", "치료" 등과 같은 표현은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과의 수득을 위해 대상체, 조직 또는 세포에 특정 영향을 가하는 것을 의미한다. 상기 효과는 질환 또는 그 징후 또는 증상의 완전 또는 부분적인 예방과 관련된 예방적 효과일 수 있거나/있고, 질환의 부분적 또는 완전한 치료와 관련된 치료적 효과일 수 있다.

용어 "치료하는"은 척추동물, 포유류, 특히 인간의 질환의 치료 또는 예방을 포괄하는 것으로서, 질환에 걸린 것으로 진단되지는 않았으나, 질환이 걸리기 쉬울(predisposed)수 있는 대상체에서 상기 질환의 발생의 예방; 상기 질환의 억제, 즉, 질환의 발생의 정지; 또는 상기 질환의 효과를 경감 또는 약화시켜 즉 상기 질환의 효과가 퇴행하도록 하는 것을 포함한다.

본 발명은 질환의 경감에 유용한 다양한 약학 조성물의 용도를 포함한다. 본 발명의 한 구현예에 따른 약학 조성물은 화학식 I의 화합물, 그 유사체, 유도체 또는 염과 하나 이상의 약학적 활성제 또는 화학식 I의 화합물의 조합 및 하나 이상의 약학적 활성제를 담체, 부형제 및 첨가제 또는 보조제를 사용하여, 대상체에의 투여에 적합한 형태의 제제로 만들어 제조된다.

흔히 사용되는 담체 또는 보조제는 마그네슘 카보네이트, 티타늄 다이옥사이드, 락토스, 만니톨 및 기타 당, 탈크, 밀크단백질, 젤라틴, 녹말, 비타민, 셀룰로스 및 그 유도체, 동물 및 식물성유, 폴리에틸렌 글리콜 및 용매, 예컨대 멸균수, 알콜, 글리세롤 및 다수산기 알콜을 포함한다. 정맥용 매체(vehicle)은 액제 및 영양보충제를 포함한다. 방부제는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스를 포함한다. 기타 약학적으로 허용가능한 담체는, 그 전문을 참조하여 본 명세서의 일부를 구성하는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed. Williams & Wilkins (2000) and The British National Formulary 43rd ed. (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http://bnf.rhn.net)에 기술된 것과 같은, 염, 방부제, 완충액 등을 포함하는, 수용액, 비독성 부형제를 포함한다. 약학조성물에 포함되는 다양한 성분의 정확한 농도는 당업자의 통상적 기술에 따라 조정된다. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed., 1985)을 참조하라.

약학 조성물은 바람직하게는 투약단위로 제조되고 투여된다. 고형 투약단위체는 정제, 캡슐 및 좌약을 포함한다. 대상 체의 치료를 위해, 화합물의 활성, 투여방법, 질환의 성질 및 심각성, 환자의 나이 및 체중에 따라, 일일 투여량이 달라질 수 있다. 특정 상황하에서는, 그러나 일일 투여량을 가감하는 것이 바람직할 수 있다. 일일 투여량의 투여는 단독 투약 단위체 또는 수개의 작은 투약 단위체위 형태로 일 회 투여되거나 또는 특정 간격으로 투약량을 나누어 수 회 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 유효량을 국소 또는 전신 투여할 수 있다. 이러한 경우 유효량은 물론 환자의 질환의 심각성 및 체중 및 일반적 건강 상태에 의존한다 전형적으로, 생체 외에서 사용된 투여량은 약학조성물의 생체 투여량의 결정에 유용한 기준을 제공할 수 있으며, 동물 모델을 사용하여 세포독성에 대한 부작용의 치료를 위한 유효량을 결정할 수 있다. 다양한 고려할 사항이 예를 들면 Langer, Science, 249: 1527, (1990)에 기술되어 있다. 경구용 제형은 단단한 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있으며, 여기에서 활성성분은 불활성 고형 희석제, 예를 들면 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린과 혼합된다. 이들은 또한 연성 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있으며, 여기에서 활성성분은 물 또는 오일매질, 예컨대 땅콩유, 액체파라핀 또는 올리브유와 혼합된다.

수용성 현탁액은 활성제를 통상적으로 수용성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합되어 포함한다. 이러한 부형제는 예컨대 소디움 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 소디움알기네이트, 폴리비닐피롤리 딘, 트래거캔스검 및 아카시아검; 분산제 또는 습윤제와 같은 현탁제일 수 있으며, 이는 하기일 수 있다:

(a) 예컨대 레시틴과 같은 천연의 포스파티드;

(b) 예를 들면 폴리옥시에틸렌 스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드와의 축합산물;

(c) 예를 들면 헵타데카에틸렌옥시세타놀과 같은 긴사슬의 지방족 알콜과 에틸렌 옥사이드와의 축합산물;

(d) 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트와 같은 헥시톨 및 지방산 유래의 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드와의 축합산물 또는

(e) 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레이트와 같은 헥시톨 무수물 및 지방산 유래의 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드와의 축합산물.

약학조성물은 멸균의 주사용 수성 또는 지성 현탁액 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 상기 언급한 것과 같은 현탁제를 사용하여 공지의 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균된 주사용 제제는 멸균 주사용액 또는 비독성의 경구투여에 적합한, 예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액으로서의 희석제 또는 용매 중의 현탁제일 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 매체 및 용매는 물, 링거액, 및 등장의 염화나트륨 용액이다. 부가하여, 멸균 고정 오일을 용매로서 또는 현탁매질로서 통상적으로 사용한다. 이러한 목적을 위해, 합성의 모노 또는 디글리세리드를 포함하는, 임의의 무자극 고정 오일을 사용할 수 있다. 부가적으로, 올레산과 같은 지방산을 주사제의 제조에 사용할 수 있다.

화학식 I의 화합물은 또한 예컨대 작은 단층 소포체, 큰 단층 소포체 및 다층의 소포체와 같은 리포좀 전달시스템의 형태로서 사용될 수 있다. 리포좀은 예컨대 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 다양한 포스포리피드로부터 형성될 수 있다.

본 발명의 화학식 I의 화합물의 투여량은 킬로그램 체중당 약 0.5mg 내지 약 20mg의 수준일 것이며, 바람직한 투여량의 범위는 체중 킬로그램 당 하루 약 0.5mg 내지 10mg일 것이다 (환자당 하루 약 0.5g 내지 약 3g). 단일 투약 단위체의 생산을 위해 담체 물질과 함께 조합될 활성제의 양은 치료될 대상체 및 투여방법에 따라 변할 것이다. 예를 들면, 인간에의 경구 투여를 위한 제형은 총 조성물의 약 5 내지 95%의 범위에서 적합하고 편리한 양의 담체물질과 함께 약 5mg 내지 1g의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 투약단위체 형태는 일반적으로 일일 약 5mg 내지 500mg의 활성 성분을 포함할 것이다.

