CN106715684B - 具有差异gstt1表达或基因型的干细胞亚群 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于通过确定或调节GSTT1表达水平或基因型来提供干细胞的亚群或多个干细胞的方法以及所述干细胞的用途。

Description

具有差异GSTT1表达或基因型的干细胞亚群
发明领域
本发明涉及确定细胞的GSTT1基因型或确定细胞中的GSTT1表达水平相关的方法，并且涉及被修饰以表达降低水平的GSTT1的细胞。
背景技术
谷胱甘肽-S-转移酶θ1(GSTT1)是一种属于GST超家族的代谢酶。II 相代谢蛋白的这一家族根据其序列和结构分成7类。它们催化还原型谷胱甘肽与亲电性和疏水性异生物质结合以解毒(图1)。它们还除去活性氧、生物合成和代谢前列腺素和甾醇。
GST基因的遗传多态性在世界群体中是常见的，其中一些成员具有基因的点突变或完全丧失基因。GSTT1纯合性缺失普遍存在于约20％至60％的大多数群体中(图2)。纯合性缺失由位于该基因侧翼的两段高度类似的序列的同源重组引起。研究已表明，GST多态性和导致疾病风险例如癌症的DNA损伤或DNA修复之间具有弱相关性。然而，很多其他研究已表明无疾病相关性。因此，关于癌症及其他疾病中的GSTT1参与没有结论性的数据。
GST家族中的数个成员已被认为具有非酶促作用。A、P和M类参与控制细胞周期和分化的信号传导途径。其使参与细胞存活和细胞死亡的 MAPK途径成员隔离。最近的研究已显示，氧化应力可能通过p38信号传导途径来诱导GSTT1表达的提高，表明其参与细胞周期控制。
发现具有高自我更新能力和多潜能性的用于临床应用的理想干细胞一直是一个挑战。
尽管在过去十年内已进行了相当多的研究并且向US FDA的IND提交的速度日益增长，但是对是什么构成间充质(或基质)干细胞(MSC)仍然没有普遍认可的定义(Keating,2012Cell Stem Cell 10(6):709-716； Mendicino等,2014Cell Stem Cell 14(2):141-145)。如Keating(2012)已简洁地指出，MSC如同其目前常常所定义的是“体外培养的现象”，这使得难以预测其在被移植回体内时如何表现。因此，仍然迫切需要使特定MSC 群的体外特征与其在被移植回体内时形成合适组织的活性密切联系起来。鉴于对MSC的临床用途的关注迅速增加，明显地需要对用于生成MSC的方案进行进一步细化；明显地塑料黏附性、表面标志物表达和分化潜能 (Dominici等,2006Cytotherapy 8:315-317)不是用于选择的充分标准，并且必须将其他特征(包括生长因子的分泌和免疫调节状况)考虑在内，然后使其与体内结果相互关联。本发明人试图解决这一需求以修正MSC的定义。
人MSC(hMSC)一般认为由可从多种成体组织获得的粘附细胞的异质亚群组成，并且在限定培养条件下证明具有自我更新的能力以及保留分化成特化细胞(例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞)的能力 (Pittenger等,2009Science 284:143-147)。然而，在体外存活和分化的能力可不再认为对修复组织的能力具有预测性，因为hMSC的体外特征不完全与体外效力相关(Ko等,2008Tissue Eng Part A 14:2105-19；Bueno和Glowacki,2009Nature Reviews Hematology 685-697；Rai等,2010 Biomaterials 7960-70)。
明显地，必需修正国际细胞治疗协会(ISCT)用于定义MSC提出的假设(包括在体外的塑料粘附性、CD标志物表达和多潜能性)以解决由培养物的异质性引起的效力问题。即使使用作为单细胞衍生集落产生的 MSC，在细胞培养中仍然存在持续异质性的问题(O’Connor等,2011BMC Proc 5增刊8:O14)。近年来，一些团队已试图通过根据已知与基本间充质干细胞功能相联系的一种或多种表面标志物富集细胞来分离同质细胞群(Simmons和Torok-Storb 1991Blood 78:55-62；Gronthos等1999Journal of Bone and MineralResearch 14:47-56；Deschaseaux等,2003British Journal of Haematology 122:506-517；Buehring等,2007Hematopoietic Stem Cells Vi 262-271；Gang等,2007Blood 109:1743-1751；Battula等,2009 Haematologica-the Hematology Journal 94:173-184；Tormin等,2011Blood 117:5067-5077)。尽管这些方法有助于使hMSC与造血细胞分离，但是其并不能使初始细胞与功能成熟群体完全区分开来。用于分离和制备均一 hMSC群的另一策略包括基于尺寸的分选以获得具有高克隆发生性和多潜能性的细胞(Colter等,2001Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 98:7841-7845；Smith等,2004Stem Cells 22:823-831)；已兴起的又一策略是这些细胞的分泌组。MSC分泌广泛的多种在植入和伤口愈合中起关键作用的生物活性旁分泌因子(Caplan和 Dennis 2006Journal of Cellular Biochemistry 98:1076-1084；Caplan和Correa, 2011Cell Stem Cell 9:11-15)。还已假设这样的分泌谱为预测hMSC潜能的方式(Caplan 2009Journal of Pathology 217:318-324；Prockop等,2010 14: 2190-2199)。
发明概述
本发明人已出乎意料地发现，GSTT1表达与生长速率(即细胞倍增时间)和/或组织形成潜能成反相关。这一发现使得能够鉴定、分离、富集和 /或选择具有相对迅速生长速率的细胞。在干细胞的情况下，这允许提供可用于在体外和体内生成组织的细胞群。这样，可在体外生成适合植入到患者中的组织，或者可将通过本发明方法鉴定或选择的细胞施用或植入到患者中以提供医学治疗，例如组织再生。
因此，在一个方面，本发明提供了用于鉴定一种或多种干细胞的方法，所述方法包括确定所述一种或多种干细胞中的GSTT1表达水平。
有利地，所述方法可用于鉴定生长速率和/或组织形成潜能提高/增强的干细胞。因此，在一些实施方案中，所述方法包括：(i)确定一种或多种干细胞的GSTT1表达水平，和(ii)将步骤(i)中确定的GSTT1表达水平与该干细胞类型的GSTT1表达水平的参照值进行比较。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定相对于参照值GSTT1表达降低的一种或多种干细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括使相对于参照值GSTT1表达降低的一种或多种干细胞与其他细胞或干细胞分开和/或分离的步骤。
本发明人还已发现，GSTT1的某些基因型与细胞增殖(即，生长速率) 和/或组织形成潜能相关。因此，在第二方面，本发明提供了用于鉴定一种或多种干细胞的方法，所述方法包括确定一种或多种干细胞的GSTT1基因型。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定具有非纯合野生型GSTT1 基因型的一种或多种干细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括使具有非纯合野生型GSTT1基因型的一种或多种干细胞与其他细胞或干细胞分开和/或分离的步骤。
GSTT1表达相比较地降低或较低的干细胞和/或具有与增强或提高的细胞增殖(即生长速率)和/组织形成潜能相关的GSTT1基因型的干细胞具有多种其他可有助于使其与GSTT1表达相对较高的干细胞和/或具有与增强或提高的细胞增殖(即生长速率)和/组织形成潜能不相关的GSTT1 基因型的干细胞区别开来的特征。因此，在本发明方法的一些实施方案中，与参照干细胞群相比，所述干细胞具有以下一种或多种特征：(i)集落形成能力增强；(ii)细胞尺寸减小；(iii)端粒长度增加和/或端粒缩短速率降低； (iv)STRO-1、SSEA-4、CD146和/或PDGFRβ的表达提高；(v)FGF-2、VEGF、 SDF-1α、Fractalkine、PDGF-BB和/或MIP-1α的分泌增加；(vi)对T细胞的抑制增强；(vii)ALP、RUNX2和/或BSP-II的表达降低；(viii)TWIST-1 和/或DERMO-1的表达提高。
本发明人已发现，可通过改变GSTT1基因或蛋白质表达水平或者 GSTT1功能来调节干细胞生长速率和/或组织形成潜能。
在第三方面，本发明提供了用于修饰一种或多种干细胞的方法，所述方法包括使一种或多种干细胞与能够修饰干细胞以降低GSTT1表达和/或功能的试剂接触。在一些实施方案中，所述方法包括：(i)任选地从个体中分离一种或多种干细胞，和(ii)使分离的一种或多种干细胞在体外与能够修饰干细胞以降低GSTT1表达和/或功能的试剂接触。
本发明还提供了一种或多种已进行修饰以降低内源性GSTT1表达和/ 或功能的干细胞。
还提供了一种或多种包含能够降低性GSTT1表达和/或功能的试剂的干细胞。
还提供了这样的一种或多种干细胞，其已被修饰以相对于野生型 GSTT1纯合的干细胞和/或具有该干细胞类型的平均(即，中值)GSTT1 表达水平和/或功能的干细胞具有降低的GSTT1表达和/或功能。
此外，本发明提供了一种或多种分离的干细胞，其相对于野生型 GSTT1纯合的干细胞具有降低的GSTT1表达和/或功能。
在本发明的另一个方面，提供了根据本发明的一种或多种干细胞，其用于医学治疗的方法。
在本发明的另一个方面，提供了根据本发明的一种或多种干细胞在制备用于医学治疗方法的药物中的用途。
在一个方面，本发明提供了在有治疗需要的患者中再生组织的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗数量的根据本发明的干细胞。
本发明还提供了根据本发明的一种或多种干细胞，其用于治疗骨折或修复软骨组织的方法，其中所述方法包括向骨折或损伤部位周围的组织施用所述干细胞。
还提供了根据本发明的一种或多种干细胞用于在体外或体内生成骨或软骨组织的用途。
在另一个方面，本发明提供了用于选择干细胞供体的方法，所述方法包括确定从个体分离的含核酸样品中GSTT1的基因型，或者确定从个体分离的样品中的GSTT1表达。
在一些实施方案中，所述方法包括检测含核酸样品中GSTT1等位基因的存在。在一些实施方案中，所述GSTT1等位基因是野生型GSTT1等位基因，已知和/或预测导致GSTT1表达相对于野生型GSTT1降低的 GSTT1基因型和GSTT1无效(即缺失型)等位基因的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了用于选择干细胞供体的方法，所述方法包括确定从个体分离的含DNA样品中GSTT1的基因型，其中选择已知和 /或预测导致相对于野生型GSTT1纯合的个体GSTT1表达降低的个体作为干细胞供体。
在另一个方面，本发明提供了用于选择干细胞供体的方法，所述方法包括：(i)确定从个体分离的样品中一种或多种干细胞的GSTT1表达水平，和(ii)将步骤(i)中确定的GSTT1表达水平与该干细胞类型的GSTT1表达水平的参照值进行比较；其中选择确定具有相对于参照值GSTT1表达降低的一种或多种干细胞的个体作为干细胞供体。
根据用于选择干细胞供体的方法，在一些实施方案中，与参照干细胞群相比，所述一种或多种干细胞另外具有以下一种或多种特征：(i)集落形成能力增强；(ii)细胞尺寸减小；(iii)端粒长度增加和/或端粒缩短速率降低； (iv)STRO-1、SSEA-4、CD146和/或PDGFRβ的表达提高；(v)FGF-2、VEGF、 SDF-1α、Fractalkine、PDGF-BB和/或MIP-1α的分泌增加；(vi)对T细胞的抑制增强；(vii)ALP、RUNX2和/或BSP-II的表达降低；(viii)TWIST-1 和/或DERMO-1的表达提高。
在本发明的另一个方面，提供了在干细胞，优选间充质干细胞(MSC) 的培养物中富集集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括隔离GSTT1 表达水平降低的干细胞。
在本发明的另一个方面，提供了在干细胞，优选间充质干细胞(MSC) 的培养物中富集集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括隔离不具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞。
细胞的隔离可涉及使具有或不具有选定特征的细胞分别与不具有或具有所述特征的细胞分开和/或分离。这样，可提供富集具有期望特征的细胞的细胞群。所述特征可以是降低的GSTT1表达水平或非纯合野生型 GSTT1基因。
在本发明的另一个方面，提供了用于确定GSTT1表达的试剂盒，所述试剂盒包括用于确定样品中一种或多种干细胞的GSTT1表达水平的试剂。
在本发明的另一个方面，提供了用于确定GSTT1基因型的试剂盒，所述试剂盒包括用于确定含DNA样品中的GSTT1基因型的试剂。
根据本发明一些方面的试剂盒可用于根据本发明的选择干细胞供体的方法。特别地，所述试剂盒可用于鉴定用于获得干细胞的合适骨髓供体。
发明内容
GSTT1
谷胱甘肽-S-转移酶θ1(GSTT1)是一种属于GST超家族的代谢酶。这一II相代谢蛋白的家族根据其序列和结构分成7类。它们催化还原型谷胱甘肽与亲电性和疏水性异生物质结合以解毒(图1A)。它们还除去活性氧、生物合成和代谢前列腺素和甾醇。
下面提供了野生型智人(Homo sapiens)GSTT1的DNA、编码DNA (即，CDS)和氨基酸序列。
智人GSTT1 DNA序列(NCBI参考序列NT_187633.1GI:568815467)
ACTGGAGTTTGCTGACTCCCTCTGGTTTCCGGTCAGGTCGGTCGGTCCCCACTAT GGGCCTGGAGCTGTACCTGGACCTGCTGTCCCAGCCCTGCCGCGCTGTTTACATC TTTGCCAAGAAGAACGACATTCCCTTCGAGCTGCGCATCGTGGATCTGATTAAAG GTAGGTCCAGCCTCGGGTTTGGGGAACCGAAAAGTCAGGAAGGGGACAGGTAGGCATACATAGCTTAGGGAACTTCTCCCAGCGCCACCTTCTTCCTGGGGCCATTGCT GGTCTGGTTTGGAGACCGAACAGAGAAAGGTGAGCCAGCAGGGAGATCCAAGA GTCGGGGCTCCCCAAAACTCTGCTCGGTCTCACGGAATAGACCACGGGGTTCCCC TGAGGCCGAATAAAGGGGTGGGGATCATGAAGAGAAGCCAGACAGGAGGACAA AAACGGGCGCAGCTGGGTGCAGGGGCACACGCCTGTAGTCCCAGCAACTCGAG AGGCTGGGGTGGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAATTCCAGGCCGCAGTGCACTA TCATGGTGCCCTTGAATAGCCACTGCACTCCCGTCAGGGCAATCTAGCGAGACCC CGTCTTAAAAAAAAAAAACAAAAAAAAACAAAATGAAAGCAGGTGTGACCTCG GCCTAGGGAAAGGTGGGATGAGAGAGGTCAAGGGTGCCAAGTGTAGAGACTGG GACAGCGTCAAGTCCCTTCTTTATGGCCCAGCTGCTGAGATTCTGCAACAGCAAA CAGCTCAGGACGTGACTTTCCATCCCTGCCCTCTGCACTCGTCCAGTCTGCATTG GGGTCCCTCTTTGTCCCTTCCTTCCTCTGTTCCTCCTGTTTTGCCTCTGACCTTGTC CTTGTCCTTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTTGCTTTTGCTTTGTTGCAGTGCAGTGG CACGGATCTCGAATCACTGCAACCACCACCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGC 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智人GSTT1编码序列(NCBI参考序列NM_000853.2GI:167466163)
ACTGGAGTTTGCTGACTCCCTCTGGTTTCCGGTCAGGTCGGTCGGTCCCCACTAT GGGCCTGGAGCTGTACCTGGACCTGCTGTCCCAGCCCTGCCGCGCTGTTTACATC TTTGCCAAGAAGAACGACATTCCCTTCGAGCTGCGCATCGTGGATCTGATTAAA GGTCAGCACTTAAGCGATGCCTTTGCCCAGGTGAACCCCCTCAAGAAGGTGCCAGCCTTGAAGGACGGGGACTTCACCTTGACGGAGAGTGTGGCCATCCTGCTCTAC CTGACGCGCAAATATAAGGTCCCTGACTACTGGTACCCTCAGGACCTGCAGGCC CGTGCCCGTGTGGATGAGTACCTGGCATGGCAGCACACGACTCTGCGGAGAAGC TGCCTCCGGGCCTTGTGGCATAAGGTGATGTTCCCTGTTTTCCTGGGTGAGCCAG TATCTCCCCAGACACTGGCAGCCACCCTGGCAGAGTTGGATGTGACCCTGCAGT TGCTCGAGGACAAGTTCCTCCAGAACAAGGCCTTCCTTACTGGTCCTCACATCTC CTTAGCTGACCTCGTAGCCATCACGGAGCTGATGCATCCCGTGGGTGCTGGCTG CCAAGTCTTCGAAGGCCGACCCAAGCTGGCCACATGGCGGCAGCGCGTGGAGG CAGCAGTGGGGGAGGACCTCTTCCAGGAGGCCCATGAGGTCATTCTGAAGGCCA AGGACTTCCCACCTGCAGACCCCACCATAAAGCAGAAGCTGATGCCCTGGGTGC TGGCCATGATCCGGTGAGCTGGGAAACCTCACCCTTGCACCGTCCTCAGCAGTC CACAAAGCATTTTCATTTCTAATGGCCCATGGGAGCCAGGCCCAGAAAGCAGGA ATGGCTTGCCTAAGACTTGCCCAAGTCCCAGAGCACCTCACCTCCCGAAGCCAC CATCCCCACCCTGTCTTCCACAGCCGCCTGAAAGCCACAATGAGAATGATGCAC ACTGAGGCCTTGTGTCCTTTAATCACTGCATTTCATTTTGATTTTGGATAATAAA CCTGGGCTCAGCCTGAGCCTCTGCTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
智人GSTT1氨基酸序列(NCBI参考序列NP_000853.2GI:167466164)
MGLELYLDLLSQPCRAVYIFAKKNDIPFELRIVDLIKGQHLSDAFAQVNPLKKVPALK DGDFTLTESVAILLYLTRKYKVPDYWYPQDLQARARVDEYLAWQHTTLRRSCLRAL WHKVMFPVFLGEPVSPQTLAATLAELDVTLQLLEDKFLQNKAFLTGPHISLADLVAIT ELMHPVGAGCQVFEGRPKLATWRQRVEAAVGEDLFQEAHEVILKAKDFPPADPTIK QKLMPWVLAMIR
在本说明书中，“GSTT1”包括与GSTT1的氨基酸序列具有至少70％，更优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的蛋白质或多肽，这样的蛋白质或多肽优选地保留谷胱甘肽还原功能。
GSTT1蛋白或多肽可以是全长GSTT1蛋白或多肽或者缺少信号序列的成熟形式的片段或截短。
GSTT1蛋白可来自于或来源于任何动物或人，例如非人动物，例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿类动物(包括啮齿目的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括乳牛，例如奶牛，或牛目的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驴和非人灵长类动物或其他非人脊椎动物类生物；和/或非人哺乳动物类动物；和/或人。
GSTT1基因型可通过本领域技术人员公知的多种方式来确定。这些包括但不限于基因组DNA的限制性片段长度多态性鉴定(RFLPI)、基因组 DNA的随机扩增多态性检测(RAPD)、基因组DNA的扩增片段长度多态性检测(AFLPD)、聚合酶链反应(PCR)、DNA测序、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针以及与DNA微阵列或珠杂交。
类似地，技术人员充分能够采用用于鉴定其他变异例如表观遗传标志的方法。这些包括但不限于基于染色质免疫沉淀(ChIP)的方法、荧光原位杂交(FISH)、使用甲基化敏感限制性酶、DNA腺嘌呤甲基转移酶识别(DamID)和亚硫酸氢盐测序。
GSTT1表达和功能
GST基因的遗传多态性在世界群体中是常见的，其中一些成员具有基因的点突变或完全丧失基因。GSTT1纯合性缺失普遍存在于约20％至60％的大多数群体中(图2)。这由位于该基因侧翼的高度类似序列段的同源重组引起。
本发明涉及影响GSTT1基因和/或蛋白质表达的水平，和/或功能性 GSTT1蛋白和/或GSTT1活性的水平的任何变异(包括遗传变异、表观遗传变异、甲基化等)。例如，所述变异可影响转录、mRNA加工(例如，剪接)、mRNA稳定性、翻译、翻译后加工、蛋白质稳定性、蛋白质降解和/或蛋白质功能/活性。
在本发明的一些方面，提供了基于GSTT1基因型来鉴定一种或多种干细胞和/或鉴定干细胞供体的方法。
特别地，本发明涉及这样的GSTT1基因型，其相对于参照干细胞的基因和/或蛋白质表达水平和/或功能性GSTT1蛋白水平和/或GSTT1蛋白功能的读数产生更小或降低的基因和/或蛋白质表达水平和/或功能性 GSTT1蛋白水平和/或GSTT1蛋白功能的读数。
本文中使用的“参照干细胞”可以是野生型GSTT1纯合的干细胞，优选对应类型的干细胞。或者，“参照干细胞”可以是对应类型的代表性干细胞。在一些实施方案中，“参照干细胞”可以是具有该干细胞类型的平均(即，中值)值/水平/状况的概念干细胞。
