KR20070022183A - 생체내 이식을 위한 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스 - Google Patents

Abstract

일반 수술, 성형 수술 및 신경 수술에서 이식 소재로서 사용하기 위한 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스 소재를 개시한다.

Description

생체내 이식을 위한 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스{THERMALLY MODIFIED MICROBIAL-DERIVED CELLULOSE FOR IN VIVO IMPLANTATION}

본 출원은 내용이 본 명세서에 참고 인용되어 있는 것인 2003년 8월 22일자로 출원된 미국 가명세 출원 제60/497,064호의 이익을 특허 청구한 것이다.

본 발명은 폴리사카라이드 재료에 관한 것이고, 보다 구체적으로 의료 및 수술 용도에 적합한 이식 특성을 갖는 미생물 유래의 셀룰로즈에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 성형 수술 및 신경 수술에 있어 조직 수복 소재, 인간 조직 대용물 및 이식물로서의 미생물 유래의 셀룰로즈의 용도에 관한 것이다.

의료 산업에서 이식가능한 장치로서 합성 재료의 광범위한 용도는 문헌상에 잘 기록되어 있다. 이러한 이식가능한 합성 재료는 일반적으로 2가지 주요 군, 즉 일시적 이식물/생체흡수성 군과 장시간 이식물/비-생체흡수성 군으로 구분할 수 있다. 생체 흡수성 합성 재료의 예로는 오랫동안 수술 봉합사로서 사용되어 오고 있는 폴리 1-락트산(PLLA) 및 폴리 1-글리콜산(PLGA)을 포함하는 중합체를 들 수 있다. 이러한 재료는 미국 특허　제6,031,148호에 설명되어 있는 바와 같이 의도한 용도에 따라 필름, 메쉬 및 보다 복합한 3차원 구조물로 제조되고 있다.

장기간 이식가능하고 비-생체흡수가능한 재료의 예로는 폴리(테트라플루오로 에틸렌) PTFE가 있으며, 이것은 혈관 이식편(vascular grafts)(미국 특허 제5,718,973호), 조직 재생 시트 및 패치(미국 특허 제5,433,996호)를 비롯한 다수의 이식가능한 물품에서 사용되고 있는 것이다. 또한, 중합체 히드로겔도 수술 이식물 (미국 특허 제4,836,884호); 연조직 및 혈관 대체물 등의 현재 발견되고 있는 용도에 채택되고 있다.

이들 재료 각각은 이 재료를 이식물 재료로서 적합하게 만드는 특정한 물리적 특징을 보유한다. 그러한 특성은 특수 용도에 매우 중요할 수 있는 생체적합성, 강도, 화학 안정성 등을 포함한다. 예를 들면, PTFE는 도관 이식편의 제조에서 중요한 것으로 강력하게 상호연결되어 있는 피브릴 구조물을 갖게 된다. 합성 히드로겔은, 고함수량으로 인하여 살아있는 조직과 유사한 외관을 갖는 것으로, 그것을 보철 장치(prothetic device)로서 만들어 주는 주위 조직에 대한 최소 자극을 나타낸다. 그러나, 이러한 합성 재료는 또한 물리적 및 생화학적 특성의 제한된 범위를 비롯한 한계점 및 단점도 갖고 있다. 따라서, 특수한 수술 용도에 보다 적합한 대체 재료를 조사할 필요성이 여전히 남아 있다.

이식가능한 물품으로서 재생된 셀룰로즈의 용도가 공지되어 있다. 몇몇 연구개발자들은 셀룰로즈 및 이것의 유도체의 조직 생체적합성을 연구하고 있고(Miyamoto, T. et al., Tissue Biocompatibility of Cellulose and its derivatives . J. Biomed . Mat. Res., V. 23, 125-133 (1989)), 또한 그 재료에 대한 몇가지 특수 용도를 검사하고 있다. 재생된 셀룰로즈의 산화 형태가 지혈제 및 유착 차단제(adhesion barrier)로서 사용되어 오고 있고(Dimitrijevich, S. D., et al. In vivo Degradation of Oxidized regenerated Cellulose. Carbohydrate Research, V. 198, 331-341 (1990), Dimitrijevich, S. D., et al. Biodegradation of Oxidized regenerated Cellulose Carbohydrate Research, V. 195, 247-256 (1990)), 비산화 대응물보다 훨씬 더 빠르게 분해되는 것으로 공지되어 있다. 문헌 (Martson, et al.)에 의해 연구된 셀룰로즈 스펀지는 피하 이식시 골 및 결합 조직 형성과의 생체적합성을 나타내었다(Martson, M., et al., Is Cellulose sponge degradable or stable as an implantation material An in vivo subcutaneous study in rat. Biomaterials, V. 20, 1989-1995 (1999), Martson, M., et al., Connective Tissue formation in Subcutaneous Cellulose sponge implants in rats. Eur . Surg . Res., V. 30, 419-425 (1998), Martson, M., et al., Biocompatibility of Cellulose Sponge with Bone. Eur . Surg . Res., V. 30, 426-432 (1998)). 이들 문헌에는 셀룰로즈 재료가 생존가능한 장기간 안정한 이식물일 수 있는 것으로 요약 기재되어 있다. 또한, 셀룰로즈의 기타 형태 및 유도체도 연구 개발되고 있다(Pajulo, O. et al. Viscose cellulose Sponge as an Implantable matrix: Changes in the structure increase production of granulation tissue. J. Biomed. Mat. Res., V. 32, 439-446 (1996).

