KR20070024644A - 약물 전달을 위한 초부과 리포좀 - Google Patents

Abstract

본원발명은 약물 전달을 위한 리포좀에 관계하며, 여기서 리포좀은 리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 적어도 하나의 요구되는 약물 분자를 포함하며, 여기서 리포좀은 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 또다른 약물 분자를 더욱 포함한다. 더욱 구체적으로, 본원발명은 리포좀에 관계하는데, 여기서 요구되는 약물 분자의 적어도 일부는 적어도 하나의 지질 단편에 존재하는 작용기와 작용하는 작용기를 함유하며, 여기서 약물은 화학결합, 예를 들면 지질 분자의 하이드록실 그룹과 약물의 산성 그룹의 에스테르 결합에 의하여 막 지질과 공유결합되어 있다. 바람직한 구체예에서, 요구되는 약물은 에리트로포이에틴과 같은 당단백질이다. 본원발명은 또한 상기 리포좀의 제조방법 및 이를 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다.

리포좀

Description

약물 전달을 위한 초부과 리포좀{SUPERLOADED LIPOSOMES FOR DRUG DELIVERY}

본원발명은 에리트로포이에틴, 또는 당단백질인 또다른 제약학적 활성 화합물을 함유하거나, 또는 글리코실화 부위의 말단에 시알산 그룹이 있는 당단백질 부분(moiety)을 갖는 리포좀에 관계한다. 본원발명은 또한 리포좀 제조 방법, 리포좀 함유 조성물 및 상기 리포좀 이용 방법에 관계한다.

기술적 배경

에리트로포이에틴(EPO)은 적혈구 합성에 포함된 공지된 당단백질이다. 담체로서 사람혈청알부민(HSA)과 함께 EPO를 포함하는 제약학적 조성물은 당해 기술분야에서 공지이다. 그렇지만, 천연 원료로부터 수득된 HSA의 사용은 항상 전염성 질병, 특히 바이러스성 전염병을 옮기는 잠재적 위험성을 갖기 때문에, 비경구(parenteral) EPO 제제를 위한 담체로서의 HSA를 대체하기 위한 시도가 있었다.

EP 0 937 456 A1는 수용성 분산물 내에서 리포좀과 함께 에리트로포이에틴을 포함하는 리포좀-기초 비경구 조성물을 개시하며, 여기서 당단백질은 실질적으로 리포좀 내에 편입되지 않으며 본질적으로 리포좀 외부의 수용성 상(aqueous phase)에 존재한다. 지름 1㎛ 미만의 리포좀 제조를 위한 고속 균질화(high speed homogenisation)를 이용하여 에탄올성 지질 상(ethanolic lipid phase)을 수용성 완충액에 주입시킴으로써 리포좀이 제조된다.

일본 특허 제 JP8231417호는 리포좀 EPO-조성물의 또다른 제조 방법을 개시하며, 여기서 EPO를 리포좀 내에 포함시키기 위한 역-상(reverse-phase) 증발에 의해 리포좀이 제조된다.

발명의 요약

당해 기술분야에서 공지된 방법은 일부 장점을 가질 수 있으나, 본원발명의 목적은 내부, 예를 들면 리포좀의 수용성 상 내에서 인캡슐레이트(encapsulated)될 뿐만 아니라 리포좀 막의 내부 및/또는 외부와 결합되거나 부착되는 요구되는 약물(desired drug)을 포함하는 리포좀을 제공하고, 약물 및 지질의 용량에 기초한 계산 및 리포좀의 평균 크기 및/또는 전체 내부 부피("포획된 부피")에 의해 예상되는 바와 같이, 수동 약물 포함(passive drug inclusion)에 의해 일반적으로 또는 심지어 이론적으로 수득가능한 부과량을 초과하는 범위에서 요구되는 약물이 부과된 리포좀을 결과함으로써, 공지 조성물의 성능을 향상시키는 것이다. 따라서 본원발명은 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하는 리포좀에 관계하는데, 여기서 수용성 내부의 상기 약물의 단지 수동 포함(passive inclusion)에 의해, 즉 막에 대한 약물의 부착 없이, 달성된 약물 부과량을 초과하는 양으로 상기 약물 분자가 존재한다.

요구되는 약물은 제약학적으로 활성인 화합물이며 바람직한 한 구체예에서는 당단백질, 또는 적어도 하나의 올리고당 또는 다당류 부분(moiety)을 갖는 또다른 생물활성인 화합물이며, 여기서 상기 당단백질 또는 올리고당 또는 다당류 부분(moiety)은 예를 들면 글리코실화 부위의 말단에서 자유롭게 영향받기 쉽고, 그 결과 활성인 시알산 그룹을 포함한다.

따라서, 본원발명의 목적은 치밀하게 부과된 리포좀을 제공하는 것이며, 여기서 요구되는 약물은 리포좀 내에서 인캡슐레이트되며 약물의 일부는 또한 외부로부터, 또한 전형적으로 내부로부터 리포좀 막에 결합되거나 부착된다. 바람직한 구체예에서 상기 약물은 에리트로포이에틴이다.

본원발명의 또다른 목적은 치밀하게 부과된 리포좀의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본원발명의 또다른 목적은 상기 치밀하게 부과된 리포좀을 함유하는 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본원발명의 원리는 독립 청구항에 더욱 기재되어 있으며, 본원발명의 다양한 구체예는 종속 청구항의 주제이다.