그러나, 임의의 특정 환자의 특이적 투여농도는 사용하는 특정 화합물의 활성, 나이, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 약물의 조합 및 치료가 진행중인 특정 질환의 심각성을 포함하는, 다양한 인자에 의존할 것이다.

부가적으로, 본 발명의 화합물의 일부는 물 또는 통상적 유기용매와의 용매화물을 형성할 수 있다. 이러한 용매화물이 본원 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 화합물은 부가하여 다른 치료제 화합물과 조합되어 기능적 조합물로 제공될 수 있다. 본 발명의 화합물의 활성을 제거하지 않는 한, 임의의 화학적 으로 합당한 약학적 활성제의 조합을 포함하는 것이다.

일반적 방법

펩타이드 합성

화학식 I의 환형 펩타이드 화합물을 본 발명자의 종전 출원인 PCT/AU98/00490 및 PCT/AU02/01427에 자세히 기술된 방법대로 제조하였으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 상응하는 선형 펩타이드가 Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg인 화합물 AcF-[OPdChaWR] (PMX53)를 특별히 참조로하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 상기 화합물로 제한되지 않는다는 것은 명백할 것이다.

국제특허출원 PCT/AU98/00490에 개시된 화합물 1-6, 17, 20, 28, 30, 31, 36 및 44와 최초로 PCT/AU02/01427에 개시된 화합물 10-12, 14, 15, 25, 33, 35, 40, 45, 48, 52, 58, 60, 66, 및 68-70은 인간 호중성 백혈구 상의 C5a 수용체에 대하여 상당한 길항효능(IC50 < 1 μM))을 가진다. PMX205, PMX53, 및 PMX273, PMX201 및 PMX218이 가장 바람직하다.

비록 개별적 화합물의 물리화학적 특성, 효능 및 생체이용률은 특정 치환체에 따라, 어느 정도 변하지만, 본 발명자들은 지금까지 테스트한 화학식 I의 모든 화합물이 넓게는 유사한 약리학적 활성을 가진다는 것을 발견하였다.

하기 기술된 일반적 테스트를 사용하여 G 단백질-연결 수용체, 특별히 C5a 수용체의 후보 억제제의 선별을 위한 초기 스크리닝에 사용할 수 있다.

약물의 제조 및 제형

인간 C5a 수용체 길항제 AcF-[OPdChaWR] (AcPhe[Orn-Pro-D-시클로헥실알라닌-Trp-Arg])를 상술한 바와 같이 합성한 후, 역상 HPLC를 사용하여 정제하고, 질량분광계 및 양자 NMR 분광기를 사용하여 특성을 완전히 분석하였다. C5a 길항제는 경구 투여용으로 증류수로 제제화된다.

수용체 결합 분석

종전에 기술(Sanderson et al, 1995)된 바대로 분리된, 신선한 인간 PMN, 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.5% 소혈청알부민, 0.1% 바시트라신 및 100 μM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)을 사용하여 분석을 수행한다. 4°C에서 분석을 수행하였으며, 완충액, 비표지된 인간 재조합 C5a (Sigma) 또는 테스트 펩타이드, Hunter/Bolton 방법을 사용하여 제조된 표지된 ¹²⁵I-C5a (~ 20 pM) (New England Nuclear, MA) 및 PMN (0.2 x 10⁶)을 후속적으로 웰당 200 μL의 최종 부피를 갖는 Millipore Multiscreen 분석 플레이트 (HV 0.45)에 추가한다. 4°C에서 60분 동안 배양 후에, 시료를 여과하고 상기 플레이트를 완충액으로 한번 세척한다. 필터를 건조한 후, 펀치로 돌여내어 LKB 감마계측기에서 계측한다. 비특이적 결합은 전형적으로 10 내지 15%의 총결합을 초래하는 1 mM 펩타이드 또는 100 nM C5a을 포함시켜 분석한다.

데이터는 비선형 회귀 및 Dunnett post-test로 통계처리하여 분석한다.

길항제 활성에 대한 미엘로퍼옥시다제 방출 분석

세포를 종전에 기술한 바대로 분리하여(Sanderson et al, 1995), 사이토샬라신 B(5μg/mL, 15 min, 37°C)와 인큐베이션한다. 0.15% 젤라틴 및 시험 펩타이드를 포함하는 행크 평형염용액 및 시험 펩타이드를 96웰 플레이트(총 부피 100 μL/웰)에 첨가한 후, 25 μL 세포 (4xlO⁶/mL)를 첨가한다. 각 펩타이드의 C5a에 대한 길항 효능을 평가하기 위하여, 세포를 각 펩타이드와 함께 37°C에서 5분간 인큐베이션한 후, C5a (100nM)를 첨가하고, 추가로 5분간 배양한다. 이어서, 50 μL의 인산나트륨(0.1M, pH 6.8)을 각 웰에 첨가하고, 각 플레이트의 온도를 실온으로 낮추고, 25 μL의 동부피의 디메톡시벤지딘 (5.7 mg/mL) 및 H₂O₂ (0.51%)의 신선한 혼합물을 각 웰에 첨가한다. 상기 반응을 2% 아자이드 나트륨을 첨가하여 종료한다. Bioscan 450 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고, 대조군 수치(펩타이드가 들어있지 않음)에 대하여 보정하고, 비선형 회귀로 분석한다.

동물 및 세포 모델

숙신산 탈수소효소의 억제제인 3-니트로프로피온산(3-NP)이, 설취류 및 영장류에서 헌팅톤병에 특징적인 운동성 병변 및/또는 인지적 효과를 유발한다는 것은 잘 확립된 사실이다 (Brouillet et al, 1999; Palfi et al, 1996; Blum et al, 2001). 3-NP는 대사-유도된 무산소증을 만들어, 선조체 영역에서 선택적으로 신경세포의 죽음을 유발한다. 이러한 모델은 헌팅톤병 및 기타 다른 증상 치료용 후보 약물의 평가에 사용되어 왔다. 3-NP에 의하여 선택적인 선조체의 병변이 유발되기 때문에, 이러한 시스템은, 선천적 유기산대사이상인 타입 I 글루타르산 요증으로 고통받는 영아에 공통적인 급성 선조체 괴사의 모델로서 제시되기도 하였다(Strauss and Morton, 2003). 혈액뇌장벽, 글루타메이트성 흥분독성, 글루타메이트 운반 및 도파민 독성대한 3-NP의 효과로 인해서, 상기 모델은 뇌졸증, 혈액뇌장벽의 부전, 신경퇴행성 또는 신경면역성 질환, 및 신경/아교세포 죽음의 모델로서 유용한 것으로 또한 제시되어 왔다 (Nishino et al, 2000). C3/C4 수용체의 발현이 이러한 모델의 선조체 병변에서 검출되기도 하였다(Shimano et al, 1995).

