KR20070023832A

KR20070023832A - ＧＣＰ-Ⅱ를 유효성분으로 함유하는 β-아밀로이드의 뇌내축적 예방 및 치료용 약학적 조성물과 치료제 스크리닝용조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20070023832A
Application number: KR1020050077372A
Authority: KR
Inventors: 안상미; 서소영; 채산숙
Original assignee: 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date: 2005-08-23
Filing date: 2005-08-23
Publication date: 2007-03-02
Also published as: US7846910B2; JP2009506026A; US20080305099A1; WO2007024097A1; KR100851035B1; JP4800387B2

Abstract

본 발명은 GCP-II를 유효성분으로 함유하는 β-아밀로이드(β-Amyloid, Aβ)의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물과 치료제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 GCP-Ⅱ는 Aβ의 모노머 및 올리고머 형태 뿐만 아니라 용해성 및 불용성 형태, 그리고 응집된 형태로 변환된 Aβ도 분해하는 효과를 가지고 있으므로, Aβ가 뇌내에 축적되는 것을 방지 또는 제거함으로써 최종적으로는 알츠하이머 질환 및 다운 증후군등의 질병 치료에 이용할 수 있다.

Description

ＧＣＰ-Ⅱ를 유효성분으로 함유하는 β-아밀로이드의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물과 치료제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법{Pharmaceutical composition and composition for screening therapeutics to preventing and treating of β-amyloid accumulation in brain comprising GCP-Ⅱ(Glutamate carboxypeptidase-Ⅱ) as an active ingredient, method for screening using said composition}

도 1은 GCP-Ⅱ가 과발현된 세포에서 Aβ의 분해 정도를 NEP(neprilysin) 또는 IDE(insulin degrading enzyme)가 과발현된 세포와 비교한 결과로서, 도 1의 A는 GCP-Ⅱ 및 NEP과 IDE를 과발현시킨 HEK293 세포에 합성된 Aβ₄₀을 반응시킨 다음 ELISA 분석 키트(IBL)를 이용하여 배지에 남아있는 Aβ의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 1의 B는 상기와 동일한 세포에 합성된 Aβ₄₂를 반응시킨 다음 배지에 남아있는 Aβ₄₂의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 1의 C는 HEK293 세포에서 항-GCP-Ⅱ, 항-NEP 항체로 웨스턴 블랏팅(western blotting)하여 GCP-Ⅱ, NEP의 발현 정도를 나타낸 것이고,

도 2는 렌티바이러스(Lenti-virus)를 이용하여 GCP-Ⅱ를 과발현시킨 대뇌 피 질 세포에서 Aβ가 분해되는 정도를 ELISA 분석으로 측정한 것이고,

도 3은 RNAi 방법에 의하여 세포내 생리적으로 발현되는 GCP-Ⅱ가 제거된 세포 배양액에서 축적된 Aβ를 측정한 결과로서, 도 3의 A는 GCP-Ⅱ 넉다운안정된 세포(knock-down stable cell)에서 siGCP-Ⅱ 유전자 서열을 이용하여 GCP-Ⅱ의 발현 감소 여부를 RT-PCR을 이용하여 확인한 결과이며, 도 3의 B는 상기 siGCP-Ⅱ 넉다운 안정 세포와 합성된 Aβ를 반응시킨 후 ELISA 분석으로 배지내에 남아있는 Aβ의 양을 측정한 결과이고,

도 4는 재조합 GCP-Ⅱ(recombinant GCP-Ⅱ, 이하 'rGCP-Ⅱ'라 칭함)에 관한 것으로서, 도 4의 A는 곤충 세포(Sf21)를 이용하여 GCP-Ⅱ를 정제하여 쿠마시 염색 및 웨스턴 블랏으로 확인한 것이며, 도 4의 B는 정제한 rGCP-Ⅱ의 효소 활성을 나타내는 Km 값을 측정한 결과이고,

도 5는 rGCP-Ⅱ가 Aβ를 분해하는 아미노산 서열을 MALDI-TOF를 이용하여 규명한 결과로서, 도 5의 A는 Aβ만을 MALDI-TOF로 분석한 결과이고, 도 5의 B~D는 rGCP-Ⅱ 농도에 따라 Aβ₄₀(100 ug/L)와 반응시킨 MALDI-TOF 분석 결과이며, 도 5의 E는 rGCP-Ⅱ를 끓인 후 Aβ₄₀와 반응시킴으로써 Aβ₄₀의 분해가 rGCP-Ⅱ의 효소활성에 기인함을 나타낸 것이고,

도 6은 MALDI-TOF 분석 결과 rGCPII에 의해 형성되는 Aβ분해 산물에 관한 것으로서, 도 6의 A는 rGCPII에 의한 Aβ의 분해위치를 나타내는 것이며, 도 6의 B는 Aβ가 GCP-Ⅱ에 의하여 분해되어 생산되는 여러 가지 분해산물을 도식화한 것이 고,

도 7은 rGCP-Ⅱ의 기질 특이성을 밝히기 위해 인슐린 β-체인, 아밀린 및 ACTH(Adrenocorticotropic Hormone)와 반응시킨 결과로서, 도 7의 A는 인슐린 β-체인(chain)만을 MALDI-TOF로 분석한 결과를 나타낸 것이며, 도 7의 B는 rGCP-Ⅱ와 인슐린 β-체인을 반응시킨 후 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 7의 C는 ACTH만을 MALDI-TOF로 분석한 결과를 나타낸 것이며, 도 7의 D는 rGCP-Ⅱ와 ACTH를 반응시킨 후 MALDI-TOF로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 7의 E는 아밀린만을 MALDI-TOF로 분석한 결과를 나타낸 것이며, 도 7의 F는 rGCP-Ⅱ와 아밀린을 반응시킨 후 MALDI-TOF로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 8은 rGCP-Ⅱ가 세포에서 분비된 Aβ를 분해하는지 규명한 결과로서, 도 8의 A는 Aβ를 과량으로 형성하는 ^swAPP(Swedish mutant APP) 과발현 안정 세포주에서 APP의 발현 정도를 나타낸 결과이며, 도 8의 B는 상기 세포의 배양액을 수거 후, rGCP-Ⅱ와 반응시켜 ELISA 분석으로 남은 Aβ의 양을 나타낸 것이고,

도 9는 다양한 형태의 Aβ가 GCP-Ⅱ에 의해 분해됨을 나타낸 결과로서, 도 9의 A는 GCP-Ⅱ의 농도에 따른 올리고머 Aβ및 모노머 Aβ의 분해를 나타내는 웨스턴 블랏 결과이며, 도 9의 B는 올리고머 Aβ및 모노머 Aβ의 분해 실험을 5회 이상 실시하여 그의 웨스턴 블랏팅 결과를 이미지 분석 프로그램을 이용하여 정량한 결과이고,

도 10은 용해성 Aβ및 불용성 Aβ가 GCP-Ⅱ에 의해 분해됨을 나타낸 결과로 서, 도 10의 A는 용해성 Aβ및 불용성 Aβ의 분해를 나타내는 결과이며, 도 10의 B는 GCP-Ⅱ에 의하여 용해성 Aβ및 불용성 Aβ가 분해됨을 도식화한 것이고,

도 11은 rGCP-Ⅱ와 응집된 Aβ를 반응시킨 후 변화된 응집 Aβ의 양을 콩고 레드(congo-red) 방법을 이용하여 나타낸 결과이다.