在一些实施方案中，与参照干细胞的表达水平相比，所述基因和/或蛋白质表达水平和/或功能性GSTT1蛋白水平和/或GSTT1蛋白功能的读数可为小于1倍、小于0.99倍、小于0.95倍、小于0.9倍、小于0.85倍、小于0.8倍、小于0.75倍、小于0.7倍、小于0.65倍、小于0.5倍、小于 0.45倍、小于0.4倍、小于0.35倍、小于0.3倍、小于0.25倍、小于0.2 倍、小于0.15倍、小于0.1倍、小于0.05倍或小于0.025倍的该表达水平。
所述基因型可以是点突变、替换、插入或缺失，并且可降低或影响转录、mRNA加工(例如，剪接)、mRNA稳定性、翻译、翻译后加工、蛋白质稳定性、蛋白质降解和/或蛋白质功能/活性。例如，所述变异可以是 GSTT1基因的纯合性缺失。目的基因型的实例包括GSTT1纯合阴性基因型(即，GSTT1-/GSTT1-)和杂合基因型(GSTT1+/GSTT1-)。
预测影响GSTT1基因和/或蛋白质表达水平，和/或功能性GSTT1蛋白水平和/或GSTT1活性的变异可使用基于信息学的技术来鉴定。例如，鉴定的GSTT1编码序列的遗传变体的预测影响可通过用计算机将改变的编码序列“翻译”成预测氨基酸序列来确定。以此方式，可鉴定预测产生例如提前终止密码子并由此产生截短的潜在非功能性GSTT1的变体。
测量GSTT1表达和功能
本发明人已出乎意料地发现，GSTT1表达与细胞增殖(即，生长速率或细胞倍增时间)和/或组织形成潜能成反相关。本文中使用的“GSTT1 表达”可以是基因表达、蛋白质表达和/或GSTT1蛋白活性。
GSTT1基因表达可通过本领域技术人员公知的多种方式来测量。例如，可通过测量GSTT1mRNA的水平，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR) 或基于报道子的方法测量GSTT1mRNA的水平来测量。
类似地，GSTT1蛋白表达可通过本领域中公知的多种方法来测量，例如，可通过基于抗体的方法，例如通过western印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA等来测量GSTT1蛋白表达。表达也可通过基于报道子的方法来进行测量。
GSTT1活性(即，GSTT1蛋白功能)可通过多种方式，例如通过测定谷胱甘肽-S-转移酶活性来测量。
GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的一种或多种干细胞鉴定为具有提高的/增强的细胞增殖(即生长速率)和/或组织形成潜能。
根据本发明的某些方法，比较例如细胞、样品和/或个体之间GSTT1 表达的读数，或者将GSTT1表达的读数与GSTT1表达的参照值进行比较。
例如，可将一种或多种干细胞的GSTT1表达水平与该干细胞类型的 GSTT1表达水平的参照值进行比较。
参照值可以是该干细胞类型的已知和/或公开GSTT1表达水平值，或者可以是该干细胞类型的平均(即，中值)GSTT1表达值。在一些实施方案中，参照值可凭经验确定或者可已经凭经验确定。
在一些实施方案中，参照值可以是具有纯合野生型GSTT1基因型 (GSTT1+/GSTT1+)的对应细胞的GSTT1表达水平值
可在细胞之间，例如在具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞和不具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞之间比较GSTT1基因表达和/或 GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性。
在一些实施方案中，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞的GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性低于GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性的参照水平的100％、低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于 75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％、低于15％、低于10％或低于5％。
在一些实施方案中，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性的水平与野生型GSTT1基因的拷贝数相关。例如，从最高到最低的GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性，基因型为GSTT1+/GSTT+>GSTT1+/GSTT->GSTT1-/GSTT-。
对于下文所述的与GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性的水平相关的每一种特性，所述特性均与野生型GSTT1基因的拷贝数相关。
干细胞
本文中培养且描述的干细胞可以是任何种类的干细胞。所述干细胞可以是全能的、多能的或多潜能的。所述干细胞可以是来自于任何组织的胚胎干细胞或成体干细胞，并且可以是造血干细胞、神经干细胞或间充质干细胞。优选地，所述干细胞是成体干细胞。
在本说明书中，干细胞意指能够分裂(即自我更新)和保持全能性、多能性或多潜能性并且产生特化细胞的任何细胞类型。
本发明中培养的干细胞可从现有培养物或者直接由任何成体组织、胚胎组织或胎儿组织获得或得到，所述组织包括血液、骨髓、皮肤、上皮或脊髓鞘(正常情况下弃掉的组织)。
干细胞的多潜能性可通过使用合适的测定来确定。这样的测定可包括检测多能性的一种或多种标志物，例如碱性磷酸酶活性；检测RUNX2， Osterix，胶原I、II、IV、VII、X，骨桥蛋白，骨钙蛋白，BSPII，聚集蛋白聚糖，ALBP，CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)，脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)，碱性磷酸酶(ALP)，骨唾液蛋白2(BSPII)，胶原2a1 (COL2A1)和SOX9。
在一些优选实施方案中，所述干细胞是例如能够分化成结缔组织和/ 或骨细胞，例如软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞的间充质干细胞(MSC)。在一些优选实施方案中，所述MSC是BM-MSC。
间充质干细胞可容易地通过最小侵入性技术从骨髓获得并且可在培养物中增殖并允许分化成期望谱系。分化可通过施用特异性生长因子来诱导。转化生长因子β(TGF-β)超家族成员蛋白(例如骨形态发生蛋白(BMP)) 是间充质干细胞的软骨形成分化和成骨分化的重要因子。
间充质干细胞可使用选择性标志物例如STRO-I从指示其髓再生潜能的CD34+级分中分离并检测。这些细胞表面标志物仅见于间充质干细胞的细胞表面上并且指示细胞的多潜能性。
合适的间充质干细胞可由从骨髓的抽吸物(例如Wexler等Adult bone marrow isa rich source of human mesenchymal'stem'cells but umbilical cord andmobilized adult blood are not.HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal ofHaematology 121(2):368-374,2003年4月)或者脐带的脐带胶质(例如Ta等Long-termExpansion and Pluripotent Marker Array Analysis of Wharton’s Jelly-DerivedMesenchymal Stem Cells.Stem Cells Dev. 2009年7月20日(电子出版))收集的骨髓单核细胞获得或得到。
如本领域中公知的，间充质干细胞可通过施用合适的分化因子通过多能干细胞例如人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞的分化来获得。
间充质干细胞是能够生成软骨、骨、肌肉、腱、韧带和脂肪的组分的多潜能祖细胞。这些原始祖细胞出生后存在并且表现出干细胞特征，即低发生率和广泛的更新潜能。这些特性结合其发育可塑性在将其替代受损组织的潜在用途方面已产生巨大意义。实际上，可将这些干细胞培养以扩增其数量，然后移植到受损部位或者在接种于支架内/上后产生合适的组织构造。
因此，用于骨骼、肌肉、腱、韧带和血液修复/再生的可替选方法是将合适的祖细胞(例如，间充质干细胞、软骨细胞)的选择、增殖和调节与支持和指导再生的传导性或感应性支架以及特异性组织生长因子的谨慎选择组合。
干细胞可从任何动物或人，例如非人动物，例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿类动物(包括来自啮齿目的任何动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马、非人灵长类动物或其他非人脊椎动物生物；和/或非人哺乳动物类动物；和/或人获得。优选地，所述干细胞是人的。任选地，所述干细胞是非人的。任选地，所述干细胞是非胚胎干细胞。任选地，所述干细胞不是全能的。
在本发明的又一个方面，提供了包含通过本发明的任意方法产生的干细胞或其他细胞或者其片段或产品的药物组合物。所述药物组合物可用于医学治疗的方法。合适的药物组合物还可包含可药用的载体、佐剂或稀释剂。
在本发明的另一个方面，干细胞或通过本发明的任意方法产生的其他细胞可用于医学治疗的方法，优选地，提供了医学治疗的方法，其包括向有治疗需要的个体施用治疗有效量的所述药物或药物组合物。
通过根据本发明的培养方法和技术获得的干细胞及其他细胞可用于分化成其他用于医学治疗方法的细胞类型。因此，分化的细胞类型可来源于通过所述培养方法和技术获得的后续允许分化的干细胞，或者可看作是通过所述培养方法和技术获得的后续允许分化的干细胞的产品。可提供包含这样的分化细胞，任选地以及可药用的载体、佐剂或稀释剂的药物组合物。这样的药物组合物可用于医学治疗的方法。
间充质干细胞
在一些优选实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞(MSC)，例如能够分化成结缔组织和/或骨细胞，例如软骨细胞、成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。
间充质干细胞(MSC)初始从骨髓分离而来并且仅以总共104至105个骨髓单核细胞(BMMNC)中1个间充质干细胞存在(Friedenstein等1966)。这些细胞能够产生由单个细胞前体衍生的集落，称作CFU-F(集落形成单位成纤维细胞)群。目前已在很多其他组织包括脂肪组织(Gimble和 Guilak 2003；Zuk等2001)、脐带血(Bieback等2004；Erices等2000；Goodwin等2001；Kogler等2004；Wagner等2005)和肌肉(Jiang等2002) 中鉴定到MSC。
国际细胞治疗学会已提出了多潜能人间充质干细胞(MSC)的最低标准(Dominici等Cytotherapy(2006)第8卷,第4期,315-317)。他们提出了三个标准来限定人MSC：对塑料的粘附性、特异性表面抗原表达和多能分化潜能。特别地，他们声明“首先，MSC当使用组织培养瓶维持在标准培养条件下时必须是塑料粘附的。其次，MSC群中的≥95％必须表达CD105、CD73和CD90，如通过流式细胞术测量的。另外，这些细胞必须缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和II类HLA (HLA-DR)的表达(≤2％阳性)。第三，细胞必须能够在标准体外分化条件下分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞”。
Dominici等也指出，最独特地鉴定MSC的生物特性是其利用标准体外组织培养-分化条件向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞进行三谱系间充质分化的能力。他们确定，向成骨细胞的分化可通过用茜素红染色或冯库萨染色来证明，脂肪细胞分化可最容易地通过用油红O染色来证明，并且成软骨细胞可通过用阿尔新蓝染色或者针对II型胶原的免疫组织化学染色来证明。Dominici等指出，用于此类测定的试剂盒可商购获得并且证明分化对所有研究人员而言都是可行的。
Dominici等还认识到未来可鉴定到也可用于限定人MSC的新表面标志物。有三种这样的标志物现在是已知的：CD49a、SSEA-4和STRO-1。
Rider等报道，与未经分选的细胞相比CD49a+克隆具有增强的CD90 和CD105表达，并且证明与未经分选的细胞相比CD49a+克隆容易多谱系分化成脂肪、骨和软骨，从而支持用于富集间充质干细胞的α-1整联蛋白 (CD49a)选择的应用，并且提供了用于与从骨髓单核干细胞的异质库选择最具多潜能的细胞的策略(Rider等J.Mol.Hist(2007)38:449-458)。Rider 等还报道，CFU-F细胞与CD49a的表达相关，表达CD49a的CFU-F细胞还共表达STRO-1，并且可使用CD49a来从除了人之外的大鼠和小鼠分离 MSC，表明其可以是用于富集的保守标志物。
Gang等报道，通常用作未分化的多能人胚胎干细胞和向胚泡阶段胚胎卵裂的标志物的阶段特异性胚胎抗原SSEA-4也鉴定成体人间充质干细胞群并且可用于分离MSC(Gang等,Blood 2007；109:1743-1751)。
Gang等还描述了与表面标志物STRO-1结合的单克隆抗体在富集克隆发生基质细胞(CFU-F)-所谓的STRO-1+阳性中的应用。
胚胎干细胞
胚胎干细胞可从灵长类动物物种的成员的胚泡分离(Thomson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)。人胚胎干细胞(hES)可使用Thomson 等(美国专利No.5,843,780；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol. 38:133ff.,1998)和Reubinoff等,Nature Biotech.18:399,2000.所述的技术由人胚泡细胞制备。
简言之，人胚泡可从人体内植入前胚胎获得。或者，可使用体外受精 (IVF)的胚胎或者可使单细胞人胚胎扩增至胚泡阶段(Bongso等,Hum Reprod 4:706,1989)。将人胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养至胚泡阶段 (Gardner等,Fertil.Steril.69:84,1998)。选择发育的胚泡进行胚胎干细胞分离。通过简单暴露于链霉蛋白酶(Sigma)来从胚泡除去透明带。通过免疫外科手术来分离内细胞团，在所述免疫外科手术中使胚泡暴露于1:50 稀释度的兔抗人脾细胞抗血清30分钟，然后在DMEM中洗涤5分钟，进行三次，并暴露于1:5稀释度的豚鼠补体(Gibco)3分钟(参见Solter等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:5099,1975)。再于DMEM中洗涤两次之后，通过温和地吸移来从内细胞团(ICM)中除去裂解的滋养外胚层细胞，并将ICM铺板在mEF饲养层上。
在9天至15天后，将内细胞团衍生的生长物通过暴露于不含钙和镁的具有1mMEDTA的磷酸缓冲盐水(PBS)、通过暴露于分散酶或胰蛋白酶或者通过用微量移液管进行机械解离，然后重铺板在新鲜的培养基中的 mEF上来解离成块。将解离的细胞重铺板在新鲜的胚胎干细胞(ES)培养基中的mEF饲养层上并观察集落形成。通过微量移液管来单独选择证明未分化形态的集落，将其机械解离成块并重铺板。胚胎干细胞样形态表征为具有明显高核质比和突出核仁的紧凑集落。然后，每1周至2周通过如下使所得胚胎干细胞常规地分裂：简单胰蛋白酶处理、暴露于Dulbecco PBS (不含钙或镁，但是具有2mM EDTA)、暴露于IV型胶原酶(约200U/mL； Gibco)或者通过微量移液管来选择单个集落。约50个至100个细胞的块尺寸为最佳。
诱导多能干细胞
诱导多能干细胞(通常简写为iPS细胞或iPSC)是由非多能细胞通过插入某些基因而人工衍生的多能干细胞的类型。所述非多能细胞通常为成体体细胞，例如成纤维细胞、肺细胞或B细胞。
iPS细胞在Takahashi,K.&Yamanaka(Induction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell2006；126:663 676)；Yamanaka S等(Yamanaka S,et al.Induction of Pluripotent StemCells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. doi:10.1016/j.cell.2007.11.019,和Yamanaka S,等Generation of germline-competent inducedpluripotent stem cells.Nature 2007；448:313-7)； Wernig M,等(In vitroreprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.Nature2007；448:318-24)；Maherali N,等(Directly reprogrammed fibroblasts show globalepigenetic remodeling and widespread tissue contribution.Cell Stem Cell 2007；1:55 70)；和Thomson JA,Yu J,等 (Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derivedfrom Human Somatic Cells. Science DOI:10.1126/science.1151526)；以及Takahashi等,(Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts bydefined factors.Cell. (2007)131(5):861-72.)中进行了综述和讨论，所有均通过引用并入本文。
iPS细胞通常通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞(例如成体成纤维细胞)中来获得。转染通常通过病毒载体例如逆转录病毒来实现。转染的基因包括主转录调控因子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，但是表明其他基因增强诱导的效率。在3周至4周后，少量的转染细胞开始在形态和生化方面变得与多能干细胞类似，并且通常通过形态学选择、倍增时间或者通过报道基因和抗生素感染来进行分离。
多能细胞的来源
现在已提供了数种分离多能干细胞且不导致胚胎破坏的方法，例如通过转化(诱导)成体体细胞或生长细胞。这些方法包括：
1.通过细胞核移植的重编程。该技术涉及将细胞核从体细胞移植到卵母细胞或合子中。在一些情况下，这可导致产生动物-人杂交细胞。例如，可通过使人体细胞与动物卵母细胞或合子融合或者使人卵母细胞或合子与动物体细胞融合来产生细胞。
2.通过与胚胎干细胞融合的重编程。该技术涉及使体细胞与胚胎干细胞融合。与上述1中一样，该技术也可导致产生动物-人杂交细胞。
3.通过培养的自发重编程。该技术涉及由非多能细胞在长期培养之后产生多能细胞。例如，已通过长期培养原始生殖细胞(PGC)产生了多能胚胎生殖细胞(embryonic germ，EG)(Matsui等,Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murineprimordial germ cells in culture.Cell 70, 841 847,1992，其通过引用并入本文)。还已报道了在长期培养骨髓衍生细胞之后产生了多能干细胞(Jiang等,Pluripotency ofmesenchymal stem cells derived from adult marrow.Nature 418,41 49,2002，其通过引用并入本文)。他们将这些细胞称为多潜能成体祖细胞(MAPC)。Shinohara等也证明，在培养来自新生儿小鼠睾丸的种系干(GS)细胞的过程期间可产生多能干细胞，他们将其称为多潜能种系干(mGS)细胞(Kanatsu-Shinohara 等,Generation of pluripotent stem cellsfrom neonatal mouse testis.Cell 119, 1001 1012,2004)。
4.通过确定的因子的重编程。例如，如上所述，通过逆转录病毒介导的转录因子(例如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4)的导入进入小鼠胚胎成纤维细胞或成体成纤维细胞中来产生iPS细胞。Kaji等(Virus-free induction of pluripotency and subsequentexcision of reprogramming factors. Nature.Online publication 2009年3月1日)也描述了包含与2A肽连接的 c-Myc、Klf4、Oct4和Sox2的编码序列的单个多重蛋白表达载体的非病毒转染，其可重编程小鼠和人成纤维细胞二者。用该非病毒载体产生iPS细胞显示出多潜能性标志物的稳健表达，指示通过体外分化测定和成体嵌合小鼠的形成在功能上确定的重编程状态。他们成功地由胚胎成纤维细胞建立了具有多潜能性标志物的稳健表达的重编程人细胞系。
方法1至4由Shinya Yamanaka在Strategies and New Developments in theGeneration of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells(Cell Stem Cell 1, 2007年7月2007Elsevier Inc)中进行了描述和讨论，其通过引用并入本文。
