KR20070029199A - Ｂ형 간염에 대한 치료제, 예방제 및 진단제 - Google Patents

Ｂ형 간염에 대한 치료제, 예방제 및 진단제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B형 간염(HBV) 프리-코어 단백질, 또는 이의 세포외 발현 생성물인 B형 간염 E 항원(HbeAg)에 의한 톨-유사(toll-like) 수용체의 발현의 조절을 제공한다. 이러한 발현을 조절하는 화합물은 동물에서 HBV 감염을 치료 및 예방하는 데 사용된다. 본 발명은 또한 HBV를 진단하는 방법, 및 진단 프로토콜에서 유용한 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 인간, 및 기타 동물 모델을 비롯한 기타 동물 종에서 병태를 모니터링하는 방법, 및 HBV에 의해 감염된 대상체의 징후 또는 다른 질병의 발달 상태를 제공하는 방법도 포함한다.

Description

Ｂ형 간염에 대한 치료제, 예방제 및 진단제{THERAPEUTIC, PROPHYLACTIC AND DIAGNOSTIC AGENTS FOR HEPATITIS B}
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 동물 종(species)의 감염을 치료 및 예방하는 데 유용한 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 HBV에 의한 감염 또는 다른 병태를 진단하는 방법, 및 진단 프로토콜에서 유용한 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 및 다른 동물 종(동물 모델 포함)의 병태를 모니터링하는 방법, 및 HBV에 의한 감염 또는 다른 병태의 발달에 대한 대상체 감수성의 지표를 제공하는 방법도 포함한다.
본 명세서에서 언급된 간행물의 상세 목록은 본 명세서의 마지막 부분에 기재되어 있다.
본 명세서에서 언급되는 어떠한 종래 기술도, 이 종래 기술이 어느 국가에서는 통상적인 지식의 한 부분이라는 점을 인정하거나 이를 시사하는 것이 아니며, 그러한 것으로 간주해서도 안 될 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 쇠약성 질환을 일으켜, 급성 간부전을 발생시킬 수 있다. HBV는 RNA 중간체를 통해 복제되는 DNA 바이러스이며, 이의 복제 시에 역 전사를 이용한다. HBV 게놈은 표면, 프리-코어(pre-core), 코어, 폴리머라제 및 X 유전자를 코딩하는 오버랩된 오픈 리딩 프레임(overlapping open reading frame)과 부분 이중-스트랜드의 DNA 구조를 가지는 복합체이다.
HBV 프리-코어/코어 유전자는 공-말단인 N-말달을 보유하는 HBcAg(코어 유전자에 의해 코딩됨) 및 HBeAg(프리-코어 유전자에 의해 코딩됨)의 합성을 조절하는 2개의 인-프레임(in-frame) 개시 코돈을 보유한다. 사실, 프리-코어 유전자는 다음의 2가지 형태의 동일한 단백질을 코딩한다: HBeAg 세포외 형태, 및 본원에서 P22라 언급되기도 하는 P22 및 P25 세포내 형태. 프리-코어 유전자 발현 생성물은 HBeAg/P22라고도 불린다. 세포외 단백질은 면역 매개성 바이러스 제거(clearance) 메커니즘에 대한 표적이다.
프리코어 단백질에 있어서, 번역은 상기 ORF의 첫 AUG로부터 개시되어, 시그널 펩티드를 코딩하는 프리C 영역이 있는 25 kD 폴리펩티드를 생성한다. 시그널 펩티드는 전구체 단백질을 ER에 삽입시킴으로써 작용하는데, 상기 펩티드는 절단되어 분비 경로를 통해 전달되는 17 kD 단백질 생성물이 된다. 17 kD 내지 25 kD의 단백질이 P22이다. 전달 도중, 염기성 C-말단 도메인은 절단되어 15 kD 내지 17 kD의 가용성 단백질이 생성되고, 이는 궁극적으로 혈청으로 분비되어 HBeAg로서 평가되지만, 일부는 외부 세포 막으로 혼입된다. HBeAg/P22는 생산적 바이러스 복제에 대해서는 요구되지 않는다.
HBcAg는 21 kD의 포스포단백질로서, 이의 합성은 제2 인-프레임 개시 코돈으로부터 개시되어 더 짧은 게놈성 전사체로부터 번역된다. HBcAg는 뉴클레오캡시드의 주 단백질 성분이다. C-말단 도메인은 높은 염기성을 띠며, 비-서열 특이적 핵 산 결합 도메인을 보유한다.
오버랩된 X 오픈 리딩 프레임(X-ORF) 영역에 존재하는 기본(basal) 코어 프로모터[BCP](뉴클레오티드 1744 내지 1804)는 프리-코어 영역과 코어 영역 모두의 전사를 조절하고, 2개의 mRNA, 즉 프리-코어 mRNA 및 프리-게놈성/C mRNA의 합성을 유도한다. 프리-코어 mRNA는 HBeAg/P22를 코딩하고, 프리-게놈성/C mRNA는 코어 단백질을 코딩한다. DNA 폴리머라제는 역 전사를 위한 주형인 프리-게놈성 RNA(pgRNA)로 작용한다.
HBeAg/P22 합성에 영향을 미치는 돌연변이 중 2개의 주요 그룹으로는 프리-코어 단백질 돌연변이(G1896A), 및 기본 코어 프로모터(BCP) 중 뉴클레오티드 1762 및 뉴클레오티드 1764에서의 돌연변이가 있으며, 이들 모두는 HBeAg/P22의 생성을 감소시켜 숙주 면역 반응을 증가시키나, 일부 환자에서는 이것이 일시적인 현상일 수 있고, 면역반응이 억제(immunosuppress)되지 않은 환자에서 발생하는 더 공격적인 간 질환과 명확한 상관관계가 없다. 프리-코어 돌연변이는 종종 비슷한 시점에서 발생하고, 종종 코어 유전자 돌연변이/결실과 관련이 있다.
프리-코어 정지(stop) 돌연변이 및 HBV 유전자형 간에는 상관관계가 존재한다. 뉴클레오티드 1896은 구아노신(G)이며, 인캡시데이션(encapsidation)과 관련이 있는 RNA 구조 요소인 엡실론(epsilon) 내에서 발견된다. 이는 뉴클레오티드 1858과 쌍을 이루는 염기이고, 뉴클레오티드 1896에서의 프리-코어 정지 돌연변이와 함께 뉴클레오티드 1858에서의 돌연변이가 엡실론의 스템-루프 영역 내에 존재하는 바이러스 염기쌍 생성을 강화시킬 수 있다. 유전자형 A HBV(유럽 일부 지역 및 북 미에서 가장 보편적인 유전자형)로 감염된 환자에서, 뉴클레오티드 1858은 C이다. 이 유전자형에서는 뉴클레오티드 1896에서의 돌연변이(G → A) 및 뉴클레오티드 1858에서의 돌연변이(C → T)가 스템-루프 구조를 안정화시키는 데 필요할 것이다. 유전자형 A HBV에서 뉴클레오티드 1858에서의 보상(compensatory) 돌연변이 없이, C-1858이 A-1896과 염기쌍을 이루고자 할 때 손상된 염기상이 발생하는데, 이는 패키징(packaging) 시그널의 스템-루프 구조를 불안정하게 만든다. 패키징을 위한 안정한 엡실론 없이, 감소된 인캡시데이션 및 이로 인한 복제의 감소로 복제-결핍성 바이러스가 발생할 수 있다. 따라서, 프리-코어 정지 코돈 돌연변이는 2개의 돌연변이가 발생되는 것을 필요로 하기 때문에 유전자형 A에서 그 빈도가 더 낮을 수 있다. 이와 대조적으로, 아시아, 아프리카, 지중해 연안 또는 중동 지역의 만성 HBV 보균자 중 70% 이상에서의 HBV 서열은 뉴클레오티드 1858에 T를 이미 보유하고 있다. 따라서, 안정한 스템-루프 쌍을 가진 프리-코어 돌연변이체를 얻기 위해서는 뉴클레오티드 1896에서의 단일 돌연변이만이 필요하다. 뉴클레오티드 1858이 T인, 상기 다른 유전자형(유전자형 B, C, D 및 E)을 갖고 있는 환자에서의 이러한 높은 빈도의 프리-코어 정지 돌연변이체 HBV는 엡실론에 대한 안정한 스템-루프 구조 및 정지 코돈을 발생시키는 데 단일 돌연변이(G1896A)만이 필요하기 때문이다(Hunt et al, Hepatology. 31(5): 1037-44, 1994; Lok et al, Proc Natl Acad Sci USA. 91(9): 4077-81, 1994).
BCP, 특히 T-1762 및/또는 A-1764를 일으키는 뉴클레오티드 1762 및 뉴클레오티드 1764에서의 돌연변이는 면역반응이 억제된 환자에서 뿐 아니라, 지속 감염, 전격성 간염을 보유하는 여러 환자에서 검출된 바 있다. T-1762 및 A-1764에서의 이중 돌연변이는 HBeAg/P22의 감소(사라지지는 않음) 및 바이러스 부하(load)의 증가와 관련이 있다(Gunther et al, Adv Virus Res. 52: 25-137, 1999; Hunt et al, 1994 supra). 일반적으로, 이러한 프리-코어 변화의 패턴은 일부 유전자형 A로 감염된 환자에서 발견된다.
코어 단백질은 2개의 주요 도메인, 즉 아미노산 위치 144에 이르는 N-말단 어셈블리(assembly) 도메인 및 기능적으로 중요한 아르기닌-풍부 C-말단 도메인으로 나눌 수 있다. C-말단 도메인은 핵 수송과 관련이 있으면서, 프리-게놈성 RNA의 결합 및 게놈 복제에도 필요하다. 흥미롭게도, HBeAg-양성 면역 관용기(immune tolerant phase)에서 환자로부터 얻은 HBV의 코어 단백질 서열은 아미노산의 변화가 없거나 거의 없는데, 이는 면역 압력이 더 낮으면 의학적으로 입증되는 돌연변이가 덜 발생할 수 있음을 시사한다. HbcAg 및 HBeAg 아미노산 변화의 발생(prevalence)은 프리-C 결함의 발생과 매우 유사하며, 이는 만성 감염의 여러 단계에서 발견된다. 그러나 일단 환자가 면역 재활성화(제거) 상태에 접어들면, HbcAg 및 HBeAg 아미노산 변화의 평균 속도가 5개 이상 증가하여, 면역 반응 및 이에 따른 바이러스 "선별"에 의해 영향을 받을 수 있는 36 핫-스팟(hot-spot) 위치로 밀집된다. 상기 핫-스팟 위치는 주요 세포독성 T-림프구(CTL)[아미노산 18 내지 30] 및 T-헬퍼(TH) 세포[아미노산 50 내지 70] 영역에, 그리고 각각 아미노산 잔기 75 내지 90, 및 120 내지 140에서 2개의 B-세포[HBc/el 및 HBc/e2] 에피토프에 결 합한다(Gunther et al, 1999 supra).
만성 HBV 감염된 특정 집단을 이해하기 위해서는 HBV 감염의 자연 병력을 이해해야 한다. 간경변 및/또는 간암을 발달시키는 만성 HBV에 감염된 환자 중 최대 30%에 있어서, 임상 시험 또는 치료를 위해 평가하고 있는 각각의 환자에 대해 HBV의 경과를 개별적으로 정의해야 한다. 현재 HBeAg 음성 만성 간염은 유전자형이 A가 아닌 감염이 보편적인 아프리카, 아시아, 중동, 지중해 연안 및 남미와 같은 일부 지역에서 HBV로 인해 발생하는 만성 간염의 주된 형태이다.
HBeAg에서 안티-HBeAg 항체로의 중요한 자발적 혈청전환(및 HBV DNA 수준 감소의 수반)은 한 해에 (야생형 바이러스를 보유하고 있는 환자에서) 만성 B형 간염 보균자 중 1% 내지 10%에서 발생하지만, 간에서 HBV 제거를 수반하는 HBsAg에서 안티-HBsAg 항체로의 혈청전환은 매우 드물다(한 해에 1% 이하).
만성 HBV 감염은 6개월 이상 HBsAg가 지속되는 것으로 정의된다. HBV 지속성은 cccDNA(covalently closed circular DNA)의 안정한 특성, 면역학적으로 우세한 부위의 감염 및/또는 HBV-특이적 면역 억제로 인한 것일 수 있다. HBeAg는 FAS-매개성 아폽토시스(apoptosis)를 통해 HBeAg- 및 HBcAg-특이적 Th1 CD4+ T-세포를 고갈시키는 방식으로 HBV 지속성에 중요한 역할을 한다고 생각된다(Milich et al, J. Immunol 160: 2013-21, 1998). HBeAg는 태반을 지나기 때문에, 수직 전염(vertical transmission)되는 지속성 HBV 감염의 빈도를 증가시키는, 신생아의 HBV에 대한 내성을 확정지을 수 있다. Th1/Th2 반응의 불균형은 HBeAg-HBcAg-특이적 CD8+ T-세포 반응, 및 IL-4 및 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 생성에 의한 Th1 이펙 터(effector) 세포의 억제를 촉진시킨다(Ferrari et al, J Immunol. 145: 3442-9, 1990; Milich et al, 1998 supra, Milich et al, Proc Natl Acad Sci USA. 92: 6847-51, 1995). 또한 미토겐(mitogen)에 대한 반응이 HBV-음성 대조군과 비교할 경우 감소하고, HBV 바이러스 부하가 안티-HBV 요법으로 감소된 후에 증가하기 때문에, 만성 HBV로 감염된 개체에서 일반화된 CD4+ T-세포의 저반응성을 야기할 수 있는 다른 메커니즘도 존재한다(Boni et al, J Clin Invest. 102: 968-75, 1998). 상기 T-세포의 "저반응성"은 HBV로 감염된 수지상 세포에서의 감소된 작용으로 인해 야기될 수 있는데, 이는 IFN-γ, TFN-α 및 IL-12 생성을 감소시켜, CD8+ T-세포 반응의 자극을 감소시킨다(Beckebaum et al, Immunology. 109: 487-95, 2003).
전체적으로, 감염이 성공적으로 제거된 개체와 비교했을 때, 지속성 HBV 감염에서 기능성 HBV-특이적 CD4+ 및 CD8+ T-세포가 감소된다. 지속성 HBV 감염된 개체에서, HBV-특이적 CD8+ T-세포 반응은 HLA-A2 양성인 만성 보균자에서의 전체 HBV 항원 또는 정의된 에피토프에 대한 증식성 반응으로 평가하는 경우 유의적으로 감소된다(Ferrari et al, J Immunol. 145: 3442-9, 1990; Maini et al, J Exp Med. 191: 1269-80, 2000). 특히, HBeAg-양성인 만성 보균자에서, 코어 에피토프(영역 18 내지 27)를 인지하는 특이적 CD8+ T-세포는 사량체로 측정하는 경우 거의 검출할 수 없으며, IFN-γ를 생성하는 능력이 감소된다. 또한 HBV-특이적 CD8+ T-세포는 간에서 발견되는데, 이들 세포는 염증 반응을 야기할 수는 있으나 HBV 감염을 제거하는 데에는 효과가 없다(Jung et al, Virology. 261: 165-72, 1999; Maini et al, 2000 supra).
숙주 바이러스 관계는 동적 프로세스인데, HBV와 같은 다양한 바이러스는 이들의 불가시성을 최대화시키고자 하나, 숙주는 감염을 억제 및 근절시키고자 한다. 초기에, 바이러스는 표적 세포에 결합하여 들어가야 하지만, 복제하고 다른 세포를 감염시키기 위해서는 적절한 세포 구획(compartment)으로 이동해야 한다. 감염된 세포는 바이러스에 의해 유발(trigger)되어 바이러스 복제 사이클 중 1 이상의 단계를 억제하는 사이토카인(예, TFN-α 및 IFN-γ)을 생성하고, 이에 따라 감염의 정도를 제한할 수 있다.
숙주 단핵구 및 매크로파지(macrophage)는 감염에 간접적 및 직접적 영향을 미치는 IL-1, TNF-α, IL-6, IL-12 및 IL-18과 같은 전-염증성 사이토카인을 분비할 때 바이러스에 대한 초기 반응에서 중요한 역할을 한다. 이들은 단핵구, 자연 살해(NK) 세포 및 T-세포를 더 모아 작용할 수 있으며, 또한 적절한 Th 기능으로의 전환을 도와 바이러스를 박멸할 수도 있다.
상기 전-염증성 사이토카인을 생성하는 병원성 미생물에 대한 선천적 면역은 톨-유사 수용체(TLR)의 활성화로 인해 발생한다. TLR은 패턴-인지 수용체의 주요 클래스로서 동정된 바 있다. 박테리아 산물, 예컨대 내독소 및 펩티도글리칸을 비롯한 TLR의 역할은 최근 확인된 바 있다(Akashi et al., J Immunol. 164: 3471-3475, 2000; Takeuchi et al., Immunity, 11: 443-451, 1999; Tapping et al., J Immunol. 165: 5780-5787, 2000). 13 이상의 TLR이 동정된 바 있으며, 이들은 다수의 상이한 박테리아에 의한 활성화에 중요한 역할을 한다. 이는 최근 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)가 뮤린(murine) 모델에서 TLR-4를 자극한다는 사실의 입증과 함께 바이러스에까지 확대되고 있다(Kurt-Jones et al., Nat Immunol. 1: 398-401, 2000; Haeberle et al., J Infect Dis. 186: 1199-1206, 2002). 또한, 홍역 바이러스(MV)가 TLR-2 의존성 시그널을 활성화시킨다는 점이 드러났으며(Bieback et al., J Virol. 76: 8729-8736, 2002), 이중-스트랜드의 RNA(여러 바이러스의 코어)가 TLR-3을 통한 반응을 직접 매개한다는 점도 드러났다(Matsumoto et al., Biochem Biophys Res Commun. 293: 1364-1369, 2002).
이들 리간드에 의해 TLR이 자극되면, 후속 염증성 반응을 조정하기 위한 세포내 시그널 전달 경로의 복잡한 네트워크의 활성화가 개시된다. 이들 시그널링 네트워크의 중요한 성분은 어댑터(adaptor) 단백질 MyD88 (및 관련 단백질), 여러 단백질 키나제(IRAK-1, p38 MAP 키나제 및 IκB 키나제 포함), TRAF6 및 전사 인자 NF-κB이다(도 7). NF-κB의 활성화는 다양한 전-염증성 매개인자(예, TNFα, IL-1, IL-6 및 MCP-1)의 발현을 유도한다(Akira, S. J Biol Chem 278, 38105-8; 2003; Barton, G. M. & Medzhitov, R. Science 300, 1524-5, 2003; Beutler, B., et al., J Leukoc Biol 74, 479-85; 2003). 또한 TLR3 및 TLR4는 어댑터 분자 (TLR3 및 TLR4에 대한) TRIF 및 (TLR4에 대한) TRAM을 비롯한, MyD88-독립적 경로를 통해 시그널링이 가능하다(Lien, E. & Golenbock, D. T. Nat Immunol 4, 1162-4, 2003).