그러나, 종래 기술은 특정한 단세포 유기체에 의해 생성된 독특한 형태의 셀룰로즈의 이용가능한 용도를 언급하지 못하고 있다. 이에 대해서는 특정한 미생물에 의해 생성된 미생물 셀룰로즈가 공지되어 있고, 1백년 이상 동안 연구되어 오고 있다. 미생물 유도된 셀룰로즈는 히드로겔과 유사한 고함수량 및 PTFE와 같은 특별 한 강도를 비롯하여 식물 셀룰로즈에서 발견되지 않는 독특한 특징을 보유하고 있다. 그 미생물 셀롤로즈는 다양한 형상 및 크기로 합성할 수 있고, 매우 우수한 형상 보유력을 갖고 있다. 이러한 특성은 대부분 그 셀룰로즈의 독특한 층상형 마이크로피브릴 3차원 구조에 기인한 것이다. 부직 방식으로 정렬된 마이크로피브릴은 면 섬유와 같은 식물 셀룰로즈보다 약 200배 더 미세한데, 이는 단위 부피 당 엄청난 표면적을 가져오게 된다.

복수의 새로운 특성을 지니고 있긴 하지만, 미생물 셀룰로즈는 아직 충분히 이용되지 않고 있어 한정된 용도만이 제시되어 오고 있다. 예를 들면, 의료 산업에서 미생물 유도된 셀룰로즈의 용도는 액체 적재된 패드(미국 특허 제4,788,146호), 상처 드레싱(미국 특허 제5,846,213호) 및 다른 국소적 용도(미국 특허 제4,912,049호)에 국한되어 있다. 문헌(Mello, L. R., et al., Duraplasty with Biosynthetic Cellulose: An Experimental Study. Journal of Neurosurgery, V. 86, 143-150 (1997))에는 실험 동물 연구에 있어 경막이식(duraplasty) 재료로서 미국 특허 제4,912,049호에 기재된 것과 유사한 생합성 셀룰로즈의 용도가 개시되어 있다. 상기 문헌상의 결과는 미생물 유도된 셀룰로즈의 건조 형태가 이중 대체물로서 적합하다는 보여주었다. 그러나, 상기 문헌(Mello et al.)에 기재된 재료는 탈피로겐화 단계(depyrogenation step)를 수행하지 못하고, 그 재료는 충분히 건조되지 않으며, 동시에 최초 국소 용도로 개발되었던 것으로 미국 특허 제4,912,049호에 기재된 것(BIOFILL ^TMWound Dressing)과 같이 늘어난다. 이와 대조적으로, 본 발명은 비-발열원성 이식가능한 재료를 제공하고, 열적 탈수화 방법을 이용하여 부 분적으로 수술 메쉬를 탈수화시킨다. 이는 앞서 설명한 셀룰로즈 재료에서 이용불가능한 매우 우수한 정합성(conformability) 및 흡수성을 본 발명에 부여한다.

발명의 또다른 측면에서는 미생물 셀룰로즈의 건조시 다양한 방법이 설명되어 있다. 미국 특허 제5,580,348호 및 제5,772,646호(Blaney et al.)에는 평균 소공 크기가 약 0.1 마이크론 내지 약 10 마이크론인 미생물 폴리사카라이드를 포함하는 흡수성 재료가 기재되어 있다. 이 흡수성 재료는 미생물 폴리사카라이드를 건조시켜 그 미생물 폴리사카라이드가 생성될 때 존재하는 대부분의 수성 매질을 제거하는 초임계 이산화탄소를 포함하는 방법에 의해 제조한다.

상기 특허(Blaney et al.)의 생성물 및 방법은 본 발명의 발명자들에 의해 발견된 생성물 및 방법과는 상이하다. 본 발명의 발명자들은 건조 없이 이식될 수 있거나 또는 초임계 이산화탄소와 같은 용매를 사용하여 건조된 이식가능한 재료를 얻게 할 수 있는 액체의 온도 유도된 제거를 이용하여 미생물 유도된 셀룰로즈를 부분적으로 탈수소화시킴으로써 이식가능한 미생물 셀룰로즈를 제조하는 방법을 결정하게 되었다. 상기 양자의 재료는 소정의 생성물에 따라 습윤 형태 또는 건조 형태로 살균처리를 수행한다. 또한, 상기 특허(Blaney et al.)의 생성물은 본 발명의 생성물이 비-발열원성(비-내독성), 강화된 인장 강도 및 봉합사 보유성(suture retention), 감마 방사선에 의한 살균처리 및 생체적합성의 결과로서 생체 이식을 수행할 수 있다.

본 발명에 기재된 물질과 유사한 물질은 제6,599,518호(Solvent Dehydrated Microbially-Derived Cellulose for Implantation)에 기재된 물질이다. 이 발명은 메탄올, 아세톤 또는 기타 유기 용매를 사용하여 15% 미만의 수분 함량까지 용매 탈수를 행한 것을 기재하고 있다. 본 발명은 용매 탈수 물질에 대해 필요한 경우에 그의 유연성(conformability)을 개선하기 위하여 재수화될 필요가 없도록 하기 위하여 탈수 후 상당히 더 많은 액체가 패드에 남아있다는 점에서 상기 물질과 다르다. 또한, 초임계 CO₂-건조 형태의 본 발명은 보다 높은 흡수성에 의해 용매 탈수와 구별된다.

