KR20070005751A

KR20070005751A - 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20070005751A
Application number: KR1020050060741A
Authority: KR
Inventors: 김성수; 노유헌; 강용구; 김용식; 이현정; 이도연; 윤지영; 이인숙; 이원복; 이무열; 김대경
Original assignee: 주식회사 바이오그랜드
Priority date: 2005-07-06
Filing date: 2005-07-06
Publication date: 2007-01-10
Also published as: KR100809410B1; WO2007004776A1

Abstract

본 발명은 줄기세포의 분화에 관한 것으로서, N-아세틸시스테인을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물, 이를 이용한 줄기세포 분화 유도방법 및 이에 의해 제작된 분화된 신경세포를 포함하는 신경질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 줄기세포로부터 효율적으로 분화세포 (바람직하게는, 신경세포, 보다 바람직하게는 도파민생성 신경세포)를 얻을 수 있다. 본 발명에 의해 제작된 신경세포는 신경손상에 의해 유발된 다양한 신경 질환을 치료하는 데 매우 유효하다.

줄기세포, 분화, N-아세틸시스테인, 신경세포, 도파민생성 신경세포

Description

줄기세포 분화 유도용 조성물 및 그의 용도{Compositions for Inducing the Differentiation of Stem Cells and Uses thereof}

도 1a는 P19 EC (embryonal carcinoma) 세포로부터 배아유사구조체 (embryonic body, EB)의 형성에 대한 N-아세틸시스테인 (NAC)의 영향을 보여주는 사진이다. 패널 A는 레티노산 (RA)를 처리하고 3일 동안 EB를 형성시키고 위상차 현미경으로 관찰한 사진이다. 패널 B는 RA와 NAC를 처리하고 3일동안 EB를 형성시킨 것이며, 패널 C는 α-에스트라디올과 RA를 처리하고 EB의 형성을 확인한 것이다. NAC 또는 α-에스트라디올 처리의 경우 RA를 1시간 전처리 하였다. NAC와 RA를 동시에 처리한 결과 RA만 처리한 결과보다 더 많고 큰 EB가 형성 되는 것을 확인할 수 있다.

도 1b는 NAC 또는 NAC+RA의 처리에 따라 형성된 EB를 직경을 기준으로 하여 그 개수를 분석한 그래프이다. NAC와 RA를 처리한 경우 RA만 처리한 경우보다 크기가 큰 EB의 개수가 많은 것을 확인할 수 있었다.

도 2a는 EB로부터 분화된 MAP-2-포지티브 세포를 보여주는 사진이다. P19 EC 세포를 신경세포로 분화시킨 다음에 MAP-2 항체를 이용해서 면역세포화학염색을 진행한 것이다. 패널 A는 RA만을 처리한 것이고, 패널 B는 RA와 α-에스트라디올 을 처리한 것이며, 패널 C는 RA+NAC를 처리한 것이고, 패널 D는 RA+NAC+BSO를 처리한 것이다. RA+NAC를 처리한 경우 많은 신경세포 분화가 진행되는 것을 확인할 수 있으며, 반면 항산화제인 α-에스트라디올은 효과를 나타내지 못했다. 또한, GSH 형성 억제제인 BSO를 처리한 경우 NAC에 의한 신경세포 분화 촉진 효과가 억제되는 것을 확인해 볼 수 있었다.

도 2b는 도 2a의 결과를 정량화한 그래프이다.

도 3은 RA+NAC 처리에 따른 세포내 GSH (글루타티온의 환원형) 양의 변화를 보여주는 그래프이다. GSH와 RA를 같이 처리한 결과 RA만을 처리한 것과 비교해 세포내 GSH의 양이 큰 차이를 보이지 못하고 있는 것을 확인했다. 그러나, RA+NAC를 처리했을 때, 세포내 GSH가 24시간 이후에 매우 유의하게 향상되는 것을 확인하였고, EB가 형성되는 3일 동안 계속 그 수준이 유지되는 것을 확인했다. BSO를 처리했을 때는 NAC에 의한 GSH의 세포내 수준 증가를 발견할 수 없었다.

도 4a는 RA+NAC 처리에 의한 P19 EC 세포의 분화에서 N-카드헤린의 발현 및 PI3-키나아제 활성의 변화를 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다. EB의 형성과 관련이 큰 접착 (adhesion) 단백질인 N-카드헤린이 RA+NAC를 처리했을 때 그 발현양이 더 증가하는 것을 웨스턴 블롯팅을 통해서 확인했다. 그리고 신경세포 분화와 관련이 있는 PI3-키나아제의 활성화 정도를 알아보기 위해서, 그의 다운스트림에 있는 Akt의 인산화된 형태의 양을 확인했다. RA+NAC를 처리했을 때 RA만을 처리한 경우보다 더 빠른 시간에 인산화된 Akt의 양이 증가되는 것을 확인함으로써, RA+NAC가 신경세포 분화 조절자인 PI3-키나아제를 활성화시킨다는 것을 알 수 있다.

도 4b는 PI3-키나아제의 억제제인 LY294002가 배발생 및 신경 분화에 미치는 영향을 분석한 그래프이다. EB의 개수는 100 mm 페트리 디쉬에서 카운팅하였다. EB를 유리 커버슬립에 플레이팅하고 분화시킨 다음 MAP-2 항체로 염색하였다. 그래프에서, 포지티브 세포는 MAP-2 항체로 염색되는 세포를 나타내며, LY는 PI3-키나아제의 억제제인 LY294002를 나타낸다.

도 5a는 RA+NAC 처리에 의한 P19 EC 세포-유래 GAD (GABA)- 및 TH (도파민)-포지키브 세포, 그리고 GFAP (신경교세포)-포지티브 세포를 보여주는 사진이다. 분화된 P19 세포를 TH-(녹색) 및 MAP-2(적색)-항체로 이중염색 하였다. TH 및 MAP-2 면역염색의 통합 이미지에서 TH⁺/MAP-2⁺ 세포는 노란색을 띤다.

도 5b는 도 5a 결과 중 GFAP (신경교세포)-포지티브 세포에 대한 결과를 정량화한 그래프이다. 전체 세포 중에서 MAP-2 포지티브 및 GFAP-포지티브 세포의 비율을 보여준다.

도 5c는 도 5a 결과 중 TH- 및 GAD-포지티브 세포에 대한 결과를 정량화한 그래프이다. 전체 세포 중에서 TH-포지티브 세포 및 GAD-포지티브 세포의 비율을 보여준다.

