KR20070002058A - 재생 세포를 함유하는 세포 운반체 및 세포 운반체 수용장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재생 세포, 예를 들면 줄기 및 기원 세포를 함유하는 세포 운반체 부분 및 세포 운반체 수용 부분을 포함하는 장치에 관한 것이다. 이 장치는 척추 유합술 관련 질환 및 긴 뼈 또는 납작 뼈 관련 결함을 포함하는 뼈 관련 질환의 치료에 유용하다. 본 장치는 재생 세포를 분리 및 농축시키기 위한 개시된 자동화 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있다.

재생 세포, 세포 운반체, 척추 유합술, 자동화시스템

Description

재생 세포를 함유하는 세포 운반체 및 세포 운반체 수용 장치{CELL CARRIER AND CELL CARRIER CONTAINMENT DEVICES CONTAINING REGENERATIVE CELLS}

<관련 출원>

본 출원은 2001년 12월 7일에 출원된 미국 임시 출원 번호 제60/338,856호의 권리를 주장하는, 발명의 명칭이 "SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS"인 2002년 12월 9일에 출원된 미국 출원 번호 제10/316,127호의 일부-계속 출원이다. 본 출원은 또한 2004년 3월 19일에 출원된, 발명의 명칭이 "CELL CARRIER AND CELL CARRIER CONTAINMENT DEVICES AONTAINING ADIPOSE DERIVED CELLS"인 미국 임시 출원 번호 제60/554,455호에 대한 우선권을 주장한다. 상기한 출원들의 내용은 본원에서 참고문헌으로 명백히 인용된다.

본 발명은 뼈 관련 질환의 치료를 위한, 재생 세포, 예를 들면 지방 유래 재생 세포와 함께 세포 운반체 부분 및 세포 운반체 수용 부분으로 이루어진 장치의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에서 개시된 신규 조합물은 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진하는데 유용하다. 본 발명은 예를 들면, 양수체 척추 유합술 수술 형태의 요법을 필요로 하는 질환을 위한, 보통 비-골전도 영역에서의 뼈 형성을 촉진하는데 특히 유용하다.

거의 6,500만 미국인이 척추 부근 신경에 대한 압박과 디스크 변성에 의해 야기되는 배통(背痛)을 앓고 있다. 일반적인 초기 치료 선택방법들은 스트레칭 운동, 등 근육으로의 진통 약물 또는 스테로이드 주사를 포함한다. 이들 치료가 실패할 경우의 선택방법으로 척추 유합술 수술이 있게 된다. 미국 정형외과 전문의 학회에 의하면, 매년 약 250,000건의 척추 유합술 수술이 대부분 45세 내지 64세 사이 연령의 성인에게 행해진다.

척추 유합술은 척주를 구성하는 척추들 중 2개 이상이 골 이식편 및 단일의 단단한 뼈로 되는 내부 장치(예를 들면 막대)와 함께 유합되게 하는 방법이다. 척추 유합술은 척추들 사이의 부자연스런 움직임을 없애고, 이것은 다시 신경 말단에 대한 압박을 감소시킬 수 있다. 또한, 척추 유합술은 예를 들면 외상에 의해 야기된 척추에 대한 손상; 척추들 사이의 완충 디스크의 돌출 및 변성(때로는 어긋난 디스크 또는 추간판탈출증으로 불림); 비정상적 굽이(예를 들면, 척주측만증 또는 척주후만증); 및 감염 또는 종양에 의해 야기된 약한 또는 불안정한 척추를 치료하는데 사용될 수 있다.

자가 뼈(환자로부터의 뼈) 또는 동종이식 뼈(다른 개체로부터의 뼈)가 뼈 형성을 유도하는데 가장 일반적으로 사용되는 재료이다. 일반적으로, 작은 뼈 조각을 유합시키려고 하는 척추들 사이의 공간에 넣는다. 때로는 보다 큰 단단한 뼈 조각을 사용하여 직접 구조적 지지를 제공한다. 유합을 촉진하는데 있어서 자가 뼈가 일반적으로 우수한 것으로 간주된다. 그러나, 이러한 절차는 골반 또는 비골 과 같은 환자 신체의 다른 부분으로부터 뼈를 제거하는 추가의 수술을 필요로 한다. 따라서, 약 30%의 환자들이 이식편 수확 부위에서의 상당한 통증 및 민감을 갖고, 이것은 지속적일 수 있으며, 일부 경우엔 수술로 고치려 하는 배통보다 오래 가는 것으로 보고되고 있다. 유사하게, 동종이식 뼈 및 다른 뼈 이식 대체물은, 비록 2차적인 수술의 필요성은 없지만, 이들은 아직 자가 뼈 유합에 대한 비용 효율적이고 효능있는 대체물임을 입증받아야 한다는 점에서 단점을 갖는다.

자가 또는 동종이식 뼈에 대한 대안은 뼈 형성을 촉진하는 증식 인자의 사용이다. 예를 들면, 뼈 형태발생 단백질("BMP")의 사용은 보다 양호한 전반적인 유합, 수술실 내에서의 적은 시간, 및 보다 중요하게는, 2차적인 수술이 필요하지 않기 때문에 환자에게 보다 적은 합병증을 초래한다는 것을 연구들은 보여주었다. 그러나, BMP의 사용은, 비록 뼈 성장을 촉진하는데 있어서 효능이 있더라도 엄청나게 비용이 많이 들 수 있다.

다른 대안은 천연 발생 뼈 증식 인자의 유전자 공학에 의해 생산된 형태의 사용이다. 이러한 접근법 역시 한계를 갖는다. 구체적으로, 전문의들은 유전자 공학에 의해 생산된 BMP가 암 세포의 증식을 굉장히 가속시키거나 비-암 세포가 보다 불길하게 되도록 할 수 있다는 염려를 나타냈다. 다른 염려는 원하지 않는 뼈 생성이다. 유전자 공학에 의해 생산된 BMP에 의해 생성되는 뼈가 척추 내의 섬세한 신경 말단 상에 또는 더 나쁘게는 신체 내 다른 어느 곳에 형성될 수 있는 가능성이 있다.

재생 세포, 예를 들면 줄기 세포(즉, 신체의 비-특수 모 세포)가 그들 자신 을 무한하게 신생시키고 성숙 특수 세포들로 발육시킬 수 있는 능력을 이용하는 재생 의약이 선행 기술의 한계점들을 회피하는 수단일 수 있다. 줄기 세포, 즉 배아 및 성인 줄기 세포들 모두가 뼈를 포함하여 신체의 200+ 세포 및 조직 유형의 다수(전체 유형이 아닌 경우)가 될 수 있는 발생능을 갖는 것으로 나타났다. 최근에, 지방 조직이 성인 줄기 세포의 공급원인 것으로 밝혀졌다(Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). 지방 조직(골수, 피부, 근육, 간 및 뇌와는 달리)은 이환율이 적으면서 비교적 많은 양으로 수집하기가 비교될 정도로 쉽다(Commons et al., 2001; Katz et al., 2001b). 따라서, 선행 기술의 척추 유합술 기술에 한계가 있어서, 재생 세포, 예를 들면 뼈 형성을 유도할 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 혼입시킨 장치에 대한 필요성이 존재한다.

<발명의 요약>

본 발명은 이들의 조합이 이식편수령자(recipient)에서 뼈 형성을 위해 의도하는 영역, 즉 표적 영역에서의 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진하는, 치료 유효량의 재생 세포 및, 세포 운반체 부분 및 세포 운반체 수용 부분을 포함하는 장치의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 장치 및 세포는 예를 들면, 양수체 척추 유합술 수술 형태의 요법을 필요로 하는 질환을 위한, 보통 비-골전도 영역에서의 뼈 형성으로부터 이익을 얻는 질환을 치료하는데 특히 유용하다. 본 발명의 장치 및 세포는 외상의 결과로 생긴 긴 뼈 중의 결함과 같이 골전도에 의해 나을 수 없는 다른 결함 또는 질환의 치료에도 또한 유용하다. 바람직한 실시태양에서는, 장치의 하나 이상의 부분들이 재흡수가능하다.

본 발명은 추가로 재생 세포, 예를 들면 성인 줄기 및 기원 세포를 제조하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추가로 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진하는 재생 세포, 예를 들면 성인 줄기 및 기원 세포의 조성물 및 방법의 발견에 근거한다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 이식편수령자에서의 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진, 야기 또는 지지하는데 필요한 첨가제들과 함께 장치의 세포 운반체 부분에 놓여지는 지방 조직으로부터 유래된 세포의 사용을 위한 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.

한 실시태양에서, 조직 추출로부터 처리를 거쳐 장치의 이식편수령자의 의도하는 뼈 및(또는) 연골 형성 부위 내로의 배치를 거치는 전체 과정은 모두 동일한 기지 내에서, 실은, 심지어 이 과정을 겪는 환자의 동일 장소에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 유효량의 재생 세포, 예를 들면 줄기 및 기원 세포를 표적 영역에 삽입하기 전에 장치의 세포 운반체 부분에 위치시킨다. 다른 실시태양에서는, 예를 들면 주사기를 통해, 이식편수령자의 의도하는 뼈 및(또는) 연골 형성 부위에 장치를 배치한 후에 유효량의 재생 세포, 예를 들면 줄기 및 기원 세포를 세포 운반체에 위치시킨다. 또 다른 실시태양에서는, 세포를 다른 세포, 조직, 조직 단편 또는 세포 증식 및(또는) 분화의 다른 자극제와 함께 장치의 세포 운반체 부분에 위치시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 세포는 상기 언급한 임의의 첨가제들과 함께, 세포를 얻어낸 사람 내에 위치시킨다(장치를 통해). 바람직한 실시태양에서, 세포 운반체 부분 및(또는) 세포 운반체 수용 부분은 재흡수가능하다.

특정 실시태양에서, 환자의 뼈 및(또는) 연골 형성 촉진은 a) 조직 제거 시 스템을 제공하는 단계; b) 조직 제거 시스템을 사용하여 환자로부터, 일정 농도의 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 제거하는 단계; c) 지방 조직의 적어도 일부분을 처리하여 뼈 및(또는) 연골 형성 촉진에 효과적인 용량을 구성하기 충분한 농도의 줄기 세포를 얻는 단계; d) 처리 단계로부터 얻은 재생 세포, 예를 들면 줄기 및 기원 세포를 본 발명의 장치의 세포 운반체 부분에 첨가하는 단계; 및 e) 세포를 포함하는 장치를 이식편수령자의 의도하는 뼈 및(또는) 연골 형성 부위에 삽입하는 단계들을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 세포 운반체 부분 및(또는) 세포 운반체 수용 부분은 재흡수가능하다. 다른 바람직한 실시태양에서는, 조직 처리 시스템이 자동화된다.

다른 실시태양에서, 환자의 뼈 및(또는) 연골 형성 촉진은 a) 조직 제거 시스템을 제공하는 단계; b) 조직 제거 시스템을 사용하여 환자로부터, 일정 농도의 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 제거하는 단계; c) 지방 조직의 적어도 일부분을 처리하여 뼈 및(또는) 연골 형성 촉진에 효과적인 용량을 구성하기 충분한 농도의 줄기 세포를 얻는 단계; d) 본 발명의 장치를 이식편수령자의 의도하는 뼈 및(또는) 연골 형성 부위에 삽입하는 단계; 및 e) 처리 단계로부터 얻은 재생 세포를 이식편수령자에 삽입된 장치의 세포 운반체 부분에 첨가하는 단계들을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 세포 운반체 부분 및(또는) 세포 운반체 수용 부분은 재흡수가능하다. 다른 바람직한 실시태양에서는, 조직 처리 시스템이 자동화된다.

문맥, 본 명세서 및 당 업계의 통상의 숙련인의 지식으로부터 자명해지는 바와 같이 본원에서 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합은, 이러한 조합에 포함 된 특징들이 서로 모순되지 않는 한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 추가적인 이점 및 측면들은 하기하는 상세한 설명에서 드러난다.

도 1은 한 여과기 조립체를 포함하는, 조직으로부터 얻은 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 시스템을 예시한다.

도 2는 직렬 배치의 다수개의 여과기 조립체들을 갖는 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.

도 3은 병렬 배치의 다수개의 여과기 조립체들을 갖는 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.

도 4는 원심분리 챔버를 포함하는, 조직으로부터 얻은 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 시스템을 예시한다.

도 5는 조직으로부터 얻은 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 시스템에 이용되는 사전고정 여과기를 포함하는 수집 챔버의 단면도이다.

도 6은 침투성 여과 시스템을 이용하는, 조직으로부터 얻은 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 시스템의 처리 챔버의 단면도이다.

도 7은 재생 세포의 농축을 위해 원심분리 장치를 이용하는, 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 시스템의 처리 챔버의 단면도이다.

도 8은 도 7의 처리 챔버의 다른 단면도이다.

도 9.1, 9.2 및 9.3은 본 발명의 시스템과 함께 사용되는 용출법(elutriation) 성분을 예시한다.

도 10은 시스템을 통해 유체를 이동시키기 위해 감압을 이용하는, 조직으로부터 얻은 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 시스템을 예시한다. 진공 시스템은 시스템의 출구에 진공 펌프 또는 진공 공급원을 가함으로써 구성될 수 있고, 흐름의 방향 및 시기를 제어하기 위하여 꼭지, 통풍구 및 클램프의 시스템을 사용하여 소정의 속도로 조직을 잡아당겨 유체가 관통하여 흐르도록 제어될 수 있다.

도 11은 시스템을 통해 유체를 이동시키기 위해 정압을 이용하는, 조직으로부터 얻은 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 시스템을 예시한다. 정압 시스템은 흐름의 방향 및 시기를 제어하기 위하여 밸브, 꼭지, 통풍구 및 클램프를 사용하여 정해진 속도로 유체 및 조직을 밀거나 또는 추진시켜 시스템을 통과시키는 연동 펌프와 같은 기계식 수단을 사용한다.

도 12A는 유체의 공급 스트림이 여과기 기공에 대하여 접선방향으로(tangentially, 평행으로) 흐르는 여과 과정을 예시한다. 도 12B는 유체의 공급 스트림이 여과기 기공에 대하여 수직방향으로 흐르는 여과 과정을 예시한다.

도 13은 본 발명의 시스템에 대한 예시적인 일회용 세트를 예시한다.

도 14는 본 발명의 시스템에 대한 예시적인 재사용가능한 성분을 예시한다.

도 15A는 도 13의 일회용 세트 및 도 14의 재사용가능한 성분을 사용하여 조립된 본 발명의 예시적인 장치를 예시한다.

도 15B는 본 발명의 시스템의 자동화된 실시태양들을 제어하는, 소프트웨어 프로그램을 통해 실행된, 예시적인 사전프로그래밍된 단계들을 예시하는 흐름도이다. 시스템의 응용이 자유자재임을 나타내는 2개의 대안적 처리 파라미터들이 나 타나 있다.

도 16은 본 발명의 장치의 예시적인 세포 운반체 부분의 입체도이다.

도 17은 본 발명의 재생 세포들이 시딩된(seeded) 도 16의 세포 운반체를 예시한다.

도 18은 본 발명의 장치의 예시적인 수용 부분의 입체도이다.

도 19는 본 발명의 예시적인 장치의 입체도이다.

도 20은 본 발명의 장치 및 지방-유래 세포의 예시적인 조합물에 대한 입체도이다.

도 21은 본 발명의 장치의 다른 예시적인 수용 부분에 대한 입체도이다.

도 22는 본 발명의 장치의 다른 예시적인 수용 부분에 대한 입체도이다.

도 23은 본 발명의 장치의 다른 예시적인 수용 부분에 대한 입체도이다.

본 발명은 치료 유효량의 재생 세포를 사용하는, 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진하기 위한 최소-침입성 및 비용-효과적인 장치를 제공한다. 본 발명은 부분적으로는, 본 발명의 재생 세포가 뼈 및 연골 기원 세포, 예를 들면 골기원 세포의 풍분한 공급원이라는 발견에 근거한다. 게다가, 본 발명의 재생 세포는 생체 내에서 뼈 및 연골을 형성하는 것으로 본원에 나타나 있다. 따라서, 본 발명의 장치는 예를 들면 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진함으로써 뼈 관련 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 1) 다공성 세포 운반체 부분 및 세포 운반체 수용 부분을 포함하는 장치(이하 본원에서 "장치"로 언급됨), 및 2) 치료 유효량의 지방 유래 재생 세포, 예를 들면 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진하는 성인 줄기 및 기원 세포의 신규 조합물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 장치 및 세포는 예를 들면, 양수체 척추 유합술 수술 형태의 요법 등을 필요로 하는 질환의 치료를 위한, 보통 비-골전도 영역에서의 뼈 형성을 필요로 하는 질환을 치료하는데 유용하다.

본 발명은 또한 지방, 골수, 혈액, 피부, 근육, 간, 연결 조직, 근막, 뇌 및 다른 신경계 조직, 혈관, 및 다른 연질 또는 액상 조직 또는 조직 성분 또는 조직 혼합물(예를 들면, 피부, 혈관, 지방 및 연결 조직을 포함하는 조직들의 혼합물)을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 광범위의 다양한 조직들로부터 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 및(또는) 기원 세포의 분리 및 농축을 위한 신속하고 신뢰가능한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 시스템은 지방 조직으로부터 재생 세포를 분리 및 농축시킨다. 다른 바람직한 실시태양에서, 시스템은 전체 방법이 최소한도의 사용자 중재 또는 전문 기술로 수행될 수 있도록 자동화된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 얻은 재생 세포는 조직을 추출해낸 신장 질병 또는 질환을 앓는 이식편수령자 내에 직접 위치시키는데 적합하다.

바람직하게는, 조직 추출로부터 재생 세포의 분리, 농축 및 이식편수령자 내로의 배치를 거치는 전체 과정은 모두 동일한 기지 내에서, 실은, 심지어 이 과정을 겪는 환자의 동일 장소에서 수행된다. 재생 세포들은 추출 및 농축 후 비교적 단시간 내에 사용될 수 있다. 예를 들면, 재생 세포들은 환자로부터의 조직 수집으로부터 약 1 시간 내에 바로 사용될 수 있고, 특정 상황에서는, 조직의 수집으로부터 약 10분 내지 40분 내에 바로 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 재생 세포는 조직의 수집으로부터 약 20분 내에 바로 사용될 수 있다. 추출로부터 분리 및 농축을 거치는 과정의 전체 길이는 환자 프로필, 수집되는 조직의 유형 및 주어진 치료 용도에 필요한 재생 세포의 양을 포함하여 많은 인자들에 따라 변할 수 있다. 세포들은 또한 이식편수령자에게 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 이끌어내려는 의도를 갖는 한 번의 수술 과정에서 다른 세포, 조직, 조직 단편, 골격 또는 다른 세포 증식 및(또는) 분화 자극제들과 함께 이식편수령자 내에 놓여질 수 있다. 시스템의 분리 및 농축 상을 넘어선 임의의 추가적인 재생 세포의 조작은 이러한 조작의 방식에 상응한 추가적인 시간을 필요로 할 것임을 알 수 있다.

본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 특정 용어들이 먼저 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명을 통해 기재된다.

본원에서 사용된 "재생 세포"는 한 기관, 조직 또는 생리학적 단위 또는 시스템의 구조 또는 기능의 완전한 또는 부분적인 재생, 복원 또는 대체에 기여하거나 또는 이를 야기하여 치료적, 구조적 또는 미용적 이익을 제공하는 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 얻은 임의의 이종 또는 동종 세포를 말한다. 재생 세포의 예는 ACS, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 기원 세포, 대식구, 섬유아세포, 혈관주위세포, 평활근 세포, 전지방세포(preadipodyte), 분화된 또는 분화제거된(de-differentiated) 지방세포, 각질세포, 단일효능 및 다중효능 기원세포 및 전구 세포(및 이들의 자손), 및 림프구를 포함한다.

재생 세포가 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 제공할 수 있게 하는 한 기작은 그들 자신 또는 그들의 자손을 새로이 생성된, 기존의 또는 수복된 조직 또는 조직 성분들 내에 혼입시키는 것에 의한다. 예를 들면, ACS 및(또는) 이들의 자손은 새로이 생성된 뼈, 근육 또는 다른 구조 또는 기능 조직 내로 혼입되어 치료적, 구조적 또는 미용적 개선에 기여하거나 이를 야기할 수 있다. 유사하게, 내피 세포 또는 내피 전구 또는 기원 세포 및 이들의 자손은 기존의, 새로이 생성된, 수복된, 또는 확장된 혈관 내에 혼입되어 치료적, 구조적 또는 미용적 개선에 기여하거나 이를 야기할 수 있다. 재생 세포가 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 제공할 수 있게 하는 다른 기작은 주어진 조직 또는 조직 성분의 구조 또는 기능의 생성, 보존, 복원 및(또는) 재생을 촉진하는 분자, 예를 들면 증식 인자를 발현 및(또는) 분비시키는 것에 의한다.

재생 세포는 존재하는 대로의 그들의 '본래' 형태 또는 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 조직으로부터 분리 및 농축된 형태로 사용될 수 있거나, 또는 이들은 증식 인자 또는 다른 생물학적 반응 개질제를 이용한 자극 또는 초회감작(priming)에 의해, 유전자 전사(일시적 또는 안정한 전사)에 의해, 물리적 성질(예를 들면, 크기 또는 밀도), 고체상 재료에 대한 차등적 접착성, 세포 표면 또는 세포내 분자의 발현, 세포 배양 또는 다른 생체밖 또는 생체내 조작, 변형 또는 분류(본원에서 추가로 설명됨)에 기초한 얻어지는 집단의 추가적 부분-분류(sub-fractionation)에 의해 변형될 수 있다. 재생 세포는 또한 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 세포의 관련 특성들을 변형 또는 향상시키는 인자, 약물, 화학물질 또는 다른 약제를 전달하는 다른 세포 또는 장치, 예를 들면 합성 또는 생물학적 골격, 재료 또는 장치와 함께 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 "재생 세포 조성물"은 조직, 예를 들면 지방 조직을 세척하고 적어도 부분적으로 산해(散解)된 후 일정 부피의 액체 중에 전형적으로 존재하는 세포들의 조성물을 말한다. 예를 들면, 본 발명의 재생 세포 조성물은 ACS, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 기원 세포, 대식구, 섬유아세포, 혈관주위세포, 평활근 세포, 전지방세포, 분화된 또는 분화제거된 지방세포, 각질세포, 단일효능 및 다중효능 기원세포 및 전구 세포(및 이들의 자손), 및 림프구를 포함하는 다수개의 상이한 유형의 재생 세포를 포함한다. 재생 세포 조성물은 또한 1종 이상의 오염물질, 예를 들면 콜라겐(조직 단편에 존재할 수 있음), 또는 본원에서 기재된 조직 산해(disaggregation) 공정으로부터 발생되거나 또는 여기에 사용된 잔류 콜라게나제 또는 다른 효소 또는 약제를 함유할 수도 있다.

본원에서 사용된 "재생 의약"은 재생 세포의 대상 내로의 직접적 또는 간접적 배치로부터 유래된 임의의 치료적, 구조적 또는 미용적 이익을 말한다. 본원에서 사용된 어구 "뼈 관련 질환"은 모든 뼈 관련 질환들을 포함하기 위한 것으로, 예를 들면 척추 고정, 척추 안정, 신체 내(예를 들면 긴 뼈 및 납작뼈 내) 분절 결함의 수복 및 보통 비-골전도 환경에서의 뼈의 증식을 필요로 하는 질환들이 뼈 관련 질환이다. 특정 실시태양에서, 이 어구는 척추 유합술 수술을 필요로 하는 질환들을 포함하기 위한 것이다. 또한, 뼈 관련 질환은 디스크 고리의 파열, 예를 들면 고리 틈새, 만성 디스크 염증, 억제 또는 이탈 돌출을 갖는 국소 디스크 탈출증, 디스크를 둘러싸고 있는 척추의 상대적 불안정성 및 변성 디스크 질환을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 척추 및 디스크의 질환을 포함하려는 것이다. 뼈 관련 질병 또는 질환의 치료는 재생 의약의 영역 내에 속한다.

본원에서 사용된 "줄기 세포(stem cell)"는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자가-재생 능력을 갖는, 다양한 다른 세포 유형들로 분화될 잠재성이 있는 다중효능 재생 세포를 말한다. 본원에 개시된 줄기 세포들 중 일부가 다중효능일 수 있다.

본원에 사용된 "기원 세포(progenitor cell)"는 하나 초과의 세포 유형으로 분화될 잠재성이 있으며 자가-재생 능력이 제한되거나 또는 없는 다중효능 재생 세포를 말한다. 본원에서 사용된 "기원 세포"는 또한 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자가-재생 능력이 제한되거나 또는 없는, 단지 1개의 세포 유형으로 분화될 잠재성이 있는 단일효능 세포를 말하기도 한다. 특히, 본원에서 사용된 "내피 기원 세포"는 혈관 내피 세포로 분화될 잠재성이 있는 다중효능 또는 단일효능 세포를 말한다.

본원에서 사용된 "전구 세포(precursor cell)"는 하나의 세포 유형으로 분화될 잠재성이 있는 단일효능 재생 세포를 말한다. 전구 세포 및 이들의 자손은 광대한 증식능을 보유할 수 있으며, 예를 들면 적절한 조건 하에서 증식될 수 있는 림프구 및 내피 세포일 수 있다.

본원에서 사용된 "줄기 세포 수" 또는 "줄기 세포 빈도"는 지방 유래 세포(ADC)를 낮은 세포 밀도(<10,000 세포/웰)로 평판배양하고 MSC 성장을 지원하는 성장 배지(예를 들면, 10% 태 송아지 혈청, 5% 말 혈청 및 항생제/항진균약을 보충한 DMEM/F12 배지) 중에서 성장시키는 클론원성 분석에서 관찰된 콜로니의 수를 말한다. 세포를 2주 동안 성장시킨 후 배양액을 헤마톡실린으로 염색하여 50개 초과의 세포들의 콜로니를 CFU-F로 계수한다. 줄기 세포 빈도는 평판배양된 100개의 유핵세포 당 관찰된 CFU-F의 수로 계산된다(예를 들어, 1,000개의 유핵 재생 세포로 개시된 플레이트 중에서 계수된 콜로니가 15이면 1.5%의 줄기 세포 빈도가 된다). 줄기 세포 수는 줄기 세포 빈도에 얻어진 유핵 ADC 세포의 총 수를 곱한 것으로 계산된다. 재생 세포로부터 성장된 CFU-F의 높은 백분율(~100%)은 골수-유래 줄기 세포에 의해서도 또한 발현되는 세포 표면 분자 CD105를 발현시킨다(Barry et al., 1999). CD105는 또한 지방 조직-유래 줄기 세포에 의해서도 발현된다(Zuk et al., 2002).

본원에서 사용된 용어 "지방 조직"은 지방을 저장하는 연결 조직을 포함하는 지방을 말한다. 지방 조직은 ACS 및 내피 기원 및 전구 세포를 포함하여 다수개의 재생 세포 유형을 함유한다.

본원에서 사용된 용어 "지방 조직 단위"는 지방 조직의 개별 또는 측정가능한 양을 말한다. 지방 조직의 단위는 그 단위의 중량 및(또는) 부피를 구함으로써 측정될 수 있다. 상기한 데이터에 기초하여, 처리된 지방흡입물(lipoaspirate)의 단위는 환자로부터 제거되었을 때, 세포 성분의 0.1 % 이상이 줄기 세포인 세포 성분을 갖는다; 즉, 상기한 바와 같이 구하였을 때 0.1 % 이상의 줄기 세포 빈도를 갖는다. 본원의 내용을 말할 때, 지방 조직 한 단위는 환자로부터 제거된 지방 조직의 전량 또는 환자로부터 제거된 지방 조직의 전량 미만의 양을 말할 수 있다. 따라서, 지방 조직의 한 단위는 다른 단위의 지방 조직과 합해져서 개별 단위들의 합계량인 중량 또는 부피를 갖는 지방 조직의 한 단위를 형성할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "부분"은 전체보다 적은 재료의 양을 말한다. 소량은 50 % 미만인 양을 말하고, 다량은 50 % 초과의 양을 말한다. 따라서, 환자로부터 제거된 지방 조직의 전량 미만인 지방 조직의 단위는 제거된 지방 조직의 한 부분이다.

본원에서 사용된 용어 "처리된 지방흡입물"은 성숙 지방세포 및 연결 조직으로부터 활성 세포 성분(예를 들면, 재생 성분을 함유하는 성분)을 분리시키도록 처리된 지방 조직을 말한다. 이 분획물은 본원에서 "지방-유래 세포" 또는 "ADC"로 언급된다. 대표적으로, ADC는 지방 조직으로부터 세포를 세척 및 분리 및 농축하여 얻은 재생 세포의 펠릿을 말한다. 펠릿은 대표적으로 원심분리 실 또는 세포 농축기의 바닥에 세포가 응집되도록 세포 현탁액을 원심분리하여 얻는다.

본원에서 사용된 용어 "투여", "도입", "전달", "배치" 및 "이식"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 원하는 부위에서 재생 세포의 적어도 부분적인 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 대상 내로의 재생 세포 설치를 말한다. 재생 세포는 세포의 적어도 일부분 또는 세포의 성분들이 생육가능하게 남아있는 대상 내 원하는 위치로의 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상에의 투여 후 세포의 생육가능 기간은 짧게는 수 시간, 예를 들면 24 시간으로부터 수 일, 길게는 수 년일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "치료"는 질병 또는 질환의 하나 이상의 부작용 또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 "재생 세포의 치료 유효량"은 유리한 또는 바람직한 임상학적 효과를 야기하기 충분한 재생 세포의 양을 말한다. 상기 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 그러나, 유효량으로 간주되는 것의 정확한 결정은 환자의 연령, 사이즈, 질병 유형 또는 정도, 질병 단계, 재생 세포의 투여 경로, 사용된 보완 요법의 유형 또는 정도, 진행중인 질병 과정 및 원하는 치료의 유형(예를 들면, 공격적 대 종래의 치료)을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 각 환자에 개별적인 인자들에 기초할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "대상"은 온혈동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 대상은 영장류이다. 더욱 더 바람직한 실시태양에서, 대상은 인간이다.

이제 본 발명의 현재 바람직한 실시태양들(이들의 예가 수반되는 도면에 예시되어 있음)을 보다 상세하게 살펴보기로 한다. 가능한 경우, 동일하거나 또는 유사한 도면부호는 도면 및 설명에서 동일하거나 또는 유사한 부분을 말하는데 사용된다. 도면인 단순화된 형태이며 정확한 비율로 그려진 것이 아님에 주목해야 한다. 본원의 내용을 말할 때, 단지 편의상 및 명료함을 위한 목적으로, 방향을 나타내는 용어, 예를 들면 상부, 하부, 좌측, 우측, 아래쪽, 위쪽, 이상, 이하, 바로아래, 후방 및 전방은 수반되는 도면에 관하여 사용된다. 이러한 방향을 나타내는 용어는 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

비록 본원의 내용은 특정 예시된 실시태양을 말하더라도, 이들 실시태양들이 실시예로 및 제한이 아니게 제공된다. 하기하는 상세한 설명의 의도는, 비록 예시적인 실시태양들을 논의한다 하더라도, 첨부된 특허청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 본질 및 영역 내에 속할 수 있는 모든 변형, 대안 및 균등물들을 포함하기 위한 것으로 생각된다. 본 발명은 당 업계에서 종래적으로 사용되는 다양한 세포 또는 조직 분리 기술과 함께 실행될 수 있으며, 단지 일반적으로 실행된 공정 단계들 중 단지 일부만이 본 발명의 이해를 제공하는데 필수적일 때 본원에 포함된다.

I. 본 발명의 방법.

1. 재생 세포를 얻는 방법( ADC )

본원에서 앞서 기재된 바와 같이, 재생 세포, 예를 들면 줄기 및 기원 세포들이 광범위의 다양한 조직으로부터 수집될 수 있다. 본 발명의 시스템이 모든 상기 조직에 사용될 수 있다. 그러나, 지방 조직이 재생 세포의 특히 풍부한 공급원이다. 따라서, 본 발명의 시스템은 본원에서 제한이 아닌 단지 실시예에 의해 재생 세포들의 공급원으로서 지방 조직을 사용하여 기록된다.