용매 탈수가 완전 건조된 이식 소재를 생성시키지만, 본 발명 이전에 미생물 유래의 셀룰로스를 포함하는 허용가능한 부분 탈수된 이식 소재는 없었다. 따라서, 매우 광범위한 의료 및 수술 분야에 사용할 수 있는 미생물 유래의 셀룰로스를 포함하는 부분 탈수된 이식 소재가 필요하다. 다양한 적용을 위해 미생물 유래의 셀룰로스를 이식하는 방법도 구체적으로 필요하다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 미생물 유래의 이식가능한 셀룰로스 및 그의 제조 방법을 제공하는 것으로서, 여기서 이식 소재는 생체내 이식물질일 수 있다. 이식 소재는 조직 대용물, 충전제(bulking agent) 및 수술용 메쉬(mesh)로서 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 미생물 유래의 이식가능한 셀룰로스를 제공하는 것으로서, 이식 소재는 장력, 신장력 및 봉합가능성과 같은 원하는 기계적 성질을 가진 생체내 이식물질일 수 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 비발열성이고 생체적합하며 살균될 수 있는 미생물 유래의 셀룰로스를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 목적은 유연하며 액체를 흡수할 수 있는 미생물 유래의 셀룰로스를 제공하는 것이다. 이들 및 기타 목적은 하기 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.

도 1은 용매 탈수 미생물 셀룰로스(SDMC)와 비교하여 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스(TMMC)의 셀룰로스 함량에서의 차이를 보여준다.

도 2는 재수화된 용매 탈수 미생물 셀룰로스(SDMC)와 비교하여 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스(TMMC)의 기계적 강도(힘 (N)) 및 신장율(%)을 보여준다.

도 3은 연신된 공기-건조 셀룰로스(BIOFILL™)와 비교하여 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스의 기계적 강도(힘(N)) 및 신장율(%)을 보여준다.

도 4는 다양한 물질에 대한 봉합 시험 구성에 대한 개략도이다.

도 5는 용매 탈수 미생물 셀룰로스(SDMC) 및 공기-건조 셀룰로스(BIOFILL™)와 비교하여 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스의 봉합 유지를 보여준다. [Biofill은 봉합력을 전혀 갖지 않음, F=0]

도 6은 여러 회수에 걸쳐 생리수 중에 침수시킨 후에 용매 탈수 미생물 셀룰로스(SDMC)와 비교하여 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스(TMMC)의 두께에서의 변화를 보여준다.

발명의 개요

본 발명의 소재는 이식가능한 형태의 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스, 특히 영양 배지에서 증식하고 조절된 조건 하에서 배양된 아세토박터 자일리넘(Acetobacter xylinum)의 배양물로부터 생산된 셀룰로스를 포함한다. 셀룰로스 필름 또는 박막은 조절된 조건 하에서의 배양을 비롯한 아세토박터 자일리넘 증식을 통해 생산된다. 발열원 및 생존가능한 미생물을 파괴하기 위하여 상기 박막을 수산화나트륨으로 화학적으로 처리한 후 여과수로 세정한다. 각 박막의 압축 후, 물질을 밀폐된 용기 내에 넣고 온도를 0℃ 이하까지 감소시킨다. 일정 시간 경과 후, 온도를 0℃ 이상까지 높이고 방출된 여분의 습기를 제거한다. 그 다음, 바람직한 양태를 절단하여 팩킹하고 감마 살균한다. 또 다른 양태는 물을 메탄올로 교환하고, 메탄올을 초임계 이산화탄소로 교환하고, 마지막으로 CO₂를 제거하여 건조된 형태의 생성물을 얻음으로써 추가 처리된다. 이어서, 이 생성물을 절단하여 팩킹하고 감마 또는 산화에틸렌으로 살균한다.

본 발명의 한 측면에서, 미생물 유래의 셀룰로스로부터 수화된 열 변성 셀룰로스 및 건조된 열 변성 셀룰로스 둘다를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 조절된 조건 하에 영양 배지에서 셀룰로스-생산 미생물을 증식시키는 단계 후, 추가 처리 전에 미생물 유래의 셀룰로스를 수산화나트륨으로 화학적으로 처리하여 발열원 및 생존가능한 유기체를 파괴하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 셀룰로스를 우선 밀폐된 용기 내에 두고 온도를 0℃ 이하까지 감소시킴으로써 탈수한다(물이 제거됨). 일정 시간 경과 후, 온도를 0℃ 이상하는 정도까지 높이고 방출된 여분의 습기를 제거한다.

본 발명의 추가 양태에서, 이 물질을 건조하기 위해 초임계 이산화탄소 기술을 이용하여 상기 물질을 처리할 수 있다.

본 발명의 추가 양태에서, 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스는 성형 수술, 일반 수술 및 신경 수술에서 이식가능한 의료 소재로서 사용된다. 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스는 다양한 수술 과정에서 유용한데, 이는 그것이 원하는 크기 및 형태로 절단되어 수술적 요건을 충족시킬 수 있고 유연하여 접착 없이 다양한 표면에 몰딩(molding)될 수 있기 때문이다.

본 발명의 추가 측면은 미생물 유래의 셀룰로스, 및 임의로 2차 방수 파우치 내에 놓여진 밀봉된 방수 파우치를 포함하며 건조된 경우에는 감마 살균 또는 산화에틸렌 살균이 행해진 패키지를 포함하는 키트에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