본 발명은 GCP-Ⅱ(glutamate carboxypeptidase-Ⅱ)를 유효성분으로 함유하는 β-아밀로이드(β-Amyloid, 이하 'Aβ'로 약칭함)의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물과 치료제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

빠른 경제적 성장을 이룬 우리나라의 경우 노인인구의 증가와 함께 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매가 사회적 문제로 대두되고 있다. 현재 알츠하이머병으로 인한 사회 경제적 부담은 매우 크며 점점 증가하는 추세를 보이고 있다.

알츠하이머 질병(Alzheimer's Disease, 이하 'AD'로 약칭함)은 병리학적으로 뇌의 Aβ축적에 의하여 나타나는 가장 우세한 신경 퇴행성 질환이다. Aβ합성과 제거의 불균형은 Aβ축적 또는 노인성 플라크를 나타내게 된다(Geula C. et al., Nat. Med., 4, 827-831(1998)). 알츠하이머성 치매는 막연히 일반인들이 생각하는 것과는 달리 유전적인 변이에 의하여 발병하는 가족성 알츠하이머병(familial AD, FAD)과 그 원인이 아직 파악되지 않은 산발성 알츠하이머병(sporadic AD, SAD)으로 나눌 수 있다. 가족성 AD의 경우는 전체 AD환자의 5-10% 정도를 차지하고 있으며 대부분의 경우가 산발성 AD 환자이다. 가족성 AD의 원인 유전인자로는 염색체 14번에 위치한 프레세닐린 1(presenilin 1, 이하 'PS1'로 약칭함) 유전인자, 염색체 21번에 위치한 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, 이하 'APP'로 약칭함) 유전인자, 염색체 1번에 위치한 프레세닐린 2(presenilin 2, 이하 'PS2'로 약칭함) 유전인자가 알려져 있다.

가족성 AD 환자에서 보이는 APP 돌연변이 유전인자를 과량 발현하는 APP 과발현 형질 전환 쥐(transgenic mice)의 경우 AD 환자에서 보이는 노인 반점이 보였으며 AD환자의 특이적 증상인 공간지각 학습능력이 저하되는 결과를 나타내었다. 또한, 정상 PS1 단백질이 과다 발현되었을 경우는 Aβ의 생성에 별 변화가 없었으나 PS1 유전인자에 돌연변이가 일어난 단백질을 과발현한 형질전환 쥐의 경우 AD환자에서 많이 발견되어지는 형태의 Aβ가 과량 생성되는 것을 알 수 있었다. 이러한 여러 가지 보고들을 종합하여 볼 때 가족성 AD 환자에서 보이는 APP 유전인자의 변이는 Aβ의 과량생성과 밀접하게 연결되며 AD의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 인식되고 있다.

가족성 AD에서 Aβ의 과량 생성과 관련된 유전자인 APP 및 PS 1, 2에 관한 연구는 활발한 반면, 노화에 따른 Aβ의 분해 저하와 관련된 연구는 미진해왔다. 최근, 세포 혹은 동물실험에서 네프릴라이신(neprilysin, 이하 'NEP'로 약칭함)이 나 인슐린 분해 효소(insulin degrading enzyme, 이하 'IDE'로 약칭함)의 활성을 저해하면 Aβ가 과량 축적되는 것을 보임으로써, Aβ를 분해하는 유전자의 발현 및 기능 저하가 노화된 뇌에서의 Aβ축적에 주요인인 것으로 사료된다. 또한, NEP 또는 IDE를 과량 발현시킨 유전자 전이 쥐(transgenic mouse)를 Aβ를 과량 생산하는 쥐와 교배하면 NEP 혹은 IDE에 의해 Aβ가 분해되는 것을 발견할 수 있었다.

이러한 Aβ를 분해할 수 있는 효소들의 활성화는 가족성 AD 뿐만 아니라 노화에 따라 증가되는 Aβ를 분해시킴으로써 AD치료에 중요한 타겟이 될 수 있으나, 실제 이들 단백질 분해 효소들이 응집된 Aβ도 분해할 수 있는지에 관하여는 여러 가지 의견들이 서로 대립되고 있으며, 이들 단백질 분해효소들이 과량 발현되는 유전자 형질전이 쥐들에서도 Aβ가 다량 남아 있음으로Aβ를 분해할 수 있는 다른 단백질 분해효소가 존재할 것으로 사료된다.

지금까지 알츠하이머 질병등을 예방 및 치료를 위하여 많은 노력이 시도되었는데, 그 예로서, Aβ응집 또는 축적 억제를 위하여 Aβ펩티드를 이용한 비-자가 항원 백신(WO 2001/39796), VEGF의 Aβ와의 결합을 억제하기 위하여 VEGF 폴리펩티드를 이용한 Aβ격리 화합물(WO 2003/055910), 다운증후군 및 알츠하이머 유형의 노인성 치매 치료에 쓰이는 화합물을 기반으로 한 Aβ코어 단백질의 생성 및 플라크 형성을 억제시키는 화합물(WO 1995/09838)등을 이용하여 알츠하이머 질병을 극복하고자 많은 시도가 있어왔다.

본 발명자들은 Aβ를 분해하는 효소를 찾기 위해 꾸준한 노력을 경주해 왔으며, 박테리아로부터 분리한 Aβ응집을 억제하는 단백질에 대해 특허를 출원한 바 있다(공개번호 제 10-2005-000007102호).

본 발명에서는 인간 단백질 중 Aβ를 분해하는 효소를 찾기 위한 노력으로 상기 특허의 Aβ분해 단백질인 AABA(amyloid peptide aggregation inhibitory activity)와 유전자 서열이 유사한 여러 인간 발현 단백질 중 GCP-Ⅱ를 후보 유전자로 하여 풀 클로닝(full cloning)하여 생물학적, 생화학적 성질을 밝혀 이를 더욱 유용하게 이용하고자 하였다. 그 결과, 본 발명의 GCP-Ⅱ는 Aβ의 모노머 및 올리고머 형태뿐만 아니라 용해성 및 불용성 형태, 그리고 응집된 형태로 변환된 Aβ도 분해하는 효과를 가진다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GCP-Ⅱ를 유효성분으로 함유하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물과 치료제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 위하여,

본 발명은 GCP-Ⅱ 단백질을 유효성분으로 함유하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 GCP-Ⅱ 유전자를 포함하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 GCP-Ⅱ 단백질을 포함하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

i) 상기 GCP-Ⅱ 유전자를 포함하는 조성물을 시험 대상 물질과 접촉시키는 단계; 및

ii) 단계 i)의 반응을 확인하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 Aβ뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

i) 상기 GCP-Ⅱ 단백질을 포함하는 조성물을 시험 대상 물질과 접촉시키는 단계; 및

또한, 본 발명은 GCP-Ⅱ가 발현되는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 Aβ뇌내 축적 예방 및 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 콩고 레드 분석(Congo red assay)에 의하여 아밀로이드 펩타 이드의 응집을 감소시키는 활성을 가지는 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.)으로부터 박테리아성 아미노펩티다제(aminopeptidase)를 발굴하였다. 그 결과 획득된 단백질을 ABBA(Amyloid peptide aggregation blocking activity)라고 명명하였으며, 상기 발명은 대한민국 특허출원 공개번호 제 10-2005-000007102호에 자세히 기재되어 있다.