발명의 상세한 설명

더욱 구체적으로, 본원발명의 제1 구체예는 약물 전달을 위한 리포좀에 관계하는데, 여기서 리포좀은 리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하며 여기서 리포좀은 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 또다른 약물 분자를 더욱 포함한다. 부착은 공유성 또는 비-공유성일 수 있으며, 즉 약물과 지질 사이의 화학 결합이 있을 수 있으며, 또는 부착은 약물과 지질 분자 사이의 반 데르 발스 힘, 수소 다리(hydrogen bridge), 정전기력, 친수성-소수성 상호작용, 친화력(affinity force), 및/또는 극성 상호작용 등(여기에 제한되지 않음)을 포함하는, 화학 결합 이외의 접착력에 의해 기인할 수 있다.

본원발명의 또다른 구체예는 리포좀에 관계하는데, 여기서 막에 부착되어 있는 약물 분자의 적어도 일부는 막 지질에 공유결합된다.

바람직한 구체예에서 공유 결합은 지질의 반응성 작용기와 지질의 작용기에 반응하는 약물의 작용기 사이의 화학 결합이다. 또한 인간 또는 동물의 몸체에 투여할 때 약물의 의도된 생리적 작용을 방해하지 않는 특성의 화학 결합이 바람직하다. 또다른 바람직한 구체예에서, 화학 결합은 투여할 때 인간 또는 동물 몸체의 생리적 조건 하에서 절단될 수 있는 특성이다.

따라서, 특정 구체예에서 본원발명은 리포좀에 관계하는데, 여기서 지질의 작용기는 하이드록실 그룹이며, 하이드록실 그룹은 다가(polyvalent) 알코올 잔류물의 일부일 수 있다. 적절한 다가(polyvalent) 알코올 잔류물은 당(sugar) 알코올 잔류물이며, 특히 글리세롤 잔류물 및 이노시톨 잔류물과 같이 지질 내에서 자연적으로 발생하는 것이다. 그렇지만, 리포좀 막에 대한 요구되는 약물의 부착을 제공하는 지질 작용기는 또한 예를 들면 포스파티딜 콜린 (레시틴) 내 콜린 잔류물일 수 있다.

지질 작용기가 하이드록실 그룹인 경우 바람직하게는 약물의 반응성 작용기는 산성 그룹, 특히 인산 잔류물, 황산 잔류물, 탄산 잔류물, 및 시알산 잔류물로 구성된 그룹으로부터 선택된 산성 그룹이다. 이 경우, 산성 그룹을 함유하는 약물 분자 또는 약물 분자의 적어도 일부는 하이드록실 그룹을 함유하는 지질 분자의 적어도 일부와 에스테르 결합에 의해 공유결합될 것이다.

또다른 구체예에서 본원발명은 전술한 리포좀에 관계하는데, 여기서 약물은 당단백질이거나 또는 올리고당 또는 다당류 부분(moiety)을 가지며 당단백질 또는 올리고- 또는 다당류 부분(moiety)은 하이드록실-함유 지질에 의한 에스테르화에 영향받기 쉬운 하나 이상의 자유 반응성 시알산 그룹을 포함한다.

리포좀 소포막의 지질 조성물은 전형적으로 인지질, 글리코지질(glykolipid), 세라마이드, 및 상기 지질 중 하나의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 천연 또는 비-천연 지질을 포함한다.

따라서, 또다른 특정 구체예에서 본원발명은 전술한 리포좀에 관계하는데, 여기서 리포좀은 인지질, 특히 스핑고인지질 및 글리세로인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 인지질을 포함하며, 스핑고인지질은 스핑고미엘린을 포함하며 글리세로인지질은 레시틴, 케팔린, 카르디올리핀, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 포함한다.

리포좀이 인지질 대신에 또는 인지질에 부가하여 글리코지질(glykolipid)을 포함하는 경우, 상기 글리코지질(glykolipid)은 바람직하게는 글리코스핑고지질 및 글리코글리세로지질로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 글리코스핑고지질는 세레브로시드, 갱글리오사이드, 설파타이드를 포함하며, 글리코글리세로지질은 글리코실모노글리세리드 및 글리코실디글리세리드를 포함한다.

특정 구체예에서, 본원발명에 따르는 리포좀은 지질 조성물을 갖는데, 여기서 막은 DPPC : 콜레스테롤 : EPG = 7 : 2 : 1의 몰 비율로 디-팔미토일-포스파티딜콜린(DPPC), 콜레스테롤, 및 에그 포스파티딜글리세롤(EPG)를 포함하며, 상기 비율은 상황에 따라 정량적으로 및/또는 정성적으로 변화할 수 있음이 이해된다.

또다른 특정 구체예에서 리포좀 내에서 인캡슐레이트된 또는 리포좀에 부착된 전달을 위한 약물은 에리트로포이에틴이다.

또다른 구체예에서, 본원발명은 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께 앞서 정의된 약물-부과된 리포좀을 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다. 제약학적 조성물은 국부부위(topic) 또는 온몸의(systemic) 비경구 투여를 가능하게 하기 위하여, 주사액, 나잘 스프레이(nasal spray), 흡입 액체, 크림(cream), 겔, 연고(ointment), 좌약, 또는 로션(lotion) 형태와 같은, 투여 특히 비경구 투여를 위한 임의의 적절한 액체, 반-액체 또는 고체 형태일 수 있다.