도 6은 P19 세포-유래 EB의 분리로부터 얻은 세포를 파킨슨병 마우스 모델에 이식한 후 이식된 세포의 생존도 (패널 A) 및 TH-포지티브 세포로의 분화 효율 (패널 B)을 보여주는 사진이다. 세포 이식은 6-OHDA의 주입 후 2주째에 실시하였다. P19 EC 세포의 생존도는 anti-네스틴 (생존 신경세포 마커) 항체에 의한 염색을 통하여 확인하고, 이미지는 형광현미경으로 얻었다. 세포이식 4주째에 파킨슨 동물모델의 뇌 절편을 TH-(적색)/MAP-2 (녹색) 항체로 이중염색하였다. TH⁺/MAP-2⁺ 세포는 통합된 이미지에서 노란색으로 나타난다.

도 7은 시간 경과에 따른 암페타민-유도 회전 반응을 보여주는 그래프이다. 암페타민에 대한 회전 반응을 이식 후 2, 4 및 6주째에 조사하였다. 데이터는 이식전 값에 상대적인 회전 스코어에서의 변화로 나타내었다. RA+NAC-처리 P19 세포를 이식한 마우스에서 회전 스코어에 대한 큰 변화가 관찰되었다.

본 발명은 줄기세포의 분화에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 줄기세포 분화 유도용 조성물, 줄기세포 분화 유도 방법 및 줄기세포를 포함하는 신경 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

줄기세포 (stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화 (differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극 (환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세 포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

현재 줄기세포는 세포치료제로서 각광을 받고 있는데, 신경세포의 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환 (neuronal diseases)의 세포치료제로서도 많은 연구가 이루어지고 있다. 특히 뇌신경계 질환은 다른 어느 질병보다 세포 이식치료에 가장 합당한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다. 이에, 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환 (demyelinating disease) 및 척추손상 (spinal cord injury) 등의 질환 치료에 줄기세포를 적용하려는 시도가 현재 진행 중이다 (Isacon O, Deacon T, Trends. Neurosci ., 10:477-482(1997); Studer et al., Nat. Neurosci ., 1:290-295(1998)).

한편, 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술이 필요하다.

WO 2005/003320은 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법을 개시하고 있으며, 보다 상세하게는 (a) 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자로 배양하는 단계; (b) 단계 (a)의 세포를 섬유아세포 성장인자 8과 Sonic Hedgehog로 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 세포를 뇌-유래 신경영양 인자로 배양하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 세포를 신경교 성상세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 방법을 개시하 고 있다. WO 2004/093812는 특정 화학구조식을 갖는 화합물이 배아줄기세포가 신경세포로 분화하는 데 유도제로 작용할 수 있다는 것을 개시하고 있다.

WO 2004/05308은 줄기세포에서 TGF-β 시그널링을 방해하여 도파민생성 (dopaminergic) 신경세포를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 현재까지 줄기세포를 특정세포 (특히, 신경세포)로 분화하는 효율적인 기술은 개발되어 있지 않은 상황이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 줄기세포의 효율적인 분화를 위하여 다양한 물질을 스크리닝한 결과, N-아세틸시스테인이 줄기세포를 분화시키는 데 가장 효과적인 물질임을 발견하였고, N-아세틸시스테인에 의해 분화된 줄기세포를 동물에 주입한 경우에도 소망하는 치료 효과가 나타남을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 줄기세포 분화 유도 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포를 포함하는 신경 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 N-아세틸시스테인을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 N-아세틸시스테인을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명자들은 줄기세포의 효율적인 분화를 위하여 다양한 물질을 스크리닝한 결과, N-아세틸시스테인이 줄기세포를 분화시키는 데 가장 효과적인 물질임을 발견하였고, N-아세틸시스테인에 의해 분화된 줄기세포를 동물에 주입한 경우에도 소망하는 치료 효과가 나타남을 확인하였다.

본 명세서에서, 용어 “줄기세포 분화 유도”는 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 배아유사구조체 (embryonic body)의 형성도 포함하는 것이 다. 즉, 본 발명의 줄기세포 분화 유도용 조성물은 줄기세포가 특정세포로 완전 분화되는 것을 효과적으로 달성되도록 할 뿐만 아니라 줄기세포에서 배아유사구조체를 형성시키는 데에도 매우 큰 효율성을 나타낸다.

본 발명에서 줄기세포 분화유도제로 이용되는 N-아세틸시스테인은 여러 입체이성질체로 존재할 수 있으며, 가장 바람직하게는 N-아세틸-L-시스테인이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 줄기세포 분화유도제로서 N-아세틸시스테인을 단독으로 포함하는 것보다는 다른 분화유도체를 추가적으로 포함하여, 이들 분화유도체 사이에 상승적인 (synergic) 효과가 발생되도록 하는 것이다. 본 발명의 조성물에 추가적으로 포함될 수 있는 분화유도제는 줄기세포의 분화유도제로 알려진 어떠한 것도 가능하며, 바람직하게는 레티노산 (retinoic acid), 아스코브산 (ascorbic acid), 멜라토닌 (melatonine), 사이토카인 (cytokine) 또는 여러 가지 성장인자 [예컨대, GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), EGF (epidermal growth factor), NGF (nerve growth factor)]을 포함하며, 가장 바람직하게는 레티노산을 추가적으로 포함한다. 종래기술에 따르면, 레티노산은 줄기세포, 예컨대 P19 EC (embryonic carcinoma cell) 세포가 신경세포로 분화하는 것을 유도한다. 그러나, 레티노산만에 의한 분화의 경우, 최종적으로 분화된 P19 EC 세포의 약 20-30%만이 신경세포 마커에 대하여 포지티브한 세포이기 때문에 분화율이 낮다. 한편, 본 발명에서 최초로 채택한 N-아세틸시스테인은 레티노산과 같이 이용되는 경우 상승적인 (synergic) 줄기세포 분화율을 나타낸다.

본 발명에 의해 분화될 수 있는 줄기세포는 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 세포는 본 발명이 적용될 수 있는 세포이다. 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 배아생식세포 및 배아종양세포를 포함하며, 바람직하게는 배아줄기세포 및 성체줄기세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의한 줄기세포의 분화는 신경세포로의 분화에 특히 유용하며, 보다 바람직하게는 도파민생성 (dopaminergic) 신경세포로의 분화에 특히 유용하다.

본 발명의 줄기세포 분화 유도방법은 크게 3 단계로 실시될 수 있다: (a) 줄기세포를 준비하는 단계; (b) N-아세틸시스테인 (바람직하게는, N-아세틸시스테인과 다른 줄기세포 분화유도제)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 배아유사구조체 (embryonic body)를 얻는 단계; 및 (c) 배아유사구조체로부터 분리 (dissociation)하여 얻은 세포를 배양하여 분화된 세포를 얻는 단계.