돌연변이 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 (SOD1)인 SOD1 G93A를 발현하는 트렌스제닉 래트는 잘 알려진 ALS 동물 모델로서, 후보 치료화합물의 테스트에 널리 사용된다. SODl G93A를 발현하는 트랜스제닉 래트는 약 115일경에 뒷다리가 약해지게된다. 이러한 동물에서 관찰된 병리적 현상은, 질환 말기에 아스트로글리알 글루타메이트 전달체인 EAAT2가 현격히 손실되는, SOD1 돌연변이체 마우스 모델에 관찰된 병리적 현상과 매우 유사하며, 이는 ALS 병인에 있어서 EAAT2 부전의 역활을 뒷받침하는 것이다. 이러한 전달체는 세포외 글루타메이트의 농도를 낮게 유지하는 주요 수단이며, 이의 손실은 세포외 글루타메이트의 농도를 증가시켜, 운동 뉴런의 흥분독성 퇴행을 유발한다. EAAT2 발현에 있어 최초의 변화는 운동 뉴런의 손실 전에 검출된다 (Howland et al, 2002).

헌팅톤병에 대한 두 가지 트랜스제닉 마우스 모델이 있으며, 하나는 인간 헌팅톤 유전자의 115- 삼핵산 반복서열을 갖고 있는 것이며 (Mangiarini et al, 1996), 다른 하나는 마우스 자신의 헌팅톤 유전자내에 인간 유전자의 중요한 제1 엑손을 가지고 있다.

향상된 초록 형광단백질에 융합된 60 또는 150 글루타민을 포함하는, N-말단이 절단된 헌팅톤 단백질을 발현하는 Neuro2a 세포와 같은 세포 모델이 보고되었다 (Wang et al, 1999).

근육약화 및 불임을 포함하는, 인간 질환 증상의 대부분을 나타내는, 케네디병(척수 및 연수 근육퇴행위축증)에 대한 마우스 모델도 최근에 개발되었다 (McManamny et al (2002).

척수소뇌성 실조증에 대한 마우스 모델도 보고되었다 (Klement, I.A. et al. Cell 95, 41-53 (1998)).

일반적 실험 방법

달리 언급이 없으면, 본 연구에 사용된 3-NP 신경독성 유도 방법은 Blum et al (2001; 2002)의 방법과 유사하나, 본 발명에서는 5일간 하루 56 mg/kg을 사용한 대신에, 7일간 하루 42 mg/kg을 사용한 점이 다르다. 요약하면, PBS (0.1 M, pH 7.4) 중의 90 mg/mL의 3-NP 용액을 제조하여 5M NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 맞추었다. 상기 용액으로 채워진 Alzet 삼투성 미니펌프 (model 2MLl, 7일 동안 10μL/hr로 전달함)를 12주의 수컷 루이스 래트에게 장착하여, 각 래트에게 정확하게 하루에 2 mg/kg이 들어가게 한다.

래트를 개별 케이지에 넣는다. 래트를 케타민, 자일라진 및 졸라자팜으로 마취한다. 펌프를 견갑골사이의 절개부분을 통하여 피하로 상기 각 래트의 등으로 삽입한 후, 절개부분을 상처용 클립으로 봉한다. 마취로부터 깨어난 후, 먹이 섭취, 체중 및 신경계를 그 후 7일에 걸쳐 매일 관찰 평가한다. 실험군에 대한 정보가 없는 관찰자에 의해 통상의 방법에 따른 신경계 및 행동에 대한 평가를 여러 시점에서 수행한다.

래트를 하기의 군으로 나눈다:

테스트 3-NP 투여 2일전(-2일)부터 실험 종료시까지, 음용수에 넣거나, 피하 주사 또는 위삽관을 이용한 경구투여를 통하 여 시험물질로 처리됨

샴테스트 샴 대조군; 3-NP 없음

비처리 3-NP만 투여하고 다른 치료는 없음

비교군 인플릭시매브 (0일에 5mg/kg 1회 정맥 주사) 및 이부프로 펜 (음용수로 30 mg/kg 공급)

점수는 다음과 같다:

근육긴장이상:

근육긴장이상 없음 - 0

한쪽 뒷다리의 간헐적 근육긴장이상 - 1

두쪽 뒷다리의 간헐적 근육긴장이상 - 2

뒷다리에 영구적 근육긴장이상 - 3

보행장애:

정상보행 - 0

조화되지 않은 보행 및 동요 - 1

횡와:

약한 횡와 - 1

(옆으로 누워있으나 자극될 경우 비조화된 움직임을 보임)

거의 죽을 것 같은 횡와 - 2

케이지 웅켜잡기:

앞발로 케이지를 웅켜잡을 수 있음 - 0

앞발로 케이지를 웅켜잡을 수 없음 - 1

상승 플랫폼 테스트:

플랫폼에 10초간 있을 수 있음 - 0

플랫폼에 10초간 있을 수 없음 - 1

총 점수: 8

본 연구의 완료 후, 래트를 자일라진 및 케타민으로 강하게 마취한다. 상기 래트에 소디움 나이트라이트 약 100mL을 관류주입하여 혈액을 제거한 후, 대략 400ml의 포름알데하이드 용액을 사용하여 뇌를 제자리 고정한다. 뇌를 이어서 조심해서 제거한 후, 조직학 분석전에, 3일 이상 포름알데하이드 용액에 보관한다. 슬라이드를 크레실바이올렛으로 염색한 후, 광학현미경으로 관찰한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 화합물 구조를 보여준다.

도 2는 3-NP 래트 모델에서의 PMX53의 효과에 대한 예비 연구의 결과를 보여준다.

A: 체중 변화;

B: 먹이 섭취량;

C: 신경/행동 점수;

D: 대표적 크레실 바이올렛으로 염색된, 대조군(Sham)(A), 비처리(B) 및 PMX53-치료(C) 래트의 선조체 단면으로 상기 부위에서의 세포괴사의 정도를 보여준다.

도 3은 PMX53 또는 비교 약물을 위삽관을 이용하여 경구 투여한 실험 결과를 보여준다. A; 7일째의 체중 변화; B: 7일째의 먹이 섭취량; C: 신경/행동 점수; D: 대표적 크레실 바이올렛으로 염색된, 대조군(Sham)(A), 비처리(B) 및 PMX53-처리(C) 및 PMX205-처리(D) 래트의 7일째의 선조체 단면으로 상기 부위에서의 세포 괴사의 정도를 보여준다.

도 4는 실시예 2에 보고한 보다 광범위한 연구 결과를 보여준다.