그 뒤, TLR 활성화 시에 유도되는 시그널은 특이적 면역 반응의 활성화를 조절한다. 상기 특이적 면역 시스템은 선천적 면역 시스템에 의해 인지되고 처리된 후에만 병원체에 반응한다는 증거가 존재한다. T-세포 수용체는 활성화가 일어나기 위해 펩티드-MHC 복합체와 함께 항원-제시 세포의 표면 상에서 발현되는, CD80 및 CD86과 같은 공-자극성 분자를 필요로 한다. 이들 공-자극성 분자의 발현은 TLR에 의해 부분적으로 조절된다(Pasare, C. & Medzhitov, R. Curr Opin Immunol 15, 677-82, 2003). 이들은 또한 류마티즘 인자를 생성하기 위해 B-세포를 활성화시키는 데 중요하다(Leadbetter, E. A. et al. Nature 416, 603-7, 2002).
따라서, TLR의 병원체-매개성 하향(down)-조절의 역할을 조사하고, 선천적 면역 시스템을 보조함으로써 감염과 싸우기 위한 메커니즘을 개발할 필요성이 존재한다.
발명의 개요
달리 언급하지 않는다면, 본 명세서를 통해 언급되는 용어 "포함하다" 또는 이의 활용형인 "포함하고" 또는 "포함하는"은, 언급된 요소(element) 또는 완전체(integer), 또는 이들 요소 또는 완전체의 군을 포함하는 것으로서, 임의의 다른 요소 또는 완전체, 또는 이들 요소 또는 완전체의 군도 제외하지 않고 포함되는 것으로 이해해야 한다.
본 발명은 HBV-특이적 이펙터 분자의 존재 또는 부재에 의해 발현 또는 활성이 변형되는 세포 표면 마커를 동정한다. 상기 세포 표면 마커는 선천적 면역과 관련이 있으며, 특히 HBV-유도성 분자는 상기 마커의 수준 또는 활성을 조절한다고 제안되어 있다. 따라서, 세포 표면 마커 및 HBV-특이적 이펙터 분자는 치료 및/또는 진단 표적으로 유용하다. 특히, 본 발명은 HBV-특이적 항원의 존재 하에 톨-유사 수용체(TLR)의 조절을 동정하고, 항원 및 TLR은 모두 HBV 감염에 대한 유용한 치료 및 진단 마커이며, 치료 프로토콜을 모니터링한다. 특정 구체예에서, HBV-특 이적 이펙터 분자는 세포내 형태인 P22 또는 P25와 같은 프리-코어 단백질, 또는 이의 분비형(예, HBeAg)이다. 집합적으로, 이들 분자는 본원에서 "HBeAg/P22"라 불린다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, TLR, 및 특히 TLR-2 및 TLR-4는 HBV 또는 이의 돌연변이체 형태에 의해 감염된 후 간 세포 상에 또는 간 세포 내에 HBeAg/P22의 존재 또는 부재에 의해 상이하게 영향을 받는다는 점이 확인되었다. HBV의 돌연변이체 형태는 프리-코어 돌연변이체 및/또는 BCP 돌연변이체를 포함한다. 따라서, 프리-코어 단백질(P22) 또는 이의 분비형(HBeAg), 및 TLR, 특히 TLR-2 및 TLR-4는 HBV의 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한, 백신을 비롯한 치료제 또는 예방제로서 유용한 표적이다. 이들은 또한 대상체가 HBV에 감염되는지 또는 감염되었는지, 또는 대상체가 지속 감염 또는 또다른 질환에 대한 병인이 있는지 또는 지속 감염 또는 또다른 질환에 걸렸는지, 또는 임상학적 또는 역학적 관리 도구(management tool)로서 사용될 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 유용한 진단 표적이다.
특히, HBV에 의한 감염은 감염 프로세스를 촉진시키는 TLR의 하향-조절을 야기한다. 프리-코어 돌연변이체와 같은 돌연변이체 HBV의 감염은 TLR의 상향-조절을 야기한다.
따라서, 본 발명은 HBV-특이적 이펙터 분자(예, HBeAg/P22) 및/또는 TLR(예, TLR-2 및 TLR-4)의 수준을 조절할 수 있는 치료제 및/또는 예방제를 제공한다. HBV-특이적 이펙터 분자는 TLR-2 또는 TLR-4와 같은 TLR을 상향-조절 또는 하향-조 절할 수 있는 임의의 분자(즉, 조절인자)를 포함한다. 예를 들어, HBV에서, 이펙터 분자는 HBeAg/P22이다.
본 발명은 또한 HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재를 검출하는 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 TLR 시그널링의 수준을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재, 또는 TLR의 상승 또는 감소 수준, 또는 TLR 시그널링 경로 내의 구성요소는 HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재에 대한 지표가 된다.
본 발명은 또한 TLR의 수준을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 존재 및/또는 수준에 의해 HBV에 의한 감염을 진단 또는 평가하는 방법, 또는 간 세포 상의 TLR(예, TLR-2 및/또는 TLR-4)의 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 TLR 시그널링의 수준을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 존재 및/또는 수준을 측정하거나, 또는 간 세포 상에서 TLR-2 및/또는 TLR-4 및 NFκβ와 같은 시그널링 경로의 구성요소 및 TLR의 수준을 측정하여 HBV에 의한 감염을 진단 또는 평가하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 치료제 및 진단제, 및 HBV 또는 이의 돌연변이체에 의한 감염 또는 감염에 대한 병인, 또는 감염의 지속 또는 제거를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 유용한 상기 치료제 및 진단제를 포함하는 조성물을 포함한다. 특히 본 발명의 이러한 측면은 HBV 감염의 치료 및 진단으로까지 확대되고, 프리-코어 돌연변이가 일어났거나 일어나지 않은 HBV에 의한 감염을 구별하는 데까지 확대된 다.
본 발명은 또한 HBV로 감염되었거나, 또는 이의 질환 또는 병인을 갖고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물의 수준을 하향-조절하거나, 또는 TLR의 수준을 상향-조절 또는 하향-조절하는 백신을 비롯한 유효량의 제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 최적 치료 방법(therapeutic regimen)의 효능을 측정하는 것 뿐 아니라 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 병태의 발달에 대한 치료 프로토콜에 대한 반응을 모니터링하는 방법을 포함하는 것으로서, 상기 방법은 TLR 시그널링을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 수준 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재, 또는 TLR의 상승 또는 감소 수준, 또는 TLR 시그널링 경로 내의 구성요소는 HBV에 의한 감염 또는 이의 관련된 질환 상태 또는 병인의 존재의 지표가 된다.
바람직한 포유동물은 인간이다. 동물 모델 또한 본 발명에 포함된다.
도 1은 프리-코어 돌연변이체 HBV로 감염된 세포와, HBV 야생형으로 감염된 세포의 TLR-2 및 TLR-4의 수준을 비교하여 나타낸 그래프이다. 배큘로바이러스 시스템을 사용하였다.
도 2는 프리-코어 돌연변이체 HBV로 감염된 세포와, HBV 야생형으로 감염된 세포의 TLR-2 및 TLR-4의 수준을 비교하여 나타낸 그래프이다. 배큘로바이러스 시스템이 100 moi로 사용하였다.
도 3은 간 세포 상의 TLR2 수준을 나타내는 그래프이다.
상측 패널: 지방증에 걸린 환자(파선), 만성 HBV를 가진 환자(흐린 부분) 및 이소타입(isotype) 대조군(점선)의 간 생검으로부터 얻은 간세포 TLR2 및 TLR4의 단일 세포 현탁액 유세포 분석 히스토그램. 이는 정상 간 생검을 수행한 개체와 비교했을 때, 만성 HBV를 가진 환자의 간세포 표면 상에서 TLR2가 하향-조절됨을 입증한다.
하측 패널: HBeAg-양성 HBV 감염된 3명의 환자, HBeAg-음성 HBV 감염된 5명의 환자, 및 5명의 지방증 대조군(C)으로부터 얻은 말초 혈액 및 간 생검을 검사하였다. 말초 혈액(혈액)은 CD14 양성 단핵구 상에서 TLR2 및 TLR4에 대해 분석하였다. 간 생검 조직은 단일 세포 현탁액으로 분리하여, 유세포 분석기 상에서 러닝(running)시켰다. 그 뒤 쿠퍼 세포(Kupffer cell) 및 간세포를 게이트(gated)하고, TLR2 및 TLR4를 측정하였다. 기하 평균 형광값은 이소타입 대조군 항체의 형광값에 대한 비로서 표현하였다. 이 데이터는 TLR의 변화율(%)로서 나타낸다. 각각의 실험으로부터 얻은 평균값 및 표준 편차를 나타낸다. *는 대조군과 비교했을 때 p 값이 0.05 미만임을 나타낸다.
도 4는 TLR2, TLR4 및 TNF-α 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 헤파린화 전혈은 20시간 동안 다양한 양의 HBV 바이러스로 자극시키고, TLR2 수준(B) 및 TLR4 수준(A)을 CD14 양성 단핵구 상에서 측정하였다. 기하 평균 형광값은 이소타 입 대조군 항체의 형광값과의 비로서 표현하였다. 이 데이터는 TLR의 변화율(%)로서 나타낸다. 패널 (C)는 ELISA로 측정한 상청액 중 TNF-α를 나타낸다. 상이한 공여자로부터 5개의 개별 실험의 평균값 및 표준 편차를 나타낸다. TLR2에 대한 결과는 p < 0.02로 나타났으며, TNF에 대한 결과 역시 p < 0.02로 나타났다.
도 5는 TLR 수준 및 TNF-α 수준의 변화율을 나타내는 그래프이다. 헤파린화 전혈은 배지(C), 야생형 HBV의 1×107 바이러스 입자(WT), B형 간염 표면 항원(sAg), HBV 프리-코어 단백질(PC) 및 HBV 코어 단백질(Co)로 20시간 동안 자극시켰다. TLR2 및 TLR4 수준은 CD14 양성 단핵구 상에서 측정하였다(상측 패널). 기하 평균 형광값은 이소타입 대조군 항체의 형광값의 비로서 표현하였다. 하측 패널은 상술한 자극에 대해 ELISA로 측정한 상청액 중 TNF-α를 나타낸다. 또한, 2개의 상이한 HBV 유전자형(A 및 D)을 나타낸다. 이 데이터는 TLR의 변화율(%)로서 나타낸다. 상이한 공여자로부터의 5개의 개별 실험의 평균값 및 표준 편차를 나타낸다. *은 대조군과 비교했을 때 p 값이 0.05 미만을 나타낸다.
도 6은 LTR 및 TNF 수준의 변화율을 나타내는 그래프이다. HepG2 세포 중 모의(mock) 감염(M), 프리-코어(PC) 및 코어(C) 배큘로바이러스 컨스트럭트(construct)는 유세포 분석기 상에서 러닝시키고, TLR2 및 TLR4를 측정하였다. 기하 평균 형광값은 이소타입 대조군 항체의 형광값에 대한 비로서 표현하였다(상측 패널). 이 데이터는 TLR의 변화율(%)로서 나타낸다. 하측 패널은 TaqMan 실시간 PCR(QPCR)을 실시한 동일한 세포를 나타낸다. 이는 Assays-On-Demand Gene Expression Products(Applied Biosystems) 및 ABI Prism 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)을 사용하여 384-웰 플레이트 상에서 수행하였다. 상대적인 PCR 생성물의 양은 비교 Ct 방법을 사용하여 측정하였는데, 여기서, 표적 DNA의 양은 18s로 정규화시키고, 모의 cDNA에 비례하였다(2-델타델타CT). 재조합 HBV 배큘로바이러스 컨스트럭트는, 상술한 바와 같이, 1.3 게놈 길이의 야생형(WT) HBV 주형(유전자형 D, 아형 ayw)(Invitrogen, Stratagene, CA)을 사용하여, 공-트랜스펙션(co-transfection) 및 위치-지정 돌연변이에 의해 제조하였다. 그 뒤 HepG2 세포는 세포 당 50 플라크 형성 단위(PFU)의 감염 다중도(MOI)로 WT, PC, BCP 및 PC/BCP 재조합 HBV 배큘로바이러스와 형질도입시켰다. 이어서, 소 태아 혈청-프리(free) MEM을 사용하여, 단일 세포 현탁액을 제조한 뒤, 유세포 분석을 위해 염색하였다. 데이터는 3개의 실험의 평균값 및 표준 편차를 나타낸다. *는 논-파라메트릭(non-parametric) Mann Whitney-U 테스트로 측정한 바와 같이 대조군과 비교했을 때 p 값이 0.05 미만을 나타낸다.
도 7은 TLR 시그널링 경로를 나타내는 모식도이다.
본 발명은 프리-코어 단백질 또는 이의 분비 형태(예, HBeAg)를 생산하는 HBV에 의한 감염으로는 간 세포(헤파토사이트 및 쿠퍼 세포 포함) 및 PBMC(말초 단핵구 포함)에서 TLR-2 및 TLR-4의 수준이 감소되나, 프리-코어 돌연변이 및/또는 BCP 돌연변이를 수반하는 HBV에 의한 감염으로는 TLR-2 및 TLR-4가 상향-조절되어 TLR 시그널링이 조절될 수 있다는 점에 기초하고 있다. TLR-2 및 TLR-4의 수준의 변경은 HBV-특이적 이펙터 분자, 프리-코어 단백질 또는 이의 분비 형태(예, HBeAg)에 의해 결정된다. 프리-코어 단백질 또는 이의 분비 형태(예, HBeAg)의 존재, 부재 또는 수준, 또는 TLR-2 및 TLR-4의 수준 및/또는 프리-코어 단백질 또는 이의 분비 형태(예, HBeAg)의 기능 또는 활성은 HBV 감염의 진단 지표, 또는 간염을 일으키는 HBV의 형태, 또는 HBV 감염에 대한 병인 또는 이의 지속성의 지표를 제공한다. 또한, 프리-코어 단백질 또는 이의 분비 형태, 예컨대 HBeAg, TLR-2 및 TLR-4는 프리-코어 단백질 또는 이의 분비 형태, 예컨대 HBeAg, 또는 TLR-2 및/또는 TLR-4 수준 또는 TLR 시그널링 경로의 구성요소를 조절하는 백신을 비롯한 제제에 대한 치료 표적이 된다.
프리-코어 단백질 또는 이의 분비 형태, 예컨대 HBeAg는 "프리-코어 단백질/HBeAg"라고도 불린다. 본 발명은 절단(truncation), 포인트 돌연변이 또는 널(null) 돌연변이와 같은 프리-코어 돌연변이를 수반하는 HBV 변이체, 및 HBV 프리-코어 유전자의 전사를 하향-조절하는 BCP 돌연변이(들)가 있는 HBV 변이체로 그 범위가 확대된다.
따라서, 본 발명은 프리-코어 단백질/HBeAg 및/또는 TLR, 특히 TLR-2 및/또는 TLR-4, 또는 TLR 시그널링 경로의 구성요소의 수준을 조절하는 제제, 프리-코어 단백질/HBeAg 및/또는 TLR-2 및/또는 TLR-4 및/또는 TLR 시그널링 경로의 구성요소의 수준을 측정하기 위한 진단제, 및 HBV 감염에 대한 백신의 개발을 비롯하여, 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 최적 치료 방법의 효능을 측정하기 위한 수단뿐 아니라, 치료 프로토콜에 대한 반응을 모니터링하는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 감염, 및 동물(예, 포유동물, 특히 인간)에서의 기타 병태의 발달에 대한 임상학적 또는 역학적 관리 도구를 제공한다.
본 발명은 또한 TLR 시그널링 경로의 구성요소 또는 TLR 수준을 기초로 하지 않는(즉, 프리코어 및/또는 BCP 돌연변이체), 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 바이러스를 생산하는 HBV에 의한 감염 간의 식별을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 HBV에 의한 감염 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재를 검출하는 방법을 포함하는 것으로서, 상기 방법은 TLR의 수준 또는 활성을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 존재 또는 부재를 측정하거나, 또는 TLR 또는 이의 상동체의 수준 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재, 또는 TLR 또는 이의 상동체의 상승 또는 감소 수준은 HBV에 의한 감염 또는 이에 대한 병태의 존재 또는 병인의 지표가 된다.
특히, 본 발명은 HBV에 의한 감염 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재를 검출하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 TLR 시그널링의 수준을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재, 또는 TLR 또는 TLR 시그널링 경로 내의 구성요소의 상승 또는 감소 수준은 HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재의 지표가 된다.
또한, 본 발명의 또다른 측면은 HBV에 의한 감염 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재를 검출하는 방법을 포함하는 것으로서, 상기 방법은 TLR의 수준 또는 활성을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 존재 또는 부재를 측정하거나, 또는 TLR 또는 이의 상동체 또는 TLR 시그널링 경로의 구성요소의 수준 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재, 또는 TLR 또는 이의 상동체 또는 TLR 시그널링 경로의 구성요소의 상승 또는 감소 수준은 HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재의 지표가 된다.
본 발명의 또다른 구체예는 HBV에 의한 감염 또는 이에 대한 병태의 발달에 대한 치료 프로토콜에 대한 반응을 모니터링하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 HBV-특이적 이펙터 분자의 수준 또는 활성, 또는 TLR 또는 이의 상동체의 수준 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재 또는 TLR 또는 이의 상동체, 또는 TLR 시그널링 경로의 구성요소의 상승 또는 감소 수준은 HBV에 의한 감염 또는 이에 대한 병태 또는 병인의 존재의 지표가 된다.
본 발명의 또다른 측면은 HBV로 감염되었거나 이에 대한 병태 또는 병인을 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 프리-코어 단백질/HBeAg를 하향-조절하거나, 또는 TLR 또는 시그널링 경로의 구성요소의 수준을 상향-조절 또는 하향-조절하는 백신을 비롯한 유효량의 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명을 더 상세하게 설명하기 전에, 달리 명시하지 않는다면 본 발명은 특정 성분 제제, 제조 방법, 투여 방법 등으로 한정되지 않으며, 이들은 다양할 수 있다고 이해해야 할 것이다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특별 구체예를 설명하기 위한 목적으로 제공하는 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것을 아니라는 점을 이해해야 할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 단수형("a", "an" 및 "the")은 달리 명시하지 않는다면 복수형까지 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다. 따라서, 예를 들어, "화합물"은 단일 화합물뿐 아니라 2 이상의 화합물도 포함하는 것이며; "활성제"는 단일 활성제뿐 아니라 2 이상의 활성제도 포함하는 것이다.
본 발명을 설명하고 청구할 때 사용되는 다음의 용어들은 다음과 같은 정의에 따라 사용된 것들이다.