상기 단계 (b)에서, N-아세틸시스테인과 다른 줄기세포 분화유도제 (예컨대, 레티노산)의 처리는 서로 시간적으로 제한이 없다. 예를 들어, N-아세틸시스테인을 레티노산보다 먼저, 동시에 또는 후에 처리할 수 있다. 그리고 이 과정에서 이용되는 배양 디쉬는 배아유사구조체의 효율적인 형성을 위하여, 세포가 부착 (adhesion)될 수 있는 작용기가 없는 박테리얼 그레이드 배양 디쉬가 적합하다.

본 발명에서 이용되는 N-아세틸시스테인의 양은 일반적으로 1-500 μM, 바람 직하게는 20-300 μM, 보다 바람직하게는 30-250 μM, 보다 더 바람직하게는 60-150 μM, 가장 바람직하게는 약 100 μM이다. 본 발명에서 이용되는 다른 줄기세포 분화유도제, 예컨대 레티노산의 양은 일반적으로 1-500 nM, 바람직하게는 20-300 nM, 보다 바람직하게는 30-250 nM, 보다 더 바람직하게는 60-150 nM, 가장 바람직하게는 약 100 nM이다.

상기 단계 (c)는 N-아세틸시스테인 및/또는 다른 줄기세포 분화유도제의 부재 또는 존재 하에서 실시될 수 있으며, 바람직하게는 N-아세틸시스테인 및/또는 다른 줄기세포 분화유도제의 부재 하에서 실시된다.

한편, 단계 (a) 및 (c)에서는, 동물세포 배양에서 통상적으로 이용되며 동물세포의 부착이 가능한 조직 배양 디쉬, 멀티웰 플레이트 또는 폴리-L-라이신 코팅-유리 커버슬립이 이용될 수 있다.

단계 (c)에서, 세포 덩어리 (cell aggregates)인 배아유사구조체로부터 개별적인 세포를 분리 (dissociation)하는 것은, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 기계적인 방법 (mechanical methods) 및 효소적 방법으로 실시될 수 있으며, 트립신과 같은 효소를 이용하는 효소적 분리 방법이 바람직하다.

상기 단계 (b)는 배아유사구조체가 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 1-10일, 보다 바람직하게는 1-8일, 보다 더 바람직하게는 2-5일, 가장 바람직하게는 약 3일이다. 상기 단계 (c)는 분화 세포가 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 2-20 일, 보다 바람직하게는 3-15일, 보다 더 바람직하게는 5-12일, 가장 바람직하게는 약 9일이다.

본 발명에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어 혈청, 완충액 및 항산화제 등을 포함하는 α-MEM 배지를 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 분화유도 과정의 구체적인 일 실시예를, 줄기세포로서 P19 EC 세포를 이용하고 목적 분화세포가 신경세포인 경우를 예로 하여 상설하면 다음과 같다: 바이카보네이트, 항생제-항진균제, 소 혈청, 우태아혈청, 피루베이트와 타이로신 용액으로 보충된 α-MEM 배지가 있는 배양 디쉬 현탁액에 줄기세포 (예컨대, PC EC 세포)를 접종하고 미분화상태로 배양한다.

이어, N-아세틸시스테인 및 세포응집 (cellular aggregation) 유도제인 레티노산의 존재 하에서 P19 세포를 3일 동안 배양하여 배아유사구조체 (embryonic body)를 얻는다. 이 과정에서 이용되는 배양 디쉬는 배아유사구조체의 효율적인 형성을 위하여, 세포가 부착 (adhesion)될 수 있는 작용기가 없는 박테리얼 그레이드 배양 디쉬가 적합하다.

3일 동안의 배아유사구조체의 생성 후, 세포응집체를 트립신으로 분리하고 조직 배양 디쉬, 멀티웰 플레이트 또는 폴리-L-라이신 코팅-유리 커버슬립에 옮긴다. 그런 다음, P19 세포를 N-아세틸시스테인 및 레티노산의 부재 하에서 9일 동안 배양하여 분화된 신경세포를 얻는다.

본 발명에서 이용되는 N-아세틸시스테인은 줄기세포의 분화 과정에서, 세포 유사구조체의 형성을 향상시키며 또한 특정세포 (바람직하게는 신경세포, 보다 바람직하게는 도파민생성 신경세포)로의 분화율도 향상시킨다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) N-아세틸시스테인을 유효성분으로 포함하는 상술한 본 발명의 줄기세포 분화 유도용 조성물에서 줄기세포를 배양하여 형성된 줄기세포유사구조체 (embryonic body)를 분리 (dissociation)하여 얻은 세포 또는 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물에서 줄기세포를 배양하여 얻은 분화된 신경세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경 질환 (neuronal disease)의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 줄기세포 분화 유도용 조성물은 레티노산 (retinoic acid), 아스코브산 (ascorbic acid), 멜라토닌 (melatonine), 사이토카인 또는 여러 가지 성장인자 [예컨대, GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), EGF (epidermal growth factor), NGF (nerve growth factor)]을 포함하며, 가장 바람직하게는 레티노산을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에서 이용되는 줄기세포유사구조체로부터 분리하여 얻은 세포는 활성화된 PI3-키나아제를 갖는다. PI3-키나아제는 신경세포 분화의 생리학적인 조절자로 알려져 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에서 이용 되는 분화된 신경세포는 항-MAP-2 항체 및 항-TH 항체에 이중염색 (double staining)된다. 즉, 분화된 신경세포는 MAP-2 및 TH를 갖는다. MAP-2 및 TH는 각각 성숙 신경세포의 마커 및 도파민생성 신경세포의 마커로 알려져 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 질환은 신경세포의 손상에 의해 유발되는 모든 신경 질환 (neuronal diseases)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 신경 질환은 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 신경 퇴행성 질환은 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 파킨슨 질병이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19^th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 국소 주입 (local injection)이 가장 바람직한 투여방법이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1회 2 x 10⁵- 2 x 10⁶ 세포이며, 통상적으로 1회 또는 2회 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

P19 세포 배양 및 분화

P19 EC (embryonal carcinoma) 세포 (ATCC), P19 마우스 배아 종양 세포주의 서브클론을 이용하였다. P19 EC 세포는 신경 발달에 대한 인 비트로 모델 시스템으로 많이 이용되고 있는 세포이다. P19 세포는 미분화 상태로 조직 배양에서 쉽게 유지 및 증식시킬 수 있다. 또한, P19 EC 세포는 인 비보 신경 발달의 초기 단계를 반영하는 것으로 판단되고 있으며, 포유동물 신경 발달의 조절 기작을 분석하는 데 매우 적합한 인 비트로 모델 시스템으로 널리 사용되고 있다 (Masaharu et al., 2002).