인간 게놈 데이타베이스를 검색하여 스트렙토마이세스 종으로부터 분리된 ABBA와 높은 상동성을 가지는 여러 포유류 아미노펩티다제(aminopeptidase)를 찾았다. 그 중 하나가 카르복시펩티다제(carboxypeptidase) 활성을 가지는 인간 GCP-Ⅱ이다.

GCP-Ⅱ는 인체의 여러 장기에서 발현되는 막관통 금속 단백질 분해 효소(transmembrane metalloproteinase)로서 식이에서 섭취된 폴레이트(folate)를 장에서 흡수할 수 있는 형태로 만드는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Halsted et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 20417-24; Ghosh et al., 2003, Prostate, 57, 140-151). 뇌에서의 GCP-Ⅱ의 역할은 허혈성 질환에서 NAAG(N-acetyl aspartyl glutamate)라는 글루탐산 신경전달물질(glutamate neurotransmitter) 전구체로부터 글루탐산(glutamate)을 형성하는데 관여하는 것으로 알려져 있으나 외국의 서로 다른 두 실험실에서 제작한 GCP-Ⅱ를 제거한 쥐(GCP-Ⅱ knockout mice)가 태아가 사망하거나 (Tsai et al., 2003, Synapse, 285-92, 2003) 또는 전혀 형질 변화를 보이지 않아 (Bacich et al., 2002, J.Neurochem., 83, 20-9) 아직까지 GCP-Ⅱ의 뇌에서의 생리적 기능은 정확히 확인할 수 없었다. 그러나, GCP-Ⅱ의 발현 저해제를 뇌졸중 모델(stroke model) 마우스에 투여하면 뇌의 세포사를 줄이는 것으로 보고되어 (Slusher et al., 1999, Nat. Med. 5, 1396-402; Tortella et al., 2000, Eur. J. Pharmacol., 402, 31-7) GCP-Ⅱ에 의한 과량의 글루탐산 생성이 신경세포에 유해한 작용을 하는 것으로 사료된다.

본 발명자들은 GCP-Ⅱ의 Aβ분해 정도를 측정하기 위해 합성된 Aβ₄₀(도 1의 A) 또는 Aβ₄₂(도 1의 B)를 GCP-Ⅱ를 과발현시킨 HEK293 세포 및 기존의 Aβ를 분해하는 효소로 알려진 NEP와 IDE가 과발현된 HEK293의 세포 배양액에 넣고 반응시켜 ELISA 분석으로 배지에 남아있는 Aβ의 양을 측정한 결과, GCP-Ⅱ를 과발현시킨 세포에서 세포 배양액에 남아있는 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂의 양은 목 벡터(mock vector)를 트랜스펙션시킨 세포의 배양액에 남아있는 양보다 30% 감소되는 것으로 나타나 GCP-Ⅱ의 효과는 NEP나 IDE가 Aβ를 분해하는 정도와 유사함을 보여주었다.

또한, GCP-Ⅱ의 Aβ분해 효과가 대뇌세포에서도 일어나는지 알아보기 위한 실험으로 렌티바이러스(Lenti-virus)를 이용하여 일차 대뇌세포(primary cortical cells)에 GCP-Ⅱ를 과발현시킨 후 Aβ가 분해되는 정도를 알아본 결과, GCP-Ⅱ는 일차 대뇌세포에서 Aβ를 90% 이상 분해하는 것으로 나타나 실제 Aβ가 축적되는 대뇌세포에서 GCP-Ⅱ가 효율적으로 Aβ를 분해함을 보여주었다(도 2).

실험적으로 GCP-Ⅱ를 과발현시킨 세포에서뿐만 아니라 생리적 수준에서 GCP-Ⅱ가 실제로 합성 Aβ를 분해할 수 있는지 확인하기 위하여 siRNA방법으로 GCP-Ⅱ의 발현을 차단한 세포주에 합성된 Aβ를 첨가하여 ELISA 분석으로 배지 내에 남아 있는 Aβ의 양을 측정하였으며, 배양 후 남은 공벡터(empty vector)를 포함하는 GCP-Ⅱ를 발현하는 세포주에서의 Aβ수준과 비교하였을 때, 상기 siRNA 세포주에 의한 Aβ의 분해가 대조군에 비해 감소되는 것으로 나타나 GCP-Ⅱ가 생리적으로 생성된 Aβ를 감소시킬 수 있음을 보여 주었다(도 3).

더불어, Aβ가 GCP-Ⅱ에 의해 분해되는 아미노산 위치를 알기 위해 재조합 GCP-Ⅱ 단백질(이하 'rGCP-Ⅱ'로 약칭함)을 제작(도 4의 A)하여 효소 활성 정도를 측정한 후(도 4의 B), Aβ및 rGCP-Ⅱ 단백질과 반응시킨 Aβ를 MALDI-TOF 방법으로 분해된 펩타이드를 확인하였고(도 5의 A~D), 끓여서 단백질의 활성을 없앤 GCP-Ⅱ와 Aβ를 반응시키면 Aβ가 분해되지 않음을 확인함으로써 GCP-Ⅱ의 Aβ분해 작용은 GCP-Ⅱ의 효소활성에 기인함을 입증하였다(도 5의 E). 또한, 상기 MALDI-TOF 분석에 의하여 획득한 Aβ₁₈, Aβ₁₉, Aβ₂₀, Aβ₂₁, Aβ₂₂, Aβ₂₅, Aβ₂₉ 및 Aβ₃₅ 단편으로 Aβ의 분해 위치를 확인하였으며, 특히 Aβ₁₈이 rhGCP-Ⅱ에 의한 주요 분해 단편으로 판명되었다(도 6).

GCP-Ⅱ가 Aβ를 특이적으로 분해한다는 것을 보여주는 실험으로 아밀린 및 ACTH(adrenocorticotropic hormone), 인슐린 β-체인(chain)과 GCP-Ⅱ를 반응시킨 후 분자량 분석기로 각 시료의 분자량을 측정한 결과, 인슐린 β-체인(도 7의 A, B)과 ACTH(도 7의 C, D)는 GCP-Ⅱ에 의하여 분해되지 않는 기질 특이성을 지니고 있다는 것을 알 수 있는 반면, 아밀린의 경우 GCP-Ⅱ와 반응시키면 1500 및 2000에서 두 개의 피크(peak)가 나타나(도 7의 E, F), 상기 결과는 GCP-Ⅱ가 Aβ혹은 아 밀린과 같은 아밀로이드 생성(amylodoigenic) 단백질에 대하여 특이성이 있음을 확인하였다. IDE도 아밀린을 분해한다는 보고(Benette et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 36621-5) 가 있어 GCP-Ⅱ의 아밀린 분해는 응집 독성을 지닌 기질을 분해하는 중요 효소임을 보여주는 결과이다.

합성 Aβ뿐만 아니라 실제 세포에서 형성된 Aβ에 대한 GCP-Ⅱ의 분해효과를 알아보기 위하여 Aβ가 과량으로 형성되는 ^swAPP(Swedish mutant APP) 유전자를 안정하게 발현하는 HEK293 세포주를 제작한 후 배지를 수거하여 rGCP-Ⅱ 단백질과 반응시키고 배지에 남아 있는 Aβ의 양을 ELISA로 측정한 결과, 상기 ^swAPP 안정 세포의 배지와 여러 농도의 rGCP-Ⅱ를 첨가하여 배양하였을 때, 생리적으로 생성된 Aβ₄₂의 농도가 감소하였다. 이는 rGCP-Ⅱ가 생리적으로 생성된 Aβ도 분해시킨다는 것을 나타낸다(도 8).