본원발명은 또한 리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하며 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 또다른 약물 분자를 더욱 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법에 관계하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

- 유기 용매 내의 지질 상(lipidic phase)을 제공하는 단계, 여기서 지질 상은 하나 이상의 지질 단편(fraction)을 포함하고 각각의 지질 분자는 하나 이상의 반응성 작용기를 가지며;

- 완충용액 및 완충용액에 용해된 하나 이상의 요구되는 약물을 포함하는 수용성 상을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 약물은 지질의 작용기와 반응 가능한 반응성 작용기를 가지며;

- 리포좀의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 지질 상을 상기 수용성 상에 공급하는 단계;

- 선택적으로 리포좀에 의한 약물 업테이크(uptake)의 효율을 증가시키기 위하여 루프(loop) 내에서 수용성 상을 순환시키고 상기 단계 c)를 반복하는 단계; 및

- 약물-부과된 리포좀을 수확하는 단계,

여기서 약물 분자의 적어도 일부는 리포좀 내에 편입되며 약물 분자의 또다른 일부는 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된다.

약물 및 지질과 관련하여 본원에서 사용된 "반응성 작용기" 또는 "작용기와의 반응"과 같은 용어는 반응 또는 반응성이 필수적으로 공유 결합성임을 의미하는 것은 아니며 그 대신에 전술한 바와 같이 지질과 약물 사이에 있어서 화학 결합 이외의 더욱 강한 또는 덜 강한 접착성 또는 부착성일 수 있음이 이해될 것이다.

전술한 바와 같이, 지질의 작용기는 하이드록실 그룹, 바람직하게는 글리세롤 및 이노시톨과 같은 자연적으로 발생한 당(sugar) 알코올로부터 유도된 당(sugar) 알코올 잔류물과 같은 다가(polyvalent) 알코올 잔류물의 일부인 하이드록실 그룹, 또는 레시틴과 같은 콜린 그룹일 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이, 약물의 반응성 작용기는 바람직하게는 인산 잔류물, 황산 잔류물, 탄산 잔류물, 및 시알산 잔류물로 구성된 그룹으로부터 선택된 산성 그룹 일 수 있다.

한 구체예에서 제조 방법은 반응성 작용기가 있는 상기 지질의 적어도 일부와 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부의 상호작용, 예를 들면 화학 반응을 허용하는 조건 하에서 지질 상을 수용성 상으로 공급하는 단계를 포함한다. 지질 작용기가 하이드록실 그룹이고 약물 작용기가 산성 잔류물인 경우, 상기 상호작용 및 선택적으로 화학 반응을 허용하는 조건은 25 내지 65℃의 반응 온도 및 수용성 상의 pH 6 내지 8에서 지질 상을 수용성 상에 공급하는 단계를 포함하며, 그 결과 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부는 작용기를 갖는 상기 지질의 적어도 일부에 부착되고 선택적으로 에스테르화에 의해 공유결합된다.

더욱 특정 구체예에서 약물은 당단백질이거나 또는 올리고당 또는 다당류 부분(moiety)을 가지며 당단백질 또는 올리고- 또는 다당류 부분(moiety)은 하나 이상의 반응성 시알산 그룹을 포함한다.

제조 방법의 또다른 구체예에서 지질 상은 인지질, 글리코지질(glykolipid), 세라마이드, 및 상기 지질의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 천연 또는 비-천연 지질을 포함하며, 반면에 가장 특정 구체예에서 지질 상의 지질 조성물은 7 : 2 : 1의 몰 비율로 DPPC, 콜레스테롤, 및 EPG를 포함하도록 조절되며, 상기 몰 비율은 경우에 따라 정량적으로 또는 정성적으로 다양하게 변화할 수 있음이 이해된다.

바람직하게는, 압력 하에서 그리고 본질적으로 무-전단(shear-free) 조건 하에서, 극도의 온화한 조건, 즉 고속 균질화를 형성하는 전단력을 사용하지 않거나 또는 소포체 형성을 위한 고 난류 형성을 위한 유사 수단을 쓰지 않는 조건하에서 즉석의 및 동시의 리포좀 형성을 허용하는 WO 02/36257에 개시된 교차 흐름 주사 기술(cross-flow injection technique)을 사용하여 지질 상이 수용성 상으로 공급된다.

또다른 구체예에서 본원발명은 제조 방법에 관계하는데, 여기서 소포체 형성 단계 이전에, 약물 분자가 막 지질에 결합하거나 또는 공유결합하기 위하여, 지질 분자당 적어도 하나의 반응성 작용기를 갖는 지질을 함유하는, 지질 단편의 적어도 일부분, 또는 지질 단편 전체가 반응성 작용기를 갖는 약물 분자의 적어도 일부와 반응한다. 상기 사전-반응은 소포체 형성 이전에 실행된다. 따라서, 한 구체예에서 본원발명은 제조 방법에 관계하는데, 여기서 지질 상을 수용성 상에 공급하기 이전에 지질 상의 적어도 일부의 지질은 요구되는 약물 분자의 적어도 일부에 부착되고, 선택적으로 공유결합된다.

