KR20070025607A

KR20070025607A - 골막으로부터 연골전구세포를 분리하는 방법

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Publication number: KR20070025607A
Application number: KR1020050081947A
Authority: KR
Inventors: 김동일; 임상민; 최용수; 이창우; 김상린; 단현광; 정한선
Original assignee: 보령제약 주식회사
Priority date: 2005-09-02
Filing date: 2005-09-02
Publication date: 2007-03-08

Abstract

본 발명은 골막으로부터 연골전구세포를 분리하는 방법 및 상기 방법으로 분리된 골막 유래 연골전구세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

골막 유래 연골전구세포, 연골화

Description

골막으로부터 연골전구세포를 분리하는 방법{Method for the Isolation of Chondroprogenitor Cells from Periosteum}

도 1은 인간 골막조직에서 세포가 분리되어 배양 접시에서 증식하는 것을 보인 사진이고,

도 2는 골막조직에서 분리되어 나온 세포들을 중간엽줄기세포 면역표시자인 CD9, CD90, CD166에 양성, 조혈줄기세포의 표시자인 CD 45에 음성인 세포만을 순수 분리하고 있는 그래프로, (a)는 세포의 크기(size)와 과립구 정도(granulity)가 비슷한 세포들만을 R1(빨간색)으로 선택한 것을, (b)는 R1에 해당하는 세포 중 CD166에 양성과 동시에 CD45에 음성인 세포를, (c)는 R1에 해당하는 세포 중 CD9과 CD90에 동시에 양성인 세포를, (d)는 R1에 해당하는 세포 중 CD9과 CD166에 동시에 양성인 세포를 나타내고,

도 3은 분리한 골막 유래 연골전구세포들을 15회에 걸쳐 계속 계대배양을 하였을 때 10회와 15회의 세포의 모양이 변함없이 유지되고 있음을 보여주는 사진이고,

도 4는 분리한 골막 유래 연골전구세포들이 계대배양 15회 때 중간엽줄기세포의 면역표시자인 CD105, SH2, SH3, SH4에 대하여 양성 반응을 보이고 조혈줄기세 포인 CD34, CD45에 대하여는 음성을 보여주는 그래프이고,

도 5는 분리한 골막 유래 연골전구세포를 시험관에서 펠렛(pellet)으로 배양을 하여 연골화 배지에서 3주간 배양하여 연골조직으로 분화시킨 사진이고,

도 6은 골막유래 연골전구세포를 펠렛 배양 후 시간에 따라 연골 특이적인 세포외기질인 제 2 형 콜라겐 mRNA의 발현이 증가하고 있음을 보여주는 사진이고,

도 7은 골막유래 연골전구세포를 펠렛 배양 후 연골화 여부를 확인하기 위하여 연골 특이적으로 염색이 되는 알시안 블루 (Alcian blue, A), 사프라닌 오 (Safranin-O, B) 그리고 연골세포 특이적인 제 2 형 콜라겐에 대하여 면역염색(C, D)을 하여 배양된 골막유래 연골전구세포가 연골조직으로 성공적으로 분화되었음을 보여주는 사진이다.