지방 조직은 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 지방 조직은 지방흡인술(주사기 또는 동력 보조)에 의해, 지방절제술, 예를 들면 흡인 지방성형술, 초음파 지방성형술, 및 절개 지방절제술 또는 이들의 병용에 의해 환자로부터 제거될 수 있다. 지방 조직이 제거되고 수집되어 본원에 기재된 본 발명의 시스템의 실시태양들 중 하나에 따라 처리될 수 있다. 수집된 조직의 양은 제공자의 신체질량지수 및 연령, 수집에 이용될 수 있는 시간, 접근가능한 지방 조직 수집 부위의 입수용이성 및 수반되는 및 기존의 의약 및 상태(예를 들면 항응고 요법), 조직을 수집하는 임상학적 목적을 포함하여 수많은 인자들에 의존한다. 예를 들면, 마른 개체로부터 추출한 지방 조직 100 ㎖의 재생 세포 %는 비만인 제공자로부터 추출된 것보다 크다(표 1). 이것은 비만인 개체에서의 증가된 지방 함량의 희석 효과를 반영하기 쉽다. 그러므로, 본 발명의 한 면에 따르면, 마른 환자로부터 인출할 양에 비해 과체중 제공자로부터 보다 많은 양의 조직을 얻는 것이 바람직하다. 이러한 관찰은 또한 본 발명의 유용성이 많은 양의 지방 조직을 갖는 개체로 한정되지 않음을 나타낸다.

조직 및 세포 수득량에 미치는 신체질량지수의 영향

신체질량지수 상태	얻은 조직의 양(g)	총 재생 세포 수득량(x107)
정상	641±142	2.1±0.4
비만	1,225±173	2.4±0.5
p 값	0.03	0.6

지방 조직을 처리한 후, 생성되는 재생 세포들은 실질적으로 성숙 지방세포 및 연결 조직이 없다. 따라서, 본 발명의 시스템은 연구 및(또는) 치료 목적에 사용될 수 있는 다수개의 이종 지방 유래 재생 세포를 생성시킨다. 바람직한 실시태양에서, 세포는 이식편수령자의 신체 내에 설치 또는 재-주사에 적합하다. 다른 실시태양에서, 세포는 연구에 사용될 수 있고, 예를 들면 연장된 기간 동안 생존할 수 있고 추가의 연구에 사용될 수 있는 줄기 또는 기원 세포주를 확립하는데 사용될 수 있다.

이제 도면들을 살펴보면, 본 발명의 시스템(10)은 일반적으로 조직 수집 챔버(20), 처리 챔버(30), 폐기물 챔버(40), 생산물 챔버(50) 및 샘플 챔버(60)으로 구성된다. 수집 챔버(20) 및 처리 챔버(30)은 집합적으로 챔버 조립체로 언급될 수도 있다. 다양한 챔버들은 생물학적 물질을 함유하는 유체들이 밀폐된 멸균 유체/조직 경로를 유지하면서 한 챔버로부터 다른 챔버로 이동할 수 있도록 1개 이상의 도관(12)을 통해 함께 연결된다. 도관은 본원에서 상호교환적으로 각각 루멘 및 배관로 언급되는 경질 또는 가요성 본체를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 도관은 가요성 배관 형태, 예를 들면 임상학적 셋팅에 종래적으로 사용되는 폴리에틸렌 배관, 실리콘 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 재료이다. 도관(12)는 유체 또는 조직의 통과가 바람직한 지의 여부에 따라 크기가 변할 수 있다. 도관(12)는 또한 시스템을 통해 순환되는 유체 또는 조직의 양에 따라 크기가 변할 수 있다. 예를 들면, 유체의 통과를 위해, 도관은 약 0.060 내지 약 0.750 인치 범위의 직경을 가질 수 있고, 조직의 통과를 위해, 도관은 약 0.312 내지 0.750 인치 범위의 직경을 가질 수 있다. 일반적으로, 도관의 크기는 상기 도관을 통해 조직 또는 유체를 수송하는데 필요한 시간과 도관이 수용할 수 있는 부피가 균형을 이루도록 선택된다. 시스템의 자동화 실시태양에서, 상기한 파라미터들, 즉 수송을 위한 시간과 부피는 적절한 신호가 시스템의 처리 장치로 전달되도록 식별되어야 한다. 이것은 장치가 정확한 부피의 조직을 한 챔버로부터 다른 챔버로 이동시킬 수 있게 한다. 사용된 가요성 배관은 붕괴의 경향을 감소시키기 위하여 부압(負壓)을 견딜 수 있어야 한다. 사용된 가요성 배관은 또한 예를 들면 시스템에 사용될 수 있는 용량형 펌프에 의해 생성되는 정압을 견딜 수 있어야 한다.

시스템의 모든 챔버들은 표준 IV, 주사기 및 흡입 배관 연결을 받아들이는 1개 이상의 문(port), 예를 들면 출구(22) 또는 입구(21)를 포함할 수 있다. 문은 밀봉 문, 예를 들면 고무 격벽 밀폐된 주사기 침 출입구(51)일 수 있다. 입구는 도관에 의해 하나 이상의 삽입관(나타나있지 않음)에 연결될 수 있다. 예를 들면, 조직 입구(21)은 통합된 1회 사용 지방흡입 삽입관에 연결될 수 있고, 도관은 가요성 배관일 수 있다. 도관은 일반적으로 시스템의 한 챔버로부터 다른 챔버로의 유체 통로를 제공하도록 위치한다. 이를 위해, 도관 및 문은 예를 들면 수동적으로 또는 자동적으로 작동될 수 있는 흡입 장치(나타나있지 않음)에 연결될 수 있다. 흡입 장치는 예를 들면 주사기 또는 전기 펌프일 수 있다. 흡입 장치는 환자로부터 조직을 흡입하기 충분한 부압을 제공할 수 있어야 한다. 일반적으로, 당 업계의 통상의 숙련인, 예를 들면 전문의에게 공지된 임의의 적합한 흡입 장치가 사용될 수 있다.

도관(12)는 시스템의 다양한 성분들 사이에서의 물질의 흐름을 조절하기 위하여 1개 이상의 클램프(나타나있지 않음)을 추가로 포함할 수 있다. 클램프는 시스템의 상이한 영역들을 효과적으로 밀봉함으로써 시스템의 멸균성을 유지하는데 유용한다. 다르게는, 도관(12)는 시스템을 통과하는 물질의 흐름을 조절하는 1개 이상의 밸브(14)를 포함할 수 있다. 밸브(14)는 도면에서 빈 원으로 표시된다. 바람직한 실시태양에서, 밸브는 전기기계적 핀치 밸브일 수 있다. 다른 실시태양에서, 밸브는 공기압식 밸브일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 밸브는 유압식 밸브 또는 기계식 밸브일 수 있다. 이러한 밸브들은 바람직하게는 지렛대에 연결될 수 있는 제어 시스템에 의해 작동된다. 지렛대는 지렛대가 작동되도록 수동적으로 조작된다. 자동화 실시태양에서, 제어 시스템은 지렛대에 뿐만 아니라, 소정의 작동 조건에서 밸브를 작동시킬 수 있는 처리 장치에 연결될 수 있다. 특정 자동화 실시태양에서, 밸브의 작동은 공정이 최적화될 수 있도록 부분적으로 자동화되고 부분적으로 사용자의 기호를 반영할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 특정 밸브는 수동적으로 작동될 수 있고, 나머지 밸브들은 처리 장치를 통해 자동적으로 작동될 수 있다. 밸브(14)는 또한 1개 이상의 펌프, 예를 들면 연동 펌프(34) 또는 용량형 펌프(나타나있지 않음)와 함께 사용될 수 있다. 도관(12) 및(또는) 밸브(14)는 또한 센서(29), 예를 들면 광학 센서, 초음파 센서, 압력 센서 또는 시스템을 통과하는 다양한 유체 성분 및 유체 양을 구별할 수 있는 당 업계에 공지된 다른 형태의 모니터를 포함할 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, 센서(29)는 광학 센서일 수 있다.

시스템은 또한 다수개의 여과기(36)을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 여과기는 시스템(28)의 챔버 내에 있을 수 있다. 여과기는 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 및(또는) 기원 세포를 시스템에 따라 사용될 수 있는 바람직하지 못한 세포 및 산해제로부터 분리시키는데 효과적이다. 한 실시태양에서, 여과기 조립체(36)은 중공 섬유 여과 장치를 포함한다. 다른 실시태양에서, 여과기 조립체(36)은 침투성 여과 장치를 포함하며, 이것은 침강 공정과 함께 사용되거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 추가의 실시태양에서, 여과기 조립체(36)은 원심분리 장치를 포함하며, 이것은 용출 장치 및 공정과 함께 사용되거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 시스템은 이들 여과 장치들의 조합물을 포함한다. 본 발명의 여과 기능은 2가지일 수 있으며, 일부 여과기는 최종 농축으로부터 콜라겐, 유리 지방, 유리 지방세포 및 잔류 콜라게나제와 같은 물건들을 제거하고, 다른 여과기들은 최종 생성물을 농축시키는데 사용된다. 시스템의 여과기는 20 내지 800 ㎛의 직경 및(또는) 길이 범위의 다수개의 기공을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 수집 챔버(20)는 80 내지 400 ㎛의 범위의 다수개의 기공을 갖는 사전고정된 여과기(28)을 갖는다. 다른 바람직한 실시태양에서, 수집 챔버(20)은 다수개의 265 ㎛ 기공을 갖는 사전고정된 여과기(28)을 갖는다. 다른 실시태양에서, 여과기는 탈착가능할 수 있고(있거나) 일회용일 수 있다.

시스템은 또한 시스템의 하나 이상의 챔버들 내에 포함된 물질의 온도를 조절하기 위해 위치하는 하나 이상의 온도 제어 장치(나타나있지 않음)를 포함할 수 있다. 온도 제어 장치는 가열기, 냉각기 또는 이들 둘 모두일 수 있다, 즉 가열기와 냉각기 사이에서 변환될 수 있다. 온도 장치는 조직, 산해제, 재현탁제, 헹굼제, 세척제, 또는 첨가제를 포함하는, 시스템을 통과하는 임의의 물질의 온도를 조절할 수 있다. 예를 들면, 지방 조직의 가열은 산해를 용이하게 하는 반면, 재생 세포 생산물의 냉각은 생육성을 유지하는데 바람직하다. 또한, 최적의 조직 처리를 위해 사전-가온된 시약들이 필요할 경우, 온도 장치의 역할은 온도를 증가시키거나 또는 감소시키기보다는 소정의 온도를 유지하는 것일 수 있다.

밀폐된 멸균 유체/조직 경로를 유지하기 위하여, 모든 문 및 밸브들은 시스템의 밀봉된 구성형태를 유지하는 클로져를 포함할 수 있다. 클로져는 유체, 공기 또는 다른 오염물질에 대해 불투과성인 막일 수 있거나, 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 적합한 클로져일 수 있다. 게다가, 시스템의 모든 문들은 이들이 시스템의 멸균성을 손상시키지 않고서 챔버 내의 물질들을 인출하기 위하여 주사기, 침 또는 다른 장치들을 받아들일 수 있도록 디자인될 수 있다.

본원에서 기재된 바와 같이, 조직은 임의의 업계 인정된 방법을 통해 환자로부터 추출될 수 있다. 흡입된 조직은 처리를 위해 시스템 중에 위치시키기 전에 추출될 수 있다. 흡입된 조직은 대표적으로 도관(12)를 통과하여 밀봉된 유입구, 예를 들면 고무 격벽 밀폐된 주사기 침 출입구(수집 챔버 상에 나타나있지 않음)를 통해 수집 챔버(20)으로 전달된다. 다르게는, 조직 추출 단계는 시스템의 한 부분일 수 있다. 예를 들면, 수집 챔버(20)은 환자 내로 삽입된 표준 삽입관을 사용하여 조직 제거를 용이하게 하는 진공 관로(11)을 포함할 수 있다. 따라서, 본 실시태양에서, 전체 시스템이 환자에 부착된다. 조직은 입구(21)을 통과하여 밀폐된 멸균 경로의 부분인 12a와 같은 도관을 통해 수집 챔버(20)으로 도입될 수 있다. 수집 챔버(20)은 다수개의 가요성 또는 경질 캐니스터 또는 실린더, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 수집 챔버(20)은 다양한 크기를 갖는 하나 이상의 경질 캐니스터를 포함할 수 있다. 수집 챔버(20)은 또한 하나 이상의 가요성 백을 포함할 수도 있다. 이러한 시스템에서, 백에는 바람직하게는 지지체, 예를 들면 내부 또는 외부 프레임이 제공되어 백에 흡인을 인가할 때 백이 붕괴하게 되는 경향의 감소를 돕는다. 수집 챔버(20)은 처리 챔버(30)에서 수행되는 공정의 세척 및 농축 단계들 전에 조직을 적절하게 세척하고 산해시키기 위해 필수적인 양의 염수를 보유할 수 있는 크기를 갖는다. 바람직하게는, 수집 챔버(20) 중에 존재하는 유체 또는 조직의 부피는 육안으로 쉽게 확인가능하다. 예를 들면, 지방 조직으로부터 재생 세포를 얻기 위하여, 적합한 수집 챔버는 지방흡입물 800 ㎖ 및 염수 1200 ㎖를 보유하는 용량을 갖는다. 따라서, 한 실시태양에서, 수집 챔버(20)은 2 리터 이상의 용량을 갖는다. 다른 실시태양에서, 혈액으로부터 적혈구를 분리하고 농축시키기 위하여, 수집 챔버(20)은 1.5 리터 이상의 용량을 갖는다. 일반적으로, 수집 챔버(20)의 크기는 환자로부터 수집된 조직의 양 및 유형에 따라 변하게 된다. 수집 챔버(20)은 조직을 적게는 약 5 ㎖로부터 최대 약 2 리터 보유할 수 있는 크기를 가질 수 있다. 보다 작은 조직 부피, 예를 들면 5 ㎖ 내지 100 ㎖의 경우, 조직은 수집 챔버(20)으로 옮기기 전에 주사기에 모을 수 있다.

수집 챔버(20)은 멸균될 수 있는 임의의 적합한 생체적합성 물질을 사용하여 구성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 수집 챔버(20)은 ISO 10993 기준에 설명된 바와 같이 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 요구조건을 충족시키는 일회용 재료로 구성된다. 예를 들면, 폴리카보네이트 아크릴 또는 ABS가 사용될 수 있다. 수집 챔버(20)의 유체 경로는 바람직하게는 발열물질이 없다, 즉 질병 전염의 위험없이 혈액용에 적합하다. 한 실시태양에서, 수집 챔버(20)은 사용자가 챔버에 존재하는 조직의 대략적인 부피를 가시적으로 측정할 수 있게 만드는 물질로 구성된다. 다른 실시태양에서, 수집 챔버(20) 내 조직 및(또는) 유체의 부피는 자동화 센서(29)에 의해 결정된다. 수집 챔버(20)은 바람직하게는 자동화 실시태양에서 시스템이 챔버 내의 조직 및(또는) 유체의 부피를 합리적인 정도의 정확도로 측정할 수 있도록 디자인된다. 바람직한 실시태양에서, 시스템은 ±15%의 정확도로 수집 챔버 내 부피를 감지한다.

단지 예로서 제공되는 특정실시태양에서, 수집 챔버(20)은 경질 챔버 형태, 예를 들면 265 ㎛의 메쉬 크기를 가는 의료용 등급 폴리에스테르로 된 대략 원추형 사전고정된 여과기(28)을 함유하는 의료용 등급 폴리카보네이트로 구성된 챔버이다(도 5 참조). 경질 조직 수집 용기는 높이 대략 8 인치 및 직경 대략 5 인치의 크기를 가질 수 있고; 벽 두께는 약 0.125 인치일 수 있다. 실린더의 내부는 예를 들면 흡입 배관을 위한 하나 이상의 문, 멸균 도킹 기술을 통한 연결을 위한 배관을 갖는 하나 이상의 문, 및(또는) 고무 격벽을 통한 침 천공 출입을 위한 하나 이상의 문을 통해 출입될 수 있다. 수집 챔버(20)의 내부의 사전고정된 여과기(28)은 예를 들면 조직들이 환자로부터 제거될 때, 지방 조직은 보유하고 비-지방 조직은 통과시키는 구조를 갖는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 여과기(28)은 지방 조직의 초기 수집 동안, 또는 다른 실시태양에서는 초기 수집 후에 지방 조직의 단편들을 보유하면서 유리 지질, 혈액, 및 염수를 통과할 수 있게 한다. 이와 관련하여, 여과기(28)은 약 20 ㎛ 내지 5 ㎜ 크기 범위의 동일하거나 또는 상이한 크기를 갖는 다수개의 기공들을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 여과기(28)은 다수개의 400 ㎛ 기공들을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 여과기(28)은 대략 265 ㎛의 기공 크기 및 대략 47%의 공면적을 갖는 대략 200 ㎛ 두께의 의료용 등급 폴리에스테르 메쉬이다. 이 물질은 헹굼 동안 조직은 보유하지만 세포들은 조직 산해후 메쉬를 통해 통과해버리게 한다. 따라서, 조직이 환자로부터 흡입될 때, 비-지방 조직은 지방 조직으로부터 분리될 수 있다. 상이한 물질, 메쉬 크기, 및 문의 갯수와 유형으로 동일한 기능성이 달성될 수 있다. 예를 들면, 100 ㎛보다 작거나 또는 크게는 수천 미크론의 메쉬 기공 크기는 지방 조직 응집물 및 단편들을 보유하면서 염수 및 적혈구의 통과는 허용하는 동일한 목적을 달성하게 된다. 유사하게, 동일한 목적은 다른 경질 플라스틱 물질의 사용에 의해, 또는 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 수많은 다른 변형에 의해 달성될 수 있다.

시스템(10)은 또한 하나 이상의 용액 공급원(22)를 포함할 수도 있다. 용액 공급원은 세척 용액 공급원(23) 및 조직 산해제 공급원(24), 예를 들면 콜라게나제를 포함할 수 있다. 수집 챔버(20)은 세척 및 산해 용액 또는 약제가 무균 방식으로 조직에 첨가될 수 있게 하는 밀폐된 유체 경로들을 포함한다.

세척 용액(23) 및 산해제(24)에 대한 용기는 그들의 멸균 방식으로 보유할 수 있는 임의의 적합한 용기, 예를 들면 붕괴가능한 백, 예를 들면 임상학적 셋팅에서 사용된 IV 백일 수 있다. 이들 용기는 세척 용액 및 산해제가 수집 챔버(20)의 내부로 전달될 수 있도록 수집 챔버(20)에 연결된, 도관(12e)와 같은 도관(12)를 가질 수 있다. 세척 용액 및 산해제는 염수(23) 및(또는) 산해제(24)용 용기의 밖에 인가된 간단한 중력 압력을 포함하여 임의의 업계-인정된 방식을 통해, 또는 도관, 예를 들면 도 4에서의 도관(12d) 상에 용량형 펌프를 설치함으로써 수집 챔버(20)의 내부로 전달될 수 있다. 자동화 실시태양에서, 시스템의 처리 장치는 사용자가 처음에 제공한 정보(예를 들면, 처리되는 조직의 부피)에 기초하여 각종 파라미터, 예를 들면 세척에 필요한 횟수 또는 시간 및 염수의 부피, 뿐만 아니라 산해에 필요한 시간 및 산해제의 농도 또는 양을 계산한다. 다르게는, 양, 시간 등은 사용자에 의해 수동적으로 조작될 수 있다.

수집 챔버 내의 조직 및(또는) 유체는 30 ℃ 내지 40 ℃ 범위의 온도에서 유지되어야 한다. 바람직한 실시태양에서, 수집 챔버 안쪽의 현탁액의 온도는 37 ℃로 유지된다. 특정 실시태양에서, 수술 절차 또는 치료 적용이 지연되어야 할 필요가 있을 경우, 선택된 조직은 나중의 사용을 위해 수집 챔버에 보관될 수 있다. 조직은 대략 실온에서 또는 약 4 ℃에서 최대 96 시간 동안 보관될 수 있다.

세척 용액은 염수 또는 임의의 다른 완충 또는 완충되지 않은 전해질 용액을 포함하여 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 임의의 용액일 수 있다. 처리되는 조직의 유형은 사용된 세척 용액들의 유형 또는 조합물을 결정하게 된다. 전형적으로, 세척 용액, 예를 들면 염수는 지방 조직이 환자로부터 제거되어 수집 챔버에 놓여진 후 수집 챔버(20)에 들어간다. 그러나, 세척 용액은 지방 조직이 추출되기 전에 수집 챔버(20)으로 전달될 수 있거나 또는 지방 조직과 동시에 수집 챔버(20)으로 전달될 수 있다. 수집 챔버(20)에서, 세척 용액 및 추출된 지방 조직은 하기되는 방법들을 포함하는 임의의 수단들에 의해 혼합될 수 있다.

예를 들면, 조직은 교반(세포 생육성을 최대화시키고 방출된 유리 지질의 양을 최소화시킴)에 의해 세척될 수 있다. 한 실시태양에서, 조직은 다양한 속도, 예를 들면 약 30 회전/분으로 다양한 도 수의 호를 통해(예를 들면, 약 45도 내지 약 90도의 호를 통해) 전체 수집 챔버(20)을 회전시킴으로써 교반된다. 다른 실시태양에서, 조직은 다양한 속도, 예를 들면 약 30 회전/분으로 다양한 도 수의 호를 통해(예를 들면, 약 45도 내지 약 90도의 호를 통해) 전체 수집 챔버(20)(여기서, 수집 챔버(20)은 수집 챔버의 안쪽 표면에 단단하게 부착된 하나 이상의 패들 또는 돌기를 포함함)을 회전시킴으로써 교반된다. 상기한 수집 챔버(20)의 회전은 수집 챔버(20)과 근접하게 또는 수집 챔버(20)에 부착된 구동 기작에 의해 수행될 수 있다. 구동 기작은 단순 벨트 또는 기어 또는 당 업계에 공지된 다른 구동 기작일 수 있다. 회전 속도는 예를 들면 30 회전/분일 수 있다. 일반적으로, 속도가 보다 높을수록 보다 많은 부피의 유리 지질을 생성시키는 것으로 밝혀졌고, 최적이 아닐 수도 있다.

다른 실시태양에서, 조직은 수집 챔버(20) 안쪽에 회전가능한 샤프트(35)를 위치시킴으로써 교반되는데, 이 때 회전가능한 샤프트는 샤프트가 회전될 때 혼합물을 통과하는 회전가능한 샤프트(25)에 단단하게 부착된 하나 이상의 패들(25a) 또는 돌기를 포함한다. 특정 실시태양에서, 패들들(25a)이 단단하게 부착되어 있는 회전가능한 샤프트(25)는 수집 챔버(20)의 바닥 상에 놓여질 수 있다. 이것은 예를 들면, 패들-유사 장치를 회전 자기장(예를 들면, 자기 교반기) 내에 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 다르게는, 조직의 교반은 당 업계에 공지된 단순 교반기, 즉 회전없이 위아래로 진탕을 행하는 장치를 사용하여 달성될 수 있다. 조직은 또한 요동(rocking), 교반, 역위(inversion) 등을 포함하는 임의의 다른 업계-인정된 수단들을 사용하여 세척될 수도 있다.

바람직한 양의 세척 사이클 후, 조직 산해제를 수집 챔버(20)에 전달하여 재생 세포를 나머지 지방 조직 성분들로부터 분리시킬 수 있다. 산해제는 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 임의의 산해제일 수 있다. 사용될 수 있는 산해제는 중성 프로테아제, 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루오니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 블렌드자임(Blendzyme) 효소 혼합물 군의 구성원, 예를 들면 리베라제 H1, 펩신, 초음파 또는 다른 물리적 에너지, 레이저, 전자파, 다른 기계식 장치 및(또는) 이들의 조합물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 산해제는 콜라게나제이다. 산해제는 다른 용액과 함께 첨가될 수 있다. 예를 들면, 상기한 바와 같은 염기 공급원(23)으로부터 전달된 염수와 같은 염수가 콜라게나제의 첨가와 함께 또는 첨가 직후에 지방 조직에 첨가될 수 있다. 한 실시태양에서, 세척된 지방 조직은 37 ℃ 부근에서 약 20-60분 동안 콜라게나제-함유 효소 용액과 함께 혼합된다. 다른 실시태양에서, 소화 시간을 감소시키기 위하여 보다 높은 농도의 콜라게나제 또는 유사한 약제가 첨가될 수 있다. 그런 다음, 세척된 지방 조직 및 조직 산해제는 세척된 지방 조직이 산해될 때까지 상기한 교반 방법과 유사한 방식으로 교반될 수 있다. 예를 들면, 세척된 지방 조직 및 조직 산해제는 전체 수집 챔버를 대략 90도의 호를 통해 회전시킴으로써, 샤프트가 회전될 때 용액을 관통하는 하나 이상의 패들을 함유하는 샤프트를 가짐으로써 및(또는) 수집 챔버의 안쪽 표면 상에 패들 또는 돌기를 함유하는 전체 수집 챔버를 회전시킴으로써 교반될 수 있다.

지방 유래된 세포가 사용될 목적에 따라, 지방 조직은 부분적으로 산해되거나 또는 완전히 산해될 수 있다. 예를 들면, 지방 유래 세포들이 지방 조직 유닛과 합해져야 하는 실시태양에서, 수확된 지방 조직을 부분적으로 산해시키고, 부분적으로 산해된 지방 조직의 일부분을 제거한 다음 수집 챔버에 남아있는 지방 조직의 나머지 부분을 계속해서 산해시키는 것이 바람직할 수 있다. 다르게는, 세척된 지방 조직의 일부분이 제거될 수 있고, 임의의 소화 전에 샘플 용기 중에 제쳐 놓을 수 있다. 다른 실시태양에서, 수확된 지방 조직은 부분적으로 산해되어 세포를 농축시킨 후 환자에 다시 재도입된다. 한 실시태양에서, 지방 조직은 일반적으로 약 20분 미만의 시간 동안 조직 산해제와 혼합된다. 부분적으로 산해된 조직의 일부분을 이어서 수집 챔버로부터 제거할 수 있고, 나머지 부분적으로 산해된 조직은 다시 40분 동안 조직 산해제와 지방 조직을 혼합함으로써 추가로 산해될 수 있다. 지방 유래 세포들이 본질적으로 순수한 재생 세포 집단으로 사용되어야 할 때, 지방 조직은 완전히 산해될 수 있다.

소화 후, 조직 및 산해제 용액은 용액의 부유 및 비-부유 성분들이 수집 챔버 내에서 분화될 수 있도록 충분한 시간 동안 정치 침강시킨다. 대표적으로, 시간은 약 15초 내지 수 분 범위일 수 있지만, 변형된 실시태양에서는 다른 시간들이 실행될 수 있다. 부유 층은 추가의 세척 및 농축을 필요로 하는 재생 세포를 포함한다. 비-부유 층은 혈액, 콜라겐, 지질 및 조직의 다른 비-재생 세포 성분들을 포함한다. 비-부유 층은 폐기물 챔버로 제거되어야 한다.

따라서, 수집 챔버(20)은 바람직하게는 혈액 및 조직의 다른 비-부유 성분이 하나 이상의 도관(12)를 통해 하나 이상의 폐기물 용기(40)으로 배수될 수 있도록 챔버의 최저점에 출구(22)를 포함한다. 수집 챔버(20)은 일반적으로 출구(22)가 수집 챔버의 바닥에 위치하도록 똑바르게 서 있는 위치에 있다(또는 똑바르게 서 있는 위치로 놓여질 수 있다). 배수는 수동적 또는 능동적일 수 있다. 예를 들면, 상기한 비-부유 성분들은 중력을 사용하여, 정압 또는 부압을 인가함으로써, 펌프(34)를 사용하여 또는 통풍공(32)의 사용에 의해 배수될 수 있다. 자동화 실시태양에서, 처리 장치는 수집 챔버(20)으로부터 비-부유 층을 배수하도록 특정 밸브 및(또는) 펌프를 신호할 수 있다. 자동화 실시태양은 또한 부유 및 비-부유 액체들 사이의 계면이 도달되었을 때를 검출할 수 있는 센서(29)를 포함할 수도 있다. 자동화 실시태양은 또한 센서(29), 예를 들면 수집 챔버로부터 시작되는 도관에서 흐르고 있는 유출액의 광 회절 변화를 검출할 수 있는 광학 센서를 포함할 수도 있다. 광 회절에서의 적절한 변화는 비-부유 층이 배수되었음을 나타내는 나가는 도관 중에서의 부유 층의 존재를 신호할 수 있다. 그러면 센서(29)는 처리 장치가 다음 단계를 진행하도록 신호할 수 있다.

그러나, 특정 실시태양에서, 조직은 조직의 비-재생 세포 성분들을 회수하도록 처리될 수 있다. 예를 들면, 특정 치료 또는 연구 분야에서, 콜라겐, 단백질, 매트릭스 또는 간질 성분, 지질, 지방세포 또는 조직의 다른 성분이 바람직할 수 있다. 이러한 실시태양에서, 상기한 바와 같이 폐기물 챔버로 제거되어야 하는 것은 재생 세포를 포함하는 부유 층이다. 이어서 비-부유 층은 필요할 때 추가의 처리를 위해 시스템에 보유된다.

일단 비-부유 층이 제거되면, 재생 세포를 포함하는 부유 층은 잔류 오염물질을 제거하도록 1회 이상 세척될 수 있다. 따라서, 수집 챔버(20)은 대표적으로는 세척 용액이 챔버의 내부로 전달되도록 하기 위한 하나 이상의 문(21), 및 폐기물 및 다른 물질들이 수집 챔버(20)으로부터 밖으로 나가도록 하는 하나 이상의 문(22)를 포함한다. 예를 들면, 수집 챔버는 본원에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 밀봉된 유입구를 포함할 수 있다. 수집 챔버(20)은 또한 세척 용액이 수집 챔버 내로 전달되고(되거나) 폐기물을 밖으로 수송되는 동안 시스템을 추가적으로 확실히 멸균상태로 유지시키는 상부 캡 및 하부 캡과 같은 하나 이상의 캡(나타나있지 않음)을 포함할 수 있다. 문(21)은 수집 챔버의 캡 상에 또는 수집 챔버의 측벽 상에 제공될 수 있다.

새로운 세척 용액을 이용한 세척 공정은 용액 중의 비-부유 오염물질의 잔류 함량이 소정의 수준에 도달될 때까지 반복될 수 있다. 달리 말하면, 지방 조직 단편을 포함하여 상기한 혼합물의 부유 물질을 포함하는 수집 챔버(20)의 나머지 물질은 원하지 않는 물질의 양이 바람직한 소정의 수준으로 감소될 때까지 한 번 이상 세척될 수 있다. 세척의 종점을 구하는 한 방법은 조직 용액 중의 적혈구의 양을 측정하는 것이다. 이것은 540 ㎚ 파장에 흡수되는 빛을 측정함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 약 0.546 내지 약 0.842 사이의 범위가 허용가능한 것으로 간주된다.

세척 및(또는) 산해 동안, 결과를 향상시킬 필요가 있을 때 하나 이상의 첨가제가 각종 용기에 첨가될 수 있다. 첨가제들의 몇몇 예는 세척 및 산해를 최적화하는 약제, 처리 동안 활성 세포 집단의 생육성을 증대시키는 첨가제, 항균제(예를 들면 항생제), 지방세포 및(또는) 적혈구를 용해시키는 첨가제, 또는 관심을 갖는 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제(고체 상 성분에 대한 차등적인 접착성에 의해 또는 세포 집단의 실질적인 감소 또는 농축을 다르게 촉진시키기 위해)를 포함한다. 다른 가능한 첨가제는 재생 세포의 회수 및 생육성을 촉진시키거나(예를 들면, 카스파제 억제제) 또는 주입 EH는 설치에 대한 역 반응의 경향을 감소시키는(예를 들면, 세포 또는 연결 조직의 응집의 억제제) 것을 포함한다.