5.由单卵裂球或活检卵裂球衍生的hESC系。参见Klimanskaya I, Chung Y,Becker S,Lu SJ,Lanza R.Human embryonic stem cell lines derived from singleblastomeres.Nature 2006；444:512；Lei等Xeno-free derivation and culture ofhuman embryonic stem cells:current status,problems and challenges.CellResearch(2007)17:682-688；Chung Y,Klimanskaya I,Becker S,等Embryonic andextraembryonic stem cell lines derived from single mouseblastomeres.Nature.2006；439:216-219；Klimanskaya I,Chung Y,Becker S,等 Humanembryonic stem cell lines derived from single blastomeres.Nature. 2006；444:481-485；Chung Y,Klimanskaya I,Becker S,等Human embryonic stem cell linesgenerated without embryo destruction.Cell Stem Cell. 2008；2:113-117；以及DuskoIlic等(Derivation of human embryonic stem cell lines from biopsiedblastomeres on human feeders with a minimal exposure to xenomaterials.StemCells And Development论文即将正式出版)，全部均通过引用并入本文。
6.由停止分裂并且在体外不能发育成桑葚胚和胚泡的停止胚胎获得的hESC系。参见Zhang X,Stojkovic P,Przyborski S,等Derivation of human embryonic stem cellsfrom developing and arrested embryos.Stem Cells 2006； 24:2669-2676；和Lei等Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells:currentstatus,problems and challenges.Cell Research(2007) 17:682-688，二者均通过引用并入本文。
7.单性生殖(或孤雌生殖)。该技术涉及对未受精卵进行化学或电刺激以促使其发育成卵裂球，由卵裂球可衍生胚胎干细胞。例如，参见Lin 等Multilineage potential ofhomozygous stem cells derived from metaphase II oocytes.Stem Cells.2003；21(2):152-61，其采用化学激活未受精的中期II 卵母细胞来产生干细胞。
8.胎儿来源的干细胞。这些细胞在潜能方面介于胚胎干细胞和成体干细胞之间并且可用于衍生多能细胞或多潜能细胞。Chris H.Jo等(Fetal mesenchymal stem cellsderived from human umbilical cord sustain primitive characteristics duringextensive expansion.Cell Tissue Res(2008)334:423 433，其通过引用并入本文)已成功地获得人脐带源性胎儿间充质干细胞 (UC fMSC)，其表达多潜能性的标志物(包括Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1、 SSEA-3、SSEA-4、Tra-1 60和Tra-1 81，如通过β-半乳糖苷酶染色所示具有最小衰老迹象并且端粒酶活性持续表达)。Winston Costa Pereira等(Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells fromhuman umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation J TissueEng Regen Med 2008；2:394 399；其通过引用并入本文)从从脐带的脐带胶质分离了纯间充质干细胞群。从脐带胶质获得的间充质干细胞还在 Troyer和Weiss(Concise Review:Wharton’s Jelly-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population.StemCells 2008:26:591-599)中进行了综述。Kim等(Ex vivo characteristics of humanamniotic membrane-derived stem cells.Cloning Stem Cells 2007Winter；9(4):581-94，其通过引用并入本文)成功地从人羊膜分离了人羊膜衍生的间充质细胞。脐带是在正常情况下丢弃的组织并且从该组织获得的干细胞往往不会引起道德或伦理异议。
9.Chung等[(2008)Human Embryonic Stem Cell Lines Generated withoutEmbryo Destruction.Cell Stem Cell.2(2)113-117.电子出版2008年 1月10日]描述了利用破坏胚胎来产生人胚胎干细胞系。
诱导多能干细胞具有以下优势：其可通过不导致胚胎破坏的方法，更特别地通过不导致人胚胎或哺乳动物胚胎破坏的方法来获得。Chung等所述的方法(上述第9项)还允许通过不导致人胚胎破坏的方法来获得人胚胎干细胞。
因此，本发明的一些方面可通过使用这样的细胞来进行或实施，所述细胞并非排他性地通过必须涉及破坏这些细胞所来源的人或动物胚胎的方法来制备。这一任选限制特别地旨在考虑欧洲专利局扩大申诉委员会 2008年11月25日的决定G0002/06。
细胞增殖
本发明部分地基于以下发现：干细胞增殖(即，生长速率)与GSTT1 表达成反相关。本文中使用的“细胞增殖”指通过细胞分裂的细胞数量增加。
本发明人已出乎意料地发现，GSTT1表达水平较低的干细胞增殖得更快(即，其具更高的生长速率)。细胞增殖/生长速率可测量为细胞分裂成两个子细胞所花费的时间-即细胞倍增时间。
细胞增殖、细胞倍增时间和/或生长速率可通过本领域技术人员公知的方法常规地确定。
GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低并且生长速率提高的干细胞具有小于该干细胞类型的细胞倍增时间的参照值的细胞倍增时间。
参照值可以是该干细胞类型的已知和/或公开的细胞倍增时间，或者可以是该干细胞类型的平均(即中值)细胞倍增时间。在一些实施方案中，参照细胞倍增时间可以凭经验来确定或者可已经凭经验确定。
可通过如下在细胞之间-例如在具有纯合野生型GSTT1基因型的细胞和不具有纯合野生型GSTT1基因型的细胞之间比较细胞增殖、细胞倍增时间和/或生长速率：在相同培养条件下进行体外细胞培养并在限定时间点对细胞进行计数。
在一些实施方案中，参照细胞倍增时间可以是具有纯合野生型GSTT1 基因型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞的细胞倍增时间。在一些实施方案中，生长速率提高的干细胞的细胞倍增时间为小于参照细胞倍增时间的100％、小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于 35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％。
克隆发生潜能
本发明部分地基于以下发现：干细胞的克隆发生潜能与GSTT1表达成反相关。即，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞具有增加的克隆发生潜能。本文中是使用的“克隆发生潜能”指干细胞自我更新的能力。
例如，对于MSC，克隆发生潜能可通过分析集落形成单位成纤维细胞 (CFU-F)来测量。例如，CFU-F分析可按如下进行：
(i)将骨髓单核细胞以0.3×105、1.0×105和3.0×105细胞/孔接种到6 孔培养板中补充有20％(v/v)FBS、2mM L-谷氨酰胺、100μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐、50U/mL青霉素、50mg/mL链霉素和β-巯基乙醇(5× 10-5M)的α-MEM中；
(ii)将细胞在37℃下在5％CO2和>90％湿度下孵育12天；
(iii)将细胞用PBS洗涤并在PBS中的1％(w/v)多聚甲醛中固定20 分钟；
(iv)将固定的细胞用0.1％(w/v)甲苯胺蓝(在1％多聚甲醛溶液中) 染色1小时，并且；
(v)对CFU-F进行计数；
其中将超过50个细胞的聚集体评分为CFU-F。
与该干细胞类型的参照CFU-F值相比，克隆发生潜能提高的干细胞具有增加的CFU-F频率。
参照值可以是该干细胞类型的已知的CFU-F频率和/或公开的CFU-F 频率，或者可以是该干细胞类型的平均(即，中值)CFU-F频率。在一些实施方案中，参照CFU-F频率可凭经验确定或者可已经凭经验确定。
在一些实施方案中，参照CFU-F频率可以是具有纯合野生型GSTT1 基因型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞的CFU-F频率。
在一些实施方案中，克隆发生潜能提高的干细胞的CFU-F频率相对于参照CFU-F频率增加0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、 0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、 4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、 12.5％、15％、17.5％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％或更多。可通过上述方法或者通过本领域技术人员已知的其他方法在细胞之间-例如在具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞和不具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞之间比较CFU-F频率。
在一些实施方案中，培养物中高比例的GSTT1基因表达和/或GSTT1 蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞维持亲本细胞的多潜能或多能特征(例如，干细胞分化成该类型干细胞特征性的特定组织类型的能力)。例如，优选地培养物中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的干细胞表现出亲本干细胞的多潜能或多能特征。这可相对于起始培养物中多潜能细胞或多能细胞的数量来测量。在一些实施方案中，可将多潜能或多能细胞比例的增加与经受相应培养条件的对照干细胞培养物进行比较。
组织形成
生长速率和/或克隆发生潜能增强的干细胞相应地具有增强的组织形成潜能。即，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞形成组织的能力增强。
本文中使用的“组织形成潜能”指干细胞形成组织的能力。这可以是组织的量，例如组织的三维体积和/或重量，或者可以是组织的质量，例如密度。
例如，所述组织可以是骨、软骨、肌肉、腱、韧带、脂肪、半月板或神经组织。在一些实施方案中，所述干细胞是MSC并且所述组织是骨组织。
在一些实施方案中，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞在体外和/或体内形成组织的能力增强。
组织形成潜能可常规地通过本领域技术人员已知的方法来评价。通常来说，将干细胞或干细胞群放置在诱导干细胞使细胞朝着特定组织的谱系分化的体外或体内条件下。
例如，离体骨的形成可如下文所述进行测量。
与该干细胞类型在相同条件下的参照组织量相比，组织形成潜能增强的干细胞在限定的时间量内每个起始细胞形成更多的组织。参照组织量可以是已知的/或公开的，或者可以是该干细胞类型的平均值(即中值)。在一些实施方案中，参照组织量可凭经验确定或者可已凭经验确定。
在一些实施方案中，参照组织量可以是由具有纯合野生型GSTT1基因型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞形成的组织的量。
可按如下在细胞之间-例如在具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞和不具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞之间比较组织形成潜能：将相同数量的干细胞放置在相同条件下、使其分化成相同的组织类型并持续相同的时间量。然后，可对得到的组织进行分析。
在一些实施方案中，与由参照干细胞形成的组织量相比，组织形成潜能增强的干细胞形成多于1倍、多于1.1倍、多于1.2倍、多于1.3倍、多于1.4倍、多于1.5倍、多于1.6倍、多于1.7倍、多于1.8倍、多于1.9 倍、多于2倍、多于2.1倍、多于2.2倍、多于2.3倍、多于2.4倍、多于 2.5倍、多于2.6倍、多于2.7倍、多于2.8倍、多于2.9倍、多于3倍、多于3.1倍、多于3.2倍、多于3.3倍、多于3.4倍、多于3.5倍、多于3.6 倍、多于3.7倍、多于3.8倍、多于3.9倍、多于4倍、多于4.1倍、多于 4.2倍、多于4.3倍、多于4.4倍、多于4.5倍、多于4.6倍、多于4.7倍、多于4.8倍、多于4.9倍或多于5倍量的组织。
标志物
本发明人已鉴定出与GSTT1表达相关的更多特征。
在一些实施方案中，与GSTT1纯合野生型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞相比和/或与该干细胞类型的平均值(即中值)相比，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞：
(i)可具有增强的集落形成能力；
(ii)可具有更小的尺寸；
(iii)可具有更长的端粒或者降低的端粒缩短速率；
(iv)可具有提高的STRO-1、SSEA-4CD146和/或PDGFRβ表达；
(v)可具有增加的FGF-2、VEGF、SDF-1α、Fractalkine、PDGF-BB和 /或MIP-1α分泌；
(vi)可表现出增强的抑制T细胞的能力，并且；
(vii)可具有降低的ALP、RUNX2和/或BSP-II表达；
(viii)可具有提高的TWIST-1和DERMO-1表达。
这些特性可容易地由技术人员来进行研究。
因此，具有这些特性中一种或多种的干细胞可用于鉴定GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞。因此，在一些实施方案中，本发明的方法可包括预筛选步骤，其中可在确定GSTT1 基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性和/或GSTT1基因型之前针对特征中的一种或多种对从个体获得的干细胞群或样品进行分析。
在一些实施方案中，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞的尺寸小于参照干细胞的尺寸的100％、小于 95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％，其中所述参照细胞可以是GSTT1纯合野生型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞和/ 或该干细胞类型的平均(即中值)尺寸。
在一些实施方案中，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞的端粒缩短速率低于参照干细胞的端粒缩短速率的100％、低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于 40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％、低于15％、低于10％或低于5％，其中所述参照细胞可以是GSTT1纯合野生型 (GSTT1+/GSTT1+)的干细胞和/或该干细胞类型的平均(即中值)端粒缩短速率。
端粒缩短的速率可例如如Samsonraj等,Telomere length analysis of humanmesenchymal stem cells by quantitative PCR,Gene 2013中所述来进行研究。
在一些实施方案中，与参照干细胞相比，GSTT1基因表达和/或GSTT1 蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞具有相对更高的生长因子受体表达，其中所述参照细胞可以是GSTT1纯合野生型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞和/或该干细胞类型的平均(即中值)生长因子受体表达。
例如，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞具有相对更高的STRO-1、SSEA-4、CD146和/或PDGFRβ中的一种或多种的表达。在一些实施方案中，与参照干细胞的表达相比，所述表达水平可超过1倍、超过1.1倍、超过1.2倍、超过1.3倍、超过1.4倍、超过1.5倍、超过1.6倍、超过1.7倍、超过1.8倍、超过1.9倍、超过2 倍、超过2.1倍、超过2.2倍、超过2.3倍、超过2.4倍、超过2.5倍、超过2.6倍、超过2.7倍、超过2.8倍、超过2.9倍、超过3倍、超过3.1倍、超过3.2倍、超过3.3倍、超过3.4倍、超过3.5倍、超过3.6倍、超过3.7 倍、超过3.8倍、超过3.9倍、超过4倍、超过4.1倍、超过4.2倍、超过 4.3倍、超过4.4倍、超过4.5倍、超过4.6倍、超过4.7倍、超过4.8倍、超过4.9倍或超过5倍。
在一些实施方案中，与参照干细胞相比，相对较高比例的GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的细胞积极表达 STRO-1,SSEA-4、CD146和/或PDGFRβ中的一种或多种。
生长因子受体的表达可通过本领域技术人员已知的多种方式，例如通过流式细胞术和/或基因表达分析来确定。
在一些实施方案中，与参照干细胞相比，GSTT1基因表达和/或GSTT1 蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞具有相对更高的参与伤口愈合的因子的分泌，其中所述参照细胞可以是GSTT1纯合野生型 (GSTT1+/GSTT1+)的干细胞和/或该干细胞类型的参与伤口愈合的因子的平均(即中值)分泌水平。
例如，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞可分泌相对更高量的FGF-2、VEGF、SDF-1α、Fractalkine、 PDGF-BB和/或MIP-1α。在一些实施方案中，所述分泌水平可超过1倍、超过1.1倍、超过1.2倍、超过1.3倍、超过1.4倍、超过1.5倍、超过1.6 倍、超过1.7倍、超过1.8倍、超过1.9倍、超过2倍、超过2.1倍、超过 2.2倍、超过2.3倍、超过2.4倍、超过2.5倍、超过2.6倍、超过2.7倍、超过2.8倍、超过2.9倍、超过3倍、超过3.1倍、超过3.2倍、超过3.3 倍、超过3.4倍、超过3.5倍、超过3.6倍、超过3.7倍、超过3.8倍、超过3.9倍、超过4倍、超过4.1倍、超过4.2倍、超过4.3倍、超过4.4倍、超过4.5倍、超过4.6倍、超过4.7倍、超过4.8倍、超过4.9倍或超过5倍的参照干细胞的分泌。
参与伤口愈合的因子的表达可通过本领域技术人员已知的多种方式，例如通过ELISA基因表达分析来确定。
在一些实施方案中，与参照干细胞相比，GSTT1基因表达和/或GSTT1 蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞具有增强的抑制T细胞的能力，其中所述参照细胞是GSTT1纯合野生型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞和/ 或该干细胞类型的平均(即中值)抑制T细胞能力。用于评价抑制T细胞的能力的测定是本领域技术人员公知的。例如，可通过评价抑制T细胞增殖的能力来测量T细胞抑制。
在一些实施方案中，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞具有降低的成骨标志物表达。例如，与GSTT1 纯合野生型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞和/或该干细胞类型的平均(即中值)表达相比，所述干细胞可具有降低的ALP、RUNX2和/或BSP-II表达。在一些实施方案中，与参照干细胞的表达水平相比，所述表达水平可低于1倍、低于0.9倍、低于0.9倍、低于0.8倍、低于0.7倍、低于0.6 倍、低于0.5倍、低于0.4倍、低于0.3倍、低于0.2倍或0.1倍的该表达水平。
在一些实施方案中，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞具有提高的中胚层基因表达。例如，与GSTT1 纯合野生型(GSTT1+/GSTT1+)的干细胞和/或该干细胞类型的平均(即中值)表达相比，所述干细胞可具有提高的TWIST-1和/或DERMO-1表达。在一些实施方案中，与参照干细胞的表达水平相比，所述表达水平可超过1倍、超过1.1倍、超过1.2倍、超过1.3倍、超过1.4倍、超过1.5 倍、超过1.6倍、超过1.7倍、超过1.8倍、超过1.9倍、超过2倍、超过 2.1倍、超过2.2倍、超过2.3倍、超过2.4倍、超过2.5倍、超过2.6倍、超过2.7倍、超过2.8倍、超过2.9倍、超过3倍、超过3.1倍、超过3.2 倍、超过3.3倍、超过3.4倍、超过3.5倍、超过3.6倍、超过3.7倍、超过3.8倍、超过3.9倍、超过4倍、超过4.1倍、超过4.2倍、超过4.3倍、超过4.4倍、超过4.5倍、超过4.6倍、超过4.7倍、超过4.8倍、超过4.9 倍或超过5倍的该表达水平。
基因表达可通过本领域技术人员公知的多种方式，例如通过定量实时 PCR(qRT-PCR)来确定。
根据本发明的方法可在体外或体内进行。术语“体外”旨在涵盖用材料、生物物质、细胞和/或组织在实验室条件或在培养物中进行的实验，而术语“体内”旨在涵盖用完整的多细胞生物进行的实验和操作。
调节GSTT1表达
本发明人已发现可通过改变GSTT1基因或蛋白表达水平或者GSTT1 功能来调节干细胞的生长速率和/或组织形成潜能。
因此，本发明提供了用于修饰一种或多种干细胞的方法，所述方法包括使一种或多种干细胞与能够修饰干细胞以降低GSTT1表达和/或功能的试剂接触。