용어 "화합물", "활성제", "약리학적 활성제", "약제", "활성" 및 "약물"은 소정의 약리학적 및/또는 생리적 효과를 유도하는 화학적 화합물을 뜻한다. 상기 용어는, 비제한적으로 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그(prodrug), 활성 대사산물, 유사체 등을 비롯하여, 본원에서 구체적으로 언급되는 상기 활성제의 약학적 허용 성분 및 약리학적 활성 성분을 포함한다. 용어 "화합물", "활성제", "약리학적 활성제", "약제", "활성" 및 "약물"이 사용되는 경우, 이는 활성제 그 자체뿐 아니라, 약학적 허용, 약리학적 활성 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 대사산물, 유사체 등도 포함하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "화합물"은 화학적 화합물만을 뜻하는 것이 아니라, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질뿐 아니라 유전 분자, 예컨대 RNA, DNA 및 이의 화학적 유사체에까지 그 범위가 확대된다. "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 다당류 또는 지질다당류 성분을 가지고 있는 분자를 포함한다. "안타고니스트(antagonist)"는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 다른 병원체-특이적 이펙터 분자의 수준을 하향-조절하거나, 또는 TLR을 하향-조절하는 화합물, 활성제, 약리학적 활성제, 약제, 활성 및 약물의 예이다. "아고니스트(agonist)" 또는 "강화제(potentiator)"는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 예컨대 TLR-2 또는 TLR-4의 수준을 상향-조절한다.
본 발명은 백신, 및 화합물 또는 제제, 예컨대 TLR-2 및/또는 TLR-4의 아고니스트 또는 안타고니스트, 및 뉴클레오시드 유사체 또는 안티-프리-코어/HBeAg 항체, 또는 항바이러스성 사이토카인(예, IFN-∝, IFN-γ, IL-2, TNF-∝) 또는 기타 면역조절제의 조합물에까지 그 범위가 확대된다.
따라서, 본 발명은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 예컨대 TLR-2 및/또는 TLR-4의 수준을 조절하거나, 또는 일반적 TLR 시그널링 또는 특이적 TLR 시그널링을 가능하게 하는 데 유용한 화합물을 포함한다. 상기 화합물은 HBV에 의한 감염을 감소 또는 예방 또는 치료하는 데, 또는 또다른 병태를 치료하는 데 효과가 있다. 조절하고자 하는 TLR을 보유하고 있는 바람직한 세포는 간 세포이다. 간 세포는 헤파토사이트를 포함한다. "화합물", "활성제", "약리학적 활성제", "약제", "활성" 및 "약물"은 2 이상의 활성의 조합물, 예컨대 프리-코어 단백질/HBeAg의 안타고니스트 또는 TLR 또는 TLR 시그널링의 강화제 또는 아고니스트를 포함한다. "조합물"은 제제를 별도 제공하여 별도 조제하거나 또는 조제하기 전에 함께 혼합하는 2-부분 약학 조성물과 같은 다중-부분을 포함한다.
예를 들어, 다중-부분 약학 팩(pack)은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 조절인자, 및 1 이상의 항균제 또는 항바이러스제를 보유할 수 있다. "조절하는" 또는 이의 활용어, 예컨대 "조절하다" 또는 "조절"은 상향-조절 또는 하향-조절을 설명하는 데 사용되는 용어이다.
본원에서 사용되는 제제의 "유효량" 및 "치료적 유효량"이란, 소정의 치료 효과 또는 생리적 효과를 얻기에 충분한 제제의 양을 뜻하는 것이다. 또한, 제제의 "효과적인 HBeAg-조절 또는 TLR-조절 양"은 프리-코어 단백질/HBeAg의 기능을 직접적 또는 간접적으로 상향-조절 또는 하향-조절하거나, 또는 특이적 TLR(예, TLR-2 또는 TLR-4)를 상향-조절 또는 하향-조절하거나, 또는 TLR 시그널링을 강화시키기에 충분한 양의 제제이다. 예를 들어, 이는 TLR 시그널링 경로의 구성요소를 모사하는 제제와 같이, 프리-코어 단백질/HBeAg의 안타고니스트 또는 TLR 또는 이의 시그널링 구성요소의 아고니스트(즉, 강화제)로서 작용하는 제제에 의해, 다른 세포 수용체를 통해 TLR 시그널링 경로를 유도하는 제제에 의해, 또는 TLR 시그널링 구성요소의 억제제를 상쇄(antagonize)하는 제제에 의해 달성될 수 있다. 바람직하지 않은 효과, 예컨대 부작용이 소정의 치료 효과와 함께 종종 나타날 수 있다; 따라서, 당업자는 적절한 "유효량"을 결정할 때 잠재적인 위험에 대한 잠재적인 이점을 비교평가해야 한다. 요구되는 정확한 양은 대상체의 종, 나이 및 일반적인 조건, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 따라서 정확한 "유효량"을 명기하는 것은 불가능할 수 있다. 그러나 어떠한 개체의 경우에 있어서의 적절한 "유효량"은 일상적인 실험법을 사용하여 당업자들라면 결정할 수 있을 것이다.
"약학적 허용" 담체, 부형체 또는 희석제란, 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질, 즉 임의의 또는 실질적인 역 반응을 야기하지 않고 선별된 활성제와 함께 대상체에 투여할 수 있는 물질로 이루어진 약학적 비히클(vehicle)을 뜻한다. 담체는 부형체, 및 희석제, 세정제, 착색제, 습윤제, 유화제, pH 완충제, 방부제 등과 같은 기타 첨가제를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 백신 조성물로서 제형에 따라 설명될 수도 있다.
유사하게, 본원에서 제공되는 바와 같은 화합물의 "약리학적 허용" 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그 또는 유도체는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그 또는 유도체이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 및 "치료"는 감염 또는 질병의 증상의 심각도 및/또는 빈도의 감소, 증상 및/또는 근본적 원인의 제거, 감염 증상의 발병 및/또는 이의 근본적 원인의 예방, 및 손상의 개선 또는 치료를 뜻한다. 바이러스 감염에 따른 부수적인 피해로는, 예를 들어 간 손상, 예컨대 간경변 또는 간세포암을 들 수 있다.
환자의 "치료"란, 감염 또는 다른 병태 또는 하류(downstream) 상태, 예컨대 간 손상 또는 암을 억제하여 개체의 임상학적인 증상의 치료뿐 아니라 감수성이 있는 개체에서의 감염 또는 다른 병태 또는 생리학적 유해 사례의 방지를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 상태 또는 질병은 감염, 특히 바이러스 감염, 특히 더 HBV에 의한 감염이다. 따라서, 예를 들어, 감염이 되었거나 감염이 될 수 있는 환자를 "치료"하는 방법에는 감염 또는 다른 병태의 예방뿐 아니라, 감염 또는 다른 병태의 치료도 포함된다.
"HBV", 즉 "B형 간염 바이러스"는 뉴클레오시드 유사체 또는 면역학적 제제와 같은 특정 치료제에 대해 내성이 있는 변이체를 비롯한 모든 변이체를 포함한다. 특히 중요한 변이체가 HBV의 프리-코어 및/또는 BCP 돌연변이체이다.
본원에서 사용되는 용어 "환자"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 뜻하는 것으로서, 이들은 본 발명의 약학 제형 및 방법으로부터 이익을 얻을 수 있다. 본원에서 설명되는 약학 제형 및 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 동물의 종류에는 제한이 없다. 인간인지 비-인간 동물인지에 상관없이 환자라 함은, 개체, 대상체, 동물, 숙주 또는 공여자가 될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 방법은 인간 의학, 수의학에서, 또한 일반적으로는 가축 또는 야생 동물의 사육 시에 사용된다.
본 발명의 화합물은 대분자, 소분자, 핵산 분자(안티센스 또는 센스 분자를 포함), 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 하이브리드 분자, 예컨대 RNAi-복합체 또는 siRNA-복합체[RISC 복합체 또는 다이서(Dicer) 복합체를 포함], 리보자임 또는 DNA자임일 수 있다. 화합물은 세포로의 도입이 용이해지도록 변형시킬 필요가 있을 수 있다. 화합물이 세포외 수용체와 상호작용하는 경우에는 상기와 같은 변형이 필요하지 않다. 제제의 예로는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR과 상호작용하는 항체 및 화학제제, 또는 프리-코어 발현을 조절하는 유전 분자를 들 수 있다.
상기한 바와 같이, 바람직한 동물은 인간이다.
실험실 시험용 동물(동물 모델 포함)의 예로는, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 및 햄스터를 들 수 있다. 토끼 및 설치류 동물, 예컨대 래트 및 마우스는 간편한 시험 시스템 또는 동물 모델이다. 가축으로는 양, 소, 돼지, 염소, 말 및 당나귀를 들 수 있다. 비-포유동물 동물, 예컨대 조류(예, 오리), 제브라피시(zebrafish), 양서류[수수두꺼비(cane toad) 포함] 및 초파리 종[예, 노랑초파리(Drosophila melanogaster)]도 포함된다.
따라서, 본 발명은 프리-코어 단백질/HBeAg를 조절하거나(예, 아고나이즈 또는 안타고나이즈), 또는 TLR-2 및/또는 TLR-4와 같은 TLR을 조절하는(즉, 강화 또는 활성화 또는 안타고나이즈) 제제를 제공한다.
본 발명은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 예컨대 TLR-2 또는 TLR-4, 또는 이의 일부와 후보 약물을 접촉시키는 단계 등을 포함하는, 상기 제제의 스크리닝 방법을 포함한다. 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 분자는 본원에서 "표적" 또는 "표적 분자"라고도 불린다. 스크리닝 방법은, (i) 약물과 표적 간의 복합체의 존재, 또는 (ii) 표적을 코딩하는 핵산 분자의 발현 수준의 변경을 분석하는 단계를 포함한다. 분석의 한 형태로는 경쟁적 결합 분석이 포함된다. 이러한 경쟁적 결합 분석에서, 표적은 통상적으로 표지시킨다. 프리(free) 표적은 임의의 추정 복합체로부터 분리하고, 프리(즉, 비복합체화된) 표지의 양은 표적 분자에 대해 시험 중인 제제 결합의 측정값이다. 또한, 프리 표적보다는 결합 표적의 양을 측정할 수도 있다. 표적보다 화합물을 표지할 수도 있으며, 시험 중인 약물의 존재 및 부재 하에 표적에 결합한 화합물의 양을 측정할 수도 있다. 상기 화합물은, 예를 들어 HBV 감염을 치료 또는 예방하는 데 필요한 TLR의 조절인자 또는 프리-코어 단백질/HBeAg의 조절인자를 찾는 데 유용한 표적을 억제할 수 있다.
약물 스크리닝을 위한 또다른 기법은 표적에 대한 적절한 결합 친화도를 갖고 있는 화합물에 대한 HTS(high throughput screening)를 제공하며, 이는 Geysen에 의한 문헌 [국제 특허 공보 제WO 84/03564호]에 상세하게 기재되어 있다. 간단하게 설명하자면, 다수의 상이한 소 펩티드 테스트 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고형 기판 상에서 합성한다. 펩티드 시험 분자는 표적과 반응시키고 세척한다. 그 뒤, 결합된 표적 분자는 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법으로 검출한다. 이 방법은 비-펩티드 화학 물질을 스크리닝하기 위해 적합시킬 수 있다. 따라서, 상기 측면은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 예컨대 TLR-2 또는 TLR-4의 표적 조절인자를 스크리닝하기 위한 조합 접근법에까지 확대된다.
정제된 표적은 상술한 약물 스크리닝 기법에서 사용하기 위해 직접 플레이트 상으로 코팅시킬 수 있다. 그러나 표적에 대한 비-중화 항체를 사용하여 고체 상(phase)에 표적을 고정시킬 수 있다. 프리-코어 단백질/HBeAg에 대해 특이적인 항체는 프리-코어 단백질/HBeAg의 억제인자로서 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 경쟁적 약물 스크리닝 분석법의 사용도 포함하는데, 이 분석법에서는, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체가 표적 또는 이의 단편에 결합하기 위해 시험 화합물과 경쟁한다. 이러한 방식으로, 항체를 사용하여 표적의 1 이상의 항원성 결정소(determinant)를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출할 수 있다.
프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR에 대한 항체는 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal)일 수 있으나, 모노클로낭 항체가 바람직하다. 항체는 여러 수단 중 임의의 수단으로 제조할 수 있다. 프리-코어 단백질 /HBeAg 또는 TLR을 검출하기 위해, 항체는 일반적으로 비-인간 동물, 예컨대 영장류, 가축(예, 양, 소, 돼지, 염소, 말), 실험실 시험용 동물(예, 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼) 및 반려 동물(예, 개, 고양이)과 같은 비-인간 동물로부터 유래하나, 반드시 그러하지만은 않다. 일반적으로, 항체계 분석은 세포 또는 조직 생검 상에서 시험관내에서 수행한다. 그러나, 항체가 적절하게 탈면역화(deimmunized)되거나, 인간에 사용할 때 항체가 인간화되는 경우, 이 항체는, 예컨대 대상체로 투여되는 핵 태그로 표지하고, 핵 표지 축적 부위는 방사선 기법에 의해 측정할 수 있다. 따라서, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 항체는 병원성 마커 표적제로 간주한다. 따라서, 본 발명은 인간 및 비-인간 대상체에서의 병원성 표적 이미지화에서 사용하기 위한 탈면역화된 항체의 형태에까지 그 범위가 확대된다. 이는 하기에서 더 설명될 것이다.
프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR에 대한 항체를 생성하기 위해, 인간 조직을 비롯한 동물로부터 얻은 것이든, 또는 재조합 방법으로 제조하는 경우 세포 배양물로부터 얻은 것이든, 분자는 생물학적 샘플로부터 추출할 필요가 있다. 일반적으로, 단핵구 및 헤파토사이트가 간편한 공급원이다. 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR은 임의의 적절한 수단을 사용하여 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같이 분리하여, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 표면 전하 특성, 크기, 밀도, 생물학적 활성 및 이의 또다른 엔티티(entity)(즉, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR이 결합하거나 회합하는 또다른 단백질 또는 화학적 화합물)에 대한 이의 친화도 중 임의의 1 이상의 장점을 취할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 분리하는 것은, 초-원심분리법, 이온-교환 크로마토그래피(예, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피), 전기영동법(예, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법, 등전위 전기영동법), 크기 분리법(예, 겔 여과, 한외여과) 및 친화도-매개 분리법(예, 비제한적으로 자기 비드 분리법, 예컨대 DynabeadTM 분리법, 면역크로마토그래피, 면역-침전법을 비롯한 면역친화성 분리법) 중 1 이상의 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 사용된 소정의 분리 기법(들)은 조직으로부터 얻었거나 발견한 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 특정 TLR의 생물학적 활성 또는 물성에 따라 다를 수 있다.
바람직하게는, 생물학적 유체로부터의 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 분리는 키나제 상에 존재하는 형태학적 에피토프(conformational epitope)를 보존하여, 분자의 변성을 야기하는 기법을 적절하게 피한다. 당업자라면, 동물에 노출되는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 상의 활성 부위 또는 항원성 결정소가 원래(native) 분자의 활성 부위 또는 항원성 결정소와 구조적으로 동일하다는 점을 확인하기 위해, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR(예, 이들을 얻은 생물학적 샘플)에 대해 특이적인 생리학적 조건을 유지하거나 가능한 한 근접하게 모방하는 것이 중요하다는 점을 이해할 것이다. 이는 원래 분자를 인지하는 면역화된 동물에서 적절한 항체를 성장시킨다.
면역화 및 후속 모노클로날 항체의 제조는 표준 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있는데, 이는 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature. 256: 495-499, 1975]; [Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6 (7): 511-519, 1976)]; 1987년 Kodansha Scientific에 의해 출간된 Coligan 등에 의한 문헌 ["Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1991-1997] 및 Toyama 등에 의한 문헌 [Monoclonal Antibody, Experiment Manual]에 기재되어 있다. 반드시, 동물은 항체-생성 세포, 특히 항체-생성 체세포(예, B 림프구)를 제조하기 위해 표준 방법에 의해 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 또는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 포함하는 샘플로 면역화시킨다. 그 뒤, 이들 세포는 불멸화를 위해 면역화된 동물로부터 제거할 수 있다.
프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 단편을 항체를 제조하는 데 사용하는 경우, 우선 운반체(carrier)와 회합시키는 것이 필요할 수 있다. "운반체"란, 비 면역원성 또는 불충분한 면역원성 성분[예, 합텐(hapten)]이 이의 면역원성을 증강시키기 위해 천연 또는 인공 결합하고 있는 통상적인 고분자량의 임의 성분을 뜻한다.
항체-생성 세포의 불멸화는 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 불멸화는 EBV(Epstein-Barr 바이러스)를 사용하여 형질전환 방법에 의해 달성할 수 있다(Kozbor et al., Methods in Enzymology. 121: 140, 1986). 바람직한 구체예에서, 항체-생성 세포는 (문헌 [Coligan et al., 1991-1997, supra]에 기재되어 있는) 세포 융합 방법을 사용하여 불멸화시키는데, 이는 모노클로날 항체를 생산하는 데 널리 사용되는 방법이다. 이 방법에서는, 항체를 생성할 수 있는 잠재력을 보유하는 항체-생성 체세포, 특히 B 세포를 골수종 세포주와 융합시킨다. 상기 체세포는 준비된(primed) 동물, 바람직하게는 설치류 동물(예, 마우스 및 래트)의 림프절, 비장 및 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 마우스 비장 세포가 특히 유용하다. 그러나 래트, 토끼, 양 또는 염소 세포, 또는 다른 동물 종으로부터의 세포를 사용할 수도 있다.
특정 골수종 세포주는 하이브리도마-생성 융합 방법에서 사용하기 위한 림프구성 종양으로부터 발달시켰다(Kohler and Milstein의 상기 논문 (1976); Shulman et al., Nature. 276: 269-270, 1978; Volk et al., J Virol. 42(1): 220-227, 1982). 이들 세포주는 3 이상의 이유로 발달시켰다. 첫번째 이유는 비융합되고, 유사하게 불명확하게 자가-증식하는 골수종 세포로부터 융합된 하이브리도마의 선별을 용이하게 하기 위함이다. 대개, 이는 하이브리도마의 성장을 지지하는 소정의 선택 배지에서는 골수종이 성장할 수 없는 효소 결핍된 골수종을 사용하여 달성한다. 두번째 이유는 림프성 종양 세포 그 자체의 항체를 생성하기 위해 림프성 종양 세포의 고유 능력에 기인한다. 하이브리도마에 의해 종양 세포 항체가 생성되지 않도록, 내인성 빛 또는 면역글로불린 중쇄를 생성할 수 없는 골수종 세포주를 사용한다. 상기 세포주의 선별을 위한 세번째 이유는 융합에 대한 이들의 적절성 및 효율이다.