또다른 한 구체예에서, 본원발명은 리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하고 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 또다른 약물 분자를 더욱 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법에 관계하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

- 유기 용매 내의 또는 건조 필름으로서의 지질 상을 제공하는 단계, 여기서 지질 상은 하나 이상의 지질 단편을 포함하고 각각의 지질 분자는 하나 이상의 반응성 작용기를 가지며;

- 완충용액을 포함하는 제1 수용성 상을 제공하는 단계;

- 완충용액 및 완충용액에 용해된 하나 이상의 요구되는 약물을 포함하는 제2 수용성 상을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 약물은 지질의 작용기에 부착 가능하거나 또는 지질의 작용기와 화학적으로 반응가능한 반응성 작용기를 가지며;

- 리포좀의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 지질 상과 상기 제1 수용성 상을 조합하는 단계;

- 약물 분자의 적어도 일부를 리포좀 내로 업테이크 가능하게 하는 조건 및 반응성 작용기가 있는 상기 지질의 적어도 일부와 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부의 상호작용, 선택적으로 화학 반응을 허용하는 조건 하에서, 상기 형성된 리포좀과 제2 수용성 상을 조합하는 단계; 및

- 약물-부과된 리포좀을 수확하는 단계,

여기서 약물 분자의 적어도 일부는 리포좀 내에 편입되며 약물 분자의 또다른 일부는 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된다.

상기 방법을 사용하면, 바람직하게는 지질 작용기는 하이드록실 그룹이고 약물 작용기는 산성 잔류물이며 상호작용, 예를 들면 화학 반응을 허용하는 조건은 25 내지 65℃의 반응 온도 및 제2 수용성 상의 pH 6 내지 8에서 리포좀과 제2 수용성 상을 조합하는 단계, 및 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부가 작용기를 갖는 상기 지질의 적어도 일부에 부착되고 선택적으로 에스테르화에 의해 공유결합될 때까지 결과물인 리포좀 현탁액을 배양하는 단계를 포함한다.

또다른 구체예에서 상기 방법은 추가적인 단계를 포함하는데, 여기서 배양하는 동안 또는 그 이후에 리포좀 현탁액은 리포좀 내로의 약물 업테이크(uptake) 강화를 의한 추가적 처리를 겪으며, 상기 처리는 바람직하게는 초음파분해(sonication), 전기천공(electroporation), 와동(vortexing), 및 구배-추진 막 확산(gradient-driven transmembrane diffusion)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

공유 결합은 에스테르 결합일 수 있다. 전달을 위한 약물을 갖는 "초-부과(super-loading)" 리포좀을 위한 적절한 약물은 에리트로포이에틴이다.

본원발명의 치밀하게 부과된 리포좀은 주사액, 나잘 스프레이(nasal spray)와 같은 비경구 적용 형태, 또는 크림(cream), 겔, 연고(ointment) 또는 로션(lotion)과 같은 국부부위(topical) 적용 형태의 1회 복용량을 상당히 감소시키는 것을 가능하게 한다. 전달을 위한 요구되는 약물의 성질에 의존하여, 본원발명의 리포좀 조성물은 인간 또는 동물 수용체 내의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 또는 실질적으로 회피하기 위하여 약물의 투여 형태의 어느 정도의 조절을 허용한다. 더욱이, 본원발명에 따르는 리포좀 제제는 인간 또는 동물 몸체 내의 생리적 조건 하에서 쉽게 분해되거나 손상을 입는 제약학적으로 활성인 화합물의 생물학적 이용도를 많이 증가시키고 연장시킨다.

요구되는 약물을 갖는 " 초-부과(super-loading)" 리포좀에 부가하여, 본원발명의 또다른 우수한 장점은 상당한 양으로 둘 이상의 서로 다른 약물을 함유하는 리포좀 제조의 가능성을 제공하는 것이며, 여기서 하나 이상의 약물은 리포좀 막에 공유결합 또는 비-공유결합으로 부착되는 반면 하나 이상의 또다른 약물은 리포좀 내의 수용성 상에 존재한다. 따라서, 본원발명의 개념의 사용은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 둘 이상의 서로 다른 약물 또는 약물 구성성분의 동시 전달을 위한 리포좀을 구체적으로 디자인할 수 있게 할 것이며, 이러한 전달은 예를 들면 치료 요법과 조합하여 요구되거나 또는 이익이 된다.

본원발명의 리포좀은 바람직하게는 본원발명에 참조문헌으로 편입된 WO 02/36257에 개시된 교차 흐름 주사 기술을 사용하여 제조된다. 요컨대, 방법은 지질 상 도관 벽 내 미세 개구 및 상기 지질 상 도관과 연결된 제2 도관 벽 내 이웃한 개구를 통하여 유기 지질 상, 전형적으로 에탄올성 지질 상을 수용성 상에 주입하는 단계 및 수용성 상을 운송하는 단계에 기초한다. 본원발명 방법의 특징은 주입 지점, 즉 교차 흐름(cross-flow) 주입 모듈 또는 혼합 챔버에서, 지질 상을 운송하는 도관은 수용성 상의 도관과 단단하게 연결되어 있으며 도관은 공통개구부(common orifice)를 통하여 서로서로 액체 연결되며, 도관은 압력하에서 그리고 스프레이 액적 형태로 유기 액체가 상기 공통개구부(common orifice)를 통과하는 수용성 상 스트림으로 유입되는 것을 허용한다. 액체 교차점 영역, 즉 유기 지질 스트림이 대략 직각으로 수용성 스트림으로 들어가는 영역에는 전단력 생성 요소가 존재하는 않으나, 리포좀이 매우 우수한 품질로 그리고 소포제 크기 분배로 동시에 형성된다. 상기 매우 온화한 방법은 예를 들면 규질화기 내에서, 전단력에 기인하는 지역적 과열 또는 공동현상(cavitational phenomena)에 의해 피해를 입거나 또는 불활성화될 수 있는 민감한 약물의 인캡슐레이션뿐만 아니라 산화- 또는 온도-민감 지질의 사용을 허용한다.