또한, Aβ의 모노머(monomer) 및 멀티머(multimer)에 대한 GCP-Ⅱ의 분해 효과를 알아보기 위하여 7일간 성숙된 Aβ를 rGCP-Ⅱ와 반응시키고, 웨스턴 블랏팅을 실시한 후 이미지 프로그램으로 정량하였다. 그 결과, GCP-Ⅱ의 농도를 증가시키면서 Aβ와 반응시키면 모노머 형태보다 올리고머(또는 멀티머) 형태의 Aβ가 더 빨리 감소됨을 관찰하였고, 따라서, GCP-Ⅱ는 신경세포에 유해한 올리고머 형태의 Aβ를 효율적으로 분해함을 알 수 있었다(도 9).

Aβ₄₀의 다양한 형태가 인간 GCP-Ⅱ에 의하여 더 쉽게 분해되는지 확인하기 위하여 Aβ를 용해성 또는 불용성으로 분획한 후 rGCP-Ⅱ와 함께 배양한 결과, rGCP-Ⅱ는 불용성 Aβ₄₀은 35% 감소시켰으며, 용해성 Aβ₄₀은 20% 감소시켰다(도 10의 A). 이로써, 본 발명의 GCP-Ⅱ는 불용성 Aβ에도 활성을 나타냄으로써 축적된 Aβ를 더욱 효율적으로 분해할 수 있음을 나타냄을 알 수 있다(도 10의 B).

응집된 Aβ에 대한 rGCP-Ⅱ의 분해 효과를 확인하기 위하여 21일간 응집된 Aβ를 rGCP-Ⅱ 단백질과 반응시킨 후 변화된 응집 Aβ의 양을 콩고 레드 방법으로 측정한 결과, Aβ가 rGCP-Ⅱ에 의해 분해됨으로써 그 응집 핵 서열(aggregation core sequence)을 잃은 Aβ단편을 생성하였음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 GCP-Ⅱ는 투여한 농도에 비례하여 Cb 값이 감소되는 것을 보임으로써 GCP-Ⅱ가 다양한 형태의 Aβ를 분해할 수 있으며, 특히 GCP-Ⅱ는 응집된 Aβ를 더욱 효율적으로 분해될 수 있음을 보여 주었다(도 11).

본 발명의 GCP-Ⅱ 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고, 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 GCP-Ⅱ 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 GCP-Ⅱ 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제등이 될 수 있다.

본 발명의 GCP-Ⅱ 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물의 투여 방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장 또는 경구 투여를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 GCP-Ⅱ 단백질을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, GCP-Ⅱ 단백질을 1일 1회 내지 수회 투 여시, 0.1μg/kg ~ 0.1g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료용 조성물은 AD 치료를 위하여 단독으로, 또는 호르몬 치료, 약물치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 인간 GCP-Ⅱ 유전자를 포함하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 상기 인간 GCP-Ⅱ 유전자는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열, 서열번호 1 또는 이의 다형현상을 포함하는 유전자 단편 염기서열 중에서 1종 이상을 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 GCP-Ⅱ 단백질을 포함하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 상기 GCP-Ⅱ 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열 중에서 선택된 하나로부터 발현된 단백질, GCP-Ⅱ와 동등한 생리적 활성을 나타내는 GCP-Ⅱ 폴리펩티드 단편 중 1종 이상을 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은

본 발명의 스크리닝 방법에서 GCP-Ⅱ 유전자를 포함하는 조성물과 시험 대상 물질간의 반응 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 및 DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.

예를 들면, 시험관 내(in vitro)에서 상기 유전자와 시험 대상 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류 세포와 시험 대상 물질을 반응시킨 후 노던 블랏 분석(northern blot assay), 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포내로 도입한 후 시험 대상 물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다.

이러한 경우 본 발명의 조성물은 GCP-Ⅱ 유전자 외에도 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 GCP-Ⅱ 단백질을 포함하는 조성물과 시험 대상 물질간의 반응 확인은 단백질-단백질 및 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.

예를 들면, GCP-Ⅱ 유전자 또는 GCP-Ⅱ 단백질과 시험 대상 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), GCP-Ⅱ 단백질에 결합하는 파지-디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high troughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포기반 스크리닝(cell-based screeing) 또는 DNA 마이크로어레이(microarray)를 이용하는 스크리닝 방법등을 사용할 수 있다.

이러한 경우 본 발명의 조성물은 GCP-Ⅱ로부터 발현된 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체내(in vivo) 실험을 위하여, 상기 단백질을 발현하는 세포 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에서 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 시험 대상 물질은 통상적인 선정방식에 따라 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물 등이 될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 시험 대상 물질 및 반대로 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 시험 대상 물질은 전자의 경우 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 시험 대상 물질에 대한 억제제를 개발함으로써 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 후보물 질이 될 수 있다.

이와 같은 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 후보 물질은 이후의 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 GCP-Ⅱ 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 증진효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제를 개발할 수 있다.

상기에 의하여 얻어진 물질은 포유류의 GCP-Ⅱ 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질에 대하여 부분적 또는 완전한 활성 증진효과를 나타내게 되므로, GCP-Ⅱ 유전자 발현 억제 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 저하에 의한 Aβ의 뇌내 축적 및 그로 인해 유발되는 질환들을 억제할 수 있다.

본 발명에서는 GCP-Ⅱ를 대뇌 세포내로 전달하기 위하여 렌티바이러스를 유전자 전달체로 이용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, GCP-Ⅱ의 세포내 발현을 유도하기 위하여 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 렌티바이러스를 포함하는 레트로 바이러스 및 백시니아 바이러스등을 이용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아 니다.

< 실시예 1> GCP -Ⅱ의 Aβ분해능 측정

<1-1> GCP -Ⅱ의 발굴

인간 GCP-Ⅱ cDNA를 획득하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. pEF1/Myc(C-말단에 Myc-tag 포함, BamHI과 NotI 제한효소 사이트 이용, Invitrogen, USA) 벡터내에 삽입하기 위한 프라이머는 BamHI 제한효소를 포함하는 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 NotI 제한효소를 포함하는 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머를 사용하였으며, 하기와 같은 PCR 조건으로 반응을 수행하였다.

정방향 프라이머 : cgcggatccaccatgtggaatctccttcacgaaa(GCP-Ⅱ-1F로 칭함)

역방향 프라이머 : atttgcggccgctggctacttcactcaaagtctc(GCP-Ⅱ-IR로 칭함)

정방향 프라이머 : cgcagatctaccatgtggaatctccttcacgaaa(GCP-Ⅱ-2F로 칭함)

역방향 프라이머 : atttagatctttaggctacttcactcaaagtctc(GCP-Ⅱ-2R로 칭함)

94℃ 5분

94℃ 30초, 62 ℃ 1분, 72 ℃ 2분 : 30 회

72℃ 7분

4℃

또한, GCP-Ⅱ cDNA를 pSG5(N-말단에 HA tag 포함, BglⅡ 제한효소 사이트 이 용, Stratagene, USA)에 삽입하기 위한 프라이머는 BglⅡ 제한효소를 포함하는 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머를 사용하였으며, 상기와 같은 조건의 PCR 반응에 의하여 U87 MG(ATCC, USA) 인간 성상세포(astrocyte)로부터 인간 GCP-Ⅱ cDNA를 증폭한 후, 각 벡터내로 삽입하였으며, 이를 각각 pMyc-GCPⅡ 및 pHA-GCPⅡ로 명명하였다.