다양한 골수종 세포주는 융합된 세포 하이브리드, 예컨대 P3X63-Ag8, P3X63-AG8.653, P3/NS1-Ag4-1(NS-1), Sp2/0-Ag14 및 S194/S.XXO.Bu.1 등을 생성하기 위해 사용될 수 있다. P3X63-Ag8 및 NS-1 세포주는 Kohler 및 Milstein 등에 의한 1976년도 상기 문헌에 기재된 바 있다. Shulman 등에 의한 1978년도 상기 문헌에서는 Sp2/0-Ag14 골수종 세포주를 발달시켰다. S194/5.XXO.Bu.1 세포주는 Trowbridge에 의한 문헌 [J. Exp. Med. 148(1): 313-323, 1978]에서 보고되었다.
항체-생성 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 생성하는 방법은 대개 세포막의 융합을 촉진하는 제제(들)(화학적, 바이러스성 또는 전기적)의 존재 하에 각각 10:1의 비율로 (약 20:1 내지 약 1:1의 비율로 달라질 수도 있음) 골수종 세포와 체세포를 혼합하는 단계를 포함한다. 융합 방법은 Kohler 및 Milstein에 의한 1975년도 상기 문헌, Gefter 등에 의한 문헌 [Somatic Cell Genet. 3: 231-236, 1977] 및 Volk 등에 의한 1982년도 상기 문헌에 기재된 바 있다. 이들 연구원들이 사용한 융합-촉진제는 센다이(Sendai) 바이러스 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이었다.
융합 방법은 매우 낮은 빈도로 생존 가능한 하이브리드를 생성하기 때문에(예, 비장을 체세포 공급원으로 사용하는 경우, 대략 1×105개의 비장 세포에 대해 단 하나의 하이브리드만이 얻어짐), 잔여 비융합 세포, 특히 비융합 골수종 세포로부터 융합 세포 하이브리드를 선별하는 방법을 갖는 것이 바람직하다. 기타 생성된 융합 세포 하이브리드 중 소정의 항체-생성 하이브리도마를 검출하는 방법 또한 필요하다. 일반적으로, 융합 세포 하이브리도마의 선별은 하이브리도마의 성장을 지지하나, 대개 불확실하게 계속 분할하는 비융합 골수종 세포의 성장을 억제하는 배지에서 세포를 배양시켜 달성한다. 융합 시에 사용되는 체세포는 시험관내 배양 시 장기간 동안 생존이 가능하지 않기 때문에, 문제를 내포하지 않는다. 본 발명의 실시예에서는, 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제가 없는 골수종 세포(HPRT-음성)를 사용하였다. 이들 세포에 대한 선별은, 비장 세포의 HPRT-양성 유전자형으로 인해 융합 세포 하이브리드가 생존하는 배지인, 하이포잔틴/아미노프테린/티미딘(HAT) 배지에서 수행한다. 유전자형으로 컴피턴트한(competent) 하이브리드의 성장을 지지하는 배지 중에서 선별할 수 있는, 상이한 유전자 결함(약물 감수성 등)을 보유하는 골수종 세포도 사용할 수 있다.
융합 세포 하이브리드를 선별적으로 배양하는 데에는 수 주가 소요된다. 이 기간 초기에는, 소정의 항체를 생산한 뒤, 클로닝하고 증식할 수 있는 하이브리드를 동정할 필요가 있다. 일반적으로, 대략 10%의 하이브리드가 소정의 항체를 생성할 수 있으나, 대개 약 1% 내지 약 30%의 범위가 그러하다. 항체-생성 하이브리드의 검출은, 예를 들어 Kennet 등에 의한 문헌 [Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp 376-384, Plenum Press, New York, 1980]에 기재되어 있는 바와 같은 효소-결합 면역분석법 및 방사면역분석법을 비롯한 여러 표준 분석법 중 어느 한 분석법, 및 FACS 분석법(O'Reilly et al., Biotechniques. 25: 824-830, 1998)을 사용하여 달성할 수 있다.
일단, 소정의 융합 세포 하이브리드가 선별되어, 개별 항체-생성 세포주로 클로닝되면, 각각의 세포주는 2가지 표준 방법 중 어느 한 방법으로 증식시킬 수 있다. 하이브리도마 세포의 현탁액은 조직적합성(histocompatible) 동물에 주입할 수 있다. 그 뒤, 주입된 동물은 융합 세포 하이브리드에 의해 생성되는 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발달시킬 것이다. 동물의 체액, 예컨대 혈청 또는 복수액을 탭핑(tapping)하여 고 농도의 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 경우에 따라, 개별 세포주를 실험실 배양 용기에서 시험관내에서 증식시킬 수 있다. 고 농도의 특이적인 단일 모노클로날 항체를 함유하고 있는 배양 배지는 디캔테이션(decantation), 여과 또는 원심분리에 이어 정제하여 수거(harvest)할 수 있다.
임의의 적절한 면역검출 방법을 사용하여 소정의 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 검출하기 위해, 세포주를 이의 특이성에 대해 시험하였다. 예를 들어, 세포주를 여러 웰로 나누어 넣고, 인큐베이션할 수 있으며, 각각의 웰로부터의 상청액을 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA), 간접 형광 항체 기법 등을 사용하여 분석한다. 표적 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 인지할 수 있으나 비-표적 에피토프를 인지하지 못하는 모노클로날 항체를 생성하는 세포주(들)를 동정한 뒤, 시험관내에서 직접 배양하거나 또는 조직적합성 동물에 주입하여, 종양을 형성하고, 소정의 항체를 생산, 수거 및 정제한다.
이들 항체는 프리-코어 단백질/HBeAg-특이적 또는 TLR-특이적이다. 이는, 상기 항체가 특정 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 다른 분자와 식별할 수 있음을 의미한다. 상기 항체가 정상 세포에서 분자와 교차-반응하지 않는다면, 더 광범위한 항체를 사용할 수도 있다.
모노클로날 항체를 프리-코어 단백질/HBeAg를 억제할 정도로 치료제로 사용하려면, 상기 치료제가 주입될 숙주(예, 인간)에 대해 탈면역화시킬 필요가 있을 것이다. 탈면역화 방법은 본 발명에 따라 제조한 모노클로날 항체와 동일하거나 유사한 특이성을 보유하는 키메라(chimeric) 항체의 제조를 비롯한 여러 형태 중 어느 형태를 취할 수 있다. 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 대개 유전 공학에 의해 상이한 종에 속하는 면역글로불린 가변 및 불변 영역 유전자로 구성된(constructed) 항체이다. 따라서, 본 발명에 따라, 일단 소정의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 얻으면, 이종간(interspecific) 모노클로날 항체를 제조하기 위한 기법을 사용하고, 여기서, 한 종의 결합 영역을 또다른 종의 항체의 비-결합 영역과 결합시킨다(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 3439-3443, 1987). 예를 들어, 비-인간(예, 뮤린) 모노클로날 항체로부터의 상보적 결정 영역(CDR)을 인간 항체에 이식시켜, "인간화" 뮤린 항체를 제조할 수 있다(유럽 특허 제0 239 400호; Jones et al., Nature. 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science. 239: 1534-1536, 1988; Richmann et al., Nature. 332: 323-327, 1988). 이 경우, 탈면역화 방법은 인간에 대해 특이적이다. 특히 더, CDR은 인간 불변 영역이 있거나 없는 인간 항체 가변 영역 상으로 이식시킬 수 있다. CDR을 제공하는 비-인간 항체는 대개 "도너(donor)"라 부르고, 골격(framework)를 제공하는 인간 항체는 대개 "어셉터(acceptor)"라 부른다. 불변 영역은 존재할 필요가 없으나, 만약 존재하는 경우, 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일, 즉, 약 85% 내지 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상 동일해야 한다. 따라서, 아마도 CDR를 제외한 모든 인간화 항체의 부분은 원래의(natural) 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 따라서, "인간화 항체"는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 도너 항체는 "인간화" 과정에 의해 "인간화"된다고 하는데, 이는 생성된 인간화 항체가 CDR를 제공하는 도너 항체와 동일한 항원에 결합할 것이라 예측되기 때문이다. 본원에서 "인간화"란, 특정 숙주, 이 경우에는 인간 숙주에 대해 탈면역화된 항체를 뜻한다.
탈면역화된 항체는 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 보존적 아미노산 치환을 보유할 수 있다고 이해해야 할 것이다. 예시적인 보존적 치환은 하기 표 1에 따라 만들어질 수 있다.
[표 1]
원래 잔기 치환의 예
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln, His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn, Gln
Ile Leu, Val
Leu Ile, Val
Lys Arg, Gln, Glu
Met Leu, Ile
Phe Met, Leu, Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp, Phe
Val Ile, Leu
본 발명에 따른 탈면역화 항체를 제조하는 데 사용할 수 있는 방법의 예는 Richmann 등에 의한 1988년도 상기 문헌; 유럽 특허 제0 239 400호; 미국 특허 제6,056,957호, 미국 특허 제6,180,370호, 미국 특허 제6,180,377호에 기재되어 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 프리-코어 단백질/HBeAg에 대한 모노클로날 항체에 의해 인지되는 에피토프에 대한 특이성을 보유하는 탈면역화된 항체 분자를 포함하는 것으로서, 상기 탈면역화 항체의 가변 영역의 CDR 중 1 이상은 상기 프리코어 단백질/HBeAg에 대한 상기 모노클로날 항체로부터 유래되고, 탈면역화 항체 분자의 잔여 면역글로불린-유래 부분은 항체가 탈면역화된 숙주로부터 얻은 면역글로불린 또는 이의 유사체로부터 유래된다.
본 발명의 상기 측면은 비-인간 항체의 골격 영역의 조작(manipulation)을 포함한다.
본 발명은 상기 항체의 돌연변이체 및 유사체에까지 그 범위가 확대되나, 이들은 여전히 프리-코어 단백질/HBeAg에 대한 특이성을 보유하고 있다.
용어 "돌연변이체" 또는 "유사체"는 1 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "CDR"은 분자 결합 부분 상에서 β 스트랜드를 가교하는 항체 골격 영역의 가변 부분 중 3개의 경쇄 및 3개의 중쇄 영역을 커버하는 CDR 구조 루프를 포함한다. 이들 루프는 특징적인 표준(canonical) 구조를 가진다(Chothia et al., J Mol. Biol. 196: 901, 1987; Chothia et al., J Mol. Biol. 227: 799, 1992).
"골격 영역"은 CDR이라고도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 차단되는, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 뜻한다. 골격 영역 및 CDR의 범위는 정확하게 정의된 바 있다(예, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest", U. S. Department of Health and Human Sciences, 1983] 참조). 상이한 경쇄 또는 중쇄의 골격 영역의 서열은 상대적으로 종 내에서는 보존되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 골격 영역"은 자연 발생적인 인간 면역글로불린의 골격 영역과 실질적으로 동일한(약 85% 이상, 대개 90% 내지 95% 이상) 골격 영역을 뜻한다. 구성적 경쇄 및 중쇄의 합쳐진 골격 영역인 항체의 골격 영역은 CDR을 배치하고 정렬시킨다. CDR은 HBeAg의 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "중쇄 가변 영역"은 아미노산 잔기의 길이가 약 110 내지 125인 폴리펩티드를 뜻하는 것으로서, 상기 아미노산 서열은 중쇄의 아미노-말단(N-말단) 아미노산 잔기로부터 시작되는, 본 발명의 모노클로날 항체의 중쇄의 아미노산 서열에 해당한다. 유사하게, "경쇄 가변 영역"은 아미노산 잔기의 길이가 약 95 내지 130인 폴리펩티드를 뜻하는 것으로서, 상기 아미노산 서열은 경쇄의 N-말단 아미노산 잔기로부터 시작되는, 본 발명의 모노클로날 항체의 경쇄의 아미노산 서열에 해당한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25 Kd 또는 214 아미노산)는 NH2-말단에서 가변 영역 유전자에 의해(약 110 아미노산), 그리고 COOH-말단에서 κ 또는 γ 불변 영역 유전자에 의해 코딩된다. 유사하게, 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50 Kd 또는 446 아미노산)는 가변 영역 유전자(약 116 아미노산) 및 상술한 불변 영역 유전자 중 한 유전자(예, γ)(약 300 아미노산을 코딩함)에 의해 코딩된다.
본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린" 또는 "항체"는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 1 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 뜻한다. 인지되는 면역글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε, μ 불변 영역 유전자뿐 아니라, 무수한(myriad) 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 면역글로불린의 한 형태는 항체의 기본 구조 단위를 구성한다. 이 형태는 4량체이고, 2개의 동일한 면역글로불린 쇄의 쌍으로 이루어지며, 상기 각각의 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 보유한다. 각각의 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 항원에 함께 결합할 수 있으며, 불변 영역은 항체 이펙터(effector) 기능을 할 수 있다. 항체 외에, 면역글로불린은, 예컨대 Fv, Fab, Fab' 및 (Fab')2를 비롯한 다양한 다른 형태로 존재할 수 있다.
본 발명은, 예컨대 Fv, Fab, Fab' 및 (Fab')2 단편을 비롯하여, 본 발명의 방법에 의해 생산된 모노클로날 항체의 단편의 용도 및 생성을 포함한다. 상기 단편은 Coligan 등에 의한 상기 문헌(1991-1997)에 기재되어 있는 바와 같이 표준 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 유사한 특이성을 가지고 있는 합성 또는 재조합 항원-결합 분자를 포함한다. 이 형태의 항원-결합 분자는 안정화된 합성 Fv 단편을 포함할 수 있다. 이 형태의 단편의 예로는 단쇄 Fv 단편(sFv, 흔히 scFv라고도 함)을 들 수 있는데, 이는 펩티드 링커(linker)를 사용하여 VL 도메인의 C-말단 또는 N-말단과 VH 도메인의 N-말단 또는 C-말단을 각각 가교하는 데 사용된다. scFv에는 전체 항체의 모든 불변 부분이 없으며, 이는 보체(complement)를 활성화시킬 수 없다. VH 및 VL 도메인을 결합시키기 위한 적절한 펩티드 링커는, Fv 단편이 유래된 전체 항체의 항원 결합 부위의 3차원 구조와 유사한 3차원 구조를 가지는 항원 결합 부위를 보유하고 있는 폴리펩티드 단쇄로 VH 및 VL 도메인을 폴딩할 수 있는 것이다. 소정의 특성을 보유하고 있는 링커는 미국 특허 제4,946,778호에 개시되어 있는 방법으로 수득할 수 있다. 그러나, 몇몇 경우에서는 링커가 없다. scFv는, 예를 들어 Krebber 등에 의한 문헌 [J Immunol. Methods.201(1): 35-55, 1997]에 약술되어 있는 방법에 따라 제조할 수 있다. 경우에 따라, scFv는 미국 특허 제5,091,513호, 유럽 특허 제239,400호, 또는 문헌 [Winter and Milstein, Nature. 349: 293, 1991)] 및 문헌 [Pluckthun et al., In Antibody engineering: A practical approach, 203-252, 1996)]에 기재되어 있는 방법에 따라 제조할 수 있다.
경우에 따라, 안정화된 합성 Fv 단편은 디설피드 안정화된 Fv(dsFv)를 포함하는데, 여기서, 시스테인 잔기는 VH 및 VL 도메인으로 도입되어, 완전하게 폴딩된 Fv 분자에서 2개의 잔기가 상기 도메인들 사이에서 디설피드 결합을 형성할 것이다. dsFv를 생산하는 적절한 방법은, 예컨대 문헌 [Glockshuber et al., Biochem. 29: 1363-1367, 1990]; [Reiter et al., J. Biol. Chem. 269: 18327-18331, 1994]; [Reiter et al., Biochem. 33: 5451-5459, 1994]; [Reiter et al., Cancer Res. 54: 2714-2718, 1994] 및 [Webber et al., Mol. Immunol. 32: 249-258, 1995]에 기재되어 있다.
또한, 예컨대 문헌 [Ward et al., Nature. 341: 544-546, 1989]; [Hamers-Casterman et al., Nature. 363: 446-448, 1993] 및 [Davies and Riechmann, FEBS Lett. 339: 285-290, 1994]에 개시되어 있는 바와 같이, 단일 가변 영역 도메인(dAb라 불림)은 합성 또는 재조합 항원-결합 분자로 간주한다.
경우에 따라, 합성 또는 재조합 항원-결합 분자는 "미니바디(minibody)"를 포함할 수 있다. 이 점에 있어서, 미니바디는 단쇄에서 전체 항체의 필수 성분을 코딩하는, 전체 항체의 작은 버전이다. 적절하게, 미니바디는, 예컨대 미국 특허 제5,837,821호에 개시되어 있는 바와 같이, 면역글로불린 분자의 힌지(hinge) 영역 및 CH3 도메인에 융합되어 있는 원래 항체의 VH 및 VL 도메인으로 이루어진다.
다른 구체예에서, 합성 또는 재조합 항원 결합 분자는 바-면역글로불린 유래의 단백질 골격을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합용으로 이미 선별된 CDR을 만들기 위해 랜덤화된(randomized) 2개의 루프를 갖고 있는 4-나선 번들(bundle) 단백질 사이토크롬 b562를 개시한, 문헌 [Ku & Schutz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 6552-6556, 1995]을 참조할 수 있다.
합성 또는 재조합 항원-결합 분자는 다가(multivalent)일 수 있다(즉, 1 이상의 항원 결합 부위를 보유함). 상기 다가 분자는 1 이상의 항원에 대해 특이적일 수 있다. 이 형태의 다가 분자는, 예컨대 문헌 [Adams et al., Cancer Res. 53: 4026-4034, 1993] 및 [Cumber et al., J Immunol. 149: 120-126, 1992]에 개시되어 있는 바와 같이, 시스테이닐-보유 펩티드를 통해 2개의 항체 단편을 이량체화시켜 제조할 수 있다. 경우에 따라, 이량체화는 자연적으로 이량체화되는 양쪽성 나선에 대한 항체 단편의 융합에 의해(Plunckthun, Biochem 31: 1579-1584, 1992), 또는 헤테로이량체화되는 것이 바람직한 도메인(예, 루신 지퍼 jun 및 fos)의 사용에 의해(Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992) 촉진될 수 있다. 다가 항체는, 예컨대 TLR-2 및 TLR-4와 같은 상이한 형태의 TLR을 검출하는 데 유용하다.
프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 활성 또는 수준을 조절하는데 유용한 다른 화합물의 공급원은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 화학적으로 개질된 리간드이다.
또한, 프리-코어 단백질/HBeAg와 TLR 사이의 상호작용을 개재 또는 길항 또는 작용화시키는 화합물이 선택될 수 있다.
본원에서 고려되는 단백질성 분자의 유사체(예를 들어 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 리간드)는 이에 제한되지는 않지만 측쇄의 변형, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성 중 비천연 아미노산 및/또는 이의 유도체의 혼입 및 가교제의 사용, 및 단백질성 분자 또는 이의 유사체에 형태적 구속을 부과하는 기타 방법을 포함한다.