리포좀 내로의 약물의 수동 편입 방법에 부가하여 본원발명은 또한 요구되는 약물을 전형적으로 유니라멜라 이중막(unilamellar bilayer)인 리포좀 막에 능동적으로 부착시키는 데 관계한다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 즉 제약학적으로 활성인 화합물을 리포좀 막에 능동적으로 부착시키거나 또는 결합시키기 위하여, 막의 지질 조성물은 전달을 위해 요구되는 약물과 일치되게 선택되는 것이 바람직한데, 즉 글리세롤 또는 이노시톨 타입의 헤드그룹을 갖는 천연 또는 비-천연 인지질과 같은, 요구되는 약물 분자와 상호작용할 수 있는 지질을 포함하고, 그리고 상기 헤드그룹을 갖는 단지 소량의 지질을 갖는 또다른 지질, 특히 천연 지질을 포함하는 것이 바람직하다.

적절한 지질은 스핑고신 및 이의 유도체, 세레브로시드 및 이의 유도체, 세라마이드 및 이의 유도체를 포함한다.

리포좀 막에 대한 요구되는 약물의 능동 결합 또는 부착을 위하여 리포좀은 약 25 내지 65℃ 및 약 중성의 pH, 즉 약 염기성 또는 약 산성, 바람직하게는 6 내지 8의 pH 에서, 예를 들면 에리트로포이에틴과 같은 요구되는 약물의 존재하에서 제조되는 것이 바람직하다. 선택적으로 시알산 그룹과 인지질 사이의 에스테르화 반응에 의한 화학 결합을 포함하는 부착은 상기 온도와 pH 범위에서 가장 잘 수행하는 것으로 나타난다.

본원발명에 따르는 리포좀은 주된 지질 단편으로서 디-팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 소이 포스파티딜콜린(SPC), 세라마이드 및 스핑고신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 지질 단편, 및 충전된 헤드그룹을 갖는 지질 및 콜레스테롤로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 또다른 지질 단편을 포함한다.

전술한 수용성 상 내로의 지질 상의 교차 흐름 주입에 의한 수동 인캡슐레이션(passive encapsulation) 방법을 사용하여 다음 결과가 수득되었다:

a) 수동 인캡슐레이션에 의해

인캡슐레이션 되는 약물의 최대 20 - 50 중량%의 인캡슐레이션 비율이 달성되었으며, 상기 결과는 주로 다음에 의존한다

- 약물-함유 수용성 상과 함께 수행되는 재순환 사이클의 횟수,

- 개선되는 리포좀의 사전 선택된 소포체 크기, 및

- 막의 지질 조성물 및 지질 농도.

상기 인캡슐레이션 비율은 예를 들면 rhSOD와 같은 특정 효소의 리포좀 포함에 대한 종전의 연구 결과와 잘 일치한다;

반면에

b) 본원발명에 따르는 리포좀의 조합된 수동 및 능동 부과에 의해

부과를 위해 제공된 약물의 최대 100 중량%의 부과 비율, 즉 인캡슐레이션 및 리포좀 막에 대한 내부 및 외부 부착이 달성되었으며, 리포좀 부과 이후의 여과 분석에 의해 확인되었다. 전형적으로, 자유 약물은 최초 공급된 농도와 비교하여 10 중량% 또는 그 미만의 농도로 여과액에서 발견되었다.

본원발명에서 유도된 대부분의 실험은 본원발명의 약물-부과 개념을 실증하게 위하여 요구되는 약물로서 에리트로포이에틴을 사용하여 수행되었다. 그렇지만, 전술한 바와 같이 본원발명은 리포좀 내에서 인캡슐레이트되고 리포좀 막, 바람직하게는 막의 한쪽 또는 양쪽 모두에 부착될 수 있는 임의의 물질에 적용가능하다. 부착은 공유결합 또는 비-공유결합, 예를 들면 당해 기술분야에서 공지된 친화력, 정전기적 상호작용, 반 데르 발스 힘, 친수성 및/또는 소수성 상호작용 등에 의한 부착일 수 있다. 그렇지만, 약물은 리포좀 막 내에 함유된 지질 작용기와 공유결합하는 것이 바람직하다. 작용기가 폴리올 타입, 특히 당 알코올 타입, 그리고 전형적으로 이노시톨 또는 글리세롤인 경우, 요구되는 약물이 인산, 황산, 탄산 또는 시알산 잔류물과 같은 활성 산성 작용기를 함유한다면, 요구되는 약물은 막에 가장 효율적으로 부착할 것이다. 상기 산성 반응성 작용기는 지질의 하이드록실 그룹과 접촉할 수 있으며 에스테르화를 통하여 지질과 약물 사이의 공유 결합을 일으킨다.

본원에서 개시된 본원발명의 더욱 완전한 이해를 위하여, 다음 실시예가 제시된다.

실시예 1 (비교 실시예) : 약물을 갖는 리포좀의 수동 부과

a) 지질 조성

DPPC : 콜레스테롤 : 스테아릴아민 = 7 : 2 : 1

b) 약물 농도

수용성 완충액(PBS) 2 ㎖ 당 에리트로포이에틴(EPO) 2868 ㎍

리포좀은 WO 02/36257에 개시된 교차 흐름 주입(cross-flow injection)에 따라 제조되었다. 약 170 ㎚의 평균 소포체 지름을 갖는 유니라멜라 이중층 리포좀이 수득되었으며 후속하여 한외여과/투석여과(ultra/diafiltration) 유닛을 사용하는 여과단계를 거쳤다.