技术人员充分能够鉴定能够修饰干细胞以降低GSTT1基因和/或蛋白表达和/或功能的试剂。
在一些实施方案中，能够修饰干细胞以降低GSTT1表达和/或功能的试剂可通过影响GSTT1转录、mRNA加工(例如剪接)、mRNA稳定性、翻译、翻译后加工、蛋白质稳定性、蛋白质降解和/或GSTT1蛋白功能/活性来实现降低的GSTT1基因或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述试剂可以是影响GSTT1mRNA的水平的试剂。例如，所述试剂可通过RNA干扰(RNAi)来敲除GSTT1表达。
在一些实施方案中，所述试剂可以是抑制性核酸。抑制性核酸可以是反义RNA或小干扰RNA，包括但不限于shRNA或siRNA。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸提供在载体上。例如，在一些实施方案中，所述试剂是编码GSTT1的shRNA的慢病毒载体。
在一些实施方案中，所述试剂可以是能够改变干细胞的基因组以降低该干细胞的GSTT1基因或蛋白表达和/或GSTT1功能/活性的试剂。例如，所述试剂可能够破坏GSTT1和/或使GSTT1失活，和/或可整合编码序列的DNA序列，所述序列编码能够降低GSTT1基因或蛋白表达和/或GSTT1 功能/活性的分子。
在一些实施方案中，所述试剂可以是GSTT1蛋白的抑制剂。例如，所述试剂可以是能够与GSTT1蛋白结合并抑制GSTT1功能/活性的分子。在一些实施方案中，所述试剂可以是针对GSTT1的抗体。在一些实施方案中，所述试剂可以是GSTT1功能/活性的竞争性抑制剂。
在一些实施方案中，所述方法包括：(i)任选地从个体分离一种或多种干细胞，和；(ii)使分离的一种或多种干细胞在体外与能够修饰干细胞以降低GSTT1表达和/或功能的试剂接触。
本发明还提供了已进行修饰以降低内源性GSTT1表达和/或功能的一种或多种干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞已用能够降低GSTT1 基因或蛋白表达和/或GSTT1功能的试剂进行修饰。
还提供了包含能够降低GSTT1基因或蛋白表达和/或GSTT1功能的试剂的一种或多种干细胞。
还提供了一种或多种这样的干细胞，其已被修饰已具有相对于野生型GSTT1纯合的干细胞和/或具有该干细胞类型的(即中值)GSTT1表达和/ 或功能的平均水平的干细胞降低的GSTT1表达和/或功能。
用途
GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低并且生长速率和/或组织形成潜能提高的干细胞可用于多种应用，这对于技术人员将是显而易见的。
所述干细胞可用于在体外和体内生成组织。例如，可在体外生成适合用于植入到患者中的组织，或者可向患者中施用或植入通过本发明方法鉴定或选择的细胞以提供医学治疗，例如组织再生。
因此，本发明提供了用于医学治疗方法的根据本发明的一种或多种干细胞。
根据本发明的一种或多种干细胞还可用于制备用于医学治疗方法的药物。
此外，本发明提供了用于在有治疗需要的患者中再生组织的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗数量的根据本发明的干细胞。
还提供了用于治疗骨折或修复软骨组织的方法的根据本发明的一种或多种干细胞，所述方法包括向骨折或损伤部位周围的组织施用所述干细胞。
使用GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞的预防或治疗可涉及组织的修复、再生或替代，所述组织特别是结缔组织，例如骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或腱。
在这些组织之一退化的患者中，施用于退化部位的GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞，优选间充质干细胞可增殖并分化成合适的结缔组织，从而实现受损组织的替代/再生和损伤的治疗。
或者，可收集由GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1 活性降低的间充质干细胞的体外培养物获得的结缔组织并植入损伤或患病部位以替代受损或衰退的组织。可任选地先从损伤或患病部位切除受损或衰退组织。
因此，GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞可用于体内伤口愈合，包括组织修复、再生和/或替代(例如，瘢痕组织或断骨的愈合)，其通过向需要治疗的患者直接施用GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞，优选间充质干细胞来实现。GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞还可用于体外生成适合用于植入到需要组织修复、再生和/或替代的患者中的组织。
骨折
在一些方面，本发明涉及GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/ 或GSTT1活性降低的干细胞治疗骨折的治疗用途(人和/或兽医)。
骨折是一种医学疾病。在本申请中，“骨折”包括其中骨破裂、断裂或碎裂的骨损害或损伤。断裂指骨不连续。骨折可由物理冲击或机械应激或者由医学疾病(例如骨质疏松症或骨关节炎)引起。
骨折的矫形外科分类包括闭合性骨折或开放性骨折和单纯性骨折或多碎片性骨折。在闭合性骨折中，皮肤仍保持完整，而在开放性骨折中，骨可通过伤口部位暴露，这引起更高的感染风险。单纯性骨折沿单条线发生，倾向于将骨一分为二。多碎片性骨折将骨分裂成多片。
其他骨折类型包括压迫性骨折，压缩性骨折，螺旋骨折，完全性和不完全性骨折，横断性骨折、线性骨折和斜形骨折；以及粉碎性骨折。
在大多数患者中，骨愈合(骨折愈合)自然地发生并且紧接损伤之后开始。出血通常导致凝固并且吸引白血细胞和成纤维细胞，之后产生胶原纤维。在这之后骨基质(钙羟基磷灰石)沉积(矿化)将胶原基质转化成骨。未成熟的再生骨通常比成熟骨弱，并且随着时间不成熟骨经历重塑以生成成熟“板层”骨的过程。完整的骨愈合过程需要大量时间，通常为很多个月。
其中发生骨折并且可从GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞的治疗受益的骨包括所有骨类型，特别是所有哺乳动物骨，包括但不限于长骨(例如，股骨、肱骨、指骨)、短骨(例如，腕骨、跗骨)、扁骨(例如，颅骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盆带)、不规则骨(例如，椎骨)、籽骨(例如髌骨)。
其中发生骨折并且可从GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或 GSTT1活性降低的干细胞的治疗受益的骨包括骨骼骨(即，骨骼的任何骨)、颅面区域的骨、中轴骨骼的骨(例如，椎骨、肋骨)、附肢骨(例如，四肢的骨)、骨盆骨骼的骨(例如盆骨)。
其中发生骨折并且可从使用GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和 /或GSTT1活性降低的干细胞的治疗受益的骨还包括头(颅骨)和颈的骨，包括面部(例如颌、鼻和颊)的那些骨。GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞可用于帮助在牙齿或面部或颅外科手术期间修复或再生骨，其可包括面部和/或口的骨(与牙齿不同)(例如，包括颌骨)的重建。
骨折还包括病理学多孔性，例如患有骨质疏松症的患者所表现的。
提供了GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞以及包含此类干细胞的药物组合物和药物，其用于治疗哺乳动物中的骨折的方法中。
治疗可包括骨的创伤愈合。所述治疗可涉及骨的修复、再生和生长。GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞有利于通过促进新骨生长来进行骨折修复。GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞发挥提高骨折修复的速度使得骨愈合能够更快地发生从而导致改善从损伤的恢复时间的作用。治疗可导致改善骨强度。
治疗还可包括骨质疏松症或骨关节炎的治疗。
GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞的施用优选地针对骨折周围的组织。这可包括直接适用于已发生骨折的骨组织。施用可针对骨或骨折周围的结缔组织或者针对骨附近并且供应骨的脉管系统(例如，血管)。施用可直接针对损伤部位，并且可针对由创伤的初始愈合形成的骨痂。
根据本发明的药物和药物组合物可配制成用于通过多种途径来施用。
施用优选地为“治疗有效量”的GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞，与对应的未经治疗骨折相比，其足以改善骨折的愈合。施用的实际数量和时间进程将取决于骨折的性质和严重程度。治疗处方在普通从业人员及其他医生的责任之内，并且通常考虑骨折的性质、个体患者的状况、递送部位、施用方法以及从业人员已知的其他因素。GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞的单次或多次施用可根据处方医学从业人员的指导来进行。
GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞可用于与其他治疗一起来治疗骨折，所述其他治疗例如施用缓解疼痛的或抗炎的药物；固定和复位骨，例如将受损的肢体固定在石膏模型内；外科手术干预，例如以使骨复位或者移动骨以矫正移位、成角或脱位。如果需要外科手术的话，则可在外科手术操作期间直接向骨折施用(例如，施加)GSTT1基因表达和/或GSTT1蛋白表达和/或GSTT1活性降低的干细胞。
用于选择干细胞供体的方法
在本发明的另一个方面，提供了用于选择干细胞供体的方法。“选择干细胞供体”可包括鉴定用于获得干细胞的骨髓的合适供体。
在一些实施方案中，所述方法包括确定从个体获得的含核酸样品中的 GSTT1基因型。在一些实施方案中，所述样品可以是或者可来源于例如从个体获得的组织或液体样品(例如，颊拭子、血液或皮肤钻取样品)。在一些实施方案中，所述方法包括制备核酸或者从样品提取核酸的步骤。
在一些实施方案中，所述核酸可以是DNA，例如基因组DNA。在一些实施方案中，所述核酸可以是RNA。在这样的实施方案中，所述方法可包括由RNA例如通过逆转录制备cDNA。
在一些实施方案中，所述方法包括检测和/或定量样品中的GSTT1核酸。
本文中使用的GSTT1核酸指GSTT1基因座中包含的或者由GSTT1 基因座转录的核酸。在一些实施方案中，GSTT1核酸可以是编码GSTT1 蛋白的核酸。即，GSTT1核酸可以是转录并随后翻译成GSTT1蛋白的核酸，或者可翻译成GSTT1蛋白的核酸，如上文所限定的。
在一些实施方案中，所述方法包括检测样品中不存在GSTT1核酸。
在一些实施方案中，所述方法包括使含核酸样品与一种或多种适合用于检测和/或定量含和核酸样品中的GSTT1核酸的寡核苷酸接触。在一些实施方案中，所述方法包括使含核酸样品与一种或多种适合用于检测含核酸样品中不存在GSTT1核酸的一种或多种寡核苷酸接触。
在一些实施方案中，所述方法包括检测含核酸样品中存在GSTT1等位基因。在一些实施方案中，所述GSTT1等位基因是野生型GSTT1等位基因、已知和/或预测将导致相对于野生型GSTT1等位基因GSTT1表达降低的GSTT1等位基因和GSTT1无效(即缺失型)等位基因的一种或多种。在一些实施方案中，所述方法包括使含核酸样品与用于检测含核酸样品中的GSTT1等位基因的寡核苷酸接触。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸(例如引物)只有当样品中存在特定GSTT1等位基因时才能够扩增DNA片段，例如，用于检测野生型 GSTT1等位基因存在的寡核苷酸可退火于包含GSTT1无效(即缺失型) 等位基因的DNA序列中不存在的DNA序列。例如，用于检测GSTT1缺失型等位基因存在的寡核苷酸可退火于不产生来自包含野生型GSTT1等位基因的DNA序列的扩增产物的DNA序列。PCR扩增反应的扩增产物可通过技术人员公知的方式来分析，例如通过PCR扩增反应产物的凝胶电泳和所扩增DNA的可视化来分析。
在一些实施方案中，用于所述方法的寡核苷酸可包含一种或多种用于检测GSTT1的引物，其在Buchard等,J Mol Diagn,(2007)9(5):612-617，第613和614页的表1和2中进行了公开，通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，所述寡核苷酸可包含以下寡核苷酸中的一种或多种：
Figure BDA0001231526180000391
Figure BDA0001231526180000401
在一些实施方案中，所述方法包括进行PCR反应。在一些实施方案中，所述方法包括进行逆转录PCR(RT-PCR)。
在一些实施方案中，所述方法包括检测和/或定量样品中的GSTT1核酸的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括对GSTT1表达进行分析。在一些实施方案中，所述方法包括检测和/或定量由从个体获得的含核酸样品制备的cDNA样品中的GSTT1核酸。在一些实施方案中，所述方法包括通过 RT-PCR来分析GSTT1表达。在一些实施方案中，分析使用适于使用 TaqMan RT-PCR平台通过RT-PCR来检测GSTT1表达的寡核苷酸(例如引物和探针)来进行。
在一些实施方案中，所述方法包括选择以下个体作为干细胞供体，所述个体确定具有(i)已知和/或预测导致相对于野生型GSTT1纯合个体 GSTT1表达降低的GSTT1基因型，或者(ii)已知和/或预测相对于野生型 GSTT1纯合个体GSTT1表达降低的GSTT1表达。
在一个相关方面，本发明提供了用于评估由个体产生的干细胞的质量的方法。所述方法包括如上所述确定GSTT1基因型或GSTT1表达。在这样的实施方案中，已知和/或预测导致相对于野生型GSTT1纯合个体 GSTT1表达降低的GSTT1基因型，或者已知和/或预测相对于野生型 GSTT1纯合个体GSTT1表达降低的GSTT1表达指示高质量干细胞。
在另一个方面，本发明提供了使用根据本发明的试剂盒来选择干细胞供体的方法。
试剂盒
在本发明的一些方面，提供了用于检测GSTT1或GSTT1基因型的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒可适于选择干细胞供体。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括用于该试剂盒所期望用于的测定的适于处理组织或细胞样品的试剂或缓冲液。这样的试剂盒可用于鉴定用于获得干细胞的骨髓的合适供体。所述试剂盒可适于评估由个体产生的干细胞的质量。
因此，提供了用于确定GSTT1表达的试剂盒。所述试剂盒可具有至少一个容器，其具有预定量的一种或多种用于确定样品中的GSTT1表达的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括一种或多种定量或定性确定样品中GSTT1表达的水平所必需的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括一种或多种用于确定从个体分离的样品中的一种或多种干细胞中的GSTT1表达水平的试剂。
技术人员能够容易地鉴定适于确定样品中GSTT1表达的水平的试剂。合适的试剂可包括一种或多种，例如一对寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物各自具有与GSTT1编码核酸(例如DNA、mRNA、cDNA)的核苷酸序列区互补的核苷酸序列。
因此，合适的试剂盒可包括至少一个具有预定量的一种或多种可用于扩增GSTT1编码核酸，例如通过聚合酶链反应方法(PCR)来扩增GSTT1 编码核酸的寡核苷酸引物的容器；和具有预定量的一种或多种热稳定酶 (例如Taq聚合酶)的容器(任选地为相同容器)，所述热稳定酶任选地与合适的缓冲液或溶剂在一起；任选地包括一个或多个可检测标记并且任选地还包括一个或多个适于进行扩增实验的无菌反应容器。
或者，合适的试剂可包括一种或多种对GSTT1具有特异性的结合剂 (例如抗体或适配体)以及任选地可检测标记，所述试剂适合与GSTT1 蛋白结合并且结合的复合物适于通过与标记缀合来进行检测。例如，所述试剂盒可适于进行夹心检测测定，并且可包括第GSTT1结合剂(例如，抗体，任选地固定在固体支持物上)、当与第一GSTT1结合剂形成复合物时能够与GSTT1结合的第二GSTT1结合剂、一种或多种适于标记或检测第一结合剂:GSTT1:第二结合剂的复合物的检测试剂；以及任选地用于检测试剂的底物和任选地缓冲液。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含进行用于确定样品中的GSTT1 表达水平的测定所必需和/或足够的所有组分，包括所有对照、用于进行测定的说明/指导以及用于分析和提供结果的任何必需软件。
还提供了用于确定GSTT1基因型的试剂盒。所述试剂盒包括用于确定样品中的GSTT1基因型的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于确定从个体分离的含DNA样品中GSTT1的基因型的试剂。技术人员能够容易地鉴定适于确定样品中的GSTT1基因型的试剂。在一些实施方案中，试剂可包括一种或多种寡核苷酸引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含进行用于确定样品中的GSTT1基因型的测定所必需和/或足够的所有组分，包括所有对照、用于进行测定的说明/指导以及用于分析和提供结果的任何必需软件。在一些具体实施方案中，所述试剂盒能够检测含核酸样品中GSTT1等位基因的存在。在一些实施方案中，所述GSTT1等位基因是野生型GSTT1等位基因、已知和/或预测导致相对于野生型GSTT1等位基因GSTT1表达降低的GSTT1等位基因和GSTT1无效(即缺失型) 等位基因的一种或多种。
在一些实施方案中，所述试剂盒能够检测野生型和缺失型GSTT1等位基因，例如通过PCR扩增来检测。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于检测野生型和缺失型GSTT1等位基因的寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述试剂盒适于检测含核酸样品中存在或不存在 GSTT1基因。在一些实施方案中，所述样品可从个体获得。在一些实施方案中，所述含核酸样品可以是或者可来源于例如从个体获得的组织或液体样品(例如，颊拭子、血液或皮肤钻取样品)。在一些实施方案中，所述核酸可以是DNA，例如基因组DNA。
在一些实施方案中，试剂盒含有用于检测基因组DNA中的野生型和缺失型GSTT1等位基因的寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含只有当样品中存在特定GSTT位基因时才能够扩增DNA片段的寡核苷酸(例如引物)。例如，用于检测野生型GSTT1等位基因存在的寡核苷酸可退火于包含GSTT1缺失型等位基因的DNA序列中不存在的DNA序列。例如，用于检测GSTT1缺失型等位基因存在的寡核苷酸可退火于不产生来自包含野生型GSTT1等位基因的DNA序列的扩增产物的DNA序列。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种用于检测GSTT1的引物，其在Buchard等,J Mol Diagn,(2007)9(5):612-617，第613和614 页的表1和2中进行了公开。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含上述“GSTT1_基因”和“GSTT1_缺失”引物组中的一种或多种寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述试剂盒能够在单个PCR扩增反应中同时检测野生型和缺失型GSTT1等位基因(如果存在于样品中的话)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含适合用于以多重形式检测野生型和缺失型GSTT1 等位基因的寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸(例如引物和探针)适于与本领域技术人员公知的TaqMan平台(Life Technologies)一起使用。例如，所述寡核苷酸可具有适于与TaqMan平台一起使用的特性(例如长度、组成、退火温度等)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸适于检测野生型GSTT1 等位基因、已知和/或预测导致相对于野生型GSTT1等位基因GSTT1表达降低的GSTT1等位基因和GSTT1无效(即缺失型)等位基因的一种或多种。在一些实施方案中，所述寡核苷酸适于检测基因组DNA中的野生型GSTT1和缺失型GSTT1等位基因。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸适于检测由从个体获得的含核酸样品制备的cDNA样品中的GSTT1。因此，在一些实施方案中，所述寡核苷酸适合用于通过RT-PCR来检测GSTT1表达。在一些实施方案中，所述寡核苷酸(例如引物和探针)适于通过使用TaqMan RT-PCR平台通过RT-PCR 来检测。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许或明确避免的。
本文中使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
现在将参考附图通过实例的方式来说明本发明的一些方面和实施例。其它方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。正文中提及的所有文件通过引用并入本文。
附图简述
现在将参考附图来讨论说明本发明的原理的实施方案和实验，在附图中：
图1
(A)基于序列同源性和结构的GST超家族分类。(B)GST酶催化谷胱甘肽与异生物质的结合。
图2
数个群体间GSTT1纯合性缺失的频率。
图3
快速生长和缓慢生长的MSC系的细胞增殖的持续监测。在 xCELLigence系统上在5天内(时间以小时示出)评估培养孔中活细胞的数量(细胞指数)。示出了代表每组的两种独立细胞系的结果，其中每种细胞系进行三次技术上的重复。线开始在下方，然后越过另一条线并保持其上方＝快速生长；另一条线＝缓慢生长。
图4