본 발명에 의해 고려되는 측쇄 변형의 예로서는 NaBH4을 이용한 환원을 수반하는 알데히드와의 반응에 의한 환원성 알킬화와 같은 아미노기의 변형; 메틸아세트이미데이트를 이용한 아미드화; 무수 아세트산을 이용한 아실화; 시아네이트를 이용한 아미노기의 카르바모일화; 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)을 이용한 아미노기의 트리니트로벤질화; 무수 숙신산 및 무수 테트라히드로프탈산을 이용한 아미노기의 아실화; 및 NaBH4을 이용한 환원을 수반하는 피리독살-5-포스페이트를 이용한 라이신의 피리독실화를 포함한다.
아르기닌 잔기의 구아니딘기는 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약을 이용해 헤테로시클릭 축합 생성물을 형성시켜 개질될 수 있다.
카르복실기는 O-아실이소우레아 형성 후, 예를 들어, 상응하는 아미드로의 후속 유도체화를 통한 카르보디이미드 활성화에 의해 개질될 수 있다.
설피드릴기는 예컨대 요오드아세트산 또는 요오드아세트아미드를 이용한 카르복시메틸화; 시스테인산으로의 과포름산 산화; 다른 티올 화합물과 혼합된 디설파이드의 형성; 말레이미드, 무수 말레산 또는 다른 치환된 말레이미드와의 반응; 4-클로로머큐리벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐설폰산, 염화페닐수은, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 및 다른 수은성 물질을 이용한 수은성 유도체의 형성; 알칼리성 pH에서 시아네이트를 이용한 카르바모일화와 같은 방법에 의해 개질될 수 있다.
트립토판 잔기는 예를 들어, N-브로모숙신이미드를 이용한 산화 또는 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 설페닐 할라이드를 이용한 인돌 고리의 알킬화에 의해 개질될 수 있다. 한편, 티로신 잔기는 테트라니트로메탄을 이용한 질화에 의해 변화되어 3-니트로티로신 유도체를 형성할 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 요오드아세트산 유도체를 이용한 알킬화 또는 디에틸파이로카르보네이트를 이용한 N-카르보에톡실화에 의해 달성될 수 있다.
펩타이드 합성 중에 포함되는 비천연 아미노산 및 유도체의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 노르루신, 4-아미노 부티르산, 4-아미노-3-히드록시-5-페닐펜탄산, 6-아미노헥산산, t-부틸글리신, 노르발린, 페닐글리신, 오미틴, 사르코신, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵탄산, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성질체의 사용을 포함한다. 본원에서 고려되는 비천연 아미노산을 표 2에 나타내었다.
[표 2]
비천연 아미노산에 대한 코드
Figure 112006093063449-PCT00001
Figure 112006093063449-PCT00002
Figure 112006093063449-PCT00003
Figure 112006093063449-PCT00004
가교제는 예를 들어, 단일이작용성 가교제, 예컨대(CH2)n 스페이서기(n=1 내지 n=6)를 갖는 이작용성 이미도 에스테르, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르 및 보통 아미노-반응성 부분 예컨대 N-히드록시숙신이미드 및 다른 특이적-반응성 부분 예컨대 말레이미도 또는 디티오 부분(SH) 또는 카르보디이미드(COOH)를 포함하는 이종-이작용성 시약을 이용하여 3D 구조를 안정화하는데 사용된다. 또한, 펩타이드는 예를 들어, Cα 및 Nα-메틸아미노산의 혼입, 아미노산의 Cα와 Cβ 원자 사이에 이중 결합의 도입, 및 N과 C 말단 사이, 두 측쇄 사이 또는 측쇄 및 N 또는 C 말단 사이에 아미드 결합을 형성하는 것과 같이 공유 결합을 도입한 시클릭 펩타이드 또는 유사체의 형성에 의해 구조적으로 제한될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 예컨대 TLR-2 또는 TLR-4, 또는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 수준 또는 활성의 변화를 초래하는 TLR 신호 경로의 성분과 결합하거나 그렇지 않으면 상호 작용하는 임의의 화합물에 관한 것이다.
다른 유용한 화합물의 군은 모방체이다. 용어 "펩타이드 모방체", "표적 모방체" 또는 "모방체"는 표적 물질과 일부 화학적 유사성을 가지나 표적을 길항 또는 작용화 또는 모방하는 물질을 가리킨다. 이 경우에 표적은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 리간드일 수 있다. 펩타이드 모방체는 단백질 2차 구조의 원소들을 모방하는 펩타이드 함유 분자일 수 있다(Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics", Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993). 펩타이드 모방체의 사용에 숨겨진 그 근본 이유는 단백질의 펩타이드 골격이 예컨대 항체 및 항원, 효소 및 기질 또는 스캐폴딩(scaffolding) 단백질의 분자적 상호 작용을 촉진시키도록 아미노산 측쇄를 배향시키기 위해 주로 존재한다는 것이다. 펩타이드 모방체는 천연 분자와 유사한 분자적 상호 작용을 허용하기 위해 고안된다. 펩타이드 또는 비펩타이드 모방체는 예를 들어, 경쟁적으로 억제하거나 아니면 프리-코어 단백질/HBeAg에 결합하거나 또는 TLR 또는 TLR 경로를 활성화하는데 유용할 수 있다. 이 경우에 바람직한 TLR은 TLR-2 및 TLR-4이다.
또한, 본 발명의 화합물은 표적과 단독으로 상호 작용 하기 위해 선택될 수 있거나, 단일 또는 다중 화합물을 다중 표적에 영향을 주기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 다중 표적은 프리-코어 단백질/HBeAg 및 병원체 자체일 수 있다. 예를 들어, 한 유용한 치료적 조합물은 프리-코어 단백질/HBeAg 및 뉴클레오시드 유사체 및/또는 항바이러스 사이토카인의 길항제일 수 있다.
스크리닝 분석에서 사용되는 표적 또는 단편은 용액 중에 유리되거나, 고체 지지체에 부착되거나, 세포 표면 상에 놓여질 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법은 바람직하게는 경쟁적 결합 분석에서 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 또는 단편을 발현하는 재조합 폴리뉴클레오티드와 안정하게 형질 전환하는 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용하는 것이다. 살아있거나 고정된 형태의 이러한 세포는 표준 결합 분석에 이용될 수 있다. 당업자는 예를 들어, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 또는 단편과 테스트되는 제제 사이의 착물 형성을 측정할 수 있거나, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 또는 단편 및 리간드 사이의 착물 형성이 테스트되는 제제에 의해 보조되거나 방해되는 정도를 검사할 수 있다.
표적 기능 또는 유전자 활성의 조절자로서 확인된 물질은 펩타이드 또는 비펩타이드성일 수 있다. 비펩타이드성 "소분자"가 다양한 생체 내 약학 용도를 위해 바람직하다. 따라서, 물질의 모방체(특히 펩타이드의 경우)는 약학 용도를 위해 고안될 수 있다.
약학적 활성 화합물로의 모방체의 고안은 "선구(lead)" 화합물에 기초한 약학물의 개발에 있어 공지된 접근 방법이다. 이는 활성 화합물이 합성하기 어렵거나 또는 고가인 경우, 또는 특정 투여 방법에 부적한 경우, 예를 들어, 펩타이드는 이들이 소화관에서 프로테아제에 의해 빨리 분해되는 경향이 있기 때문에 경구 조성물을 위한 활성제로는 부적절한 경우에 있어서 바람직하다. 모방체 고안, 합성 및 시험은 일반적으로 표적 특성에 대한 다수의 분자를 무작위 스크리닝 하는 것을 피하는데 사용된다.
주어진 표적 특성을 갖는 화합물로부터 모방체를 고안하는데는 흔히 여러 단계가 있을 수 있다. 먼저, 표적 특성을 결정하는데 있어서 결정적이거고/이거나 중요한 화합물의 특정 일부를 결정한다. 펩타이드의 경우, 이는 펩타이드 내 아미노산 잔기에 있어서 전체적인 다양화, 예를 들어 각 잔기를 치환하여 수행할 수 있다. 펩타이드의 알라닌 스캔은 이러한 펩타이드 모티프를 정제하기 위해 흔히 사용된다. 화합물의 활성 영역을 구성하는 이들 부분 또는 잔기들은 "약리작용단(pharmacophore)"으로 알려져 있다.
일단 약리작용단이 발견되면, 이의 구조는 소스 범위, 예를 들어 분광학적 기법, x-선 회절 데이타 및 NMR를 사용하여 이들의 물리적 특성, 예를 들어, 입체 화학, 결합, 크기 및/또는 전하에 따라서 모델링된다. 컴퓨터 분석, 유사성 맵핑(이는 원자들 사이에 결합보다는 약리작용단의 전하 및/또는 부피를 모델링한다), 및 다른 기법이 상기 모델링 공정에 사용될 수 있다.
이러한 접근법의 변형에서, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 및 이의 리간드의 3차원적 구조가 모델링된다. 이는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 및/또는 이의 리간드가 결합시 구조를 변화시키는 곳에서 특히 유용하여, 모델이 모방체의 고안에서 이를 참작하도록 상기 사항을 참작할 수 있도록 해 준다. 모델링은 선형서열 또는 3차원적 구조와 상호작용하는 억제제를 생성하는데 사용될 수 있다.
주형 분자는 이후 약리작용단을 모방하는 화학적 기들이 그래프트될 수 있는 곳에서 선택된다. 주형 분자 및 그 위에 그래프트된 화학적 기들은 적절하게 선택될 수 있어서, 모방체가 합성이 용이하고, 약리학적으로 수용가능하며, 선구 화합물의 생물학적 활성을 보유하면서 생체 내에서 분해되지 않도록 해준다. 대안적으로, 모방체가 펩타이드를 기초로 하는 경우에는, 펩타이드를 고리화하여 이의 강성도를 증가시켜 추가의 안정성을 달성할 수 있다. 이러한 접근법에 의해 발견된 모방체(들)은 이후 이들이 표적 특성을 가지고 있는지, 또는 이러한 특성을 어느 정도로 나타낼 수 있는 지를 검사하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이후 추가의 최적화 또는 변형을 수행하여 생체 내 또는 임상적 시험을 위한 하나 이상의 최종 모방체를 달성할 수 있다.
합리적인 약물 고안의 목적은 예를 들어, 폴리펩타이드의 보다 활성이거나 안정한 형태이거나, 또는 예를 들어, 생체 내 폴리펩타이드의 기능을 증가 또는 방해할 수 있는 약물을 정형화하기 위해 이들이 상호 작용(예를 들어 작용제, 길항제, 억제제 또는 증강제) 하는 소분자의 구조적 유사체 또는 해당 생물학적 활성 폴리펩타이드를 제조하는 것이다. 예를 들어 Hodgson (Bio/Technology. 9: 19-21, 1991)를 참조한다. 한 접근법에서, 당업자는 x-선 결정학, 컴퓨터 모델링 또는 가장 전형적으로는 이러한 접근법들의 조합에 의해 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 리간드의 3차원적 구조를 결정한다. 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 리간드의 구조와 관련한 유용한 정보는 동종 단백질의 구조에 기초한 모델링에 의해 수득될 수 있다. 합리적인 약물 고안의 예로서 HIV 프로테아제 억제제의 개발이 있다 (Erickson et al., Science. 249: 527-533,1990). 또한, 표적 분자는 알라닌 스캔(Wells, Methods Enzymol. 202: 2699-2705,1991)으로 분석할 수 있다. 이 기법에서, 아미노산 잔기를 Ala로 치환하고 펩타이드 활성에 대한 이의 영향을 측정한다. 펩타이드의 각각의 아미노산 잔기를 이러한 방식으로 분석하여 펩타이드의 중요한 영역을 결정한다.
프리-코어 단백질/HBeAg-특이적 또는 TLR-특이적 항체를 단리 (예컨대 상기 기술된 방법에 의해)하여 이의 결정 구조를 밝히는 것도 가능하다. 사실상, 이러한 접근은 후속적인 약물 고안이 기초가 될 약리작용단을 생성한다. 항이디오타입 항체(anti-ids)를 작용성의, 약리학적으로 활성이 항체로 생성시켜 단백질 결정학을 생략하는 것도 가능하다. 거울상 이미지로서, 항이디오타입 항체의 결합 부위는 본래 수용체의 유사체인 것으로 생각된다. 항이디오타입 항체는 이후 펩타이드의 화학적 또는 생물학적으로 생성된 뱅크로부터 펩타이드를 동정 및 단리하는데 사용될 수 있다. 선택된 펩타이드는 이후 약리작용단으로서 작용할 것이다.
본 발명은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 예컨대 TLR-2 또는 TLR-4를 코딩하는 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절에 대한 유전적 접근까지 확장한다. 일반적으로, 유전자 사일런싱 예컨대 전사 전 또는 전사후 유전자 사일런싱을 유도하기 위해 유전적 수단을 사용하는 것이 보다 편리하고, 따라서 HBV의 프리-코어 유전자 또는 다른 병원체에서 이의 동등물을 사일런싱하는 것이 보다 적절하거나 편리하다. 그러나, 발현의 상향 조절하는데 사용되는 일반적 기법은 유전자 복제수를 증가시키거나 또는 유전자 발현의 억제제를 길항시키는 것이다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태 및 혼성 중합체, 센스 및 안티센스 스트랜드 모두를 포함하며, 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질될 수 있거나, 또는 비천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표지, 메틸화, 하나 이상의 자연발생적 뉴클레오티드의 유사체로의 치환(예컨대 모르폴린 고리), 뉴클레오티드간 변형 예컨대 비하전된 결합 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트, 등), 하전된 결합(예를 들어 포스포로티오데이트, 포스포로디티오에이트, 등), 펜던트 부분 (예를 들어 폴리펩타이드), 개재자 (예를 들어 아크리딘, 프소랄렌, 등), 킬레이트제, 알킬화제 및 변형된 결합(예를 들어 α-아노머 핵산, 등)을 포함한다. 또한, 수소 결합 및 기타 화학적 결합을 통해 지정된 서열에 결합하는 능력을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 모방하는 합성 분자들을 포함한다. 이러한 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 펩타이드 결합이 분자 골격에서 포스페이트 결합을 대체하는 것들을 포함한다.
안티센스 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 프리-코어 단백질/HBeAg-코딩 프리-코어 유전자의 전사물을 사일런싱하는데 유용하다. 세포 내의 이러한 안티센스 구조물의 발현은 프리-코어 단백질/HBeAg 유전자 전사 및/또는 번역을 방해한다. 또한, 예컨대 단방해 RNA(siRNA) 또는 ONA-유도된 RNAi(ddRNAi)를 이용하여 RNAi를 유도하는 기작 및 공동 억제도 사용될 수 있다. 따라서, 안티센스 또는 센스 분자는 직접 투여될 수 있다. 후자의 구체예에서, 안티센스 또는 센스 분자는 또한 조성물로 제형화되어 표적 세포에 임의의 다수 수단으로 투여되거나 발현 구조체를 통해 투여될 수 있다.
안티센스 및 센스 분자 상의 변형은 모르폴린 뉴클레오티드 유도체와 포스포로디아미데이트 결합으로 이루어진 올리고뉴클레오티드인 모르폴리노의 사용과 관련된다 (예를 들어, Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 7: 187-195,1997). 이러한 화합물은 배아에 주사되면 mRNA와의 간섭 효과가 관찰된다.
한 구체예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드와 같은 화합물 및 핵산 분자의 기능 또는 효과를 조절하는데 사용되는 유사한 화학종 예컨대 프리-코어 단백질/HBeAg을 코딩하는 것들을 사용하는데, 즉 올리고뉴클레오티드는 전사 전 또는 전사 후 유전자 사일런싱을 유도한다. 이는 특이적으로 하이브리드하거나, 또는 프리-코어 단백질/HBeAg을 코딩하는 핵산 분자로 보충되는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 달성된다. 올리고뉴클레오티드는 세포에 직접적으로 제공될 수 있거나, 세포 내에서 발생할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "표적 핵산" 및 "프리-코어 단백질/HBeAg 유전자 전사물을 코딩하는 핵산 분자" 는 프리-코어 단백질/HBeAg을 코딩하는 DNA, 이러한 DNA로부터 전사된 RNA (pre-mRNA 및 mRNA 또는 이의 일부), 및 이러한 RNA로부터 유도된 cDNA를 포함하는 의미로 사용되어 왔다. 본 발명의 화합물과 이의 표적 핵산과의 혼성화는 "안티센스" 로 지칭되거나, 이는 다이서(dicer)예컨대 RISC와의 착물의 일부일 수 있다.
본 발명에서 "혼성화"는 올리고머 화합물의 상보적 가닥들의 접합을 의미한다. 본 발명에서, 바람직한 접합 기작은 올리고머성 화합물의 스트랜드의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드 염기들 사이에 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역 후그스틴 수소결합일 수 있는 수소결합과 관련된다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합을 형성을 통해 접합하는 상보적 핵염기이다. 혼성화는 다양한 환경 하에서 일어날 수 있다.
안티센스 또는 RNAi 화합물은 표적 핵산으로의 화합물이 결합이 표적 핵산의 통상적인 기능을 방해하여 활성의 손실을 야기하는 경우 특이적으로 혼성화가능하며, 특이적 결합은 바람직한 조건, 즉 생체 분석 또는 치료적 처지의 경우의 생리학적 조건 하, 및 생체외 분석의 경우 분석이 수행되는 조건 하에서 안티센스 화합물의 비표적 핵산으로의 비특이적 결합을 피하기 위해 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
본원에서 "상보적"이란, 올리고머 화합물의 두 핵염기 사이의 정밀한 접합 을 위한 수용성을 지칭한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드(올리고머 화합물)의 특정 위치에서의 핵염기가, 표적 핵산의 특정 위치에서 핵염기와 수소 결합하는 거이 가능한 경우에, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자이어서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 수소결합의 위치는 상보적 위치인 것으로 간주된다. 올리고뉴클레오티드 및 추가의 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 각 분자 내에서 충분한 수의 상보적 위치가 서로 수소결합할 수 있는 핵염기에 의해 점유되는 경우에 서로 상보적이다. 따라서, "특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보적인" 이라는 용어는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 수의 핵염기에 있어서 충분한 정도의 정밀 접합 또는 상보성을 가리키는데 사용된다.
본원에서, 용어 "올리고머 화합물" 은 다수의 단량체 단위를 포함하는 중합체 또는 올리고머를 지칭한다. 본원에서, 용어 "올리고뉴클레오티드" 는 리보핵산(RNA) 또는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 및 동종체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 자연 발생적 핵염기, 당 및 뉴클레오시드(골격) 간 공유 결합으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 유사하게 작용하는 비자연 발생적 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 향상된 세포 흡수성, 표적 해산에 대한 향상된 친화성 및 뉴클레아제의 존재 하의 증대된 안정성과 같은 바람직한 특성때문에 천연 형태에 비해 종종 바람직하다.
올리고뉴클레오티드가 본 발명의 화합물의 바람직한 형태이고, 다른 부류의 화합물도 고려되지만, 올리고뉴클레오티드 유사체 및 모방체 예컨대 본원에 기술된 것들 만으로 제한되지는 않는다.
