CN111139299A - Josd2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Josd2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供JOSD2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，所述JOSD2蛋白的序列如SEQ ID No：1所示。本发明实验证明JOSD2高表达的恶性肿瘤患者生存期显著低于低表达的患者，且在癌组织中的表达明显特异性高于正常组织；而在癌细胞中敲低JOSD2蛋白可显著抑制癌细胞的增殖和平板克隆形成能力；此外，在癌细胞中敲低JOSD2蛋白可完全抑制癌细胞体内移植瘤形成能力。本发明可制备诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品和JOSD2 siRNA以及JOSD2抑制剂，可作为诊断恶性肿瘤及预测恶性肿瘤预后的特异标志蛋白，使恶性肿瘤诊断更加准确和快速，为防治恶性肿瘤提供新的靶点治疗有效新药。

Description

JOSD2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一个蛋白的应用，尤其涉及一种JOSD2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命。其中肺癌等是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤。近年来，针对肺癌等的靶向治疗获得一定进展，围绕EGFR、EML-ALK、MET等分子靶点研发的药物已成功使部分肺癌患者获益，然而这一比例仅为20-30％左右。大部分(约70-80％)肺癌等患者因上述靶点未被激活，无法使用吉非替尼、克唑替尼等分子靶向药物，导致治疗失败。而免疫检查点抑制剂虽已获批用于晚期肺癌的治疗，但客观缓解率仅为10-20％，仍有大量患者无法从中获益。这些数据说明，寻找促进肺癌等癌细胞异常增殖的新分子靶点与信号通路，并基于该靶点和信号通路研究肺癌治疗的新方法和新手段，是目前肺癌治疗药物研究的热点和难点问题。
人JOSD2蛋白是由JOSD2基因(Genebank No.NM 001270639.1)编码而来，目前只清楚该蛋白属于去泛素化酶的MJDs(Machado-Joseph domain proteases)家族成员之一。目前该蛋白的功能几乎未被探索，其生理学功能及在肺癌等恶性肿瘤发生发展过程中发挥的作用均不明确。
发明内容
本发明的目的是提供一种JOSD2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，该JOSD2蛋白的序列如SEQ ID No：1所示，所述恶性肿瘤由JOSD2高表达所致。所述恶性肿瘤包括肺癌、肝癌、胆管癌等JOSD2高表达的实体癌。
所述治疗恶性肿瘤的药物包括：通过RNA干扰抑制JOSD2基因表达的双链核糖核酸，或用于抑制JOSD2蛋白活性的蛋白质，或用于抑制JOSD2蛋白功能的小分子化合物。
本发明的另一个目的是提供一种JOSD2蛋白在制备诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品中的应用。所述JOSD2蛋白的序列如SEQ ID No：1所示，所述产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品，尤其制备恶性肿瘤的诊断和预测恶性肿瘤预后试剂盒。JOSD2可作为恶性肿瘤诊断的标记分子，所述恶性肿瘤由JOSD2高表达所致。所述恶性肿瘤包括肺癌、肝癌、胆管癌等JOSD2高表达的实体癌。本发明提高恶性肿瘤诊断和预测恶性肿瘤预后的准确性，基于JOSD2的检测，制备诊断试剂盒。
在本发明中，所述用免疫检测诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品包括：与JOSD2蛋白特异性结合的抗体。
所述用RT-PCR诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品至少包括一对特异性扩增JOSD2基因的引物。如正向引物：5’-ATGTCCCAGGCCCCG-3’(SEQ ID No：2)；反向引物：5’-AGCTGGCTGCGGACAGACTGA-3’(SEQ ID No：3)。
所述用实时定量PCR诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品至少包括一对特异性扩增JOSD2基因的引物。如正向引物：5’-CCCACCGTGTACCACGAAC-3’(SEQ ID No：4)；反向引物：5’-CTCCTGGCTAAAGAGCTGCTG-3’(SEQ ID No：5)。
所述用原位杂交诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品包括：与JOSD2基因的核酸序列杂交的探针，如5’-CGGCAACTATGATGTCAATG-3’(SEQ ID No：6)。
所述用基因芯片诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品包括：与JOSD2基因的核酸序列杂交的探针，如5’-CGCTCTGCAGGGGCTGGGCC-3’(SEQ ID No：7)。