손상된 연골 치료용으로 사용 가능한 세포로서는 환자의 자가 연골세포 이외의 대체 세포 자원으로 골수줄기세포(Majumdar M. K. et al., J. Cell. Physiol. 185: 98-106, 2000), 제대혈(Gang E. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 321: 102-108, 2004), 활액막(Fickert S. et al., Osteoarthritis Cartilage 11: 790-800, 2003), 그리고 골막(De Bari C. D. et al., Arthritis Rheum. 44: 85-95, 2001) 등이 연구되고 있다. 골수의 경우에는 치료용 세포를 환자의 뼈에서 얻어내기에는 환자의 고통이 따르는 어려운 점이 있으나, 골수 유래 줄기세포가 연골세포로 분화되는 사실을 세포외기질이 합성되어 가는 과정을 통해 연구한 결과들이 2001년경에 보고되기 시작하였다(Barry F. et al., Exp. Cell Res. 268: 189-200, 2001). 제대혈 유래 줄기세포를 이용하는 방법의 경우에는 그 안에 존재하는 줄기세포의 수가 적어 줄기세포를 증식시켜야 사용 가능한 경우가 많다. 이때 치료를 위해 충족할만한 세포 수를 얻기 위해서 줄기세포의 기능을 유지한 상태로 자가증식(self-renewal) 시키기가 어려운 기술적 문제점이 있으나, 줄기세포 자체를 얻기 쉬운 장점이 있어서 제대혈로부터 중간엽줄기세포만을 분리하여 사용하는 연구들이 시도되고 있다. 활막에서 분리한 세포들의 경우에는 분리된 세포들을 체외에서 연골세포로 분화시킨 후 생쥐에 이식하였을 때 안정한 연골 형성을 하는데 실패했다는 연구 보고가 있다(De Bari C. et al., Arthritis Rheum. 50: 142-140, 2004). 위에서 고려한 세포들은 공통적으로 세포치료제로 이용하기 위해서는 그 세포 수를 확보하기가 어렵다는 공통적인 어려움이 있다. 즉 무릎연골 관련 질병 치료를 쉽게 하기 위해서는 상당량의 세포가 확보되어야 한다. 세포의 획득과 수적인 면 그리고 전구세포로서의 분화능력 등을 고려해 볼 때 골막 유래 연골전구세포가 매우 유용하다고 판단된다.

골막조직에 대한 연구는 많은 연구자들에 의해 오랫동안 수행되어 왔으며 (Nakahara H. et al., Clin. Orthop. 259: 223-232, 1990; Nakahara H. et al., Bone 11: 181-188, 1991; Nakata K. et al., FEBS Lett. 299: 278-282, 1992), 기존의 연구에서 골막조직을 그대로 agarose gel 등 에서 배양 또는 분화시킴으로써 골막조직 내에는 연골조직 또는 뼈조직으로 분화 가능한 전구세포가 존재함을 보고하였다(O'riscoll S. W. et al., J. Bone Joint Surg. Am 76: 1042-1051, 1994). 또 다른 연구팀에서는 골막조직으로부터 세포를 분리하여 고농도 배양(micromass culture)을 수행하여 골막조직 내에 뼈 또는 연골세포로 분화 가능한 세포가 존재함을 확인하였다(De Bari C. D. et al., Arthritis Rheum. 44: 85-95, 2001).

그러나, 골막으로부터 중간엽줄기세포의 특징을 연골전구세포만을 분리하고, 이를 연골세포로 분화시키는 방법에 대해서는 기술된 바가 없다.

이런 배경하에, 본 발명자는 중간엽줄기세포 표면 면역표시자인 CD9, CD90, CD166에 양성, 조혈줄기세포의 표면 면역 표시자인 CD45에 음성인 세포만을 순수 분리하고, 상기 세포가 연골세포로 분화되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 포유동물 유래의 골막조직을 절편으로 자른 후 배양하여 골막조직으로 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 세포로부터 중간엽줄기세포 표면 면역 표지자 양성이고 조혈줄기세포 표면 면역 표지자 음성인 세포만을 분리하는 단계를 포함하는 골막으로부터 연골전구세포를 분리하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분리된 골막조직 유래의 연골전구세포를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분리된 골막 유래 연골전구세포를 TGF-β3를 포함하는 배지에서 펠렛 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서 본 발명은 포유동물 유래의 골막조직을 절편으로 자른 후 배양하여 골막조직으로 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 세포로부터 중간엽줄기세포 표면 면역 표지자 양성이고 조혈줄기세포 표면 면역 표지자 음성인 세포만을 분리하는 단계를 포함하는 골막으로부터 연골전구세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "연골전구세포(chondroprogenitor cells)"란 연골 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 본 발명의 연골전구세포를 골막조직으로부터 분리하였다.