본 발명에 사용된 모든 클론들은 DNA 서열 분석(sequencing)에 의하여 확인하였다.

<1-2> GCP -Ⅱ의 Aβ분해능 측정

GCP-Ⅱ의 Aβ분해 정도를 측정하기 위해 합성 Aβ₄₀ 또는 Aβ₄₂(Biosource international INC.) 2ng/uL를 GCP-Ⅱ가 과발현되는 HEK293 세포의 배양액에 넣고 20 시간 후 ELISA 분석 키트(Biosource international INC.)를 이용하여 배지에 남아있는 Aβ의 양을 측정하였다.

GCP-Ⅱ를 과발현하는 HEK293 세포주(human embryonic kidney cell)는 상기 실시예 1-1에서 제조한 GCP-Ⅱ 발현벡터인 pHA-GCPII 또는 pmyc-GCPII를 트랜스펙션 시약(Lipofectamine Plus^TM Reagent, Invitrogen, USA)을 사용하여 HEK293 세포주에 일시적으로 도입하였으며, 상기 GCP-Ⅱ가 일시적으로 도입된 HEK293 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 100IU/ml 페니실린(penicillin) 및 100μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배 지에서 배양하였다. 상기 HEK293 세포주는 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitor : aprotinin, leupeptin, phenylmethyl sulfonyl fluoride)를 함유한 RIPA 버퍼로 세포 용해물을 획득하였고, 8% SDS-PAGE로 GCP-Ⅱ 단백질을 분리하여 GCP-Ⅱ의 발현을 확인한 후 사용하였다.

pcDNA벡터에 삽입되어 있는 NEP와 IDE 컨스트럭트는 각각 일본의 Saito(Shipp et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 4819-23)와 미국의 Selkoe교수로(Kuo et al., 1991, Mol. Endocrinol., 5, 1467-76)부터 받았으며 HEK293 세포주에 일시적인 트렌스펙션 방법으로 도입하여 발현을 확인한 후에 사용하였다.

상기 NEP와 IDE의 플라스미드를 트랜스펙션시킨 HEK293 세포를 양성 대조군으로 사용하였으며, 공벡터는 음성 대조군으로 사용하였다. 트랜스펙션된 HEK293 세포에서 인간 GCP-Ⅱ 또는 NEP의 발현 수준은 각기 항-GCP-Ⅱ 항체(MAB544B, Maine Biotechnology) 또는 항-NEP 항체(L-CD10-270, Novocastra)를 사용한 웨스턴 블랏(western blot) 분석에 의하여 확인하였다(도 1의 C).

GCP-Ⅱ를 발현하는 HEK 293 세포 배지에 남아있는 외인성 Aβ의 수준은 Aβ첨가 20시간 후 목-컨스트럭트(Mock-construct)로 트랜스펙션시킨 세포와 비교하였을 때 60 ±5% 수준으로 감소하는 것으로 나타나, GCP-Ⅱ의 효과가 기존의 Aβ를 분해하는 효소로 알려진 NEP나 IDE가 Aβ를 분해하는 정도와 유사함을 보여주었다.

< 실시예 2> 렌티바이러스를 이용한 GCP -Ⅱ를 과발현시킨 대뇌 피질 세포에서의 Aβ 분해능

GCP-Ⅱ의 Aβ분해 효과가 대뇌 피질 세포에서도 일어나는지 알아보기 위한 실험으로 렌티바이러스(Lenti-virus)를 이용하여 일차 대뇌 피질 세포(primary cortical cells)에 GCP-Ⅱ를 과발현시킨 후 Aβ가 분해되는 정도를 알아보았다(도 2). 피질 세포는 E16 쥐(Sprague-Dawley rat)로부터 분리 배양하였고, 배양의 10% 이하를 구성하는 비신경 세포의 확산을 방지하기 위해 배양 후 3-6일부터는 5-플루오로-2-데옥시유리딘(5-fluoro-2-deoxyuridine)이 들어간 24웰 플레이트(웰당 1 × 10⁵)에서 배양하였다. GCP-II를 발현하는 렌티바이러스를 제조하기 위하여 pLentiH1.2 벡터에 GCP-II를 삽입한 후(이하 pLentiH1.2-GCPⅡ라 명명함) 293T 세포주에 pLentiH1.2-GCPII 및 페키징 컨스트럭트(packaging construct)와 외피 컨스트럭트(envelope construct)를 함께 도입하여 48시간 후에 배지로 방출된 바이러스의 농도를 계산하였다.

상기 방법에 의하여 GCP-Ⅱ가 도입된 렌티 바이러스 유전자 전달체를 제조하였고, 이를 Lenti-GCP-Ⅱ로 명명하였다.

3일 동안 Lenti-GCP-Ⅱ를 감염시킨 대뇌 피질 세포는 20 시간동안 Aβ₄₀를 첨가하여 배양한 후 배지에 남아있는 Aβ를 상기 실시예 1의 ELISA 분석을 이용하여 측정하였다.

트랜스펙션된 세포에서 GCP-Ⅱ의 발현 수준은 각기 항-GCP-Ⅱ 항체(MAB544B, Maine Biotechnology)를 사용한 웨스턴 블랏(western blot) 분석에 의하여 확인하 였다.

10, 20, 50 MOI의 Lenti-GCP-Ⅱ로 감염된 대뇌 피질 세포에서 각각 Aβ의 양이 약 90% 정도 감소하는 것으로 나타나(도 2), AD환자에서 Aβ가 축적되는 부위인 대뇌 피질 세포에서 GCP-Ⅱ가 효율적으로 Aβ를 분해함을 보여주었다.

< 실시예 3> 생리적 수준에서의 RNAi 방법에 의한 GCP -Ⅱ의 Aβ분해능 검증

실험적으로 GCP-Ⅱ를 과발현시킨 세포에서뿐만 아니라 생리적 수준에서 GCP-Ⅱ가 실제로 합성 Aβ를 분해할 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 HEK293 세포주에서 siRNA방법으로 GCP-Ⅱ의 발현을 차단한 세포주, GCP-Ⅱ 넉-다운 안정 세포(knock-down stable cell)를 제작하고 합성된 Aβ를 첨가하여 16시간 후 ELISA 분석을 통해 배지 내에 남아있는 Aβ의 양을 측정하였다(도 3). 26개 염기서열로 이루어진 GCPII siRNA가 들어있는 네오마이신 저항성의 컨스트럭트를 open biosystems회사로부터 구입하여 HEK293 세포주에 트렌스펙션을 한 후 600 μg/mL 의 G418으로 셀렉션하여 GCP-Ⅱ 넉다운 안정 세포를 제작하고 RT-PCR 방법으로 siGCP-Ⅱ 효과를 확인하였다. 목-벡터를 포함하는 GCP-Ⅱ를 발현하는 대조군에 비하여 siGCP-Ⅱ에 의한 GCP-Ⅱ 넉다운 안정 세포(knock-down stable cell)에서 siGCP-Ⅱ에 의한 GCP-Ⅱ 발현 감소를 확인하였으며(도 3의 A), 특히 HEK293 세포 콜로니 중 #4-5와 #4-7에서 현격히 감소되었다.