번역 개시 코돈과 번역 종료 코돈 사이의 영역을 지칭하는 것으로 당업계에 공지된 오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 "코딩 영역" 은 효율적으로 표적화될 수 있는 영역이다. 본 발명의 문맥에서, 하나의 영역은 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 번역 개시 또는 종료 코돈을 포함하는 유전자 내의 영역이다.
다른 표적 영역은 번역 개시 코돈의 5' 방향의 mRNA의 부분을 지칭하는 것으로 당업계에 공지된 5' 비번역된 영역(5'UTR)을 포함하며, 따라서 mRNA(또는 유전자 상의 해당 뉴클레오티드)의 5' 캡핑 부위와 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오시드를 포함하고, 번역 종료 코돈의 3' 방향의 mRNA의 부분을 지칭하는 것으로 당업계에 공지된 3' 비번역된 영역(5'UTR)을 포함하며, 따라서 mRNA(또는 유전자 상의 해당 뉴클레오티드)의 3' 말단 부위와 번역 종료 코돈 사이의 뉴클레오시드를 포함한다. mRNA의 5' 캡핑 부위는 5'-5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA의 5'-most 잔기에 결합된 N7-메틸화 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡핑 영역은 5' 캡핑 구조 그 자체 뿐만 아니라 캡핑 부위에 인접한 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주된다.
당업계에 공지된 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합물이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 보통 헤테로시클릭 염기이다. 가장 흔한 두 부류의 이러한 헤테로시클릭 염기는 퓨린과 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분과 공유 결합된 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드에 있어서, 포스페이트기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 부분과 결합할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 형성에 있어서, 포스페이트기는 인접하는 뉴클레오시드와 서로 결합하여 선형 중합체 화합물을 형성한다. 결과적으로, 상기 선형 중합체 화합물의 각 말단은 추가로 결합하여 환형 화합물을 형성할 수 있지만, 선형 화합물이 유전학적으로 바람직하다. 또한, 선형 화합물은 내부 핵염기 상보성을 가질 수 있어서, 완전 또는 부분적으로 이중 가닥 화합물을 생성하도록 하는 방식으로 폴딩될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내에서, 포스페이트기는 흔히 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 골격을 형성하는 것으로 알려져 있다. RNA 및 DNA의 통상의 결합 또는 골격은 3' 대 5' 포스포디에스테르 결합이다.
본 발명에서 유용한 바람직한 안티센스 또는 RNAi 화합물의 구체적인 예로서는 변형된 골격 또는 비천연 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드는 골격 내 인 원자를 보유하는 것들 및 골격 내 인 원자를 가지지 않는 것들을 포함한다. 본원의 목적을 위해, 그리고 당업계에서 언급된 바와 같이, 뉴클레오시드간 골격에 인 원자를 가지지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 올리고뉴클레오시드일 수 있다.
인 원자를 포함하는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은, 예를 들어, 포스포로티오데이트, 키랄 포스포로티오데이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트 예컨대, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 통상의 3'-5' 결합, 이들의 2'-5' 결합 유사체, 및 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합이 3' 대 3', 5' 대 5' 또는 2' 대 2' 결합인 역극성을 갖는 것들을 포함하는 보라노포스페이트를 포함한다. 역극성을 갖는 바람직한 올리고뉴클레오티드는 3'-most 뉴클레오티드간 결합에서 단일의 3' 대 3' 결합, 즉 염기가 제거될 수 있는 단일 역 뉴클레오시드 잔기 (핵염기가 손실되거나 이를 대신해 히드록실기를 가짐)를 포함한다. 다양한 염, 혼성 염 및 유리산 형태도 포함된다.
안티센스 또는 RNAi 올리고뉴클레오티드는 흡입, 국소 또는 전신성 수단을 포함하는 임의의 통상적 수단에 의해 투여될 수 있다.
대안적인 구체예에서, DNA 백신을 포함하는 유전적 구조물을 생체 내 안티센스 또는 ddRNAi 분자를 생성시키는데 사용된다.
프리-코어 단백질/HBeAg와 상호 작용하거나 또는 TLR 또는 TLR 경로를 조절하는 제제의 동정에 이어, 이는 제형 또는 조성물 예컨대 의약, 약학 조성물 또는 약물의 제조에서 사용될 수 있다. 이들은 치료 방법 또는 예방으로 개체에 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들은 패치 또는 서방형 캡슐 또는 임플란트로서 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명은 약학 조성물, 의약, 약물 또는 기타 조성물 예컨대 패치 또는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 활성 또는 유전자 발현의 조절자, 또는 TLR 신호 경로의 성분의 활성 또는 유전자 발현의 조절자를 포함하는 서방형 제형까지 확장된다.
본 발명의 다른 측면은 감염 또는 기타 질병 상태의 치료 또는 예방을 위해 대상에게 이러한 조성물의 투여를 포함하는 방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 화합물을 약학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 또는 담체, 및 임의로는 기타 첨가성분들과 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법에 대한 것이다. 다목적 조성물이 제공되는 경우, 이후 이러한 조성물은 동시적, 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 연속적 투여는 10억분의 1초, 초, 분, 시간 또는 일 단위의 투여를 포함한다. 바람직하게는, 연속적 투여는 수초 또는 수분 내이다.
프리-코어 단백질/HBeAg 활성 또는 수준과 상호 작용하고 TLR 예컨대 TLR-2 또는 TLR-4를 함께 조절하는 것들과 같은 다중 성분들을 포함하는, 두 파트를 포함하는 다중 파트를 포함하는 약학 조성물 또는 팩도 고려된다. 추가로 항병원균제, 예컨대 뉴클레오시드 유사체도 포함될 수 있다. 이러한 다중 파트 약학 조성물 또는 팩은 서로 다른 제제들 또는 제제의 군들을 별개로 보유할 수 있다. 이들은 별개로 처리되거나 그 전에 혼합된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 대상에게 감염 또는 기타 질병의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 개체에 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 대상은 포유동물 예컨대 인간 또는 동물 모델 시스템 예컨대 마우스, 래트, 래빗, 기니아 피그, 햄스터, 불가사리 또는 양서류 또는 조류 종 예컨대 오리이다.
상기 방법은 또한 세포에 야생형 또는 돌연변이 표적 유전자 기능을 제공하는 단계를 포함한다. 이는 동물 모델에 있어 특히 유용하다. 대안적으로, 이는 유전자 치료 접근법의 일부일 수 있다. 표적 유전자 또는 유전자 일부를 세포에 도입하여 벡터 내에 유전자가 염색체 외부에 잔류하도록 할 수 있다. 이러한 상황에서, 유전자는 염색체 외부 위치에서 세포에 의해 발현될 수 있다. 유전자 일부를 도입하여 돌연변이 표적 대립유전자를 수반하는 세포 내에서 발현되는 경우, 유전자 일부는 표적 단백질의 일부를 코딩해야만 한다. 재조합 및 염색체 외부에서의 유지를 위한 유전자 도입용 벡터는 당업계에 공지되어 있으며 임의의 적절한 벡터가 사용될 수 있다. 전기천공 칼슘 포스페이트 공침전 및 바이러스 형질도입은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 이러한 측면은 ddRNAi를 코딩하는 구조물까지 확장된다.
당업계에 공지된 유전자 전달 시스템은 유전자 조작의 수행에 있어 유용할 수 있다. 이들은 바이러스 및 비-바이러스성 전달 방법을 포함한다. 다수의 바이러스가 유전자 전달 벡터 또는 유전자 전달 벡터 제조를 위한 재료로서 사용되어 왔는데, 이의 예로서는 파포바이러스(예를 들어 SV40, Madzaket al., J Gen. Virol. 73: 1533-1536, 1992), 아데노바이러스(Berkner, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-66, 1992; Berkner et al., BioTechniques 6; 616-629, 1988; Gorziglia and Kapikian, J. Virol. 66: 4407-4412, 1992; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584, 1992; Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155, 1992; Wilkinson et al., Nucleic Acids Res. 20: 2233-2239, 1992; Stratford- Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1: 241-256, 1990; Schneider et al., Nature Genetics 18: 180-183, 1998), 백시니아 바이러스(Moss, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348, 1996), 아데노 관련 바이러스(Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-129, 1992; Ohi et al., Gene 89: 279-282, 1990; Russell and Hirata, Nature Genetics 18: 323-328, 1998), 헤르페스바이러스 예컨대 HSV 및 EBV(Margolskee, Curr. Top. , Microbiol. Immunol. 158: 67-95, 1992; Johnson et al., J Virol, 66: 2952-2965, 1992; Fink et al., Hum. Gene Ther. 3: 11-19,1992; Breakefield and Geller, Mol. Neurobiol. 1: 339-371,1987; Freese et al., Biochem. Pharmacol. 40: 2189-2199, 1990; Fink et al., Ann. Rev. Neurosci. 19: 265-287, 1996), 렌티바이러스(Naldini et al., Science 272: 263-267, 1996), Sindbis and Semliki Forest 바이러스(Berglund et al., Biotechnology 11: 916-920,1993), 및 조류(Bandyopadhyay and Temin, Mol. Cell. Biol. 4: 749-754,1984; Petropoulos et al., J. Viol. 66: 3391-3397,1992], 쥐과 [Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24,1992; Miller et al., Mol. Cell. Biol.5: 431-437,1985; Sorge et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1730-1737, 1984; 및 Baltimore, J. Virol. 54: 401-407,1985; Miller et al., J. Virol. 62: 4337-4345, 1988] 및 인간 [Shimada et al., J Clin. Invest. 88: 1043-1047,1991; Helseth et al., J Virol. 64: 2416-2420,1990; Page et al., J Virol. 64: 5270-5276,1990; Buchschacher and Panganiban, J Virol. 66: 2731-2739,1982] 기원의 레트로바이러스를 포함한다.
비-바이러스성 유전자 전달 방법은 예컨대 칼슘 포스페이트 공침전을 포함하는 화학적 기법, 기계적 기법, 예를 들어, 마이크로인젝션, 리포좀을 이용한 막 융합-매개 전달 및 직접적 DNA 흡수 및 수용체-매개 DNA 전달과 같이 당업게에 공지되어 있다. 바이러스-매개 유전자 전달은 리포좀 전달을 이용하여 직접 생체내 유전자 전달과 조합할 수 있어, 당업자로 하여금 바이러스벡터를 특정 세포에 연결할 수 있게 한다. 대안적으로, 레트로바이러스 벡터 제조 세포주는 특정 조직에 주사될 수 있다. 제조 세포주의 주사는 이후 벡터 입자의 연속적 공급원을 제공할 수 있다.
생물학적 및 물리적 유전자 전달 방법을 조합한 접근 방법에서, 임의의 크기의 플라스미드 DNA를 아데노바이러스 헥손 단백질에 특이적인 폴리라이신-콘쥬게이트된 항체와 혼합하여 생성된 복합체를 아데노바이러스 벡터에 결합시켰다. 삼분자 복합체를 이후 세포를 감염시키는데 사용하였다. 아데노바이러스 벡터는 커플링된 DNA가 손상을 입기 전에 엔도좀의 효율적인 결합, 내재화 및 분해를 허용한다. 아데노바이러스계 벡터의 전달을 위한 다른 기법은 미국 특허 5,691,198 을 참고한다.
리포좀/DNA 복합체는 생체 내 직접 유전자 전달이 가능한 것으로 여겨져 왔다. 표준 리포좀 제조에서 유전자 전달 과정이 비특이적인 경우, 국소화된 생체 내 흡수 및 발현은 예를 들어, 직접적인 현장 투여에 수반하는 종양으로 보고되어 있다.
폴리뉴클레오티드가 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임 또는 DNA 효소를 코딩하는 경우, 발현은 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임 또는 DNA 효소를 생성할 것이다. 따라서, 본원에서, 발현은 단백질 생성물이 합성되는 것을 요구하지는 않는다. 발현 벡터에 클로닝된 폴리뉴클레오티드 이외에, 벡터는 또한 진핵 세포에서 작용성인 프로모터를 포함한다. 클로닝된 폴리뉴클레오티드 서열은 이 프로모터로 조절된다. 적절한 진핵 세포 프로모터는 상기 기술된 것들을 포함한다. 발현 벡터는 또한 본원에 기술된 선별가능한 마커 및 다른 서열과 같은 서열을 포함할 수 있다.
돌연변이 표적 유전자(예를 들어 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR-2 또는 TLR-4)를 수반하는 세포는 감염 또는 기타 질병 상태의 효과를 연구하기 위한 모델 시스템으로 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물, 제제, 의약, 핵산 분자 및 다른 표적 길항제 또는 작용제는 통상적인 약학 합성 기법에 따라 제조되는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A.)]을 참조한다. 조성물은 활성 제제 또는 활성 제제의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 이들 조성물은 하나의 활성 물질 이외에, 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체는 투여를 위해 바람직한 제제 형태, 예를 들어, 국소형, 정맥내, 경구, 뇌막, 신경상막 또는 비경구인지에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다.
경구 투여에 있어서, 화합물은 고체 또는 액체 제제, 예컨대 캡슐, 환약, 정제, 로젠지, 분말, 현탁액 또는 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 경구 투여형의 조성물의 제조에서, 임의의 통상적인 약학 매질을 사용할 수 있는데, 예컨대, 경구 액체 제제(예컨대 현탁액, 엘릭시르 및 용액)의 경우에는 예를 들어, 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제, 현탁제 등을 사용할 수 있고, 경구 고체 제제의 경우에는 전분, 당, 희석제, 과립제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 담체를 사용할 수 있다. 이들의 투여의 용이성 때문에, 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구 투여단위 형태이고, 이 경우 고체 약학 담체가 사용된다. 필요하다면, 정제는 표준 방법에 의해 당-코팅 또는 장용-코팅될 수 있다. 활성 제제는 코팅외어 위장관을 통과시에 안전하며, 동시에 뇌혈관 장벽을 통과하여 지나갈 수 있도록 해준다. 예를 들어, 국제특허공보 WO 96/11698 를 참조한다.
비경구 투여에 있어서, 화합물은 약학적 담체에 용해되어 현탁 용액으로서 투여될 수 있다. 적절한 담체의 예로서는 물, 식염수, 덱스트로스 용액, 프럭토스 용액, 에탄올, 또는 동물성, 식물성 또는 합성 오일이 있다. 담체는 또한 다른 성분들, 예를 들어, 보존제, 현탁제, 가용화제, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 화합물이 뇌막을 통해 투여되는 경우, 이들은 또한 뇌척수액에도 용해될 수 있다.
활성 제제는 바람직하게는 치료적 유효량으로 투여된다. 투여되는 실제량과 투여 시간은 치료되는 질환의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 투여량, 시간 등에 대한 치료 처방의 결정은 일반적인 당업자 또는 전문가의 역량 내에 있으며, 보통 치료될 질병, 개개 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 당업자에게 알려진 기타 요인을 고려하게 된다. 예시적인 기법과 프로토콜은 상기 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.
대안적으로, 표적화 치료는 표적화 시스템 예컨대 항체 또는 세포 특이적 리간드 또는 특이적 핵산 분자를 사용하여 특정 유형의 세포에 보다 특이적으로 활성제제를 전달하는데 사용될 수 있다. 표적화는 예를 들어 제제가 수용불가능할 정도로 독성이거나 너무 많은 투여량이 요구된다든지 또는 표적 세포에 침입할 수 없다든지의 다양한 이유로 바람직할 수 있다.
이들 제제를 직접 투여하는 대신에, 이들을 표적 세포에서 생성시킬 수 있는데, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 바이러스성 벡터 내에서 또는 미국 특허 5,550,050 및 국제특허공보 WO 92/19195, WO 94/25503, WO 95/01203, WO 95/05452, WO 96/02286, WO 96/02646, WO 96/40871, WO 96/40959 및 WO 97/12635 에 기술된 바와 같은 세포 기재의 전달 시스템에서 생성시킬 수 있다. 벡터는 표적 세포에 표적화될 수 있다. 세포 기재의 전달 시스템은 소정의 표적 부위에 환자의 신체에 임플란팅할 수 있도록 고안되며 표적 제제를 위한 코딩 서열을 포함한다. 대안적으로, 상기 제제는 처리될 또는 표적화될 세포 내에서 생성된 활성화제에 의해 활성형으로의 전환을 위해 전구체 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 유럽특허출원 0 425 731A 및 국제특허공보 WO 90/07936 를 참조한다.
본 발명은 또한 감염 또는 기타 질병 상태의 존재 또는 부재를 측정하는 것으로서 감염이 만성인지의 여부, 개체의 감염에 대한 감수성 및/또는 치료 프로토콜의 효능의 여부를 측정하는 진단 프로토콜에 관한 것이다.
면역학 기재의 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 검출 프로토콜은 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 다수의 항체들은 특정 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 또는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 포함하는 단핵세포 또는 간세포에 각각 다른 특이성을 갖는 어레이에 고정화시킬 수 있다. 생체검사에서 세포는 이후 항체 어레이와 접촉시키고 프리-코어 단백질/HBeAg의 수준 및 유형에 대해 세포 위 또는 세포 내에서 상승되거나 하향 조절시킬 수 있다.
보다 통상적인 다른 분석도 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 분석, 면역침전 분석, 면역형광 분석, 면역화학 분석, 또는 FACS 분석으로 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 또는 이와 동일한 것 또는 단편, 변형체 또는 유도체를 포함하는 세포의 검출 방법에 대한 것으로, 샘플을 항체 또는 이의 단편 또는 유도체와 접촉시키는 단계, 및 상기 항체 및 HBeAg 또는 TLR 또는 단편, 이의 변형체 또는 유도체를 포함하는 복합체의 수준을 통상의 대조군과 비교하여 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 변형된 수준은 감염 또는 기타 다른 질환의 존재 또는 부재를 나타낸다.
바람직하게는, TLR은 TLR-2 및/또는 TLR-4 이다.
상기 언급한 바와 같이, 복합체의 형성을 측정하는 임의의 적절한 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 리포터 분자를 갖는 항체가 면역분석에 사용될 수 있다. 이러한 면역 분석은 이에 제한되지는 않지만 당업자에게 잘 알려진 방사선 면역분석(RIA), 효소 면역 측정법(ELISA) 및 면역 크로마토그래피 기법(ICT), 웨스턴 블롯을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다양한 면역분석법을 개시하고 있는 상기 문헌[Coligan et al., 1991-1997]을 참조할 수 있다. 면역분석법은 경쟁적 분석법을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 정량적 및 정성적 면역분석을 포함한다.
적절한 면역분석 기법은 예를 들어, 미국 특허 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653 에 기술되어 있다. 이들은 통상적인 경쟁적 결합 분석 뿐만 아니라, 비경쟁적 유형의 단일 부위 및 이중 부위 분석 모두를 포함한다. 이들 분석법은 또한 표적 항원에 표지된 항원 결합 분자의 직접 결합을 포함한다. 이 경우 항원은 TLR 또는 이의 단편이다.
이중 부위 분석법은 본 발명의 사용에서 특히 선호된다. 이러한 분석의 다수의 변형이 존재하며, 이들 모두 본 발명에 포함된다.