충분한 침강 시간이 경과한 후에, 생성되는 세척된 지방 조직 단편 및 조직 산해제의 혼합물의 비-부유 분획물은 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 및 다른 지방 유래 기원 세포를 함유하게 된다. 본원에서 논의된 바와 같이, 재생 세포를 함유하는 비-부유 분획물은 지방 유래 줄기 세포와 같은 관심을 갖는 재생 세포가 혼합물의 비-부유 분획물에 존재하는 다른 세포 및 물질로부터 분리되게 되는 처리 챔버(30)으로 전달되게 된다. 이러한 비-부유 분획물은 본원에서 재생 세포 조성물로 언급되고, 줄기 세포, 기원 세포, 내피 전구 세포, 지방세포 및 본원에 기재된 다른 재생 세포의 다수개의 상이한 유형을 포함한다. 재생 세포 조성물은 또한 하나 이상의 오염물질, 예를 들면 콜라겐 및 다른 연결 조직 단백질 및 이의 단편(조직 산해 공정으로부터의 잔류 콜라게나제 또는 지방 조직 단편 중에 존재)을 함유할 수도 있다.

본 발명의 처리 챔버(30)은 바람직하게는 재생 세포 조성물이 수집 챔버(20)으로부터 배관(12), 밸브(14) 및 펌프(34)를 사용하여 멸균 방식으로 처리 챔버(30)으로 이동하도록 시스템 내에 위치한다. 처리 챔버는 10 mL 내지 1.2 L 범위의 조직/유체 혼합물을 수용하는 크기를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 처리 챔버는 800 mL를 수용하는 크기를 갖는다. 특정 실시태양에서는, 수집 챔버(20)으로부터의 전체 재생 세포 조성물이 처리 챔버(30)으로 보내진다. 그러나, 한 실시태양에서는 재생 세포 조성물의 일부분이 처리 챔버(30)으로 보내지고, 다른 부분은 시스템의 상이한 영역, 예를 들면 샘플 챔버(60)으로 보내져서 나중에 처리 챔버(30)에서 처리된 세포들과 다시 합해지게 된다.

처리 챔버(30)은 멸균될 수 있는 임의의 적합한 생체적합성 물질을 사용하여 구성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 처리 챔버(30)은 ISO 10993에 설명된 바와 같이, 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 필요조건을 충족하는 일회용 물질로 구성된다. 예를 들면, 폴리카보네이트, 아크릴, ABS, 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 스티렌-부타디엔 공중합체(SBC)가 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, 일화용 처리 챔버의 유체 경로에는 발열물질이 없다. 처리 챔버는 플라스틱 백 형태, 예를 들면 혈액 은행에서 혈액을 처리하는데 종래적으로 사용되는 것일 수 있고; 또는 다른 실시태양에서는, 구조적으로 강성일 수 있다(도 6). 한 실시태양에서, 처리 챔버(30)은 그들의 전체 내용이 본원에서 참고문헌으로 인용되는 일반적으로 소유된, 2001년 12월 7일에 출원된 미국 출원 제10/316,127호 및 2002년 12월 20일에 출원된 미국 출원 제10/325,728호에 개시된 처리 챔버와 유사할 수 있다.

처리 챔버(30)은 여과 및 원심분리 및(또는) 이들의 병행을 포함하여, 세포를 분리 및 농축하는데 적합한 임의의 방식으로 구성될 수 있다. 특정 실시태양에서, 수집 챔버(20)으로부터의 재생 세포 조성물은 처리 챔버(30)으로 도입되고, 여기서 조성물은 여과되어 특정 재생 세포 집단을 분리 및(또는) 농축시킬 수 있다. 세포 여과가 특정 성분 및 세포를 상이한 성분 또는 세포 유형으로부터 분리시키는 한 방법이다. 예를 들면, 본 발명의 재생 세포 조성물은 줄기 세포, 기원 세포 및 지방 세포, 뿐만 아니라 하나 이상의 오염물질, 예를 들면 콜라겐(조직 산해 공정으로부터의 잔류 콜라게나제 또는 지방 조직 단편에 존재함)을 포함하는 다수개의 상이한 유형의 세포를 포함한다. 처리 챔버(30)에 존재하는 여과기(36)은 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 또는 내피 기원 세포 등의 특정 아집단의 분리 및 농축을 가능하게 할 수 있다.

액체로부터의 세포의 여과와 관련된 일부 변수는 여과재의 기공 크기, 기공의 기하형태(형상), 여과기의 표면적, 여과되는 용액의 흐름 방향, 막통과 압력, 특정 세포 집단의 희석, 특정 크기 및 형태, 뿐만 아니라 세포 크기 및 세포 생육성을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 본원에서의 개시내용에 따라, 분리 또는 여과되길 바라는 특정 세포는 대표적으로 지방 유래 줄기 세포이다. 그러나, 특정 실시태양에서, 특정 세포는 지방 유래 기원 세포, 예를 들면 내피 전구 세포를 단독으로 또는 줄기 세포들과 함께 포함할 수 있다.

재생 세포 조성물은 여과기 조립체(36)와 같은 여과기 조립체를 통해 보내질 수 있다. 특정 실시태양에서, 여과기 조립체(36)은 상이한 기능을 수행하고 재생 세포 조성물을 별도의 부품 또는 성분들로 분리하는 구조를 갖는 다수개의 여과기를 포함한다. 예를 들면, 여과기들 중의 하나도 재생 세포 조성물로부터 콜라겐을 분리하도록 구성될 수 있으며, 여과기들 중 하나는 재생 세포 조성물로부터 지방세포 및(또는) 지질 성분을 분리하도록 구성될 수 있으며, 여과기들 중 하나는 재생 세포 조성물로부터 조직 산해제와 같은 잔류 효소를 분리하도록 구성될 수 있다. 특정 실시태양에서, 여과기들 중 하나는 2개의 기능, 예를 들면 조성물로부터 조직 산해제 및 콜라겐의 분리를 수행할 수 있다. 다수개의 여과기는 대표적으로는 직렬 배열되지만; 그러나, 여과기의 적어도 일부분은 또한 병렬 배열될 수 있다. 여과기 조립체(36)의 여과기들의 병렬 배치는 도 3에 나타나 있다.

한 실시태양에서, 여과기 조립체(36)은 제1 여과기, 제2 여과기, 및 제3 여과기를 포함한다. 제1 여과기는 재생 세포 조성물에 존재하는 콜라겐 임자들을 제거하도록 구성된다. 이들 콜라겐 입자들은 대표적으로는 직경 대략 0.1 미크론이고 최대 20 미크론 길이일 수 있다. 콜라겐 입자들은 소화에 따라 다양한 크기를 갖는 것일 수 있다. 이들은 또한 피브릴일 수 있는데, 이것은 이들이 꼬임 및 회전을 가짐을 의미한다. 본원에 기재된 임의의 여과기는 폴리에테르술폰, 폴리에스테르, PTFE, 폴리프로필렌, PVDF 또는 가능하게는 셀룰로스로 제조될 수 있다. 콜라겐을 여과하기 위해서는 2가지 가능성이 있다. 하나는 보다 큰 입자를 먼저 제거하게 세포들을 관통시키는(예를 들면 아마도 10 미크론 범위 내의 여과기를 필요로 할 것임) 시도이다. 두 번째 방법은 세포들은 붙잡고 콜라겐을 통과시키도록, 콜라겐이 잘 소화되도록 하는 의도로, 보다 작은 크기의 여과기, 예를 들면 4.5 미크론을 사용하는 것이다. 이것은 여과기로부터 다시 세포를 부유시키는 수단을 필요로 한다. 콜라겐 섬유를 끌어당겨 붙들게 되는 여과기를 수행할 가능성이 있을 수 있다.

제2 여과기는 재생 세포 조성물 중에 부유하지 않는 유리 미성숙 지방세포를 제거하도록 구성된다, 한 실시태양에서, 제2 여과기는 폴리에스테르로 구성될 수 있고, 약 30 내지 약 50 미크론의 기공 크기를 갖고, 바람직한 기공 크기는 약 40 미크론이다. 비록 제2 여과기로 언급되지만, 이러한 장치의 설치는 보다 큰 세포 및 입자의 초기 제거를 용이하게 하는, 제2가 아닌 제1 위치일 수 있다. 제3 여과기는 조성물 중에 존재하는 사용되지 않은 또는 잔류 콜라게나제 또는 다른 조직 산해제를 제거하도록 구성된다. 바람직한 시행에서, 콜라게나제는 시간이 지남에 따라 변성될 수 있다. 한 실시태양에서, 제3 여과기는 1 ㎛ 미만의 직경 또는 길이를 갖는 다수개의 기공을 포함한다. 특정 실시태양에서, 기공은 1 ㎛보다 작은 직경을 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 기공은 10 kD 내지 5 미크론의 직경을 갖는다. 특정 실시태양에서, 제3 여과기는 본원에서 논의된 바와 같이, 재생 세포 집단을 작은 부피의 염수 또는 다른 세척 용액으로 농축시키도록 구성될 수 있다. 현재 바람직한 것으로서, 단지 최종 여과기는 중공 섬유 유닛이다. 임의의 여과기가 중공 섬유 유형의 것일 필요는 없다. 바람직한 시행에서는 중공 섬유 유닛이 최종 여과기에 사용되는데, 이것이 재생 세포에 최소한의 유해 효과를 가지면서 콜라게나제를 제거하는데 가장 효율적이기 때문이다. 장치가 규격품들의 집합인 한 실시태양에서, 3개의 여과기들은 별도의 하우징 내에 있다. 중공 섬유 유닛이 제3 여과기에 사용되는 경우 한 하우징 내로 합해진 제1 및 제2 여과기를 갖는 것이 가능하다. 최종 여과기가 중공 섬유 셋업이지 않는 경우라면, 모든 3개의 여과기들이 한 하우징 내에 포함될 수 있다.

여과기 조립체(36)의 여과기들은 처리 챔버(30)에 위치할 수 있거나 또는 처리 챔버(30)과는 별도의 성분으로 제공될 수 있다. 또한, 여과기 조립체(36)의 여과기는 다수개의 처리 챔버들 내에 또는 인라인 방식으로 제공될 수 있다. 특정 실시태양에서, 도관 또는 배관은 처리 챔버 또는 챔버들로서 작동할 수 있다. 처리 챔버는 여과기들을 연결시키는 도관의 내부 부피가 되도록 크기가 감소될 수 있다. 이러한 유형의 시스템은 조직 용액의 부피가 적절한 크기를 가질 경우 정확하게 기능하게 된다. 따라서, 도관들은 여과기를 통해 실행될 때 세포를 갖는 유체를 함유함으로써 처리 챔버로서 작용할 수 있다. 세포/조직이 시스템의 초회감작 및 실행 과정에서 헛되이 손실되지 않도록 도관의 부피를 최소화하도록 주위할 수 있다.

상기한 실시태양을 살펴보면, 세척된 세포 및 잔류 콜라겐, 지방세포 및(또는) 소화되지 않은 조직 산해제를 함유하는 재생 세포 조성물은 제1 여과기를 통과하게 보내져서 조성물로부터 콜라겐 입자의 적어도 일부분 및 바람직하게는 실질적으로 모두를 제거하여 여과된 용액에 콜라겐 입자가 거의, 및 바람직하게는 전혀 존재하지 않도록 할 수 있다. 지방세포 및(또는) 소화되지 않은 조직 산해제를 함유하는 여과된 재생 세포 조성물은 이어서 제2 세포를 통과하게 보내져서 여과된 재생 세포 조성물로부터 유리 지방세포의 적어도 일부분, 및 바람직하게는 실질적으로 모두를 제거할 수 있다. 이어서, 소화되지 않은 조직 산해제를 함유하는 2번 여과된 재생 세포를 본원에서 기재된 바와 같이 중공 섬유 여과 장치와 같은 제3 여과기를 통과하게 보내어 재생 세포 조성물로부터 소화되지 않은 조직 산해제를 제거 또는 감소시킬 수 있다.

3번 여과된 재생 세포 조성물(즉, 제1, 제2 및 제3 여과기를 통과한 후 남아있는 조성물)은 이어서 다수개의 출구로 보내지는데, 이것은 다수개의 출구들을 포함하는 처리 챔버(30)의 일부분을 포함할 수 있다. 이들 출구는 필수적인 압력을 유지할 뿐만 아니라, 도관을 통해 수집 챔버(20), 생산물 챔버(50), 및(또는) 폐기물 챔버(40)을 포함할 수 있는 다른 용기와의 연결을 제공하는 데 사용될 수 있다.

한 실시태양에서, 여과기 조립체(36)의 여과기는 중공-섬유 여과 부재를 포함한다. 또는, 달리 말하면, 여과기는 여과재로 성형된 중공관의 집합을 포함한다. 개시된 시스템(10)과 함께 사용될 수 있는 여과재의 예는 폴리술폰, 폴리에테르술폰 또는 혼합된 에스테르 물질 등을 포함한다. 이들 여과재의 중공 섬유 또는 중공관은 여과기 조립체(36)의 원통형 카트리지에 포함될 수 있다. 여과재의 개별 관 또는 섬유는 대표적으로 약 0.1 ㎜ 내지 약 1 ㎜ 범위 내부 직경을 갖고, 바람직한 값은 약 0.5 ㎜이다. 적합한 원통형 카트리지의 직경 및 길이가 카트리지 내부에 위치할 수 있는 여과재의 개별 관의 수를 결정하게 된다. 적합한 중공 섬유 여과기 카트리지의 한 예는 화이버플로(FiberFlo)® 탄젠셜 플로 여과기(Tangential Flow Filter), 카탈로그 #M-C-050-K(미네소타주 미네아폴리스 소재 민테크(Minntech))이다. 여과재의 기공 크기는 약 10 킬로달톤 내지 약 5 미크론 범위일 수 있고, 바람직한 기공 크기는 약 0.5 미크론이다.

중공-섬유 여과기에서, 각 중공 관은 제1 단부 및 제2 단부가 있는 본체, 및 본체 내에 위치하여 제1 단부와 제2 단부 사이에서 연장되는 루멘을 갖는다. 각 중공 관의 본체는 다수개의 기공을 포함한다. 기공은 일반적으로 본체에서 재생 세포 조성물이 본체의 루멘을 통해 흐름으로써 여과되도록 및 여과되어야 하는 생성물은 도 12A에 나타낸 바와 같이 기공을 약간 스칠 정도로 통과하도록 배향된다. 달리 말하면, 액체 중의 보다 작은 입자들은 본체의 루멘을 통한 유체의 흐름에 비하여 기공을 약간 스칠 정도로 통과한다. 재생 세포를 갖는 조성물은 조성물이 여과될 때 각 중공 관의 루멘을 통과한다. 바람직하게는, 조성물의 흐름은 각 중공 관의 본체의 기공에 접선방향이다.

유체의 접선방향 흐름을 사용함으로써, 줄기 세포의 여과 효율은 다른 여과 기술에 비하여 향상될 수 있다. 예를 들면, 일부 여과 기술에 따라, 여과재의 기공은 도 12B에 예시한 바와 같이, 여과재가 여과되는 유체의 경로를 차단하도록 여과기가 유체의 흐름에 대하여 수직으로 배향되는 방식으로 위치한다. 이러한 유형의 여과에서, 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포로부터 여과되어 입자들은 여과기의 한 면 상에 축적되어 기공을 통과하는 유체의 흐름을 차단하기 쉽다. 이러한 차단은 여과기의 효율을 감소시킨다. 또한, 세포들은 유체 흐름의 압력, 뿐만 아니라 여과기의 상류 쪽에 축적되는 세포들의 중량에 의해 일정하게 압축된다. 따라서, 유체의 흐름이 여과기 내 기공들의 배향에 평행하는 이러한 여과 기술에서는, 유체가 기공을 통과할 때 큰 세포 및 작은 입자가 모두 바람직하지 못하게 여과재에 대향하게 될 수 있다. 결과적으로, 세포와 같이 액체 중의 보다 큰 생성물은 기공을 차단할 수 있고, 이에 의해 여과 효과를 감소시키고 세포 파열 또는 손상의 발생을 증가시킨다.

대조적으로, 본 시스템(10)의 중공 섬유 배위에서는, 여과되는 유체가 중공 관의 루멘 내부에서 흐른다. 여과기 본체의 기공을 통과할 수 있는 능력을 갖는 유체 부분은 본체의 내부에 미치는 유체의 정압, 뿐만 아니라 본체의 외부에 인가되는 부압의 도움으로 그렇게 된다. 이러한 실시태양에서, 세포들은 전형적으로 유체 흐름의 압력 또는 다른 세포의 중량을 받지 않고, 따라서 줄기 세포에 대한 전단력이 감소된다. 따라서, 여과의 효율 및 효능은 재생 세포 용해의 감소 및 막힘 속도의 감소에 의해 향상될 수 있다. 염수 및 원하지 않는 단백질 분자의 크기 때문에, 여과 동안 이들 분자 및 다른 작은 성분들은 중공 관의 본체의 기공들을 통해 중공 관의 바깥으로 통과하여 폐기물 용기(40)으로 보내진다. 한 실시태양에서, 여과는 중공 관 여과재의 바깥 쪽에 진공을 생성시킴으로써 향상된다. 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 또는 기원 세포의 크기로 인하여, 이들 세포는 대표적으로 본체의 기공을 통과하고, 따라서 중공 관 여과기의 내부에(예를 들면, 관의 루멘에) 남아있고, 여과기와 처리 챔버 사이의 도관을 통해 다시 처리 챔버(30)으로 또는 생산물 챔버(50)으로 보내진다.

한 특정 실시태양에서, 중공 섬유 여과기는 약 0.05 미크론 기공 크기를 갖고, 대략 550 ㎠의 여과재 표면적을 함유한다. 개별 여과재 관은 대표적으로 약 0.5 ㎜의 직경을 갖는다. 130 ㎖의 재생 세포 조성물을 처리하는데 있어서, 대략 120 ㎖의 추가 염수가 조성물에 첨가될 수 있다. 처리 또는 여과기 시간은 대략 8분일 수 있다. 중공 섬유 관의 본체의 어느 한 면 상에 미치는 압력(예를 들면, 본체의 루멘 내부 압력 및 본체 외부 압력)의 차는 막-통과 압력으로 간주된다. 막-통과 압력은 약 1 ㎜Hg 내지 약 500 ㎜Hg 범위일 수 있고, 바람직한 압력은 약 200 ㎜Hg이다. 중공 관 여과를 사용한 평균 유핵 세포 회수율 및 생육성은 생육 세포의 대략 80 %일 수 있다.

상기 시스템에서 대표적으로 제거되는 콜라게나제의 양은 3 로그 감소와 동등하다. 예를 들면 수집 챔버로부터 처리 챔버로 이동되는 재생 세포 조성물 중의 콜라게나제의 초기 농도가 0.078 U/㎖인 경우, 최종 재생 세포 조성물의 콜라게나제 농도는 0.00078 U/㎖이게 된다. 콜라게나제는 중공 관 여과기에서 제거되고, 중공 섬유 여과기는 상기 논의된 제3 여과기에 해당한다.

상기한 하나 이상의 여과 방법들을 예시하는 처리 챔버는 도면에, 특히 도 1-3에 나타나 있다. 도 1-3을 참고할 때, 여과기 조립체(36)의 여과 챔버와 처리 챔버(30) 사이에, 펌프, 예를 들면 펌프(34)가 제공될 수 있다. 또한, 통풍구 및 압력 센서, 예를 들면 통풍구(32) 및 압력 센서(39)가 처리 챔버(30) 및 여과기 조립체(36)과 인라인으로 제공될 수 있다. 생산물 챔버(50)을 위한 핏팅도 또한 제공될 수 있다. 이들 임의적인 성분들(예를 들면, 펌프(34), 통풍구(32), 압력 센서(39) 및 생산물(50)용 핏팅)은 처리 챔버(40)에 함유된 액체가 여과기 조립체(36)을 통과하여 흐르기 전에 이들 임의적인 성분들 중 하나 이상으로 흐를 수 있도록 여과기 조립체(36)과 처리 챔버(30) 사이에 제공될 수 있다. 예를 들면, 액체는 여과기 조립체(36)으로 가기 전에 펌프(34)를 통과하여 흐를 수 있다. 또는, 액체는 압력 센서(39)를 관통하여 흐른 후 여과기 조립체를 통과하여 흘러 시스템 내에 사전-여과기 액체 압력을 얻을 수 있다. 특정 상황에서, 이들 성분들 중 하나 이상이 도 6에 예시된 바와 같이 처리 챔버(30)의 한 엘레멘트로서, 예를 들면 통풍구(32)로서 제공될 수도 있다. 예시된 실시태양에서, 압력 센서(39)는 여과기 조립체(36)의 여과 챔버로 들어갈 때 펌프(34)에 의해 생성되는 재생 세포 조성물의 압력을 인라인으로 측정하는 것이다. 이러한 구성은 여과기 막을 가로지르는 막통과 압력의 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 조성물이 여과기 조립체(36)을 통해 여과될 때 원하지 않는 단백질의 제거를 돕기 위하여 추가적인 염수 또는 다른 완충제 및 세척 용액을 재생 세포 조성물에 첨가할 수 있다. 이러한 반복되는 세척은 여러 회 수행되어 재생 세포의 순도를 향상시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 염수는 여과를 향상시킬 필요가 있다고 생각될 때 임의의 단계에서 첨가될 수 있다.

제한이 아닌 단지 예로서 제공되는 한 특정 실시태양에서, 원하지 않는 단백질 및 염수 또는 다른 세척 용액이 하기하는 방식으로 제거된다. 재생 세포, 뿐만 아니라 콜라겐 및 연결 조직 입자 또는 단편, 지방 세포 및 콜라게나제를 갖는 조성물은 최소 부피에 도달될 때까지 일련의 여과기를 통해 순환된다. 최소 부피는 일부 소정의 상수 및 시스템의 전체 보유 부피의 함수이다. 보유 부피는 모든 처리 챔버가 비어 있는 경우, 배관 및 도관에 함유되어 있는 액체의 부피이다. 한 실시태양에서, 최소 부피는 15 ㎖이다. 최소 부피에 도달될 때, 세척 용액의 소정의 부피는 재생 세포 조성물과 혼합되어야 하는 시스템 내로 도입된다. 재생 세포 조성물 및 세척 용액의 이러한 혼합물은 이어서 최소 부피에 다시 도달될 때까지 여과기를 통해 순환된다. 이러한 사이클은 재생 세포의 순도를 향상시키도록, 또는 달리 말하면 조성물 중의 다른 물질에 대한 조성물 중의 재생 세포의 비를 증가시키기 여러 번 반복될 수 있다.

재생 세포 조성물이 원하지 않는 단백질을 세정하고 충분히 농축되었음(예시적인 실시태양에서는, 약 1 x 10⁵ 내지 약 1 x 10⁷ 세포/㎖ 범위 내의 최소 농도가 사용될 수 있고, 바람직한 실시태양에서 최소 농도는 약 1 x 10⁷ 세포/㎖임)을 결정한 후에, 생산물 챔버(50), 예를 들면 생산물 백이 특정 실시태양에 따라, 여과기 조립체(36) 및(또는) 처리 챔버(30)의 출구에 연결될 수 있다. 통풍구, 예를 들면 통풍구(32)가 이어서 개방되어 농축된 재생 세포의 생산을 용이하게 할 수 있다. 한 시행에서, 이러한 최소 농도가 도달된 때의 측정은 실험들을 실시하여 장치의 전자식 제어로 프로그래밍한 후에 실험적으로 이루어진다. 측정값은 얻고자 하는 것, 즉 얼마나 많은 줄기/기원 세포들이 바람직한 지, 또는 세포 농도의 범위의 처리로의 입력값일 수 있다. 과학적 데이터에 기초하여, 사전 결정된 양의 지방 조직을 얻어서 시스템에 넣고 원하는 출력값을 달성해야 할 필요가 있다. 통풍구(32)가 개방되면서, 펌프, 예를 들면 펌프(34)가 농축된 재생 세포를 생산물 백으로 이동시키는 기능을 할 수 있다. 한 실시태양에서, 생산물 백(50)은 한 단부에 핏팅을 갖는 관을 갖는 비어 있는 혈액 백과 유사하다. 멸균 방식으로, 생산물 백 상의 핏팅은 출구에 부착될 수 있으며, 농축된 재생 세포들이 생산물 백으로 이동될 수 있다.

도 1-3에 예시된 바와 같이, 진공 펌프(26)은 무엇보다도, 시스템 내의 압력을 변화시키도록 시스템(10) 내에 제공될 수 있다. 예를 들면, 진공 펌프(26)은 도관, 예를 들면 도관(12b)를 통해 수집 챔버(20)에 연결되어 수집 챔버(20) 내의 압력의 감소를 야기시킨다. 진공 펌프(26)은 또한 도관, 예를 들면 도관(12g)를 사용하여 처리 챔버(30)에 연결될 수 있다. 펌프(34)와 연결되는 진공 펌프(26)의 작동에 관하여, 2개의 별도의 진공 펌프 또는 공급원이 시행될 수 있거나, 또는 공정의 상이한 지점에서 필요로 하는 상이한 도관으로 진공을 보내는 밸브를 사용함으로써 1개가 시행될 수 있다. 또한, 진공 펌프(26)은 도관, 예를 들면 도관(12f)를 통해 폐기물 용기(40)에 연결될 수 있다.

도 10 및 11을 살펴볼 때, 진공 펌프(26)에 의해 생성된 압력을 사용하여 재생 세포를 포함하는 유체의 흐름을 도관(12)를 관통하게 보낼 수 있다. 이 압력은 예를 들면 시스템(10) 내 하나 이상의 밸브(14)의 위치를 자동적으로 또는 수동적으로 제어함으로써 다수개의 방향으로 제공될 수 있다. 시스템(10)은 정압의 사용과 함께 또는 부압의 사용을 통해, 또는 이들의 병용으로 적절하게 기능하도록 만들어질 수 있다. 예를 들면, 재생 세포는 상기한 제1 및 제2 여과기를 통해 제3 여과기에 연결된 연질 측면을 갖는 용기로 당겨질 수 있다. 연질-측면을 갖는 용기는 제3 여과기의 앞에 인라인(직렬) 연결될 수 있다. 최종 생산물 챔버는 제3 여과기의 다른 쪽에(예를 들면 하류측)에 있는 연질 측면을 갖는 용기일 수 있다. 이 실시태양에서, 압력을 사용하여 한 연질 측면을 갖는 용기로부터 여과기를 통해 제2의 연질 측면을 갖는 용기로 이동시킨다.

시스템(10)의 다른 실시태양에서, 줄기 세포 및(또는) 지방 유래 기원 세포의 여과는 침입성 여과 및 침강의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 상기 시스템은 조직 재생 세포 조성물(예를 들면, 줄기 세포 및(또는) 지방 유래 기원 세포를 함유하는 조성물)에 이어 여과기를 통과하는 염수를 사용한다. 재생 세포 조성물로부터 세포의 침입성 여과와 관련된 변수들 중 일부는 여과재의 기공 크기, 기공 기하형태 또는 형상, 여과기의 표면적, 여과되는 재생 세포 조성물의 흐름 방향 주입된 염수의 유량, 막-통과 압력, 세포 집단의 희석, 세포 크기 및 생육성을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.

시스템(10)의 한 실시태양에서, 처리 챔버(30)은 재생 세포를 분리 및 농축시키기 위하여 침입성 여과 및 침강을 시행하는 여과기 조립체를 사용한다. 제한이 아닌 예로서, 처리 챔버(30)은 도 6에 나타낸 바와 같이, 측벽(30a), 상부 표면(30b) 및 하부 표면(30c)을 갖는 일반적으로 원통형 본체로서 정의된다. 멸균 통풍구(32)가 상부 표면(30b)에 제공된다.

도 6의 실시태양에서, 처리 챔버(30)은 2개의 여과기, 예를 들면 큰 기공 여과기(36a), 및 작은 기공 여과기(36b)를 포함하는 여과기 조립체(36)을 포함하는 것으로 예시된다. 여과기(36a 및 36b)의 기공 크기는 대표적으로는 약 0.05 미크론 내지 약 10 미크론의 범위 내이다. 큰 기공 여과기(36a)는 약 5 ㎛의 직경을 갖는 기공들을 포함하고, 작은 기공 여과기(36b)는 약 1-3 ㎛의 직경을 갖는 기공을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 여과기는 약 785 ㎟의 표면적을 갖는다. 여과기(36a 및 36b)는 제1 챔버(37a), 제2 챔버(37b), 및 제3 챔버(37c)를 포함하도록 처리 챔버(30)의 내부를 분할한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 제1 챔버(37a)가 제2 챔버(37b)와 제3 챔버(37c) 사이에 위치한다. 또한, 제1 챔버(37a)는 입구(31a) 및 출구(3lb)를 갖는 처리 챔버(30)의 영역인 것으로 나타나 있다. 예시된 처리 챔버(30)은 처리 챔버(30)의 외부로부터 처리 챔버(30)의 내부로의 소통 경로를 제공하는 다수개의 문, 예를 들면 문(31a, 31b, 및 31c)을 포함한다. 문(31a, 31b, 및 31c)은 처리 챔버(30)의 본체의 측벽(30a)에 배치되는 것으로 예시된다. 그러나, 문(31a, 31b, 및 31c)은 또한 다른 영역에 위치할 수도 있다. 문(31a)은 재생 세포를 함유하는 조성물이 처리 챔버(30)의 내부로 통과될 수 있도록 도관에 연결되도록 구성된 샘플 입구로서 예시된다. 문(31b)는 분리되고 농축된 세포들이 처리 챔버(30)의 내부로부터 제거될 수 있도록 도관에 연결되도록 구성된 출구로서 예시된다. 문(31c)는 염수와 같이 새로운 세척 용액의 처리 챔버의 내부로의 전달을 위해 도관에 연결되도록 구성된 입구로서 예시된다.

사용시에, 재생 세포는 입구(31a)을 통해 중앙 챔버(37a)로 도입될 수 있다. 염수 또는 다른 완충제는 입구(31c)를 통해 하부 챔버(37b)로 도입된다. 염수는 약 10 ㎖/분의 속도로 챔버(37a) 중의 재생 세포 조성물을 관통하게 보내질 수 있다. 염수의 유량은 중력의 힘에 반대작용하도록 하는 것이다. 염수의 유량은 챔버 중의 세포들이 세포의 밀도에 기초하여 분리될 수 있는 능력을 제공한다. 대표적으로는, 염수가 조성물을 통과하여 위로 보내질 때, 조성물 중의 보다 큰 세포들은 중앙 챔버(37a)의 바닥에 침강하게 되고, 보다 작은 세포 및 단백질은 제2 여과기(36b)를 통해 멀리 상부 챔버(37c) 내로 운반되게 된다. 이러한 여과는 보다 큰 세포가 제 자리에서 롤링되어 보다 작은 입자들이 유리되어 염수와 함께 멀리 운반되도록 염수의 유량을 조절함으로써 달성된다. 멸균 통풍구(32)가 처리 유닛 내의 3개의 챔버에서 정확한 압력 구배가 유지되도록 보장하기 위하여 챔버(30) 내에 포함된다. 상부 챔버(37c)는 흡수 매체(33)을 포함할 수 있다. 흡수 매체의 목적은 용액 중의 원하지 않는 단백질이 예를 들면, 염수 유량이 감소될 경우, 다시 여과재를 가로질러 처리 용액으로 가지 못하도록 보장하기 위해 염수 중의 원하지 않는 단백질을 트랩핑하는 것이다. 흡수 매체는 여과되어야 하는 물질 또는 성분들을 끌어당기는, 흡수성인 한 유형의 여과기 물질일 수 있다. 폐기물의 인출을 돕기 위하여 상부 여과기 위에 유출구가 추가될 수 있다. 이것의 다른 실시태양은 폐기물을 인출하는 것을 돕기 위해 상부로부터 부드러운 진공을 인가하기 위한 것일 수 있다. 흡수 매체는 예시된 실시태양에서는 유량이 비교적 작을 때 시행될 수 있다. 과량의 염수 및 단백질은 이어서 멀리 폐기물 용기로 운반된다.

보다 큰 세포(예를 들면, 지방 유래 줄기 세포 및(또는) 기원 세포)가 보다 작은 세포 및 단백질로부터 충분히 분리되었을 때, 분리된 세포를 함유하는 조성물이 본원에서 논의된 바와 같이 농축될 수 있다. 조성물은 챔버(37a)로부터 출구(31b)를 통해 제거된 후에, 또는 챔버(37a) 중에 있는 동안에 추가로 농축될 수 있다. 한 실시태양에서, 조성물 중의 세포의 농도는 하기하는 방식으로 증가된다. 세포들이 충분히 분리된 후, 여과기들, 예를 들면 여과기(36a 및 36b)는 서로를 향해 이동될 수 있다. 이러한 이동은 2개의 여과기들 사이의 부피(예를 들면, 챔버(37a)의 부피)를 감소시키는 효과를 갖는다. 조성물 중 세포의 농축을 용이하게 하기 위하여 처리 챔버(30)과 연결하여 진동 부재가 제공될 수도 있다. 한 실시태양에서, 진동 부재는 여과기(36b)(예를 들면, 작은 기공 여과기)에 연결될 수 있다. 진동은 여과기 내에 트랩핑되는 세포의 빈도를 감소시킬 수 있다. 조성물의 부피 감소는 과량의 염수가 폐기물로서 제거되도록 하고 세포가 보다 작은 부피로 농축되도록 한다.