포유 동물, 바람직하게는 인간의 골막조직을 작은 절편으로 자른 후 배양하면 조직으로 다양한 성질을 가지는 세포가 분리되는데, 이로부터 연골전구세포만을 분리하기 위하여, 세포 표면 표지자의 특성을 이용하였다.

본 발명에서 용어, "세포 표면 표지자(cell surface marker)"란 세로를 다 른 세포와 구별가능 하도록 하는 물질을 의미한다. 본 발명자는 골막조직으로부터 분리된 세포로부터, 중간엽줄기세포 표면 면역 표지자 양성이고 조혈줄기세포 표면 면역 표지자 음성인 세포만을 분리하였다. 중간엽줄기세포 표면 표지자는 CD9, CD90, CD105, CD165, SH2, SH3, SH4 등을 포함하고, 조혈줄기세포 표면 표지자는 CD34, CD45 등을 포함하고, 특별히 이로 제한되지 않는다.

세포 분리 방법은 특별히 제한되지 않고, 예들 들어, 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용할 수 있다.

상기 방법을 이용하여, 분리된 세포는 15회까지의 계대 배양에도 연골전구세포로서의 특징을 동일하게 유지함을 알 수 있었다(표 1). 따라서, 본 발명은 세포치료제로 이용하기에 충분한 양의 연골전구세포를 골막조직으로부터 대량으로 확보할 수 있는 방법을 제공한다. 또한, 상기 방법은 매우 정확하고 손쉽고 간편하게 연골전구세포를 분리할 수 있는 장점을 가진다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분리된 골막조직 유래의 연골전구세포(periosteum-derived chondroprogenitor cells: PDCPCs)에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명자는 상기 방법으로 분리된 골막조직 유래의 중간엽 줄기세포 표면 표지자 양성 및 조혈줄기세포 표면 표지자 음성인 특징을 가지는 연골전구 세포를 2005년 9월 1일자로 대전광역시 유성구 어은동 52번지 소재의 국제기탁 기관, KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 10840BP호 로 기탁하였다.

또 다른 양태로서 본 발명은 상기 방법으로 분리된 골막 유래 연골전구세포를 TGF-β3를 포함하는 배지에서 펠렛 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

상기의 방법으로 분리된 골막조직 유래 연골전구세포를 원심분리하여 세포를 펠렛이 되도록 한 후, TGF-β3가 첨가된 배지에서 2주 내지 4주 펠렛 배양하여 연골세포로 분화시킨다. 실제, 상기 방법을 통하여 연골전구세포가 연골세포로 분화되는 것을 연골특이적인 세포외기질인 제2형 콜라겐의 발현이 증가하고 연골 특이적으로 염색이 되는 알시안 블루 (Alcian blue, A), 사프라닌 오 (Safranin-O, B) 등의 조직염색 분석으로 확인할 수 있었다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 골막세포에서 연골전구세포의 분리방법을 제공한다. 환자로부터 골막조직을 얻은 후 24시간 안에 세포를 분리하였다. 골막조직을 인산염 완충액으로 수회 세척을 하고 작은 절편으로 자른 후 형성층(뼈쪽 층)이 배양접시 면을 향하도록 조심스럽게 옮기고 우태아 혈청을 10%(v/v) 첨가한 배양액을 넣어주었다. 이 상태로 37℃, 5% CO₂의 동물세포 배양기에서 7일 이내에 조직으로부터 분리되는 세포를 확인할 수 있다.

본 발명은 분리된 세포의 표면 면역표시자의 종류와 그 유지 상태를 제공한다. 중간엽줄기세포의 표면 면역표시자인 CD9, CD90, CD105, CD166, SH2, SH3, SH4와 조혈줄기세포의 표면 면역표시자인 CD34, CD45로 계대배양에 따른 변화를 계대배양을 진행하면서 3회, 5회, 10회, 그리고 15회 때 유세포분석기로 확인하였다. 표1에서 확인 할 수 있듯이 CD166을 제외한 중간엽줄기세포 표면 면역표시자 나머지는 모두 최저 78.4%에서 최고 96.96%까지 유지되고 있음을 확인하였다.