여과액이 자유 약물, 즉 비-인캡슐레이트된 약물에 대하여 분석되었으며, 결과는 다음과 같다:

리포좀 보유액 (2 ㎖) : 711 ㎍ EPO = 25 중량% 인캡슐레이션;

전체 여과액 : 2175 ㎍ EPO = 75 중량% 비-인캡슐레이티드;

단편으로 분해: 여과액 F1 = 843 ㎍;

여과액 F2 = 596 ㎍,

여과액 F3 = 345 ㎍,

여과액 F4 = 391 ㎍.

본 실시예에서 리포좀 내 EPO의 인캡슐레이션을 위한 당해 기술분야의 방법의 사용은 25 중량%의 약물 포함, 예를 들면 리포좀 보유액 1 ㎖ 당 356 ㎍의 약물을 결과하였다. 더욱 일반적으로, 상기 약물의 수동 인캡슐레이션 방법의 사용은 초기에 공급된 약물의 용량과 비교하여, 전형적으로 약 25 내지 약 50 중량% 범위의 포함 비율을 결과하였다.

상기 부과 효율은 리포좀 인캡슐레이션을 위하여 요구되는 약물로서 유전자재조합 사람 초산화 불균등화효소(recombinant human superoxide dismutase, rhSOD)와 같은 단백질 또는 펩티드를 사용하는 종전의 연구와 일치된다.

실시예 2:

a) 지질 조성

DPPC : 콜레스테롤 : EPG = 7 : 2 : 1

b) 약물 농도

2㎖ 수용성 완충액(PBS) 내 3375 ㎍의 Epo

리포좀은 WO 02/36257에 개시된 교차 흐름 주입(cross-flow injection)에 따라 제조되었다. 약 170 ㎚의 평균 소포체 지름을 갖는 유니라멜라 이중층 리포좀이 수득되었으며 후속하여 한외여과/투석여과(ultra/diafiltration) 유닛을 사용하는 여과단계를 거쳤다.

여과액이 자유 약물, 즉 비-인캡슐레이트된 약물에 대하여 분석되었으며, 결과는 다음과 같다:

리포좀 보유액 (2㎖) : 3043 ㎍ EPO = 90 중량%

전체 여과액 : 328 ㎍ EPO = 10 중량%;

단편으로 분해: 여과액 F1 = 24 ㎍;

여과액 F2 = 128 ㎍,

여과액 F3 = 0-1 ㎍,

여과액 F4 = 176 ㎍.

본 실시예에서 리포좀 내 EPO의 인캡슐레이션을 위한 교차 흐름 주입 방법은 pH 7.5 및 50℃의 온도에서 수행되었으며, 리포좀 보유액 1 ㎖ 당 1522 ㎍의 약물에 대응하는 90%의 약물 포함을 결과하였다.

더욱 일반적으로, 본 방법 또는 이와 동등한 방법, 즉 선택적으로 리포좀 막에 대한 약물의 공유 결합을 포함하는(리포좀의 수용성 내부 약물의 수동 포함에 부가하여) 준비된 부착을 허용하는 지질의 적절한 선택에 의한, 요구되는 약물을 갖는 리포좀의 조합된 수동 및 능동 부과 방법은 전형적으로 최초 제공된 약물의 용량과 비교하여, 약 80 내지 100 중량% 범위의 부과 비율을 결과할 것이다.

실시예 3 : 상이한 약물의 조합

수용성 상이 3500 ㎍의 rhSOD를 포함하는 점을 제외하고, 실시예 2가 반복되었다. 여과 이후, 리포좀 보유액은 약 25 %(보유액 2㎖ 당 약 820 ㎍)의 rhSOD 및 약 70%( 보유액 2 ㎖ 당 약 2200 ㎍)의 EPO를 포함하였으며, 약물의 잔여량이 여과액 내에 감지되었다.

본 실시예는 심지어 동시에 서로 다른 두 개의 약물을 사용할 때 "초부과(superload)" 리포좀을 가능하게 하는 점을 실증한다. 예상한 바와 같이 리포좀의 내부 수용성 공간이 제공되는 전체 rhSOD의 약 25 중량%를 흡수할 수 있으며, 또한 리포좀은 제2 약물, 즉 EPO의 많은 용량(약 70 중량%)을 흡수할 수 있었다. 이는 제2 약물과 리포좀 막의 EPG 지질 단편 사이의 상호작용 때문에 가능하며, 이는 리포좀 소포체의 수용성 내부에서의 수동 포함의 일정한 확장(본원에서 별도로 정량화되지 않음)에 부가하여 리포좀 막 내 상기 지질 단편에 대한 상기 약물의 부착을 결과한다.

본원에 개시된 실험 및 추가 실험(데이터는 제시되지 않음)은 약물-포함 수용성 상의 전통적인 수동 포함(passive inclusion)보다 뛰어난 본원발명에 따르는 능동 부과의 우수성을 인상깊게 나타내었다. 실제로 본원발명의 능동 부과 방법, 특히 조합된 능동 및 수동 부과 방법은 수용성 상의 포획된 부피에 따라 이론적으 로 기대되는 용량의 최대 200%의 용량으로 약물이 부과된 리포좀을 수득하였다.