(A)归一化的微阵列珠芯片信号。所有的缓慢生长物(B、D和F) 均以适度水平表达GSTT1，而快速生长物中有两种(A和C)具有可忽略的表达。(B)GSTT1的基因分型。BM-MSC系A和C是无效基因(GSTT1-/-)，剩余的均为阳性的(B、D、E、F：GSTT1+/-；10R、11R：GSTT1+/+)。(C) 通过qRT-PCR的表达分析。GSTT1水平与等位基因的拷贝数相关。(D) 蛋白质表达分析。表达与“三模态效应”一致。
图5
通过彗星试验的DNA损伤评价。对显微镜载玻片上包埋在低熔点琼脂糖中的细胞进行裂解和电泳。(A)彗星试验之后的彗星图像。缓慢和快速生长物的经DAPI染色细胞核具有类似程度的尾长。(B)通过olive尾距值来定量DNA损伤在两组中检测到不显著的损伤。
图6
通过彗星试验的氧化应激后DNA损伤的评价。将包埋的细胞10μM 过氧化氢处理20分钟，之后裂解并进行hOGG1处理，然后进行电泳。对照：不处理、仅诱变剂和仅酶。(A)彗星试验之后的彗星图像。在过氧化氢和酶处理之后尾长增加，但是在快速和缓慢生长物之间尾长相当。(B) DNA损伤的Olive尾测量结果。在不同处理下在组间未检测到差异。
图7
通过qRT-PCR(A)和western印迹(B)的代间GSTT1表达分析。 GSTT1表达随着传代而提高。
图8
(A)GSTT1敲除效率。与非沉默对照相比，用GSTT1的shRNA慢病毒感染缓慢生长物导致mRNA水平降低70％。(B)活细胞计数。与对照相比，在敲除物中观察到细胞数量增加80％。(C)EdU标记测定。在将细胞与10μM EdU孵育18小时并与硫酸铜反应和647-叠氮化物反应之后通过流式细胞术的分析。(D)在xCELLigence系统上的实时增殖测量。敲除物具有更短的倍增时间。
图9
通过CFU-F测定的克隆发生潜能评估。将以10cm形式铺板的150个细胞在培养物中维持2周，固定并用Geimsa染色。(A)经Geimsa染色的板。与对照相比，敲除物具有更大、更高数量的集落。(B)CFU-F频率的定量。用敲除物检测到更高的CFU-F频率。(C)集落尺寸的测量。敲除物的集落尺寸增大。
图10
(A)GSTT1过表达分析。在快速生长物(无效)中转染表达载体发现在转染后3天GSTT1水平提高了对照的约50 000倍。(B)活细胞计数。与对照相比在过表达系统中细胞数量增加40％。(C)EdU标记测定。在标记之后进行流式细胞术分析显示具有过表达的分裂细胞的数量下降。(D) xCELLigence系统实验。在过表达下生长速率提高。
图11
从供体A至F分离的BMMNC的表征。(A)从供体分离的BMMC的显微术。(B)显示CFU-F效率和集落尺寸的条形图。(C)左图：显示“小”细胞的比例的条形图。右图：散点图。(D)显示传代期间的细胞数量的图表和条形图。(E、F)显示传代期间的端粒长度(E)和R2值[相关系数] (F)的图表和条形图
图12
显示hMSC的表面表型谱的散点图。检测hMSC上一组24种CD标志物的表达。来自所有供体的细胞均满足由ICST设定的最低标准：证明 CD103、CD73和CD90表达>95％并且造血标志物的表达<2％。点状参照线对应于2％。细胞显示在生长因子受体和另外hMSC相关标志物(例如 CD146、STRO-1和SSEA-4)的表达方面具有可变性。
图13
显示由来自供体A至F的hMSC产生的细胞因子和生长因子的条形图。
图14
显示由来自供体A至F的hMSC的细胞因子产生的条形图。
图15
MSC抑制T细胞增殖的能力的分析。(A)显示hMSC在抗体刺激下对T细胞增殖的剂量依赖性抑制的条形图。(B)概括结果的表格。*P<0.05。
图16
快速生长的hMSC和缓慢生长的hMSC的基因表达。(A)显示快速生长的hMSC和缓慢生长的hMSC的TWIST-1和DERMO-1表达的条形图。 (B)差异表达基因的数据。(C)显示从供体A至F分离的快速生长的hMSC 和缓慢生长的hMSC的RUNX2、ALP、BSP-II、SOX9、COL2、CEBPα和PPARγ表达的图。*P<0.05。
图17
从供体A至F分离的快速生长的hMSC和缓慢生长的hMSC的多谱系分化能力。(A)显示从供体A至F分离的快速生长的hMSC和缓慢生长的hMSC的RUNX2、BSP-II、ALP、COL2A1、SOX9CEBPα和PPARγ表达的图。(B)显示从供体A至F分离的细胞的冯库萨、茜素红(Alizarinred)、阿尔新蓝(Alician blue)和油红O染色的图像。(C)显示(B)中染色的定量的图。*P<0.05，**P<0.01。
图18
由从供体A至F分离的hMSC在小鼠体内形成异位骨(A)。(B)由从供体A至F分离的hMSC形成的骨的图像、x-射线和3DμCT图像。显示由从供体A至F分离的hMSC形成的骨体积的(C)条形图和(D)盒形图；*P＝0.002、ANOVA(试验后，Fisher LSD)。(E)显示由快速hMSC 和缓慢生长的hMSC形成的骨体积的条形图；*P＝<0.001(t-检验)。
图19
(A)由从供体A至F分离的快速生长的hMSC和缓慢生长的hMSC 的体内植入物收获的切片的免疫组织化学分析。(B)组织学分析。在从最低级(左)到最高级(右)骨形成范围的代表性图像。对于每个供体而言，前三幅图＝H&E染色，后三幅图＝Rallis三色染色。较浅的染色＝纤维组织，较深的染色＝骨组织。
图20
显示当铺板来自供体A至F的骨髓单核细胞时形成的hMSC集落的照片。
图21
CFDA-SE测定的代表性示意图。来自代表性快速生长供体(供体A) 或代表性缓慢生长供体(供体F)的T细胞和hMSC以不同的T细胞:MSC 比例共培养。可由CFSE读数(通过FITC通道读取)推导T细胞增殖的百分比，其中峰值显示连续的细胞分裂。散点图(SSC相对于FITC)表示 FITC阳性细胞的百分比。通过96孔板的单个孔的T细胞显微图来可视化增殖T细胞集落的尺寸差异。阳性对照(无hMSC)和阴性对照(无抗体) 也包括在内。
图22
显示诱导培养物(上面的孔)和对照培养物(底部的孔)的染色强度之间的差异的6孔板扫描图像，所述培养物通过冯库萨染色法并用茜素红染色以检测骨生成期间的矿化，以及用油红O染色以检测脂肪生成期间的脂质形成。显示软骨发生期间的糖胺聚糖形成差异的经阿尔新蓝染色的细胞团的切片。
图23
显示GSTT1和导致无效基因的缺失的基因组定位的示意图(由Teixeira等,(2013)Tuberculosis-Current Issues in Diagnosis and Management；第6章:TuberculosisPharmacogenetics:State of the Art复制)。GSTT1的无效等位基因由涵盖22号染色体上的整个基因的50kbp缺失产生。无效基因型常见(20％至58％)于人群中。
图24
用于检测缺失型和野生型GSTT1等位基因的测定的示意图。在GSTT1 存在下，GSTT1_缺失引物组将不扩增产物，因为正向和反向引物之间的距离太长而不能扩增，并且只有GSTT1_基因引物组生成产物。通过 GSTT1_缺失的扩增仅发生于该基因不存在下。
实施例
实施例1-GSTT1是用于骨再生的功能性间充质干细胞的预后生物标志物。
编码谷胱甘肽-S-转移酶同工型T1的基因(GSTT1)在人群中通常缺失。本发明人已发现GST T1基因型显著影响从患者获得的BM-MSC的增殖和骨形成潜能。特别地，相对于保留GSTT1的功能性等位基因的 BM-MSC，GSTT1的无效等位基因赋予BM-MSC更大的体外增殖和提高的骨形成活性。
这一发现是可在临床上应用的，因为其提供了基于供体的基因型来预筛选和选择供体的方式由此提高用BM-MSC移植进行骨修复的效力。
1.1快速和缓慢生长物之间在增殖速率方面的变化
已根据增殖速率将来自数个供体的骨髓源间充质干细胞(BM-MSC) 表征为“快速生长物”或“缓慢生长物”。
通过微阵列进行全基因组表达分析以发现两组之间的转录物组水平差异。目的是确定是否存在固有的分子变异，以及发现导致表型差异的遗传差异。所得数据的基因本体论显示：与缓慢生长物相比，在快速生长物中与细胞周期相关的数个生物过程上调而分化和/或发育相关过程下调，这与表型相关。
在xCELLigence系统上的增值速率评估示出了快速生长物和缓慢生长物之间的实时生长速率的变化(图3)。快速生长物的细胞倍增时间平均为 35小时，而对于缓慢生长物而言细胞倍增时间超过两倍为75小时。这证实了通过其他生长测定观察到的两组之间的增殖差异(Samsonraj等,手稿准备中)。
1.2缓慢生长物表达GSTT1而最快速生长物缺乏GSTT1
表征供体来源系的增殖和克隆发生潜能发现来自供体A、C和E的 BM-MSC是快速生长物，而来自供体B、D、F以及10R和11R的那些 BM-MSC为缓慢生长物。BM-MSC系的微阵列分析显示GSTT1为两组之间表达差异最大的基因，其中与快速生长物相比，缓慢生长物高度表达该基因(图4A)。
对GSTT1进行基因分型揭示三种快速生长物中有两种(A和C)具有该基因的纯合性缺失，而缓慢生长物是阳性的，为杂合子(B、D和F)或纯合子阳性物(10R和11R)(图4B)。通过qRT-PCR的RNA分析和通过 western印迹的蛋白质表达分析分别显示A和C系缺少GSTT1表达，而其他系具有表达，这与基因分型结果一致(图4C和4D)。纯合子阳性物的该基因的表达还高于杂合子，这与用等位基因的拷贝数观察到的三模态效应一致。
1.3快速生长物和缓慢生长物之间无DNA损伤差异
DNA修复机理的失常通常与由错误细胞周期检查点引起的增殖加速相关。这可导致DNA损伤累积，其可通过检测DNA损伤的测定例如彗星试验(还称为单细胞电泳测定)来进行研究。使用该方法对快速生长物和缓慢生长物进行研究以检测其DNA损伤程度从而确保增殖差异不是由 DNA损伤监控机理的功能障碍引起。对两组而言，彗星尾大部分未受损伤，并且彗星尾(如果存在的话)非常微小(图5A)。对彗星的定量还显示对于两组而言DNA损伤的水平几乎可忽略(图5B)，确定DNA的正常完整状态。对于快速生长物而言，DNA修复/损伤的细胞周期控制似乎受控制。
1.4快速生长物和缓慢生长物的类似氧化应激响应
GST超家族的酶由于其通过谷胱甘肽结合除去活性氧(ROS)而在氧化应激响应中发挥重要作用。关于GSTT1丢失对氧化应激响应的影响尚未获得具有说服力的数据。为了评估GSTT1基因型是否影响氧化应激响应，将快速生长物和缓慢生长物用过氧化氢进行处理，接着用在氧化嘌呤处裂解的hOGG1(DNA糖基化酶)进行处理，之后通过彗星试验进行分析。对于两组，与未经处理的对照相比，经过氧化氢和酶处理的样品具有显著更高的氧化DNA损伤水平(图6)。此外，DNA损伤的程度在两组之间相当，表示尽管基因型不同但是在应激响应方面并无差异。因此，GSTT1 的丢失不影响氧化因子的去除，表明其他GST酶的存在足以处理应激。
1.5GSTT1表达随着传代而提高
随着传代延长通常调节与细胞周期相关基因，被认为模拟老化的效应。已知，GSTT1随着老化而增加，但是其发生的原因尚不可知。将MSC 以最佳状态维持在培养物中直至第8代，在此之后其增殖减慢并且其表现出衰老迹象。为了研究传代对GSTT1的作用，将缓慢生长物维持在培养物中，并且在70％汇合时传代。在某些代时，收获细胞以通过qRT-PCR和 western印迹进行表达分析。两种方法发现GSTT1的表达水平随着传代而提高(图7)，表明其在细胞周期调控中的作用。在p5至p8观察到类似的表达，但是在p10之后表达持续地提高。截止p15，mRNA水平为早期表达的2.5倍高。
1.6GSTT1敲除提高增殖和克隆发生潜能
为了评估是否是GSTT1基因型导致在快速生长物(GSTT1无效)下观察到的相对于缓慢生长物(GSTT1阳性)的增强增殖，进行GSTT1稳定敲除并对增殖潜能进行研究。GSTT1表达被抑制高达非沉默对照的GSTT1 表达的0.30倍(SD±0.14)。
对于两种处理，将以相同密度接种的细胞用锥虫蓝染色并在接种后5 天定量。对于敲除物而言，活细胞计数显著更高：相对于非沉默物，高约 80％(SD±28.28％)(图8B)。如通过掺入5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU) 所测量的，在24小时期间内分裂细胞的百分比也更高(图8C)。通过 xCELLigence系统实时监测增殖还确定敲除物的增殖加快。敲除物的增殖速率为约34小时，其与非沉默物的43小时的倍增时间相差接近10小时 (图8D)。总体而言，增殖测定显示在GSTT1降低时生长速率提高。如通过多种技术所评估的，用包装有shRNA的慢病毒感染GSTT1无效 BM-MSC系不影响其增殖(数据未示出)，表明shRNA对GSTT1的特异性。
还测量了克隆发生潜能以确定敲除GSTT1表达是否影响BM-MSC的自我更新。MSC的克隆发生潜能通过集落形成单元成纤维细胞(CFU-F) 来限定。将敲除物和非沉默对照以低密度铺板并维持2周，之后将其固定并通过Giemsa复染。目测检查显示：与对照相比，敲除物形成更大数量的集落，所述集落还比对照大(图9A)。对结果的定量发现CFU-F频率平均增加约7％(图9B)并且集落尺寸增大约1mm(图9C)。数据显示，在较低的GSTT1表达下克隆发生潜能提高，表明其对BM-MSC的自我更新特性的影响。
1.7GSTT1的过表达降低增殖
GSTT1表达显示与BM-MSC的增殖成反相关。为了研究该基因的过表达是否将导致与敲除相对的效应，将该基因在GSTT1无效的快速生长物中瞬时过表达。在转染的3天内，与经空载体转染的细胞相比，表达水平接近50 000倍(图10A)。在转染后1周至2周进行增殖评估。
在以一定密度接种后第5天使用锥虫蓝进行活细胞计数，显示相对于经空载体转染的细胞，过表达转基因细胞群的细胞百分比降低至60％(SD ±3.79)(图10B)。在24小时的时间内对分裂细胞进行EdU标记还发现有丝分裂细胞的比例降低了约8％(图10C)。生长速率的实时测量结果与其他增殖测定一致。过表达细胞系具有63小时的更长时间，相比之下对照为53小时。总而言之，GSTT1的过表达减慢细胞的生长。数据证实GSTT1 以与增殖成反相关的方式参与细胞增殖。
1.8结论
有关缓慢生长BM-MSC和快速生长BM-MSC的微阵列数据鉴定 GSTT1在两组之间表达差异最大。缓慢生长物表达GSTT1，而快速生长物具有几乎可忽略的表达。对GSTT1的基因分型确定缓慢生长物具有 GSTT1的功能性等位基因而快速生长物是GSTT1无效的。
在我们的异位动物研究中，快速生长物(GSTT1无效)生成更多的骨质。因此，我们表明，GSTT1基因型预测从患者分离的BM-MSC的骨形成。
GSTT1基因型影响BM-MSC增殖和分化的发现与先前表明氧化应激可能通过p38信号传导途径来诱导GSTT1表达提高的研究一致，表明其参与细胞周期控制。表达研究证实GSTT1与增殖相关，并且还表明GSTT1 的丢失不影响氧化应激响应，这对细胞的正常生理学具有重要意义。
实施例2-体外hMSC表现与体内效力的相关性
2.1引言
本发明人建立了一组用于选择具有高效力的hMSC的基准。确定体外分化潜能自身不是干细胞效力的可靠指示，并且试图重新评估最低标准以更好地定义hMSC且使它们直接基准于体内效力。他们发现，除ISCT (2006)限定的标志物之外，Stro-1、CD146、CD140b也与体内形成骨的能力最佳相关。还发现表达这些额外标志物的细胞还表现出更快的群体倍增时间、较小的细胞表型以及相对富含FGF2、VEGF165和PDGF-BB的分泌组。由此，本发明人鉴定了构成干细胞特征的组合，所述特征高度预测成功的体内结果。
2.2人骨髓源间充质干细胞的分离和培养
如先前所述(Rider等,2008)，人MSC(Lonza,Walkersville,MD)按照如下方法由骨髓单核细胞(BMMNC)(表1)分离：将单核细胞级分铺板在由补充有10％胎牛血清(FCS；Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml 青霉素和50U/ml链霉素(Sigma-Aldrich)的包括Dulbecco改良的Eagles 培养基(DMEM-低葡萄糖，1000mg/l)的维持培养基中。除非另外声明，否则所述实验均使用第4代的细胞。将来自单独供体的细胞表征并自始至终作为单独hMSC群处理。对于CFU-F测定，将BMMNC以0.5×106至 3.0×106细胞/T75瓶铺板，允许粘附并形成集落，并在14天后用0.5％结晶紫(Sigma-Aldrich,USA)染色。然后，仅当可见集落的数量大于或等于 50个细胞时并且不与其他集落接触时，才对其进行计数。
表1
供体信息
Figure BDA0001231526180000531
Figure BDA0001231526180000541
2.3在集落形成、细胞尺寸、生长和端粒长度方面的供体变化性
2.3.1细胞尺寸分析
将hMSC的单细胞悬液用Annexin V染色，洗涤并重悬于MACS缓冲液(2mM EDTA,PBS中的0.5％BSA,pH 7.2)中，之后用FACSArrayTM Bioanalyzer进行分析。在将Annexin V+细胞门控出之后，向活群体施加象限门(quadrant gate)并评估非常低的FSC/SSC事件的级分以获得小型细胞的相对百分比。
所有供体BMMNC均快速地粘附至组织培养塑料并且产生容易在培养物中扩展的集落(图11A)。供体之间的比较揭示CFU-F效率和集落尺寸方面存在显著差异。与供体B、D和F(3.2±1.1)相比，供体A、C和 E表现出相对更高的集落形成效率(7.4±1.7)(图11B)。在较早的传代数时未观察到形态的差异(图11A)，但是在稍后的传代时，来自具有高 CFU-F效率的供体的hMSC显示出较小的、紧凑的纺锤形形态，而来自具有低CFU-F效率的供体的hMSC显得较大且较长(数据未示出)。因此，根据塑料粘附性和集落形成，所有的供体均符合鉴定为间充质干细胞的 ISCT标准。
对细胞尺寸进行分析。除大量的纺锤形和大扁平细胞之外，异质群还包含小的圆形细胞，其可鉴定为快速地自我更新(RS)(Colter等,2001 Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 98:7841-7845；Sekiya等,2002Stem Cells 20:530-541；Smith等, 2004Stem Cells 22:823-831)，通过流式细胞术可表征为低前向光散射 (FSClo)和低侧向光散射(SSClo)。具有较高集落形成能力的供体A、C、 E平均由74.4％的较小型细胞组成(在象限1中鉴定为FSClo/SSClo，图 11C)，而具有较低集落形成能力的供体B、D、F由仅66.4％小细胞的组成。因此，CFU-F效率和存在的较小细胞的比例之间成正相关(图11B、11C)。
2.3.2累积生长和端粒长度分析
为了比较供体间的hMSC生长，以5,000细胞/cm2接种细胞并在维持条件下进行培养。在70％至80％汇合时，通过0.125％胰蛋白酶/维尔烯酶促除去细胞并使用Guava
Figure BDA0001231526180000551
测定用Guava EasyCyteTM Plus System/CytoSoftTM软件(MilliporeTM)计数活细胞。将细胞以相同的密度重铺板并渐进地传代培养以评估历经13次至15次传代或者直至衰老的累积细胞数和群体倍增。分离不同代数的基因组DNA并进行端粒长度分析。使用人胚胎干细胞(hES3,ES International,Singapore)作为参照，相对于参照细胞系确定hMSC的端粒长度，并且以相对端粒长度(RTL)的单位表示，如前所述(Samsonraj等,2013Gene)。hMSC样品DNA(12ng/ 反应)和参照DNA(横跨不同稀释度)作为模板用于使用特定端粒(Tel)和36B4(单拷贝基因)引物的基于SYBR Green的实时PCR装置中。
由于自我更新能力是一种限定性性状，因此生长是MSC质量的关键量度。已知，MSC在长期增殖下经历表型变化，最终丧失增殖能力。监测培养物中的细胞生长，持续延长的时间(8周至10周)。在数次传代期间测定的累积细胞数和群体倍增程度揭示在增殖潜能方面具有显著差异。供体C表现出最大生长，供体F表现出最低生长(图11D)。平均地，与(生长缓慢)供体B、D和F相比，来自(生长快速)供体A、C和E的细胞实现33％以上的累积细胞数(P<0.05)。这些供体还表现出更大的集落形成效率(图11B)和更高的较小细胞百分比(图11C)，表示细胞生长、集落形成和尺寸之间的相关性。总而言之，这些结果允许我们将供体A、C和E分组为快速生长的hMSC，并将供体B、D和F分组为缓慢生长的hMSC。对增殖速率的实时评估证明快速生长细胞具有比缓慢生长细胞(约75小时)更短的群体倍增时间(约35小时)，因此确定如在长期扩增中所观察到的两组之间具有生长差异(图20)。
由于端粒与细胞分裂紧密相关，因此对这些细胞的端粒状态进行检测。从初始接种(P1)到衰老(P13至P15)在7个不同代数的分析显示，随着细胞发生分裂相对长度逐渐减小。如曲线的负斜率指出的，端粒缩短速率以线性方式发生(图11E)，但是速率不同，如直线梯度和R2值(相关系数)(图11F)。供体A、C和E的回归图显示比供体B、D和F具有显著更小的回归(R2)值，表明快速生长的hMSC以低于缓慢生长的hMSC 的速率缩短其端粒(图11F)。另外，缓慢生长的hMSC在传代13次后达到衰老，而快速生长的hMSC发生细胞分离直至15代。
鉴于供体的年龄(20Y至30Y)在较窄的界限内，综合考虑我们的结果证实细胞产生更多集落的供体具有较高比例的小型细胞以及提高的生长速率和相对更长的端粒。
2.4通过流式细胞术的免疫表型表征
进行流式细胞术以比较hMSC的表面免疫表型谱。将单细胞悬液用藻红蛋白(PE)-或异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的抗人CD105、CD73、 CD90、CD45、CD34、CD49a、CD29、EGF-R、IGF-IRα(CD221)、NGF-R (CD271)、PDGF-Rα和β(CD140a和CD140b)、CD11b、HLA-DR、CD19、CD14、CD106、CD146、SSEA-4、STRO-1抗体或同种型匹配对照IgG1、 IgG1κ、IgG2aκ、IgG2bκ、IgM(μ)和IgG3染色并在BD FACSArrayTM Bioanalyzer和FlowJo软件上进行分析。除IgM(μ)(Caltag实验室)和 STRO-1(由澳大利亚阿德莱德大学医学和兽医学研究所的StanGronthos 教授慷慨提供)之外，所有的抗体均购买自BD Biosciences。
2.4.1hMSC的免疫表型谱