본 발명은 15 mL 폴리스틸렌 튜브에 분리된 연골전구세포를 연골화 유도 상용배지와 함께 2.5×10⁵개가 되도록 넣어준 후 원심분리하여 세포를 펠렛이 되도록 하고 튜브의 뚜껑을 살짝 열어놓아 공기가 통할 수 있도록 하여 37℃, 5% CO₂의 동물세포 배양기에서 3주간 배양하였다.

펠렛배양으로 연골전구세포의 연골화가 진행됨에 따라 연골세포가 합성하는 특정 세포외기질인 제2형 콜라겐 mRNA와 단백질이 발현되는 것을 역전사효소 중합반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)과 조직염색, 그리고 면역조직염색법을 통하여 확인하였다.

따라서, 본 발명을 통하여 분리 및 특성이 규명된 골막 유래 연골전구세포를 이용하여 손상된 연골의 치료를 위한 세포를 제공하는데 있어서 보다 쉽고 대량으로 얻을 수 있는 방법을 제공하여 손상된 연골치료에 좋은 대체 세포공급원이 될 수 있다.

이하 본 발명을 실시 예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 중간엽줄기세포 표면 면역표시자를 이용한 골막 유래 연골전구세포의 분리

1. 골막 유래 세포의 분리와 증식

인간의 골막으로부터 세포를 분리하기 위한 골막조직은 수술 후 획득된 조직을 이용하였다. 수술한지 24시간 이내의 골막조직으로부터 세포를 분리하였다.

골막조직을 인산염 완충용액으로 수회 세척을 하고 항생제를 넣은 인산염 완충용액에 담아 1.5×1.5 cm의 조직을 작은 조각(<0.5 cm²)으로 자른 후 형성층(뼈쪽 층) 쪽이 배양접시의 바닥을 향하게 놓고 10%(v/v) 우태아혈청 첨가된 DMEM(Dubecco's modified Eagle's medium)을 넣어주었다. 37℃, 5% CO₂의 동물세포 배양기(Sanyo Electric Co., Gunma, Japan)에서 배양하면 7일 이내에 조직으로부터 분리되는 세포를 확인할 수 있다. 배지교환은 3일 간격으로 수행하였다.

조직으로부터 분리된 세포가 배양접시에서 10~14일 이내에 80% 정도 증식을 하면 곧바로 0.25% trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포의 수와 생존율의 측정을 위해서는 트립판 블루 색소 배제법(trypan blue dye exclusion method)를 이용하였다. 그리고 이 때의 세포상태를 계대수1 (P1)로 설정하였다.

배양 1~10일 후에 골막조직으로부터 분리된 세포 형태를 전도현미경으로 관찰한 결과, 세포가 떨어져 나와 배양 접시에 붙어 섬유세포의 형태로 균질하게 증식하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

2. 골막 유래 연골전구세포의 분리

골막조직으로부터 분리한 세포를 증식시킨 후 이들 세포 중에서 전구세포만을 분리하기 위하여 세포 분리기능을 보유한 유세포분석기 FACSVantage (Becton Dickinson, NJ, USA)를 사용하였다.

줄기세포 분리를 위한 단일 면역표시자가 현재까지 알려지지 않았기에 그 확률을 높이고자 줄기세포의 표면에 많이 나타난다고 알려진 항원에 대한 면역표시자를 동시에 만족하는 세포를 선별함으로써 분리된 전구세포의 수율을 높이고자 하였다. 이렇게 분리된 세포를 골막 유래 연골전구세포(periosteum-derived chondroprogenitor cells, PDCPCs)라 명명하였다. 이 때 얻어진 세포의 PDL (population doubling level) 수를 1로 정하였다.