A; 7일째의 체중 변화;

B: 7일째의 먹이 섭취량;

C: 신경/행동 점수;

D: 래트 뇌의 니슬-염색된 단면 분석으로 결정된 병변의 크기.

도 5는 실시예 2의 래트 뇌의 단면의 조직학적 및 조직화학적 검사 결과를 보여준다. (a) 헤마톡실린 및 에오신 염색 (b)나프틸 에스터라제 염색 (c) 세포사멸의 검출을 위한 TUNEL 염색.

도 6은 실시예 2의 래트 뇌의 단면을 면역조직화학적으로 분석한 결과를 보여준다.

도 7은 트랜스제닉 ALS 래트모델을 사용한 본 발명의 화합물의 치료효과를 보여준다.

(a) 운동기능의 상실 개시 시기;

(b) 생존률(%);

(c) 시간의 경과에 따라, 각 군에서 운동이상 증상의 개시를 나타내는 래트의 백분률;

(d) 최초 체중감소와 운동이상 증상 개시 사이의 지연.

도 8은 i.v. 주사 후의 뇌에서의 본 발명의 화합물의 농도를 보여준다.

실시예 1 PMX53의 영향에 관한 기초실험

예비실험을 통하여 7일간 하루에 42 mg/kg의 투여량이 본 모델에서 재현성 있는 결과를 가져오는 것으로 나타났다. 작은 규모의 기초연구를 수행하여 본 모델시스템에서의 PMX53의 효과를 테스트하였다. 본 연구에서 PMX53로 처리된 래트를 샴 및 비처리 대조군과 비교하였다. 하기와 같이 총 12마리의 래트를 사용하였다:

샴 2

비처리 5

PMX53 5

PMX53을 3-NP 투여 2일 전부터 시작하여, 매일 2 mg/kg의 투여량으로 음용수에 넣어 투여하였다. 동물들은 먹이를 먹지 않아서, 물도 마시지 않았을 수 있기 때문에, 이렇게 PMX53 처리된 동물에게 피하주사로 0, 3, 6 및 8일에 1 mg/kg을 또한 투여하였다. 후속 실험에서 -2일부터 위삽관을 사용하여 동물에게 매일 투여하여 상기와 같은 잠재적 혼란을 피하였다. 이러한 초기 실험에서, 펌프를 7일 후에 제거하고, 피부를 약한 할로세인 마취제하에서 봉합한 후 다시 7일간 매일 관찰하였다.

결과는 도2A-2D에 나타낸다. 이러한 결과는 비처리 및 PMX53 처리된 래트 모두에서 회복 후 체중 및 먹이 섭취가 감소한 반면, 샴 대조군의 래트는 실험기간에 걸쳐 계속적 성장을 나타내었다(도 2A 및 2B). PMX53 처리된 래트는 5-7일에 체중감소가 유의적으로 감소되었으며(P<0.05, n=5; 도 2A), 먹이섭취도 5-7일에 현저히 증가하였다. 비처리 래트는 3-NP 주입기간에 걸쳐, 4일째부터 시작하여 7일째에 피크를 나타내며 신경/행동 점수에 있어 급격한 증가를 나타내었으며, 그 후 12일째 (즉, 주입 종료 후 5일) 단지 약하게 증가한 수준으로 감소하였다. 대조적으로, PMX53-처리된 래트는 7일째 피크를 나타내며, 그 후 단지 약하게 상승된 수준정도로 감소하였다. 점수에 있어 약간의 상승만을 나타내었으며, PMX53-처리된 래트는 4-9일에 유의적으로 감소된 신경/행동 점수를 나타내었다 (P<0.05, n=5; 도 2C). 샴-처리된 래트는 실험기간에 걸쳐 점수에 있어 유의성 있는 변화를 보이지 않았다.

조직학적으로, 본 예비연구에서 비처리 래트 유래의 뇌의 선조체 단면에서 종전에 발표한 연구결과와 일치하는 세포괴사 및 병변이 관찰되었다 (도 2D). 그러나, PMX53로 처리된 래트는 선조체 영역에서 괴사성 세포의 수가 대조군과 비교하여 적었다.

7일 후에 모든 래트가 회복하는 것으로 나타났기 때문에, 그룹간 가장 큰 차이를 보이는 기간, 즉, 최초 7일에 실험을 중단하는 것으로 결정하였기 때문에 펌프를 제거할 필요성이 없었다.

실시예 2 다른 제제와의 비교

PMX53의 효과를 화학식 I의 제2 화합물, PMX205 (하이드로시나메이트- [OpdChaWR] (HC-[OPdChaWR]) 및 공지의 항염증제 이부프로펜 및 인플릭시매브와 비 교하였다. 래트의 군 및 각 군의 래트의 수는 다음과 같다:

샴 4

비처리 6

PMX53 4

PMX205 4

이부프로펜 5

인플릭시매브 4

3-NP 투여 2일 전부터 PMX53 (10 mg/kg/day) 및 PMX205 (10 mg/kg/day)를 매일 위삽관으로 경구투여하고, 이부프로펜 (30 mg/kg/day)은 음용수로 투여하였다. 인플릭시매브는 0일에 5mg/kg의 양을 일회 정맥주사하였다.

결과는 도3A-3D에 있다. 도 2A 및 2B 는 7일 후의 체중의 증가 정도 및 먹이 섭취가 실시예 1에서 관찰된 것과 유사함을 나타낸다. 신경/행동 점수의 경우, PMX53 및 PMX205 모두 3-NP의 유해효과를 상당히 방어하는 반면, 인플릭시매브는 어떤 효과든 미미하였으며, 이부프로펜은 5일까지만 효과를 나타내었다 (도 3C). 도 3D에서 보는 바와 같이, 비처리 래트유래 뇌의 선조체 영역 단면의 조직학적 검사 결과, 현저한 세포괴사 및 실시예 1에서 관찰된 것보다 더욱 큰 육안으로 보이는 병변을 관찰하였다. PMX53로 처리된 래트는 선조체 영역에서의 세포괴사가 적었으며, 이는 실시예 1의 PMX53-처리된 래트의 단면과 유사한 것이었다.

많은 수의 동물 및 본 발명의 추가의 화합물, PMX201을 사용하여 실험을 계 속하였다. 부가하여, 뇌의 병변의 크기를 니실 염색약으로 염색된 뇌 단면의 사진을 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 동물의 군의 다음과 같다:

비처리 26

PMX53 21

PMX205 19

PMX201 3

인플릭시매브 10

이부프로펜 12

상기 결과를 도4에 요약하였으며, 테스트한 모든 세 가지의 PMX 화합물은 3-NP의 유해성을 개선하였다. PMX53 및 PMX205의 효과는 테스트한 모든 변수에 있어 통계적으로 유의하였다; 그러나, 사용가능한 화합물이 충분치 않아 PMX201로 테스트한 동물의 수는 너무 적어 유의성을 평가할 수 없었다. 이 부분의 실험에 사용할 양의 화합물 PMX201이 확보되어, 실험이 진행 중에 있다.