다른 실시태양에서, 재생 세포의 농도는 하기하는 방식으로 달성된다. 세포들이 충분히 분리된 후, 재생 세포 조성물은 중력을 사용하여 과량의 염수를 여과시키는 다른 챔버(나타나있지 않음)로 전달될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 침강은 침투와 동시에 일어날 수 있다. 이러한 침강은 약 10 kD 내지 약 2 미크론 범위의 기공 크기를 갖는 여과기의 상부에 조성물을 도입시킴으로서 달성될 수 있다. 한 실시태양에서, 적합한 여과기는 약 1 미크론의 기공 크기를 갖는다. 중력은 염수 및 보다 작은 입자들이 여과기를 통과하도록 하면서 조성물 중의 세포들은 여과기를 통과하지 못하게 할 것이다. 원하는 농도의 세포가 얻어진 후, 및 여과된 보다 작은 입자들이 여과기 아래로부터 제거된 후, 재생 세포 조성물은 여과기로부터 세포를 제거하도록 교반될 수 있고, 이어서 농축된 재생 세포들은 생산물 백으로 전달될 수 있다. 보다 작은 입자들이 출구를 통해 폐기물로서 인출될 수 있다.

특정 실시태양에서, 수집 챔버(20)으로부터의 재생 세포 조성물은 조성물이 재생 세포들을 분리 및 농축하도록 원심분리될 수 있는 처리 챔버(30)으로 이송된다. 원심분리 원리는 당 업계에 공지되어 있어, 간결함을 위해 본원에서 반복하지 않을 것이다. 업계가 인정한 표준 원심분리 장치, 성분 및 파라미터들이 본원에서 이용된다. 원심분리 장치의 부품으로 사용하기 위한 예시적인 처리 챔버는 도 7에 및 8에 나타나 있다. 대표적으로, 원심분리 장치는 원심분리 챔버(예를 들면, 도 7에 나타나있는 것)가 축 주위를 회전하도록 하고, 이에 의해 용액 중의 세포에 미치는 힘이 중력보다 더 크도록 증가시킨다. 용액 중의 보다 치밀한 또는 보다 무거운 물질은 대표적으로 원심분리 챔버의 한 단부로, 즉 도 7의 생산물 챔버로 침강되어 재생 세포 펠릿을 형성한다. 이어서 펠릿을 재현탁시켜 원하는 농도의 세포 및(또는) 원하는 부피의 세포 및 매질을 갖는 용액을 얻을 수 있다. 도 7에 나타낸 처리 챔버는 원심분리력 및 중력을 모두 사용하여 세포를 분리 및 농축시키도록 구성된다. 구체적으로, 원심분리 동안, 원심분리력은 재생 세포 조성물의 보다 치밀한 성분, 예를 들면 재생 세포를 원심분리 챔버의 가장 외부 단부를 향하게 된다. 원심분리 챔버가 느려져서 마침내 멈추었을 때, 중력은 재생 세포가 원심분리 챔버의 가장 외부 단부에 남아 있도록 돕고 세포 펠릿을 형성한다. 따라서, 재생 세포 조성물의 원하지 않는 성분, 즉 폐기물은 세포 펠릿을 방해하지 않고서 제거될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 처리 챔버는 회전 막 여과기 형태의 세포 농축기를 포함할 수 있다. 원심분리 공정의 추가의 실시태양에서는, 원심분리에 의한 용출법도 또한 가해질 수 있다. 이 실시태양에서, 세포들은 원심분리에 의해 인가되는 지향성(예를 들면 바깥쪽의) 힘이 세포 및 용질을 상이한 속도로 침강시키도록 개별 세포 침강 속도에 기초하여 분리될 수 있다. 용출법에서, 표적 세포 집단의 침강 속도는 용액을 원심분리에 대한 반대 방향으로 펌핑함으로써 인가되는 반대쪽(예를 들면, 안쪽의) 유량에 의해 방해를 받는다. 용액 내의 세포 및 입자들이 분리되도록 향류가 조절된다. 깨끗이 씻는 공정은 많은 경우의 세포 분리에서 적용되어 왔고(Inoue, Carsten et al. 1981; Hayner, Braun et al. 1984 ; Noga 1999), 흐름 및 원심분리 파라미터들을 최적화하는데 사용된 원리 및 관행들이 당 업계의 통상의 숙련인에 의해 본 발명의 내용에 비추어 본원에서 적용될 수 있다.

도 9는 본 발명에 따른 용출법의 시행과 관련된 원리를 예시한다. 용출 실시태양은 스핀형 회전자를 사용하여 용액에 힘이 인가되도록 하는 점에서 원심분리 시행과 유사할 수 있다. 현재구체화된 용출법 분리와 관련된 변수들 중 일부는 회전 챔버의 크기 및 형태, 회전자의 직경, 회전자의 속도, 향류 배관의 직경, 향류의 유량, 뿐만 아니라 용액으로부터 제거되어야 하는 세포 및 입자들의 크기 및 밀도를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 원심분리에서와 같이, 재생 세포는 개별 세포 밀도에 기초하여 분리될 수 있다.

한 실시태양에서, 재생 세포 조성물, 예를 들면 재생 세포 및 콜라게나제를 함유하는 용액은 도 9.1에 나타낸 바와 같이 스핀형 회전자의 챔버 내로 도입된다. 용액을 챔버에 첨가한 후, 추가적인 염수를 소정의 유량으로 챔버에 첨가한다. 염수의 유량은 회전자의 속도, 세포 직경 및 실험적으로 확립된 챔버 상수의 함수로서 사전결정될 수 있다. 유량은 예를 들면 IV 펌프와 유사한 장치로 제어되게 된다. 추가적인 염수의 목적은 도 9.2에 예시된 바와 같이, 보다 큰 입자들은 챔버의 한 면으로 이동하게 되고 보다 작은 입자들은 나머지 면으로 이동하게 되는 회전자 챔버 내의 조건을 제공하는 것이다. 흐름은, 본 출원에서는, 도 9.3에 나타낸 바와 같이, 보다 작은 입자들이 챔버를 빠져 나외 폐기물 용기로 이동하게 되도록 조절된다. 이러한 이동은 줄기 세포와 같은 세포의 실질적으로 균질한 집단을 갖는 회전자 챔버 내 용액을 생성시킨다. 줄기 세포가 용액(챔버로부터 제거된 유리 지질 및 원하지 않는 단백질을 갖는) 내 나머지 품목으로부터 분리되었음이 측정된 후, 향류가 중단된다. 챔버 내 세포들은 이어서 챔버의 외부 벽 상에 농축된 펠릿을 형성하게 된다. 향류는 역으로 되고 세포 펠릿은 생산물 백으로 이동된다.

본원에서 앞에서 기재된 바와 같이, 처리 챔버(30) 또는 생산물 챔버(50)은 하나 이상의 문, 예를 들면 문(51 또는 52)를 포함할 수 있다. 이들 문들 중 하나 이상은 상기한 방법들 중 임의의 조합, 또는 이의 일부분을 사용하여 얻은 재생 세포들을 도관을 통해 다른 수술 장치, 세포 배양 장치, 세포 마리네드 장치, 유전자 치로 장치 또는 정제 장치로 이동시키도록 디자인될 수 있다. 이들 문은 또한 상기한 바와 동일한 목적을 위해 재생 세포를 도관을 통해 시스템 내의 추가의 챔버 또는 용기로 또는 다른 시스템의 부품으로 이동시키도록 디자인될 수 있다. 문 및 도관들은 또한 하나 이상의 첨가제, 예를 들면 증식 인자, 재현탁 유체, 세포 배양제, 세포 팽창제, 세포 보존제 또는 유전자를 세포로 전사하는 약제를 포함하는 세포 변형제를 첨가하는데 사용될 수도 있다. 문 및 도관은 또한 재생 세포를 다른 표적, 예를 들면 이식 물질(예를 들면, 골격 또는 뼈 단편), 뿐만 아니라 다른 수술 이식물 및 장치로 이동시키는데 사용될 수 있다.

세포의 추가의 처리는 또한 일회용 세트의 기존 시스템의 상호연결을 재구성하고, 기존 시스템의 처리 장치를 재-프로그래밍함으로써, 기존 시스템에 상이한 또는 추가적인 용기 및(또는) 챔버를 제공함으로써, 세포를 하나 이상의 추가의 시스템 또는 장치 및(또는) 이들의 조합물로 이송함으로써 개시될 수 있다. 예를 들면, 시스템은 시스템을 사용하여 얻은 재생 세포들이 다음 중 하나 이상을 받을 수 있도록 상기한 임의의 수단에 의해 재구성될 수 있다: 세포 팽창(하나 이상의 재생 세포 유형의) 및 세포 유지(세포 시트 헹굼 및 매질 변화를 포함); 부분-배양; 세포 시딩; 일시적인 트랜스펙션(대량 공급무로부터 트랜스펙션된 세포의 시딩 포함); 수확(효소적, 비-효소적 수확 및 기계적으로 긁어내는 것에 의한 수확 포함); 세포 생육성 측적; 세포 평판배양(예를 들면, 미세적정 플레이트 상에서, 개별 웰로부터 팽창을 위한 세포의 픽킹(picking), 새로운 웰 내로의 세포의 팽창 포함); 고 처리량 스크리닝; 세포 치료 적용; 유전자 치료 적용; 조직 공학에 의한 처리 적용; 치료 단백질 적용; 바이러스 백신 적용; 뱅킹(banking) 또는 스크리닝을 위한 재생 세포 또는 상등액의 수확, 세포 증식의 측정, 용해, 접종, 감염 또는 유도; 세포주(혼성세포 포함)의 발생; 투과성 연구를 위한 세포의 배양; RNAi 및 바이러스 내성 연구를 위한 세포; 낙-아웃(knock-out) 및 트랜스게닉(transgenic) 동물 연구를 위한 세포; 친화성 정제 연구; 구조 생물학 적용; 분석 개발 및 단백질공학에 의한 처리 적용.

예를 들면, 특정 분야에 재생 세포 집단의 팽창이 요구될 경우에는, 그 집단을 우선적으로 팽창시키면서 다른 집단들은 유지시키거나(및 이에 의해 생장되는 선택된 세포들로의 희석에 의해 감소됨) 또는 필요한 증식 조건의 부재로 인하여 손실되는 배양 조건을 사용하는 접근법이 사용될 수 있다. 세키야 등(Sekiya et al)은 골수-유래 줄기 세포에 관하여 사용될 수 있는 조건을 설명하였다(Sekiya et al., 2002). 이 접근법(조직 배양 플라스틱에 대한 차등적인 접착성과 함께 또는 없이)은 본 발명의 추가의 실시태양에 적용될 수 있다. 이러한 실시태양에서는, 최종 재생 세포 펠릿을 생산물 챔버로부터 제거하여 세오 배양 성분을 제공하는 제2 시스템에 넣는다. 이것은 종래의 실험실 조직 배양 인큐베이터 또는 생체반응기-스타일(Bioreactor-style) 장치, 예를 들면 타소 등(Tsao et al.)의 US 특허 No. 6,001,642에 의해 또는 암스트롱 등(Armstrong et al.)의 US 특허 No. 6,238,908에 의해 설명된 바와 같은 형태일 수 있다. 다른 실시태양에서, 세포 팽창 또는 세포 배양 성분이 기존의 시스템에, 예를 들면 생산물 챔버 내로 첨가되어, 지방 유래 세포 집단의 단기간 접착성 및(또는) 세포 팽창을 가능하게 할 수 있다. 이 다른 실시태양은 세포 배양 및(또는) 세포 팽창 성분의 시스템으로의 통합을 허용하고 이 시스템으로부터 세포를 제거하여 다른 시스템 내에 설치할 필요성을 없앤다.

처리 동안, 결과를 향상시킬 필요가 있을 때 하나 이상의 첨가제를 다양한 챔버 또는 용기에 첨가하거나 또는 제공할 수 있다. 이들 첨가제는 또한 기존 시스템과 관련된 다른 시스템의 일부분으로서 또는 기존 시스템과는 별도로 제공될 수도 있다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 첨가제는 시스템으로부터 재생 세포를 제거할 필요없이 첨가되거나 또는 제공된다. 다른 실시태양에서는, 첨가제를 포함하는 새로운 용기 또는 챔버를 멸균 방식으로 시스템의 미사용 문으로 연결함으로써 첨가제가 첨가 또는 제공된다. 또 다른 실시태양에서는, 첨가제는 본 발명의 시스템에 연결되지 않은 제2 시스템 또는 장치에 첨가 또는 제공된다. 첨가제들의 일부 예는 본원에 기재된 바와 같은 세척 및 산해를 최적화하는 약제, 처리 동안 활성 세포 집단의 생육성을 향상시키는 첨가제, 항균제(예를 들면, 항생물질), 지방세포 및(또는) 적혈구를 용해시키는 첨가제 또는 관심을 갖는 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제(고체 상 성분에 대한 차등적인 접착성에 의하거나 또는 세포 집단의 실질적인 감소 또는 농축을 다른 방식으로 촉진시켜)를 포함한다.

예를 들면, 균질한 재생 세포 집단을 얻기 위하여, 특정 재생 세포 유형을 분리 및 농축하는 임의의 적합한 방법, 예를 들면 줄기 세포 또는 기원 세포, 예를 들면 내피 전구 세포 상에 존재하는 항원을 인식하고 결합하는 세포-특이성 항체를 사용하는 방법이 사용될 수 있다. 이들은 양성적 선택(표적 세포의 선택), 음성적 선택(원하지 않는 세포의 선택적 제거) 또는 이들의 병행을 모두 포함한다. 세포내 마커, 예를 들면 효소가 또한 특정 효소에 의한 작용을 받을 때 형광을 내는 분자를 사용하는 선택에 사용될 수 있다. 또한, 최종 세포 펠릿 내의 특정 재생 세포 집단의 차등적인 접착성 및(또는) 용출을 가능하게 하도록 선택된 접착성을 갖는 고체 상 물질이 시스템의 생산물 챔버에 삽입될 수 있다.

이러한 차등적인 접착성 접근법의 다른 실시태양은 표적 재생 세포 및 원하지 않는 세포 상에 차등적으로 발현되는 표면 분자들을 인식하는 항체 및(또는) 항체들의 조합물의 사용을 포함한다. 특이적 세포 표면 마커의 발현에 기초한 선택이 항체들이 고체 상 지지 구조물에 부착(직접적으로 또는 간접적으로)되는 다른 일반적으로 적용되는 기술이다(Geiselhart et al., 1996; Formanek et al., 1998; Graepler et al., 1998; Kobari et al., 2001; Mohr et al., 2001).

다른 실시태양에서, 세포 펠릿은 재-현탁되고, 형성된 유체 물질 위에(또는 아래에) 연속 또는 불연속 밀도 구배로 적층되고, 세포 밀도에 기초하여 세포 집단들을 분리하기 위한 원심분리기 내에 넣을 수 있다. 유사한 실시태양에서는, 연속 흐름 접근법, 예를 들면 성분채집술(Smith, 1997), 및 경사법(향류와 함께 또는 없이)(Lasch et al., 2000)(Ito and Shinomiya, 2001)이 또한 사용될 수 있다.

첨가제의 다른 예는 본원에 논의된 바와 같이 추가적인 생물학적 또는 구조적 성분, 예를 들면 세포 분화 인자, 성장 촉진제, 면역억제제, 의료용 장치 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 예를 들면, 다른 세포, 조직, 조직 단편, 증식 인자, 예를 들면 VEGF 및 다른 공지된 혈관형성 또는 동맥성 증식 인자, 생물학적으로 활성 또는 불활성 화합물, 재흡수가능한 골격 또는 재생 세포 집단의 전달, 효능, 내성, 또는 기능을 향상시키고자 하는 다른 첨가제들이 첨가될 수 있다. 재생 세포 집단은 또한 DNA의 삽입에 의해 또는, 구조적 또는 치료적 목적을 유도하기 위하여 재생 세포의 기능을 변화, 향상 또는 보충하는 방식으로 세포 배양 시스템(본원에 기재된 바와 같거나 또는 당 업계에 공지된 바와 같음) 내에 위치시킴으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포를 위한 유전자 전달 기술은 문헌[Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000)]에 개시된 바와 같이 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있고, 문헌[Walther and Stein, 2000] 및 문헌[Athanasopoulos et al., 2000)]에 개시된 바와 같이 바이러스 트랜스펙션 기술, 및 보다 구체적으로는 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 기술을 포함할 수 있다. 비-바이러스 기재 기술도 또한 문헌[Muramatsu et al., 1998]에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다. 하나 이상의 세포 분화 인자, 예를 들면 증식 인자(들) 또는 시토킨(들)을 코딩하는 유전자 또한 첨가될 수 있다. 각종 세포 분화제의 예는 문헌[Gimble et al., 1995; Lennon et al., 1995; Majumdar et al., 1998; Caplan and Goldberg, 1999; Ohgushi and Caplan, 1999; Pittenger et al., 1999; Caplan and Bruder, 2001; Fukuda, 2001; Worster et al., 2001; Zuk et al., 2001]에 개시되어 있다. 항-아폽토시스 인자 또는 약제를 코딩하는 유전자들도 또한 첨가될 수 있다. 유전자(또는 유전자들의 조합물)의 첨가는 아데노바이러스 형질도입, "유전자 건(gene guns)", 리포좀-매개 형질도입, 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질도입, 플라스미드, 아데노-관련 바이러스를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 당 업계에 공지된 임의의 기술에 의할 수 있다. 이들 재생 세포는 이어서 형질도입이 현장에서 계속되거나 또는 개시될 수 있도록 시간이 지남에 따라 유전자를 세포로 방출 및(또는) 제공할 수 있는 유전자 전달 비히클을 갖는 운반체 물질과 함께 이식될 수 있다.

세포 및(또는) 세포를 함유하는 조직이 세포 및(또는) 조직을 얻은 환자 이외의 환자에 투여될 때, 이식 거부반응을 감소시키고, 및 바람직하게는 막기 위하여 하나 이상의 면역억제제가 세포 및(또는) 조직을 수령하는 환자에 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "면역억제 약물 또는 약제"는 정상적인 면역 기능을 억제하거나 또는 방해하는 제약학적 약제를 포함하기 위한 것이다. 본원에 개시된 방법과 함께 적합한 면역억제제의 예는 U.S. 특허 공개 No. 20020182211에 개시된 바와 같이, T-세포/B-세포 코스티뮬레이션(costimulation) 경로를 억제하는 약제, 예를 들면 CTLA4 및 B7 경로를 통한 T-세포 및 B-세포의 커플링을 방해하는 약제를 포함한다. 바람직한 면역억제제는 시클로스포린 A이다. 다른 예는 마이오페닐레이트 모페틸, 라파미신, 및 항-가슴샘세포 글로불린을 포함한다. 한 실시태양에서, 면역억제 약물은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다. 면역억제 약물은 투여 경로에 적합한 제제로 투여되고, 바람직한 치료 효과를 달성하기에 충분한 투여형으로 대상에 투여된다. 다른 실시태양에서, 면역억제 약물은 본 발명의 재생 세포에 대한 내성을 유도하기에 충분한 시간 동안 일시적으로 투여된다.

이들 실시태양에서, 재생 세포는 본원에서 기재된 교반 장치 및 관련 방법과 같은 장치를 포함하여, 임의의 업게 인식된 방식을 통해 첨가제와 접촉되거나, 합해지거나, 혼합되거나 또는 첨가될 수 있다. 예를 들면, 요동, 역위, 펄스된 압축 또는 이동하는 롤러가 사용될 수 있다.

다른 면에서, 세포 집단은 이식편수령자 내에 위치시키고 재흡수가능한 플라스틱 외피 또는 다른 물질 및 관련 성분, 예를 들면 마크로포어 바이오서지, 인크.(MacroPore Biosurgery, Inc.)가 제조한 것으로 둘러싼다(예를 들면, U.S. ㅌ트특허 No. 6,269,716; 5,919,234; 6,673,362; 6,635,064; 6,653,146; 6,391,059; 6,343,531; 6,280,473 참조).

모든 상기한 실시태양에서, 분리 및 농축된 재생 세포의 적어도 일부분은 일반적으로 양도되고 그의 내용은 본원에서 참고문헌으로 인용되는 것으로 나타나 있는, 2001년 9월 14일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제60/322,070호의 권리를 청구하는, 2002년 9월 12일에 출원된, U.S. 특허 출원 No. 10/242,094, 발명의 명칭 "PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES"에 기재된 바와 같이, 냉동보존될 수 있다.

처리 종반에, 재생 세포는 생산물 챔버로부터 수동적으로 회수될 수 있다. 세포는 피하로, 근육내로, 또는 환자 내의 표적 부위로 세포를 전달하는 다른 기술에 의해 이식편수령자 내에 설치하기 위하여 전달 장치, 예를 들면 주사기 내로 부하될 수 있다. 달리 말하면, 세포들은 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 임의의 수단에 의해 환자 내에 위치할 수 있다. 바람직한 실시태양은 바늘 또는 삽입관에 의한, 또는 직접적인 수술 이식에 의한 설치를 포함한다. 다른 실시태양에서, 세포는 환자 내에 세포를 위치시키는데 사용될 수 있는, 용기, 주사기 또는 삽입관 등의 형태일 수 있는 생산물 챔버로 자동적으로 이송될 수 있다. 용기는 또는 나중 사용을 위해 또는 냉동보존을 위해 세포를 보관하는데 사용될 수 있다. 모든 회수 방법들은 멸균 방식으로 수행된다. 수술용 이식의 실시태양에서, 세포는 본원에서 기재된 바와 같이 사전성형된 매트릭스 또는 골격과 같은 첨가제와 관련하여 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양(예를 들면, 도 4에 나타낸 실시태양)에서, 시스템은 자동화된다. 다른 실시태양에서, 시스템은 자동화 및 수동식 성분을 갖는다. 시스템은 재-사용가능한 하드웨어 성분 또는 모듈에 연결시키거나 또는 장착된 하나 이상의 일회용 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 자동화 시스템은 시스템의 적절한 작동을 유발하는 스크린 디스플레이(도 16 참조)를 제공한다. 자동화 시스템은 또한 시스템의 일회용 성분들의 적절한 셋업을 위하여 절차의 상태 및(또는) 단계별 지시사항을 제공하는 스크린을 제공할 수 있다. 스크린은 또한 시스템 내 문제 또는 잘못이 일어난 경우 이를 지시하고 적절한 경우 "문제해결" 지침을 제공할 수 있다. 한 실시태양에서, 스크린은 예를 들면 터치 스크린을 통해 사용자가 시스템 내로 파라미터들을 입력할 수 있게 하는 사용자 인터페이스 스크린이다.

부분 및 완전 자동화 시스템은 처리 장치(예를 들면, 마이크로프로세서 또는 개인용 컴퓨터) 및 사용자 입력에 기초하여 공정의 하나 이상의 단계들을 작동시키고 자동화시키도록 시스템에 대한 제어 로직을 제공하는 관련 소프트웨어 프로그램을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 시스템의 하나 이상의 측면은 처리 장치 내에 들어있는 소프트웨어를 통해 프로그래밍가능한 것일 수 있다. 처리 장치는 리드 온리 메모리(Read Only Memory)(ROM) 내 하나 이상의 사전-프로그래밍된 소프트웨어 프로그램을 가질 수 있다. 예를 들면, 처리 장치는 혈액을 처리하도록 맞춰진 사전-프로그래밍된 소프트웨어, 지방 조직을 처리하여 작은 부피의 재생 세포를 얻는 다른 프로그램 및 지방 조직을 처리하여 보다 큰 부피의 재생 세포를 얻는 다른 프로그램을 가질 수 있다. 처리 장치는 또한 필요한 재생 세포의 양, 처리되는 조직의 유형, 필요한 후-처리 조작의 유형, 치료 적용 유형 등과 같은 관련 정보의 사용자 입력에 기초하여 공정을 최적화하기 위한 적절한 파라미터를 사용자에게 공급하는 사전-프로그래밍된 소프트웨어를 가질 수도 있다.

소프트웨어는 또한 시스템의 펌프 및 밸브를 제어함으로써 특정 배관 경로를 따라 조직 및 유체의 진입 및 탈출의 제어; 활성화의 적절한 순서 및(또는) 방향의 제어; 압력 센서를 이용한 차단의 검출; 기작들의 혼합, 용적형 기작을 사용하여 특정 경로를 따라 이동되어야 하는 조직 및(또는) 유체의 양 측정; 열제어 장치를 사용한 각종 성분들의 온도 유지; 및 타이밍 및 소프트웨어 기작과 분리 및 농축 공정의 통합과 같은 단계들의 자동화를 가능하게 할 수 있다. 처리 장치는 또한 처리되는 조직 유형 및(또는) 수확되는 세포 집단 또는 아집단, 및 수행되어야 하는 절차의 유형(예를 들면, 재생 세포로 개시되는 지방 조직을 사용한 조직 증강, 또는 재생 세포 코팅된 뼈 이식편을 사용하여 뼈 손상 적용을 위한 세포의 처리)에 기초하여 원심분리 속력을 제어할 수 있다. 처리 장치는 또한 다른 컴퓨터 또는 네트워크와 소통되는 다른 수단들 또는 표준 병렬식 또는 직렬식 포트를 포함할 수 있다. 따라서, 처리 장치는 스탠드 단독 유닛일 수 있거나, 또는 본원에 기재된 추가의 처리 방법들을 위한 관련된 하나 이상의 추가적인 장치일 수 있다.

소프트웨어는 예를 들면 일회용 성분의 품목 번호, 온도 및 부피 측정치, 조직 부피 및 세포 수 파라미터, 가해지는 효소의 투여량, 배양 시간, 작업자 아이덴티티, 날짜 및 시간, 환자 아이덴티티 등을 포함하는 "시행 데이터" 수집의 자동화를 가능하게 할 수 있다. 장치의 바람직한 실시태양에서, 바 코드 해독 시스템과 같은 캐릭터 인식 시스템은 처리의 문서화의 일부로서 처리 장치 내로의 이들 변수(예를 들면 일회용 세트 품목 번호 및 유효 기한, 콜라게나제의 품목 번호 및 유효 기간, 환자/샘플 확인자 등)의 데이터 기입을 허용하도록 통합되게 된다. 이것은 데이터 기입 오류 가능성을 감소시키게 된다. 이러한 바 코드 해독 시스템은 USB 또는 당 업계에 공지된 다른 인터페이스 포트 및 시스템을 사용하여 처리 장치에 쉽게 포함될 수 있다. 이러한 방식으로, 장치는 공정의 문서화 및 데이터 기입의 통합된 제어를 제공하게 된다. 이들 파라미터들의 인쇄된 보고서는 시스템의 프로그래밍된 작업의 사용자-결정 파라미터의 일부분이게 된다. 보통 이것은 프린터 성분(하드웨어 및 드라이버) 또는 소프트웨어 중의 프린터 드라이버 + 장치의 하드웨어 내 프린터에 대한 인터페이스 출력 연결기(예를 들면, USB 포트)의 통합을 필요로 하게 된다.

특정 실시태양에서, 본 시스템은 완전 자동화 시스템이다. 예를 들면, 사용자가 처음에 처리하고자 하는 조직의 양을 선택하여 시스템을 환자에 부착할 수 있고, 시스템은 추가의 사용자 입력 없이 중단없는 순서로 지동적으로 필요한 조직을 흡입하고 재생 세포를 분리 및 농축할 수 있다. 사용자는 또한 필요한 재생 세포의 양을 입력하여 시스템이 필요한 양의 조직을 흡입하여 그 조직을 처리하게 할 수 있다. 완전 자동화 시스템은 또한 세척 사이클 횟수, 원심분리 속도 등과 같은 많은(예를 들면, 2 이상) 사용자 입력 파라미터들에 기초하여 재구성될 수 있는 시스템을 포함한다. 시스템은 또한 시스템이 사용자 중재 없이 특정 단계들을 통과하지만 특정 처리공정이 일어나기 전에는 사용자 중재를 요구하는 반-자동 모드로 운전될 수도 있다. 다른 실시태양에서, 시스템은 사용자가 소정의 시간에 소정의 작업을 수행하도록 안내하는 지시사항을 나타내는 단일 통합 시스템이다. 예를 들면, 처리 장치는 배관, 챔버 및 시스템의 다른 성분들의 적절한 삽입을 필요로 하는 단계들을 통과하고 있음을 사용자에게 알릴 수 있다. 따라서, 사용자는 확실하게 적절한 작업 순서가 수행되게 할 수 있다. 이러한 시스템은 처리과정 내 단계들의 불가피한 활성화 또는 종료를 예방하기 위하여 사용자에 의한 각 작업 단계의 확인을 추가로 요구할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본 시스템은 배관, 챔버의 정확한 삽입, 차단의 부재 등을 확인하기 위하여 자동화 시험을 개시할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 시스템은 시스템을 통과하는 조직 흐름의 자동적 제어를 통해 분리 및 농축 공정을 여러 회 수행하도록 프로그래밍될 수 있다. 이러한 특징은, 예를 들면 다른 방식으로 손실되게 되는 조직을 시스템 내에서 수집하여 그 조직으로부터 재생 세포를 분리 및 농축하여 환자에게 돌려보내는 수술을 환자에 행하는 동안 중요할 수 있다.

본원에서 기재한 바와 같이, 시스템의 성분들은 시스템의 일부분이 한 번 사용 후에 폐기될 수 있도록 일회용(본원에서는 "일회용 세트(들)"로 언급됨)일 수 있다. 이러한 시행은 환자의 조직과 접촉하게 되는 임의의 표면이 확실하게 사용된 후에 적절하게 폐기되도록 하는 것을 도울 수 있다. 예시적인 일회용 세트가 도 13에 예시되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 시스템의 일회용 성분들은 사용하기 쉽고 장전하기 쉬우며, 많은 배관 연결 및 배관 연결의 복잡한 경로를 필요로 하지 않는 "규격품"으로 사용할 수 있도록 사전-멸균 및 포장된다. 이러한 일회용 성분은 비교적 저렴하게 제조되고, 그러므로 그들의 폐기로 인해 상당한 지출을 발생시키지 않는다. 한 실시태양에서, 일회용 시스템(본원에서 상호교환적으로 "일회용 세트(들)"로 언급됨)은 수집 챔버(20), 처리 챔버(30), 폐기물 챔버(40), 생산물 챔버(50), 여과기 조립체(36), 샘플 백(60) 및 관련 도관(12) 또는 배관을 포함하거나, 이들을 필수 성분으로 하여 구성되거나 또는 이들로 구성된다. 시스템의 일회용 세트의 바람직한 실시태양에서, 수집 챔버(20) 및 처리 챔버(30)은 경질 프레임 내에 수용된 도관(12)를 사용하여 연결된다. 처리 챔버(30)의 회전하는 시일 네트워크(도 7 & 8) 또한 동일한 경질 프레임 내에 수용될 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 일회용 세트의 다양한 챔버 및 용기들은 펌프, 밸브, 센서 및 시스템을 자동화하는 다른 장치가 사용자 중재 없이 필요할 때에 적절하게 활성화되거나 또는 탈-활성화되도록 시스템의 처리 장치와 소통할 수 있는 필수적인 인터페이스를 포함한다. 인터페이스는 또한 시스템을 셋업하는데 필요한 시간 및 노력을 감소시키고, 어떻게 시스템을 적절하게 셋업하는지를 지시하고 잘못된 셋업의 경우 사용자에게 경고함으로써 오류 또한 감소시킨다.