달리 명시하지 않는 한, 단수형의 용어는 하나 이상을 의미한다. 본 발명의 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스를 제조함에 있어서, 셀룰로스는 박테리아, 바람직하게는 아세토박터 자일리넘(야생형)에 의해 합성되고 접종 플라스크로부터 회수되고 원하는 부피의 미생물 유래의 셀룰로스를 얻기 위하여 최적화된 배지가 함유된 후속 플라스크 및 탱크에서 직선형 생장 주기 동안 계속된 접종 및 배양을 통해 증식시킨다. 배지는 수크로스, 황산암모늄, 인산나트륨, 황산마그네슘, 구연산, 아세트산 및 미량 원소와 같은 영양분으로 구성되어 산성 pH를 가진 생장 배지가 된다. 살균된 배지를 아세토박터 자일리넘의 증식 배양물로부터 접종하고 적당한 부피의 생체반응기 트레이 내에 충진시켜 셀룰로스 대 물의 최종 비율이 약 1:20 내지 약 1:100이 되도록 한다. 생체반응기 트레이를 밀봉하고 30℃±2°의 조절된 환경에서 미생물 유래의 셀룰로스 박막의 성장이 완결될 때까지 항온처리한다. 박막을 생체반응기 트레이로부터 꺼내어 화학적으로 처리함으로써 박테리아 부산물 및 잔류 배지를 제거한다. 가성 용액, 바람직하게는 약 0.1 M 내지 4 M의 바람직한 농도의 수산화나트륨을 사용하여 박테리아로부터 생산된 생존가능한 유기체 및 발열원(내독소)을 상기 박막으로부터 제거한다. 이어서, 처리된 박막을 여과수로 세정하여 미생물 오염(bioburden)을 감소시킨다.

그 후, 외피를 소정의 두께로 압축한다. 최초 충전 부피 및 압축 단계는 본 발명에 통합 적용하여 셀룰로스의 강도, 일관성, 및 기능에 영향을 주는 소정의 밀도를 얻게 해준다. 본 발명의 추가적인 과정은 밀폐된 용기내에 셀룰로스를 두고, 온도를 0℃ 이하로 감소시키는 것으로 이어진다. 일정 시간 이후, 온도를 0℃ 이상으로 증가시키고, 방출된 과량의 수분을 제거하여 셀룰로스를 부분적으로 탈수화시킨다. 이론에 구속되지 않고, 0℃ 이하의 온도에서, 물 결정이 셀룰로스 메쉬의 표면에 형성 및 발생된다고 여겨진다. 0℃ 이상의 온도에서, 제거된 액체는 외과 수술용 메쉬를 다시 수화시키지 못하므로, 다양한 외과 수술 과정에서 이식가능한 의료 장치로 사용되는 경우, 증가된 인장 강도, 신장율(스트레치), 정합성 및 봉합사 보유력을 가지는 제품을 얻게 해준다. 탈수화의 소정 수치에 따라, 필름은 1 이상의 온도 변화 사이클에 노출된다. 과량의 액체는 붓기(pouring), 두드리기(dabbing) 또는 진공 제거에 의해 제거된다. 부분적으로 탈수화된 샘플에 대해 셀룰로스 함량 및 흡수 용량을 테스트 하였다.

부분적으로 탈수화된 샘플에 대해, 샘플 중 액체(물)를 메탄올로 교환시키는 과정을 추가로 수행할 수 있다. 그 후, 메탄올이 흡수된 샘플을 초임계 유체 추출기에 두고, 메탄올을 초임계 상태의 이산화탄소로 교환한다. 교환이 일어난 후, 온도를 상승시키고, C0₂를 제거하면, 샘플이 건조된 셀룰로스 패드(pad)로 관찰된다.

제어된 환경하에서, 습윤 또는 건조 필름을 당업자가 이해할 수 있는 다양한 형태와 크기로 절단할 수 있다. 각각의 단위를 방수 단일 또는 이중-파우치 시스템에 포장하고, 35 kGy 만큼의 투여 수치(그러나, 더 낮은 수치를 사용하는 것이 바람직함)에서 감마 방사선에 노출시켜 살균한다. 감마 투여량은 [ISO11137 Sterilization of Health Care Products - Requirements for Validation and Routine Control - Radiation Sterilization]에 서술된 비살균 재료에 대한 미생물 존재량(bioburden) 수치에 의해 결정된다.

방수 포장은 방수성의 내부 및 외부 셰브런(chevron) 박피가능한 파우치로 구성된다. 재료는 살균(예를 들어 감마 방사선에 의한 살균)에 적합한 실리카 코팅된 폴리에스테르로 밀봉된 폴리에스테르/LDPE/호일 블렌드일 수 있다.

본 발명의 미생물 유래의 셀룰로스는 일반 수술, 성형 수술 및 신경 수술 용도에 적합한 대상 미생물 유래의 셀룰로스 소재의 이식을 포함하여, 조직 확대 또는 수복에 사용될 수 있다. 외과 수술적 용도의 예에는, 일반적인 연조직 확대, 골반상 재구성, 방광 경부 서스펜젼, 탈장 회복, 서혜부 탈장 패치 및 경막형성술이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 셀룰로스 재료의 다른 용도에는 위치를 봉합시키는 능력이 포함된다. 봉합사 보유력은 이식가능한 의료 물품에 있어, 외과수술, 치료 및 기능수행 동안 위치를 안전하게 유지하는 데 있어 중요하다. 외과의는 바늘 삽입 동안 봉합사가 파열되지 않도록 하는 것은 물론, 이식물의 봉합된 가장자리에서 봉합사가 파열되지 않고 유지되도록 이식가능한 재료의 능력을 고려해야 한다.

외과수술 과정에 사용되는 본 발명의 미생물 유래의 셀룰로스의 능력은 이 소재가 의도된 목적에 효과적이고 안전하며, 충분한 생체적합성을 얻을 수 있어야 할 것을 요구한다.