도2는 골막조직으로부터 분리된 세포에서 중간엽줄기세포 면역표시자인 CD9, CD90, CD166과 조혈줄기세포 면역표시자인 CD45를 사용하여 골막 유래 전구세포를 분리하는 것을 나타내었다. 일차적으로 비슷한 크기와 과립구 양에 따라 세포군을 선정한 것을 R1으로 표시하고, R1에 해당하는 세포군 중에서 중간엽줄기세포의 표면 면역표시자로 잘 알려져 있는 CD9, CD90, CD166에 동시에 양성으로 나타나고 동시에 조혈줄기세포에 존재하는 표면 면역표시자인 CD45에는 음성을 나타내는 골막 유래 연골전구세포들만 선택적으로 분리한 것을 나타내는 결과이다.

세포들을 계속적으로 PDL수를 정확히 지켜주면서 계대배양을 하면서 세포의 형태 변화를 관찰한 결과 섬유세포 형태를 유지하고 있음을 보여주며, P10, P15까지 계속해서 균일한 세포의 형태를 유지하였다(도 3). 이는 형태적으로는 단일한 세포임을 의미하는 것이다. 따라서 이는 위에서처럼 P15까도 균일한 세포 형태를 보여줄 수 있는 세포를 분리함에 있어서 삼중 양성(triple positive)의 조건을 충족시키는 세포가 효과적으로 분리되었음을 보여준다.

실시 예 2 : 인간 골막 유래 연골전구세포에 발현되는 면역표시자 유지에 대한 특성

1. 유세포분석기를 이용한 세포 표면 면역표시자의 분석

분리된 세포를 배양 플라스크에 접종한 후 세포가 증식하여 80% 정도 채워지면 세포를 수확한 뒤 세포를 1×10⁶ cells/mL의 농도로 시험관에 분주한 뒤 FACSCalibur (Becton Dickinson, NJ, USA)로 분석하였다. 항체는 CD9-FITC, CD90-Cy, CD166-PE, CD105-FITC, CD45-FITC, CD34-PE, anti-mouse IgG-FITC, anti-mouse IgG-PE (Becton Dickinson, NJ, USA), SH2, SH3, SH4 (Hybridoma, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), anti-mouse IgM-FICT (SouthernBiotech, Birmingham, AL)를 이용하였다. 사용한 항체는 얼음 위에서 20~30분간 암조건으로 세포와 반응을 시킨 후 반응하지 않은 항체를 인산염 완충용 액으로 세척한 후 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.

분리한 골막 유래 연골 전구세포를 15번 계대배양한 후 (PDL 29) 세포를 수확하여 상기된 방법으로 중간엽줄기세포의 표면 면역표시자가 유지되는지 확인하였다. SH2, SH3, SH4, 그리고 CD105가 계속 유지되었으며 조혈줄기세포의 표시자인 CD34, CD45에 음성으로 나타났다(도 4).

2. 골막 유래 연골전구세포에서 발현되는 면역표시자 유지

위와 같이 분리된 골막 유래 연골전구세포가 체외에서 배양되는 동안 중간엽줄기세포의 표면 면역표시자가 유지되고 계속적인 계대배양에 의해 골막 유래 연골전구세포의 표면 면역표시자가 어떻게 변화하는지를 살펴보았다(표 1).

그 결과, 본 발명은 분리한 연골전구세포를 15회에 걸쳐 계속 계대배양을 시행할 때, 특정 중간엽줄기세포의 세포 표면 면역표시자가 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3 : 인간 골막 유래 연골전구세포의 연골화

1. 펠렛배양을 통한 연골화

세포를 수확하여 인산염 완충용액으로 세척을 하고, 총 세포 수를 계산하여 chondrogenic basal medium (hMSC Differentiation BulletKit® Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., MD, USA)에 첨가물(hMSC Chondrogenic BulletKit® Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., MD, USA)을 넣은 배지로 분산 후 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 세포가 2.5×10⁵개가 되도록 분주하였다. 각 튜브들을 원심분리하여 세포를 펠렛이 되도록 한 후, chondrogenic basal medium에 상기 첨가물 및 TGF-β3 (R&D System, MN, USA)가 첨가된 배지를 0.5 mL씩 넣고 다시 원심분리하여 세포가 펠렛 상태가 되도록 만들어 주었다. 튜브의 뚜껑을 살짝 열어놓아 공기가 통할 수 있도록 하여 37℃, 5% CO₂의 동물세포 배양기에서 배양하였다.