실시예 3 PMX53 유사체의 효과

화학식 I의 하기 화합물을 실시예 2에 기술한 바와 동일한 방식으로 테스트한다:

PMX205: HC-[OPdChaWR]

PMX273: AcF-[OPdPheWR] PMX201:

AcF-[OPdChaWCitrulline]

PMX218: HC-[OPdPheWR]

모든 약물은 -2일부터 일일 10 mg/kg의 양으로 위삽관으로 투여하였다. 만약 상기 투여량이 효과적인 것으로 판명되며, 일일 3 및 1 mg/kg의 투여량 또는 이보다 적은 투여량도 테스트하여 투여량에 따른 반응을 결정하였다. PMX53에 대한 투여량-반응 관계도 결정한다.

이러한 제제의 효과를 또한 인플릭시매브 (5mg/kg 일회 정맥주사, 0일) 및 음용수 중의 이부프로펜(30 mg/kg)과 비교하였다.

실시예 4 실시예 2 유래의 시료의 조직학적 및 조직화학적 검사

실시예 2에 사용한 래트 유래의 뇌조직의 파라핀 단면을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 현미경하에서 관찰하였다. 도 5a에서 보는 바와 같이, 병변의 주위 및 병변내에 염증세포가 상당히 침투해 있었으며, 이는 도 5b에 나타낸 바와 같이 나프틸에스터라제로 염색된 호중성 백혈구에 대한 특이적 염색결과로 확인되었다.

TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)분석 (Gavrieli, Y., et al. (1992) J. Cell. Biol. 119, 493.)은 세포사멸의 중요한 생화학적 특징인 핵의 DNA 절편화를 측정한다. 상기 방법을 사용하여, 척수근육위축증의 한 형태인 워드니그-호프만병에서의 신경 뉴런의 세포사멸을 증명하였다 (Simic et al, 2000). 따라서, 표준키트 (ApopTag Plus/TUNEL method; Chemicon)를 사용하여 뇌단면에 대하여 TUNEL분석을 하였다. 관심있는 부위를 포함하는 뇌의 선조체 부분을 슬라이드에 고정하고 탈파라핀화하였다. 슬라이드를 이어서 프로티나제 K (20μg/mL)로 예비처리하고, 내인성 퍼옥시다제를 3% 과산화수소로 없앴다. 이어서, 평형 완충액을 첨가한 후, TdT 효소를 넣고 1시간 배양하였다. 시료를 이어서 세척하고, 항-디그옥시제닌 컨쥬게이트를 넣고 30분간 반응하였다. 퍼옥시다제 기질(디아미노벤지딘)을 첨가하고, 6분간 발색하였다. 이어서, 시료를 0.5% 메틸 그린으로 카운터염색하고, Permount로 마운트하였다. 단편을 각 단계사이에서 PBS (0.1 M, ph 7.4)로 세척하였다. 도 5c는 병변에 사멸된 세포가 있음을 명백하게 보여준다.

모든 경우에, C5a 수용체 길항제 PMX53 및 PMX205로의 처리는 호중성 백혈구의 침윤을 완전히 예방하고 세포사멸을 감소시켰다.

실시예 5 면역조직화학적 분석

실시예 2의 래트 뇌의 단면을 다양한 보체 성분을 특이적으로 인식하는 항체로 또한 염색하였다. 표준 키트 (IHC Select; Chemicon)를 사용하여 단면을 C3, C9 및 C5a 수용체에 대하여 염색하였다. C5a 수용체 (C5aR) 염색의 경우, 1차 모노클론 항체인 마우스 항-래트 C5aR는 HyCuIt Biotechnology로부터 구입하였다. 상기 항체는 래트 C5a 수용체에 특이적인 것으로 보고되었다 (Rothermel et al., 2000). 관심있는 부위를 포함하는 뇌의 선조체 단면을 슬라이드에 고정한 후 파라핀을 제거하였다. 슬라이드를 사이트레이트 완충액(pH 6.0)으로 40분간 800℃에서 처리하여 항원을 노출시켰다. 슬라이드를 이어서 혈청으로 블록한 후 1:100으로 희석된 상기 1차 항체로 처리하여 2시간 동안 인큐베이션하였다. 내인성 퍼옥시다제를 이어서 3% 과산화수소로 없애고 2차 항체(토끼 항-마우스 IgG)를 첨가한 후 2시간동안 인큐베이션하였다. 단면을 이어서 스트렙타빈-말 래디쉬 퍼옥시다제와 인큐베이션하고 디아미노벤지딘으로 6분간 또는 발색시까지 인큐베이션하였다. 단면을 이어서 퍼마운트로 마운트하였다. 모든 단면을 각 단계사이에 PBS로 세척하였다.

C3 염색의 경우, 토끼 항-래트 C3 항체는 Bethyl Laboratories로부터 구입하였다. 상기 폴리클론 항체는 어느 정도 특징이 밝혀진 상태이다 (Juli-an et al., 1992). C9 염색의 경우, 토끼 항-래트 C9 항혈청을 Prof BP. Morgan (University of Walos College of Medicine, Cardiff)로부터 수득하였다. 상기 항체는 특징이 잘 밝혀져 있다(Linington et al., 1989). 이들 항체는 상술한 바대로 사용하였으나, 단 항체를 1:10으로 희석해서 사용하였으며, 염소 항-토끼 IgG 2차 항체를 사용하였다. C5a 수용체에 대한 염색결과를 보여주는, 대표적인 결과를 도6에 나타낸다. 어둡게 염색된 세포가 C5a 수용체를 발현하는, 아마도 활성화된 마이크로글리아이며, 병변의 가장자리에서 발견된다. 샴-처리된 동물은 검출가능한 염색은 없었다.

보체 성분인 C3 및 C9 및 C5a 수용체의 강한 상향조절이 병변의 가장자리에서 또한 관찰되었다. 이는 보체활성 및 이와 동시에 증가된 C5a 수용체 발현이 본 모델의 병리과정에서 중요한 과정임을 나타내는 것으로, 본 발명의 C5a 수용체 길항제에서 관찰된 현저한 치료 효과를 설명하는 것이다. 세포를 죽음에 이르게 하 는, 뚜렷하지 않은 외상, 즉 마이토콘드리알 허혈 후, 이들 래트의 뇌에서의 이러한 보체의 현저한 상향조절은, 뇌에서의 보체의 활성 및 상향 조절이 다양한 종류의 뇌외상, 예컨대 뇌졸증, 외상 및 신경퇴행성 증상에서 작동하는 공통적 경로일 수 있음을 제시하는 것이다.