탈파이로젠화(depyrogenation) 및 살균화 과정을 견디기 위한 본 발명의 능력은 일반 수술, 성형 수술 및 신경 수술용 이식가능한 의료 장치를 생산하는데 필수적이다. 종종, 생체의료 중합체들은 금속, 세라믹 및 합성물질과 같은 기타 물질들보다 낮은 열 안정성과 화학적 안정성을 가진다. 따라서, 이들은 종래의 방법을 사용하여 살균하는 것이 곤란하다. 이식가능한 의료 장치로 사용되는 임의의 재료의 경우, 내독소(비-파이로젠성), 미생물, 및 수용체에 해롭고 치료 과정을 방해하는 기타 가능한 오염원이 존재하지 않아야 한다.

본 발명은 파이로젠에 노출된 재료에 의한 박테리아 또는 교차-오염으로 인해 존재할 수 있는 내독소를 파괴한다고 알려진, 가열된 부식성 용액을 사용하여 탈파이로젠화된다. 그 후, 미생물 존재량 수치(비살균 재료에 전형적으로 존재하는 미생물 양)에 기초하여, 미리 결정된 살균 보장 수치에 의해 미생물 오염을 파괴시키기에 충분한 투여량으로 재료에 감마 방사선을 조사한다. 샘플에 약 35 kGy의 투여량으로 감마 방사선을 조사한다. 재료를 승온에서 강알카리성 수산화나트륨 용액으로 탈파이로젠화하여, 기계적 성질에 중요한 영향을 주지않도록 감마 살균화하여 과정을 종료할 수 있다. 또한, 건조 형태의 경우는 감마 방사 또는 산화에틸렌 살균을 수행할 수도 있다.

이식용 의료 장치는 이들의 의도된 용도에 적합하기 위해, 미국 식약청(FDA) 규제 또는 표준화 국제기구(ISO) 요구에 부합하는 다양한 기준에 부합해야 한다. 한다. 세포독성 연구는 이식 장치가 인간 조직에서 안전하고/생체적합성을 가지는지를 입증하기 위해 고려된다. [International Organization for Standardization 10993: Biological Evaluation of Medical Devices, Part 5: Tests for Cytotoxicity: in vitro Methods Guidelines]에 기초한, 시험관내 생체적합성 연구를 세포독성에 대한 잠재성을 측정하기 위해 본 발명에서 수행하였다.

미생물 유래의 셀룰로스의 기계적 성질은 인장 강도, %신장율 및 봉합사 보유력에 관한 것이다. 상기 재료는 선형 중합체의 성질을 가질 뿐만 아니라, 다방면으로 고려되는 반면, 중합체 사슬은 드로우(draw) 방향으로 나열되는 경향이 있다. 따라서, 절단 방향을 고려할 필요가 없었다.

이하 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이다. 그러나, 본 발명이 이러한 실시예에 서술된 특정 조건이나 세부 사항들로 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서를 통해, 임의의 참고문헌 및 모든 참고문헌은 본 특허출원에 참고자료로 특히 포함된다.

실시예 1 - 이식가능한 미생물 유래의 셀룰로스의 제조

본 실시예는 미생물 존재량(미생물 오염)을 최소화시키는 제어된 환경내에서 아세토박터 자일리넘에 의해 생산된 표준 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스 필름의 제법에 관한 것이다. 증식 용기에서, 살균된 배지에 아세토박터 자일리넘을 접종하고, 약 100 g의 부피로 생물반응기에 충전시킨 후, 외피의 최적 성장이 관찰될 때까지 배양하였다. 외피를 트레이로부터 추출한 후, 약 1 시간 동안 가열시킨 부식성 용액 탱크에서 화학적 가공(탈파이로젠화)을 수행하였다. 그 후, 외피를 여과수로 연속 린싱 하였다. 필름을 공기압 내에서 압축시켜 소정의 중량 및 셀룰로스 함량을 가지는 외피를 수득하였다.

그 후, 가압된 필름을 밀폐된 용기에 두고, 온도를 강하시켜 2 내지 10일 동안의 다양한 기간 동안 0℃ 이하로 유지하였다. 그 후, 필름을 상온으로 하고, 과량의 물을 제거하였다. 이 배치에 대한 평균 셀룰로스 함량은 6.47%이었다. 본 실시예에 서술되는 이후 배치들에 대해서도 셀룰로스 함량을 테스트 하였다. 결과 셀룰로스 함량은 5.2% 내지 18.4%이었으며, 총 평균이 12.7%이었다. 각각의 샘플 단위를 파우치에 두고, 밀봉하여, 다양한 기계적 테스트에 사용하였다. 도 1은 용매가 탈수화된 미생물 셀룰로스에 대한 비교를 나타내준다.

실시예 2: 다양한 두께의 열 변성된 미생물 유래 필름의 제조

다양한 두께의 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스 필름은 실시예 1의 과정에 따라 일반적으로 제조되는 아세토박터 자일리넘에 의해 제조되었다.

증식 용기(propagation vessel)에서, 살균된 배지에 아세토박터 자일리넘을 접종하고, 각각 다른 용량으로 생물반응기 트레이에 채우고 균막(pellicle)의 최적 생장이 관찰될 때까지 배양하였다. 균막을 트레이로부터 추출한 다음, 약 1 시간 동안 가열된 수산화나트륨 탱크에서(최초 적재 중량에 따라) 화학 공정(탈파이로젠화)을 진행하였다. 그런 다음 균막을 여과된 물로 연속적으로 세척하였다. 필름을 공기 압축으로 압축하여 소망하는 중량 및 셀룰로스 함량을 갖는 균막을 얻었다.

이어서 압축된 필름을 밀폐된 용기에 넣고, 온도를 감소시켜 2 내지 10일의 다양한 기간 동안 0℃ 보다 낮게 유지하였다. 그럼 다음 필름을 실온으로 옮기고 과량의 물을 제거하였다.