대부분의 본 발명의 일회용 세트는 많은 공통 엘레멘트들을 갖게 된다. 그러나, 당 업계의 통상의 숙련인은 시스템의 상이한 적용분야가 일회용 세트의 일부분일 수 있는 추가적인 성분들을 요구할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 일회용 세트는 환자로부터 지방 또는 다른 조직을 얻고 재생 세포를 환자로 보내는데 적합한 하나 이상의 바늘 또는 주사기를 추가로 포함할 수 있다. 포함되는 주사기 및 바늘의 다양성 및 유형 수는 처리되는 조직의 양 및 유형에 의존하게 될 것이다. 일회용 세트는 시스템 내에 사용되는 세척 유체 및 다른 처리 시약을 보유하는 하나 이상의 경질 또는 가요성 용기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 일회용 세트는 절차에 필요한 염수, 효소 및 임의의 다른 치료 또는 대체 유체를 보유하는 용기들을 포함할 수 있다. 또한, 적합한 세척 용액, 재-현탁 유체, 첨가제, 약제 또는 이식 물질에는 본 발명의 시스템 및 방법과 함께 사용하기 위한 일회용 세트가 제공될 수 있다.

본원에 기재된 또는 다른 방식으로 본 발명을 실행하는데 필요한 시스템 성분, 장비 또는 공급물의 임의의 조합물이 키트의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키트는 예를 들면 작은 부피의 조직의 처리를 가능하게 하는 바람직한 여과재를 함유하는 멸균 주사기 및 지방흡입에 기초한 주사기용 최적 길이 및 게이지 바늘을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있고 본 발명의 키트로 포함될 수 있는 다른 예시적인 장비 및 공급물은 아래 표 II 및 III에 열거된다.

아래 표 II는 본 발명의 시스템 및 방법에 따라 지방 유래 재생 세포를 얻는데 사용될 수 있는 공급물의 예들을 나타낸다.

종목	공급업체	수량	주해
10 ml 주사기	벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson)	필요량	임의적, 지방흡입에 사용
14GA 둔단 바늘		필요량	임의적, 지방흡입에 사용
하나의 혈액 팩(600 ml)	백스터 펜월(Baxter Fenwal)	1	주요 세포 처리 백; 백은 라인 상에 스파이크 어댑터 및 2개의 자유 스파이크 포트를 갖는다
커플러가 있는 전달 팩(150 ml)	백스터 펜월	1	4개 백 세트
커플러가 있는 전달 팩(1L)	백스터 펜월	1	폐기물 백
샘플 부위 커플러	백스터 펜월	2
0.9& 염수(주사용)	백스터 펜월	1
14GA 예리한 바늘	모노젝트(Monoject)	필요량	백에 지방흡입 조직 첨가용
20GA 예리한 바늘	모노젝트	3	콜라게나제 첨가 및 PLA 세포 제거용
0.2 ㎛ 스터플립(Sterflip) 여과기	밀리포어(Millipore)	1	콜라게나제 여과용
테루플렉스(Teruflex) 알루미늄 밀봉 클립	테루모(Terumo)	4	일시적인 관 밀봉을 위한 ME*ACS121
포비돈 요오드 제제 패드	트리아딘(Triadine)	필요량	10-3201
리버라제 H1 콜라게나제	로쉐(Roche)		과정 주해 1 참조
TSCD 웨이퍼	테루모	2	TSCD 멸균 배관 용접기와 사용하기 위한 1SC*W017

아래 표 III은 본원에 개시된 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있는 장비를 나타낸다.

종목	공급업체	수량	주해
소발 레전드(Sorvall Legend) T 이지 세트(Easy Set) 원심분리	피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)	1	75-004-367
회전자	켄드로(Kendro)/소발(Sorvall)	1	TTH-750 회전자
회전자 버켓	켄드로/소발	4	75006441 둥근 버켓
150 ml 백용 어댑터	켄드로/소발	4	00511
혈장 발현기	백스터 펜월	1	4R4414
관 밀봉기	세브라(Sebra)	1	모델 1060
TSCD 멸균 배관 용접기	테루모	1	3ME*SC201AD
랩라인 써멀 락커(LabLine Thermal Rocker)	랩라인(LabLine))	1	4637
'일회용' 플라스틱 지혈-스타일 클램프	다브론(Davron)	3
균형 백 세트		2	원심분리 균형을 이루는데 사용된 물-충전된 백
생물유해 예리한 챔버		1
생물유해 폐기물 챔버		1

시스템의 재사용가능한 성분은 수집 챔버용 교반 기작, 펌프 및 밸브와 펌프 제어를 작동시키는 관련 센서, 원심분리 모터, 원심분리 모터의 회전하는 프레임, 사용자 인터페이스 스크린 및 USB 포트, 일회용 세트가 재사용가능한 하드웨어 성분에 고정적으로 부착되어 접촉하도록 일회용 세트를 연결시키는 연동 또는 도킹 장치 또는 구성물 및 다른 관련 장치들을 포함하거나, 이들을 필수 성분으로 하여 구성되거나 또는 이들로 구성된다. 예시적인 재사용 성분이 도 14에 예시되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 재사용가능한 성분은 재생 세포 조성물로부터 재생 세포를 분리 및 농축하기 위한 수단, 예를 들면 회전하는 원심분리를 포함한다. 이 실시태양에서, 재사용가능한 성분은 도 15A에 나타낸 바와 같이 일회용 세트의 처리 챔버(원심분리 챔버 포함)의 일부분에 연결 및 접촉하도록 디자인된다. 재사용가능한 성분 내 재생 세포의 분리 및 농축 수단은 회전하는 원심분리에 제한되지 않고, 스핀형 막 여과기를 포함하여 본원에 기재된 임의의 다른 구성물도 또한 포함할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 재사용가능한 성분은 또한 몇 가지 상이한 조직 처리 과정들을 수행하고 이에 따라 시스템의 각종 펌프 및 밸브를 선택적으로 작동시키기 위한 사전-프로그래밍된 소프트웨어를 함유하는 본원에 기재된 처리 장치를 수용할 수 있다. 프로세서는 또한 제공자/환자 정보를 보관하고, 나중의 다운로드 또는 편집을 위해 정보 및 다른 데이터를 처리 또는 수집할 수 있는 데이터 저장능을 포함할 수 있다. 재사용가능한 성분은 각종 일회용 세트들과 함께 사용될 수 있다. 일회용 세트는 예를 들면, 일회용 세트가 재사용가능한 성분 상에 존재하는 처리 장치가 일회용 세트의 각종 성분들, 뿐만 아니라 재사용가능한 성분들 및 다른 관련 장치 및 시스템의 각종 성분을 제어, 즉 이들로부터 신호를 받고 신호를 이들로 보내는 방식으로 재사용가능한 하드웨어 성분에 고정적으로 부착 및 접촉하도록 일회용 세트를 연결하는 연동 장치 또는 구성물을 통해 재사용가능한 성분에 연결된다.

한 실시태양에서, 본 시스템에 사용하기 위한 일회용 세트는 약 800 mL의 조직을 수용할 수 있는 수집 챔버(20); 수집 챔버(20)에서 세척되고 소화된 약 800 mL 조직에 의해 생성된 재생 세포 조성물을 처리할 수 있는 처리 챔버(30); 0.5 mL 이상의 재생 세포를 수용할 수 있는 생산물 챔버(50); 및 약 10 L의 폐기물을 수용할 수 있는 폐기물 용기(40)을 포함한다. 본 실시태양에서, 하드웨어 장치는 24"L X 18"W X 36"H 이하이다. 일회용 세트 뿐만 아니라 하드웨어 장치의 다양한 성분들의 다른 치수들이 필요할 때에 구성될 수 있고, 비제한적으로 본 발명에 의해 포함된다.

시스템의 일회용 성분들은 장치에 설치하기 쉽다. 상응하는 재사용가능한 성분들과 함께 조립되어 이용되는 일회용 세트의 한 예가 도 15A에 예시되어 있다. 시스템은 바람직하게는 적절하게 적재된 일회용 성분들을 검출할 수 있도록 디자인된다. 예를 들면, 각 일회용 세트의 성분들은 배관, 챔버 등을 적절하게 정렬시켜 시스템 내 적절한 위치에 삽입시키는 색-안내되는 표시를 가질 수 있다. 추가적인 실시태양에서, 본원에 개시된 시스템은 휴대용 유닛이다. 예를 들면, 휴대용 유닛은 지방 조직 수확이 일어난 한 위치로부터 지방 조직 수확을 위한 다른 위치로 이동될 수 있다. 특정 시행에서는, 휴대용 유닛은 환자의 침상 곁에서 지방 조직을 수확 및 처리하는데 적합하다. 그리하여, 휴대용 유닛은 환자로부터 한자로 이동할 수 있는 시스템의 일부분일 수 있다. 따라서, 휴대용 유닛은 제 자리에 위치하는 휠 상에 있을 수 있고, 따라서 과정 전반에 걸쳐 안정되고 고정된 자세로 있는 편리한 위치에 쉽게 위치하여 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, 휴대용 유닛은 테이블 상부와 같은 편평한 표면 상에서의 셋업 및 작업을 위해 디자인된다. 휴대용 유닛은 하우징 유닛 내에 넣어질 수도 있다. 휴대용 유닛은 행거, 후크, 라벨, 자 및 과정에 도움을 주는 다른 장치를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 재사용가능한 시스템 성분, 예를 들면 원심분리, 처리 장치, 디스플레이 스크린은 모두 시스템의 휴대용 유닛 상에 장착될 수 있다.

재생 세포를 얻기 위한 다른 수동적 실시태양도 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 예를 들면, 한 실시태양에서, 지방 조직은 본원에 기재된 시스템, 장비 및(또는) 공급물의 성분들의 임의의 조합물을 사용하여 진행될 수 있다.

본 발명을 구체화하는 시스템의 특정 예가 도 4에 나타나 있다. 도 4는 환자 내에서의 재주사에 적합한, 조직, 예를 들면 지방 조직으로부터 재생 세포의 분리 및 농축을 위한 자동화 시스템 및 방법을 예시한다. 도 4에 나타낸 시스템의 특정 실시태양에서, 시스템은 환자로부터 주어진 양의 조직을 흡입하는 자동화 단계를 추가로 포함한다. 도 4에 나타낸 시스템은 도 15A에 나타낸 시스템의 자동화 실시태양에 도달하기 위해 도 14에 나타낸 시스템의 재사용가능한 성분에 연결된 도 13에 나타낸 일회용 세트를 포함한다. 일회용 세트는 예를 들면, 일회용 세트가 재사용가능한 성분 상에 존재하는 처리 장치가 일회용 세트의 각종 성분들, 뿐만 아니라 재사용가능한 성분들 및 다른 관련 장치 및 시스템의 각종 성분을 제어, 즉 이들로부터 신호를 받고 신호를 이들로 보내는 방식으로 재사용가능한 하드웨어 성분에 고정적으로 부착 및 연결되도록 일회용 세트를 재사용 성분에 연결하는 연동 또는 도킹 장치 또는 구성물을 통해 재사용가능한 성분에 연결된다.

사용자는 일회용 세트를 재사용가능한 성분에 연결하고, 사용자 인터페이스를 사용하여 특정 파라미터들, 예를 들면 수집되는 조직의 부피를 입력하고 시스템을 환자에 부착할 수 있으며, 시스템은 사전-프로그래밍된 및(또는) 사용자 입력 파라미터들을 사용하여 중단없는 순서로 도 4에 나타낸 단계들을 모두 자동적으로 수행한다. 이러한 한 순서를 도 15B에 예시한다. 다르게는, 조직은 사용자에 의해 환자로부터 수동적으로 흡입되어 처리, 즉 재생 세포의 분리 및 농축을 위해 시스템으로 이송될 수 있다.

구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 조직, 예를 들면 지방 조직은 도관(12)를 사용하여 환자로부터 인출되어 수집 챔버(20) 내로 도입될 수 있다. 도 4의 수집 챔버를 도 5에 상세하게 예시한다. 도 5에 예시된 바와 같이, 수집 챔버(20)은 표준 삽입관을 사용하여 조직 제거를 용이하게 하는 진공 관로(11)을 포함할 수 있다. 사용자는 이 지점에서 수집 챔버(20)으로 보내지는 추정된 부피의 조직을 넣을 수 있다. 조직은 조직, 염수 및 다른 약제들이 무균 방식으로 조직에 첨가될 수 있게 하는 밀폐된 유체 통로의 일부분인 입구(21)을 통해 수집 챔버(20)에 도입된다. 시스템의 광학 센서, 예를 들면 센서(29)는 조직의 사용자 입력 부피가 수집 챔버(20) 내에 존재할 때를 검출할 수 있다. 특정 실시태양에서, 사용자 입력량보다 적은 조직이 수집 챔버에 존재하는 경우, 사용자는 수집 챔버(20) 내에 존재하는 부피의 조직의 처리를 시작할 수 있는 선택권을 갖게 된다. 특정 실시태양에서, 환자로부터 제거된 조직의 일부분은 펌프, 예를 들면 연동 펌프의 사용을 통해, 사용자 인터페이스를 이용한 사용자 입력을 통해 작동될 수 있는 도관을 통해 샘플 챔버(60)으로 보내질 수 있다.

센서(29)는 재사용가능한 성분에 존재하는 처리 장치에 신호를 보내어 조직을 세척 및 산해시키는 필요한 단계들을 작동시킬 수 있다. 예를 들면, 처리 장치는 자동화 밸브 및 펌프를 사용하여 수집된 조직의 부피에 기초하여 사전-설정된 부피의 세척제를 도입시킬 수 있다. 이러한 사이클은 광학 센서가 유출액이 충분히 투명하고 원하지 않는 물질이 없음을 확인할 때까지 수집 챔버 내에서 반복될 수 있다. 예를 들면, 수집 챔버(12b 또는 12d)로부터 나오는 도관을 따른 광학 센서(29)는 원하지 않는 물질이 제거되었음을 검출할 수 있고, 처리 장치에게 신호를 보내어 필요한 밸브를 닫아 다음 단계를 개시할 수 있다.

다음으로, 처리 장치는 수집된 조직의 부피에 기초하여 사전-프로그래밍된 양의 산해제를 도입할 수 있다. 처리 장치는 또한 수집된 조직의 초기 부피에 기초하거나 또는 사용자 입력에 기초하여 사전설정된 기간 동안 수집 챔버에서 조직의 교반을 작동시킬 수 있다. 도 4에 나타낸 실시태양에서, 산해제, 예를 들면 콜라게나제가 일단 콜라게나제 공급원(24)를 통해 수집 챔버(20)에 첨가되면, 수집 챔버(20) 내 모터가 처리 장치를 통해 작동된다. 모터는 자기 교반기 및 패들-유사 장치를 포함하고 하나 이상의 패들(25a)가 수집 챔버(28)에 사전고정된 여과기의 여과기 케이지(27)에 단단하게 부착되어 있는 회전가능한 샤프트(25)를 작동시킨다. 패들은 산해제 존재하에 재생 세포가 조직으로부터 분리되도록 교반시킨다.

수집 챔버(20) 내 용액은 사전설정 기간 동안에 침강될 수 있도록 한다. 용액의 부유 부분은 용액의 상부로 상승되게 된다. 일단 사전설정 기간이 경과한 후, 처리 장치에 의해 필수적인 밸브 및 펌프를 작동시켜 비-부유 부분을 폐기물 챔버(40)으로 제거한다. 폐기물 챔버(40)으로의 전달은 수집 챔버로부터 나오는 도관(12b 또는 12d)을 따른 센서(29)가 용액 중의 부유 분획물이 폐기물 챔버(30)으로 전달되려고 함을 검출할 때까지 계속된다. 예를 들면 수집 챔버로부터 나오는 도관(12b 또는 12d)을 따른 센서(29)는 원하지 않는 물질이 제거되었음을 검출할 수 있고, 필요한 밸브를 닫도록 처리 장치에게 신호를 보낼 수 있다.

이 때 용액 비-부유 분획물, 예를 들면 재생 세포 조성물은 처리 챔버(30)으로 이동된다. 이것은 필수적인 밸브 및 연동 펌프의 사용을 통해 달성된다. 특정 실시태양에서, 재생 세포 조성물의 처리 챔버(30)으로의 전달 전에, 추가적인 부피의 염수가 수집 챔버(20) 내 남아있는 용액의 부유 분획물에 첨가될 수 있다. 다른 세척 사이클이 반복될 수 있다. 이 사이클 후, 용액은 침강되어 비-부유 분획물(재생 세포를 함유)은 처리 챔버(30)으로 이송되고 부유 분획물은 폐기물 챔버(40)으로 배수된다. 추가적인 세척 사이클을 사용하여 모든 분리된 재생 세포들의 처리 챔버(30)으로의 전달을 최적화한다.

일단 재생 세포 조성물이 도관(12)에 의해 처리 챔버(30)으로 이송되면, 조성물은 농축 시기의 시작 전에 한 번 이상의 세척 단계들을 행할 수 있다. 이것은 수집 챔버(20)으로부터 폐기물 및 잔류 오염물질들이 확실하게 제거되도록 한다. 유사하게, 농축 단계 후에, 재생 세포 조성물은 하나 이상의 추가적인 세척 단계들을 행하여 잔류 오염물질을 제거할 수 있다. 원하지 않는 물질은 동일한 방식으로, 즉 상기한 바와 같이, 처리 장치로부터의 신호를 통한 밸브 및 펌프의 제어로 처리 챔버(30)으로부터 폐기물 챔버(40)으로 제거될 수 있다.

도 4에 나타낸 처리 챔버(30)의 각종 실시태양들을 아래에서 상세하게 설명한다. 도 4에 나타낸 처리 챔버(30)은 원심분리 챔버 형태이다. 도 4의 처리 챔버의 상세한 설명을 도 7 및 8에 나타낸다. 이 처리 챔버(30)은 일반적으로 외부 하우징(30.2), 하나 이상의 시일(30.3), 하나 이상의 베어링(30.4) 및 처리 챔버를 시스템의 재사용가능한 성분 내에 존재하는 원심분리 장치에 연결하기 위한 부착 지점(30.6); 회전하는 시일로부터 연장되어 각 단부가 하나 이상의 문(52) 및 생산물 챔버(50)을 수동적으로 재위치시키기 위한 하나 이상의 핸들을 포함하는 프레임(53) 내에 수용된 생산물 챔버(50)의 형태로 있는 원심분리 챔버에서 끝나는 도관 형태의 하나 이상의 유체 통로(30.5)를 포함하는 회전하는 시일 네트워크(30.1)을 포함한다.

회전하는 시일 네트워크(30.1)은 처리 챔버의 유체 통로가 확실하게 멸균 조건으로 유지될 수 있도록 하기 위해 포함된다. 또한, 처리 챔버의 유체 통로는 임의의 시간에, 심지어 처리 챔버의 원심분리 챔버가 회전하고 있는 동안에도, 멸균 방식으로 (예를 들면 약제 또는 세척 용액을 첨가하기 위해) 출입될 수 있다.

도 7 및 8에 나타낸 회전하는 시일 네트워크(30.1)은 2개 이상의 베어링(30.4), 3개 이상의 립 시일(30.3) 및 외부 하우징(30.2)를 포함하는 회전하는 샤프트를 포함한다. 본 실시태양에서, 베어링(30.4)는 본원에서 레이스(race)로 언급되는 외부 및 내부 샤프트(나타나있지 않음)을 추가로 포함한다. 이들 레이스는 정밀 둥근 구에 의해 분리될 수 있다. 베어링을 구성하는 레이스 및 구는 바람직하게는 체액과의 접촉에 적합한 물질로 제작되거나 또는 체액과의 접촉에 적합한 물질로 코팅된다. 바람직한 실시태양에서, 레이스 및 구는 예를 들면 실리콘 니트라이드 또는 지르코니아를 사용하여 제작된다. 게다가, 본 실시태양에서, 3개의 립 시일은 원형 "U"형 채널(나타나있지 않음), 뿐만 아니라 원형 스프링(나타나있지 않음)을 포함한다. 원형 "U"형 채널은 바람직하게는 회전하는 시일 네트워크(30.1)의 회전하는 샤프트와 누출방지 접합이 형성되도록 가요성 물질을 사용하여 제작된다. 추가적으로, 립 시일은 바람직하게는 처리 챔버를 관통하여 흐르는 재생 세포 조성물로부터의 압력이 시일 조립체가 증가된 장력으로 그의 회전하는 샤프트와의 접합을 밀폐시키는 방식으로 배향된다. 시일은 회전하는 시일 네트워크(30.1)의 외부 하우징(30.2) 내 홈에 체결되도록 필요할 때 연장 및(또는) 붕괴될 수 있는 하나 이상의 원형 클립(나타나있지 않음)을 통해 제 위치에 고정될 수 있다. 회전하는 시일 네트워크(30.1)에 의해 또는 그 부근에 발생된 열은 통로를 통해 이동하고 있는 용액 중의 세포의 용해를 예방하도록 제어되어야 한다. 이것은 예를 들면, 회전하는 샤프트를 구성하기 위해 경질 물질을 선택하고, 시일과 접촉하게 되는 회전하는 샤프트의 영역을 연마하고, 회전하는 샤프트와 시일 사이의 접촉을 최소화함으로써 달성될 수 있다.

다른 실시태양에서, 회전하는 시일 네트워크(30.1)은 단일 고무 시일(30.3) 및 에어 개스킷(나타나있지 않음)을 포함한다. 이 시일 및 개스킷은 시스템의 멸균성을 손상시킬 수 있는 임의의 생물학적 물질에 대하여 구불구불한 경로를 제공한다. 다른 실시태양에서, 회전하는 시일 네트워크(30.1)은 개별 유체 경로를 격리시키는 다수개의 스프링 적재된 시일(30.3)을 포함한다. 시일(30.3)은 윤활제 없이 회전하는 샤프트를 밀봉할 뿐만 아니라 멸균될 수 있는 물질로 제작된다. 다른 실시태양에서, 회전하는 시일 네트워크(30.1)은 상이한 유체 경로를 생성하는 한 쌍의 세라믹 디스크(나타나있지 않음)를 포함하고, 시스템의 회전에 견딜 수 있으며 세포 용해를 야기시키지 않는다. 다른 실시태양에서, 유체 통로는 가요성이고, 처리 챔버에 대하여 권취 및 권출될 수 있다. 이것은 처리 챔버(30)의 내 2회 회전에 대하여 한 번 회전하는 가요성 유체 통로를 가짐으로써 달성된다. 이것은 회전하는 시일 전체에 대한 필요를 없앤다.

재생 세포 조성물은 회전하는 시일 네트워크(30.1)의 회전 축을 관통하여 유체 경로를 따라 수집 챔버(20)으로부터 펌핑된 다음 최소한 2개의 유체 통로들(30.5)로 분배되고, 각각의 유체 통로는 처리 챔버30)의 중심 축으로부터 바깥쪽으로 방사상으로 퍼져 처리 챔버(30)의 외부 단부 부근에서, 즉 생산물 챔버(50)을 수용하는 원심분리 챔버 내에서 종료된다(도 7 및 8). 따라서, 바람직한 실시태양에서, 처리 챔버(30)은 도 7 및 8에 나타낸 바와 같이 2개 이상의 생산물 챔버(50)을 포함한다. 이들 생산물 챔버(50)은 이들이 처리 동안 한 배향으로(30.7) 및 농축된 재생 세포의 수복을 위해서는 다른 배향으로(30.8) 있도록 위치된다. 예를 들면, 생산물 변화는 처리 동안 한 각으로 경사지고 세포 수복을 위해서는 다른 각으로 경사진다. 세포 수복각은 처리 각보다 더 수직이다. 생산물 챔버(50)의 2개의 위치는 처리 챔버(30)으로부터 돌출되어 있는 핸들(53)을 통해 수동적으로 조작될 수 있다. 재생 세포는 이들이 수복 배향(30.8)에 있을 때 주사기를 사용하여 생산물 챔버(50)으로부터 수동적으로 수복될 수 있다. 다른 실시태양에서, 유체 경로(30.5)는 처리 챔버 외부를 분할한 다음 처리 챔버(30)의 외부 단부들을, 즉 생산물 챔버(50)(나타나있지 않음)을 수용하는 원심분리 챔버 내에서 연결하도록 구성된다. 이러한 실시태양에서, 큰 부피의 재생 세포 조성물 및(또는) 첨가제, 용액 등이 원심분리 챔버 및또는) 생산물 챔버로 직접적으로 이송될 수 있다.

도 4 및 7-9를 살펴볼 때, 수집 챔버(20) 및 처리 챔버(30) 사이에, 펌프(34) 및 하나 이상의 밸브(14)가 제공될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 밸브(14)는 전기기계식 밸브이다. 또한, 센서, 예를 들면 압력 센서(29)가 수집 챔버(20) 및 처리 챔버(30)과 인라인으로 제공될 수 있다. 밸브, 펌프 및 센서는 시스템의 농축 단계들을 자동화하기 위하여 재사용가능한 성분(도 14) 상에 존재하는 처리 장치와 제휴하여 작용한다.

센서는 원심분리 내 재생 세포 조성물의 존재를 검출하여 시스템의 처리 장치와의 소통을 통해 원심분리 장치를 작동시킨다. 이어서 재생 세포 조성물은 원래 수집한 조직의 양 및(또는) 사용자 입력에 기초한 사전-프로그래밍된 시간 동안 사전-프로그래밍된 하중을 받는다. 특정 실시태양에서, 이러한 단계는 자동적으로 또는 사용자 입력을 통해 반복될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 대략 5 분의 기간 동안 중력의 대략 400배의 하중을 받는다. 생산물 챔버(50)은 챔버의 외부 맨가쪽이 치밀한 입자 및 세포에 대한 작은 저장조를 형성하도록 구성된다. 외부 챔버(50)은 '세포 펠릿'이라 불리는 치밀한 입자들은 보유하면서 보다 가벼운 상등액은 유체 경로, 예를 들면 회전하는 시일 네트워크(30.1)의 회전 축을 따라가고 처리 챔버(30)의 중심 내 낮은 지점으로부터 회전하는 시일 네트워크(30.1)을 통해 폐기물 용기(40)으로 이동하는 유체 경로를 통해 제거될 수 있게 한다. 밸브(14) 및 펌프(34)는 생산물 챔버(50) 내에 존재하는 세포 펠릿을 붕괴시키지 않고서 폐기물 용기(40)으로 상등액을 제거하는 단계를 작동시키도록 처리 장치에게 신호를 보낸다.

도 4에 나타낸 시스템을 사용하여 얻은 세포 펠릿은 본 발명의 농축된 재생 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상등액을 제거하여 폐기물 챔버(40)으로 보낸 후, 유체 경로(30.5)를 사용하여 원심분리 후에 형성된 세포 펠릿을 추가의 용액 및(또는) 다른 첨가제와 함께 재현탁시키는데 사용될 수 있다. 세포 펠릿의 이러한 방식의 재현탁은 원하지 않는 단백질 및 화학적 화합물을 제거하기 위한 재생 세포의 추가적 세척 뿐만 아니라 세포로의 산소 흐름의 증가를 가능하게 한다. 생성되는 현탁액은 대략 5 분의 또다른 기간 동안 중력의 대략 400배의 또다른 하중을 받을 수 있다. 제2 세포 펠릿이 형성되고 생성되는 상등액이 폐기물 챔버(40)으로 제거된 후, 상기한 방식의 최종 세척을 염수 또는 일부 다른 적절한 완충 용액으로 수행할 수 있다. 이러한 반복된 세척은 재생 세포 용액의 순도를 증대시키기 위하여 여러 회 수행될 수 있다. 특정 실시태양에서, 염수는 공정 향상에 필수적인 것으로 생각될 때 임의의 단계에서 첨가될 수 있다. 도 4에 나타낸 시스템을 사용하여 얻은 재생 세포의 농도는 수집된 조직의 양, 환자 연령, 환자 프로파일 등에 따라 변할 수 있다. 예시적인 수득율이 표 1에 제공된다.

생산물 챔버(50)에 존재하는 최종 펠릿은 이어서 생산물 챔버(50)이 세포 제거를 위해 적절한 배향으로 위치한 후에 적절한 주사기를 사용하여 무균 방식으로 수복될 수 있다. 다른 실시태양에서, 최종 펠릿은 생산물 챔버(50) 내의 용기로 자동적으로 이동될 수 있고, 이것은 필요에 따라 제거 및 보관 또는 사용될 수 있다. 이 용기는 임의의 적절한 형태 또는 크기일 수 있다. 예를 들면, 용기는 주사기일 수 있다. 특정 실시태양에서, 생산물 챔버(50) 그 자체는 이어지는 재생 세포의 수복 및 환자로의 재주사를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 치료 분야에의 사용을 위해 가열 밀봉(자동적으로 또는 수동적으로)되어 처리 챔버의 다른 성분으로부터 격리될 수 있다. 세포는 또한 생산물 챔버로부터의 수복 전에 또는 제2 시스템 또는 장치로의 전달 후에 본원에 기재된 바와 같은 추가의 공정을 거칠 수 있다. 도 14에 나타낸 재사용가능한 성분은 이것이 필요시 추가의 공정을 위한 하나 이상의 추가적인 시스템 또는 장치에 연결될 수 있도록 구성된다.

2. 장치의 세포 운반체 부분의 제조 방법

본 발명의 세포 운반체 부분은 재생 세포의 뼈 형성 기능을 유지하는데 중요하다. 구체적으로, 재생 세포가 위치하게 되는 세포 운반체는 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 세포들을 3 차원으로 유기화하는 작용을 한다. 따라서, 기질 물질을 고려할 때, 임상학적으로 허용되는 생체적합성을 나타내는 것을 선택하는 것이 절대적으로 필요하다. 또한, 세포 운반체의 기계적 특성은 환자의 정상적인 활동 동안에 붕괴되지 않도록 충분해야 한다.

각종 세포 운반체들이 당 업계에 공지되어 사용되고 있으며, 이들은 본 발명에 포함된다. 겔, 예를 들면 히드로겔 형태의 세포 운반체가 본 발명에 포함된다. 섬유 기재 운반체 또한 본 발명에 포함되며, 직물 메쉬, 편물 메쉬, 부직포 메쉬(펠트) 및 중합체 코팅된 메쉬(강도를 증가시키기 위하여)를 포함한다. 섬유 기재 세포 운반체의 제조 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 편물 메쉬 기재 세포 운반체는 문헌[H.J. Buchsbaum, W. Christopherson, S. Lifshitz, and S. Bernstein. Vicryl mesh in pelvic floor reconstruction. Arch . surg 120(12:1389-1391, 1985]에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 부직포 메쉬 기재 세포 운반체는 문헌[L.E. Freed, G. Vunjak-Novakovic, R.J. Biron, D.B. Eagles, D.C. Lesnoy, S.K. Barlow, and R. Langer. Biodegradable polymer cell carriers for tissue engineering. Biotechnology (N Y) 12 (7): 689-693, 1994]에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 중합체 코팅된 메쉬(강도를 증강시키기 위한)는 문헌[W.S. Kim, J.P. Vacanti, L. Cima, D. Mooney, J. Upton, W.C. Puelacher, and C.A. Vacanti. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg 94 (2): 233-237, 1994]에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 장치의 세포 운반체 부분은 미립자로 사전성형되게 된다. 이들 미립자의 크기 및 형태는 각각 직경이 1 ㎜ 미만으로부터 최대 10 ㎜ 범위이고, 추상적 형상의 과립으로부터 결정된 형태에 이를 수 있다. 이들 미립자는 매우 다공성(95% 초과의 공극률)이거나 또는 비다공성일 수 있다. 세포 운반체 미립자는 세포를 수용 장치의 외부 주위에 또는 중심에 포함하기 위해 사용될 수 있고, 포장 및 멸균 전에 수용 장치 내에 또는 상에 사전부하될 수 있거나 또는 수용 장치와는 별도로 포장 및 멸균될 수 있다.

스폰지 또는 발포체 기재 세포 운반체도 또한 본 발명에 포함되며, 용매-주조된-미립자 침출(SC-PL), 용융 성형된-미립자 침출(여기서, 용융 성형은 예를 들면 압축 성형, 사출 성형 EH는 압출을 포함할 수 있음), 압출-미립자 침출, 유화액-동결 건조, 미립자-침출과 병용된 동결 건조, 용액 주조, 겔 주조, 분무화 포옴, 상 분리, 미립자 침출과 병용된 상 분리, 고압 C02, 비등성 염의 기체 발포, 3D 인쇄, 융합된 침착 모델링(fused deposition modeling) 및 전기회전 나노섬유(electrospun nanofibers) 또는 다른 나노섬유를 사용하는 방법과 같은 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 세포 운반체 부분은 용매 주조/동결 건조 방법을 사용하여 제조된다.