이중 부위 분석법이 본 발명에 사용하기에 특히 바람직하다. 이러한 분석법의 여러 변형예들이 존재하며, 이들 모두 본 발명에 포함된다. 요약하면, 전형적인 포워드(forward) 분석법의 경우, 표지되지 않은 항원-결합 분자, 예컨대, 표지되지 않은 항체을 고체 기질에 고정화시키고, 테스트할 샘플을 결합한 분자와 접촉하도록 한다. 적당한 항온처리 시간이 지난 후, 항체-항원 복합체가 형성될 만큼의 충분한 시간 동안, 다른 항원-결합 분자, 적합하게는 검출가능한 신호를 낼 수 있는 레포터 분자로 표지된, 항원에 특이적인 제2 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 다른 복합체가 형성되도록 충분한 시간 동안 항온처리한다. 반응하지 않은 임의의 물질을 세척해내고, 항원의 존재를 레포터 분자가 내는 신호를 관찰하여 결정한다. 이러한 결과는 시각적인 신호의 단순한 관찰에 의해 정성적으로 분석될 수도 있으며, 또는 공지된 양의 항원을 함유하는 대조군 샘플과 비교하여 정량적으로 분석될 수도 있다. 포워드 분석법의 변형예로서, 샘플과 표지된 항체 모두를 동시에 결합된 항체에 첨가하는 동시적 분석법이 있다. 이러한 기법은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 당업자에게 자명한 약간의 변형도 포함하는 것이다.
전형적인 포워드 분석법의 경우, 항원 또는 그의 항원부에 특이성을 가지는 제1 항체를 고체 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합시킨다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이며, 가장 보편적으로 사용되는 중합체는 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌이 있다, 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크, 또는 면역분석을 수행하기 적합한 다른 임의의 표면의 형태일 수 있다. 결합 과정은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 가교결합성 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 구성되며, 중합체-항체 복합체를 테스트 샘플 제조시 세척한다. 그 후, 테스트할 샘플의 분취액을 고체상 복합체에 첨가하고, 존재하는 임의의 항원이 항체에 결합하도록 해주는 충분한 시간 및 적절한 조건하에서 항온처리한다. 항온처리 시간이 지난 후, 항원-항체 복합체를 세척 및 건조하고, 항원의 일부에 특이적인 제2 항체로 항온처리한다. 제2 항체는 일반적으로 제2 항체가 항원에 결합하였는지를 알려주는데 사용되는 레포터 분자를 가진다. 결합된 레포터 분자에 의해 측정되는 바와 같은, 표지된 항체의 결합량은 고정화된 제1 항체에 결합한 항원의 양에 비례한다.
대안적인 방법은, 생물학적 샘플에 존재하는 항원을 고정화시킨 후, 이를 항체(레포터 분자로 표지되거나 표지되지 않을 수 있음)에 특이적인 고정화된 항원에 노출하는 것을 포함한다. 표적의 양 및 레포터 분자 신호의 강도에 따라, 항체로 직접 표지함으로써 결합된 항원을 검출할 수 있다. 대안적으로, 제1 항체에 특이적인, 제2 표지된 항체를 표적-제1 항체 복합체에 노출시켜, 표적-제1 항체-제2 항체 3차 복합체를 형성할 수도 있다. 이 복합체는 레포터 분자가 방출하는 신호에 의해 검출된다.
상기로부터, 항원 결합 분자와 관련된 리포터 분자는 하기를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다;
(a) 항체로의 리포터 분자의 직접 결합;
(b) 항체로의 리포터 분자의 간접적 결합; 즉, 후속적으로 항체에 결합하는 다른 분석 시약으로의 리포터 분자의 결합; 및
(c) 항체의 후속 반응 생성물로의 결합.
리포터 분자는 크로모겐, 촉매, 효소, 형광색소, 화학발광 분자, 상자성 이온, 란탄계열 이온 예컨대 유로퓸(Eu34), 핵 태그 및 직접 시각 표지를 포함하는 방사성동위원소를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
직접 시각 표지의 경우, 콜로이드 금속성 또는 비금속성 입자, 염료 입자, 효소 또는 기질, 유기 중합체, 라텍스 입자, 리포좀, 또는 신호를 생성하는 물질 등을 포함하는 다른 비히클을 사용할 수 있다.
레포터 분자로 사용하기 적합한 여러 효소들에 대해서는 미국특허번호 U.S. 4,843,000, 및 U.S. 4,849,338에 공개되어 있다. 본 발명에 유용한 적합한 효소에는, 알칼리성 포스파타제, 호르세라디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase), 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 클루코즈 옥시다제, 라이소자임, 말레이트 디히드로게나제 등이 있다. 이러한 효소는 단독으로 또는 용액 중 제2 효소와의 조합물로 사용할 수 있다.
적합한 형광색소로는, 이에 제한되지는 않지만, 플루오레스세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC), R-피코에리트린(RPE), 및 텍사스-레드(Texas Red)가 포함된다. 다른 예시적인 형광색소로는, 국제특허공보번호 WO 93/06121에 기술된 것이 포함된다. 미국특허 제5,573,909호 및 제5,326,692호에 기술된 형광색소에 대한 것도 참고할 수 있다. 대안적으로, 미국특허 제5,227,487호, 제5,274,113호, 제5,405,975호, 제5,433,896호, 제442,045호, 제5,451,663호, 제5,453,517호, 제5,459,276호, 제5,516,864호, 제5,648,270호 및 제5,723,218호에 기술된 형광색소에 대한 것도 참고할 수 있다.
효소 면역분석법의 경우, 효소를 일반적으로 글루타르알데히드 또는 페리오데이트로 제2 항체에 컨쥬게이트한다. 그러나, 쉽게 인식하는 바와 같이, 당업자가 용이하게 이용가능한 폭넓은 상이한 컨쥬게이션 기법이 존재한다. 특이적 효소와 함께 사용되는 기질은 일반적으로 대응되는 효소에 의한 가수분해시, 검출가능한 색깔 변화를 내도록 선택된다. 적합한 효소의 예에는, supra에 기술된 것이 포함된다. 전술한 발색성 기질 대신, 형광성 생성물을 내는 형광성 기질을 사용하는 것도 가능하다. 모든 경우에, 효소-표지된 항체를 제1 항체-항원 복합체에 첨가하여, 결합하도록 한 후, 과량의 시약을 세척해낸다. 그 후, 적절한 기질을 함유하는 용액을 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 제2 항체에 결합된 효소와 반응하여, 정량적인 시각적 신호를 낼 것이며, 이러한 신호는 일반적으로 분광학적으로 추가 정량분석되어, 샘플 중에 존재하는 항원의 양을 지시해주게 된다.
대안적으로, 형광성 화합물, 예컨대, 플루오레스세인, 로다민 및 란탄족원소, 유로퓸(EU)은, 이들의 결합 용량에 변화없이 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장 빛의 조사로 활성화되는 경우, 형광색소-표지된 항체는 빛 에너지를 흡수하여, 분자를 민감한 상태로 유도한 후, 광현미경에 의해 시각적으로 검출가능한 특정적인 색깔로 빛을 방출하게 된다. 형광-표지된 항체를 제1 항체-항원 복합체에 결합시킨다. 결합하지 않은 시약을 세척한 후, 잔여 3차 복합체를 적절한 파장의 빛에 노출시킨다. 관찰된 형광도는 대상 항원의 존재를 나타내준다. 면역형광계 분석법(IFMA) 또한 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 그러나, 다른 레포터 분자, 예컨대 라디오이소토프, 화학발광성 또는 생물발광성 분자도 사용할 수 있다.
프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR에 대한 모노클로날 항체는 TLR의 ELISA-매개 검출에도 사용할 수 있다. 이는 여러 방법으로, 예컨대, 항-프리-코어 단백질/HBeAg 또는 항-TLR 항체를 지지체에 고정화시키고, 이들을 간 세포와 접촉하는 방법으로 수행할 수 있다. 그 후, 표지된 항-프리-코어 단백질/HBeAg 또는 항-TLR 항체를 고정화된 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 검출에 사용한다. 대안적으로, 다른 간 세포 표면 마커에 대한 항체도 사용한다. 이러한 분석법은 다양한 방법으로 변형될 수 있으며, 이러한 모든 변형은 본 발명에 포함된다. 이러한 접근법은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 수준의 신속한 검출 및 정량화를 가능케 한다.
본 항체는 또한 현장 하이브리드화, 예컨대, 생체검사 물질의 현장 하이브리드화에도 유용하다. 이러한 분석법은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR, 예컨대 TLR-2 및 TLR-4의 수준의 신속한 진단을 가능케 한다.
진단적 분석법은 FACS 또는 웨스턴 블롯 과정에 기초한 것이 바람직하다.
다른 구체예에서, 검출 방법은 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포내 발현 수준을 검출하는 것을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 발현은 임의의 적합한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 코딩하는 표지된 폴리뉴클레오티드를, 세포에서 수득된 RNA 추출물의 노던 블롯에 있어 프로브로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 증폭 반응, 예컨대 RT PCR에서, 동물 유래의 핵산 추출물을 키나제 또는 이의 측면 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 서열에 대응되는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 같이 사용한다. 여러 자동화된 고체상 검출 기법들 또한 적합하다. 예를 들어, 매우 큰 규모인 고정화된 프라이머 어레이(VLSIPS(상표명))를 핵산 검출에 사용할 수 있으며, 이에 대해서는 예를 들어, 문헌[Fodor et al., Science. 251: 767-777, 1991 및 Kazal et al., Nature Medicine, 2: 753-759, 1996]에 기술되어 있다. 상기 유전적 기법들은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
예를 들어, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 코딩 RNA 전사물의 경우, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR RNA를 함유할 것으로 예측되는 세포 샘플로부터 RNA를 분리하였다. 본 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, TRIZOL(상표명) 시약(GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, Md.)을 사용하여, RNA를 분리할 수 있다. 올리고-dT, 또는 랜덤-서열 올리고뉴클레오티드, 및 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 역전사효소 반응에서 프라이머로 사용하여, 분리된 RNA로부터 첫번째 가닥의 cDNA를 제조할 수 있다. 결과 얻어진 첫번째 가닥의 cDNA를 PCR 반응으로 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시켜, 증폭된 생성물을 수득한다.
"폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 미국특허 제4,683,195호에 기술된 바와 같이, 핵산, RNA 및/또는 DNA의 기선택된 단편의 양을 증폭시키는 과정 또는 기법을 나타낸다. "PCR"에 대한 언급에는 다중 PCR이 포함된다.
일반적으로, 관심 영역의 말단부 또는 그 바깥부에 대한 서열 정보를 올리고뉴클레오티드 프라이머의 디자인에 사용한다. 이러한 프라이머는 증폭될 주형의 ㅂ반대 가닥 서열과 동일 또는 유사할 것이다. 특이적 RNA 서열 및 총 세포 RNA로부터 전사된 cDNA를 증폭시키는데 PCR을 사용할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Mullis et al.(Quant. Biol. 51: 263,1987; Erlich, eds., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989)]을 참고하길 바란다. 따라서, PCR에 의한 특이적 핵산 서열의 증폭은, 보전된 뉴클레오티드 서열을 가지는 "프라이머" 또는 올리고뉴클레오티드에 의존적이다(이때, 보전된 서열은 관련 유전자 또는 단백질 서열의 배열, 예를 들어, 포유동물 TLR 유전자의 서열 비교로부터 유추된다). 예를 들어, 한 프라이머는 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR을 코딩하는 cDNA 분자의 안티센스 가닥에 어닐링(annealing)하도록 제조하며, 다른 프라이머는 이의 센스 가닥에 어닐링하도록 제조한다.
증폭된 생성물을 검출하기 위해, 반응 혼합물에 전형적으로 아가로즈 겔 전기영동 또는 다른 편리한 분리 기술법을 적용하며, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 특이적 증폭된 DNA의 상대적인 존재를 검출하였다. 예를 들어, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR 증폭된 DNA는 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 서던 하이브리드화를 이용하여 검출하거나, 또는 공지된 분자 질량을 가지는 DNA 표준과 전기영동 이동성을 비교한다. 증폭된 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR DNA의 분리, 정제 및 특징분석은, 겔로부터 단편을 잘라내어 용출하고(예를 들어, 문헌[Lawn et al., Nucleic acids Res. 2: 6103, 1981; Goeddel et al., Nucleic acids Res. 8: 4057-1980] 참고), 증폭된 생성물을 적절한 벡터, 예컨대 pCRII 벡터(Invitrogen)의 클로닝 위치에 클로닝한 후, 클로닝된 삽입물의 서열을 밝히고, 그 DNA 서열을 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR의 공지된 서열과 비교함으로써, 수행할 수 있다. 그 후, 프리-코어 단백질/HBeAg 또는 TLR mRNA 및 cDNA의 상대적인 양을 측정할 수 있다.
실시간 PCR은 PCR 유전자의 전사 수준을 측정하는데 특히 유용하다. 전사 활성의 측정에는 이용가능한 mRNA 전사물에 기초한 잠재적인 번역 활성의 측정도 포함된다. 실시간 PCR뿐만 아니라 다른 PCR 과정도, DNA 결합 형광물질(fluorophores), 5' 엔도뉴클레아제, 인접한 라이너 및 헤어핀 올리고프로브 및 자가-형광 앰플리콘(amplicon)의 결합을 포함하는 PCR 생성물의 검출을 위한 여러 화학물질을 사용한다. 이러한 화학물질 및 실시간 PCR에 대해서는 일반적으로 예를 들어, 문헌[Mackay et al., Nucleic Acids Res. 30(6): 1292-1305, 2002; Walker, J Biochem. Mol. Toxicology. 15(3): 121-127,2001; Lewis et al., J. Pathol. 195:66-71, 2001]에 언급되어 있다.
본 발명은 추가적으로 mRNA 전사물의 상향 또는 하향조절용 스크리닝을 위한, 유전자 어레이 및/또는 유전자 칩 및/또는 RNAse 보호법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양태는 HBeAg 전사물의 하향조절 또는 TLR 유전자 전사물의 조절을 초래하는 조건을 확인하는데 특히 유용하다.
추가적인 방법에서, TLR 시그날링의 직접적 또는 간접적인 결과로 생성 또는 블록된 세포외 사이토카인을 스크리닝할 수 있다. 적절한 사이토카인의 예에는, TNF-α, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ가 포함된다. 간편하게는, 3개의 사이토카인을 혈청, 전체 혈액, 소변 또는 다른 유체 중에서 스크리닝한다. 세포외 또는 세포내 HBeAg의 수준도 측정할 수 있다.
본 발명을 이하 비제한적인 실시예로 추가로 설명한다.
실시예 1
TLR2 및 TLR4 수준의 측정
방법
HBV 바큘로바이러스로 감염된 HepG2
HepG2 세포를 HBV 1:3 야생형, HBV 1:3 프리코어 돌연변이 또는 모의(mock) 바큘로바이러스로 감염시키고, 유동 세포측정법(flow cytometry)을 위해 염색하기 이전에 7일 동안 배양하였다. 일부 세포는 RNeasy 미니 킷트(Qiagen)를 이용하여 이하 제조자의 설명에 따라 총 RNA를 추출하기 위해 보관하였다.
유동 세포측정법
세포 표면 염색은 TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience) 및 TLR4-PE(HTA125; eBioscience) 항체를 이용하여 HepG2 세포 상에서 수행하였다. 적절한 이소타입 대조군을 사용하였다. 죽은 세포는 이의 산발 프로파일에 기초하여 배제시켰다. 실험은 FACSCalibur 유동 세포측정기(BD)에서 수행하였다. 각 샘플에 대해 총 10000개의 세포를 획득하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc.)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 야생형 또는 프리코어 돌연변이로 감염된 세포의 기하 평균 형광도에서 모의 감염된 세포의 기하 평균 형광도를 감하여 상대적인 형광도를 측정하였다.
QPCR
cDNA의 실시간 PCR 분석 이전에 총 RNA를 랜덤 헥사머를 사용하여 역전사시켰다. PCR은 TaqMan 유니버샬 PCR 마스터 믹스 및 에세이-온-디맨드(Assays-On-Demand) 유전자 발현 분석 프로브 및 프라이머(Applied Biosystems)를 이용하여 최종 10 ㎕ 부피로 3회 반복 수행하였다. 신호 검출은 ABI Prism 7700 서열 검출 시스템을 50℃, 2분; 95℃, 10분; 95℃ 15초, 40 사이클; 60℃, 1분으로 프로그래밍하여 사용하였다. 각각의 유전자의 감지 사이클(threshold cycle, CT) 값을 18S의 CT 값(ΔCT)과 비교하여, 각각의 샘플에 대한 상대적인 발현 단위(relative expression unit, REU)를 계산하였다. 따라서, REU= 2^CT(대상 유전자)-CT(18S)=2^ΔCT
결과
이 결과는 도 1 및 2 및 표 3에 나타낸다. TLR2 및 TLR4의 수준을 HBV 야생형과 프리-코어 돌연변이 HBV로 감염된 세포에서 비교하였다.
Figure 112006093063449-PCT00005
실시예 2
만성 HBV 감염시 손상된 TLR 발현
환자
간의 생체검사
CHB를 가지는 5명의 환자에서 단회성(single pass) 간 생체검사를 수행하였다. 이들 환자는 대학 교습 병원의 전문 간 외래환자 클리닉에 참석한 임상적으로 안정된 환자들이었다. 이들은 정상이거나 또는 약간 높은 트랜스아미나제 농도를 가졌다(평균 ALT 87.8 U/L(N<45); 평균 AST 32.2 U/L(N<45). Ishak 변형 조직 활성 지수 스코어는 1/6-3/6의 질병 단계에 따라 1/18-7/18로 다양하였다. 5명의 환자 중 4명은 HBeAg 양성이였으며, 바이러스 복제가 진행중이었다(HBV DNA 200-1.1 x 108 카피/ml, 평균 1500 카피/ml). 단일 세포 현탁을 수행하는 실험실로 보내기 위해, 생체조직을 RPMI-1640(Gibco-BRL)에 유지시켰다. 생체조직의 절반(1.5 x 8 mm)을 헐거운 피스톨을 이용하여 와어어 메쉬 또는 유리 호모게나이저에 위치시키고, 다른 세포와 혼합되어 있는 약 6 x 104개의 간세포를 분리시켰다. 수용체 손상을 피하기 위해, 이 과정에서는 콜라게나제 또는 DNAse를 사용하지 않았다. 그 후, 이러한 단일 세포 현탁물을 적절한 항체로 염색하고, 유동 세포측정법(이하 참고)으로 분석하였다.