在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对JOSD2蛋白特异的抗体。例如，将纯化的人JOSD2蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人JOSD2蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。本发明的抗体包括可以阻抑JOSD2功能的抗体，也可以是不影响人JOSD2蛋白功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人JOSD2蛋白的片断或功能域致免疫而产生，而人JOSD2蛋白产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的JOSD2蛋白结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化JOSD2蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能够完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可以短至25、20、15或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明实验证明JOSD2高表达的肺癌、肝癌、胆管癌等患者生存期显著低于低表达的患者，且JOSD2蛋白在肺癌、肝癌、胆管癌等组织中的表达明显特异性高于相对应器官的正常组织；而在肺癌细胞和肝癌细胞中敲低JOSD2蛋白可显著抑制肺癌细胞和肝癌细胞的增殖和平板克隆形成能力；此外，在癌细胞中敲低JOSD2蛋白可完全抑制JOSD2高表达的癌细胞体内移植瘤形成能力。因此，JOSD2蛋白可作为诊断和预测JOSD2高表达的恶性肿瘤的特异性标志蛋白，使这些癌诊断更加准确、快速。本发明JOSD2蛋白为防治肺癌、肝癌、胆管癌等JOSD2高表达的恶性肿瘤提供了新的治疗靶标和有效新药。
附图说明
图1是本发明通过数据库分析发现JOSD2蛋白表达水平与肺癌患者预后显著负相关以及和肺正常组织相比，肺癌组织中JOSD2表达水平显著升高。
图2是本发明通过数据库分析发现JOSD2蛋白表达水平与肝细胞肝癌患者预后显著负相关以及和肝正常组织相比，肝细胞肝癌组织中JOSD2表达水平显著升高。
图3是本发明通过数据库分析发现JOSD2蛋白表达水平与胆管癌患者预后显著负相关以及和胆管正常组织相比，胆管癌组织中JOSD2表达水平显著升高。
图4是本发明通过慢病毒法敲低JOSD2蛋白可显著抑制肺癌细胞的体外增殖和平板克隆形成能力。
图5是本发明通过慢病毒法敲低JOSD2蛋白可显著抑制肝细胞肝癌细胞的体外增殖和平板克隆形成能力。
图6是本发明通过慢病毒法敲低JOSD2蛋白可显著抑制肺癌细胞的裸鼠体内移植瘤形成能力。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明所述的JOSD2基因的应用，可参考常规的药物配制方法和实际开发。药物剂型和生物剂型为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
实施例1：
利用Kaplan Keier-plotter数据库分析JOSD2与肺癌患者生存期的相关性；利用Oncomine数据库对临床肺癌患者样本进行分析，考察JOSD2在肺正常组织和肺癌组织中是否存在表达差异。如图1所示，JOSD2高表达的肺癌患者生存期显著低于低表达的患者；和肺正常组织相比，肺癌组织中JOSD2表达水平显著升高。
实施例2：
利用GEPIA平台分析JOSD2与肝细胞肝癌患者生存期的相关性；利用ULCAN数据平台对临床肝细胞肝癌患者样本进行分析，考察JOSD2在肝正常组织和肝细胞癌组织中是否存在表达差异。如图2所示，JOSD2高表达的肝细胞癌患者生存期显著低于低表达的患者；和正常肝组织相比，肝细胞癌组织中JOSD2表达水平显著升高。
实施例3：
利用GEPIA平台分析JOSD2与胆管癌患者生存期的相关性；利用ULCAN平台对临床胆管癌患者样本进行分析，考察JOSD2在正常胆管组织和胆管癌组织中是否存在表达差异。如图3所示，JOSD2高表达的胆管癌患者无病生存期显著低于低表达的患者；和正常胆管组织相比，胆管癌组织中JOSD2表达水平显著升高。
实施例4：
在传代培养的肺癌细胞NCI-H1299，PC-9，NCI-H292和NCI-H358中分别采用慢病毒法敲低JOSD2蛋白(JOSD2敲低-1组和JOSD2敲低-2组)，并设置空白对照(阴性对照组)。待感染72h后，采用Western blot法检测JOSD2的敲低效率；按照每孔1000个细胞将肺癌细胞NCI-H1299，PC-9，NCI-H292和NCI-H358的对照组和JOSD2敲低组接种于96孔板，采用SRB法检测敲低JOSD2对肺癌细胞增殖的影响；按照每孔2000个细胞将肺癌细胞NCI-H1299，PC-9，NCI-H292和NCI-H358的对照组和JOSD2敲低组接种于6孔板，采用平板克隆法检测敲低JOSD2对肺癌细胞存活的影响。如图4所示，稳定敲低JOSD2显著抑制四株肺癌细胞NCI-H1299，PC-9，NCI-H292和NCI-H358的增殖以及克隆形成。该结果说明JOSD2是促进肺癌异常增殖的重要蛋白。
实施例5：
在传代培养的肝细胞肝癌细胞HepG2和7402中分别采用慢病毒法敲低JOSD2蛋白(JOSD2敲低-1组和JOSD2敲低-2组)，并设置空白对照(阴性对照组)。待感染72h后，采用Western blot法检测JOSD2的敲低效率；按照每孔1000个细胞将肝细胞肝癌细胞HepG2和7402的对照组和JOSD2敲低组接种于96孔板，采用SRB法检测敲低JOSD2对肺癌细胞增殖的影响；按照每孔1000个细胞将肝细胞肝癌细胞HepG2和7402的对照组和JOSD2敲低组接种于6孔板，采用平板克隆法检测敲低JOSD2对肺癌细胞存活的影响。如图5所示，稳定敲低JOSD2显著抑制两株肝细胞肝癌细胞HepG2和7402的增殖及克隆形成。该结果说明JOSD2是促进肝细胞癌异常增殖的重要蛋白。
实施例6：
在传代培养的肺癌细胞NCI-H1299中采用慢病毒法敲低JOSD2蛋白(JOSD2敲低-1组)，并设置空白对照(阴性对照组)。将转染后的细胞进行稳定传代，收集细胞并以100万细胞/只通过腋下接种建立裸小鼠移植瘤模型，考察敲低JOSD2蛋白对肺癌体内成瘤能力的影响。如图6所示，稳定敲低JOSD2的肺癌细胞NCI-H1299腋下无移植瘤生成。该结果通过体内实验说明JOSD2在肺癌异常增殖的过程中发挥了重要的作用。
序列表
<110> 浙江大学
<120> JOSD2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 188