본 발명의 스폰지 또는 포옴 기재 세포 운반체를 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 용매 주조된-미립자 침출된(SC-PL) 세포 운반체는 문헌[A.G. Mikos, A.J. Thorsen, L.A. Czerwonka, Bao Y., and R. Langer. Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams. Polymer 35 (5): 1068-1077, 1994] 및 문헌[P.X. Ma and J.W. Choi. Biodegradable polymer cell carriers with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng 7 (1): 23-33, 2001]에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. SC-용융 성형된 세포 운반체는 문헌[R.C. Thomson, M.J. Yaszemski, J.M. Powers, and A.G. Mikos. Hydroxyapatite fiber reinforced poly(alpha-hydroxy ester) foams for bone regeneration. Biomaterials 19 (21): 1935-43, 1998]에 따라 제조될 수 있다. 압출-미립자 침출 기재 세포 운반체는 문헌[M.S. Widmer, P.K. Gupta, L. Lu, R.K. Meszlenyi, G.R. Evans, K. Brandt, T. Savel, A. Gurlek, C.W. Patrick, Jr., and A.G. Mikos. Manufacture of porous biodegradable polymer conduits by an extrusion process for guided tissue regeneration. Biomaterials 19 (21): 1945-1955, 1998]에 따라 제조될 수 있다.

동결-건조(상 분리) 기재 세포 운반체는 문헌[H. Lo, Ponticiello M.S., and K.W. Leong. Fabrication of controlled release biodegradable foams by phase separation. Tissue Eng 1 (1): 15-28, 1995] 및 문헌[C. Schugens, V. Maquet, C. Grandfils, R. Jerome, and P. Teyssie. Polylactide macroporous biodegradable implants for cell transplantation. II. Preparation of polylactide foams by liquid-liquid phase separation. J Biomed Mater . Res 30 (4): 449-461, 1996]에 따라 제조될 수 있다. 미립자-침출과 병용된 동결 건조(상 분리)를 사용하여 제조된 골격은 문헌[J.H. de Groot, A.J. Nijenhuis, Bruin P., A.J. Pennings, R.P.H. Veth, J. Klompmaker, and H.W.B. Jansen. Use of porous biodegradable polymer implants in meniscus reconstruction. 1. Preparation of porous biodegradable polyurethanes for the reconstruction of meniscus lesions. Colloid Polym . Sci. 268: 1073-1081, 1990] 및 문헌[Q. Hou, D.W. Grijpma, and J. Feijen. Preparation of interconnected highly porous polymeric structures by a replication and freeze-drying process. J Biomed Mater . Res 67B (2): 732-740, 2003]에 따라 제조될 수 있다. 동결-추출 기재 세포 운반체는 문헌[M H. Ho, P.Y. Kuo, H.J. Hsieh, T.Y. Hsien, L.T. Hou, J.Y. Lai, and D. M. Wang. Preparation of porous cell carriers by using freeze-extraction and freeze-gelation methods. Biomaterials 25 (1): 129-138, 2004]에 따라 제조될 수 있다. 유화액-동결 건조 기재 세포 운반체는 문헌[K. Whang, C.H. Thomas, and K.E. Healy. A novel method to fabricate bioabsorbable cell carriers. Polymer 36 (4): 837-842, 1995]에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

겔 주조 또는 용액 주조 방법을 사용하여 제조된 골격은 문헌[J.P. Schmitz and J.O. Hollinger. A preliminary study of the osteogenic potential of a biodegradable alloplastic-osteoinductive alloimplant. Clin Orthop. (237): 245-255, 1988, A.G. Coombes and J.D. Heckman. Gel casting of resorbable polymers. 1. Processing and applications. Biomaterials 13 (4): 217-224, 1992]을 사용하여 및 U.S. 특허 No. 5,716,416(1998)에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 분무화 포옴을 사용하는 세포 운반체 제조 방법은 문헌[H. Lo, Ponticiello M.S., and K.W. Leong. Fabrication of controlled release biodegradable foams by phase separation. Tissue Eng 1 (1): 15-28, 1995]에서 찾아볼 수 있다. 발포-미립자 침출을 사용하는 방법은 문헌[Y.S. Nam, J.J. Yoon, and T.G. Park. A novel fabrication method of macroporous biodegradable polymer cell carriers using gas foaming salt as a porogen additive. J Biomed Mater. Res 53 (1): 1-7, 2000]에서 찾아볼 수 있다.

3D 인쇄(Theriform^TM 공정)는 예를 들면 문헌[R.A. Giordano, B.M. Wu, S.W. Borland, L.G. Cima, E.M. Sachs, and M.J. Cima. Mechanical properties of dense polylactic acid structures fabricated by three dimensional printing. J Biomater. Sci Poly . Ed 8 (1): 63-75, 1996] 및 문헌[S.S. Kim, H. Utsunomiya, J.A. Koski, B.M. Wu, M.J. Cima, J. Sohn, K. Mukai, L.G. Griffith, and J.P. Vacanti. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer cell carrier with an intrinsic network of channels. Ann Surg 228 (1): 8-13, 1998]에 기재되어 있다. 융합된 침착 모델링 기재 방법은 문헌[D.W. Hutmacher, T. Schantz, I. Zein, K.W. Ng, S.H. Teoh, and K.C. Tan. Mechanical properties and cell cultural response of polycaprolactone cell carriers designed and fabricated via fused deposition modeling. J Biomed Mater. Res 55 (2): 203-216, 2001]에서 찾아볼 수 있다. 전자회전 나노섬유를 사용하는 방법은 문헌[W.J. Li, C.T. Laurencin, E.J. Caterson, R.S. Tuan, and F.K. Ko. Electrospun nanofibrous structure: a novel cell carrier for tissue engineering. J Biomed Mater . Res 60 (4): 613-621, 2002]에서 찾아볼 수 있다. 포로겐(porogen) 침출과 나노섬유를 사용하는 방법은 문헌[R. Zhang and P.X. Ma. Synthetic nano-fibrillar extracellular matrices with predesigned macroporous architectures. J Biomed Mater . Res 52 (2): 430-438, 2000]에서 찾아볼 수 있다.

천연(예를 들면, 콜라겐, 엘라스틴, 폴리(아미노산); 다당류, 예를 들면 히알루론산, 글리코사민 글리칸, 카르복시메틸셀룰로스; 및 세라믹-기재 세포 운반체, 예를 들면 다공성 히드록시아파타이트, 인산삼칼슘, 및 키토산) 및 합성 물질 모두를 본 발명의 세포 운반체를 제조하는데 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 세포 운반체는 세포 운반체 내에서 조직 증식의 여지를 허용하면서 세포 운반체를 제거할 제2의 수술에 대한 필요성을 없애는 재흡수가능한 물질로 구성된다. 본 발명의 세포 운반체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 재흡수가능한 중합체는 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D-락티드)(PDLA), 폴리(D,L-락티드)(PDLLA) 및 그들의 공중합체, 뿐만 아니라 PCL, PDO 및 PTMC 및 이들의 공중합체를 포함한다. 이들 중합체는 그들의 멸균성 및 상대적 생체적합성이 잘 문서화되어 있다는 점에서 독특한 이점들을 제공한다. 또한, 이들의 재흡수 속도는 신규 조직 형성의 속도와 일치하도록 맞춰질 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 세포 운반체는 70:30 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)로 구성된다. 다른 실시태양에서, 세포 운반체는 85:15 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)로 구성된다.

특정 실시태양에서, 상기한 임의의 골격 또는 세포 운반체 부분은 모의 체액(SBF) 용액을 사용하여 인회석으로 코팅될 수 있다. SBF 용액은 인간 혈장의 대략 0-10배 이온 농도로 제조될 수 있고 .22 ㎛ PES 막 또는 유사한 막 여과기를 통해 멸균 여과될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 업계-인정된 SBF 용액 및 그의 변화형의 제조 방법은 예를 들면, 문헌[Chou et al.(2004) The Effect of Biomimetic Apatite Structure on Osteoblast Vitality, Proliferation and Gene Expression Biomaterials(In press); Oyane et al. (2003) Preparation and Assessment of Revised Simulated Body Fluids J. Biomed mater Res 65A: 188-195; Murphy et al. (1999) Growth of Continuous Bonelike Mineral Within Porous Poly(lactic-co-glycolide) Scaffolds In Vitro J. Biomed. Mater. Res. 50: 50-58]에서 발견할 수 있다. 골격 또는 세포 운반체는 습윤성 및 SBF 이온에 대한 친화성을 개선시키기 위하여 SBF 용액에 침지시키기 전에 글로 방전, 아르곤-플라즈마 에칭으로 처리할 수 있다. SBF 농도, 성분 pH 및 각 SBF 용액 중에서의 세포 운반체 또는 골격의 지속기간을 제어함으로써 상이한 인회석 미세환경이 골격 또는 세포 운반체 표면 상에 생성될 수 있다. 진공 또는 유체 흐름(지향성이거나 또는 비-지향성)을 사용하여 강제로 SBF를 골격 또는 세포 운반체 부분의 기공 내로 보낼 수 있다.

세포 운반체 부분의 바람직한 재흡수 속도는 특정 치료 용도에 기초하여 변하게 됨을 당 업계에서는 이해할 수 있을 것이다. 0.1 밀리미터 내지 약 5 밀리미터의 두께를 갖는 본 발명의 세포 운반체 부분은 뼈 형성이 달성되고 최적화될 수 있도록, 실질적으로 분해되기 전에, 약 2 주 초과 내지 수 개월, 바람직하게는 3 내지 6 개월의 기간 동안 그의 구조적 일체성을 유지해야 하는 것으로 생각된다.

세포 운반체의 재흡수 속도는 또한 선택적으로 제어될 수 있다. 예를 들면, 세포 운반체 부분은 수술 과정으로부터 환자의 회복 속도에 따라 상이한 속도로 분해되도록 제조될 수 있다. 따라서, 평균 환자에 비하여 수술 과정으로부터 보다 신속하게 회복되는 환자에게는 예를 들면 세포 운반체 부분의 중합체 물질에 대해 선택적이고 세포 운반체 부분이 보다 신속하게 분해되도록 하는 약제가 투여될 수 있다. 또는, 중합체 물질이 예를 들면 온도 감응성이거나, 또는 전하에 의해 영향을 받을 때, 장치가 이식될 수 있는 영역이 국소적으로 가열 또는 냉각되거나 또는 다른 방식으로 장치를 개별 환자에 대해 바람직한 속도로 용해시키는 전하에 노출될 수 있다.

재흡수 속도 외에, 세포 운반체의 특정 물리적 특성들도 또한 고려되어야 한다. 일반적으로, 세포 운반체는 세포 부착이 가능하도록 큰 표면적을 가져야 한다. 이러한 결과를 달성하는 한 방법은 고 다공성 중합체 포옴을 생성시키는 것일 수 있다. 이들 포옴에서, 기공 크기는 세포들이 기공으로 침투할 정도로 충분히 커야 하고, 기공들은 구성물 내의 셀 깊이에 의해 영양소 교환을 용이하게 하도록 상호연결되어야 한다. 이들 특성(다공성 및 기공 크기)은 종종 세포 운반체 제작 방법(Mikos, A.G., Bao, Y., Cima, L.G., Ingber, D.E., Vacanti, J.P. and Langer, R. (1993a). Preparation of Poly(glycolic acid) bonded fiber structures for cell attachment and transplantation. Journal of Biomedical Materials Research 27: 183-189; Mikos, A.G., Sarakinos, G., Leite, S.M., Vacanti, J.P. and Langer, R. (1993b) Mikos, A.G., Thorsen, A.J., Czerwonka, L.A., Bao, Y., Langer, R. , Winslow, D.N. and Vacanti, J.P. (1994). Preparation and characterization of poly (L-lactic acid) foams. Polymer 35: 1068-1077; Nam, Y.S. and Park, T.G. (1999a). Biodegradable polymeric microcellular foams by modified thermally induced phase separation method. Biomaterials 20: 1783-1790; Nam, Y.S. , Yoon, J.J. and Park, T.G. (2000). A novel fabrication method of macroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt as a porogen additive. Journal of Biomedical Materials Research ( Applied Biomaterials ) 53: 1-7)에 의존적이다.

뼈 형성을 위한 최적의 기공 크기는 일반적으로 40 내지 400 미크론 범위이다. 고 다공성 세포 운반체를 생성시키기 위해 섬유 결합(Mikos et al. 1993 상기함), 용매 주조/미립자 침출(Mikos et al. 1993 상기함; Mikos et al. 1994 상기함), 기체 발포(Nam et al. 2000 상기함) 및 상 분리(Lo, H., Ponticiello, M.S. and Leong, K.W. (1995). Fabrication of controlled release biodegradable foams by phase separation. Tissue Engineering 1:15-28; Whang, K. , Thomas, C.H., Healy, K.E. and Nuber, G. (1995). A novel method to fabricate bioabsorbable scaffolds. Polymer 36: 837-842; Lo, H., Kadiyala, S., Guggino, S.E. and Leong, K.W. (1996). Poly(L-lactic acid) foams with cell seeding and controlled-release capacity. Journal of Biomedical Materials Research 30: 475-484; Schugens, C., Maquet, V., Grandfils, C., Jerome, R. and Teyssie, P. (1996). Polylactide macroporous biodegradable implants for cell transplantation II. Preparation of polylactide foams for liquid-liquid phase separation. Journal of Biomedical Materials Research 30: 449-461; Nam and Park 1999 상기함)를 포함하는 몇몇 방법들이 개발되었다. 이들 방법들 중, 섬유 결합, 용매 주조/미립자 침출, 기체 발포/미립자 침출 및 액체-액체 상 분리가 세포 시딩 및 이동을 용이하게 하는 큰 상호연결된 기공을 생성한다. 섬유 결합, 용매 주조/미립자 침출 및 기체 발포/미립자 침출 방법은 임상적으로 허용가능한 생체적합성을 나타낸다.

본원에 기재된 모든 방법, 뿐만 아니라 세포 운반체 제조를 위한 업계-인정된 방법들은, 생체내 새로운 조직을 형성할 수 있는 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 유기 용매를 제거하도록 적절하게 개질되어야 한다. 본 발명의 세포 운반체를 제조하는 몇몇 방법들이 본원에서 제한이 아닌 예로서 기재된다.

예를 들면, 상기 기재한 바와 같이, 3차원 세포 운반체를 구성하는데 사용되는 한 기술은 "용융 성형"으로 알려져 있으며, 여기서는 미세 PLGA 분말 및 젤라틴 미소구의 혼합물을 테플론(Teflon).RTM. 금형 중에 부하시키고 중합체의 유리 전이 온도 이상으로 가열한다. PLGA-젤라틴 복합체를 금형으로부터 제거하고 증류된 탈이온수 중에서의 선택적 용해에 의해 젤라틴 미소구를 침출시킨다. 다른 세포 운반체 제조 기술은 중합체/세라믹 섬유 복합체 포옴 처리, 상 분리 및 고압 처리를 포함한다.

세포 운반체를 제조하기 위한 다른 기술은 "용매-주조 및 미립자-침출"로 알려져 있다. 이 기술에서는, 체질한 염 입자, 예를 들면 염화나트륨 결정을 PLLA/클로로포름 용액 중에 분산시킨 다음 이를 사용하여 막을 주조한다. 용매를 증발시킨 후, PLLA/염 복합체 막을 PLLA 용융 온도 이상을 가열한 다음 조절된 속도로 냉각시킴으로써 켄칭 또는 어닐링하여 규칙적인 결정성을 갖는 비정질 또는 반결정질 형태를 얻었다. 염 입자는 궁극적으로 선택적 용해에 의해 침출되어 다공성 중합체 매트릭스를 생성시킨다.

본 발명의 세포 운반체를 제조하기 위한 또 다른 기술은 "섬유 결합"으로 공지되어 있으며, 이것은 원하는 세포 운반체 형태의 금형을 제조하고, 섬유, 예를 들면 폴리글리콜산(PGA)를 금형 내에 넣고, PGA 섬유를 폴리(L-락트산)(PLLA)/메틸렌 클로라이드 용액에 매립시키는 것을 포함한다. 용매를 증발시키고 PLLA-PGA 복합체를 양 중합체의 용융 온도 이상으로 가열한다. 이어서 냉각후 선택적 용해에 의해 PLLA를 제거하여 임의의 표면 또는 벌크 변형없이 PGA 섬유들이 그들의 교차점에서 물리적으로 연결되어 있게 하고 그들의 초기 직경을 유지시킨다. 섬유 결합은 얇은 세포 운반체를 제작하는데 특히 유용하다.

다른 기술은 임의적으로 복합한 형태를 신속하게 및 자동적으로 제작하기 위해 공업 분야에 사용되어 온 전산-도움-설계 및 전산-도움-제조(CAD/CAM) 방법으로 언급되는 고체 유리형태 제작(SFF)일 수 있다. SFF 공정은 증가되는 물질 축적 및 횡단면 층들의 융합에 의해 형태를 구성한다. 이들 접근법에서는, 3차원(3D) CAD 모델을 먼저 자동화 공정 플래너를 통해 대표적으로 0.004 내지 0.020 인치 두께의 얇은 횡단면 층 표시들로 분해 또는 "슬라이싱"하였다. 물리적 형태를 만들기 위하여, 각 층을 이어서 선택적으로 첨가 또는 퇴적시켜 자동화 제작 기계에서 이전 층에 융합시킨다. 이들 및 다른 세포 운반체 제조 기술은 그의 전체 내용을 본원에서 참고문헌으로 인용하는 U.S. 특허 No. 6,143,293에서 논의된다.

본 발명의 다른 면에 따라, 세포 운반체 부분은 세포 조절용 물질, 예를 들면 세포-이동에 영향을 미치기 위한 화학주성 물질, 세포-이동에 영향을 주기 위한 억제 물질, 세포 증식에 영향을 미치기 위한 분열촉진 증식 인자, 세포 분화에 영향을 미치기 위한 증식 인자, 및 혈관생성(새로운 혈관의 형성)을 촉진하는 인자를 포함한다. 세포 조절 물질은 세포 운반체 상의 하나 이상의 소정의 위치에 위치할 수 있다. 예를 들면, 세포 성장 및(또는) 분화를 일반적으로 억제하거나 또는 다른 방식으로 감소시키는 물질이 세포 운반체의 한 표면(예를 들면, 의도하는 뼈 형성 영역 내의 뼈 성장이 바람직하지 않은 영역에 근접하게 되는 표면) 상에 위치할 수 있다. 유사하게, 세포 성장 및(또는) 분화를 일반적으로 촉진하거나 또는 다른 방식으로 향상시키는 물질은 세포 운반체의 한 표면(예를 들면 의도하는 뼈 형성 영역에 근접하게 되는 표면) 상에 위치할 수 있다. 추가로, 억제 및 촉진 물질은 장치의 표면 상에서 상이한 영역에서 세포 성장 속도에 영향을 미치는 소정의 위치에서 세포 운반체 전체에 걸쳐 분산되어 있을 수 있다.

바람직하게는, 장치의 적절한 세포 운반체 부분은 포장 및 멸균 전에 제조업자에 의해(예를 들면, 마크로포어 바이오서저리, 인크.에 의해) 세포 운반체 수용 부분의 형태와 일치하는 특정 형태, 구성 및 크기로 사전성형되게 된다. 그러나, 사전-성형된 세포 운반체 부분은 또한 수술 시에, 물질을 가열 아이론, 열기, 가열된 스폰지 또는 온수욕 방법을 사용하여 그의 유리 전이 온도로 함으로써 성형될 수 있다. 특정 실시태양에서, 세포 운반체는 수용 부분 내로 절단 및 기계식으로 압착-핏팅되어 얻어지는 간섭 핏에 의해 제 자리에 유지될 수 있다. 다른 실시태양에서, 수용 부분은 유리 전이 온도로 가열되어 소정의 및 사전성형된 기하형태로 되돌아가서 세포 운반체의 클램핑을 야기하고 멸균을 야기할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 세포 운반체는 상기 수용 부분 내의 하나 이상의 개구를 통해 삽입된 하나 이상의 적절한 크기를 갖는 짝을 이루는 재흡수가능한 또는 재흡수가능하지 않은 나사, 압정 또는 핀에 의해 수용 부분에 부착될 수 있다. 재흡수가능한 나사, 택 또는 핀은 마크로포어 바이오서저리, 인크.(미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 얻을 수 있다. 다르게는, 일단 의도한 뼈 형성 영역 내에 삽입되면, 그 영역으로의 물의 유입이 세포 운반체를 팽창시키고 세포 수용 부분을 수축시키거나 또는 세포 운반체를 수축시키고 수용 부분을 팽창시켜, 고정을 초래한다. 세포 운반체 및 수용 부분은 또한 중합체 용액, 용매 또는 적절한 글루를 사용하여 서로에 부착될 수 있다.

i. 장치의 다공성 세포 운반체 부분의 예시 실시태양

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장치의 다공성 세포 운반체 부분(210)은 상부 면(211), 하부 면(212), 측면(213), 정면 단부(214) 및 후면 단부(215) 및 다수개 상호연결된 기공들(216)을 갖는 포물선 형태이다.

3. 장치의 세포 운반체 부분으로의 재생 세포 첨가 방법

세포 운반체는 의도한 뼈 형성 영역에서 뼈 형성을 최적화하기 위하여 wotd세포로 적절하게 시딩되어야 한다. 세포 운반체의 기능은 의도된 뼈 형성 부위에서의 최적의 세포 매개 뼈 형성과 양립될 수 있는 방식으로 세포를 전달하는 것이다. 운반체는 세포가 시딩되는 섬유 또는 스폰지 미세구조를 갖는 고상 재흡수가능한 또는 재흡수가능하지 않는 중합체 기재 골격, 또는 세포가 그 안에 봉입되는 히드로겔, 예를 들면 피브린, 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 운반체는 세포 부착, 예를 들면 RGD, 세포 분화, 예를 들면 CBFA-l유전자, 석회화, 예를 들면 인 기를 지지하기 위하여 화학물질, 펩티드, 단백질 또는 유전자로 변형될 수 있다. 세포는 치료 부위에서 주사에 의해 또는 다른 적절한 방법에 의해 생체내 시딩되거나 또는 생체외 시딩될 수 있다.

본 발명에 포함되는 고체 기재 골격에 대한 생체외 시딩 방법은 업계-인정된 방법, 예를 들면 정적 시딩(또는 모세관 작용), 주사, 동적 시딩, 예를 들면 단일- 및 이중 방향 관류, 스피너 플라스크, 궤도 또는 무작위 진탕기, 회전 또는 엔드-오버-엔드(end-over-end) 생체반응기 시딩, 및 진공 보조 시딩, 이 방법들의 혼합을 포함한다. 본 발명에 포함되는 천연 또는 합성 겔 기재 운반체에 대한 시딩 방법은 세포와 겔 기재 운반체의 액체 성분과의 혼합 및 물리적 상호반응 가교결합(예를 들면, 수소, 반 데르 바알스력, 극성력, 이온 결합) 또는 공유 가교결합에 의한 겔 형성과 같은 업계-인정된 방법을 포함한다. 겔 기재 운반체를 사용한 시딩은 생체내로 또는 생체외로 달성될 수 있다. 세포 운반체 부분이 특정 형태를 갖는 것일 경우, 시딩 방법은 상기한 바와 같을 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들면, 세포는 세포 운반체 부분과 단순히 혼합되어 세포/미립자 혼합물을 의도하는 뼈 형성 영역, 예를 들면 수용 장치의 중앙에 및(또는) 수용 장치 주위에 설치, 가압 핏팅 또는 주사할 수 있다.

운반체 내로 혼입되어야 하는 세포는 세포의 운반체에 대한 접착 능력 또는 세포의 뼈 형성능을 자극할 수 있는 능력을 촉진할 수 있는 임의의 물질과 함께 미리 인큐베이션 또는 배양될 수 있고, 후자의 예로는 뼈 성장 촉진 단백질 또는 유전자(예를 들면, BMPs) 또는 다른 뼈 성장 조절 분자(예를 들면, CBFA-1)가 있다. 생체외 접근법에서, 세포 부하된 세포 운반체를 이어서 본 발명의 세포 운반체 수용 부분과 함께 의도하는 뼈 형성 영역 내에 위치시켜 뼈 형성을 유도한다. 일단 이식되면, 숙주 세포 유입 및 ADC 증식, 분화, 풋뼈(osteoid) 침착, 무기화, 및 재흡수가능한 골격의 경우, 수반되는 골격의 재흡수가 진행된다.

이들 및 다른 세포 운반체 시딩 방법은 예를 들면 문헌[S.L. Ishaug, G.M. Crane, M.J. Miller, A.W. Yasko, M.J. Yaszemski, 및 A.G. Mikos. Bone formation by three-dimensional stromal osteoblast culture in biodegradable polymer scaffolds. J Biomed Mater Res 36 (1): 17-28, 1997; H.L. Wald, G. Sarakinos, M.D. Lyman, A.G. Mikos, J.P. Vacanti, and R. Langer. Cell seeding in porous transplantation devices. Biomaterials 14 (4): 270-278, 1993 ; N.S. Dunkelman, M.P. Zimber, R.G. LeBaron, R. Pavelec, M. Kwan, and A.F. Purchio. Cartilage production by rabbit articular chondrocytes onpolyglycolic acid scaffolds in a closed bioreactor system. Biotechnol Bioeng 46: 299-305, 1995 ; L.E. Freed, A.P. Hollander, I. Martin, J.R. Barry, R. Langer, and G. Vunjak-Novakovic. Chondrogenesis in a cell-polymer-bioreactor system. Exp Cell Res 240 (1): 58-65, 1998 ; R.E. Schreiber, N.S. Dunkelman, G. Naughton, and A. Ratcliffe. A method for tissue engineering of cartilage by cell seeding on bioresorbable scaffolds. Ann N Y Acad Sci 875: 398-404, 1999 ; G. VunjakNovakovic, et al (1999) van Wachem PB, tronck JW, oers-Zuideveld R, ijk F, and ildevuur CR. Vacuum cell seeding: a new method for the fast application of an evenly distributed cell layer on porous vascular grafts. Biomaterials 11 (8): 602-606, 1990 ; L.E. Freed, J.C. Marquis, G. Vunjak-Novakovic, J. Emmanual, and R. Langer. Composition of cell-polymer cartilage implants. Biotechnol . Bioeng 43: 605-614, 1994; J.L. van Susante, P. Buma, G.J. van Osch, D. Versleyen, P.M. van der Kraan, W.B. van der Berg, and G.N. Homrninga. Culture of chondrocytes in alginate and collagen carrier gels. Acta Orthop Scand 66 (6): 549-56, 1995 ; J. Elisseeff, W. McIntosh, K. Anseth, S. Riley, P. Ragan, and R. Langer. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. J. Biomed . Mater . Res. 51: 164-171,2000]에 개시되어 있다.

일단 세포 운반체 상에 시딩되면, 장치는 이식편수령자 내 의도된 뼈 형성 영역 내로 삽입될 수 있다. 다르게는, 장치(세포 운반체 부분 및 수용 부분)를 이식편수령자 내 의도된 뼈 형성 영역 내로 삽입한 후 세포를 세포 운반체 상에 시딩할 수 있다. 일잔 장치가 삽입되면, 생체내 세포 증식 및 재흡수가능한 세포 운반체의 경우 수반되는 세포 운반체의 재흡수가 진행된다.

본 발명의 다른 면에 따라, 세포 운반체 부분은 세포 시딩을 용이하게 하는 물질(예를 들면, 화학적 또는 생물학적 분자), 예를 들면 접착성 펩티드, 또는 세포 부착을 향상시키는 다른 생물학적 분자, 세포 운반체의 소수성을 변경시키는 물질, 세포 부착을 증가시키거나 또는 세포 운반체 내로의 유체 흡수를 증가시키는 표면 전하, 극성 분자, 또는 계면활성제 또는 습윤제를 추가로 포함할 수 있다. 세포 시딩을 용이하게 하는데 사용되는 물질은 세포 운반체 기공의 표면, 세포 운반체의 외부 영역에 위치하거나 소정의 위치에 세포 운반체 물질의 벌크 중에 분산되거나 또는 이들의 조합일 수 있다.

i. 재생 세포가 시딩된 세포 운반체의 예시 실시태양

도 17에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장치의 다공성 세포 운반체 부분(210)은 상부 면(211), 하부 면(212), 측면(213), 정면 단부(214) 및 후면 단부(215), 줄기 세포 및 기원 세포와 같은 재생 세포(217)가 시딩된 다수개의 상호연결된 기공(216)을 갖는 포물선 슬리브 형태이다.

4. 장치의 세포 운반체 수용 부분의 제조 방법

넓은 실시태양에서, 장치의 세포 운반체 수용 부분("수용 부분")은 본원에서 기재된 방법에 따라 사용될 때 뼈 형성을 지배하는데 효과적인 임의의 물질로부터 구성될 수 있다. 바람직하게는, 수용 부분은 재흡수가능하다. 예를 들면, 수용 부분은 임의의 생분해가능한 물질, 예를 들면 재흡수성 중합체로부터 구성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 수용 부분은 중요한 항원성 또는 면역원성 생물학적 반응을 유발하지 않는 물질로 구성된다.

한 실시태양에 따라, 본 발명의 수용 부분을 형성하는데 사용될 수 있는 비-제한적인 중합체는 락티드(L, D, DL, 또는 이들의 조합물), 글리콜리드, 트리메틸렌 카보네이트, 카프롤락톤의 중합체(예를 들면, 공중합체) 및(또는) 이들의 물리적 및 화학적 조합물을 포함한다. 한 실시태양에서, 수용 부분은 L-락티드 및 D,L-락티드의 공중합체일 수 있는 폴리락티드를 포함한다. 예를 들면, 공중합체는 약 60-80%의 L-락티드 및 약 20-40%의 D,L-락티드를 포함할 수 있고, 바람직한 실시태양에서, 공중합체는 70:30 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)를 포함한다.

한 실시태양에서, 수용 부분은 하나 이상의 환식 에스테르, 예를 들면 락티드(즉, L, D, DL, 또는 이들의 조합물), 엡실론-카프롤락톤 및 글리콜리드로부터 유도된 중합체(예를 들면, 단일 및(또는) 공중합체)에 의해 형성된다. 예를 들면, 한 실시태양에서, 수용 부분은 약 1 내지 99% 엡실론-카프롤락톤을 포함할 수 있고, 다른 실시태양에서는 20 내지 40% 엡실론-카프롤락톤을 포함할 수 있다. 한 예에서, 막은 65:35 폴리(L-락티드-코-엡실론-카프롤락톤)을 포함한다. 다른 실시태양에서, 부티롤락톤, 발레로락톤 또는 디메틸 프로피올락톤을 엡실론-카프롤락톤과 함께 또는 이의 대체물로서 사용할 수 있다. 다른 실시태양에서, 수용 부분은 상기한 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)보다 신속하게 신체로 재흡수되는 락티드 및 글리콜리드를 포함하는 공중합체를 포함할 수 있다.

본 발명의 중합체(예를 들면, 공중합체)는 비교적 단순한 화학 반응 및 배합을 요구한다. 본 발명의 수용 부분은 바람직하게는 매끈하고 실질적으로 비다공성이다. 바람직하게는, 수용 부분은 포장 및 멸균 전에 제조업자(예를 들면, 마크로포어 바이오서지, 인크.)에 의해 특정 형태, 배위 및 크기로 성형될 수 있다. 그러나, 사전-성형된 수용 부분은 또한 수술 시에, 물질을 가열 아이론, 열기, 가열된 스폰지 또는 온수욕 방법을 사용하여 그의 유리 전이 온도로 함으로써 성형될 수 있다.

수용 부분은 약 0.1 밀리미터 내지 약 5 밀리미터의 두께를 가질 수 있다. 바람직하게는, 수용 부분은 약 2 밀리미터 내지 약 4 밀리미터의 두께를 가질 수 있다. 수용 부분의 물질은 뼈의 만곡과 일치하도록 충분히 가용성일 수 있고, 장치가 표적 영역에 부착될 때 주변 움직임이 내부 공간으로 전달되는 것을 제한하고 뼈 결함의 거대-움직임을 감소시키기 충분하게 강성일 수 있다. 수용 부분은 뼈 형성 동안 인접하는 연질 조직의 표적 영역 내로의 탈출증으로부터 표적 영역을 보호하도록 적용되고, 추가로 원하는 새로운 뼈 형성이 발생된 후 장치의 삽입과 관련된 응력 차폐로 인한 뼈의 재흡수를 막도록 적용된다.