B형 간염 바이러스 시약 및 시험관내 모델 세포 배양 시스템
세포 배양
인간 간아세포종 세포주 HepG2는 페니실린 및 스트렙토마이신, L-글루타민 및 10% v/v 열로 비활성화된 소태아 혈청(FCS)(Invitrogen)이 첨가된 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium, MEM; Invitrogen/Gibco)에서 유지하였다. 모든 세포주는 일주일마다 계대하고, 37℃, 5% v/v C02에서 3일마다 배지를 교환하면서 유지하였다. 인간 간종양(Huh-7) 세포는 10%의 열로 비활성화된 FCS, 100 U/ml 페니실린 G, 및 100 U/ml 스트렙토마이신(Gibco-BRL)이 첨가된, 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY)에서 유지하였다.
인간 간종양 세포주 PLC/PRF/5는 경우에 따라 필라멘트를 가지는 주로 22 nm 입자 형태로 HBsAg를 세포 배양 상청액으로 방출한다(Alexander et al, S. Afr Med J 54(23):973-974, 1978). 이들 세포는 10% FCS를 함유하는 MEM에서 배양 및 유지하며, HBV는 생성하지 않는다. 세포주는 미국 모식균 배양소(American Type Culture Collection, ATCC: CTL-8024)에서 얻었다(미코플라즈마 비함유). PLC/PRF/5 세포에서 얻은 세포 배양 상청액을 접종 5일 이후에 회수하여, 효소 면역분석(IMX: Abbott Laboratories, North Chicago, ILL)으로 평가시 HBsAg 수준(> 1 ㎍/ml)이 높았다.
일시적인 형질감염에 의한 B형 간염 바이러스 생성
Fugene 6 시약(Roche, IN)을 사용하여 HBV의 감염성 cDNA 클론으로 HepG2 세포를 형질감염시켜 재조합 HBV를 얻고(Chen et al, Hepatology 27(1):27-35, 2003), 5일 후, 세포 배양 상청액을 회수하였다. 분비된 바이러스를 함유하는 상청액을 회수하고 모은 후, 원심분리하여 세포 단편을 펠렛화시켰다. 그 후, SW28 로터(Beckman)를 사용하여, 20% 수크로즈 쿠션(20% w/v 스크로즈, 1 mM EDTA, 30 mM Tris pH7.4, 150mM NaCl)에서 16시간 동안 25,000 rpm, 12℃로 상청액을 초원심분리하여 HBV를 농축하였다.
펠렛화된 물질내에 존재하는 바이러스의 양을 확인하기 위해, 20 ㎕의 농축된 HBV의 분취액에 대해 MagNA Pure(Trade Mark) 추출 시스템을 제조자 지시에 따라 이용하여 DNA를 추출하였다. 그 후, 제조자의 지시에 따라 ARTUS 실시간 PCR 키트를 사용하여 Light-Cycler(Roche)에서, HBV DNA의 양을 타이터(titre, 바이러스 게놈 카피/ml로 표현됨)로 분석하였다. 또한 상기 샘플에 대해 표준 효소 면역분석(IMX: Abbott Laboratories, North Chicago, ILL)을 이용하여 HBsAg 및 HBeAg도 테스트 하였다.
HBV 프리코어 및 코어 단백질 생산 세포주
HBV 프리코어 및 코어 단백질을 엄격히 유도성으로 발현하는 Huh-7 세포는, 유전자형 D cDNA(Chen 2003 Supra) 유래의 HBV 코어 또는 프리코어 유전자를 테트라사이클린 반응성 발현 시스템(pTRE-2; Clontech, Palo Alto, CA)에 클로닝하여 제조하였다. 이러한 3개의 세포주 PC47(프리코어 생산), C4B(코어 생산) 및 Parent(대조군 세포주)의 제조 및 특성에 대해서는 상세히 공개되어 있다(Locamini et al., J Clin Virol. 32:113-21, 2005). 배양 10일 후, 테트라사이클린의 존재시(단백질 발현 억압) 또는 부존재시(단백질 발현 유도)의 배양물로부터 세포 배양 상청액을 회수하였다.
재조합 HBV 바큘로바이러스가 형질도입된 세포
앞서 언급한 바와 같이(Chen 2003 Supra), 1.3 게놈 길이의 야생형(WT) HBV 주형(유전자형 D, 서브타입 ayw)(Invitrogen, Stratagene, CA)을 사용하여, 위치-지정 돌연변이시키고 공동형질감염하여, 재조합 HBV 바큘로바이러스 작제물을 얻었다. 그 후, HepG2 세포를 대조군, WT, 및 프리코어 돌연변이 재조합 HBV 바큘로바이러스로, 세포(22,23) 당 50 플라크 형성 단위(PFU)의 감염 다중도(MOI)로 대등하게 형질도입하였다. 세포 배양 배지를 형질도입 1, 3 및 5일 이후에 교환하고, 7일째 되는 날 세포를 회수하였다.
전체 혈액 배양물의 시험관내 HBV 자극
500 ㎕의 전체 리튬-헤파린 혈액을 500 ㎕의 RPMI-1640(항생제 및 5% v/v 열로 비활성화된 태아 소혈청이 첨가됨)로 희석하고, 뚜껑을 단단히 닫은 5ml 폴리스티렌 튜브(Becton Dickinson, San Jose, CA) 내에서 온화하게 회전시키면서 37℃에서 배양하였다. 1, 10 및 50 x 106개의 바이러스 게놈 카피/ml 농도의 HBV 야생형 1.5(유전자형 A), 1 ㎍/ml 라미부딘, PLC/PRF/5 세포(HBsAg) 유래의 세포 상청액 또는 HBV 프리코어(pC47: HBeAg-양성) 또는 코어 단백질(C4B) 생산 세포주 유래의 상청액, 및 적절한 대조군 세포주로 세포를 자극시켰다. 20시간 이후, 세포 배양 상청액을 회수하고, 사이토카인 분석에 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 남은 세포는 유동 세포측정법을 위해 염색하였다.
TNF-α ELISA
TNF-α는 제조자의 지시에 따라 OptEIA 셋트(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 캡쳐 ELISA에 의해 측정하였다. ELISA의 감도는 8 pg/ml이었다.
유동 세포측정법
간 세포 현탁액
세포 표면 염색은, CD14-PerCP(MφP9; Becton Dickinson, San Jose, CA), TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA) 및 TLR4-PE(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)를 사용하여, 환자의 간 생체조직에서 유래된 간 세포 현탁액에서 수행하였다. 적절한 이소타입 대조군을 사용하였다. CD14 표면 발현량에 따라 세포를 게이팅(gating) 하였다; 고 CD14 또는 저 CD14. 이는 이의 산란 프로파일과 관계가 있었다. 고 CD14 세포(간세포)는 저 CD14 세포(Kupffer 세포)보다 크기가 더 크고 더 과립형을 가진다.
환자 혈액
세포 표면 염색은, 전술한 바와 같이(Riordan et al., Hepatology 37:1154-64, 2003), CD14-PerCP(MφP9; Becton Dickinson, San Jose, CA), TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA) 및 TLR4-PE(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)를 사용하여, 신선한 리튬-헤파린 혈액에서 수행하였다. 적절한 이소타입 대조군을 사용하였다. 이의 산란 프로파일에 기초하여, FACSCalibur 유동 세포측정기(Becton Dickinson, San Jose, CA) 상에서 임파구 꼬리를 골라내어 단핵세포를 게이팅 하였다. 각각의 샘플에 대해 총 8000개의 CD14+ 단핵세포를 수득하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc., Ashland, OR)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 상대적인 형광도는, 샘플의 기하평균 형광도의 이에 매칭되는 이소타입 대조군의 기하평균 형광도에 대한 비율로 측정하였다. 결과는 TLR의 %변화로 표현하였다.
전체 혈액 배양물
세포 표면 염색은, CD14-PerCP(MφP9; Becton Dickinson, San Jose, CA), TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA) 및 TLR4-PE(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)를 사용하여, 전체 혈액 배양물에서 수행하였다. 적절한 이소타입 대조군을 사용하였다. 이의 산란 프로파일에 기초하여, FACSCalibur 유동 세포측정기(Becton Dickinson, San Jose, CA) 상에서 임파구 꼬리를 골라내어 단핵세포를 게이팅 하였다. 각각의 샘플에 대해 총 8000개의 CD14+ 단핵세포를 수득하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc., Ashland, OR)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 상대적인 형광도는, 샘플의 기하평균 형광도의 이에 매칭되는 이소타입 대조군의 기하평균 형광도에 대한 비율로 측정하였다. 결과는 TLR의 %변화로 표현하였다.
인간 간종양 세포주
후속 유동 세포측정법을 위해, 세포 조건과 수용체 보전을 최적화시키기 위해, 모든 인간 간 세포주 단일층을 행크스 균형화 염 용액(Hank's balanced salt solution)(칼슘, 마그네슘 비함유)로 5번 세척한 후, Versene 용액(0.02% w/v EDTA.4Na, 행크스 균형화 염 용액과 1:1로 혼합됨)에서 항온배양하여, 세포 단일층을 탈착시켰다. 그 후, 유동 세포측정을 위한 염색 이전에, 무혈청 MEM을 단일 세포 현탁액 제조에 사용하였다. 세포를 실온에서 회수한 직후, 세포를 TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA) 및 TLR4- APC(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)로 염색하였다. 세포를 PBS + 1% v/v 포르말린으로 고정시키고, 염색 직후 바로 러닝(running) 하였다.
정량적 PCR
제조자의 지시에 따라 RNeasy MiniKit(Qiagen)를 사용하여 세포주로부터 RNA를 분리하였다. RNA를 컬럼으로부터 50 ㎕의 뉴클레아제를 함유하지 않는 물로 용출시켜, -70℃에서 저장하였다. RNA의 농도는 OD 260 nm에서 분광학적으로 계산하였다.
랜덤 헥사머를 사용하여 RNA의 러그(lug)로부터 cDNA를 합성하였다. 얻어진 cDNA 샘플은 -70℃에서 저장하였다.
TaqMan 실시간 PCR(QPCR)을 에세이-온-디맨드(Assays-On-Demand) 유전자 발현 제품(Applied Biosystems) 및 ABI Prism 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 384-웰 플레이트에서 수행하였다. PCR 생성물의 상대적인 양은 비교적인 Ct 방법을 사용하여 측정하였으며, 이 방법에서 표적 DNA의 양은 18s 리보좀 RNA에 대해 정규화되며, 모의 cDNA(2-deltadeItaCT)에 대해 상대적인 값이다.
결과
말초 혈액과 간세포는 유사한 TLR2의 하향조절을 보였다
HBeAg-양성 CH-B인 환자 4명, HBeAg-음성 CH-B인 환자 3명 및 지방증(steatosis) 대조군 환자 5명의 간 생체조직에 대해 말초 혈액 및 간세포를 검사하였다. 이들 간 세포조직의 간세포를 상기 "방법" 섹션에서 기술한 바와 같이 단일 세포로 분리하고, 2개의 분리된 CD14+ve 세포 집단을 도 3에 나타낸 바와 같이 유동 세포측정법에 의해 게이팅 하였다. 이들 두 집단에서(하나는 간세포를 나타내고, 다른 하나는 Kupffer 세포를 나타냄), TLR2 및 TLR4를 측정하였다(도 4 및 5). 간세포에서도 TLR2이 검출되며, 이의 발현 수준은 HBeAg 음성 CHB 및 지방증 환자에 비교하여 HBeAg 양성 CHB의 간세포에서 하향조절되었다(도 5). 이러한 TLR2의 하향조절은 말초 혈액에 대한 이전의 설명들이 HBV 감염된 환자의 간세포 및 Kupffer 세포 모두에서도 분명하다는 것을 확인해 주는 것이다(도 5)(Visvanathan et al, GUT 52:130, 2003). TLR4 발현 수준은 3개의 그룹 사이에서 현저히 다르지는 않았다.
HepG2 세포의 바큘로바이러스 작제물
임상적으로 관찰되는 TLR 경로와 프리코어 단백질간의 상호작용에 대해 추가적으로 밝히기 위해, 본 발명자는 HepG2 세포의 재조합 HBV 바큘로바이러스 형질도입 시스템을 시험관내에서 사용하였다. HepG2 세포를 대조군, 야생형 또는 프리코어 돌연변이 재조합 HBV 바큘로바이러스로 동등하게 형질도입시키고, 7일 후 전술한 유동 세포측정법을 이용하여 TLR2 및 TLR4의 발현을 확인하기 위해 염색하였다(도 4).
형질도입된 세포에 대해 양 측정을 위해 RNA를 추출하고, 실시간 PCR로 TLR2, TLR3, TLR4(2개의 전사체 변이체) TLR9 및 TNF-α의 mRNA 수준을 확인하였다. TLR2 및 TLR4의 기하평균 형광도는 이소타입 대조군 항체의 기하평균 형광도에 대한 비율로 표현하며, 데이터는 TLR의 % 변화로 나타내었다.
이러한 유동 세포분석 실험의 결과는, 프리코어 돌연변이 바이러스(HBeAg-음성)가 형질도입된 HepG2 세포가, 야생형 바이러스(HBeAg-양성)가 형질도입된 HepG2 세포와 비교할 때, TLR2 수준이 현저하게 증가되었음을 보여주었다. TLR4 발현 수준은 3개의 그룹 사이에서 현저히 다르지는 않았다. 이 결과는 반복 실험을 통해 확인하였다.
각각의 전사체에 대한 PCR 생성물의 상대적인 양은 도 6에 나타내었으며(이하 패널 참고), 비교적인 Ct 방법을 사용하여 측정하였으며, 이 방법에서 표적 DNA의 양은 18s 리보좀 RNA에 대해 정규화되며, 이미 설명한 바와 같이 모의 cDNA에 대해 상대적인 값이다. 상기 데이터는 3번의 별개 실험에서 평균 및 표준 에러를 나타낸다. 주목할만한 특징은, 프리코어 돌연변이(HBeAg-음성)가 형질도입된 세포에서 TLR2 mRNA가 상향조절된다는 것이며, 반면 야생형 HBeAg-양성으로 형질도입된 세포의 전사체는 두드러지게 하향조절된다는 것으로, 이들 두 값은 모두 대조군 세포에 대해 비교된 것이다. 재조합 HBV 바큘로바이러스가 형질도입된 세포는 HBeAg 상태와 관계없이, TLR3, TLR4 및 TLR9가 하향조절되었다(도 6). 가장 중요한 것은, 메세지(도 6) 및 단백질 수준 모두에서의 상응하는 TNF-α의 생성 감소가 TLR2의 감소와 함수적 대응관계를 가진다.
HBV 및 이의 성분을 이용한 전체 혈액의 자극
본 발명자는 다음으로 HBV 및 이의 개별적인 항원 성분의 희석율을 다양하게 하면서, 전체 혈액의 시험관내 자극을 조사하였다. 항온배양 20시간 이후, 유동 세포측정법에 의해 혈액에 대해 CD14 양성 단핵세포상에서 TLR2 및 TLR4의 발현을 분석하였다(도 5). 추가적으로, 이들 자극물로부터 상청액을 회수하여, ELISA에 의해 TNF-α를 측정하였다(도 6). CD14+ 세포를 HBV에 노출하면, TLR2의 억제는 두드러지나, TLR4는 그러하지 않았으며, 이는 만성 HBeAg-양성 HBV 감염을 가지는 환자에서 얻은 임상 데이터를 추가적으로 확인시켜 주는 것이다. TNF-α 억제는 TLR2 감소와 대등하며, 이는 자극 실험에서 TLR의 감소와 함수적 대응관계가 있음을 보여주는 것이다. 또한, 프리코어 단백질 자극은 야생형 바이러스에서 보여지는 TNF-α 억제와 동등하게 유사하며, 이는 프리코어 단백질 자극이 CHB에서 TLR2를 하향조절해주는 인자일 수 있음을 나타내는 것이다.
본 기술 분야의 당업자라면 본 명세서에 기술된 발명이 상세히 서술된 것 이외의 변형예나 변화예에도 미친다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 이러한 변형예나 변화예 모두를 포함하는 것임을 이해해야 한다. 본 발명은 또한, 본 명세서에서 지시하거나 언급한 단계, 특징, 조성물 및 화합물 모두를 개별적으로 또는 통합적으로 포함하며, 이들 단계나 특징의 임의의 2개 이상의 모든 조합도 포함한다.
참조 서적 목록
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Claims (19)

  1. TLR 시그널링의 수준을 조절하는 HBV-특이적 이펙터(effector) 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 병태(disease condition) 또는 병인(predisposition)의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재, 또는 TLR 또는 TLR 시그널링 경로 내의 구성요소의 상승 또는 감소 수준은 HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 관련 병태 또는 병인의 존재를 표시하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 프리-코어(pre-core) 발현 생성물은 세포내 형태인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 프리-코어 발현 생성물은 세포외 형태인 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TLR은 TLR-2 또는 이의 상동체인 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, TLR 시그널링의 수준은 TLR 또는 TLR-2를 코딩하는 mRNA의 양으로 측정되는 TLR 또는 TLR-2의 수준으로 결정하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물 또는 TLR의 수준은 단백질 수준에서 측정하는 것인 방법.
  7. TLR 시그널링을 조절하는 HBV-특이적 이펙터 분자의 수준 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, HBV에 의한 감염 또는 병태의 발달에 대한 치료 프로토콜에 대한 반응을 모니터링하는 방법으로서, 상기 이펙터 분자의 존재 또는 부재, 또는 TLR 또는 TLR 시그널링 경로 내의 구성요소의 상승 또는 감소 수준은 HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 관련 병태 또는 병인의 존재를 표시하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, HBV는 프리-코어 및/또는 BCP 돌연변이체인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, HBV-특이적 이펙터 분자는 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물인 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, TLR은 TLR-2 또는 이의 상동체인 것인 방법.
  11. 제7항 또는 제10항에 있어서, TLR 시그널링의 수준은 TLR 또는 TLR-2를 코딩하는 mRNA의 양으로 측정되는 TLR 또는 TLR-2의 수준으로 결정하는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물, 또는 TLR 또 는 이의 상동체의 수준은 단백질 수준에서 측정하는 것인 방법.
  13. HBV에 감염된 대상체, 또는 이에 대한 병태 또는 병인을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물의 수준을 하향(down)-조절하거나 또는 TLR의 수준을 상향(up)-조절 또는 하향-조절하는 백신을 포함하는 유효량의 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, HBV는 프리-코어 및/또는 BCP 돌연변이체인 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, HBV-특이적 이펙터 분자는 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물인 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, TLR은 TLR-2 또는 이의 상동체인 것인 방법.
  17. 제13항 또는 제16항에 있어서, 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물 또는 TLR의 수준은 이를 코딩하는 mRNA의 양으로 측정하는 것인 방법.
  18. 제13항 또는 제16항에 있어서, 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물 또는 TLR의 수준은 단백질 수준에서 측정하는 것인 방법.
  19. HBV에 의한 감염, 또는 이에 대한 병태 또는 병인을 치료하기 위해 사용되는 약학 조성물 또는 백신으로서, 세포내 또는 세포외 프리-코어 발현 생성물의 조절인자(modulator), 경우에 따라 TLR 또는 이의 상동체의 조절인자, 및 1 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물 또는 백신.
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