서브크로닝하기 위하여, 바이카보네이트 (Sigma, 2.2 mg/ℓ), 1% 항생제-항진균제 (GIBCO), 7.5% 소 혈청 (GIBCO), 2.5% 우태아혈청 (GIBCO), 피루베이트 (Sigma, 100 mM)과 1% 타이로신 용액(Sigma)으로 보충된 100 ㎖ α-MEM (GIBCO) 배지가 있는 100 mm 배양 디쉬 현탁액에 100개의 PC EC 세포를 접종하였다. 신경 분화는 도 1과 같이 진행되었다. 조직 배양 디쉬에서 미분화 세포상태로 P19 EC 세포를 배양하였다 (단계 1). 세포응집 유도제인 RA (retinoic acid, Sigma, 1 μM, DMSO 0.1%>)의 존재 하에서 P19 세포를 0-3일 동안 배양하여 배아유사구조체 (embryonic body)를 얻었다 (단계 2). 3일 동안의 배아유사구조체의 생성 후, 세포응집체를 1% 트립신 (GIBCO)으로 분리하고 조직 배양 디쉬, 멀티웰 플레이트 또 는 폴리-L-라이신 코팅-유리 커버슬립에 옮겼다. 분리된 P19 세포를 RA의 부재 하에서 성장시켰다. 9일 후, P19 EC 세포가 신경세포로 분화되었다 (단계 3). N-아세틸시스테인 (Sigma) 또는 아스코브산 (Sigma)을 최종 농도가 100 μM (신경 분화에 가장 효율적인 농도)이 되도록 배지에 첨가하였다.

면역세포화학

세포를 고정화하고 메탄올/아세톤 (50/50)에서 5분 동안 실온에서 투과화 (permeabilized) 한 다음, PBS로 3회 세척하고 0.1 M PBS-3% H₂O₂로 5분 동안 처리한 후, 5% BSA (bovine serum albumin)을 함유하는 PBS로 1시간 동안 블록킹하였다. 이어, DAB/니켈 염색 방법에 따라 염색하였다. 이용된 항체와 희석도는 다음과 같다: TH 모노클로날 항체 1:1000 (Santa Cruz biotechnology, CA, USA), 마이크로튜블-연합 단백질-2 (MAP-2) 모노클로날 항체 1:300 및 신경교-원섬유성 산성 단백질 (GFAP) 모노클로날 항체 1:1000 (Santa Cruz biotechnology, CA, USA), 도파민 트랜스포터 (DAT) 모노클로날 항체 1:500 (Santa Cruz biotechnology, CA, USA), 네스틴 폴리클로날 항체 1:50 및 훼스트 33258. 제1차 항체의 검출을 위하여, 제조회사의 프로토콜에 따라 바이오틴-결합 제2차 항체 및 형광-표지 (Alexa 488 or Alexa 594, Molecular Probes, Oregon, USA) 제2차 항체를 이용하였다. 유리 커버슬립 (폴리-L-라이신으로 코팅됨) 상의 세포를 마운팅 배지에 놓고 형광 현미경 (Nikon, Tokyo, 일본) 및 공초점 현미경 (LSM 510 meta, Zeiss, Feldbach, 스위스)을 이용하여 사진을 얻었다.

면역블롯팅

P19 EC 세포로부터 3일 동안의 배발생 후, 세포를 얼음-냉장 PBS로 2회 세척하였다. 라이시스 완충액 (1% TX-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM Na₃VO₄, 40 mM NaF, 5 mM 에틸렌 글라이콜-비스 (β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 0.2% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 0.5% 소듐 디옥시 콜레이트 (SDC) 및 0.2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF))을 세포에 첨가하였다. 세포 추출물을 음파파쇄한 다음, 15,800 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 얻어진 상청액 (RIPA 파쇄물)을 면역블롯팅에 이용하였다. RIPA 파쇄물의 단백질 농도를 BSA를 표준물질로 이용하여 Bradford (Bradford 1976) 방법으로 결정하였다. 시료 완충액을 파쇄물의 분획 (50 ㎍ 단백질)에 첨가하고, 3분 동안 끓인 후, 환원 조건 하에서 SDS-PAGE (Laemmli 1970) 하였다. 그런 다음, 단백질을 니트로셀룰로오스 (NC) 막 (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)에 전이시킨 후, UK) phospho-Akt 항체 (Santa Cruz, CA, USA)로 면역블롯팅 하였다. 블롯들을 ECL 검출 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech)으로 검출하였다. p-Akt와 액틴 밴드에 대한 정규화한 덴시토미터 (Vilber Lourmat, Torcy, France)를 이용하여 상대적인 단백질 양을 결정하였다.

인 비보 연구

25 g의 웅성 C57BL/6 마우스를 인 비보 연구에 이용하였다. 모든 실험은 중앙대학교에 허가된 바에 따라 실시하였다. 모든 마우스는 5-11 주령의 웅성 마우스였고, 21± 1℃, 습도 50± 10% 및 광/암 주기 12 hr/hr로 사육하였고, 사료와 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. C57BL/6 마우스는 SAMTAKO (Korea, KyungGi-Do)에서 구입하였다. 펜토바비탈 마취 하에서, 3 ㎕ 6-OHDA (3 ㎍/ℓ in 노말 염수)를 선조체 번들에 정위고정적으로 주입하였다 (전정 후측으로 0.0 mm; 미들라인 측면으로 2.0 mm; 경막 복면으로 3.0 mm). 절단바는 제로 (경막내 라인) 밑의 3.55 mm에 세팅하였다.

6-OHDA 처리 2주 후, 암페타민 (amphetamine)-유도 터닝 행동 (암페타민 0.1 mg/kg i.p.)에 대하여 실험동물을 조사하였다. 1.5분 간격으로 마우스에 대하여 조사하였고, 손상된 다른 부분에서 떨어져 1분당 최소 400 풀 턴의 네트 회전성 비대칭 (net rotational asymmetry)을 나타내는 동물을 선택하여 이식 수술을 하였다. 이식 후 2주, 4주 및 6주 경과시의 암페타민-유도 레이션 (ration)을 평가하였다.

배발생 3일째에, 세포를 트립신 처리하고, 배지에 현탁하였다. 실험동물을 펜토바비탈로 마취시키고 정위고정 프레임에 위치시켰다. 18-게이지 바늘을 이용하여, 세포 현탁액 (4000 세포/㎕) 5 ㎕를 10분에 걸쳐 손상된 선조체에 주입하였다 (전정 후측으로 0.0 mm; 미들라인 측면으로 2.0 mm; 경막 복면으로 3.4 mm).

이식후 2주 및 6주째에, 동물을 마취시키고 PBS 내의 4% 파라포름알데히드를 심장내 관류시켰다. 뇌를 제거하고 PBS 내의 30% 수크로스에 하룻밤 동안 함침시킨 다음, 냉동 마이크로톰으로 절편화 하였다. 자유-유영 뇌 절편 (30 ㎛ 두께)에 대하여 상술한 바와 같이 TH-, GAD, 및 MAP-2- (Santa Cruz biotechnology, CA, USA) 면역조직화학염색 하였고, 그 이미지를 공초점 현미경 (LSM 510 meta, Zeiss, Feldbach, 스위스)으로 얻었다.