압축된 필름 중 몇몇은 초임계 CO₂ 를 사용하여 다음과 같은 공정을 더 진행하였다. 재료를 100% 메탄올에 2 내지 7일 동안 두면서 새로운 메탄올로 매일 교환하였다. 그런 다음 재료를 폴리프로필렌 메쉬에 감고, 초임계 유체 교환 시스템에 두었다. 약 2000 psi의 CO₂ 압력을 사용하여, 교환은 약 3 시간 수행하였다. 샘플을 건조 형태로 하였다. 건조 재료에 대한 모든 실험은 최소 수화 후에 수행하였다.

실시예 3: 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스 필름의 기계적 특성

A. 미생물 유래의 셀룰로스의 기계적 특성 실험

열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스의 기계적 실험은 체내 삽입용 의료 물질로서 적용할 수 있는 장력 강도, 신장율 및 봉합사 유지력(견인력)을 결정하기 위해 수행하였다. 본 발명에 의한 샘플은 실험을 위해 외과수술용 가위 및 템플리트(template)를 사용하여 1cm x 4cm 또는 1cm x 8cm 조각으로 절단하였다. 예를 들어, 각 조각은 필름의 가장자리에 평행한 영역으로부터는 절단하지 않았고, 각 필름 내의 전체 영역을 나타내기 위해 필름 내에서 다양한 방향으로부터 절단하였다. 두께는 전자 캘리퍼(caliper)를 사용하여 밀리미터 단위로, ±0.03mm 오차 범위 내로 정확하게 측정하였다.

열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스의 기계적 특성은 장력 측정기(United Calibration Corporation) Model SSTM-2kN을 사용하여 하중 대 이동된 크로스헤드 거리 셋업으로 측정하였다. 500 lb. 하중 셀을 측정하였다. 표본의 표준 길이는 각 실험의 시작 전에 기록하였다. 표준 길이는 각 그립(grip) 사이의 표본의 길이이다(각 40mm 조각에서 25mm로, 그리고 봉합사가 부착된 각 조각에서 60mm로 측정됨). 상부 그립은 하부 그립과 일직선이 되도록 구성하고 위치시켰다. 하부 그립은 각 견인 주기 동안 움직임을 피하도록 구성하고 기계 바닥에 고정시켰다. 공기 그립은 각 그립의 꺾쇠(clamps) 내에 샘플을 꽉 죄기 위해 사용하였다. 각 샘플은 실험 전에 샘플의 상태가 정확하고 하중이 영인 것을 확인하도록 하였다. 예비하중(preload) 1 N을 5 mm/분의 비율로 적용하고, 300 mm/분으로 설정된 크로스헤드 속도로 실험을 수행하였다.

각 샘플은 그 천연 형태로 실험하였다. 장력 강도 및 신장율 실험을 위해, 각 샘플은 긴 길이가 힘 적용 방향과 평행하도록 실험 장치의 상부 꺽쇠에서 중앙에 위치시켰다. 상부 그립을 꽉 조이고 샘플의 바닥은 하부 꺾쇠에 위치시키고 조였다. 봉합사 유지력을 위해, 조각을 반으로 접어서 각 1cm x 8cm 샘플을 준비하고, "이중 두께"로 접힌 실험 샘플의 말단, 끝에서 2 내지 4mm 에 봉합사를 삽입하였다(도 4). 에티콘 2-0 프롤렌(Ethicon 2-0 Prolene) 봉합사를 끝이 가는 SH 바늘과 함께 사용하였다. 표면을 따라 유지 압력을 동등하게 분배하도록 상부 그립을 조였다. 봉합사는 힘 적용 방향에 평행한 하부 그립의 꺾쇠 사이에 조심스럽게 삽입하고, 팽팽하게 했다. 샘플이 꺾쇠에서 미끌어지거나, 꺾쇠에서 또는 가장자리가 손상되거나, 또는 샘플이 찢어지고 봉합사가 샘플로부터 뜯어내지지 않으면, 그 결과는 버리고 재료의 이용가능성을 반복 실험하였다.

샘플은 샘플이 찢어지거나 봉합사 재료가 샘플을 관통하여 찢어질 때까지 300mm/분의 일정한 비율로 실험하였다. 최종 장력 강도(실패시 응력) 및 신장율 퍼센트(최대 변형)는 장력 측정기 소프트웨어로부터 생성된 응력-변형(stress-strain) 커브로부터 계산하였다.

B. 장력 강도 및 신장율 % 실험의 결과

열 변성된 미생물 셀룰로스 샘플의 평균 장력 강도 및 신장율 %는 도 2 및 3에 나타낸다.

표 1은 피크 로드(Peak Load(Newtons))의 평균을 나타낸다. 신장율 %는 각 개별 응력-변형 커브로부터 최대 변형 대 응력으로 계산하였다. 모든 결과는 유효하다.

[표 1]

열변성 미생물 유래의 셀룰로스

피크 로드(N)	피크 신장율 %
20.5±8.5	19.2±5.9

생물학적 재료를 실험할 때 일관되고 신뢰성 있는 결과를 결정하기 위한 50% 버리는 가이드라인(discard guideline) 내에 들어가는 장력 강도는 10.4 내지 53.4 뉴톤(Newtons) 범위였다. 신장율 %는 9.3% 내지 40.0%의 범위였다. 이들 값은 체내 삽입용 재료가 일반적인 성형 수술 중에 연조직 치료를 보조하거나 유지하기 위해 사용될 때 최적의 신장(stretch) 정도를 나타낸다. 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스는 용매 건조된 미생물 유래의 셀룰로스에 비하여 파손에 대해 더 높은 신장 및 더 낮은 탄성율을 나타낸다.