수용 부분은 뼈 성장을 효과적으로 촉진할 수 있는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 한 실시태양에서, 수용 부분은 포물선 형태로 제공될 수 있다. 다른 실시태양에서, 수용 부분은 직사각형 형태로 제공될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 수용 부분은 사다리꼴 형태로 제공될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 수용 부분은 원통형 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 수용 부분은 해부학적 구조 주위에 일치하도록 충분히 가요성일 수 있다.

한 실시태양에서, 수용 부분은 2개의 대향 표면을 포함한다. 수용 부분의 한 면에는, 뼈가 성장하는 실질적으로 매끈한 면 또는 표면이 있고, 다른 면에는 뼈가 성장하지 않는 실질적으로 매끈한 면 또는 표면이 있다. 바람직하게는, 뼈가 성장하는 실질적으로 매끈한 면이 의도하는 뼈 형성 영역을 향하도록 위치하고, 뼈가 성장하지 않는 실질적으로 매끈한 면은 뼈 형성이 바람직하지 않는 영역을 향하도록 위치한다.

본원에서 사용된 용어 "비-다공성"은 일반적으로 물이 새지 않는 물질이고, 바람직한 실시태양에서 따르면 유체 투과성이 아닌 물질을 말한다. 그러나, 본 발명의 변형된 실시태양에서는, 예를 들면 조직의 흉터형성을 야기하도록 수용 부분의 표면의 매끈함을 실질적으로 붕괴하지 않을 정도로 본 발명의 수용 부분에 미세-기공(즉, 유체 투과서이지만, 세포 투과성은 아님)이 존재할 수 있다. 제한된 적용을 위한 상당히 변형된 실시태양에서는, 세포 투과성이지만 혈관 투과성이지 않는 기공이 제조되어 사용될 수 있다. 현재 바람직한 것으로, 수용 부분은 실질적으로 비-다공성 수용 부분을 수득하기 위하여 사출 성형 과정을 사용하여 제조된다. 수용 부분은 또한 압출 또는 압축 성형 과정을 사용하여 제조될 수도 있다. 수용 부분은 반-경질 구성을 가질 수 있으며, 약 55℃로 가열될 때 완전히 체형에 맞게 제작가능하다.

따라서, 특정 실시태양에서, 수용 부분의 실질적으로 매끈한 표면은 직경 20 미크론 내지 3000 미크론 범위의 직경을 갖는 다수개의 개구를 포함할 수 있다. 개구는 이를 통해 혈관 및 연결 조직 세포들의 증식을 가능하게 하면서 인접하는 연질 조직의 생물학적 조직 결함 내로의 탈출은 막도록 적용된다. 또한, 개구는 주변 조직, 근육조직 및 골막으로부터 표적 영역으로의 혈관의 중요한 보급을 가능하게 한다. 장치를 통해 표적 영역으로 침입하는 혈관은 새로운 뼈의 생성을 크게 향상시킬 수 있다. 모세관이 주변 조직으로부터 장치를 통해 증식할 수 있는 능력은 뼈 상(床) 및 골막으로부터 이동하는 세포가 그들의 증식 혈관 공급을 능가하지 못하게 하는 것을 도울 수 있다. 이러한 혈관의 증식은 주어진 표적 영역 내에서의 뼈 형성의 잠재성을 증가시킬 수 있다.

수용 부분의 표면은 1 내지 5 밀리미터 범위의 직경을 갖는 보다 큰 다수개의 개구를 추가로 포함할 수 있다. 수용 부분 내 이러한 보다 큰 개구는 의도하는 뼈 형성 영역 내에 장치를 고정하기 위한 삽입 및(또는) 고정 장치의 삽입을 용이하게 하도록 전략적으로 놓여진다. 개구는 또한 지연 유합 또는 불유합의 경우에 개구를 통해 추가적인 재생 세포를 주사하는 후속 수술 과정을 위해 전략적으로 놓여질 수 있다. 수용 부분 상의 보다 큰 개구의 크기는 표적 영역 내에 장치를 고정하는데 사용된 삽입 공구 및(또는) 고정 장치의 유형에 따라 변할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 업계-인정된 장치 삽입용 공구 외에, 장치는 클램프, 스테이플, 나사, 봉합, 압정, 핀 및 다른 종래 수단을 사용하여 표적 영역 내에 마찰적으로 고정될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 고정 장치, 예를 들면 마크로포어 바이오서지, 인크.에 의해 제조된 것은 재흡수가능하다. 다른 실시태양에서, 삽입 장치 또는 고정 장치의 조합이 사용될 수 있다.

바람직한 재흡수 속도는 특정 치료 용도에 기초하여 변하게 됨을 당 업계에서는 이해할 수 있을 것이다. 1 밀리미터 내지 약 5 밀리미터, 바람직하게는 2-4 밀리미터의 두께를 갖는 본 발명의 수용 부분은 뼈 형성이 달성되고 최적화될 수 있도록, 실질적으로 분해되기 전에, 약 1 개월 초과, 바람직하게는 3 개월 초과, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 6 개월의 기간 동안 그의 구조적 일체성을 유지해야 하는 것으로 생각된다. 상기 기재된 장치의 세포 운반체 부분의 재흡수 속도와 유사하게, 장치의 세포 운반체 수용 부분의 재흡수 속도도 또한 선택적으로 제어될 수 있다.

본 발명의 모든 측면들의 제조 및 사용에 관련된 예시적인 물질 및 방법은 예를 들면 모두 그의 내용이 본원에서 참고문헌으로 인용되어 있는, U.S. 특허 No. 5,919,234, 6,280,473, 6,269,716, 6,343,531, 6,477,923, 6,391,059, 6,531,146 and 6,673,362에 개시되어 있다. 본 발명의 장치의 재흡수가능한 수용 부분은 마크로포어 바이오서지, 인크.(미국 캘리포니아주, 샌 디에고)로부터 입수가능하다.

i. 장치의 세포 운반체 수용 부분의 예시 실시태양

도 18에 나타낸 바와 같이, 한 실시태양에서, 본 발명의 장치의 세포 운반체 수용 부분은 상부 면(219), 하부 면(220), 측면(221), 정면 단부(222) 및 후면 단부(223)를 갖는 포물선 형태(218)이다. 상부 및 하부 면(219 및 220)의 표면은 각각 표적 영역 내 주변 뼈로 장치의 수용 부분을 정착시키는 것을 돕기 위한 능선(224)을 갖는다. 능선들(224) 사이의 오목부는 평면 내 장치의 수용 부분의 정착에 도움을 주게 되는 기계적 안정성을 증대시킬 수 있다. 세포 운반체 수용 부분(218)은 장치를 제 자리에 나사고정하는데 사용될 수 있는, 적절한 직경의 개구(225)를 포함할 수 있다. 개구(225)는 또한 장치를 표적 영역 내에 삽입하기 위한 업계-인정된 공구를 삽입하는데 사용될 수 있다. 세포 운반체 수용 부분은 본 발명의 세포 운반체 부분의 삽입을 위한 큰 중앙 홀(226)을 갖는다. 도 19는 포물선 형태의 다공성 세포 운반체가 포물선 형태의 수용 부분 내로 삽입되어 있는 본 발명의 한 실시태양을 묘사한다. 도 20은 본 발명의 재생 세포가 시딩된 포물선 형태의 다공성 세포 운반체가 포물선 형태의 수용 부분 내로 삽입되어 있는 본 발명의 한 실시태양을 묘사한다. 도 20은 업계-인정된 수술용 기술을 사용하는 이식편수령자 내로의 삽입에 적합한 세포 및 장치의 한 실시태양을 묘사한다.

도 21에 나타낸 바와 같이, 한 실시태양에서, 본 발명의 장치의 세포 운반체 수용 부분은 상부 면(228), 하부 면(229), 측면(230), 정면 단부(231) 및 후면 단부(232)를 갖는 사다리꼴 형태(227)이다. 상부 및 하부 면(228 및 229)의 표면은 각각 표적 영역 내 주변 뼈로 장치의 수용 부분을 정착시키는 것을 돕기 위한 능선(233)을 갖는다. 능선들(233) 사이의 오목부는 평면 내 장치의 수용 부분의 정착에 도움을 주게 되는 기계적 안정성을 증대시킬 수 있다. 세포 운반체 수용 부분(227)은 장치를 제 자리에 나사고정하는데 사용될 수 있는, 적절한 직경의 개구(234)를 포함할 수 있다. 개구(234)는 또한 장치를 표적 영역 내에 삽입하기 위한 업계-인정된 공구를 삽입하는데 사용될 수 있다. 세포 운반체 수용 부분은 본 발명의 세포 운반체 부분의 삽입을 위한 큰 중앙 홀(235)을 갖는다.

도 22에 나타낸 바와 같이, 한 실시태양에서, 본 발명의 장치의 세포 운반체 수용 부분은 상부 면(237), 하부 면(238), 측면(239), 정면 단부(240) 및 후면 단부(241)을 갖는 원통형 형태(236)이다. 상부 및 하부 면(237 및 238)의 표면은 각각 표적 영역 내 주변 뼈로 장치의 수용 부분을 정착시키는 것을 돕기 위한 능선(242)을 갖는다. 능선들(242) 사이의 오목부는 평면 내 장치의 수용 부분의 정착에 도움을 주게 되는 기계적 안정성을 증대시킬 수 있다. 세포 운반체 수용 부분(236)은 장치를 제 자리에 나사고정하는데 사용될 수 있는, 적절한 직경의 개구(243)를 포함할 수 있다. 개구(243)은 또한 장치를 표적 영역 내에 삽입하기 위한 업계-인정된 공구를 삽입하는데 사용될 수 있다. 세포 운반체 수용 부분은 본 발명의 세포 운반체 부분의 삽입을 위한 큰 중앙 홀(244)을 갖는다.

도 23에 나타낸 바와 같이, 한 실시태양에서, 본 발명의 장치의 세포 운반체 수용 부분은 상부 면(246), 하부 면(247), 측면(248), 정면 단부(249) 및 후면 단부(250)을 갖는 직사각형 형태(245)이다. 상부 및 하부 면(246 및 247)의 표면은 각각 표적 영역 내 주변 뼈로 장치의 수용 부분을 정착시키는 것을 돕기 위한 능선(251)을 갖는다. 능선들(251) 사이의 오목부는 평면 내 장치의 수용 부분의 정착에 도움을 주게 되는 기계적 안정성을 증대시킬 수 있다. 세포 운반체 수용 부분(245)은 장치를 제 자리에 나사고정하는데 사용될 수 있는, 적절한 직경의 개구(252)를 포함할 수 있다. 개구(252)은 또한 장치를 표적 영역 내에 삽입하기 위한 업계-인정된 공구를 삽입하는데 사용될 수 있다. 세포 운반체 수용 부분은 본 발명의 세포 운반체 부분의 삽입을 위한 큰 중앙 홀(253)을 갖는다.

5. 뼈 및(또는) 연골 형성을 위한 장치의 사용 방법

본원에 예시되는 바와 같이, 본 발명의 지방 유래 재생 세포는 뼈 또는 연골 전구 세포의 풍부한 공급원이고, 이들은 생체내에서 뼈 및 연골을 형성하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 장치를 사용하여, 예를 들면 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진함으로써 뼈 관련 질환을 치료할 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 면에서는, 재생 세포를 제공자의 지방 조직으로부터 추출하고, 재흡수성 세포 운반체 수용 부분에 의해 둘러싸여진 다공성 세포 운반체 에 첨가하고, 세포 및 장치의 조합물을 이식편수령자 내 의도하는 뼈 형성 영역에 삽입하고 이에 의해 뼈 및(또는) 연골 형성을 촉진함으로써 치료적 이익을 이끌어낸다. 바람직한 실시태양에서, 세포는 이식을 받아야 하는 사람의 지방 조직으로부터 추출되고, 이에 의해 이식에 대한 항원성 및(또는) 면역원성 반응과 관련된 잠재적인 합병증을 감소시킨다. 환자는 대표적으로 의사 또는 다른 임상학적 제공자에 의해 수행되는 하기 과정들 주 하나 이상에 의해 뼈 관련 질환을 평가 분석받는다: 환자의 건강력, 물리적 관찰, 및 방사선사진을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 객관적 데이터.

한 실시태양에서, 뼈 관련 질환의 치료, 예를 들면 척추 유합술 수술과 관련하여 혈액 응고를 감소시키도록 디자인된 임의의 제품을 환자가 제공받기 전에 수확 과정을 수행한다. 그러나, 특정 실시태양에서는, 환자가 수확 과정 전에 응고에 영향을 주는 것으로 알려진 약물(예를 들면, 아스피린)을 제공받을 수 있다. 또한, 한 바람직한 방법은 시도되는 임의의 척추 유합 과정 전에 지방 조직의 수집을 포함한다. 그러나, 당 업계의 통상의 숙련인이 이해하는 바와 같이, 수집 시기는 무엇보다도 특히, 환자의 안정성, 환자의 응고 프로파일, 제공자 이용가능성 및 품질 보호 기준을 포함하는 몇몇 인자들에 따라 변하는 것으로 예측된다. 궁극적으로, 수집 시기는 병에 걸린 환자에 대한 조치를 행할 책임을 갖는 전문의에 의해 결정될 것이다.

환자로부터 수집된 지방 조직의 부피는 약 1 cc 내지 약 2000 cc, 및 일부 실시태양에서는 최대 3000 cc로 변할 수 있다. 제거된 지방 부피는 환자에 따라 다를 것이고, 연령, 신체 습관, 응고 프로파일, 혈류역학 안정성, 중복이환율 및 의사 기호를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 수많은 인자에 의존할 것이다.

세포는 미리 추출되어 냉동보존 방식으로 저장되거나 또는 필요한 정해진 시간에 또는 그 즈음에 추출될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 세포는 세포를 추가로 정제, 변형, 자극 또는 다른 방식으로 변화시키는 추가의 처리 또는 하기하는 추가적인 과정 없이, 환자에 투여되거나, 또는 손상된 조직에 또는 손상된 조직 부근에 직접 가해질 수 있다. 예를 들면, 환자로부터 얻은 세포는 이들을 환자에 투여하기 전에 세포를 배양하지 않고서 재흡수성 세포 운반체 및 재흡수성 세포 운반체 수용 부분을 통해 필요로 하는 환자에 투여될 수 있다. 한 실시태양에서, 지방 조직의 수집은 환자의 침상 곁에서 수행하게 된다. 혈류역학 모니터링을 사용하여 환자의 임상적 상태를 모니터할 수 있다.

본원에 개시된 본 발명에 따라, 재생 세포는 환자로부터 지방 조직을 수확한 후 금방 환자에 전달될 수 있다. 예를 들면, 세포는 지방 조직의 처리 및 재생 세포 조성물의 수득 후 즉시 장치를 통해 투여될 수 있다. 궁극적으로, 전달 시기는 지방 조직을 처리하는데 필요한 처리 시간 및 환자 이용가능성에 의존할 것이다. 다른 실시태양에서, 전달 시기는 환자에 주입되어야 하는 세포가 본원에서 논의되는 바와 같이 추가적인 변형, 정제, 자극 또는 다른 조작을 받는 경우 비교적 더 길 수 있다. 환자에 투여되는 세포의 수는 예를 들면, 지방 조직 처리 후의 세포 수득율에 관계있을 수 있다. 세포의 총 수의 일부분이 나중 사용을 위해 보유되거나 또는 냉동보존될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, 환자에 전달되어야 하는 세포, 예를 들면 정제되지 않은 세포의 수는 약 5.5 x 10⁴ 세포인 것으로 예측된다. 그러나, 이 수는 원하는 치료 효과를 달성하기 위한 크기 만큼 조절될 수 있다.

지방 조직으로부터 산해 후 얻은 세포는 연골기원세포, 골전구 세포 또는 모든 세포를 포획하지만 이들 세포들 중 하나만을 포획하는 장치 내의 또는 장치와는 별도의 생물학적 기재 성분 위를 통과시킴으로써 뼈 또는 연골 기원 세포를 추가로 풍부하게 할 수 있다. 전자의 경우, 장치 내에 또는 외부에 포함된 추가적인 단계들을 사용하여 생물학적 기재 성분으로부터 포획된 세포를 방출시킨다. 이러한 연골기원세포 또는 골전구체 농축의 한 예는 연골기원세포 또는 골전구 세포(예를 들면, SH3 세포)를 인식하는 항체가 부착된 크로마토그래피 수지이다. 방출제의 한 예는 수지로부터 항체/세포 착체를 절단해낼 수 있는 파파인 또는 펩신이다.

세포는 또한 의도하는 치료 효과를 증대, 제어 또는 다른 방식으로 지시하는 첨가제와 함께 인가될 수 있다. 세포는 세포에 의해 제공되는 치료 반응(들)을 촉진하는 것으로 생각되거나 또는 촉진하도록 의도되는 유전자 생성물을 발현하도록 유전자 조작 후에 투여될 수 있다. 조작의 예는 뼈 또는 연골 형성을 촉진하는 인자의 발현, 연골 또는 뼈 세포 성장 및 증식을 자극하거나 특정 연골 또는 뼈 세포 계통으로의 분화를 촉진하는 개발 유전자의 발현을 제어(증가 또는 감소)하기 위한 조작을 포함한다.

활성 세포 집단은 단독으로 또는 다른 세포, 조직, 조직 단편, 증식 인자(예를 들면, BMP), 또는 그 집단의 전달, 효능, 내성 또는 기능을 증대시키고자 의도된 다른 첨가제와 함께 본 장치의 재흡수성 세포 운반체에 인가될 수 있다. 세포 집단은 또한 재생 세포 집단은 또한 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내 DNA의 삽입에 의해 또는, 구조적 또는 치료적 목적을 유도하기 위하여 세포의 기능을 변화, 향상 또는 보충하는 방식으로 세포 배양물 내에 위치시킴으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포를 위한 유전자 전달 기술은 문헌[Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000)]에 개시된 바와 같이 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있고, 문헌[Walther and Stein, 2000] 및 문헌[Athanasopoulos et al., 2000)]에 개시된 바와 같이 바이러스 트랜스펙션 기술, 및 보다 구체적으로는 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 기술을 포함할 수 있다. 비-바이러스 기재 기술도 또한 문헌[Muramatsu et al., 1998]에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다.

다른 면에서, 세포는 연골 또는 뼈 형성 동안에 세포가 그들 자신의 증식 인자 공급원으로 작용하도록 하는 프로-연골기원 또는 프로-뼈형성 증식 인자(들)을 코딩하는 유전자와 조합될 수 있다. 항-아폽토시스 인자 또는 약제를 코딩하는 유전자도 또한 가해질 수 있다. 유전자(또는 유전자들의 조합물)의 첨가는 아데노바이러스 형질도입, "유전자 건", 리포좀-매개 형질도입, 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질도입, 플라스미드, 아데노-관련 바이러스를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 당 업계에 공지된 임의의 기술에 의할 수 있다. 세포는 형질도입이 현장에서 계속되거나 또는 개시될 수 있도록 시간이 지남에 따라 유전자를 세포로 방출 및(또는) 제공할 수 있는 유전자 전달 비히클을 갖는 운반체 물질과 함께 이식될 수 있다. 특히 세포 및(또는) 세포를 함유하는 조직이 세포 및(또는) 조직을 얻은 환자 이외의 환자에 투여될 때, 이식 거부반응을 감소시키고, 및 바람직하게는 막기 위하여 하나 이상의 면역억제제가 세포 및(또는) 조직을 수령하는 환자에 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "면역억제 약물 또는 약제"는 정상적인 면역 기능을 억제하거나 또는 방해하는 제약학적 약제를 포함하기 위한 것이다. 본원에 개시된 방법과 함께 적합한 면역억제제의 예는 U.S. 특허 공개 No. 20020182211에 개시된 바와 같이, T-세포/B-세포 코스티뮬레이션(costimulation) 경로를 억제하는 약제, 예를 들면 CTLA4 및 B7 경로를 통한 T-세포 및 B-세포의 커플링을 방해하는 약제를 포함한다. 바람직한 면역억제제는 시클로스포린 A이다. 다른 예는 마이오페닐레이트 모페틸, 라파미신, 및 항-가슴샘세포 글로불린을 포함한다. 한 실시태양에서, 면역억제 약물은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다. 면역억제 약물은 투여 경로에 적합한 제제로 투여되고, 바람직한 치료 효과를 달성하기에 충분한 투여형으로 대상에 투여된다. 다른 실시태양에서, 면역억제 약물은 본 발명의 ADC에 대한 내성을 유도하기에 충분한 시간 동안 일시적으로 투여된다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 세포는 하나 이상의 세포 분화제, 예를 들면 증식 인자 및 시토킨과 함께 환자에 투여될 수 있다. 각종 세포 분화제의 예는 문헌[Gimble et al., 1995; Lennon et al., 1995; Majumdar et al., 1998; Caplan and Goldberg, 1999; Ohgushi and Caplan, 1999; Pittenger et al., 1999; Caplan and Bruder, 2001; Fukuda, 2001; Worster et al., 2001; Zuk et al., 2001]에 개시되어 있다.

i. 추간판 수복 또는 양수체 척추 유합 과정을 위한 장치의 사용 방법

본원에서 기재된 바와 같이, 배통은 특히 나이 든 사람들 사이에서 중요한 공중 보건 문제로 남아있다. 이 통증은 척추의 추간판 비정상과 밀접하게 관련된다. 배경으로서, 인간 척추는 33개의 척추로 구성된 가요성 구조물이다. 추간판을 인접하는 척추들을 분리시키고 완충작용을 하며, 척추에 인가되는 하중을 최소화시키는 작용을 하고, 척추들 사이의 움직임(굽힘, 신장, 회전)을 가능하게 한다. 추간판은 2개의 중요한 성분: 수핵 및 섬유테를 포함한다. 수핵은 디스크의 중앙에 위치하고 디스크 전체 단면적의 25-40 %를 차지한다. 수핵의 매트릭스는 대체로 물, 다당류 및 단백질 분자로 구성된 두꺼운 젤라틴성 물질로 구성된다. 섬유테는 수핵을 둘러싸고, 디스크에 인가되는 뒤틀림 및 굴곡력을 견뎌낸다. 척추 말단판은 디스크의 어느 한 면에서 척추로부터 디스크를 분리시킨다. 외부 고리 층은 구조적으로는 주로 세포외 매트릭스 내의 타입 I 콜라겐으로 구성된 중첩되는 섬유연골 직교 층으로 주로 이루어진다. 이러한 십자 패턴이 인접하는 척추들에 의해 인가되는 압력에 대한 두드러진 구조적 탄성을 부여한다. 섬유테의 중간에 위치하는 내부 코어는 타입 II 콜라겐 및 히알루론산 풍부 매트릭스 내에 매립된 소수개의 세포들로 이루어지고, 생체기계적 충격 흡수제로서 작용한다.

운동, 부상, 질병, 사고 또는 과용의 결과로, 척추들 중 하나 이상 및 디스크들 중 하나 이상이 손상될 수 있게 된다. 구체적으로, 척추 및 디스크의 질환은 1) 디스크 고리의 파열, 예를 들면 고리 틈새; 2) 만성 디스크 염증; 3) 억제 또는 이탈 돌출을 갖는 국소 디스크 탈출증; 4) 디스크를 둘러싸고 있는 척추의 상대적 불안정성; 및 5) 외상을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.

섬유테 및 수핵 둘 모두 내의 추간판 세포가 단지 디스크 부피의 작은 %를 구성하지만, 이들은 디스크의 세포외 매트릭스를 구성하는 프로테오글리칸 풍부 조직(연골과 유사)을 합성할 수 있는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 병에 걸린 디스크에서는, 친수성 세포외 매트릭스의 생산 감소에 의해 수핵 내 추간판 세포 밀도의 감소가 수반된다. 추간판 세포의 감소는 따라서 점진적으로 변성 디스크 질환(DDD)으로 되는 추간판 공간의 구조적 감소를 초래한다. 전통적으로, 연골은 히알린, 탄성 또는 섬유연골로 분류된다. 수핵의 겔-유사 해부학적 특징(뿐만 아니라 그의 독특한 척삭 배아 기원)은 임의의 연골 범주에 맞지 않고, 분류적으로 연골로 간주되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 연골의 것과 유사하게 프로테오글리칸 풍부 세포외 매트릭스가 스며든다. 연골 및 뼈를 생성할 수 있는 본 발명의 재생 세포의 능력에 기초하여, 이들 세포는 또한 프로테오글리칸 풍부 세포외 매트릭스와 같이 연골의 형성을 자극하고, 이에 의해 추간판을 복원할 수 있다.

배통을 치료하기 위한 다양한 접근법들이 개발되어 왔다. 사소한 배통은 의약 및 다른 비-침입성 요법에 의해 치료될 수 있다. 가볍게 내지 적당하게 변성된 디스크는 디스크 수핵 및 섬유테 내 손상 조직을 복원함으로써 치료될 수 있다. 따라서, 본 발명의 재생 세포는 연골 발육을 자극하고 이에 의해 다양한 변성 단계에서 추간판을 복원하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 재생 세포는 가벼운 손상(디스크가 대체로 여전히 전체적으로 무상이지만 파손되기 시작함)의 경우 디스크의 수핵 내로 직접 생리학적 용액으로의 주사를 통해 전달될 있다. 적당한 디스크 변성(디스크가 거시적으로 변성되고 있음)의 경우, 재생 세포는 수핵 내로 주사될 때 현장에서 겔화되는 히드로겔 액체와 혼합될 수 있다. 겔화는 열적으로 또는 열화학적으로 매개될 수 있다.

그러나, 손상된 및(또는) 잘못기능하는 등 성분의 적어도 일부분을 제거할 필요가 종종 있다. 예를 들면, 디스크가 파열되었을 때, 추간판절제술 수술 과정을 수행하여 파열된 디스크를 제거하고 제거된 디스크 사이의 2개의 척추들을 함께 유합시킬 수 있다. 척추 유합 방법의 대표적인 시행에 관한 세부사항들은 본원에서 그의 내용을 전체적으로 참고문헌으로 인용하고 있는 U.S. 특허 No. 6,033,438 및 5,015,247에 개시되어 있다.

척추 유합술은 구조적 변형, 외상적 불안정성, 변성적 불안정성 및 절제 후 의인성 불안정성과 같은 질환에 척주의 안정화를 제공하는 것으로 나타나 있다. 유합술 또는 관절고정술은 따라서 예를 들면 인접하는 운동 분절 사이에 뼈 다리를 형성함으로써 달성될 수 있다. 유합술은 연속되는 척추 본체들 사이 앞에서 또는 척추의 연속되는 횡방향 과정, 판, 또는 다른 뒤 측면들 사이 뒤에서 달성될 수 있다. 척추 유합술에 대한 수술 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 본 발명은 자인성 뼈 이식편을 수확하기 위한 제2 수술의 필요성을 없애기 때문에 업계-인정된 기술에 비하여 고유의 이점을 제공한다. 또한, 전형적으로는, 뼈 이식 물질 및(또는) 증식 인자들이 척추 유합술을 촉진할 필요가 종종 있다. 본 발명은 이식 거부반응의 두려움없이 및 비용-효율적으로 뼈 성장을 촉진하는 자인성 재생 세포를 제공한다.

뼈 관련 질환을 치료하기 위한 척추 유합술 및 다른 수술 기술용 수술 방법은 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있다. 이러한 모든 업계-인정된 기술은 본 발명에 의해 포함된다.

본 발명은 절대 추가로 제한하는 것으로 간주되지 않아야 하는 하기하는 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원서 전체에 걸쳐 인용된 문헌 인용, 특허허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시계류중인 특허 출원을 포함하는 모든 인용된 참고문헌들의 내용은 이에 의해 명백하게 참고문헌으로 인용된다.

하기 기재된 실시예 전체에 걸쳐 사용된 ADC 또는 재생 세포는 본 명세서에서 설명된 방법(들) 및(또는) 2001년 12월 7일에 출원된 U.S. 임시 출원 일련번호 No. 60/338,856에 대한 우선권을 주장하는, 2002년 12월 9일에 출원된 U.S. 출원 일련번호 No. 10/316,127, 발명의 명칭 "SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS"에 설명된 방법(들), 뿐만 아니라 2002년 12월 9일에 출원된 U.S. 출원 일련번호 No. 10/316,127, 발명의 명칭 "SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS"에 대한 우선권을 주장하는, 2004년 6월 25일에 출원된 U.S. 출원 No. __________, 발명의 명칭 "SYSTEMS AND METHODS FOR SEPARATING AND CONCENTRATING REGENERATIVE CELLS FROM TISSUE"에 설명된 방법들에 의해 얻을 수 있으며, 상기 특허들은 모두 일반 양도되었고, 그의 내용들은 모두 본원에서 명백하게 참고문헌으로 인용된다.

실시예 1: 인간 지방 조직은 골기원 세포의 공급원이다

방법 및 재료:

지방흡입: 인간 지방 조직을 선택 지방성형술(지방흡입)을 받는 개체로부터 얻었다. 일반적으로 지방흡입 과정은 복강 및(또는) 허벅지의 피부에 0.5 ㎝ 절개를 만든 후 부어오르는 용액(리포카인 및 에피네프린을 보충한 염수)을 이용한 피하 공간의 침윤을 포함한다. 대략 10분 후, 피하 지방 조직을 기계-보조된 흡입 하에 삽입관(의사 기호에 따라 3-5 ㎜ 직경)을 통해 흡입하였다. 지방 조직, 혈액 및 부어오르는 용액(지방흡입물)을 일회용 용기 내에 수집하고 실험실로의 이송 동안 4 ℃에서 보관하였다.

조직 소화: 지방 조직을 따뜻한(37 ℃) 염수로 여러 번 세척하여 과량의 혈액 및 유리 지질을 제거하였다. 조직을 이어서 37 ℃에서 블렌드자임 콜라게나제(블렌드자임 1 45분 동안 또는 블렌드자임 3 20분 동안; 로쉐(Roche), 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로 대략 2배 부피의 염수 중에서 소화시켰다. 일정한 교반을 가하여 소화 동안에 걸쳐 조직 및 매질의 적절한 혼합을 보장하였다. 세포 소화 후, 비-부유 세포들을 제거하고 3회 세척하여 잔류 효소를 제거하였다. 형광 현미경을 사용하여 혈구계 상에서 중요한 염료(요오드화 프로피듐)를 사용하여 세포를 계수하였다.

CFU - AP 분석: 세척한 세포를 이중으로 6 다중웰 플레이트(코닝(Corning), 뉴욕) 중에서 1,000, 5,000, 및 25,000 세포/웰로 평판배양하였다. 0.1 μM 덱사메타손(시그마(Sigma), 미저리주 세인트 루이스), 10 mM β-글리세로포스페이트(시그마, 미저리주 세인트 루이스) 및 50 μM L-아스코르브산 2-포스페이트(시그마, 미저리주 세인트 루이스)가 보충된 α-MEM (셀그로(Cellgro), 버지니아주 헌든), 10% PBS/5% 말 혈청/1% 항생제-항진균 용액(오메가 사이언티픽(Omega Scientific, 캘리포니아주 타르자나)으로 이루어진 배지 중에서 3주 동안 세포를 배양함으로서 골형성 분화를 유도하였다. 유도 제1 주 후, 배지를 매주 덱사메타손이 없는 골형성 배지로 교환하였다. 알칼리성 포스파타제(AP) 활성을 검출하기 위하여, 배양판을 PBS로 헹구고, 1% 나프톨(Napthol) AS-BI 포스페이트(시그마, 미저리주 세인트 루 이스) 및 1 mg/ml 패스트 레드(Fast Red) TR(시그마, 미저리주 세인트 루이스)로 37 ℃에서 20분 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 PBS로 세척하고, 10% 완충된 포르말린 포스페이트(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 펜실베니아주 피츠버그)로 15 분 동안 고정하였다. 양성 AP 염색을 갖는 50개 초과의 세포로 이루어진 콜로니를 CFU-AP로 정의하였다. 각 웰에서 CFU-AP의 수를 계수하고, 이중 샘플로부터 CFU-AP의 평균 수를 계산하였다.