축삭 성장의 측정

3개의 독립된 실험 세트에서 얻은 최소 6개의 배양물의 무작위 선택 부위로부터 얻은 MAP-2⁺ 세포의 이미지를 얻었다. Olympus 디지털 카메라 시스템과 Olympus 이미지 분석기 (Olympus, Tokyo, 일본)가 장착된 Olympus 위상차 현미경을 이용하여 형태학적 특성을 정량화하였다. 초기 축삭 (primary neurite)의 길이를, 최장 브랜치의 구간 (soma)으로부터 끝 (tip)까지의 거리로 정의하였다. 축삭의 종합 정도 (total extent)는 세포 당 모든 축삭의 총 길이로 정의하였다. 세포 당 축삭의 수는, 길이가 두개의 세포 직경보다 긴 모든 프로세스로 정의하였다.

세포수 카운팅 및 통계적 분석

40 또는 200 배율의 아이피스 리드를 이용하여 각각의 웰의 6-12 단일 무작위 선택 부위에서의 면역반응성 또는 DAPI-염색 세포의 수를 측정하였다. 각각의 실험에서 3-6 배양 웰을 분석하였다. 데이터는 평균± SEM으로 나타내었다. 2 그룹 이상이 관여하여 통계적 비교를 할 때, Tukey post hoc analysis (SPSS, Chicago, IL, USA)를 갖는 ANOVA를 이용하였다.

실험 결과

NAC 는 신경 분화 과정에서 배아유사구조체의 생성을 향상시킨다

배아유사구조체 (embryonic bodies)의 형성은 신경 분화에서 중요한 단계이다. 미분화 P19 EC 세포를 레티노산 (1 μM)로 응집시키고, 100 mm 비부착성 페트리 디쉬에서 현탁액으로 3일 동안 배양하였다. 배아유사구조체의 발달에 대한 N-아세틸시스테인 (NAC)의 영향을 평가하기 위하여, NAC (100 μM)와 RA (1 μM)의 공동처리 또는 RA (1 μM) 단독처리한 후 형성된 배아유사구조체의 수 및 크기를 관찰하였다. RA 단독처리 및 NAC와 RA의 공동처리에 의한 배아유사구조체의 발달은 크게 차이가 있었다 (도 1a). 직경 0.05 ㎛ 단위로 0.05 ㎛ 내지 0.2 ㎛로 배아유사구조체를 분류하였다 (도 1b). RA와 함께 NAC를 공동처리한 경우에는 RA 단독처리보다 매우 큰 직경을 갖는 배아유사구조체가 형성되었다 (도 1a 및 1b). NAC+RA에 의해 발달된 배아유사구조체 중에서 직경이 0.10 ㎛ 이하인 것의 개수는 RA에 의해 발달된 것보다 적었다. 그러나, NAC+RA에 의해 발달된 배아유사구조체 중에서 직경이 0.15 ㎛ 이상인 것의 개수는 RA에 의해 발달된 것보다 많았다. 한편, 100 mm 조직 배양 디쉬에서 총 배아유사구조체의 수를 조사하였고, 그 결과는 다음 표 1과 같다.

처리 방법	배아유사구조체의 개수
RA	1826± 70.65
NAC+RA	2242± 113.07
α-에스트라디올+RA	1901± 76.66
NAC+RA+BSO	1912± 60.23

표 1에 기재된 바와 같이, NAC와 RA의 공동처리에 의해 형성된 배아유사구조체의 개수는 RA 단독처리의 경우보다 훨씬 크다. NAC와 RA의 공동처리에 의해 형성된 배아유사구조체의 개수는 2242± 113.07으로 크게 증가하였다. 한편, NAC와 같이 항산화제의 일종인 α-에스트라디올로 처리한 경우에는 이러한 증가된 패턴이 관찰되지 않았다. 결과적으로, NAC는 RA에 의한 P19 세포 응집에 대한 매우 유효한 촉진제임을 알 수 있다. NAC와 RA의 공동처리에 의해 형성된 배아유사구조체에서, 세포 대 세포 상호작용이 증가되었다. 또한, NAC와 RA의 공동처리 그룹에서 BSO (글루타티온 환원형 GSH의 억제제, L-buthionine (S,R)-sulfoximine, GIBCO)를 처리한 결과 배아유사구조체 개수의 증가 현상이 현저하게 감소하였는데, 이는 NAC가 세포내 GSH의 농도를 증가시켜 배아유사구조체의 개수를 증가시킨다는 것을 나타낸다.

NAC 는 신경 분화의 효율을 향상시킨다

NAC에 의한 배발생의 개선이 신경세포 분화에 직접적으로 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여, RA 또는 NAC+RA에 의한 P19 EC 세포의 분화를 면역화학염색으로 조사하였다. 분화된 P19 EC 세포를 트립신 처리한 다음, 부드럽게 재현탁하고 폴리-L-라이신 코팅 유리 커버슬립 (2% CS가 있는 α-MEM) 상에서 7일 동안 배양하였다. 세포를 에탄올/아세톤 (50/50)으로 고정화한 다음, 신경세포 특이 마커인 MAP-2에 대하여 면역세포화학염색을 실시하였다 (도 2a, 패널 A-D).

면역세포화학염색 결과, 신경세포 마커의 발현 정도는 NAC+RA의 경우가 RA보다 2배 이상이었다. 그러나, RA의 경우와 RA+α-에스트라디올의 경우, 신경 분화율이 거의 동일하였다. 또한, NAC와 RA의 공동처리 그룹에서 BSO를 처리한 결과 신경 분화율이 RA보다 조금 낮았다.

MAP-2에 대하여 염색된 P19 세포에 대하여 초기 축삭의 길이 및 개수를 분석하였다 (표 2).

항목	RA 처리-p19 EC 세포 (n = 50)	RA+NAC 처리-p19 EC 세포 (n = 90)
초기 축삭 (μM)	19.69± 0.89	20.13± 0.64
총 축삭 정도 (μM)	34.61± 1.27	82.32± 1.56
세포당 축삭 수	2.11± 0.12	4.57± 0.31

NAC+RA는 RA와 비교하여 초기 축삭의 길이 및 개수를 크게 증가시켰다. 특히, NAC+RA에 의해 분화된 P19 세포에서 초기 축삭의 개수는 RA 경우보다 2배 이상 증가하였다.