또한, 상기 각각의 세포 배지에 Aβ를 첨가하여 20시간 동안 배양한 다음 남은 Aβ양을 비교한 결과, 목-벡터를 포함하는 GCP-Ⅱ를 발현하는 안정 세포주군의 Aβ수준에 비하여 GCP-Ⅱ 넉다운 안정 세포(knock-down stable cell)에서 약 1.7~2배 높았다(도 3의 B).

이는 상기 siRNA 세포주에 의해서 배양액에 첨가한 Aβ의 분해가 대조군에 비해 감소되는 것으로 나타나 GCP-Ⅱ가 생리적으로 Aβ를 감소시킬 수 있음을 보여 주었다.

< 실시예 4> rhGCP -Ⅱ를 이용한 GCP -Ⅱ의 Aβ분해 분석

<4-1> rGCP -Ⅱ의 제조

GCP-Ⅱ가 과발현된 세포에서 Aβ의 양이 감소되는 것이 GCP-Ⅱ에 의한 분해 작용인지 확인하고, 또한 Aβ가 GCP-Ⅱ에 의해 분해되는 아미노산 위치를 확인하기 위해 rGCP-Ⅱ 단백질을 제작하였다.

상기 실시예 1에서 제조하였던 pEF-GCP-Ⅱ를 주형으로 하여 PCR 방법으로 얻어진 절편을 제한 효소를 이용하여 배큘로바이러스(baculovirus)에서 발현을 위한 pEntrBHRNX 벡터를 BamHI과 XhoI 제한효소로 자른 후 서브클로닝하였다(Neurogenex Co., Korea). 상기 방법에 의하여 제조된 벡터를 pBHRNX-GCP-Ⅱ로 명명하였다.

곤충 세포주인 SF21(Neurogenex Co., Korea)을 숙주세포로 사용하였고, pBHRNX-GCP-Ⅱ로 감염시킨 곤충 세포에 0.1mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다.

상기 세포는 용해 버퍼(50mM NaH2PO4, pH8.0, 300mM NaCl, 10mM imidazole, 1mg/ml lysozyme, protease inhibitor cocktail)에 재부유시킨 다음 얼음에서 소니 케이션(sonication)하고 원심분리하였다. 단백질 정제 컬럼(His-Strep Ni-chelating column, Qiagen, USA)을 사용하여 원심분리로 얻어진 펠렛(pellet)을 1ml 50% Ni-NTA 슬러리와 반응시킨 후 컬럼에 로딩한 후 버퍼(50mM NaH₂PO₄, pH8.0, 300mM NaCl, 20mM imidazole)를 이용하여 3회 세척하였다. 마지막으로, rGCP-Ⅱ는 추출 버퍼(50mM NaH₂PO₄, pH8.0, 300mM NaCl)를 이용하여 추출하였으며, 쿠마시 염색(coomassie staining) 또는 웨스턴 블랏(western blot)에 의하여 분석하였다(도 4의 A).

<4-2> rGCP -Ⅱ에 의한 Aβ분해 위치 확인

Aβ분해에 대한 rGCP-Ⅱ의 기능을 확인하기 이전에 37℃, 50ng/μL rGCP-Ⅱ에 의하여 0.002~2μM N-acetyl-L-aspartyl-L-[3,4-³H] 글루타메이트(glutamate)로부터 유리된 [³H] 글루타메이트를 측정함으로써 rGCP-Ⅱ의 효소 활성을 나타내는 Km 값을 분석하였다. rGCP-Ⅱ의 효소 작용은 1.0μM N-acetyl-L-aspartyl-L-[3,4-³H]로부터 포화되었고, 그 결과 rGCP-Ⅱ의 Km 값은 0.5μM 으로 나타났다.

상기 효소 활성 정도를 측정한 후(Km=0.5μM, 도 4의 B) Aβ₄₀(100ng/L) 및 GCP-Ⅱ 단백질과 Aβ₄₀을 20시간 동안 반응시킨 다음 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption/Ionization Time of Flight)를 이용하여 분해된 펩타이드를 확인하였다(도 5의 A~D). rGCP-Ⅱ와 함께 배양한 Aβ는 샘플 프로브(probe)상에 로딩 하고, 상온에서 건조하였다. MALDI-TOF 분자량 분석기(Vayager-DE Pro mass spectrometer, Applied Biosystems, USA)에 상기 프로브를 넣고, 샘플의 분자량을 분석하여 Aβ의 분자량을 측정하였다. 또한, 끓여서 불활성화시킨 GCP-Ⅱ와 Aβ를 반응시켜 Aβ가 분해되지 않음을 확인하였다(도 5의 E).

GCP-Ⅱ와 반응하지 않은 Aβ의 분자량이 4331에서 주 피크(peak)를 보이는 반면 0.5 ng/μL의 GCP-Ⅱ와 반응시킨 Aβ에서는 3915와 2662에서 새로운 피크를 나타내었다. 이 피크에 해당하는 분자량은 Aβ₃₅와 Aβ₂₁ 펩타이드에 일치하는 크기로서, 이는 GCP-Ⅱ가 Aβ를 분해하여 나타난 산물을 의미하였다. 만일 GCP-Ⅱ의 농도를 25 ng/μL로 증가시키면 2,300-3,500에서 6~7개의 새로운 피크가 생성되나 25 ng/μL이상의 GCP-Ⅱ와 반응시키면 Aβ₁₈에 해당하는 분자량 2,167에서 하나의 주요 피크를 나타내고 GCP-Ⅱ의 양을 증가시켜도 더 이상 분해되는 펩타이드 절편은 보이지 않았다. 상기 MALDI-TOF 분석으로 Aβ의 분해 위치를 확인하였고(도 6의 A), 이를 통하여 GCP-Ⅱ에 의해 분해되는 주요 Aβ의 단편은 Aβ₁₈임을 나타내었다(도 6의 B).

<4-3> GCP -Ⅱ의 Aβ에 대한 특이성 확인

GCP-Ⅱ가 Aβ를 특이적으로 분해한다는 것을 보여주는 실험으로 아밀린 및 ACTH(adrenocorticotropic hormone), 인슐린 β-체인(chain)과 GCP-Ⅱ를 37℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 분자량 분석기로 각 시료의 분자량을 측정하였다(도 7). 인슐린 β-체인(도 7의 A, B) 및 ACTH(도 7의 C, D)는 GCP-Ⅱ에 의하여 분해되지 않는 기질 특이성을 지니고 있다는 것을 알 수 있는 반면, 아밀린의 경우 GCP-Ⅱ와 반응시키면 1500 및 2000에서 두 개의 피크(peak)가 생성되었다(도 7의 E, F).

아밀린은 신장에서 응집되어 아밀로이드 생성(amyloidogenesis)을 일으키는 단백질로서, 상기 결과는 GCP-Ⅱ는 Aβ혹은 아밀린과 같은 아밀로이드 생성(amyloidogenic) 단백질에 대하여 특이성을 지니는 것으로 나타났다. IDE도 아밀린을 분해한다는 보고(Benett et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 36621-5)가 있어 GCP-Ⅱ의 아밀린 분해는 응집 독성을 지닌 기질을 분해하는 중요 효소임을 보여주는 결과이다.