실시예 6 3- NP 모델에서의 추가의 연구

보체 C5a는 뇌세포의, 상향 조절된 C5a 수용체에 결합하여, 감염세포의 침윤을 촉진하여 궁극적으로 병변(뇌세포 괴사/사멸)을 형성하는 것으로 가정되었다. 뇌에서의 보체의 활성이 가시적 병변의 검출 전에 발생하는 지를 알기위하여, 현재 본 모델을 이용하여 7일 동안 다양한 시점에서 래트에 대한 검사가 진행 중이다.

C5a 길항제가 병리현상을 회복시킬 수 있는지를 확인하기 위하여 다른 연구도 진행중에 있다. 본 발명자들은 현재 래트에게 3-NP 투여 개시 후 2일째부터 PMX205(10 mg/kg/day po)를 투여하고 있다.

선조체 세포 배양 또는 선조체 유래의 뇌절편을 3-NP의 존재 중에서 시험관내 배양하여 세포손상을 유도한다. 이어서, C5a 길항제를 상기 배양물에 첨가하여 이의 손상 예방 능력을 평가한다. 생체내에서 검사를 수행할 후보물질 선별용의 예비스크리닝 분석으로서도 유용할 것으로 기대된다.

실시예 7 ALS 모델에서의 C5a 수용체 길항제의 효과

한 카피의 돌연변이 SOD-1 유전자(G63A)를 갖고 있는 트랜스제닉 Sprague- Dawley 래트를 Australia의 Melbourne 소재의 Howard Florey Institute for Physiology and Medicine에서 구입하였다. 이들 래트는 태어난지 약 110 내지 140일부터 자동적으로 급성 형태의 운동 뉴런 질환(MND; amyotrophic lateral sclerosis (ALS)))을 발병하며, 이는 인간에서 나타나는 증상과 매우 강한 유사성을 보인다. 실제, G63A 돌연변이는 가족력 형태의 ALS를 갖는 인간환자의 10-20%에서 발견되는 것과 동일한 돌연변이다.

이는 C5a 수용체 길항제의 효능을 연구하기에 적합한 모델이다. 초기연구에서, 수컷 래트를 PMX53 (n=6), PMX205 (n=2), 또는 비처리 대조군으로서 물(n=10)만으로 처리하였다. 래트가 태어난 지 70일째부터 처리를 시작하였다. 약물은 약 1 mg/kg/day의 투여량으로 음용수에 넣어 투여하였다. 3마리의 야생형(WT) Sprague-Dawley 래트(G63) 그룹을 샴 대조군 동물로서 포함시켰다. 이어서, 하기의 스케일을 사용하여, 래트에 대하여 운동장애의 징후를 모니터하였다:

뒷 다리(좌 및 우의 점수):

비정상적이지 않음

두드러진 근육약화 (꼬리를 잡고 들었을 경우, 다리를 벌리거나 또는 몸을 떪

극심한 근육 약화(등을 굽힐 수 (dorsifex)없음)

다리 마비

걸음걸이:

비정상적이지 않음

비정상 걸음걸이, 뒤뚱거림 등

바로잡기 반사 (등을 대고 눕힐 경우 다시 일어나는 시간):

0초 (등을 대고 눕힐 수 없음)

<1 초 (곧장 다시 일어날 수 없음)

<5 초

5-10초

>10 초 -->이 시점에서 안락사시킴

체중을 또한 매일 기록하였다. 바로잡기 반사의 점수가 4에 달하거나 또는 최고 체중의 >20%가 줄어든 경우, 래트를 안락사 시켰다.

안락사 후, 각 래트에 식염수(100mL)을 관류주입하고, 이어서 포름알데히드를 주입하여 조직을 고정하였다. 뇌, 척수 및 양다리의 장딴지 근육을 잘라내어 조직학, 조직화학적 검사 및 전자현미경으로 관찰하였다.

결과는 도7에 나타냈다. 도 7A에서 보는 바와 같이, 치료를 하지 않은 비처리 래트는 101일령부터 운동기능 상실의 증후를 나타내기 시작하였으며, 평균 발병시기는 116 + 4 일령이다. PMX53로 처리된 래트는 평균 발병 일령이 124 ± 10일인 반면, PMX205-처리된 래트의 평균 발병 일령은 138 ± 7 일이다. 그러므로, PMX205-처리군에서 발병이 명백하게 늦춰지며, PMX53-처리군의 경우는 이보다 덜하 다. PMX205로 나타난 효과를 확인하기 위하여, 본 실험을 보다 많은 수의 동물을 사용하여 반복하는 중이다.

도 7B는 시간에 따른, 상이한 군에서 래트의 생존률을 보여준다. 마찬가지로, 두 마리의 PMX205-처리된 래트에서는 사망률이 뚜렷이 지연되었다. PMX53-처리군에서는 비처리 동물과 비교하여 개선 정도가 적었다.

도 7C는 상이한 군에서 시간에 따라 운동이상 증상이 발생한 래트의 퍼센트이다. 도 7C의 생존률 결과에서와 같이, 두 마리의 PMX205-처리된 래트에서는 운동이상 증상의 발생시기가 뚜렷이 지연되었다. PMX53-처리된 래트에서는 비처리 동물과 비교하여 개선 정도가 적었다.

도 7D는 C5a 길항제-처리된 래트에서, 최초 체중감소와 최초로 관찰된 운동기능 손실사이의 기간에 있어 증가가 있었다. 이러한 결과는 특히 PMX205-처리된 래트에서 현저하였다.

이러한 결과는 약물-처리된 래트에서의 생존률의 증가가 질환진행 과정에서의 지연으로부터 초래되었음을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 C5a 수용체 길항제가 본 연구의 트랜스제닉 MND 래트 모델에서 치료적 효과가 있음을 나타내는 것이다. 특히, 이러한 결과는 PMX205가 PMX53보다, 보다 큰 효능 및/또는 효과를 갖고 있음을 나타낸다. 이는 다른 동물 모델에서 상기 두 화합물을 사용한 실험에서 관찰된 결과와 일맥상통하는 것이다. 그러므로 본 연구의 모델에서의 추가를 연구를 위해 큰 배치(batch)의 PMX205를 제조하였다.

실시예 8 C5a 수용체 길항제로 처리된 트랜스제닉 래트 유래의 조직에 대한 연구.