알칼리성 포스파타제 분석: 지방 조직-유래 세포의 21일 배양에서의 접체 포스파타제 활성을 열량계 분석(시그마 다이아그노스틱스(Sigma Diagnostics), 미저리주 세인트 루이스)를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 긁어냄으로써 21일 배양물을 수확하여, 세포를 염수 중에 재현탁시키고, 음파처리하여 용해시켰다. 세포 용해물을 이어서 30 ℃에서 15분 동안 pH 10.2에서 p-니트로페닐 포스페이트와 함께 인큐베이션하였다. 405 nm에서의 흡광도를 터너(Turner) SP-830 분광계(터너 디자인스(Turner Designs), 캘리포니아주 써니데일)를 사용하여 구하였다.

결과:

제공자 특징: 제공자 집단의 특징을 아래 표 A에 나타낸다. 이 집단은 미용 지방성형술을 행한 집단을 대표한다. 미국 미용 성형 수술 협회의 데이터는 2003년 미국에서 384,626건의 지방 흡입술이 행해졌고, 이것은 남성 및 여성 모두의 경우 가장 일반적인 미용 수술 과정이었다. 여성은 모든 지방성형 수술의 84%를 차지하였다(본 연구에서는 81%). 2003년 지방성형술을 행한 모든 환자의 대략 절반이 35세 내지 50세 사이의 연령이었고, 본 연구에서 평균 연령은 46이었다.

제공자 특징
성별	44F 10M
평균 연령	46(범위 19-72)
지방흡인물의 평균 부피	510±47ml(범위 50-1,500)
지방흡입으로부터 조직 처리까지의 시간	< 6시간 17
	밤동안 37
신체 질량 지수	정상 20
	과체중 12
	비만 6
	미측정 16

CFU - AP 분석의 전개 및 확인: 조직 처리로 지방 조직 단위 부피(ml) 당 ㅍ펴평균 7.3±0.1x10⁵ 생육 비-부유 유핵 세포를 수득하였다. 이들 세포들을 이어서 이 세포 공급원에 대한 이 분석을 확인하기 위하여 여러 개의 밀도에서 CFU-AP 분석으로 평판배양하였다. 추가로, 본 발명자들은 CFU-AP 계수가 1,000 내지 50,000 세포/웰 범위에 걸쳐 평판배양된 세포 수와 선형임을 입증하였다. 검출된 빈도의 범위는 표준 분석의 경우 본 발명자들이 웰 당 콜로니 수가 웰 당 10-60 범위에 속하는 배양물 갖도록 보장하기 위하여 본 발명자들이 통상적으로 2개의 상이한 세포 농도에서 3중으로 세포들을 평판배양하는 것이다.

골기원 세포 빈도 및 수율

본 접근법을 사용하여 본 발명자는 54명(표 A)의 제공자로부터 얻은 지방 조직을 시험하였다. 데이터는 새로운 조직(수집으로부터 6 시간 이내에 처리된 조직)으로부터 처리된 샘플 중의 CFU-AP 빈도가 조직 수집 다음 날리 처리된 샘플의 것보다 유의적으로 더 높았음을 나타낸다(2.0±0.3 CFU-AP/100 세포 대 0.6±0.2 CFU-AP/100 세포; p=0.001). CFU-AP 빈도는 제공자 연령 또는 성별과 상관되지 않았다.

골기원 세포의 평균 수율은 7,225±1,760 CFU-AP/ml 지방 조직(범위 120-67,500)이었다. CFU-AP 빈도와는 달리, 제공자 연령이 증가함에 따라 지방 조직 단위 부피당 CFU-AP 수율이 감소되려는 경향이 있었다. 그러나, 상위 4분위 연령(>48세)을 하위 4분위 연령(<34세)과 비교하였을 때 차이는 통계학적 유의에 이르지는 못하였다(나이 든 제공자의 경우 4,300±1,500 세포/ml 조직 대 젊은 제공자의 경우 9,200±1,800; p=0.09).

알칼리성 포스파타제 활성

본 연구에서는 콜로니를 알칼리성 포스파타제-양성이고 50개 이상의 세포를 함유하는지를 분석하려는 목적을 위해 단지 계수하였다. 콜로니 크기는 상당히 변하여 일부 콜로니는 수 천 개의 세포로 이루어진다. 전체 알칼리성 포스파타제 활성은 전체 골모세포 수(기원 세포 증식의 함수) 및 이들 세포의 분화 정도를 모두 고려할 때 뼈형성 활성을 측정하는 우수한 방법을 나타낼 수 있다. 따라서, 알칼리성 포스파타제 분석을 15명의 병행 제공자들에서 복제 웰 중에서 수행하였다. 전체 알칼리성 포스파타제 활성은 평판배양된 세포 수와 직선 관계를 나타냈다. 이어서 알칼리성 포스파타제 활성(평판배양된 세포 수에 대하여 표준화됨)을 연령에 대하여 플롯팅하였을 때 데이터는 연령과 알칼리성 포스파타제 활성 사이의 역 관계를 입증하였다(도 2; r² = 0.57).

골기원 세포 수율 및 신체 질량 지수

제공자 신장 및 체중에 대한 데이터를 38명의 제공자로부터 입수하였다. 이것으로 신체 질량 지수(BMI)를 계산하여 3개의 군으로 나누었다: 정상 BMI을 갖는 20명의 제공자(18.5 내지 24.9), 과체중 범주 내 12명((25.0-25.9), 및 6명의 비만 제공자(≥30). 조직의 단위 부피 당 CFU-AP의 수율은 과체중인 제공자의 경우보다 정상 BMI를 갖는 사람에서 유의적으로 더 높았다(5,279±780 정상 BMI 제공자 대 1,373±1,150 과체중 제공자; p<0.02). 비만 제공자는 조직의 단위 부피 당 CFU-AP의 수율에 상당한 변동을 보였다(867-18,462 CFU-AP/ml; 도 3). 평균은 과체중 제공자의 경우보다 더 높았지만 통계학적 유의에 이르지는 못하였다(p=0.08).

요약

상기한 결과들은 인간 지방 조직이 골기원 세포의 풍부한 공급원일 수 있음을 보여준다. 구체적으로, 결과는 인간 지방이 조직 그램 당 평균 대략 7,200 개의 골기원 세포를 함유함을 보여준다. 이 집단 내에서의 CFU-AP 빈도는 조직 수집으로부터 조직 처리까지의 시간에 의존하여, 수집으로부터 6 시간 내에 처리된 조직이 2.0±0.3 CFU-AP/100 유핵 세포의 빈도를 생성하였다. 새롭게 수확된 인간 골수를 이용한 연구는 50,000에서 대략 1의 빈도로 CFU-AP 수율을 200-2,000 CFU-AP/ml 골수로 추정하였다(Banfi, 2001; Galotto, 1999; D'Ippolito 1999). 따라서, 이 데이터는 인간 지방 조직이 유사한 부피의 솔수보다 실질적으로 더 많은 골기원 세포를 함유함을 보여준다.

상기 연구에 이용된 지방 조직은 생육 세포의 회수가 아닌 조직 추출을 위해 최적화된 지방흡입 과정을 사용하여 얻었다. 그러나, 지방흡입에 대한 변경된 파라미터들(즉, 예를 들면 사용된 삽입관의 크기 및 스타일 및 인가된 흡입력의 양을 변화시킴으로써 생육 세포의 회수를 목적으로 함)과 함께 본 발명의 시스템 및 방법의 사용은 의심할 여지 없이 더욱 더 큰 재생 세포 수율을 초래할 것이다. 보다 높은 골기원 세포 수율은 본 발명의 장치의 내용에서 특히 중요하다. 예를 들면, 보다 높은 빈도의 골기원 세포는 보다 높은 투여량의 적용 및 잠재적으로 뼈 형성을 촉진하는데 있어서 더 큰 임상학적 효율을 가능하게 할 것이다.

실시예 2: 지방 유래 재생 세포는 생체내에서 연골 및 뼈를 형성한다.

방법 및 재료:

세포 골격:

PLA 골격 제작 및 준비:

대략 90 %의 다공도를 갖는 다공성 중합체 골격을 용매-주조/미립자-침출 방법으로 제조하였다(예를 들면, 문헌[A.G. Mikos, A.J. Thorsen, L.A. Czerwonka, Bao Y., and R. Langer. Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams. Polymer 35 (5): 1068-1077, 1994] 참조). 요약하면, 염화나트륨을 침출가능한 포로겐으로 사용하고 직경 300-500 ㎛ 범위의 입자들로 체질하였다. 3% 중합체 용액을 70:30 폴리(L-락티드-코-DL-락티드)와 클로로포름을 합하여 만들었다. 체질한 염 및 중합체 용액을 테플론 페트리 접시에서 혼합하여 염 대 중합체 중량비 9:1로 만들고 2일 동안 후드 중에서 용매가 증발되게 하였다. 물을 매 8-12 시간마다 교환하여, 물 중에 3일 동안 침지시킴으로서 골격으로부터 염을 침출하였다. 다공성 중합체 스폰지를 낮은 진공 하에 2일 동안 둥 잔류 용매를 제거하였다. 중합체 시트로부터 8 ㎜ 직경 이식물을 펀칭하여 골격 이식에 맞는 크기로 하였다. 골격을 밤동안 70% 에탄올 중에 잠기게 두고 자외선에 노광시키고, 0.9% 주사용 염수로 3회 헹군 다음 세포 시딩 전에 골격으로부터 잔류 염수를 제거하여 골격을 무균으로 만들었다.

탈무기질화 뼈 매트릭스(DBM) 골격 준비 및 세포 시딩:

균일하게 분배된 부분들(이식물 당 대략 70 ㎎)을 0.9 % 주사용 염수로 3회 헹군 후 골격으로부터 잔류 염수를 제거하여 그라프톤(Grafton)® 디미네랄라이즈드 본 매트릭스 퍼티(Demineralized Bone Matrix Putty)(오스테오테크(Osteotech), 뉴 저지주)를 세포 시딩을 위해 준비하였다.

지방 유래 재생 세포 단리, 배양 및 세포 시딩 :

그린 형광 단백질[C57BI/6-TgN(ACTbEGFP)lOsb]을 발현하는 트랜스게닉 마우스로부터 백색 피하 지방 조직을 절개해 내어 ADC를 얻었다. 조직을 효소 소화시켰다. 요약하면, 세포를 l x PBS 중에 세척하고, 0.075% 콜라게나제(Collagenase) I (시그마) 중에서 45 분 동안 37 ℃ 진탕으로 소화시킨 다음, 둘베코 변형 필수 배지(Dulbecco's Modified Essential Medium)(집코(Gibco)) 중 10% FBS(피셔)로 중화하고, 세포 스트레이닝(straining) 여과기(100 ㎛, 70 ㎛ 및 40 ㎛)의 구배를 통과시키고, 400g에서 5 분 동안 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 뼈형성 배지[0.1 μM 덱사메타손(시그마, 미저리주 세인트 루이스), 10 mM β-글리세로포스페이트(시그마, 미저리주 세인트 루이스) 및 50 μM L-아스코르브산 2-포스페이트(시그마, 미저리주 세인트 루이스)가 보충된 α-MEM (셀그로, 버지니아주 헌든), 10% FBS, 1% 항생제-항진균 용액(오메가 사이언티픽, 캘리포니아주 타르자나)] 중에 재현탁시켰다. 인큐베이션 처음 3일 후, 배지를 매주 덱사메타손이 없는 골형성 배지로 교환하였다. 플라스크를 3주 배양 기간 동안 2회 계대배양하였다. 이어서 배양된 ADC를 0.9% 주사용 염수 중에 재현탁시키고(5 x 10⁷ 세포/ml) 골격 당 2.5 x 10⁶ 세포로 PLA 또는 그라프톤 DBM 골격 상에 시딩할 때까지 4 ℃로 유지시켰다.

수술 과정:

무흉선 쥐(대략 200 g)를 케타민/자일라진[각각 100/10 mg/kg (TW Medical Veterinary Supply)]으로 마취시켰다. 쥐의 복강을 면도하고, 베타인 및 70% 이소프로판올을 면봉으로 발랐다. 멸균 조건 하에서, 힙 영역에 가까운 다리의 피부를 통해 대략 길이 1.5 cm의 전체 두께에 걸친 절개부를 만들었다. 긴장근을 비절개 박리를 통해 노출시키고 긴장근을 따른 1.0 cm 절개를 만들어 대퇴근막을 박리하여 직근을 노출시켰다. 미세주걱(microspatula)을 사용하여, 채널을 생성시킨 다음, 그 안에 단일 이식편을 넣었다. 5-0 실크 봉합사를 한 번 통과시켜 채널을 막은 후, 5-0 코팅된 비크릴(Vicryl)® 편조 봉합사로 긴장근 절개를 봉합하고, 9 mm 창상 클립으로 피부 절개를 닫았다. 수술 후, 가열 패드 상에서 동물이 마취로부터 회복되게 하였다. 깨어났을 때, 수술후 통증을 완화시키기 위하여 부프레노르핀 (0.02-0.05 mg/kg, 피하로)을 투여하였다.

분석:

수술 2 주 후, 쥐를 C0₂ 노출로 안락사시키고, 이식물을 회수하였다. 조직을 밤동안 0.4 % 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 파라핀 중에 매립하고, 5 미크론 절편으로 절단한 다음 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) 또는 본 코싸(Von Kossa)로 염색하여 각각 연골 및 무기질화 조직을 가시화하였다. 염색되지 않은 절편들을 그린 형광 제공자 세포의 존재에 대하여 평가하였다.

결과:

연골, 풋뼈 및 무기질화 뼈의 혼합물을 포함한 BMP-2로 현장 밖에서 초회감작되었던 ADC를 시딩한 골전도((DBM) 또는 비-골전도(PLA) 골격을 조직에 이식하였다. 연골은 이색 염색된 세포 및 조직의 존재에 의해 톨루이딘 블루 염색된 절편에서 확인되었다. 연골 세포가 공간 내에 존재하였다. 이들은 프로테오글리칸-풍부 매트릭스에 의해 둘러싸여졌다. 풋뼈는 골세포가 매립되어 있는 매끄러운 매트릭스로서 드러났다. 무기질화 뼈는 본 코싸 염색된 분절에서 드러났다. 초기 조혈 요소들은 세포 부하된 골수강의 존재에 의해 뼈 중에서 확인되었다. 연골은 또한 초회감작되지 않은 ADC 및 DBM으로 구성된 이식물을 갖는 조직에서 드러났다. 대조적으로, ADC 없이 이식된 어떠한 유형의 골격 상에서도 연골 또는 뼈가 존재하지 않았다.

요약:

요약하면, 상기한 결과들은 지방 유래 재생 세포가 골전도(DBM) 또는 비-골전도(PLA) 골격 상에서 골격근 내로 전달될 때 연골 및 뼈를 형성할 수 있는 능력을 가짐을 입증하였다. 따라서, 지방 유래 재생 세포는 추간판을 복원하기 위하여 연골 형성을 자극하는데 있어서 유용하다. 게다가, 상기한 연구는 추간체 및 가로돌기간 척추 유합술 모두에서(이 둘의 환경은 모두 골격근에 의해 둘러싸여져 있다) 뼈 형성을 자극하는데 있어서의 지방 유래 재생 세포의 사용을 지지한다. 골기원세포로 알려진 위성 세포들을 함유하는 골격근은 지방 유래 재생 세포와 제휴하여 튼튼한 뼈 형성을 자극하는 작용을 한다. 최소한, 골격근은 지방 유래 재생 세포가 뼈 형성을 자극할 수 있는 지지하는 환경을 제공한다.

실시예 3: 재생 세포는 생체내에서 연골, 뼈 및 골격근을 형성한다.

방법 및 재료:

재생 세포 제조:

인간 재생 세포를 본원에서 기재한 바와 같이 효소 소화에 의해 수확하였다. 단리된 재생 세포들을 이어서 면역 자기 비이즈를 사용하여 CD34 (+) 및 CD34 (-) 집단으로 분리하였다. 세포들의 각 아집단을 다중웰 배양판 내 완전 배지(DMEM, 10% 태 소 혈청, 5% 말 혈청, 및 1% 항생제, 항진균제 용액) 중에서 여러 개의 밀도로 배양하였다. 3 주에, 이들 배양물로부터 CD34 (-) 클론을 선택하고, 하기하는 배지들 중 하나 중에서 대략 2개월 동안 계대배양하였다: 완전 배지, 뼈형성 배지 또는 연골형성 배지.

분석:

클론 세포의 연골 또는 뼈로의 분화를 각각 알시안 블루 또는 알칼리성 포스파타제로 염색하여 측정하였다. 클론 세포의 근육으로의 분화를 골격근 특이적 마커 myf5 및 myoDl 뿐만 아니라, 인간 마이오신 중쇄에 대한 항체를 사용하는 CD34 (+) 및 CD34 (-) 세포의 면역조직화학적 염색에 의해 분석하였다. RT-PCR을 수행하여 마이오신 중쇄, myf5, 및 myoDl의 유전자 발현을 평가하였다.

결과:

CD34 (-) 클론 콜로니로부터의 재생 세포들은 사용된 배지에 따라, 연골세포, 골모세포 및 근육 세포로 분화되었다. 각각 알시안 블루 또는 알칼리성 포스파타제를 이용한 조직화학적 염색에 의해 명백하게 드러나는 바와 같이, 뼈형성 배지 중에서 배양된 재생 세포는 골모세포로 분화된 반면, 연골형성 배지 중에서 배양된 재생 세포는 연골세포로 분화되었다. 게다가, 임의의 분화 매질 부재 하에 완전 배지 중에서 배양된 CD34 (-) 클론 콜로니로부터의 재생 세포는 마이오신 중쇄, myf5, 및 myoD에 대하여 면역조직화학적으로 양성이어서, 그들의 근육모세포 표현형으로의 분화를 입증한다. 면역조직화학적 데이터와 일치하게, 이들 근육 클론들은 마이오신 중쇄, myf5, 및 myoD에 대한 유전자를 발현하였다.

요약:

요약하면, 이들 데이터는 인간 배양된 재생 세포 콜로니가 연골세포, 골모세포 및 골격 근육모세포를 발생시킴을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재생 세포는 불유합 긴 뼈 골절에서와 같이 경질 조직 파손을 치유하는데 있어서, 뿐만 아니라 손실 조직, 예를 들면 연골, 힘줄 또는 인대 내 연질 조직 열상을 복원하기 위하여 연골, 뼈 및 골격근 형성을 자극할 수 있는 능력을 갖는다. 추가로, 본 발명의 재생 세포는 가로 돌기 또는 척추들 사이에서의 뼈 형성에 의해 예를 들면 척추 유합술 적용에서 기계적 지지를 부여하기 위하여 조직을 새로이 생성할 수 있는 능력을 갖는다.

본원에서 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합은 이러한 상기 조합물 중에 포함된 특징들이 문맥, 본 명세서 및 당 업계의 통상의 숙련인의 지식으로부터 명백하게 될 때 상호 모순되지 않는다면 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명을 요약하기 위하여, 본 발명의 특정 면, 이점 및 신규 특징들을 본원에서 설명하였다. 물론, 반드시 모든 상기 측면, 이점 또는 특징들이 본 발명의 임의의 특정 실시태양에서 구체화되는 것은 아님을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 추가적인 이점 및 측면들은 하기 상세한 설명 및 특허청구의 범위에서 드러난다.

상기한 실시태양들은 예로서 제공되었으며, 본 발명은 이들 실시예로 제한되지 않는다. 당 업계의 통상의 숙련인은 상기한 설명을 고려하여, 상호 배타적이지 않는 정도의 개시된 실시태양에 대한 다수의 변동 및 변형을 만들 수 있다. 추가로, 본원의 내용에 비추어 다른 조합, 생략, 치환 및 변형이 당 업계의 숙련인에게 드러날 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 실시태양에 의해 제한되는 것이 아니라, 첨부된 특허 청구의 범위를 참고로 하여 정의되어야 한다.

수많은 공개 및 특허들이 상기 본원에 인용되었다. 인용된 공개 및 특허 각각은 본원에서 그들 전체가 참고문헌으로 인용된다.

균등물

당 업계의 통상의 숙련인들은 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에서 설명된 본 발명의 특정 실시태양에 대한 수많은 균등물들을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물들은 하기 특허 청구의 범위에 의해 포함되어야 한다.

Claims (77)

1. (1) a. 재생 세포들이 조직으로부터 분리되도록 조직의 산해를 용이하게 하는, 환자로부터 제거된 조직을 수용하기 위한 챔버 조립체,

   b. 챔버 조립체 중에 존재하는 산해된 조직으로부터 재생 세포를 농축시키는, 챔버 조립체에 연결될 수 있는 농축 장치, 및

   c. 챔버 조립체 및 농축 장치와 소통할 수 있고 이들을 제어할 수 있는, 프로그래밍가능한 처리 장치

   를 포함하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리 및 농축시키기 위한 자동화 시스템을 제공하는 단계;

   (2) a. 세포 운반체 부분; 및

   b. 세포 운반체 수용 부분

   을 포함하는 장치를 제공하는 단계; 및

   (3) 자동화 시스템에 의해 분리 및 농축된 재생 세포들을 장치의 세포 운반체 부분에 첨가하는 단계

   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 챔버 조립체가 산해를 용이하게 하기 위한 수집 챔버 및 수집 챔버로부터 산해된 조직을 수용하도록 연결된 처리 챔버를 포함하고,

   상기 농축 장치가 처리 챔버에 연결될 수 있는 원심분리 장치를 포함하고, 및

   상기 프로그래밍가능한 장치가 챔버 조립체의 수집 챔버 및 처리 챔버 모두와 소통하고 이들 모두를 제어할 수 있는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 방법이 뼈 관련 질환을 치료하는데 사용되는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 뼈 관련 질환이 척추 유합 결함인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 뼈 관련 질환이 척추 안정 결함인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 뼈 관련 질환이 분절 결함인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 뼈 관련 질환이 신체의 비-골전도 영역에 있는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 뼈 관련 질환이 척추의 질환인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 뼈 관련 질환이 디스크의 질환인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 재생 세포가 줄기 세포를 포함하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 재생 세포가 기원 세포를 포함하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 재생 세포가 줄기 세포 및 기원 세포의 조합물을 포함하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 장치의 세포 운반체 부분이 증식 인자를 추가로 포함하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 재생 세포가 장치에 배치되기 전에 세포 배양으로 증식되는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 재생 세포가 뼈발생 표현형으로의 분화를 촉진하는 배양 조건에서 증식되는 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 재생 세포가 자인성 세포인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 장치가 양수체 척추 유합술 장치인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 장치의 세포 운반체 부분 및 세포 운반체 수용 부분이 실질적으로 포물선 형태, 실질적으로 원통 형태, 실질적으로 사다리꼴 형태 및 실질적으로 직사각형 형태로 이루어진 군으로부터 선택된 형태인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 부분이 재흡수가능한 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 세포 운반체 수용 부분이 폴리락티드 중합체 물질을 포함하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 폴리락티드 중합체가 70:30 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)인 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 수용 부분이 재흡수가능하지 않은 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 수용 부분이 다수개의 개구를 포함하는 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 부분이 다공성인 방법.
25. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 부분이 겔 또는 히드로겔인 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 부분이 재흡수가능한 것인 방법.
27. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 부분이 재흡수가능하지 않은 것인 방법.
28. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반체 부분이 인회석으로 코팅된 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 세포 운반체 부분이 모의 체액 용액을 사용하여 코팅된 방법.
30. 제1항에 있어서, 상기 조직이 지방 조직인 방법.
31. 제1항에 있어서, 상기 분리 및 농축된 재생 세포가 환자로의 주입에 적합한 방법.
32. 제2항에 있어서, 상기 자동화 시스템의 수집 챔버가 조직은 보유하고 유리 지질, 혈액 및 세척 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 비-조직 성분들을 여과해내기 위하여 수집 챔버 내의 여과기 케이지 내에 수용된 여과기를 추가로 포함하는 방법.
33. 제2항에 있어서, 상기 자동화 시스템의 수집 챔버가 회전가능한 샤프트가 교반될 때 패들이 조직의 산해를 용이하게 하도록 하는 패들을 포함하는 회전가능한 샤프트의 교반을 통해 조직의 산해를 용이하게 하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 패들이 수집 챔버 내의 여과기 케이지에 부착된 방법.
35. 제33항에 있어서, 상기 회전가능한 샤프트가 자기 교반기를 통해 교반되는 방법.
36. 제2항에 있어서, 상기 수집 챔버가 회전가능한 샤프트가 회전할 때 패들이 조직의 산해를 용이하게 하도록 하는 패들을 포함하는 회전가능한 샤프트의 회전을 통해 조직의 산해를 용이하게 하는 방법.
37. 제33항에 있어서, 상기 회전가능한 샤프트가 구동 기작을 통해 회전되는 방법.
38. 제1항에 있어서, 세척 용액 공급원을 추가로 포함하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 세척 용액이 염수인 방법.
40. 제1항에 있어서, 산해제 공급원을 추가로 포함하는 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 산해제가 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리베라제 H1, 펩신, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
42. 제2항에 있어서, 상기 처리 챔버가 원심분리 장치에서 산해된 조직의 원심분리 동안 처리 챔버에 존재하는 산해된 조직을 보유하는 하나 이상의 원심분리 챔버를 포함하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 원심분리 챔버가 원심분리 장치에서의 산해된 조직의 원심분리 동안 농축된 재생 세포를 수집하기 위한 하나 이상의 생산물 챔버를 추가로 포함하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 하나 이상의 생산물 챔버가 원심분리 동안 상이한 각도로 및 농축된 재생 세포의 수집을 위해 상이한 각도로 기울어지는 시스템.
45. 제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 생산물 챔버가 농축된 재생 세포의 수집을 위한 각에 도달하도록 수동적으로 재위치될 수 있는 시스템.
46. 제44항에 있어서, 상기 농축된 재생 세포가 주사기를 사용하여 수집되는 시스템.
47. 제2항에 있어서, 상기 처리 챔버가 멸균 방식으로 산해된 조직의 수집을 용이하게 하는 회전하는 시일을 포함하는 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 회전하는 시일이 회전하는 샤프트, 2개 이상의 베어링, 3개 이상의 립 시일, 외부 하우징, 원형 채널 및 원형 스프링을 포함하는 방법.
49. 제47항에 있어서, 상기 회전하는 시일이 회전하는 샤프트, 단일 고무 시일, 공기 개스킷, 하나 이상의 스프링 적재된 시일, 및 2개의 세라믹 디스크를 포함하는 방법.
50. 제2항에 있어서, 폐기물 챔버를 추가로 포함하는 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 폐기물 챔버가 환자로부터 제거된 조직의 비-재생 세포 성분들을 수용하는 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 폐기물 챔버에 존재하는 비-재생 세포 성분들이 콜라겐, 단백질, 지질, 지방세포 및 매트릭스 성분들을 포함하는 성분들을 분리 및 농축시키기 위해 원심분리되는 방법.
53. 제2항에 있어서, 상기 수집 챔버 및 처리 챔버가 배관을 통해 연결되는 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 배관이 센서를 추가로 포함하는 시스템.
55. 제2항에 있어서, 상기 수집 챔버 및 처리 챔버가 하나 이상의 밸브, 펌프, 센서 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는 방법.
56. 제54항에 있어서, 상기 수집 챔버, 처리 챔버 및 배관이 일회용인 시스템.
57. 제2항에 있어서, 상기 원심분리 장치 및 처리 장치가 재사용가능한 것인 방법.
58. 제2항에 있어서, 상기 원심분리 장치가 원심분리 모터, 원심분리 모터 제어기 및 원심분리 브레이크 제어기를 추가로 포함하는 방법.
59. 제2항에 있어서, 상기 처리 장치가 하나 이상의 펌프의 사용을 통해 조직 흐름을 지시함으로써 수집 챔버, 처리 챔버 및 원심분리 챔버를 제어하는 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 펌프가 연동 펌프인 방법.
61. 제59항에 있어서, 상기 펌프가 재사용가능한 것인 방법.
62. 제1항에 있어서, 상기 처리 장치가 사용자가 파라미터들을 시스템 내로 입력하기 위한 사용자 인터페이스를 추가로 포함하는 방법.
63. 제1항에 있어서, 상기 처리 장치가 사용자가 파라미터들을 입력하게 안내하고, 사전-프로그래밍된 단계들을 확인하고, 오류 또는 이들의 조합에 대해 경고하는 지시사항들을 표시하기 위한 디스플레이 스크린을 추가로 포함하는 방법.
64. 제1항에 있어서, 1종 이상의 첨가제들이 재생 세포를 장치에 첨가하기 전에 재생 세포에 첨가되는 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 첨가제들이 증식 인자, 재현탁 유체, 세포 배양제, 세포 팽창제, 세포 보존제 또는 세포 변형제, 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 방법.
66. 제1항에 있어서, 1종 이상의 첨가제들이 재생 세포를 장치에 첨가한 후에 재생 세포에 첨가되는 방법.
67. 제66항에 있어서, 상기 첨가제가 증식 인자, 재현탁 유체, 세포 배양제, 세포 팽창제, 세포 보존제 또는 세포 변형제, 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 방법.
68. a) 세포 운반체 부분 및 세포 운반체 부분을 적어도 부분적으로 포함하도록 구성된 세포 운반체 수용 부분을 포함하는 장치 및 조직 제거 시스템을 제공하는 단계;

    b) 조직 제거 시스템을 사용하여 환자로부터 지방 조직을 제거하는 단계;

    c) 지방 조직의 적어도 일 부분을 처리하여 일정 농도의 재생 세포를 얻는 단계;

    d) 재생 세포를 장치의 세포 운반체 부분에 첨가하는 단계; 및

    e) 장치를 환자의 의도된 뼈 형성 영역에 삽입하고 이에 의해 환자에서 뼈 및 연골 중 적어도 하나의 형성을 촉진하는 단계

    를 포함하는, 환자의 뼈 또는 연골 형성 촉진 방법.
69. 제68항에 있어서, 상기 환자에서 뼈 및 연골 형성이 촉진되는 방법.
70. 제68항에 있어서, 상기 장치를 제공하는 단계가 세포 운반체 부분의 삽입을 위한 중앙 홀을 갖는 세포 운반체 수용 부분을 제공하는 것을 포함하는 방법.
71. 제70항에 있어서, 상기 장치를 제공하는 단계가,

    포물선 형태를 갖고 다공성인 세포 운반체 부분을 제공하는 단계;

    포물선 형태를 갖는 세포 운반체 수용 부분을 제공하는 단계

    를 포함하는 방법.
72. a) 세포 운반체 부분 및 세포 운반체 부분을 적어도 부분적으로 포함하도록 구성된 세포 운반체 수용 부분을 포함하는 장치 및 조직 제거 시스템을 제공하는 단계;

    b) 조직 제거 시스템을 사용하여 환자로부터 지방 조직을 제거하는 단계;

    c) 지방 조직의 적어도 일 부분을 처리하여 일정 농도의 재생 세포를 얻는 단계;

    d) 장치를 환자의 의도된 뼈 형성 영역에 삽입하는 단계; 및

    e) 재생 세포를 환자에 삽입된 장치의 세포 운반체 부분에 첨가하고 이에 의해 환자의 뼈 및 연골 중 적어도 하나의 형성을 촉진하는 단계

    를 포함하는, 환자의 뼈 또는 연골 형성 촉진 방법.
73. 제72항에 있어서, 상기 재생 세포를 첨가하는 단계가 환자의 뼈 및 연골 형성을 촉진하는 방법.
74. 제72항에 있어서, 상기 장치를 제공하는 단계가 세포 운반체 부분의 삽입을 위한 중앙 홀을 갖는 세포 운반체 수용 부분을 제공하는 것을 포함하는 방법.
75. 제74항에 있어서, 상기 장치를 제공하는 단계가,

    포물선 형태를 갖고 다공성인 세포 운반체 부분을 제공하는 단계; 및

    포물선 형태를 갖는 세포 운반체 수용 부분을 제공하는 단계

    를 포함하는 방법.
76. 제72항에 있어서,

    상기 지방 조직의 적어도 일부분의 처리 단계가, 지방 조직의 적어도 일부분을 처리하여 치료 유효량의 재생 세포를 얻는 것을 포함하고;

    상기 재생 세포를 첨가하는 단계가, 치료 유효량의 재생 세포를 환자에 삽입된 장치의 세포 운반체 부분에 첨가하고 이에 의해 환자의 뼈 및 연골 중 적어도 하나의 형성을 촉진하는 것을 포함하는 방법.
77. 제76항에 있어서, 상기 치료 유효량의 재생 세포의 첨가가 환자의 뼈 및 연골 형성을 촉진하는 방법.

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