< 실시예 5> GCP -Ⅱ에 의한 세포내에서 형성된 Aβ의 분해효과 확인

본 발명에서 나타낸 인간 GCP-Ⅱ의 효과가 합성 Aβ를 사용하여 확인되었기 때문에 실제 세포에서 형성된 Aβ에 대한 GCP-Ⅱ의 분해효과를 알아보기 위하여 Aβ가 과량으로 형성되는 ^swAPP(Swedish mutant APP: database search, 합성 또는 구입처 등 이 유전자의 입수 경로 또는 방법등을 기재하여 주시기 바랍니다) 유전자를 안정하게 발현하는 세포주를 제작하기 위하여 HEK293 세포주에 ^swAPP를 트렌스펙션하고 G418으로 셀렉션한 후 배지를 수거하여 rGCP-Ⅱ 단백질과 반응시키고 배지에 남아 있는 Aβ의 양을 ELISA로 측정하였다(도 8).

Aβ₄₂ 농도 및 APP 발현 수준은 ^swAPP 안정 세포 콜로니를 선발하기 위한 기준으로 사용되었다. 여러 안정 세포 콜로니 중 #2 콜로니는 APP 발현 수준이 가장 높았으며(도 8의 A), Aβ₄₂ 농도는 생리적으로 생성된 Aβ수준에 비하여 14배로 나타났다. 상기 ^swAPP 안정 세포의 #2 콜로니 배지와 각 0, 0.5, 2.5 및 10μg/μL 농도의 rGCP-Ⅱ를 함께 배양하였을 때, 생리적으로 생성된 Aβ₄₂의 농도가 감소하였다. 이는 rGCP-Ⅱ가 생리적으로 생성된 Aβ도 분해시킨다는 것을 나타낸다(도 8의 B).

< 실시예 6> Aβ의 모노머 (monomer) 및 멀티머(multimer)에 대한 GCP -Ⅱ의 분해 효과 확인

Aβ의 모노머(monomer) 및 멀티머(multimer)에 대한 GCP-Ⅱ의 분해 효과를 알아보기 위하여 7일간 성숙된 Aβ를 rGCP-Ⅱ와 20시간 동안 반응시키고, 16% 트리스-트리신 젤(tris-tricine gel)에 내린 후에 항-Aβ 항체(6E10)로 웨스턴 블랏팅을 실시하였으며(도 9의 A), 5회 이상 실시된 블랏팅 결과를 이미지 프로그램(Image J program, NIH, USA)을 이용하여 정량하였다(도 9의 B). 그 결과, GCP-Ⅱ의 농도를 증가시키면서 Aβ와 반응시키면 모노머 형태보다 올리고머(또는 멀티머) 형태의 Aβ가 더 빨리 감소함을 관찰하였고, 따라서 GCP-Ⅱ는 신경세포에 유해한 올리고머 형태의 Aβ를 효율적으로 분해한다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 7> 용해성(soluble) 및 불용성(insoluble) 형태의 Aβ에 대한 GCP -Ⅱ의 분해 효과 확인

반응 용액내에 다양한 형태의 Aβ₄₀가 존재하기 때문에 본 발명자들은 상기 Aβ₄₀에 대한 rGCP-Ⅱ의 친화성을 확인하고자 하였다(도 10).

대뇌 피질을 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitor cocktail)를 포함하는 pH7.6, 50mM Tris-HCl 버퍼(TBS)에서 균질화(homogenize)하였고, 4℃, 100,000×g, 40분간 원심분리하였다. 상청액(supernatant)은 용해성 단편으로 정의하고, 펠렛은 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitor cocktail)를 포함하는 6M 구아니딘-HCl(guanidine-HCl) 버퍼에서 소니케이션(sonication)하여 용해하여 불용성 단편으로 정의하고, 용해성 Aβ및 불용성 Aβ의 농도를 측정하였다.

용해성 Aβ및 불용성 Aβ와 rGCP-Ⅱ를 함께 배양한 결과, rGCP-Ⅱ는 불용성 Aβ₄₀은 35% 감소시켰으며, 용해성 Aβ₄₀은 20% 감소시켰다(도 10의 A). 이로써, 본 발명의 GCP-Ⅱ는 용해성 Aβ뿐만 아니라 불용성 Aβ에도 활성을 나타냄으로써 축적된 Aβ를 더욱 효율적으로 분해할 수 있음을 나타내었다(도 10의 B).

< 실시예 8> 응집된 Aβ에 대한 rGCP -Ⅱ의 분해 효과 확인

21일간 응집된 Aβ를 16시간 동안 rGCP-Ⅱ 단백질과 반응시킨 후 변화된 응집 Aβ의 양을 콩고 레드 방법을 이용해 측정함으로써 rGCP-Ⅱ의 분해능을 다시 한번 확인하고자 하였다.

5.0mM 콩고-레드 원용액(stock solution)을 5.0mM KH₂PO₄, 150mM NaCl, pH 7.4 콩고-레드(Congo red) 용액(5μM)으로 준비한 다음, rGCP-Ⅱ 유무에 따라 Aβ와 함께 혼합하여 흡수율 측정전에 30분동안 상온에서 배양하여 스펙트럼을 획득하였다. 콩고 레드 분석 방법에서, 단백질의 응집된 형태는 콩고 레드와 결합함으로써 흡수 분광 분석(absorption spectroscopy) 값을 증가시킨다.

GCP-Ⅱ는 용해성을 잃은 응집 Aβ₄₀을 분해하는데 21일간 성숙된 Aβ₄₀ 응집체(aggregates)만의 콩고-레드 값(congo-red value, Cb)이 3 ±0.45 μM인데 반하여 GCP-Ⅱ와 반응시키면 Cb값이 각 GCP-Ⅱ 농도가 증가함에 따라 2.35, 1.82, 0.72로 감소하는 것으로 나타났다.

나아가, rGCP-Ⅱ 작용에 의한 Aβ의 주요 단편인 Aβ₁₈의 Cb 값은 21일동안 성숙후에도 거의 없었다(blank). 이는 Aβ₄₀이 rGCP-Ⅱ에 의해 절단됨으로써 그 응집 핵 서열(aggregation core sequence)을 잃은 Aβ단편을 생성하였음을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 GCP-Ⅱ는 투여한 농도에 비례하여 Cb값이 감소되는 것을 보임으로써 GCP-Ⅱ가 다양한 형태의 Aβ를 분해할 수 있으며, 특히 Aβ가 응집됨에 따라 GCP-Ⅱ에 의해 더욱 효율적으로 분해될 수 있음을 보여 주었다(도 11).

본 발명자들은 Aβ를 분해하는 새로운 단백질 분해 효소를 발견하였고, 본 발명의 GCP-Ⅱ가 Aβ의 모노머 및 올리고머 형태 뿐만 아니라 용해성 및 불용성 형태, 그리고 응집된 형태로 변환된 Aβ도 분해한다는 것을 나타냄으로써 AD를 치료할 수 있는 주요 인자임을 확인하였다. 나아가, 이를 이용하면 AD치료 및 다운 증후군, 아밀로이드증을 위한 약물 개발 및 유전자 치료에 응용될 수 있다.