본원발명의 따르는 수용성 상으로부터 수확된 매우 농축된 리포좀 현탁액은 ㎖ 당 약 0.5 - 2 ㎎의 약물을 포함한다. 후속하여 경구 또는 비경구 적용, 특히 근육(intramuscular), 정맥(intravenous), 피하(subcutaneous), 피부(cutaneous), 점막내(intramucosal), 비강내(intranasal), 또는 폐내(intrapulmonary) 투여를 위한 제약학적 조성물 및 일반적인 고체, 액체 또는 반-액체 의학적 조제품으로 재희석 및/또는 조제될 수 있다.

Claims (34)

1. 리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하는 약물 전달을 위한 리포좀에 있어서, 상기 약물은 당단백질이거나 또는 올리고당 또는 다당류 부분(moiety)을 가지며 상기 리포좀은 리포좀 막(liposomal membrane)의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 또다른 약물 분자를 더욱 포함함을 특징으로 하는 리포좀.
2. 제 1항에 있어서, 막(membrane)에 대한 약물 분자의 부착 없이 수용성 내부에서 상기 약물의 수동 포함(passive inclusion)에 의해 달성할 수 있는 최대 약물 부과(load)를 초과하는 용량으로 상기 약물 분자가 존재함을 특징으로 하는 리포좀.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 전형적으로 약물과 지질 분자 사이의, 반 데르 발스 힘, 수소 다리 정전기력(hydrogen bridges electrostatic force), 친수성-소수성 상호작용(hydrophilic-hydrophobic interaction), 친화력(affinity force), 및 극성 상호작용(polar interaction)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 한가지 이상의 접착력(adhesion force)을 포함하는, 화학 결합에 의한 공유결합 또는 화학 결합 이외의 접착력에 의한 비-공유성 부착을 통하여 적어도 약물 분자의 일부가 막에 부착됨을 특징으로 하는 리포좀.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 부착은 지질의 반응성 작용기와 약물의 작용기 사이에서 일어남을 특징으로 하는 리포좀.
5. 제 4항에 있어서, 지질의 작용기는 하이드록실 또는 콜린 그룹임을 특징으로하는 리포좀.
6. 제 5항에 있어서, 상기 하이드록실 그룹은 다가(polyvalent) 알코올 잔류물의 일부임을 특징으로 하는 리포좀.
7. 제 6항에 있어서, 상기 다가(polyvalent) 알코올 잔류물은 글리세롤 잔류물 및 이노시톨 잔류물로 구성된 그룹으로부터 선택된 당(sugar) 알코올 잔류물임을 특징으로 하는 리포좀.
8. 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 약물의 반응성 작용기는 인산 잔류물, 황산 잔류물, 탄산 잔류물, 및 시알산(sialic acid) 잔류물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 산성 그룹이며, 약물의 적어도 일부는 막 지질에 부착되며, 선택적으로 에스테르 결합에 의해 지질에 공유결합됨을 특징으로 하는 리포좀.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질 또는 올리고- 또는 다당류 부분(moiety)은 하나 이상의 반응성 시알산 그룹을 포함함을 특징으로 하는 리포좀.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 인지질, 글리코지질(glykolipid), 세라마이드, 및 이러한 지질의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 천연 또는 비-천연 지질을 포함함을 특징으로 하는 리포좀.
11. 제 10항에 있어서, 상기 인지질은 스핑고인지질 및 글리세로인지질로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 스핑고인지질은 스핑고미엘린을 포함하며 글리세로인지질은 레시틴, 케팔린, 카르디올리핀, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 포함함을 특징으로 하는 리포좀.
12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 글리코지질(glykolipid)은 글리코스핑고지질 및 글리코글리세로지질로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 글리코스핑고지질은 세레브로시드, 갱글리오사이드, 설파타이드를 포함하며, 글리코글리세로지질은 글리코실모노글리세리드 및 글리코실디글리세리드를 포함함을 특징으로 하는 리포좀.
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 7 : 2 : 1의 몰 비율로 DPPC, 콜레스테롤, 및 EPG를 포함함을 특징으로 하는 리포좀.
14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 에리트로포이에틴임을 특징으로 하는 리포좀.
15. 경구 또는 비경구 투여를 위한 제약학적으로 수용 가능한 담체와 함께, 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 정의된 약물-부과된 리포좀을 포함하는 제약학적 조성물.
16. 제 15항에 있어서, 주사액, 나잘 스프레이(nasal spray), 흡입 액체, 크림(cream), 겔, 연고(ointment), 좌약, 또는 로션(lotion) 형태인 제약학적 조성물.
17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 국부부위(topic) 또는 온몸의(systemic) 비경구 투여를 위한 제약학적 조성물.
18. - 유기 용매 내의 지질 상을 제공하는 단계, 여기서 지질 상은 하나 이상의 지질 단편을 포함하고 각각의 지질 분자는 하나 이상의 반응성 작용기를 가지며;

    - 완충용액, 및 당단백질이거나 또는 올리고당 또는 다당류 부분(moiety)을 가지며 완충용액에 용해된 하나 이상의 요구되는 약물을 포함하는 수용성 상을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 약물은 지질의 작용기에 부착 가능하거나 또는 지질의 작용기와 화학적으로 반응가능한 반응성 작용기를 가지며;

    - 리포좀의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 지질 상을 상기 수용성 상에 공급하는 단계;