C. 봉합사 유지력 실험의 결과

상업적 체내 삽입용 봉합 제품에 대한 지침은 전형적으로 수술 부위에서 연조직에 제품의 가장자리로부터 2 내지 4mm 보다 큰 봉합을 요구한다; 따라서 모든 샘플은 바닥 가장자리로부터 2 내지 4mm 봉합사를 삽입함으로써 실험하였다(도 4). 기본적인 실시를 결정하기 위해 상업적 제품과 다른 재료들을 비교할 때, 봉합사 견인력 데이터를 조사하는 것이 필요하다.

TMMC 접혀진 재료에 대한 피크 로드(Newtons)의 평균 결과는 7.47N+/-1.18 이었다. TMMC 접혀지지 않은 재료에 대한 피크 로드(Newtons)의 평균 결과는 1.66N±0.64 이었다(도 5). 모든 결과는 유효하다.

실시예 4 - 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스 대 용매 탈수된 미생물 유래의 셀룰로스와 시판품의 기계적 성질 비교

다양한 정도의 인장 강도, 신장율(%) 및 봉합 유지력을 확인하기 위해서 각종 미생물 유래의 셀룰로스 물질의 일반적인 기계적 강도 분석을 실시하였다. 표 2와 도 2, 3 및 5는 열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스(TMMC) 대 용매 탈수된 미생물 셀룰로스(SDMC) 및 공기 건조되고 연신된 미생물 유래의 셀룰로스 BIOFILL™ (BioFill Productos Biotechnologicos, Curritiba, Parana, Brazil)의 비교 결과를 보여준다. BIOFILL™을 1 x 4 cm 스트립으로 절단하고, 실시예 3에서와 같은 실험을 실시하였다. BIOFILL™은 아세토박터 자일리넘으로부터 합성하며, 연신 과정에서 공기 건조되는 필름으로 가공된다.

열 변성된 미생물 유래의 셀룰로스, 용매 탈수된 미생물 셀룰로스 및 BIOFILL™ 에 대한 인장 강도, 신장율(%) 및 봉합사 견인력(suture Pull-out)이 표 2에 제시되어 있다. TMMC는 SDMC와 비교하여 인장 강도(N)가 낮고(-59%), 습윤 미생물 셀룰로스와 비교하여 인장 강도가 동등하며, 공기 건조된 BIOFILL™ 과 비교하여 인장 강도가 우수하다(+165%)는 것이 입증되었다. 인장 강도는 외과적 취급, 삽입, 치유 과정 및 이식 기능에 중요하다.

열 변성된 미생물 셀룰로스는 SDMC와 비교하여 신장율(%)이 동일한 것으로 확인되었다. 이로부터, 열 변성된 미생물 셀룰로스는, 이식의 적응증이 경막 성형술 등일 때 바람직한 성질인 제한된 "연신성" 및 정합성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

[표 2]

* BIOFILL 소재는 1 N 사전 하중에서 봉합을 유지하지 못하고 인열된다(0.2 N)

도 2에 도시된 바와 같이, TMMC는 SDMC보다 인장 강도가 낮지만 신장율(%)은 같다.

또한, 도 3 및 5에 도시된 바와 같이, TMMC는 공기 건조된 셀룰로스 (BIOFILL™)보다 우수하다.

공기 건조된 셀룰로스 (BIOFILL™)는 연신율이 최소이며, 기계적 시험 과정에서 취급하기가 매우 곤란하다. 재수화 후에, 공기 건조된 셀룰로스 (BIOFILL™)는 투명해지고, 파지 겸자로 삽입하는 과정에서 말리고 오므라들기 때문에 취급하기 어려우며, 주변 작업 조건에서 직전에 건조시키기 때문에 당기는 과정 이전에 몇몇 조각은 파단된다.

봉합사 견인력에 대하여, 도 5는 봉합 유지력 결과를 나타낸다. 공기 건조된 셀룰로스 (BIOFILL™) 소재는 봉합이 가능하지 않기 때문에 BIOFILL™ 에 대한 결과는 제시되지 않았다는 것에 주목해야 한다. TMMC 및 SDMC는 테스트 과정에서 봉합을 유지하는 능력이 유사하였다.

본 발명의 셀룰로스 재료와 용매 탈수된 셀룰로스 및 공기 건조된 셀룰로스 (BIOFILL™)는 아세토박터 자일리넘으로부터 유도하였다. 실험 결과는 상이한 공정으로 생산한 재료 사이의 기계적 성질의 명백한 차이를 보여준다. 기계적 성질의 차이는 본 발명의 미생물 유래의 셀룰로스의 제조 공정에 기인하는 것으로 생각된다. 셀룰로스 필름의 열 변성으로 생성되는 필름의 성질, 특히 정합성을 조절할 수 있고, 따라서, 본 발명은 이전의 이식 소재, 특히 경막용의 이식 소재보다 양호한 결과를 나타내는 이식 가능한 소재를 제공할 수 있다.

실시예 5- 팽윤성 비교

일부 이식 소재(즉, 경막 대용물)에 대한 바람직한 특징은 최대에 달하는 주변액 흡수에 의해 두께가 약간 증가되고 그 형상은 유지할 수 있는 것이다. 등장성 염수에 침지할 때 시간 경과에 따른 각종 소재의 두께 변화를 확인하는 연구를 실시하였다.

오차가 0.03 mm인 캘리퍼를 사용하여 열 변성된 미생물 셀룰로스와 용매 탈수된 미생물 셀룰로스의 샘플의 초기 두께를 측정하였다. 그 다음 이 재료를 염수에 담그고 29 일까지 시간을 다양하게 하여 두께를 측정하였다. 도 6의 그래프는 재료의 두께가 초기에 증가한 다음 평형이 된다는 것을 보여준다. TMMC는 약 0.25 mm의 증가를 나타내는 반면, SDMC는 0.16 mm만이 증가하였다.