下一步是验证CD标志物的存在。对一组27种标志物进行分析，所述标志物包括ISCT描述为对MSC具有限定性的那些(Dominici等,2006 Cytotherapy 8:315-317)。来自所有供体的经培养增殖的hMSC一致地且强烈地对CD105、CD73和CD90呈阳性(大于95％)，而对造血标志物CD45、 CD34、CD11b、CD14、CD38、CD19、CD31和HLA-DR呈阴性(图12)。在最近已提出用于鉴定MSC的标志物的表达中观察到供体差异。如谱中的数据分布证明的，例如EGFR、IGFR、PDGFRα/β的生长因子受体具有可变的表达。其他最近描述的标志物(例如细胞粘附分子CD106、CD146、 CD166)也差异表达，但是与生长的相关性很小。在缓慢生长的hMSC中，与成骨潜能相关的PDGFRα水平(Tokunaga等,JBMR 2008)较高。值得注意的是，快速生长的hMSC具有显著更高的STRO-1、SSEA-4、CD146 和PDGFRβ表达，P<0.05,t-检验)。由我们的图谱可以看出，ISCT标准不够充分，并且MSC鉴定应当包括检测STRO-1、SSEA-4、CD146和PDGFRβ的水平。
2.5细胞因子的定量多重检测
在4天后收集由以3,000细胞/cm2接种在维持培养基中的细胞条件化的培养基。为了释放基质结合蛋白，将细胞层用20mM HEPES(pH 7.4) 中的2M NaCl处理5秒至10秒。使用Millipore
Figure BDA0001231526180000571
MAP-人细胞因子/趋化因子试剂盒(目录号MPXHCYTO-60K)根据生产商的说明单独分析条件化培养基和盐洗液以同时定量十四种不同的生长因子。结果以经相对于细胞数量归一化的以pg/ml计的总生长因子的浓度来表示，其包括分泌到培养基中的因子和基质结合的因子。
2.5.1hMSC的细胞因子分泌谱
测定由hMSC产生的细胞因子和生长因子的水平作为可能的体内效力的指示。对大部分生长因子观察到显著的供体变化性。成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)是分泌最高的因子(500pg/ml至6000pg/ml)(图13)，其次是已知在细胞迁移和血管发生二者中起重要作用的MCP-1。PDGF-BB (成骨细胞分化程序中的细胞组分和贡献因子之间的中心连接因子(Caplan和Correa,2011))的水平显著高于PDGF-AA的水平。总而言之，当基于生长来对因子进行分组时，注意到在快速生长的hMSC中，FGF-2、 VEGF、SDF-1α、Fractalkine、PDGF-BB和MIP-1α的量显著更高(图14)。注意到，在快速生长的细胞中，例如以下参与伤口愈合的关键因子上调：促有丝分裂因子FGF-2、促血管发生分子VEGF、趋化因子SDF-1α和 Fractalkine、促炎趋化因子MIP-1α和PDGF-BB(高效的血管发生性、促有丝分裂且趋化性的因子)。我们的结果突出了测定这些生长因子的水平的重要性，这些生长因子的水平可对预测hMSC的体内效力具有重要意义并且因此可充当有利于用于可能临床应用的MSC筛选的关键参数。
2.6活化的T细胞的免疫抑制
使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)从成人全血获得外周血单核细胞(PBMC)。使用EasySep阴性选择人CD4+T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies,Canada)从PBMC分离CD4+T细胞并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；
Figure BDA0001231526180000581
CFDA SE细胞示踪试剂盒)标记。通过抗 CD3和抗CD28MACSiBeads(Miltenyi Biotec,Germany)以每个T细胞4 个珠子的比例刺激CD4+CFSE+细胞(0.5x 105至1x 105)，以不同T细胞:MSC比向T细胞添加hMSC并在37℃下孵育。在7天后通过流式细胞术测量CD4+CFSE+细胞的增殖并确定hMSC对T细胞增殖的抑制百分比。
2.6.1hMSC的免疫抑制能力
为了测试在混合的淋巴细胞培养中或者在促有丝分裂刺激下MSC分泌能够通过抑制T细胞增殖来阻抑进行的免疫应答的免疫调节因子的能力，对来自快速生长库(供体A)和缓慢生长库(供体F)的一个代表性供体的细胞进行检测(图21；表2)。通过流式细胞术分析细胞分裂显示， hMSC以剂量依赖性方式抑制抗体刺激下的T细胞增殖(图15)。在T细胞:MSC比为32:1时，未观察到抑制，并且在此条件下增殖细胞的百分比等于“无hMSC”对照组。在1T细胞:2hMSC比时，抑制最高，其中增殖百分比与无抗体刺激下的T细胞生长相当。快速生长的hMSC持续地表现出显著更大的T细胞抑制(*P<0.05)。值得注意的是，快速生长的hMSC 持续地表现出显著更高的T细胞抑制(*P<0.05)。该免疫抑制的功能性测定强调了快速生长的细胞在对治疗起效方面的优势。
表2
T细胞增殖的剂量依赖性抑制。将不同比例的T细胞和hMSC共培养。 $:1(T细胞:hMSC)的比导致T细胞增殖的50％抑制。
Figure BDA0001231526180000591
2.7基因表达研究
2.7.1定量实时聚合酶链反应(PCR)：使用Nucleospin RNA II试剂盒 (MachereyNagel,Bethlehem,PA)根据生产商的说明分离总RNA并通过NanoDropTM 1000(ThermoFisher Scientific Inc.)定量。在转化为cDNA 之后(Superscript VILO,InvitrogenCorporation,CA)，使用
Figure BDA0001231526180000592
基因表达测定在Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统上评估中胚层基因 TWIST-1和DERMO-1；成骨标志物RUNX2、ALP和BSP-II；脂肪形成标志物PPARγ和CEBPα以及软骨形成基因COL2A1和SOX9的表达(表 3)。将CT值相对于β-肌动蛋白归一化并以相对表达单位(REU)绘制结果。
表3
Figure BDA0001231526180000602
基因表达实时PCR测定
Figure BDA0001231526180000601
2.7.2微阵列和基因本体论分析：使用TotalPrep RNA扩增试剂盒根据生产商的说明(Ambion Inc.,USA)来扩增在P5提取的RNA以用于微阵列。将得到的经纯化的生物素标记的互补RNA(cRNA)归一化并利用其直接杂交测定设施使其杂交到HumanHT-12第4版珠芯片(Illumina Inc., USA)上。然后，芯片被清洗，封闭并被Cy3-链霉抗生物素蛋白结合于杂交的cRNA上。利用使用Illumina珠扫描软件的Illumina珠阵列阅读器来对芯片成像并通过GenomeStudio(Illumina Inc.,USA)将成像数据转换成表达谱。减去背景并将数据提交至GeneSpring(Agilent,USA)。求三次重复的平均值并进行逐对分析，之后进行Student t-检验未配对统计学分析， p<0.05并且倍数变化≥1.5。分析具有两个技术重复样品的两种供体样品 (代表每组)。使用Entrez基因ID将生成的基因列表上传到DAVID上以通过GOTERM_BP_FAT以中等分类严谨性来进行功能注释聚类。仅考虑p ≤0.05的生物过程。
2.7.3基因表达分析
快速生长的细胞和缓慢生长的细胞之间的表型差异可归因于基因表达的系统性差异。为了鉴定转录物组水平的此类持续性差异，进行qPCR 以检测中胚层相关标志物Twist-1和Dermo-1的水平。快速生长的hMSC 证明这些标志物的转录物水平更高。在鉴定到此类差异之后，通过微阵列对两组进行全局基因表达分析。倍数变化截止值为1.5和p值<0.05划定出在两组之间差别表达的一小组转录物，其中有74种在快速生长物中显著富集，有149种在缓慢生长物中显著富集(图16B)。基因集的有限大小表明，两组大体上类似并且性状差异可归因于这些基因。
通过DAVID功能注释聚类对生成的基因列表进行基因本体论(GO) 分析以鉴定快速组和缓慢组中富集的生物过程。在快速组中调节细胞粘附、细胞骨架和细胞器的基因显著上调(p值≤0.05)(表4)，其中后者指示更快的更新速率。对细胞外基质和邻近细胞的粘附与细胞周期进程(2,3) 相关。缓慢生长细胞中富集的基因倾向于是细胞形态发生的并且倾向于伴随着间充质衍生器官的发育(表4)。
表4
基因本体论(GO)分析。使用DAVID功能注释术语(子程序： GOTERM_BP_FAT)对快速生长的hMSC(表4A)和缓慢生长的hMSC
(表4B)中富集的基因集进行GO分析。子代GO术语由亲代术语来表示。
表4A快速生长物中富集的生物过程
GO ID GO说明 p-值 基因
GO:0051493 调节细胞骨架组织 0.008 BRCA1,SKA3,PDGFA,SCIN
GO:0033043 调节细胞器组织 0.028 BRCA1,SKA3,PDGFA,SCIN
GO:0007155 细胞粘附 0.051 TEK,CDH4,OPCML,OMD,PCDH19,THRA
表4B缓慢生长物中富集的生物过程
Figure BDA0001231526180000621
为了研究参与MSC分化的基因的上调/下调，通过qPCR在非诱导条件下测定标志物的转录物水平。单独供体证明在这些基因的基线表达方面存在变化性，然而在两组之间未观察到三谱系分化标志物的显著差异。
2.8体外多谱系分化
如先前所述来评价hMSC对成骨、脂肪形成和软骨形成谱系的分化潜能(Rider等,2008)。使用Quantity
Figure BDA0001231526180000631
软件(Bio-Rad Laboratories)来分析经染色的板/孔的平均强度，记录并表示为相对强度单位：即，处理孔与其各自的对照孔相比的强度增加倍数。在这些测量结果中，染色越深指示强度值越高。
2.8.1多谱系分化能力
为了评估hMSC的多潜能性，通过用确定的培养基组分和培养条件培养细胞来诱导细胞向下分化成成骨谱系、脂肪形成谱系和软骨形成谱系 (图22)。所有的供体hMSC均满足称为“间充质干细胞”的最低标准，因为其全部能够自我更新和分化，虽然能力不同。如由TWIST和DERMO 水平可见具有最高比例的潜在前体的快速生长细胞展现出与RUNX2、ALP 和CEBPα的表达相关的变化性。发现高表达Twist-1和Dermo-1的hMSC 展现出最高的增殖潜能，因此较高的TWIST表达与成骨分化能力的降低和自我更新能力的提高二者均相关(图17A)。研究平均值之间的比较，观察到差异，但未注意到其他显著影响。当基质的沉积是更具功能性的读数时，对细胞层的染色进行分析。观察到快速生长的细胞和缓慢生长的细胞之间在诱导条件下在钙沉积方面具有显著差异(图17B、17C)。能够注意到，在缓慢生长的细胞中ALP mRNA水平相应地更高。这表明，这些细胞可能已经引发向下分化成成骨谱系。当然，对于骨谱系而言，在快速生长的供体中基因表达水平紧密地聚簇。参与脂肪形成的基因在脂肪形成培养中表现出PPARγ和CEBPα的上调。两hMSC组之间在转录物水平方面未观察到显著差异，但是在经归一化的染色强度方面观察到显著差异 (P<0.05)(图17C)。一般来说，快速生长的供体在成骨和软骨形成分化下的变化性较低。在软骨形成条件下，在两组之间未观察到差异。
考虑到所述差异可能不是生物学上相关的，能够注意到所有供体均证明具有三谱系分化潜能。当我们的研究集中于鉴定临床相关性时，我们关于分化的结果提供了一组用于MSC鉴定的标准的过度评估。此时，这不能认为是证明快速生长细胞是更佳的分化细胞的充分证据，尽管其效率略有不同。尽管如此，所有的单独供体均证明具有三谱系分化潜能并且因此满足MSC鉴定的ISCT标准。
2.9异位骨形成测定
如先前所述(Zannentino等,2010)，使离体第4代细胞扩增并以约3× 106至5x 106接种到
Figure BDA0001231526180000641
Matrix支架(Medtronic,Inc.USA)上，之后将其移植到8周龄免疫缺陷小鼠(NIH-bg-nu-xid,Harlan Sprague-Dawley)的皮下袋中。根据伦理允许的小动物方案(IACUC: #110651)的规定来进行外科手术。在移植后立即以及在8周时使用 ShimadzuMobileArt MUX-101Standard(Shimadzu Corporation,Japan)和
Figure BDA0001231526180000642
MEDICAL-CR35VET图像板扫描仪来获取x射线。在第4周和第8周时使用SkyScan CT分析仪对动物进行微CT，重建数据集并通过 CTAn(SkyScan)和Mimics软件进行分析以通过施加合适的阈值设定来计算骨体积。在8周后从动物回收植入物，脱钙化，包埋在石蜡中并用苏木精/伊红和Rallis三色染色。如下进行免疫组织化学：通过将组织切片与合适浓度的针对小鼠骨钙蛋白(M188,1:100,Takara Bio Inc.)、人骨钙蛋 (ab76690,1:50,Abcam)、小鼠胶原I(NBP1-77458,1:200,Novus Biologicals)的一抗或者相同浓度的小鼠IgG(MG100,Caltag Lab,USA；作为阴性对照)一起在封闭缓冲液中在4℃下孵育过夜。将切片洗涤并与大鼠吸收的经生物素标记抗小鼠IgG(Vector Lab Inc,USA)一起孵育1小时，之后添加抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)，持续1小时。使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB；DAKO,USA)检测过氧化物酶活性。将切片洗涤，固定并在Zeiss AxioImager(Z1)直立式显微镜下检测。
2.9hMSC的体内异位骨形成效力
在hMSC的体内表征之后进行功能性体内测定。其中，MSC效力的最重要测定是移植在异位部位之后形成骨的能力。来自所有供体的MSC均证明具有形成骨的能力，但是程度方面具有显著变化性。对植入物的汇总分析显示：如通过μCT定量的，与缓慢生长相比，快速生长的hMSC表现出两倍或三倍大的形成移位骨的能力(图18A至18E)。经H&E和Rallis 三色染色的植入物切片表现出如颜色梯度条所指示的形态、骨形成程度和纤维组织程度(图19B)。将所收获植入物的切片用针对骨钙蛋白的物种特异性抗体染色以确定所形成的骨是否是人或小鼠来源的。这使得能够确定移植的hMSC是否已分化成人成骨细胞以在异位部位形成骨，或者其是否已支持宿主组织形成骨。免疫组织化学分析揭示，存在大于小鼠骨钙蛋白的水平的人骨钙蛋白(图19A)。如通过对人骨钙蛋白染色所指示的，观察到在支架孔中的沉积骨的成骨细胞样细胞是人来源的。与供体B、D和F 相比，供体A、C和E触发更大量的骨钙蛋白沉积，这与μCT分析联系起来。无hMSC的支架也揭示一定程度的骨沉积，与载体的骨传导性能一致。在所有植入物中均主要是小鼠胶原，其中快速生长的hMSC显示具有比缓慢生长细胞更高的胶原1沉积。
研究的所有hMSC群均能够展现出体内骨形成能力，尽管水平不同。将体外参数与上述体内结果联系起来，发现展现出增殖潜能提高、端粒更长和生长因子分泌水平更高的hMSC在异位部位形成骨的效力更高。
2.10结论
人骨髓源性间充质干细胞的体外和体内特性的相关性揭示：与缓慢生长细胞相比，来自具有高CFU-F效率的供体的细胞平均具有更小的尺寸，表现出生长提高并且具有更长的端粒；多潜能性的生物标志物(CD谱绘制)在具有较高比例小尺寸hMSC的供体中高度相似；营养因子FGF-2、 VEGF、PDGF-BB、SDF-1α、Fractalkine的分泌在表现出增殖潜能增强的hMSC中升高，并且在皮下异位部位的骨形成与移植在培养物中具有较高营养因子分泌水平、较高增殖潜能和相对较长端粒的hMSC成正相关。监测本研究中所述的FGF-2水平、端粒长度和生长速率的基准应能够实现选择用于治疗的有效细胞、节省时间并且涉及hMSC移植的资源。选择在上述特征方面表现出较高效率的hMSC应提高体内效力。这些发现为通过能够选择种类最佳hMSC来开发指导和增强培养物扩增MSC的生长和发育以用于组织工程应用的未来策略奠定了基础。
通过使体外发现与体内相联系，本发明人得出结论，倍增时间更快、快速自我更新细胞比例更高、端粒更长和某些关键生长因子(特别是 FGF-2、VEGF、PDGF-BB和SDF-1α)的分泌水平更大的hMSC在体内在异位部位形成新骨的效力更高。有些矛盾的是，产生更大新骨形成的快速生长的hMSC展现出最低的体外矿化能力。快速生长物和缓慢生长物中增殖相关过程和成熟相关过程的富集分别表明可支持其表型差异的生理学基础。由于BM-MSC根据标准化操纵由供体获得并增殖，在操作变化尽可能小的情况下，细胞生理学方面的差异可能归因于其潜在的转录物变化。
迄今，已证明hMSC的体外特性与其体内治疗效果之间无系统性的关系，主要是因为尚不存在普遍可接受的用于预测MSC的治疗能力的方法 (REF)。Janicki等(2011)试图提供临床上相关效力测定的关键研究证明 hMSC的倍增时间与体内骨形成充分相关；在此本发明人已将该概念在较大程度上延伸至与异位骨形成相关的其他体外参数因素，包括用于促有丝分裂和细胞因子分泌的测定。回顾地，分析产生快速生长的hMSC的供体的CFU-F效率确定，hMSC能够在7代内完成超过15个累积群体倍增，具有优越的诱导体内骨形成能力。
先前已报道，还观察到自我更新快速的细胞表表达较高的CXCR4和 CX3R1水平(Lee等,2006)，CXCR4和CX3R1分别是SDF-1α和Fractalkine 的参与血细胞生成、血管发生和免疫细胞高效运输的受体。还已知，趋化因子受体表达提高的快速自我更新祖细胞更好地移植到小鼠神经球(REF) 中。快速生长的hMSC中的Twist-1和Dermo-1表达(已知对间充质干细胞生长和发育的键的基因)更大也倾向于确证Isenmann等(2009)进行的功能性研究，Isenmann等(2009)证明此类MSC的成骨/软骨形成分化能力降低但进行脂肪形成的倾向性增强。
2.10.1使体外hMSC特征与体内效力联系起来
尚不知道为何hMSC生长是异位模型中结果的预示，在该异位模型中还必须存在骨诱导性生长因子、机械刺激和支持骨环境。可能，在移植部位产生活性的血液丰富微环境需要高合成代谢。Helledie等(2012)显示，端粒较长的hMSC当移植到裸大鼠中的临界尺寸骨缺损中时能够存活更长时间。
在体外，快速生长的hMSC和缓慢生长的hMSC之间在软骨基因的表达方面存在显著差异。缓慢生长的hMSC在成骨诱导之后表现出更佳的体外矿化，但是在体内则表现较差。这表明，群体中较大部分MSC的高增殖速率竞争超过由可能已开始变为成骨细胞的细胞部分产生的可能优势。支架孔中的骨沉积表明，沉积矿化基质的能力在空间上受到控制，并且实现这一点的最适合hMSC可能是增殖更快者而非生长缓慢的分化前细胞。根据我们团队之前的研究，标准体外成骨测定产生较差的预后，并且其他工作表明离体基质矿化特定缺乏特异性，并且显示与真实的骨形成一致性很低或者不一致(Watson,200；Rai等,2010)。
快速生长的hMSC在异质细胞群中由较高比例的小型细胞组成，具有高克隆发生性和多潜能性。这种相关性是令人感兴趣的，因为其将hMSC 表现的以下三个方面联系起来：营养因子分泌、RS细胞亚群的比例和骨形成效力。
在调节骨代谢的众多生长因子中，认为FGF-2是间充质细胞的特别有效的有丝分裂原。FGF-2由属于成骨细胞谱系的细胞产生，在骨基质中累积并充当骨细胞的自分泌/旁分泌因子(REF)。成骨细胞分化和骨形成的 FGF-2刺激部分地由调节Wnt途径来介导(Kasten等,2008；Fei等,2011)。外源施用FGF-2通过改变骨形成祖细胞表面上BMPR的表达来促进 BMP-2诱导的异位骨形成而对骨形成具有刺激作用，这是现在认为是 FGF-2在体内的主要药理学作用的效应(Nakamura等,2005)并且是为何 hMSC在产生异位骨形成方面优于分化前成骨细胞的貌似合理理由(图 15B)。VEGF属于PDGF生长因子超家族，并且是血管发生的关键调节因子，而血管发生是对所有组织愈合至关重要的过程(Zentilin等,2006；Schipani等,2009)。VEGF还充当内皮细胞(Han等,2009)和成骨细胞 (Hiltunen等,2003)以及MSC(Huang等,2010)的强促有丝分裂刺激物。本发明人还证明，hMSC分泌VEGF；如由组织学支持的，可能地快速生长细胞部分地由于其优越的刺激内皮细胞募集的能力而产生优良骨。血管发生涉及毛细血管形成内皮细胞的募集，其转而被促血管发生因子刺激诱导新血管形成细胞的进一步迁移和增殖(Abboud,1993)。由于骨愈合与血管发生密切相关，因此VEGF和MCP-1水平的提高与早前报道充分联系起来(Zisa等,2009)。
尽管在过去十年内进行了大量的工作，但是对为特性不可预测的异质细胞混合物的MSC的了解仍然相对较少。如Mendicino等2014在其最近的综述中指出的，提案人在向USFDA的监管提交物中如何定义、制备和描述MSC，存在扑朔迷离的多样性，不仅是在组织来源方面如此，而且还在体外增殖、细胞表面标志物表达和产品制备方面也如此。根据他们FDA提交物的研究，他们确定有七种细胞表面标志物常规地用于MSC类产品 IND提交物(CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14和II类HLA)，这与ISCT在其2006意见书中指出的标志物组一致(Dominici等,2006 Cytotherapy 8:315-317)。然而，显然该标志物组远远不是限定性的并且涵盖大量不具有实际“干细胞样”质量的细胞；最近已表明，培养物中需要特殊的条件(包括特异性HS含量)以维持并且甚至提高能够真正自我更新的骨髓源性粘附细胞的分数(Helledie等,2012)。因此，哪个具体标志物组真正地描述其异质细胞种类，仍然是一个未决问题。
MSC生物活性还可依赖于微环境中的线索、临床指征和施用途径。 MSC的最具靶向性的临床指征是心血管疾病、神经疾病、矫形外科疾病和代谢病，特别是糖尿病。近四分之一寻求改善免疫介导的疾病，特别是移植物抗宿主病。已采用了多种施用途径，包括静脉内、直接注射(大部分是心脏)和表面施用(REF)。概念验证动物研究不定地试图监测细胞表现的例如以下方面：表型、增殖能力、分布和施用后存活以及甚至其组合，尽管缺乏精确评估细胞如何发挥其生物活性的有说服力方式。
明显可以看出，需要对在此所述的种类进行更多的工作以更好地了解亚群的表型稳定性和对MSC基治疗的影响。这对于可利用的信息甚至更少的非骨髓源性MSC基治疗可能更加如此。预测治疗益处的标志物可预期产生用于在临床上翻译MSC基产品的倍增效应。
实施例3-基于GSTT1的技术的开发
3.1开发生物标记试剂盒-设计用于临床环境的GSTT1基因型测试
设计能够负担的PCR诊断试剂盒以检测2种主要的GSTT1等位基因：野生型和GSTT1缺失型等位基因。
最简单、最快速且最便宜的方式是使诊断测试适用于诊断学界中广泛使用的TaqMan RT-PCR平台。对两种等位基因设计在该TaqMan模式中工作良好的RT-PCR引物。出于商业化考虑，对试剂盒进行优化以用于从有希望的供体采集的外周血。
所述试剂盒是通用的并且能够以从来自在MSC分离期间通常弃掉的骨髓制备物的非粘附细胞提取的DNA开始。选择具有用于TaqMan平台的合适特性(例如，退火温度)的引物和探针。