도 5는 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 2.5×10⁵개의 세포가 스스로 응집이 되어 펠렛의 형태로 배양되고 있는 모습을 보여주고 있다.

2. 역전사효소중합반응을 통한 연골화의 분석

배양한 세포를 인산염 완충액으로 세척 후 TRIzol Reagent (Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 1 μg을 취하여 AMV reverse transcriptase (RNA PCR Kit, Takara Korea Biomedical Inc., Seoul, Korea)를 사용하여 25℃/10분, 42℃/60분, 99℃/5분, 4℃/5분의 반응을 거쳐 cDNA를 합성하였다. PCR(Polymerase chain reaction)은 총 부피 25 μL로 2 μL의 cDNA를 넣고 최종 농도로 2.5 mM MgCl₂, 1 mM dNTP, 0.2 μM의 전진 및 후진 프라이머, Tag 폴리머라제(Takara Korea Biomedical Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 수행하였다. PCR System 2700 GeneAmp(Applied Biosystems Korea Ltd., Seoul, Korea)에 넣고 먼저 95℃/2분간 변성을 시키고, 95℃/30초 denaturation, 58℃/30초 annealing, 72℃/2분 extension을 25회 반복 수행하였다. 마지막으로 extension 시간을 72℃에서 5분을 더 수행하고 4℃로 냉각하였다. 제2 형 콜라겐 mRNA 확인을 위한 전진 프라이머는 (5'-CTGGCTCCCAACACTGCCAACGTC-3' 서열번호 1)을, 후진 프라이머는 (5'-TCCTTTGGGTTTGCAACGGATTGT-3' 서열번호 2)을 사용하였다. GAPDH mRNA 확인을 위한 전진 프라이머는 (5'-GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3' 서열번호 3)을, 후진 프라이머는 5'-CGTTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3' 서열번호 4)을 사용하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.8% agarose gel에서 TAE 버퍼를 사용하여 전기영동하였다.

그 결과, 연골화를 시도한지 1주차(lane 4)에는 제 2형 콜라겐의 mRNA 발현 양이 적었으나 2주(lane 5), 3주차(lane 6)에는 확실히 제 2형 콜라겐의 mRNA가 발현되었음을 확인할 수 있었다(lane 1; 1kb DNA ladder, lane 2; chondrocytes, lane 3; non-inductive PDCPC)(도 6).

3. 조직염색을 통한 연골화의 분석

세포 펠렛 또는 지지체에서 배양한 조직을 2% formaldehyde에서 4~6 시간 충분히 고정하였다. 그런 후 조직 내에 남아있는 고정액을 제거하기 위해 10, 15, 20% 수크로즈(sucrose)를 첨가한 인산염 완충용액으로 각 4시간씩, 마지막으로 하룻밤 처리하였다. 조직을 동결용 포매제(OTC compound)에 넣고 cryostat (Leica, Nussloch, Germany)에서 동결시키고 6~8 μm 두께로 박절하였다. 박절한 동결절편은 silane 처리된 유리 슬라이드에 부착하였다.

Alcian blue염색을 위해 함수 과정이 끝난 슬라이드를 3%의 아세트산 용액에 30분간 처리 후 주 시약인 Alcian blue (pH 2.5) 용액에 30~40분 동안 염색하였다. 1~2분간 수세 후 Nuclear fast red에서 1분간 염색하고 다시 수세, 탈수, 청명, 봉입하였다.