<212> PRT
<213> 人(Homosapiens)
<400> 1
Met Ser Gln Ala Pro Gly Ala Gln Pro Ser Pro Pro Thr Val Tyr His
1 5 10 15
Glu Arg Gln Arg Leu Glu Leu Cys Ala Val His Ala Leu Asn Asn Val
20 25 30
Leu Gln Gln Gln Leu Phe Ser Gln Glu Ala Ala Asp Glu Ile Cys Lys
35 40 45
Arg Leu Ala Pro Asp Ser Arg Leu Asn Pro His Arg Ser Leu Leu Gly
50 55 60
Thr Gly Asn Tyr Asp Val Asn Val Ile Met Ala Ala Leu Gln Gly Leu
65 70 75 80
Gly Leu Ala Ala Val Trp Trp Asp Arg Arg Arg Pro Leu Ser Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Pro Gln Val Leu Gly Leu Ile Leu Asn Leu Pro Ser Pro Val
100 105 110
Ser Leu Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg His Trp Val Ala
115 120 125
Leu Arg Gln Val Asp Gly Val Tyr Tyr Asn Leu Asp Ser Lys Leu Arg
130 135 140
Ala Pro Glu Ala Leu Gly Asp Glu Asp Gly Val Arg Ala Phe Leu Ala
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ala Gln Gly Leu Cys Glu Val Leu Leu Val Val Thr Lys
165 170 175
Glu Val Glu Glu Lys Gly Ser Trp Leu Arg Thr Asp
180 185
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
atgtcccagg ccccg 15
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 3
agctggctgc ggacagactg a 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 4
cccaccgtgt accacgaac 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 5
ctcctggcta aagagctgct g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 6
cggcaactat gatgtcaatg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 7
cgctctgcag gggctgggcc 20

Claims (9)

1.一种JOSD2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述JOSD2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述恶性肿瘤由JOSD2高表达引起。
2.根据权利要求1所述的一种JOSD2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述治疗恶性肿瘤的药物为：通过RNA干扰抑制JOSD2基因表达的双链核糖核酸，或用于抑制JOSD2蛋白活性的蛋白质，或用于抑制JOSD2蛋白功能的小分子化合物。
3.一种JOSD2蛋白在制备诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品中的应用，其特征在于，所述JOSD2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品，所述恶性肿瘤由JOSD2高表达引起。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括：与JOSD2蛋白特异性结合的抗体。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品至少包括一对特异性扩增JOSD2基因的引物，正向引物序列如SEQ ID No：2所示，反向引物序列如SEQ ID No：3所示。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR产品至少包括一对特异性扩增JOSD2基因的引物，正向引物序列如SEQ ID No：4所示，反向引物序列如SEQ IDNo：5所示。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用原位杂交诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品为与JOSD2基因的核酸序列杂交的探针，探针序列如SEQ ID No：6所示。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用基因芯片诊断恶性肿瘤和预测恶性肿瘤预后的产品为与JOSD2基因的核酸序列杂交的探针，探针序列如SEQ ID No：7所示。
9.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为由JOSD2高表达所致的肺癌、肝癌、胆管癌。
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