따라서, NAC+RA에 의한 배발생 (embryogenesis)의 개선은 P19 EC 세포로부터 신경 분화율을 효과적으로 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 또한, NAC+RA에 의해 분화된 신경세포는 RA에 의해 분화된 신경세포와 비교하여 성숙도가 더 컸다.

NAC 에 의한 GSH 유도는 P19 EC 세포의 배발생 및 신경 분화에 영향을 미친다

앞선 실험에서, NAC가 배발생 및 신경 분화를 촉진한다는 것을 확인하였다. N-아세틸-L-시스테인 (NAC)은 잘 알려진 GSH 전구체이다. 그러나, GSH+RA 처리 조건은 RA 단독처리와 비교하여 배발생 및 신경 분화를 촉진시키지 않았다. P19 EC 세포 배발생에서 GSH+RA를 처리한 이후, GSH로 세포를 처리한 경우 세포내 GSH 양은 거의 변화가 없었다. 세포 내 GSH의 보다 높고 지속적인 농도는 NAC+RA로 P19 EC 세포 배발생을 한 경우에 달성될 수 있었다. P19 EC 세포의 신경 분화에 대한 NAC-유도 GSH의 영향을 조사하기 위하여, P19 EC 세포를 BSO (100 μM)로 처리하여 GSH의 농도를 낮추었다. BSO는 γ-글루타밀시스테인 신테타아제의 비가역적 억제제로 잘 알려진 물질이다 (Toxicology 152, 2000, 75-84). BSO+NAC+RA로 처리한 결과, 배발생 및 신경분화에서 NAC 효과가 관찰되지 않았다 (도 3). BSO는 RA에 의한 신경분화 시스템에서 NAC 추가 처리 효과를 감소시켰다. BSO는 세포내 GSH 함량을 상당히 감소시켰다 (도 3). 세포내 GSH 함량 조절은 NAC에 의한 배발생 및 신경 분화 유도에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다. 따라서, NAC에 의한 GSH 유도는 P19 EC 세포의 배발생 및 신경 분화에 영향을 미친다.

NAC +RA 공동처리에 의한 배아유사구조체의 발달 동안에 PI3 - 키나아제 활성이 상향-조절된다

NAC가 P19 EC 세포의 배발생 및 신경분화율을 증가시킨다는 것을 확인하였다. N-카드헤린 및 L-cadherin에 관여하는 접착 분자 (adhesion molecule)들은 배발생뿐만 아니라, 신경분화를 위한 세포 대 세포의 상호작용에서 중요한 역할을 담당한다 (Ann N Y Acad Sci. 2004 Apr;1014:140-54). NAC+RA 처리의 경우, 접착 분자-매개 시그널링이 배발생을 촉진시키는 지를 연구하기 위하여, 웨스턴 블롯팅 방법으로 N-카드헤린의 발현 패턴을 조사하였다. NAC+RA 신경 분화 조건에서 N-카드헤린의 발현은 초기 배발생 단계 (24 hr)에서 RA보다 상당히 증가된 패턴을 보였다. NAC+RA 조건에서 초기 단계의 N-카드헤린 발현 증가는, NAC+RA 처리가 배아유사구조체를 초기에 RA보다 많이 생성시킨다는 결과와 거의 일치하는 것이다. 그러나, RA 조건에서 N-카드헤린의 발현은 48 hr부터 상향-조절되어 72 hr째에는 NAC+RA와 비교하여 거의 차이가 없는 것이 관찰되었다.

PI3-키나아제는 신경 분화 세포의 생리학적 조절자로 알려져 있다. PI3-키나아제의 활성화가 NAC+RA-유도 분화의 개선에 관여하는 지를 조사하기 위하여, P13-키나아제의 시그널 전달에서 다운스트림에 있는 Akt의 활성도를 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 3일째 응집 P19 세포로부터 세포 분쇄물을 준비하고 인산화 Akt를 인지하는 항체를 처리하였다. 웨스턴 블롯팅 결과, NAC+RA-처리된 P19 세포가 RA 단독처리된 것보다 인산화-Akt의 증가된 양을 보여주었다 (도 4a). NAC 처리에 의한 배아유사구조체의 발달 동안 활성화된 PI3-키나아제가 유지되었다. α-에스트라디올은 배아유사구조체 및 신경 분화에 영향을 미치지 않기 때문에, Akt의 활성화 형태의 증가에 영향을 미치지 않는다. LY294002 (GIBCO)를 이용하여 PI3-키나아제를 억제하였다. LY294002 (10 μM)를 처리한 경우, NAC+RA 공동처리에 의한 배아유사구조체의 개수가 감소하였다. NAC 및 RA와 함께 PI3-키나아제 억제제 (10 μM LY294002)를 처리한 경우, NAC와 RA 공동처리 세포에서보다 신경 세포 분화가 억제되었다 (도 4b). 이러한 실험 결과는, PI3-키나아제가 NAC+RA 공동처리에 의한 신경 발달에서 주요한 매개자임을 보여주는 것이다.

NAC 는 도파민생성 세포로의 분화 효율을 증가시킨다

상기의 실험 결과는 NAC+RA 처리가 P19 EC 세포로부터의 신경 세포 분화를 증가시킨다는 것을 명확하게 보여주고 있다. 더 나아가, NAC 처리가 도파민생성 신경세포 및 GABA생성 신경세포의 분화에도 기여하는 지를 연구하기 위하여, GABA생성 신경세포에 대한 anti-GAD 항체, 도파민생성 신경세포에 대한 anti-TH 항체, 신경교 세포에 대한 anti-GFAP 항체 및 성숙 신경세포에 대한 anti-MAP-2 항체를 이용하여 이중 면역형광염색을 실시하였다. 세포를 9일 동안에 걸쳐 배아유사구조체로부터 분화시킨 다음, 이중 면역형광염색을 실시하였다.

NAC+RA에 의하여 분화된 P19 EC 세포는 MAP-2 and TH에 대한 항체로부터 염색이 되었으나, RA에 의해 분화된 세포는 염색이 되지 않거나 또는 조금 염색되었다 (도 5a). NAC+RA 처리 전체 배양물에서 TH⁺ 세포 및 MAP-2에 대한 머젼스 (mergence)의 평균 백분율은 48.72± 2.12%이었으나, RA 단독처리의 경우에는 7.12± 9.32%이었다. 특히, 앞선 결과와 동일하게, MAP-2 포지티브 세포는 NAC+RA의 경우가 RA보다 훨씬 많았다.

GABA생성 신경세포에 대한 anti-GAD 항체와 anti-MAP-2 항체 또는 신경교 세포에 대한 anti-GFAP 항체와 anti-MAP-2 항체를 이용하여 이중 면역형광염색을 하였다. NAC+RA 처리에서 GAD⁺ 세포 및 MAP-2에 대한 머젼스 (mergence)의 평균 백분율은 21.7± 7.5%이었으나, RA 단독처리의 경우에는 24.32± 0.456%이었다. 이와 유사하게, NAC+RA 처리에 의하여 분화된 P19 세포에서 GFAP 포지티브 세포는 RA 처리보다 감소된 양상을 나타내었다.