C5a 수용체 길항제가 운동 뉴런 세포의 죽음을 감소시킴으로써 생존률을 증가시키는지 여부를 결정하기 위하여, 실시예 7 유래의 척수 및 뇌시료에 대하여 조직학적 연구를 수행하여 척수 및 운동 피질의 운동 뉴런의 수를 측정한다. C5a 길항제가 근육자체의 퇴행을 예방할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 전자현미경을 사용하여, 뒷다리의 장딴지근육에 대하여 종판 퇴행의 징후에 대하여 검사가 수행된다. 보체의 상향조절이 본 질환의 발병과 연관되어 있는지 여부를 결정하기 위하여, C5a 수용체를 포함하는, 상이한 보체 성분에 대한 항체를 사용하여, 잘라낸 척수 및 운동 피질을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 면역화학적 염색을 한다.

실시예 9 PMX205 로의 처리 시기의 효과

실시예 7에서, 본 발명자들은 C5a 수용체 길항제를 예상되는 질환 증상의 발생 약 1-2개월전에 투여할 경우에 유익한 효과가 있음을 관찰하였다. 수컷 SOD-1 래트 (n = 12)에게 28일령부터 PMX205 (음용수 중에 1 mg/kg/day )를 투여하여, 조기처리로 인해 치료효과가 향상되는지 여부를 결정하였다.

증상의 발생 후 다양한 시기에서 투여된 래트에 대한 효과를 검사하여, 약물 치료가 발병된 질환을 회복시킬 수 있는지를 관찰한다.

암컷 래트도 또한 검사한다.

실시예 10 PMX 화합물을 혈액뇌장벽을 통과하는가?

PMX 화합물이 혈액뇌장벽의 통과하는지 여부를 확인하기 위하여, 암컷 Wistar 래트 (250g 내지 300g)를 마취하고 이어서 3 mg/kg의 PMX53 (AcF- [OPdChaWR]), PMX205 (HC-[OPdChaWR]), PMX201 (AcF-[OPdChaWCit]) 또는 PMX200 (HC-[OPdChaWCit])를 대퇴혈관을 통하여 정맥주사하였다. 그 후 래트를 15분 동안 둔 후, 이 시점에서 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈장을 수집하였으며, 심장을 찔러서 150mL의 식염수를 관류주입하여 뇌로부터 혈액을 제거하였다. 이어서 뇌를 절제해냈다. 혈장 및 뇌시료를 준비하여 약동학적 분석을 수행하여 각 시료 중의 PMX 화합물들의 농도를 결정하였다. 결과는 도 8에 나타낸 바와 같이 혈액에서의 퍼센트 농도로서 각 뇌에서 결정된 농도로 나타냈다.

PMX 화합물로 처리된 모든 래트는 정맥 투여 후 15분에 어느 정도의 화합물이 뇌로 흡수되는 것으로 나타났다. PMX53, PMX205 또는 PMX201이 투여된 래트도 유사한 정도의 흡수 (~7%)를 나타냈으며, 반면 PMX200은 흡수정도가 이보다는 낮았다.

이들 결과는 C5a 수용체 길항제가 전신 투여 후 혈액뇌장벽을 통과할 수 있음을 보여주는 것이며, 시트룰린으로의 치환을 통한 상기 화합물의 말단 알지닌의 양전하의 제거가 흡수에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 더우기, 하이드로시나메이트 또는 시트룰린과의 치환을 통한 상기 PMX 화합물의 지질친화성의 증가도 또한 흡수에 영향을 미치지 않는다. 이는, PMX200의 경우를 제외하고는, PMX 화합물의 지속적이고 상대적으로 높은 흡수와 함께, 혈액뇌장벽을 통한 특이적 전달기 전을 나타내는 것일 수 있다.

하기와 같은 다양한 경로(i.v., i.p., s.c, p.o etc.)를 통한 투여를 통하여 뇌로의 상기 화합물 흡수의 자세한 약동학적 프로파일을 작성하여 혈액뇌장벽을 통한 PMX 화합물의 흡수를 추가로 조사한다. 이는 투여 후 다양한 시점에서 시료채취를 포함한다. 뇌척수액의 시료를 또한 화합물 투여 후 다양한 시점에서 취한다. 뇌로의 PMX 화합물의 축적을 또한 뇌에서 시료채취 전에 시간적으로 화합물을 주입하여 조사한다.

실시예 11 추가의 세포 및 동물모델에서의 테스트

상술한 바와 같이, 본 발명의 화합물의 헌팅톤병에의 효과를 추가로 조사하기 위한 시험관내 Neuro2a 세포를 이용한 세포모델 및 생체내 연구를 위한 트랜스제닉 모델의 사용이 가능하다. 척수소뇌성 실조증-1 및 캐네디병(척수 및 연수 근육퇴행위축증)용 마우스 모델도 알려져 있다.

화학식 I의 화합물은 시험관내에서 Neuro2a 세포모델을 통하여 일차로 스크리닝될 수 있다. 시험 화합물의 적절한 투여량은 통상의 시행착오를 통하여 용이하게 결정될 수 있다.

이러한 모델 및 3-NP 모델에서 유효한 것으로 발견된 화합물을 또한 하나 이상의 트렌스제닉 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 테스트할 수 있다.

먹이섭취 및 체중감소의 결과는 본 발명의 화합물이 최소의 독성을 가지고 있는 것을 나타내며, PMX53는 류마티스성 관절염 및 건선에서 임상시험이 진행중이 다. 기술분야의 당업자라면 본 명세서에서 열거한 신경계 및 신경퇴행성 증상의 치료에 필요한 화학식 I의 화합물의 효능 및 안정성을 테스트할 적절한 임상시험 프로토콜을 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명을 명확하고 잘 이해할 수 있도록 하기 위하여 어느 정도 자세하게 본 발명을 기술하였지만, 본 명세서에 기술된 구현예 및 방법은 본 명세서에 기술된 발명의 개념을 벋어나지 않으면서 변형할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에 참조한 참고문헌을 다음에 기술하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

참고문헌

Claims (31)

1. 염증과 관련된 신경계 또는 신경퇴행성 증상의 치료방법에 있어서, 상기 증상의 치료가 필요한 대상체에게, 유효한 양의 C5a 수용체 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 염증과 관련된 신경계 또는 신경퇴행성 증상의 치료방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 증상은 증가된 보체경로 활성과 연관된 증상인 것을 특징으로 하는 치료방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 억제제는

   (a) C5a 수용체의 길항제이며,

   (b) 실질적으로 작용제의 활성이 없으며;

   (c) 하기 화학식 I의 환형 펩타이드 또는 펩티드모방성 화합물로서,

   

   상기 식 중에서,

   A는 H, 알킬, 아릴, NH₂, NH-알킬, N(알킬)₂, NH-아릴, NH-아실, NH-벤조일, NHSO₃, NHSO₂-알킬, NHSO₂-아릴, OH, O-알킬, 또는 0-아릴이며;