<110> Korean National Institute of Health(KNIH) <120> Pharmaceutical composition and composition for screening therapeutics to preventing and treating of beta-amyloid accumulation in brain comprising GCP-II(glutamate carboxypeptidase-II) as an active ingredient, method for screening using said composition <130> 5p-02-19 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2253 <212> DNA <213> Human <400> 1 atgtggaatc tccttcacga aaccgactcg gctgtggcca ccgcgcgccg cccgcgctgg 60 ctgtgcgctg gggcgctggt gctggcgggt ggcttctttc tcctcggctt cctcttcggg 120 tggtttataa aatcctccaa tgaagctact aacattactc caaagcataa tatgaaagca 180 tttttggatg aattgaaagc tgagaacatc aagaagttct tatataattt tacacagata 240 ccacatttag caggaacaga acaaaacttt cagcttgcaa agcaaattca atcccagtgg 300 aaagaatttg gcctggattc tgttgagcta gcacattatg atgtcctgtt gtcctaccca 360 aataagactc atcccaacta catctcaata attaatgaag atggaaatga gattttcaac 420 acatcattat ttgaaccacc tcctccagga tatgaaaatg tttcggatat tgtaccacct 480 ttcagtgctt tctctcctca aggaatgcca gagggcgatc tagtgtatgt taactatgca 540 cgaactgaag acttctttaa attggaacgg gacatgaaaa tcaattgctc tgggaaaatt 600 gtaattgcca gatatgggaa agttttcaga ggaaataagg ttaaaaatgc ccagctggca 660 ggggccaaag gagtcattct ctactccgac cctgctgact actttgctcc tggggtgaag 720 tcctatccag atggttggaa tcttcctgga ggtggtgtcc agcgtggaaa tatcctaaat 780 ctgaatggtg caggagaccc tctcacacca ggttacccag caaatgaata tgcttatagg 840 cgtggaattg cagaggctgt tggtcttcca agtattcctg ttcatccaat tggatactat 900 gatgcacaga agctcctaga aaaaatgggt ggctcagcac caccagatag cagctggaga 960 ggaagtctca aagtgcccta caatgttgga cctggcttta ctggaaactt ttctacacaa 1020 aaagtcaaga tgcacatcca ctctaccaat gaagtgacaa gaatttacaa tgtgataggt 1080 actctcagag gagcagtgga accagacaga tatgtcattc tgggaggtca ccgggactca 1140 tgggtgtttg gtggtattga ccctcagagt ggagcagctg ttgttcatga aattgtgagg 1200 agctttggaa cactgaaaaa ggaagggtgg agacctagaa gaacaatttt gtttgcaagc 1260 tgggatgcag aagaatttgg tcttcttggt tctactgagt gggcagagga gaattcaaga 1320 ctccttcaag agcgtggcgt ggcttatatt aatgctgact catctataga aggaaactac 1380 actctgagag ttgattgtac accgctgatg tacagcttgg tacacaacct aacaaaagag 1440 ctgaaaagcc ctgatgaagg ctttgaaggc aaatctcttt atgaaagttg gactaaaaaa 1500 agtccttccc cagagttcag tggcatgccc aggataagca aattgggatc tggaaatgat 1560 tttgaggtgt tcttccaacg acttggaatt gcttcaggca gagcacggta tactaaaaat 1620 tgggaaacaa acaaattcag cggctatcca ctgtatcaca gtgtctatga aacatatgag 1680 ttggtggaaa agttttatga tccaatgttt aaatatcacc tcactgtggc ccaggttcga 1740 ggagggatgg tgtttgagct agccaattcc atagtgctcc cttttgattg tcgagattat 1800 gctgtagttt taagaaagta tgctgacaaa atctacagta tttctatgaa acatccacag 1860 gaaatgaaga catacagtgt atcatttgat tcactttttt ctgcagtaaa gaattttaca 1920 gaaattgctt ccaagttcag tgagagactc caggactttg acaaaagcaa cccaatagta 1980 ttaagaatga tgaatgatca actcatgttt ctggaaagag catttattga tccattaggg 2040 ttaccagaca ggccttttta taggcatgtc atctatgctc caagcagcca caacaagtat 2100 gcaggggagt cattcccagg aatttatgat gctctgtttg atattgaaag caaagtggac 2160 ccttccaagg cctggggaga agtgaagaga cagatttatg ttgcagcctt cacagtgcag 2220 gcagctgcag agactttgag tgaagtagcc taa 2253 <210> 2 <211> 750 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe 20 25 30 Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu 35 40 45 Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile 65 70 75 80 Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile 85 90 95 Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His 100 105 110 Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile 115 120 125 Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe 130 135 140 Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro 145 150 155 160 Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr 165 170 175 Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190 Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val 195 200 205 Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly 210 215 220 Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly 245 250 255 Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr 260 265 270 Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly 275 280 285 Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys 290 295 300 Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg 305 310 315 320 Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val 340 345 350 Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro 355 360 365 Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly 370 375 380 Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg 385 390 395 400 Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile 405 410 415 Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr 420 425 430 Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala 435 440 445 Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val 450 455 460 Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu 465 470 475 480 Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser 485 490 495 Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile 500 505 510 Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu 515 520 525 Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn 530 535 540 Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val 565 570 575 Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val 580 585 590 Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala 595 600 605 Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr 610 615 620 Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr 625 630 635 640 Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser 645 650 655 Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu 660 665 670 Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg 675 680 685 His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser 690 695 700 Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp 705 710 715 720 Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala 725 730 735 Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala 740 745 750 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCP-II-1F <400> 3 cgcggatcca ccatgtggaa tctccttcac gaaa 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCP-II-1R <400> 4 atttgcggcc gctggctact tcactcaaag tctc 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCP-II-2F <400> 5 cgcagatcta ccatgtggaa tctccttcac gaaa 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCP-II-2R <400> 6 atttagatct ttaggctact tcactcaaag tctc 34

Claims

GCP-Ⅱ 단백질을 유효성분으로 함유하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, GCP-Ⅱ 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, Aβ는 용해성(soluble) 또는 불용성(insoluble) Aβ인 것을 특징으로 하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료용 약학적 조성물.
인간 GCP-Ⅱ 유전자를 포함하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물.
제 4항에 있어서, 인간 GCP-Ⅱ 유전자는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열, 서열번호 1 또는 이의 다형현상을 포함하는 유 전자 단편 염기서열 중에서 선택되는 1종 이상의 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물.
GCP-Ⅱ 단백질을 포함하는 Aβ의 뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물.
제 6항에 있어서, GCP-Ⅱ 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열 중에서 선택된 하나로부터 발현된 단백질, GCP-Ⅱ와 동등한 생리적 활성을 나타내는 GCP-Ⅱ 폴리펩티드 단편 중 선택된 1종 이상의 Aβ 뇌내 축적 예방 및/또는 치료제 스크리닝용 조성물.
i) 제 4항 또는 제 5항의 조성물을 시험 대상 물질과 접촉시키는 단계; 및

ii) 단계 i)의 반응을 확인하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 Aβ뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
i) 제 6항 또는 제 7항의 조성물을 시험 대상 물질과 접촉시키는 단계; 및

ii) 단계 i)의 반응을 확인하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 Aβ뇌내 축적 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
GCP-Ⅱ가 발현되는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 Aβ뇌내 축적 예방 및 치료제.
제 10항에 있어서, 발현 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 레트로 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스성 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 Aβ뇌내 축적 예방 및 치료제.