본 실험 결과들을 통하여, NAC가 도파민생성 신경세포의 발달을 증가시키지만, GABA생성 신경세포와 신경교 세포의 발달은 억제시킨다는 것을 알 수 있다.

NAC 는 파킨슨병 동물 모델에서 P19 세포 이식에 의한 세포치료의 효율을 증 가시킨다

상술한 in vitro 실험을 통하여 NAC+RA 공동처리가 도파민생성 신경세포 분화 효율을 크게 증가시킨다는 것을 입증하였다. 더 나아가, 이러한 NAC 효과가 in vivo에서도 재현되는 지 여부를 확인하기 위하여, 6-OHDA에 의한 파킨슨병 동물 모델에 세포 이식을 실시하였다. 이식하기 전, in vitro에서 발달된 배아유사구조체로부터 이식할 세포를 준비하였고, Hoechst 33324로 태깅하였다. 이용된 NAC+RA 공동처리 배양 시스템이 신경 분화를 향상시키는 지 여부 및 이식에 이용된 NAC+RA-처리 세포가 in vivo에서 도파민생성 신경세포를 포함하는 지 여부를 분석하였다.

6-OHDA 주입 후 2주째에 P19 세포 이식을 실시하였다. 이식된 세포의 생존도 및 신경 분화 기회를, Hoechst 33324와 anti-네스틴 항체에 의한 이중염색을 한 다음 공초점 현미경으로 관찰하여 형태학적으로 조사하였다 (도 6a). 도 6a에서 볼 수 있듯이, 이식 후 2주째에 NAC+RA-처리 이식 세포의 92.6%가 Hoechst 33324와 anti-네스틴 항체의 멀전스 (mergence)를 나타내었으나, RA-처리 이식 세포 및 대조군은 면역조직염색에 대한 멀전스가 검출되지 않았다. 이식 4주째, MAP-2 항체 및 TH 항체로 이중 면역형광염색을 실시하였다. 도 6b에서 볼 수 있듯이, NAC+RA-처리 P19 이식 세포에서 MAP-2 및 TH의 멀전스가 RA 단독처리 보다 더 강하게 나타났다. 이어, 6-OHDA-유도 파킨슨병 마우스 모델에서, 암페타민-유도 운동 비대칭의 기능적 회복을 실험하였다. 암페타민에 대한 회전 반응을 이식 후 2, 4 및 6주째에 조사하였다. NAC+RA 처리에 의하여 분화된 세포를 갖는 동물은 시간이 경과함에 따라 암페타민-유도 터닝 행동으로부터 회복을 나타내었으나, RA에 의한 분화 세포를 갖는 동물은 그러하지 않았다 (도 7). 회전 스코어의 감소는 점진적으로 이루어졌고, NAC+RA-처리 분화된 P19 EC 세포를 갖는 동물은 이식후 2주, 4주 및 6주째에 회전 스코어가 크게 감소되었다. 그러나, RA-분화 시스템에 의한 세포를 이식받은 동물은 이식후 2주, 4주 및 6주째에 대조군 (sham)과 비교하여 차이를 나타내지 않았다 (도 7).

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 신규한 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 줄기세포 분화 유도 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 줄기세포를 포함하는 신경 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 줄기세포로부터 효율적으로 분화세포 (바람직하게는, 신경세포, 보다 바람직하게는 도파민생성 신경세포)를 얻을 수 있다. 본 발명에 의해 제작된 신경세포는 신경손상에 의해 유발된 다양한 신경 질환을 치료하는 데 매우 유효하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

Anderson ME, Meister A, Intracellular delivery of cysteine. Methods Emzymol. 143:313-325, 1987

Brahma B, Forman RE, Stewart EE, Nicholson C and Rice ME, Ascorbate inhibits edema in brain slices. J Neurochem. 74(3):1263-1270, 2000

Cotfreave IA, N-acetylcysteine: pharmacological considerations and experimental and clinical applications. Adv . P. 38:205-227, 1997

Dolores D, Cecile MK and Terrance JK, Expression of Glutamate-cysteine ligase during mouse development. Molecular reproduction and development. 62:83-91, 2002

Frei B, Kim MC and Ames BN, Ubiquinol-10 is an effective lipid-soluble antioxidant at physiological concentrations. Proc Natl Acad Sci U S A. 87(12):4879-83, 1990

Frida Ponthan, John IJ, Lena K, Juan C and Per Kogner, The synthetic retinoid RO 13-6307 induces neuroblastoma differentiation in vitro and inhibits neuroblastoma tumor growth in vivo. Int . J. Cancer. 104:418-424, 2003

Gao X, Bian W, Yang J, Tang K, Kitani J, Atsumi T, and Jing N, A Role of N-cadherin in neuronal differentiation of embryonic carcinoma P19 cells, BBRC 284: 1098-1103, 2001

Griffith OW and Meister A, Origin and turnover of mitochondrial glutathione. Proc . NAtl . Acad . Sci . USA 82:4668-4672, 1985

Grunewald RA, Ascobic acid in the brain. Brain Res Rev 18:123-133, 1993

Guillemain I, Fontes G, Privat A, and Chaudieu I, Early programmed cell death in human NT2 cell cultures during differentiation induced by all-trans-retinoic acid. J. Neuroscience Research 71:38-45, 2003

Henry PT and Chandry MJ, Effect of ascorbic acid on infarct size in experimental focal cerebral ischemia and reperfusion in a primate model. Acra Neurochir 140:977-980, 1998

Huntter DE., Till BG. and Greene JJ, Redox state changes in density-dependent regulation of proliferation. Exp . Cell. Res. 232: 435-438, 1997

Jacson MH, Edward WC and Craig H, Altered differentiation in rat and rabbit limb bud micromass cultures by glutathione modulating agents. Free Radi. Biol . and Medi. 31(12):1582-1592, 2001

Jones-Villeneuve EM, McBurney MW, Rogers KA and Kalnins VI, Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiation into neurons and glial cells. J. Cell. Biol . 94:253-262, 1982

Jones-Villeneuve EM, Rudnichi MA, Harris JF and Mcburney MW, Retinoic acid induced neural differentaition of embryonal carcinoma cell. Mol . Cell. Biol. 3:2271-2279, 1983

JunYan, LorenzStuder and Ronald DGMcKay, Ascorbic acid increases the yield of dopaminergic neurons derived from basic fibroblast growth factor expanded mesencephalic precursors, J Neurochem 76:307-311, 2001