    - 선택적으로 리포좀에 의한 약물 업테이크(uptake)의 효율을 증가시키기 위하여 루프(loop) 내에서 수용성 상을 순환시키고 상기 공급 단계를 반복하는 단계; 및

    - 약물-부과된 리포좀을 수확하는 단계

    를 포함하는,

    리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하고 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 또다른 약물 분자를 더욱 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법에 있어서, 약물 분자의 적어도 일부는 리포좀 내에 편입되며 약물 분자의 또다른 일부는 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착되는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 지질의 작용기는 하이드록실 또는 콜린 그룹인 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 하이드록실 그룹은 다가(polyvalent) 알코올 잔류물의 일부인 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 다가(polyvalent) 알코올 잔류물은 글리세롤 잔류물 및 이노시톨 잔류물로 구성된 그룹으로부터 선택된 당(sugar) 알코올 잔류물인 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 약물의 반응성 작용기는 인산 잔류물, 황산 잔류물, 탄산 잔류물, 및 시알산 잔류물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 산성 그룹인 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
23. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 작용기가 있는 상기 지질의 적어도 일부와 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 지질 상이 수용성 상으로 공급되는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 지질 작용기는 하이드록실 그룹이고 상기 약물 작용기는 산성 잔류물이며 여기서 상호작용을 허용하는 조건은 25 내지 65℃의 반응 온도 및 수용성 상의 pH 6 내지 8에서 지질 상을 수용성 상에 공급하는 단계를 포함하며, 그 결과 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부가 작용기를 갖는 상기 지질의 적어도 일부에 부착되고 선택적으로 에스테르화에 의해 공유결합되는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
25. - 유기 용매 내의 또는 건조 필름으로서의 지질 상을 제공하는 단계, 여기서 지질 상은 하나 이상의 지질 단편을 포함하고 각각의 지질 분자는 하나 이상의 반응성 작용기를 가지며;

    - 완충용액을 포함하는 제1 수용성 상을 제공하는 단계;

    - 완충용액, 및 당단백질이거나 또는 올리고당 또는 다당류 부분(moiety)을 가지며 완충용액에 용해된 하나 이상의 요구되는 약물을 포함하는 제2 수용성 상을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 약물은 지질의 작용기에 부착 가능하거나 또는 지질의 작용기와 화학적으로 반응가능한 반응성 작용기를 가지며;

    - 리포좀의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 지질 상과 상기 제1 수용성 상을 조합하는 단계;

    - 약물 분자의 적어도 일부를 리포좀 내로 업테이크 가능하게 하는 조건 및 반응성 작용기가 있는 상기 지질의 적어도 일부와 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부의 상호작용, 선택적으로 화학 반응을 허용하는 조건 하에서, 상기 형성된 리포좀과 제2 수용성 상을 조합하는 단계; 및

    - 약물-부과된 리포좀을 수확하는 단계

    를 포함하는,

    리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하고, 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 또다른 약물 분자를 더욱 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법에 있어서, 약물 분자의 적어도 일부는 리포좀 내에 편입되며 약물 분자의 또다른 일부는 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착되는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
26. 제 25항에 있어서, 상기 지질 작용기는 하이드록실 그룹이고 상기 약물 작용기는 산성 잔류물이며 여기서 상호작용, 선택적으로 화학 반응을 허용하는 조건은 25 내지 65℃의 반응 온도 및 제2 수용성 상의 pH 6 내지 8에서 리포좀과 제2 수용성 상을 조합하는 단계, 및 반응성 작용기를 함유하는 상기 약물 분자의 적어도 일부가 작용기를 갖는 상기 지질의 적어도 일부에 부착되고 선택적으로 에스테르화에 의해 공유결합될 때까지 결과물인 리포좀 현탁액을 배양하는 단계를 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
27. 제 26항에 있어서, 배양하는 동안 또는 그 이후에 리포좀 현탁액은 리포좀 내로의 약물 업테이크(uptake) 강화를 의한 추가적 처리를 겪으며, 여기서 처리는 바람직하게는 초음파분해(sonication), 전기천공(electroporation), 와동(vortexing), 및 구배-추진 막 확산(gradient-driven transmembrane diffusion)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
28. 제 18항 내지 27항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질 또는 올리고- 또는 다당류 부분(moiety)은 하나 이상의 반응성 시알산 그룹을 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
29. 제 18항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 상은 인지질, 글리코 지질(glykolipid), 세라마이드, 및 이러한 지질의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 천연 또는 비-천연 지질을 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
30. 제 18항 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 상은 7 : 2 : 1의 몰 비율로 DPPC, 콜레스테롤, 및 EPG를 포함하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
31. 제 18항 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 하에서 그리고 본질적으로 무-전단(shear-free) 조건 하에서, 즉석의 및 동시의 리포좀 형성을 허용하는 교차 흐름 주사 기술(cross-flow injection technique)을 사용하여 지질 상이 수용성 상으로 공급되는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
32. 제 18항 내지 31항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 상이 수용성 상에 공급되기 이전에 지질 상의 적어도 일부의 지질이 요구되는 약물 분자의 적어도 일부에 부착되며, 선택적으로 공유결합되는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
33. 제 32항에 있어서, 상기 공유 결합은 에스테르 결합인 약물-부과된 리포좀 제조 방법.
34. 제 18항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요구되는 약물은 에리트로 포이에틴임을 특징으로 하는 약물-부과된 리포좀 제조 방법.