TMMC는 일부 유체를 흡수하여 과량의 유체를 빨아들일 가능성이 있지만, 지나치게 두꺼워지지는 않았다.

실시예 6 - 생체적합성 테스트

이식가능한 소재는 생체적합성이어야 한다. 이를 입증하는 테스트는 국제 표준 기구(ISO) 10993 문서에 제시된 방법을 따랐다. 용도에 따라서 특별한 테스트가 요구된다. 미생물 셀룰로스는 하기 표 3에 제시된 테스트를 사용하여 조사하였다.

[표 3]

미생물 셀룰로스의 생체적합성 테스트

본 발명의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 방법 및 조성물의 각종 변형 및 변화가 가해질 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 그 등가 범위 내에 있는 한 본 발명의 변형 및 변화를 포괄하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개 공보 및 참조 문헌은, 개별적으로 참고 인용되었다는 제시된 것과 동일한 범위로 그 전문이 참고 인용된다.

Claims (32)

1. a) 미생물 유래의 셀룰로스를 제공하는 단계;

   b) 상기 미생물 유래의 셀룰로스에 비발열성을 부여하기 위해, 상기 셀룰로스를 처리하는 단계;

   c) 0℃ 이하의 온도에 상기 미생물 유래의 셀룰로스를 노출시킨 다음, 상기 셀룰로스를 0℃ 이상의 온도에 노출시켜, 상기 셀룰로스를 부분 탈수시키는 단계; 및

   d) 이어서 제거된 액체를 버리는 단계

   를 포함하는, 의료용 또는 수술용 이식 또는 국소 소재의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 미생물 유래의 셀룰로스는 박테리아 아세토박터 자일리넘(Acetobacter xylinum)이 생산하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 미생물 유래의 셀룰로스의 처리 단계는 화학 세정의 이용을 포함하는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 화학 세정은 수산화나트륨을 사용하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 수산화나트륨 농도는 약 0.1 M 내지 약 4 M인 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 온도는 약 1 시간 내지 약 60 일의 기간 동안 0℃ 또는 그 이하로 유지하는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 후속 온도는 약 1 시간 내지 약 60 일의 기간 동안 0℃ 이상으로 유지하는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 어느 하나의 온도는 약 1 내지 약 21 일 동안 유지하는 것인 방법.
9. a) 이식 소재로서 사용하기 위한, 제1항의 방법에 의해 제조된 미생물 유래의 셀룰로스; 및

   b) 상기 미생물 유래의 셀룰로스를 함유하는 방습 패키지

   를 포함하는 키트.
10. 제1항에 있어서, 상기 미생물 유래의 셀룰로스는 감마 방사선으로 살균하는 것인 방법.
11. a) 제1항의 방법에 의해 제조된 미생물 유래의 셀룰로스를 포함하는 이식 소재를 제공하는 단계; 및

    b) 조직 확대를 필요로 하는 개체에게 상기 소재를 이식하는 단계

    를 포함하는 조직 확대 방법.
12. 제1항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 조직 대용물을 포함하는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 이식 충전제(bulking agent)를 포함하는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 이식 수술용 메쉬(mesh)를 포함하는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 조직 수복제를 포함하는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 미생물 유래의 셀룰로스는

    a) 패드내 잔류 액체를 유기 용매로 교환하는 단계;

    b) 유기 용매를 초임계 유체로 교환하는 단계; 및

    c) 가스 형태의 초임계 유체를 제거하는 단계

    를 포함하는 건조 형태로 더 가공하는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤 또는 이의 혼합물인 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 교환은 약 10 분 내지 약 60 일의 기간에 걸쳐 발생하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 기간은 약 30 분 내지 약 7 일인 것인 방법.
20. 제16항에 있어서, 초임계 유체는 이산화탄소인 것인 방법.
21. 제16항에 있어서, 압력은 약 1000 psi 내지 약 4000 psi인 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 압력은 약 1500 psi 내지 약 2500 psi인 것인 방법.
23. 제21항에 있어서, 목적하는 압력에서의 시간의 길이는 약 30 분 내지 약 7 일인 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, 시간의 길이는 약 1 시간 내지 약 6 시간인 것인 방법.
25. a) 이식 소재로서 사용하기 위한, 제16항의 방법에 의해 제조된 미생물 유래의 셀룰로스; 및

    b) 상기 미생물 유래의 셀룰로스를 함유하는 방습 패키지

    를 포함하는 키트.
26. 제16항의 방법에 의해 제조되고, 비발열성의 미생물 유래의 셀룰로스를 포함하는 생체내 이식 소재.
27. 제16항에 있어서, 상기 미생물 유래의 셀룰로스는 감마 방사선 또는 산화에틸렌으로 살균하는 것인 방법.
28. a) 제16항의 방법에 의해 제조된 미생물 유래의 세룰로스를 포함하는 이식 소재를 제공하는 단계; 및

    b) 조직 확대를 필요로 하는 개체에게 상기 소재를 이식하는 단계

    를 포함하는 조직 확대 방법.
29. 제16항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 조직 대용물을 포함하는 것인 방법.
30. 제16항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 이 식 충전제를 포함하는 것인 방법.
31. 제16항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 이식 수술용 망상 직물을 포함하는 것인 방법.
32. 제16항에 있어서, 소재는 일반 수술, 성형 수술 또는 신경 수술에 적합한 조직 수복제를 포함하는 것인 방법.

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