Kalir HH and Mytilineou C, Ascorbic acid in mesencephalic cultures-effects on dopaminergic neuron development. J. Neurochem . 57: 458-464, 1991

Kratzing CC, Kelly JD and Kratzing JE, Ascorbic acid in fetal rat brain, J Neurochem 44:1623-1624, 1985

Kuo Ch, Yonehara N, Hata F and Yoshida H, Subcellular distribution of ascorbic acid in rat brain, Jpn J Pharmacol 28:789-791, 1978

Laeng P, Decimo D, Pettmann B, Janet T and Labourdette G, Retinoic acid regulates the development of oligodendrocyte precursor cells in vitro. J. Neurosci. Res. 39:613-633, 1994

Love JM and Gudas LJ, Viamin A differentiation and cancer. Curr . Opin . Cell Biol 6:613-633, 1994

Lovat PE, Irving H, Annicchiarico-Petruzzelli M, Bernassola F, Malcolm AJ, Pearson Ad, Melino G and Redfern CP, Apoptosis of N0-type neuroblastoma cells after differentiation with 9-cis-retinoic acid and subsequent washout. J Natl Cancer inst 89:446-452, 1997

Maihous C, Howard MK, and Latchman DS, A common pathway mediates retinoic acid and PMA-dependent programmed cell death (apoptosis) of neuronal cells. Brain Res. 664:7-12, 1994

Malek RL and Halvorsen SW, Opposing regulation of ciliary neurotrofic factor receptor on neuroblastoma cells by distinct differentiation agents. J. Neurobiol . 32:81-94, 1997

Margaret ER, Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci 23(5):209-216, 2000

McBurney MW, Jones-Villeneuve EM, Edwards MK, and Anderson PJ, Control of muscle and neuronal differentiation on a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature 299:165-167, 1982

Milby K, Oke A and Adams RN, Detailed mapping of ascorbate distribution in rat brain. Neurosci Lett 28:15-20, 1982

Mizuchima Y, HArauchi T, Yoshizaki T and Makino S, A rat mutant unable to synthesize vitamin C. Experimentia 40:359-361, 1984

OKazawa H, Shimizu J, kamei M, Imafuku I, Hamada H and Kanazawa I, Bcl-2 ingibits retinoic acid-induced apoptosis during the neural differentiation of embryonal stem cells, J. Cell Biol . 132:955-968, 1996

Peluso JJ, N-cadhrine-mediated cell contact regulates ovarian surface epithelial cell survival. Biol . Signals Recept 9:115-121, 2000

Perez-Pinzon MA, Patricia LM, Myron R and Thomas JS, Antioxidant, mitochondrial hyperoxidation and electrical recovery after anoxia in hippocampal slices. Brain Res 754:163-170, 1997

Peter Erhardt, Jakob Troppmair, Ulf PR and Geoffrey MG, Differential regulation of Raf-1 and B-Raf and Ras-Dependent activation of Mitogen-Actibated Protein Kinase by Cyclic AMP in PC12 Cells. Molecular and Cellular Biology 15(10):5524-5530, 1995

Pilling D, Akbar AN, Shamsadee N, Scheel-Toellner D, Buchley C and Salmon M, High cell density probides potent survival signals for resting T-cells. Cell Mol Biol 46:163-174, 1998

Rebec GV and Pierce RC, A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamergic transmission. Prog Neurobiol 42:537-565, 1994

Reynolds CP, Kane DJ, Eiohorn PA, Matthay KK, Crouse VL, Wilbur JR, Shurin SB and Seeger RC, Response of neuroblastoma to retinoic acid in vitro and in vivo. Prog Clin Biol Res 366:203-211, 1991

Rice Me, Ascobate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci 23:209-216, 2000

Rice Me, Lee ME, and Choy Y, High levels of ascorbic acid, not glutathione, in the CNS of anoxia-tolerant reptiles contrasted with levels in anoxia-intolerant species. J Neurochem 64:1790-1799, 1995

Rosenberg PA, Quaglino DJr and Bergamini G, Ascorbic acid and connective tissue, in ascorbic acid: biochemistry and biomedical cell biology (Harris R., ed), Plenum Press, New York.

Scianmanna MA and Lee CP, Ischemia/reperfusion-induced injury of forebrain mitochondria and protection by ascorbate, Arch Biochem Biophys 305:215-224, 1993

Sen C K and Packer L, Antioxidant and redox regulation of gene transcription. FASEB J. 10:709-720, 1996

Sidell N, Retinoic acid-induced growth inhibition and morphologic differentiation of human neuroblastoma cell in vitro. J. Natl Cancer Inst 68:589-596, 1982

Sun Y and Oberly LW, Redox regulation of transcriptional activators. Free. Radic. Biol . Med . 21:335-348, 1994

Tong L, Werrbach-Perez K, and Perez-Polo JR, Retinoic acid induced apoptosis in PC12 cells independent of neurotrophic factor. J. Neurochem . 68:1424-1434, 1997

Claims

N-아세틸시스테인을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 레티노산 (retinoic acid), 아스코브산(ascorbic acid), 멜라토닌 (melatonine), 사이토카인(cytokine) 및 성장인자로 구성된 군으로부터 선택되는 분화유도제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 분화유도제는 레티노산인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포의 분화는 신경세포로의 분화인 것을 특징 으로 하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 신경세포는 도파민생성 (dopaminergic) 신경세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
N-아세틸시스테인을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 분화 유도용 조성물은 레티노산 (retinoic acid), 아스코브산(ascorbic acid), 사이토카인들(cytokine) 및 성장인자들로 구성된 군으로부터 선택되는 분화유도제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 분화유도제는 레티노산인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 줄기세포의 분화는 신경세포로의 분화인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 신경세포는 도파민생성 (dopaminergic) 신경세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 유도 방법.
(a) N-아세틸시스테인을 유효성분으로 포함하는 상기 제1항의 줄기세포 분화 유도용 조성물에서 줄기세포를 배양하여 형성된 줄기세포유사구조체 (embryonic body)를 분리 (dissociation)하여 얻은 세포 또는 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물에서 줄기세포를 배양하여 얻은 분화된 신경세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경 질환 (neuronal disease)의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 분화 유도용 조성물은 레티노산 (retinoic acid), 아스코브산(ascorbic acid), 멜라토닌 (melatonine), 사이토카인 (cytokine) 및 성장인자로 구성된 군으로부터 선택되는 분화유도제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 분화유도제는 레티노산인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 신경세포는 도파민생성 (dopaminergic) 신경세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 줄기세포유사구조체로부터 분리하여 얻은 세포는 활성화된 PI3-키나아제를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 분화된 신경세포는 항-MAP-2 항체 및 항-TH 항체에 의해 이중염색되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 신경 질환은 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.