   B는 알킬, 아릴, 페닐, 벤질, 나프틸 또는 인돌기, 또는 D- 또는 L-아미노산의 측쇄이나, 글라이신, D-페닐알라닌, L- 호모페닐알라닌, L-트립토판, L-호모트립토판, L- 타이로신, 또는 L-호모타이로신의 측쇄는 아니며;

   C는 D-, L- 또는 호모-아미노산의 측쇄이나, 이소루이신, 페닐알라닌, 또는 시클로헥실알라닌의 측쇄는 아니며;

   D는 중성 D-아미노산의 측쇄이나, 글라이신 또는 D-알라닌의 측쇄, 부피가 큰 평면 측쇄, 또는 부피가 큰 하전된 측쇄는 아니며;

   E는 부피가 큰 치환체이나, D-트립토판, L-N-메틸트립토판, L-호모페닐알라닌, L-2-나프틸 L-에트라하이드로이소퀴놀린, L-시클로헥실알라닌, D-루이신, L-플루오레닐알라닌, 또는 L-히스티딘의 측쇄는 아니며;

   F는 L-알지닌, L-호모알지닌, L-시트룰린, 또는 L-카나바닌의 측쇄, 또는 그 생동배체(bioisostere)이며;

   X는 -(CH₂)_nNH- 또는 (CH₂)_n-S-, n은 1 내지 4의 정수; -(CH₂)₂O-; -(CH₂)₃O-; -(CH₂)₃-; -(CH₂)₄-; -CH₂-COCHRNH-; 또는 -CH₂-CHCOCHRNH-이며, R은 임의의 통상적 또는 비통상적 아미노산의 측쇄임.
4. 제 3 항에 있어서, n은 2 또는 3인 것을 특징으로 하는 치료방법.
5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, A는 아세트아미드기, 아미노메틸기, 또는 치환 또는 비치환된 설폰아미드기인 것을 특징으로 하는 치료방법.
6. 제 5 항에 있어서, A는 치환된 설폰아미드이며, 치환체는 탄소원자수 1 내지 6의 알킬쇄, 또는 페닐 또는 톨루일기인 것을 특징으로 하는 치료방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 치환체는 탄소원자수 1 내지 4의 알킬쇄인 것을 특징으로 하는 치료방법.
8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B는 L-페닐알라닌 또는 L- 페닐글라이신의 측쇄인 것을 특징으로 하는 치료방법.
9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C는 글라이신, 알라닌, 루이신, 발린, 프롤린, 하이드록시프롤린, 또는 티오프롤린의 측쇄인 것을 특징으로 하는 치료방법.
10. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D는 D-루이신, D-호모루이신, D-시클로헥실알라닌, D-호모시클로헥실알라닌, D-발린, D- 노르루이신, D-호모-노르루이신, D-페닐알라닌, D- 테트라하이드로이소퀴놀린, D-글루타민, D-글 루타레이트, 또는 D-타이로신의 측쇄인 것을 특징으로 하는 치료방법.
11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E는 L-1-나프틸 또는 L-3-벤조티에닐 알라닌, 또는 L-페닐알라닌, L-트립토판 및 L-호모트립토판으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산의 측쇄인 것을 특징으로 하는 치료방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 C5a 수용체에 대한 길항활성을 가지며, C5a 작용제 활성은 없는 화합물인 것을 특징으로 하는 치료방법.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 마이크로몰라 수준의 농도보다 낮은 농도에서 강한 길항제 활성을 갖는 것을 특징으로 치료방법.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 IC50 < 25μM의 수용체 친화도 및 IC50 <lμM의 길항제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 치료방법.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 PCT/AU02/01427에 기술된, 화합물 1 내지 6, 10 내지 15, 17, 19, 20, 22, 25, 26, 28, 30, 31, 33 내지 37, 39 내지 45, 47 내지 50, 52 내지 58 및 60 내지 70으로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 치료방법.
16. 제 14 항에 있어서, 상기 화합물은 PMX53 (AcF[OP-DCha-WR]), PMX205(HC-[OPdChaWR]), PMX273 (AcF[OP-DPhe-WR]), PMX201 AcF[OP-DCha-WCit]) 또는 PMX218 (HC-[OPdPheWR]) 인 것을 특징으로 하는 치료방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 화합물은 PMX205 또는 PMX53 인 것을 특징으로 하는 치료방법.
18. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 혈액뇌장벽을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 치료방법.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증상은 선조체의 병변 및/또는 폴리글루타민 반복서열과 연관된 신경퇴행성 증상인 것을 특징으로 하는 치료방법.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 증상은 헌팅톤병, 척수 및 연수 근육퇴행위축증, 척수소뇌성 실조증, DRPLA(dentatorubral pallidoluysian atrophy), 선초체 손상, 및 유형 I 글루타르산 요증과 연관된 급성 선조체 세포괴사로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
21. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증상은 운동 뉴런 질환인 것을 특징으로 하는 치료방법.
22. 제 20 항에 있어서, 상기 증상은 근육위축가쪽경화증; 진행성 연수마비; 영아 및 소아형을 포함하는, 척수근육위축증; 쿠겔베르그-웰란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome); 듀센 마비(Duchenne's paralysis); 워드니그-호프만병(Werdnig-Hoffmann disease); 및 양성 국소근위축증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
23. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증상은 신경퇴행성 증상 및/또는 허혈성손상과 연관된 질환인 것을 특징으로 하는 치료방법.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 증상은 파킨슨병, 알츠하이머병, 윌슨병, 및 혈액뇌장벽의 부전과 연관된 질환을 포함하는, 뇌허혈 및 기타 신경계 질환의 후속으로 발병되는 병리적 증상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
25. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증상은 운동이상 질환 인 것을 특징으로 하는 치료방법.
26. 제 23 항에 있어서, 상기 증상은 진행성 핵상마비, 헌팅톤병, 대뇌 신경퇴행성 질환군(multiple system atrophy), 피질-기저핵 변성증, 윌슨병, 할러보르덴-스파츠병(Hallervorden- Spatz disease, 뇌의 철분 축적과 관련된 신경퇴행성 질환), 진행성 담창위축증, 도파-반응성 근긴장이상-파킨슨증, 경직, 알츠하이머병 및 비정상적 운동 또는 자세를 유발하는 기타 기저핵 질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 신경계 또는 신경퇴행성 증상 치료용의 하나 이상의 다른 제제와 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 다른 제제는 인플릭시매브 또는 C3a 억제제인 것을 특징으로 하는 치료방법.
29. 염증이 있는 신경계 또는 신경퇴행성 증상 치료용 의약의 제조에 사용되는, C5a 수용체 억제제의 용도.
30. 제 29 항에 있어서, 상기 증상은 증가된 보체 경로의 활성과 연관된 증상인 것을 특징으로 하는 용도.
31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 화합물은 제 3 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 정의된 화합물인 것을 특징으로 하는 용도.

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