Safranin-O 염색은 함수 과정이 끝난 슬라이드에 Hematoxyline 용액을 6분간 처리 후 수세과정을 거처 0.02% fast green 용액에서 3분간 염색하였다. 1% acetic acid에서 반응 후 0.01% Safranin-O 용액에서 5분간 염색 후 수세, 탈수, 청명, 봉입하였다.

면역조직염색은 immunohistochemical reagent (LSAB 2 System-HRP, Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)를 사용하여 표준 분석방법을 따라 수행하였다. 제작된 슬라이드를 PBS로 세정한 후 0.3% 과산화수소로 10분간 내인성 과산화효소 활성을 제거한 후, BSA를 2%로 녹인 PBS로 1시간 blocking하였다. 일차 항체로 mouse anti-human collagen type Ⅱ (Chemicon International, Inc., CA, USA)를 처리하고 하룻밤 동안 4°C에서 반응시켰다. PBS로 세정 후 biotin이 붙어있는 항체를 10분간 상온에서 처리하고 다시 세정하였다. HRP가 붙어있는 streptavidin을 10분간 상온에서 처리하고 세정한 후, 마지막으로 DAB 기질을 처리한다. 현미경으로 관찰하면서 PBS로 세정하고 이어서 탈수, 청명 그리고 봉입과정을 수행하였다.

도 7은 펠렛배양 후 생성된 연골특이적 기질(collagen type II, glycosaminoglycan(GAG), aggrecan)의 조직학적 검증을 위해 Safranin-O (A)와 Alcian blue (B) 염색, 그리고 면역화학염색(C, D)을 수행한 결과이다. 연골 특이적 기질의 합성이 많아질수록 그 염색한 색깔이 짙어지는데, 펠렛 배양한 시간이 증가함에 따라 연골 특이적 기질에 대한 염색된 정도가 증가하였다. 또한 제 2형 콜라겐 단백질에 대한 면역화학염색에서도 그 발색량이 증가하였다.

골막조직으로부터 유래된 세포들에서 중간엽줄기세포 표면 면역표시자를 이용하여 유세포분석기를 이용하여 연골전구세포만을 분리해 얻어진 PDCPCs(periosteum-derived chondroprogenitor cells) 가 연골세포로 성공적으로 분화됨을 확인하였다. 이때 분리된 세포는 15번까지 계대배양이 가능하여 손상된 연골치료를 위한 세포를 대량 확보 할 수 있어서 연골세포치료제로 이용할 수 있는 세포공급원으로 이용될 수 있어 앞으로의 연골세포 치료제 개발을 한 단계 발전시킬 수 있을 것으로 사료된다.

<110> BORYUNG PHARMACEUTICAL CO., LTD <120> Method for the Isolation of Chondroprogenitor Cells from Periosteum <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer specific for collagen type 2 <400> 1 ctggctccca acactgccaa cgtc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer specific for collagen type 2 <400> 2 tcctttgggt ttgcaacgga ttgt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer specific for GAPDH <400> 3 gctctccaga acatcatccc tgcc 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer specific for GAPDH <400> 4 cgttgtcata ccaggaaatg agctt 25

Claims

포유동물 유래의 골막조직을 절편으로 자른 후 배양하여 골막조직으로 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 세포로부터 중간엽줄기세포 표면 표지자 양성이고 조혈줄기세포 표면 표지자 음성인 세포만을 분리하는 단계를 포함하는 골막으로부터 연골전구세포를 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
제1항에 있어서, 중간엽줄기세포 표면 표지자가 CD9, CD90 및 CD116인 방법.
제1항에 있어서, 조혈줄기세포 표면 표지자가 CD45인 방법.
제1항에 있어서, 중간엽줄기세포 표면 표지자 양성이고 조혈줄기세포 표면 표지자 음성인 세포를 유세포 분석기를 이용하여 분리하는 방법.
제1항의 방법으로 분리된 골막 유래 연골전구세포.
제6항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10840BP로 기탁된 세포.
제1항의 방법으로 분리된 골막 유래 연골전구세포를 TGF-β3를 포함하는 배지에서 펠렛 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법.