使用优化的引物设计算法设计10至20个引物对组合，并测试检测 GSTT1等位基因的能力。然后，逐对测试最佳对以鉴定用于在单个反应中检测GSTT1等位基因的多重形式的合适匹配组。已设计简单的DNA基试剂盒，其允许在决定是否收获干细胞之前根据GSTT1的存在或不存在来筛选患者或有希望的供体。
可使用多种组织来检测GSTT1的存在或不存在，例如颊拭子、血液或皮肤钻孔。所述试剂盒主要用于测试从知情同意供体的颊拭子收获的细胞。基于组织可获得性，认为其他组织材料是颊拭子的替代选择。
使用标准的提取操作从样品提取基因组DNA(gDNA)。使用Buchard 等设计的用于检测GSTT1基因拷贝数的引物来探测gDNA样品(图24) －参见Buchard等,J Mol Diagn,(2007)9(5):612-617：
Figure BDA0001231526180000691
Figure BDA0001231526180000701
“GSTT1_缺失型”引物组与邻近位于两种GSTT1侧翼的同源区域的特异性序列杂交(图24)。当缺失GSTT1基因时，由于缺失使引物的杂位点在PCR扩增中变得足够接近，这些引物扩增约3Kb的产物。“GSTT1_ 基因”引物组对GSTT1序列的一个节段具有特异性，并且当存在该基因 (即，未缺失)时扩增1Kb产物。
GSTT1+/+：仅1kb条带
GSTT1+/-:1kb条带和3kb条带
GSTT1+/+：仅3kb条带
在多重PCR测定中，引物使得我们能够确定供体的基因型。因此，可鉴定患者和供体中GSTT1的拷贝数，从而使得能够预筛选对干细胞分离的生物标志物无效的个体。这可节省产生用于细胞基治疗的优质干细胞的时间和资源。应用这些选择性分离的细胞还可具有更佳的用于此类临床目的的效力。
3.2评估体外干细胞质量
根据GSTT1基因型来筛选干细胞供体并且使GSTT1基因型与干细胞表型联系起来。
a.骨髓抽吸：在知情同意下、之后并且根据标准方案使用Jamshidi 针在局部麻醉下从10个正常健康成年供体(n＝10)的髂嵴获得骨髓抽吸液(30ml)。
b.MSC的分离：将骨髓冲洗液铺层在Ficoll上并在2000rpm下离心 20分钟。将单核细胞级分在无菌下转移到组织培养板并在37℃,5％CO2 下孵育直至形成粘附细胞的集落。收集非粘附细胞群并分离DNA以使用根据3.1的生物标志物试剂盒来验证GSTT1身份。
c.MSC表征：通过以下方法来单独表征来自多个供体的分离的MSC：
(i)集落效率-通过将不同MSC制备物(50万至200万个骨髓单核细胞 /T75瓶)铺板并将其培养14天来测定CFU-F。对具有多于50个细胞的集落(不与其他集落接触)进行评分。
(ii)增殖-使用Guava PCA-96Base System通过ViaCount测定按照生产商的说明(Millipore)来确定直至第10代的类似细胞数量。
(iii)细胞表面抗原标志物表达-使用TrypLETM来提升细胞并洗涤。大约地，将1×105个细胞与抗体(CD73、CD90、CD105、STRO-1、SSEA-4、CD-19、CD34、CD45、CD14和HLA-DR)一起孵育并在BD FACS Array Bioanalyzer上进行分析。所有样品均以一式三份进行测量。
(iv)多谱系分化-在表型上评估MSC当用成骨、脂肪形成或软骨形成补充物刺激时沉积骨样基质、形成载脂肪液滴或分泌糖胺聚糖的能力。在平行培养物中，分离总RNA并将TWIST-1、DERMO-1以及其他主要成骨、脂肪形成和软骨形成生物标志物的mRNA水平相对于β-肌动蛋白归一化。
(v)端粒长度-分离染色体DNA，然后沉淀，洗涤，干燥并定量。使用 DNA(12.5ng)通过实时定量PCR(RQ-PCR)以一式三份方式扩增端粒重复序列。由标准曲线(Ct相对于log量)来评估端粒重复序列的相对表达，所述标准曲线由从人胚胎干细胞系(Invitrogen)分离的染色体DNA 制成。
3.3在异位骨形成模型中的体内干细胞质量的评估
在临床上相关小鼠的异位骨形成膜型中，使3.2中所表征MSC的骨愈合潜能与GSTT1基因型联系起来。
异位骨形成测定
表5用于异位骨形成测定的实验组
Figure BDA0001231526180000721
(i)动物物种：使用免疫缺陷8周龄雌性Beige小鼠(NIH-bg-nu-xid) 作为皮下移植物的接受者。
(ii)细胞和支架制备：将来自供体体外扩增的第4代MSC(在维持条件下)通过0.125％胰蛋白酶/维尔烯提升并重悬在维持培养基中，之后接种到
Figure BDA0001231526180000724
Matrix支架(Medtronic,Inc.USA)上。
Figure BDA0001231526180000725
Matrix支架是包含15％HA/80％β-TCP陶瓷颗粒的胶原海绵。使用手术刀在无菌条件下将支架切割成尺寸为3×3×3mm(27mm3)的方块。向经切割的支架上接种约300万至500万个成骨细胞并在37℃下孵育1小时，之后植入。将支架和细胞与用15μl小鼠凝血酶(在2％CaCl2中的100U/ml；
Figure BDA0001231526180000722
USA)和15μl小鼠纤维蛋白原(在PBS中的30mg/ml；
Figure BDA0001231526180000723
USA)产生的纤维蛋白凝块放在一起。
(iii)外科手术：根据伦理许可的小动物方案IACUC:#110651(等待更新)的规定来进行操作。在每只小鼠的背侧面上产生0.5cm的中间纵向皮肤切口，并通过钝器解剖来形成皮下袋。向每个袋中放入一块植入物，每只动物两块植入物。用手术刀闭合切口。将每种移植入物和对应的对照移植物在相同条件下植入(n＝6)。
(iv)分析方法：通过X-射线、微CT和组织学来分析新骨形成的程度。 X-射线在移植后立即在手术的当天和在8周后照射。
微CT在第4周和第8周使用SkyScan μCT-Analyser来对动物进行。使用Mimics软件来分析重建的图像以通过施加每个要素的合适阈值设置来计算总骨体积。对于组织学分析，使用轮转切片机(Leica Microsystems, Germany)从每块3mm至4mm植入物的中间和任一端切割5μm厚度的切片。将石蜡切片放置在带正电的显微镜载玻片上，干燥并用H&E和Rallis Trichrome染色，最后在Zeiss AxioImager(Z1)直立式显微镜下检查。对于免疫组织化学分析，将组织切片与合适浓度的针对小鼠骨钙蛋白、人骨钙蛋白、小鼠胶原I的一抗或相同浓度的小鼠IgG一起孵育。将切片与大鼠吸收的经生物素标记抗小鼠IgG(VectorLab Inc,USA)，与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)溶液(Immunopure ABC过氧化物酶染色试剂盒,Vector Lab.Inc)一起孵育1小时。使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB；DAKO,USA)来检测过氧化物酶活性。
表6实验计划
Figure BDA0001231526180000731
3.4用于调节GSTT1和确定对干细胞质量的作用的策略的评估
研究通过siRNA和小分子抑制剂来调节GSTT1水平对体外MSC的作用。
鉴于GST的重要性，其已成为药物发现，特别是用于癌症和炎性疾病的药物发现的活性靶标。初步数据表明，GSTT1的表达直接影响MSC的增殖速率。鉴定到GSTT1的小分子抑制剂，将MSC在移植之前用抑制剂处理，并评估是否可赋予GSTT1野生型细胞骨形成能力。
GST抑制剂从商业来源获得并且根据针对其对增殖的作用来在体外对GSTT1表达MSC进行测试。使用一系列已建立的测定，其揭示GSTT1+ 和GSTT1-/-MSC内的差异活性，包括集落形成潜能(集落形成活性)、细胞增殖(xCELLigence系统)和生长速率(EdU标记)。然后，测试选定的 GSTT1抑制剂对体内MSC细胞因子表达谱、免疫表型和多潜能性的影响。
还可靶向GSTT1的下游信号传导途径。初步数据表明，p38MAPK调控GSTT1表达(数据未示出)。因此，p38MAPK可能是MSC增殖和骨形成活性的关键调节因子。因此，可选择性地靶向该途径以提高MSC的再生潜能。使用分子和药理学工具来研究那些细胞因子受GSTT1的影响，同样地对作用机制进行研究。GSTT1在无效细胞中过表达，并且对细胞因子表达的变化进行研究。类似地，通过shRNA在野生型MSC中敲除GSTT1 表达，并研究生长、信号转导、表型和细胞因子产生的后续变化。这样的干扰研究提供了解细胞因子表达的信息，并且提供探索在GSTT1存在/不存在下的潜在信号传导途径的方式。
对样品尺寸以及分析和解释数据的方式的统计学调整
基于细胞的测定-所有实验均在三次独立重复下进行。计算平均值和标准偏差。利用方差分析(ANOVA)来评估实验组之间的显著差异水平，之后在适当时进行Tukey事后测试。所有的统计学分析均使用SPSS V 12.0 软件(SPSS,Inc.Chicago,USA)来进行。如果p≤0.05，则认为差异是显著的。
序列列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 干细胞
<130> RIC/FP7128655
<150> SG 10201403640X
<151> 2014-06-26
<160> 15
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 8146
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
actggagttt gctgactccc tctggtttcc ggtcaggtcg gtcggtcccc actatgggcc 60
tggagctgta cctggacctg ctgtcccagc cctgccgcgc tgtttacatc tttgccaaga 120
agaacgacat tcccttcgag ctgcgcatcg tggatctgat taaaggtagg tccagcctcg 180
ggtttgggga accgaaaagt caggaagggg acaggtaggc atacatagct tagggaactt 240
ctcccagcgc caccttcttc ctggggccat tgctggtctg gtttggagac cgaacagaga 300
aaggtgagcc agcagggaga tccaagagtc ggggctcccc aaaactctgc tcggtctcac 360
ggaatagacc acggggttcc cctgaggccg aataaagggg tggggatcat gaagagaagc 420
cagacaggag gacaaaaacg ggcgcagctg ggtgcagggg cacacgcctg tagtcccagc 480
aactcgagag gctggggtgg gaggatcgct tgagcccagg aattccaggc cgcagtgcac 540
tatcatggtg cccttgaata gccactgcac tcccgtcagg gcaatctagc gagaccccgt 600
cttaaaaaaa aaaaacaaaa aaaaacaaaa tgaaagcagg tgtgacctcg gcctagggaa 660
aggtgggatg agagaggtca agggtgccaa gtgtagagac tgggacagcg tcaagtccct 720
tctttatggc ccagctgctg agattctgca acagcaaaca gctcaggacg tgactttcca 780
tccctgccct ctgcactcgt ccagtctgca ttggggtccc tctttgtccc ttccttcctc 840
tgttcctcct gttttgcctc tgaccttgtc cttgtccttt tttttttgag acagagtctt 900
gcttttgctt tgttgcagtg cagtggcacg gatctcgaat cactgcaacc accacctccc 960
gggttcaagc aattctcctg cttcagcctc ctgagtagct agattacaaa tgtgtgccac 1020
tatgtctggc taattttttt gtatttttaa cagagatggg atttcacaat tttggtcagg 1080
ctgttctcga actcctgaca tcaaatgatc tgccggctta gcctcccaaa gtgctgggat 1140
tacaggcatg agccactgtg cctggcccaa ggcattttgt ttatttgttt gtttgttttt 1200
gagacggagt ctcgctctgt cgcccaggct ggagtgcagt ggcaggatca cagctcactg 1260
caacctctgc cgcccgaaac cttgtcctct gcctcttgtt cctgctgggg aggtaggttg 1320
ccccaggctg ctgatgctgg aagcagcagg gggaccctgg ggcttgatga gccctacacc 1380
ctgttttgtt tctctagcat gcctccaagg cccttgagga ctcagctggc aggcccaggc 1440
ccaggcccag tgcagggtgg ggtagtagga ggggttggaa gcagaatcca ggtatggctg 1500
gtggggcaag taaggcgact ctacttggct aagccttctg cccagggctc ccactccatg 1560
gctggccctc tgcctgaaac ttctccacat aatctcttct gcaaactgcc cactgtcctg 1620
cgcaaggact tcctctgcag agtgtggagt agaggaaagg gaatggggga caagaggacg 1680
tccaagctgg ttgtcaaatg tagtggtgca gagggaagtg tgttttccca ggagacagag 1740
gagggttttc ctggtgaagg aacagtctga agggagggtg aagagagggt agcaggctgg 1800
gcatggtggc tcacacctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaagtagg aagattactt 1860
gaggccagta gttcaagacc agcctgggca acatagtgag accccaactg taaggggaat 1920
aaaagtttgg ggcacagggg gtggtagcag gtatgctaca cacagctcca cagtgcccag 1980
ggcagggtga acaaagggac atggtggggc cagtagaagt tgcttctaag taggtagata 2040
ccagaaaaag accacttctc tgtgtttcat gaccctgcct tagaattaat ggtggaaggg 2100
acaaggtagt cagtcccctc aggtgaccta tcgtgcagct tggggtgctc tgattgtgag 2160
ttcatgaagc tggcaatagt ggaaagagga gatgggtagg gtgcatgcaa aggtccagga 2220
accacaccct gcacagtgag ctctgttgca gaggggcagc ctgtgggagg aggctgtgcc 2280
tacaggactt agcaaggggt gttgtctatt ttgtaccagc cggtggagtg gtctcctcct 2340
cctcccgcag gggcccttcc agtctttgcc aaccaggagt gcagactggt gggaagaaga 2400
actgtgaaac tggggccaga gcattgcagg gaggggcaca ggccatggcg ggctcagcgt 2460
tctcctccca ccacccacca tgctggactc ttcccaggtc agcacttaag cgatgccttt 2520
gcccaggtga accccctcaa gaaggtgcca gccttgaagg acggggactt caccttgacg 2580
gagaggtaac tgggacccta ggactgctgc caggcctgct ggaaccatcc tgttctaacc 2640
ctctatttca tagacaagga aactaaagtc ttcagaggca gagagtctct gtgccccgca 2700
tcctgcagag agtcagtact ggaccccagg cccttgcctt cctgctattc cagttcaccc 2760
tgatgattag aaaagcaaat atctacttta cttccacacc agtgctttgg ttgctggtga 2820
gtggtgagag tatccttgag acagggtagg ccagaggacg atggcagctt tgcccaccgt 2880
ggggcaggcc tctggccaag cttgtgtggc gatggctcag tggcatctgg gctgcccggt 2940
ggctccatct ctgggctgca gcttcccagg atgggtcttc cccatggaag agccaccaga 3000
tatggacgtc ttacatcaca gctggtccca agaagttgaa tcctcttcag gaaaagccaa 3060
tctttcccca gttctgcccc ttttgtcacc agagtcaccc ttcccctaac aagaacctgg 3120
agtttgtgct ttaaagctca tctctgaaat ctcaggatgg acgcacctcc gatgaattcc 3180
tctgacattc tgccagggcc cgtcttcctc cctggtgccc caggtgtcct gagtccttgt 3240
gtcactcagc gttgtgaccc ccaggtacca gccagagtca atgtgcaatc tctgcctctg 3300
tcactactct caccttcagg tctgtggctc acagagacct gcagccctcc tcagaggtgg 3360
cttgaacaat tggctgggag caaaaggagc tcctgggcac cctgcacaga caacggagtc 3420
gttaagctgg gacacgtgtg tagccccagc ttaaaagaga atataggccc gtggcagata 3480
cagaggtttt ctgccctttt ggcctgcatg cccaaccttt gggaaacccc aagttcctga 3540
aagcttttct gtgtctccaa atggacacat cctgtgtcct tccaggtcca tgctcatctc 3600
atcaccatgg cggccctcaa aacccaggga aggaggagag tgccaggggg ccttgtctgt 3660
tctgttgttc taggatcctg cagctgcagg agtgcttcct gagtggtact ttaggaagcc 3720
aaactacccc agtcagctta gataggagct gattcttggc agaaagaatg acagaaagaa 3780
caaagggaca cggaagcctt tttgaacagt caggccatca gaggctggtc ggaatcccag 3840
cagatgagag tggataccga atggaaagaa ctgagcttct ttaaagctca gctttgatgc 3900
cccgttctcc tggaagctct ctctggttct ctgatcagaa actgtctcta aacatttggc 3960
aagacattct gttgtgggat tttgcctggt ggtaggaaaa gcttgggtat tagcctcaga 4020
aagattctca gctctgccat taagagctgt gtgccctagg gcaagtctct gcctttctaa 4080
gcctggtttt cttctctgga aaatgaggct aatactttgg caaattgtca gaaaggttaa 4140
agaagtgtgc tgggcacagt ggttcatgcc tataatgcca gcgctttggg atgccaaggc 4200
tggaggattg cttgaggata ggagtttaag accagcctgg caatacagtg agatcccatc 4260
tctacaaaaa agaaaaaagg tagccaggca tggtggtgca ctcctataaa aattgaagct 4320
gcagtgagct gagactgcac cactgcactc cagcctgggt gactgaggaa gaccttgtct 4380
ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaggccaggt gcggttgctt atacgtgtaa 4440
tcacagcact ttgggaggcc gaggcaggca gatcacaagg tcaggagttc gagaccatcc 4500
tggctaatat ggtgaaaccc catctctact aaaactacaa aaaattagcc aggcatggtg 4560
gcacgcacct gtagttccag ctacttggga ggctgaggca ggagaatcac ttgaacccgg 4620
gaggtggagg ttgcagtgag ccaagatcgc accactgcac tccagcctga gcgacagagc 4680
gagactccgt atcaaaaaaa aaaaaaagcg actatgtatg aaatacccag cacagtgccc 4740
ttcccttacc catcatgacc cccacaccca cagtgtggcc atcctgctct acctgacgcg 4800
caaatataag gtccctgact actggtaccc tcaggacctg caggcccgtg cccgtgtgga 4860
tgagtacctg gcatggcagc acacgactct gcggagaagc tgcctccggg ccttgtggca 4920
taaggtgagg ctgggaatgt ggggggcggc agcgagagca ttccccaaag gtgttcaggc 4980
accagtctct tcttttcagt tttggattat ttctactgac ctgtctttgc cttcacagat 5040
tctttcctct gttgtgccaa attgctatta agcccatcca atacattctt tgtttgagat 5100
atgtattttt cagctctgga aattccattt ggttgttttt tagaatttcc acttctctga 5160
tgaaattcac catctgttca tccattttat ctgtcttttc ttgtaaattc tttaacatat 5220
ttatcactgt tacctaaaaa tctttgtcaa ctaatttcaa cacgtaggtg ttctgtgggt 5280
ctggtttttt tgttttgttt tgtttttgag atggggtctc actctgtcac ccaggctgag 5340
tgcaatggtg cgatctcagc tcactgcaac ctccacctcc caggctcaag cgattctcct 5400
gcctcagcct cctgcgtagc tgggattaca ggcacccacc agcacacctg gctaactttt 5460
gttatttgta gtggagaccg ggtttcacca tgttggccag gctggtttcg aactctccac 5520
ctgaagtgat tcgtcctcct tggcttccca aagtgttggg attacaggca tgagccacca 5580
tacccagcct acgggtctat ttctattgat tgttgttttc tccctcttga ttatgggtca 5640
catttgcctg cttctttgca tgtctcatga tgtattatca ttatttttta tttttttgag 5700
acggactctc actccattgc ccaggctggc gtgcaatggc acgatcttgg ctcactgcaa 5760
cctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc cacctcagcc tcccaagtag ctagaattac 5820
aggcacctgc catcatgcct ggctaatttt tgtatttttg tagagacagg gtttcaccat 5880
gttggccagg ctggtcttga actcctgacc tcaggtgatc ctcccatctc ggcctcccaa 5940
agtgctggga ttgtaggcat gagccaccat gcccggcctc atgatgtatc cttgtgtgcc 6000
agacattatg ataaaagaag agcagagatt gaattgcata ataaacaccc ccaagaaagg 6060
gcttgcactt ccctgtgtca ggtagccagg atgtgaggct gttctcttct aagctaatca 6120
ggaggtgggc tgggttgcag gtttagttgg tttcagttta tctttggttt caaatatctt 6180
gaatgtgaga tcaggtcact agctcagtct agcatggctt tggaatctaa tcaccaacta 6240
cgatgttgcc tgtaagatct ctctgctttt catccctgcc cccagttccc aaactgctgc 6300
tcagtcagaa aagcccatgc ctgtgacagt ctttctccca gcctgcttgg gcccaaggaa 6360
atgaaattgg aatgaaagta gctcatctag gaacggctta tgcctctctg gaatttagtt 6420
catttagtca agtgctgtcc gatagaagta taaagtgagc cacatacgta attttaaatt 6480
ttctagtagg cacatttaaa aagtaaaaag agtccaggca cagtggctca tgccaataat 6540
cctagcactt tgggaggcca aggcagtgga tcacctgagg tcaggagttc gagaccagcc 6600
tggtcaacat ggggaaacct tgtctctact aaaaccacaa aaattagcca ggcttggtgg 6660
cctgtgccta taatcccagc tactcaggat gctgaggcag gagaattgct tgaacccagg 6720
gggcaaagtt ggcagtgtgc cgagatggtg ccacttcact ccagcctggg tgacagagct 6780
gaacactgtc tcaaaagaaa aaaaaaaagt aaaaggaaat tgatatattt tacttaaccc 6840
aatgtgttga gaatattatc attttggcca acaagtacaa gaaaagatgc ttggccgggc 6900
gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcg gaggcaggca gatcacaagg 6960
tcaggagatt gagaccatcc tggctaacac agtgaaaccc tgtctctact aaaaataaaa 7020
aaaaaattag ctgggcgtgg tggcgggcac ctgtagtccc agctactcgg gaggctgagg 7080
caggagaatg gcgtgaaccc aggaggcgga gcttgcagtg agccgagatc accccactgc 7140
actccagcct gggcgagaga gcaagactca gtctcaaaaa aaaaaaaaaa agaaaagatg 7200
ctcagcatca ctaatcatta gggaaatgca aatcaaaact aactccctac tccagtaact 7260
cccgactttg cctgcccaat ccccaggtga tgttccctgt tttcctgggt gagccagtat 7320
ctccccagac actggcagcc accctggcag agttggatgt gaccctgcag ttgctcgagg 7380
acaagttcct ccagaacaag gccttcctta ctggtcctca catctcctta gctgacctcg 7440
tagccatcac ggagctgatg catgtgagtg ctgtgggcag gtgaacccac taggcagggg 7500
gccctggcta gttgctgaag tcctgcttat gctgccacac cgggctatgg cactgtgctt 7560
aagtgtgtgt gcaaacacct cctggagatc tgtggtcccc aaatcagatg ctgcccatcc 7620
ctgccctcac aaccatccat ccccagtctg tacccttttc cccacagccc gtgggtgctg 7680
gctgccaagt cttcgaaggc cgacccaagc tggccacatg gcggcagcgc gtggaggcag 7740
cagtggggga ggacctcttc caggaggccc atgaggtcat tctgaaggcc aaggacttcc 7800
cacctgcaga ccccaccata aagcagaagc tgatgccctg ggtgctggcc atgatccggt 7860
gagctgggaa acctcaccct tgcaccgtcc tcagcagtcc acaaagcatt ttcatttcta 7920
atggcccatg ggagccaggc ccagaaagca ggaatggctt gcctaagact tgcccaagtc 7980
ccagagcacc tcacctcccg aagccaccat ccccaccctg tcttccacag ccgcctgaaa 8040
gccacaatga gaatgatgca cactgaggcc ttgtgtcctt taatcactgc atttcatttt 8100
gattttggat aataaacctg ggctcagcct gagcctctgc ttctaa 8146
<210> 2
<211> 1076
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
actggagttt gctgactccc tctggtttcc ggtcaggtcg gtcggtcccc actatgggcc 60
tggagctgta cctggacctg ctgtcccagc cctgccgcgc tgtttacatc tttgccaaga 120
agaacgacat tcccttcgag ctgcgcatcg tggatctgat taaaggtcag cacttaagcg 180
atgcctttgc ccaggtgaac cccctcaaga aggtgccagc cttgaaggac ggggacttca 240
ccttgacgga gagtgtggcc atcctgctct acctgacgcg caaatataag gtccctgact 300
actggtaccc tcaggacctg caggcccgtg cccgtgtgga tgagtacctg gcatggcagc 360
acacgactct gcggagaagc tgcctccggg ccttgtggca taaggtgatg ttccctgttt 420
tcctgggtga gccagtatct ccccagacac tggcagccac cctggcagag ttggatgtga 480
ccctgcagtt gctcgaggac aagttcctcc agaacaaggc cttccttact ggtcctcaca 540
tctccttagc tgacctcgta gccatcacgg agctgatgca tcccgtgggt gctggctgcc 600
aagtcttcga aggccgaccc aagctggcca catggcggca gcgcgtggag gcagcagtgg 660
gggaggacct cttccaggag gcccatgagg tcattctgaa ggccaaggac ttcccacctg 720
cagaccccac cataaagcag aagctgatgc cctgggtgct ggccatgatc cggtgagctg 780
ggaaacctca cccttgcacc gtcctcagca gtccacaaag cattttcatt tctaatggcc 840
catgggagcc aggcccagaa agcaggaatg gcttgcctaa gacttgccca agtcccagag 900
cacctcacct cccgaagcca ccatccccac cctgtcttcc acagccgcct gaaagccaca 960
atgagaatga tgcacactga ggccttgtgt cctttaatca ctgcatttca ttttgatttt 1020
ggataataaa cctgggctca gcctgagcct ctgcttctaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1076
<210> 3
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Gly Leu Glu Leu Tyr Leu Asp Leu Leu Ser Gln Pro Cys Arg Ala
1 5 10 15
Val Tyr Ile Phe Ala Lys Lys Asn Asp Ile Pro Phe Glu Leu Arg Ile
20 25 30
Val Asp Leu Ile Lys Gly Gln His Leu Ser Asp Ala Phe Ala Gln Val
35 40 45
Asn Pro Leu Lys Lys Val Pro Ala Leu Lys Asp Gly Asp Phe Thr Leu
50 55 60
Thr Glu Ser Val Ala Ile Leu Leu Tyr Leu Thr Arg Lys Tyr Lys Val
65 70 75 80
Pro Asp Tyr Trp Tyr Pro Gln Asp Leu Gln Ala Arg Ala Arg Val Asp
85 90 95
Glu Tyr Leu Ala Trp Gln His Thr Thr Leu Arg Arg Ser Cys Leu Arg
100 105 110
Ala Leu Trp His Lys Val Met Phe Pro Val Phe Leu Gly Glu Pro Val
115 120 125
Ser Pro Gln Thr Leu Ala Ala Thr Leu Ala Glu Leu Asp Val Thr Leu
130 135 140
Gln Leu Leu Glu Asp Lys Phe Leu Gln Asn Lys Ala Phe Leu Thr Gly
145 150 155 160
Pro His Ile Ser Leu Ala Asp Leu Val Ala Ile Thr Glu Leu Met His
165 170 175
Pro Val Gly Ala Gly Cys Gln Val Phe Glu Gly Arg Pro Lys Leu Ala
180 185 190
Thr Trp Arg Gln Arg Val Glu Ala Ala Val Gly Glu Asp Leu Phe Gln
195 200 205
Glu Ala His Glu Val Ile Leu Lys Ala Lys Asp Phe Pro Pro Ala Asp
210 215 220
Pro Thr Ile Lys Gln Lys Leu Met Pro Trp Val Leu Ala Met Ile Arg
225 230 235 240
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 寡核苷酸探针
<400> 4
tcgggaaccc agaaggcaca gacag 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 寡核苷酸探针
<400> 5
tacaagcact cccacttcat ctgga 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列:寡核苷酸探针
<400> 6
tccagttcag ggcagtagtg actca 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列:寡核苷酸探针
<400> 7
tctcataatg ccatcaggtt tgggc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列:寡核苷酸探针
<400> 8
tcgtgccttg tcattttatt tggag 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 寡核苷酸探针
<400> 9
gccggagacc tagatgtcat tgttt 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 寡核苷酸探针
<400> 10
acgtgcgcga gcgccagcgc accca 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 寡核苷酸探针
<400> 11
tggtcttggt ggaaactttg ctgcc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 正向引物
<400> 12
tcttttgcat agagaccatg accag 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 反向引物
<400> 13
ctccctactc cagtaactcc cgact 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 正向引物
<400> 14
gaagcccaag aatgggtgtg tgtg 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列: 反向引物
<400> 15
tgtccccatg gcctccaaca tt 22

Claims (18)

1.一种用于鉴定一种或多种具有提高的生长速率和/或组织形成潜能的干细胞的方法，所述方法包括确定一种或多种干细胞中的GSTT1表达水平，以及将所确定的GSTT1表达水平与该干细胞类型的GSTT1表达水平的参照值进行比较，其中相对于该干细胞类型的GSTT1表达水平的参照值，一种或多种确定GSTT1表达降低的干细胞被鉴定为具有提高的生长速率和/或组织形成潜能。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括使相对于该干细胞类型的GSTT1表达水平的参照值，所述一种或多种确定GSTT1表达降低的干细胞与其他细胞或干细胞分开或分离的步骤。
3.一种用于鉴定一种或多种具有提高的生长速率和/或组织形成潜能的干细胞的方法，所述方法包括确定一种或多种干细胞的GSTT1基因型，其中一种或多种确定具有非纯合野生型GSTT1基因型的干细胞被鉴定为具有提高的生长速率和/或组织形成潜能。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法还包括使一种或多种确定具有非纯合野生型GSTT1基因型的干细胞与其他细胞或干细胞分开或分离的步骤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中与参照干细胞群相比，所述一种或多种被鉴定为具有提高的生长速率和/或组织形成潜能的干细胞另外具有以下一种或多种特征：
(i)集落形成能力增强；
(ii)细胞尺寸减小；
(iii)端粒长度增加和/或端粒缩短速率降低；
(iv)STRO-1、SSEA-4、CD146和/或PDGFRβ的表达提高；
(v)FGF-2、VEGF、SDF-1α、Fractalkine、PDGF-BB和/或MIP-1α的分泌增加；
(vi)对T细胞的抑制增强；
(vii)ALP、RUNX2和/或BSP-II的表达降低；
(viii)TWIST-1和DERMO-1的表达提高。
6.一种用于修饰一种或多种间充质干细胞的方法，所述方法包括使一种或多种间充质干细胞与能够修饰细胞以降低GSTT1表达和/或功能的试剂接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括：
(i)从个体中分离一种或多种间充质干细胞，和
(ii)使所分离的一种或多种间充质干细胞在体外与能够修饰间充质干细胞以降低GSTT1表达和/或功能的试剂接触。
8.一种或多种间充质干细胞，所述间充质干细胞已被修饰以相对于野生型GSTT1纯合的间充质干细胞和/或具有该干细胞类型的平均GSTT1表达和/或功能的间充质干细胞具有降低的GSTT1表达和/或功能。
9.一种或多种分离的间充质干细胞，所述间充质干细胞相对于野生型GSTT1纯合的间充质干细胞具有降低的GSTT1表达和/或功能。
10.一种或多种干细胞在制备药物中的用途，其中所述一种或多种干细胞已被修饰以降低内源性GSTT1表达和/或功能，或者所述一种或多种干细胞包含能够降低GSTT1表达和/或功能的试剂。
11.一种或多种干细胞在制备用于治疗骨折的药物中的用途，其中所述一种或多种干细胞已被修饰以降低内源性GSTT1表达和/或功能，或者所述一种或多种干细胞包含能够降低GSTT1表达和/或功能的试剂，其中当所述药物被施用时，向所述骨折周围的组织施用所述干细胞。
12.一种或多种干细胞用于在体外生成骨组织的用途，所述一种或多种干细胞已被修饰以降低内源性GSTT1表达和/或功能，或者所述一种或多种干细胞包含能够降低GSTT1表达和/或功能的试剂。
13.一种用于选择干细胞供体的方法，所述方法包括确定从个体分离的含DNA样品中的GSTT1的基因型，其中选择经确定具有已知和/或被预测导致相对于野生型GSTT1纯合个体GSTT1表达降低的GSTT1基因型的个体作为干细胞供体。
14.一种用于选择干细胞供体的方法，所述方法包括：
(i)确定从个体分离的样品中的一种或多种干细胞的GSTT1表达水平，和
(ii)将步骤(i)中所确定的GSTT1表达水平与该干细胞类型的GSTT1表达水平的参照值进行比较；
其中选择经确定具有一种或多种相对于所述参照值GSTT1表达降低的干细胞的个体作为干细胞供体。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中与参照干细胞群相比，所述一种或多种干细胞另外具有以下一种或多种特征：
(i)集落形成能力增强；
(ii)细胞尺寸减小；
(iii)端粒长度增加和/或端粒缩短速率降低；
(iv)STRO-1、SSEA-4、CD146和/或PDGFRβ的表达提高；
(v)FGF-2、VEGF、SDF-1α、Fractalkine、PDGF-BB和/或MIP-1α的分泌增加；
(vi)对T细胞的抑制增强；
(vii)ALP、RUNX2和/或BSP-II的表达降低；
(viii)TWIST-1和DERMO-1的表达提高。
16.一种在干细胞的培养物中富集集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括隔离相对于该干细胞类型的GSTT1表达水平的参照值GSTT1表达水平降低的干细胞。
17.一种在干细胞的培养物中富集集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括隔离不具有纯合野生型GSTT1基因型的干细胞。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)。
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